JP4851034B2

JP4851034B2 - 化学修飾された脂質分解酵素

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Publication number: JP4851034B2
Application number: JP2001502561A
Authority: JP
Inventors: ヘンゲルカリセン，トーマス; アナントパトカル，シャムカント; スベンゼン，アラン; ビン，エスペル
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2020-06-02
Also published as: US6964944B1; US7282233B2; JP2003529322A; WO2000075295A1; DK1185630T3; EP1185630B1; ATE416252T1; US20050281912A1; AU5060900A; DE60040980D1; EP1185630A1

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、化学修飾された脂質分解酵素、その調製及び使用に関する。
【０００２】
発明の背景
脂質分解酵素、例えばリパーゼやホスホリパーゼは、例えば洗剤やベーキングにおいて用いられている。
リパーゼは、長年、衣類やその他の繊維品から脂質性の汚れを除くために洗剤用酵素として用いられており、特に、商品名リポラーゼ（Lipolase, Novo Nordisk A/S）として販売されているHumicola lanuginosa 由来のリパーゼ（EP258068及びEP305216）が用いられている。
脂肪酸により修飾されたリパーゼ及びエステル転移反応におけるその使用が報告されている（M. Murakami et al., JAOCS 70(6), 571-574(1993); K. Green et al., JAOCS 75(11), 1519-1526(1998) ）。
また、リパーゼやホスホリパーゼをパン生地に加えることが知られている（WO 94/04035, WO 98/26057）。
【０００３】
発明の要旨
本発明者は、当該酵素分子に１又は複数の疎水基を共有結合することによって化学的に修飾された脂質分解酵素を開発した。本発明者は、この化学修飾により、例えばベーキング及び洗剤における脂質分解酵素の性能を向上させうることを見出した。その利点には、熱安定性の向上及び基質特異性の変更が含くまれる。修飾されたリパーゼ又はクチナーゼは、洗浄性、特に初回洗浄性能、白さ維持能、黒ずみ浄化能を向上させ、そして乾燥時の脂肪酸形成と不快な臭いの発生の危険性を低下させうる。ベーキングにおける利点には、焼き上がったパンの容積の増加が含くまれる。
【０００４】
従って、本発明は、１又は複数（特に１〜３）の疎水基を当該酵素に共有結合することによって化学修飾された脂質分解酵素を提供する。本発明はまた、洗剤及びベーキングにおける、この様な修飾された脂質分解酵素の使用を提供する。本発明は、更に、親の脂質分解酵素に疎水基を共有結合することによって、化学修飾された脂質分解酵素を調製する方法を提供する。場合により、当該酵素のアミノ酸配列を、共有結合する前に改変してもよい。
【０００５】
発明の詳細な説明
親の脂質分解酵素
当該脂質分解酵素は、国際生化学分子生物学連盟（IUBMB ）の勧告（1992）に基づく酵素分類番号で E.C.3.1.1.-（カルボン酸エステルヒドロラーゼ）に分類される酵素である。従って、当該脂質分解酵素は、E.C.3.1.1.の規定上記載されている基質、例えばモノ−、ジ−、及びトリグリセリド、リン脂質、チオエステル、コレステロールエステル、ワックスエステル、クチン、スベリン、合成エステル、又はその他の脂質中に存在するカルボン酸エステル結合に対して、典型的には水／脂界面において、加水分解活性を示しうる。当該脂質分解酵素は、例えばリパーゼ活性（基質としてのトリグリセリドに対し）、ホスホリパーゼ活性、エステラーゼ活性又はクチナーゼ活性を有しうる。
【０００６】
親となる脂質分解酵素は、原核生物、特に細菌、例えばシュードモナス菌に由来する酵素でよい。この例は、シュードモナス菌、例えばP. cepacia, P. glumae, P. pseudoalcaligenes 及びシュードモナス菌株SD705 のリパーゼである。別の例は、細菌、例えばシュードモナス菌、例えばP. mendocina（US 5,389,536）又はP. putida（WO 88/09367）のクチナーゼである。
あるいは、親となる脂質分解酵素は、真核生物、例えば真菌、例えばフミコラ菌類（Humicola）やジゴミセテス菌類（Zygomycetes ）の脂質分解酵素、及び真菌のクチナーゼでもよい。真菌クチナーゼの例は、Fusarium solanipisi やHumicola insolens のクチナーゼである。
【０００７】
フミコラ菌類の脂肪分解酵素は、H. lanuginosa菌株DSM4109に由来するリパーゼ及びこのリパーゼに対して50％超の相同性を有するリパーゼから成る。H. lanuginosa （別名 Thermomyces lanuginosus）由来のリパーゼは、EP258068及びEP305216に記載されており、US 5,869,438に記載の配列番号２の位置1〜269 に示すアミノ酸配列を有する。
フミコラ菌類はまた、下記の脂質分解酵素を含んでいる：Penicillium camembertii 由来のリパーゼ、Fusarium oxysporum由来のリパーゼ／ホスホリパーゼ、F. heterosporum 由来のリパーゼ、Aspergillus foetidus由来のリゾホスホリパーゼ、A. oryzae 由来のホスホリパーゼA1、A. oryzae 由来のリパーゼ、A. niger由来のリパーゼ／フェルラ酸エステラーゼ、A. tubingensis由来のリパーゼ／フェルラ酸エステラーゼ、A. tubingensis由来のリパーゼ、A. niger由来のリゾホスホリパーゼ、及びF. solani 由来のリパーゼ。
【０００８】
ジコミセテス菌類は、Rhizomucor miehei のリパーゼに対して少なくとも50％相同であるリパーゼを含んでいる。また、この菌類は、Absidia reflexa, A. sporophora, A. corymbifera, A. blakesleeana, A. griseola及びRhizopus oryzae に由来するリパーゼを含んでいる。
ホスホリパーゼは、リン脂質から脂肪酸を除き、そしてリゾリン脂質を形成するA₁又はA₂活性を有し、あるいはホスホリパーゼＢ又はリゾホスホリパーゼ活性を有しうる。これは、リパーゼ活性、すなわちトリグリセリドに対する活性を有しても、又は有さなくてもよい。ホスホリパーゼは動物に由来してよく、例えば膵臓（例えばウシ又はブタの膵臓）、ヘビ毒又はハチ毒に由来してよい。あるいは、ホスホリパーゼは微生物に由来してよく、例えば糸状真菌、酵母又は細菌、例えばAspergillus, Fusarium 又はHyphozyma 属の菌類（WO 98/18912 ）、特に菌種A. niger又はF. oxysporum（WO 98/26057 ）に由来してよい。
【０００９】
その他の脂質分解酵素の例がPCT/DK99/00664（デンマーク国特許出願PA 1998 01572 ）に記載されている。
脂質分解酵素は、前記の由来源に固有のものでも、又はそのアミノ酸配列の改変により得られるその変異体でもよい。この様な変異体の例が、WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 98/08939, PCT/DK 99/00068, EP 99610010.3及びPCT/DK00/00156（デンマーク国特許出願PA 1999 00441）に記載されている。特定の例は、変異E1SPPCGRRP +E99N +N101S +E239C +Q249R を有するHumicola lanuginosa のリパーゼである。
【００１０】
疎水基
一般的には、疎水基を、水から油への移動における負の自由エネルギーによって同定することができる。より詳しくは、前記の２つの媒体が洗剤水溶液と、選択した（脂質）基質を含有する界面とである分配係数実験によって、適当な疎水基を同定することができる。この一般原理は、標準的な教科書、例えばC. Tanford(1980), The hydrophobic effect, Wiley, New York に記載されている。
疎水基は、脂肪族アシル基、特に炭素原子数12−22又は14−20の脂肪族アシル基でよく、これは直鎖状又は分枝状、飽和、モノ又はポリ不飽和でよく、場合により置換されてもよい。この例は、ミリストイル（テトラデカノイル）、パルミトイル（ヘキサデカノイル）、ステアロイル（オクタデカノイル）、及びアラキドイル（エイコサノイル）である。
【００１１】
疎水基の別の例は、界面活性剤中に一般的に見い出せるもの、例えば疎水性ポリマー基、例えば一般式R¹-(O-CHR²-CH₂)_nのポリアルコキシ又はアルキルポリアルコキシである。ただし前記式中、R¹はＨ又はC₁₄-C₂₂アルキルであり、R²はＨ又はメチルであり、そしてｎは10〜200 、例えば20〜100 である。
疎水基は、特には、脂肪分解酵素の脂質接触域内（WO 92/05249 に記載の通り）、又はその領域の境界から５Å以内のアミノ酸に連結されうる。
１，２又は３個の疎水基を含んでいる修飾された脂質分解酵素を、各々モノポッド、ジポッド又はトリポッドと呼ぶ。
【００１２】
共有結合
疎水基を、脂質分解酵素のアミノ酸配列内の、例えばアミノ基（リシン又はＮ末端）、チオール基（システイン残基）、ヒドロキシル基（セリン又はスレオニン）又はカルボキシル基（グルタミン酸、アスパラギン酸、又はＣ末端）に共有結合しうる。この共有結合を、当分野に既知の方法により行いうる。
従って、アミノ基との結合を、高pH（例えばpH８〜９）で、反応中間体、例えばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドにより活性化された脂肪酸、例えばステアロイル又はアラキドイル酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、又はマレイミドエステルを介して行いうる。
【００１３】
チオール基との結合を、pH6.5 〜７でマレイミドへの結合により、脂肪酸メタンチオスルホネートとの（例えばpH８での）反応により、又は、WO 91/16423, WO 98/23732若しくはWO 99/37323 の記載通りに行いうる。
カルボキシル基との結合を、WO 95/09909 の記載通りに疎水性アミンを結合することにより行いうる。
各酵素分子に結合された疎水基の数を確実に１〜３にするために、１つの方法として、１，２又は３個の注目する基（例えばアミノ又はチオール）を有するアミノ酸配列を有する脂質分解酵素を用いる。これを下記で説明する。
もう１つの方法は、平均して１〜３個の疎水基が各酵素分子に結合する様な結合反応条件（試薬量など）を選択することである。
【００１４】
アミノ酸配列
１〜３個の基を有する脂質分解酵素は、ある脂質分解酵素のアミノ酸配列を、部位特異的変異誘発法を用いた組換え技術により改変することによって得られた変異体でもよい。
Duncan et al. (1993) Anal. Biochem. 132, 68-73に記載の通りに化学反応により、チオール基を導入することもできる。
【００１５】
部位特異的変異誘発法を用いて、Ｎ末端をグルタミンに変え、そして発現後に、これを閉環によりピログルタメートに変換することにより、Ｎ末端アミノ基を除くことができる（Thiede B., Lamer S., Mattow J., Siejak F., Dimmler C., Rudel T., Jungblut PR., rapid communications in Mass spectroscopy, Vol. 14(6), pp. 496-502(2000) ）。糸状真菌においてピログルタメート含有ペプチドを発現させるために、糸状真菌Coprinus cinereus に由来するペルオキシダーゼのシグナルペプチド部分とＮ末端を用いることができるだろう。このペルオキシダーゼは、Ｎ末端としてピログルタメートを有する（Baunsgaard L., Dalboge H., Houen G., Rasmussen EM, Welinder KG., European journal of Biochemistry vol. 213(1) 605-611(1993) ）。
前記ペルオキシダーゼのＮ末端とその近接アミノ酸部分を、標準的な分子生物学的技術により、脂質分解酵素のＮ末端に付与することにより、Ｎ末端としてピログルタメートを有する変異体を作製することができる。
【００１６】
脂質分解酵素変異体
リシン又はシステインに関わるアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換により、アミノ基又はチオール基の数及び位置を変更する様に、脂質分解酵素の変異体を設計しうる。
リシン残基数の変更を、等電点をほとんど変化させないために、その他の荷電アミノ酸数の変更により釣り合わせうる。従って、リシンを、別の正荷電性アミノ酸（ヒスチジン又はアルギニン）により置換してよい。
【００１７】
１つの方法は、置換又は欠失によりいくつかのリシン残基を除去し、そして１〜３個のリシン残基をそのまま維持することである。従って、Humicola lanuginosa のリパーゼの６個のリシン残基のうち、K24, K98, K233のいずれか又は複数を保持しうる。
別の方法は、置換又は欠失により天然の脂質分解酵素の全てのリシン残基（及び場合によりＮ末端アミノ基）を除去し、そして脂質接触域内の選択された位置に、置換又は挿入により１，２又は３個のリシン残基を導入することである。
【００１８】
従って、Humicola菌類の脂質分解酵素において、存在するアミノ基を除去して、そしてHumicola lanuginosa のリパーゼの下記アミノ酸に対応する位置に、１〜３個のリシン残基を導入しうる：14，15，17−28，35−42，45，54−65，80−85，87−95，110−116，119，144−151，171−177，195−209，213−215，219，221−231，234，238，242−251，257−269、特には199，56，27，111，118，37，227，226，210，95，93，255，96，252，57又は211。同様に、真菌のクチナーゼにおいて、存在するアミノ基を除去して、そして、例えばI5K，V158K，D63K，N44K及び／又は R149Kに相当する置換により、１〜３個のリシン残基を導入しうる。この例は、I5K +V158K +D63K及びN44K +V158K +D63K である。
【００１９】
修飾された脂質分解酵素の使用
この修飾された脂質分解酵素を、当該酵素のために知られている任意の利用において、例えばベーキングにおいて、洗剤において、又は種々の処理のための固定化形として用いることができる。
ベーキング
生地、パン及びケーキの製造において、例えば、生地の安定性及び取扱いやすさを高めるために、パンの容積を増すために、あるいは、パン又はケーキの弾力性を改善するために、この修飾された脂質分解酵素を用いることができる。従って、この酵素を、パンの製造工程において用いることができ、この工程は、パンを製造するために、パン生地の成分にこの酵素を加え、その生地をこね、そして焼くことを含んでなる。US 4,567,046(Kyowa Hakko), JP-A 60-78529(QP Corp.), JP-A 62-111629(QP Corp.), JP-A 63-258528(QP Corp.), EP 426211(Unilever )又はWO 99/53769(Novo Nordisk )の記載と同様にして、これを行うことができる。
【００２０】
洗剤
当該脂質分解酵素（例えばリパーゼ）を、洗剤組成物中の添加剤として用いうる。この添加剤を、都合良くは非粉末性の顆粒、安定化した液体、スラリー又は保護化した酵素として製剤化する。この添加剤を、当分野に既知の方法により調製しうる。
リパーゼは、１回を超える洗浄サイクルの後に、最高の脂肪除去効果を発揮する傾向にある（Gormsen et al., Proceedings of the 3rd World Conference on Detergents, AOCS press, 1993, pp 198-203 ）。
【００２１】
固定化酵素
当該脂質分解酵素を、当分野に既知の方法により、例えば、ポリマーベースの担体上への吸着により、活性化されたポリマーベースの担体（例えばエポキシ又はアルデヒド）への共有結合により、そして顆粒化により、例えばWO 89/02916, WO 90/15868, WO 95/22606 又はWO 99/33964 に記載の通りに、固定化しうる。この固定化脂質分解酵素を、エステル交換、例えば水不溶性のカルボン酸エステル（例えばトリグリセリド）と、別のエステル、遊離の脂肪酸又はアルコールとのエステル交換のために用いうる。この固定化酵素を、エステル合成又はラセミ化合物の分割において用いることもできる。
【００２２】
洗剤組成物
本発明の洗剤組成物を、例えば、手洗濯用及び機械洗濯用洗剤組成物として、例えば洗濯用添加剤組成物、及び汚れた布地の前処理に適する組成物、リンス時に添加される布地用柔軟剤組成物、並びに、一般的な家庭用具表面の洗浄及び食器の洗浄のための組成物として調合しうる。
【００２３】
本発明の洗剤組成物は、本発明のリパーゼ及び界面活性剤を含んで成る。更に、場合により、これは、ビルダー、別の酵素、抑泡剤、柔軟剤、色移り防止剤、及び洗剤に通常用いられるその他の成分、例えば汚れ懸濁化剤、汚れ遊離剤、蛍光増白材、研磨剤、殺菌剤、変色防止剤、着色剤、及び／又は、封入化された、若しくは、されない香料を含んでもよい。
【００２４】
本発明の洗剤組成物は液体、ペースト、ゲル、棒又は顆粒の形であってよい。そのpH（使用濃度での水溶液において測定したもの）は、通常中性又はアルカリ性であり、例えば７〜11、特に９〜11である。本発明の顆粒組成物は「圧縮された形」でもよく、すなわちこれは、通常の顆粒洗剤よりもかなり高い密度、すなわち 550〜 950ｇ／ｌを有しうる。
【００２５】
本発明のリパーゼ、又は、場合により洗剤組成物中に組込まれる別の酵素は、標準的には、洗剤組成物中に、その組成物の重量に対して 0.00001〜２重量％、特に0.0001〜１重量％、更に特に 0.001〜 0.5重量％、更に特に0.01〜 0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで組込まれる。
【００２６】
本発明の洗剤組成物は、当該リパーゼを、洗剤１グラムあたり10〜 50000LU、特に20〜5000LU／ｇ、例えば 100〜1000LU／gに相当する量で含みうる。脂質分解酵素を、洗浄液１リットルあたり25〜 15000LU、特に 100〜5000LU／ｌ、例えば 300〜2000LU／ｌに相当する量で含んでいる洗浄液を生産する様に、この洗剤を水に溶解しうる。リパーゼタンパク質の量は、洗剤１グラムあたり 0.001〜10mg、又は洗浄液１リットルあたり 0.001〜 100mgでよい。
より詳しくは、本発明のリパーゼを、WO 97/04079, WO 97/07202, WO 97/41212, PCT/DK WO 98/08939 及び WO 97/43375に記載の通りに洗剤組成物中に組込みうる。
【００２７】
界面活性剤系
当該界面活性剤系は、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性、及び／又は両性イオン性の界面活性剤を含みうる。その界面活性剤系は、陰イオン性界面活性剤70〜 100重量％と非イオン性界面活性剤０〜30重量％との組合せ、特には陰イオン性界面活性剤80〜 100重量％と非イオン性界面活性剤０〜20重量％との組合せ、及び陰イオン性界面活性剤40〜70重量％と非イオン性界面活性剤30〜60重量％との組合せを含んで成りうる。
この界面活性剤は、典型的には、 0.1〜60重量％、例えば１〜40重量％、特には10〜40重量％、特には約３〜約20重量％のレベルで存在する。界面活性剤のいくつかの例を以下に示す。
【００２８】
陰イオン性界面活性剤
適当な陰イオン性界面活性剤には、アルキルスルフェート、アルキルエトキシスルフェート、線状アルキルベンゼンスルホネート、及びそれらの混合物が含まれる。
このアルキルスルフェート系界面活性剤は、式ROSO₃Mで表せる水溶性の塩又は酸である。ただし前記式中Ｒは、特には C₁₀〜C₂₄ のヒドロカルボイル、特には C₁₀〜C₂₀ のアルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくは C₁₂〜C₁₈ のアルキル又はヒドロキシアルキルであり、そしてＭは、水素又はカチオン、例えばアルキル金属カチオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム）、あるいはアンモニウム又は置換アンモニウムである。
アルキルベンゼンスルホネートは、適当な、特には線状（直鎖状）の、特にはアルキル基の炭素数が10〜18であるアルキルベンゼンスルホネート（LAS ）である。
【００２９】
適当な陰イオン性界面活性剤には、式RO(A)_mSO₃Mで表せる水溶性の塩又は酸であるアルキルアルコキシル化スルフェートがある。ただし前記式中Ｒは、 C₁₀〜C₂₄ の未置換アルキル又はヒドロキシアルキル基、特には C₁₂〜C₂₀ アルキル又はヒドロキシアルキル、より特には C₁₂〜C₁₈ のアルキル又はヒドロキシアルキルであり、Ａはエトキシ又はプロポキシであり、ｍは０より大きく、典型的には約0.5 〜約６であり、より特には約0.5 〜約３であり、そしてＭは、水素又はカチオン、例えば金属カチオン（例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウムなど）、あるいはアンモニウム又は置換アンモニウムカチオンである。ここではアルキルエトキシル化スルフェート及びアルキルプロポキシル化スルフェートが考えられる。置換アンモニウムカチオンの特定の例には、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオン、及び第四アンモニウムカチオン、例えばテトラメチルアンモニウム及びジメチルピペリジニウムカチオン、そしてアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミンに由来するもの、それらの混合物、及び類似物がある。
【００３０】
その他の陰イオン性界面活性剤には、石鹸の塩（例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、及び置換アンモニウムの塩、例えばモノ−、ジ−及びトリエタノールアミンの塩）、C₈〜C₂₂ の第一又は第二アルカンスルホネート、C₈〜C₂₄ のオレフィンスルホネート、アルカリ土類金属クエン酸塩の熱分解産物のスルホン化によって調製されるスルホン化ポリカルボン酸がある。
【００３１】
非イオン性界面活性剤
当該界面活性剤は、アルキルフェノールのポリアルキレンオキサイド（例えばポリエチレンオキサイド）縮合体を含みうる。そのアルキル基は約６〜約14の炭素原子を含み、直鎖又は分鎖状であってよい。そのエチレンオキサイドは、アルキルフェノール１モルあたり約２〜約25モルに相当する量で存在しうる。
当該界面活性剤は、また、第一及び第二脂肪族アルコールと約１〜約25モルのエチレンオキサイドとの縮合産物を含みうる。その脂肪族アルコールのアルキル鎖は直鎖でも分鎖でもよく、一般的には約８〜約22の炭素原子を含む。
【００３２】
更に、当該非イオン性界面活性剤は、アルキルフェノールのポリエチレンオキサイド縮合体、第一及び第二脂肪族アルコールと約１〜約25モルのエチレンオキサイドとの縮合産物、アルキル多糖、及びそれらの混合物、特には３〜15のエトキシル基を有するC₈〜C₁₄ のアルキルフェノールエトキシレート、及び２〜10のエトキシル基を有する C₈〜C₁₈（特には平均としてC₁₀ ）のアルコールエトキシレート、及びそれらの混合物を含みうる。
非イオン性界面活性剤の例は、アルコールエトキシレート、アルコールフェノールエトキシレート、ポリヒドロキシ脂肪酸アミド、アルキルポリグルコシド、及びそれらの混合物である。
【００３３】
実施例
実施例１：平均３個の疎水基を有する修飾されたリパーゼ
テトラデカノイル（C₁₄ ）及びヘキサデカノイル（C₁₆ ）基を各々、リポラーゼ（Humicola lanuginosa のリパーゼ）に共有結合することによって、修飾されたリパーゼを調製した。各リパーゼ分子は、７個のアミノ基（Ｎ末端と６個のリシン残基）を有し、そして平均３個の脂肪族アシル基が各分子に結合されていると推定された。
【００３４】
実施例２：３又は４個の疎水基を有する修飾されたリパーゼ
アミノ酸置換により、下記アミノ基を有する様に、リポラーゼの２つ変異体を調製した。その他のリシン残基をアルギニンにより置換した。
３アミノ基：Ｎ末端と、位置46及び98のリシン。
４アミノ基：Ｎ末端と、位置24，46及び98のリシン。
脂肪族アシル基（各々ミリストイル及びステアロイル）を、各変異体のアミノ基に共有結合した。
【００３５】
実施例３：２個の疎水基を有する修飾されたリパーゼ
リシン残基をアルギニンにより置換することにより、Ｎ末端及びリシン24に２つのアミノ基を有するリパーゼ変異体を得る様に、リポラーゼ変異体を調製した。
その変異体のアミノ基に下記の疎水基を結合することにより、４種類の修飾されたリパーゼを作製した。
ステアロイル；
C₁₈H₃₇-(O-CH₂-CH₂)₁₀₀；
C₁₈H₃₇-(O-CH₂-CH₂)₂₁ ；
アラキドイル。
同様の修飾されたリパーゼを、パルミトイル基に結合することにより作製することができる。
【００３６】
実施例４：修飾されたリパーゼの構築
ピログルタメート環化によりＮ末端アミノ基を除き、そしてアミノ酸置換により下記の位置にリシンを有する変異体を作製することにより、リポラーゼからモノポッド、ジポッド及びトリポッドを調製する。その他のリシン残基をアルギニンにより置換する。
モノポッド：位置98，211 又は 223のリシン残基
ジポッド：位置98と 233、又は96と 255のリシン残基
トリポッド：位置24と98と 223、又は57と96と 252のリシン残基
疎水基（脂肪族アシル又はポリプロピレン）を、各変異体の前記リシン残基に共有結合する。
【００３７】
実施例５：初回洗浄性能
前記の２つの修飾されたリパーゼを下記の通りに検査した。未修飾リポラーゼを、比較のために検査した。
本発明のいくつかの変異体を、陰イオン性界面活性剤中で検査した。実験条件は下記の通りであった。
【００３８】

【００３９】
評価：反射計により 460nmで反射率を測定した。その結果を、ΔＲ（反射率の差）＝（リパーゼを含む洗剤中で洗浄した布片の反射率）−（リパーゼを含まない洗剤中で洗浄した布片の反射率）として表す。
【００４０】
結果：

この結果は、明らかに、これらの修飾されたリパーゼが、向上した初回洗浄性能を有することを示している。
【００４１】
実施例６：ベーキング試験
パルミトイル基をHumicola lanuginosa のリパーゼに結合することにより、化学修飾されたリパーゼを調製した。各リパーゼ分子に平均２〜３個のアシル基が結合する様に、試薬の量を選択した。
この化学修飾されたリパーゼを、伝統的なヨーロッパ式の直接的な生地ベーキング手順において、未修飾リパーゼと比較した。
そのロールパンの容積及び形状を評価した。容積を、10個のロールパンの単純排除量により評価した。形状を、高さ／幅を測定することにより評価した。その結果は下記の通りであった。
【００４２】

この結果は、明らかに、この修飾リパーゼが、対照リパーゼの半分の濃度で、容積及び形状に関して向上した性能を有することを示している。

Claims

界面活性剤、及び２又は３個の、テトラデカノイル及びヘキサデカノイルから成る群より選ばれる疎水基を親のフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）のリパーゼに共有結合することにより化学的に修飾されたフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）のリパーゼを含む洗浄組成物。
前記の親のフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）のリパーゼが、２又は３個のアミノ基を有するアミノ酸配列を有し、かつそのアミノ基に前記テトラデカノイル及びヘキサデカノイルから成る群より選ばれる疎水基が共有結合された、請求項１記載の洗浄組成物。
請求項１又は２記載の洗浄組成物の製造方法であって、
ａ）アミノ、チオール、ヒドロキシ又はカルボキシ基の数及び／又は位置を変更する様に、親のフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）のリパーゼを改変すること、及び
ｂ）そのアミノ、チオール、ヒドロキシ又はカルボキシ基に、２又は３個のテトラデカノイル及びヘキサデカノイルから成る群より選ばれる疎水基を共有結合すること、
を含んでなる、方法。
２又は３個の、パルミトイルから成る疎水基を親のフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）のリパーゼに共有結合することにより化学的に修飾されたフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）のリパーゼを含む生地組成物。
前記の親のフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）のリパーゼが、２又は３個のアミノ基を有するアミノ酸配列を有し、かつそのアミノ基に前記パルミトイルから成る疎水基が共有結合された、請求項４記載の生地組成物。
請求項４又は５記載の生地組成物の製造方法であって、
ａ）アミノ、チオール、ヒドロキシ又はカルボキシ基の数及び／又は位置を変更する様に、親のフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa ）のリパーゼを改変すること、及び
ｂ）そのアミノ、チオール、ヒドロキシ又はカルボキシ基に、２又は３個のパルミトイルから成る疎水基を共有結合すること、
を含んでなる、方法。