JP4846160B2 - ナイセリア属のタンパク質のハイブリッド発現 - Google Patents
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Description
【０００１】
本明細書に引用される全ての文献は、その全体において参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、タンパク質発現の分野に存在する。特に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、または好ましくはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のタンパク質の異種発現に関する。
【０００３】
（背景技術）
国際特許出願ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０およびＷＯ００／２２４３０は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質を開示する。これらのタンパク質は、Ｎ末端ＧＳＴ融合物またはＣ末端Ｈｉｓタグ融合物のいずれかとして、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現される（すなわち、異種発現）ように、典型的に記載されるが、他の発現系（ネイティブのＮｅｉｓｓｅｒｉａでの発現を含む）もまた開示される。
【０００４】
これらのタンパク質の異種発現のための代替的かつ改善されたアプローチを提供することが本発明の目的である。これらのアプローチは、典型的に発現レベル、精製の容易さ、発現の細胞内局在、および／または発現タンパク質の免疫学的特性に影響する。
【０００５】
（発明の開示）
本発明にしたがって、２つ以上（例えば、３，４，５，６、またはそれ以上）の本発明のタンパク質が、単一のハイブリッドタンパク質として発現される。非ナイセリア属融合パートナー（例えば、ＧＳＴまたはポリＨｉｓ）が使用されないことが好ましい。
【０００６】
これは、２つの利点を提供する。第１に、それ自体では不安定またはほとんど発現され得ないタンパク質は、その問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することによって支援され得る。第２に商業生産が簡素化される（２つの別個に有用なタンパク質を生成するために、たった１つの発現および精製しか使用される必要がない）。
【０００７】
したがって、本発明は、２つ以上の本発明のタンパク質の同時異種発現のための方法を提供し、この方法において、その２つ以上の本発明のタンパク質は融合される（すなわち、それらは、単一ポリペプチド鎖として翻訳される）。
【０００８】
この方法は、典型的に以下の工程を含む：本発明の第１のタンパク質をコードする第１の核酸を得る工程；本発明の第２のタンパク質をコードする第２の核酸を得る工程；その第１の核酸と第２の核酸とを連結する工程。生じた核酸は、発現ベクターに挿入され得るか、または既に発現ベクターの一部であり得る。
【０００９】
ちょうど２つのタンパク質が連結される場合、そのハイブリッドタンパク質は、単に式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−ＣＯＯＨによって示され得る。ＡおよびＢは、それぞれ任意のナイセリア属タンパク質から、そして特に配列番号１〜４３２６によって示されるものから選択され得る。この方法は、タンパク質ｏｒｆ１、ｏｒｆ４、ｏｒｆ２５、ｏｒｆ４０、Ｏｒｆ４６／４６．１、ｏｒｆ８３、２３３、２８７、２９２Ｌ、５６４、６８７、７４１、９０７、９１９、９５３、９６１、および９８３の発現によく適している。
【００１０】
式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−ＣＯＯＨの以下の表における「Ｘ」によって示される４２個のハイブリッドが好ましい：
【００１１】
【表１】
したがって、ハイブリッドとして発現される好ましいタンパク質は、ＯＲＦ４６．１、２８７、７４１、９１９、９５３、９６１および９８３である。これらは、基本的に全長の形において使用され得るか、またはポリグリシン欠損（ΔＧ）形態が使用され得る（例えば、ΔＧ−２８７、ΔＧＴｂｐ２、ΔＧ７４１、ΔＧ９８３など）か、または短縮型が使用され得る（例えば、Δ１〜２８７、Δ２〜２８７などか、またはドメイン欠損バージョンが使用され得る（例えば、２８７Ｂ、２８７Ｃ、２８７ＢＣ、ＯＲＦ４６１〜４３３、ＯＲＦ４６４３３〜６０８、ＯＲＦ４６、９６１ｃなど）。
【００１２】
特に好ましいものは、以下である：（ａ）９１９および２８７を含むハイブリッドタンパク質；（ｂ）９５３および２８７を含むハイブリッドタンパク質；（ｃ）２８７およびＯＲＦ４６．１を含むハイブリッドタンパク質；（ｄ）ＯＲＦ１およびＯＲＦ４６．１を含むハイブリッドタンパク質；（ｅ）９１９およびＯＲＦ４６．１を含むハイブリッドタンパク質；（ｆ）ＯＲＦ４６．１および９１９を含むハイブリッドタンパク質；（ｇ）ＯＲＦ４６．１、２８７および９１９を含むハイブリッドタンパク質；（ｈ）９１９および５１９を含むハイブリッドタンパク質；および（ｉ）ＯＲＦ９７および２２５を含むハイブリッドタンパク質。
【００１３】
さらなる実施形態が、図面において示され、そして以下を含む：
【００１４】
【表２】
２８７が使用される場合それは、ハイブリッドのＣ末端にあるのが好ましい；これがＮ末端で使用される場合、２８７ΔＧ形態の使用が好ましい（例えば、ＯＲＦ４６．１、９１９、９５３、または９６１とのハイブリッドのＮ末端として）。
【００１５】
２８７が使用される場合、これは、２９９６株または３９４／９８株由来であることが好ましい。
【００１６】
９６１が使用される場合、これは、Ｎ末端にあることが好ましい。９６１のドメイン形態が使用され得る。
【００１７】
ＯＲＦ４６、２８７、９１９、および９５３の多型形態のアライメントが、ＷＯ００／６６７４１において開示される。これらの多型のいずれもが本発明に従って使用され得る。
【００１８】
好ましくは、本発明に従うハイブリッドタンパク質における構成タンパク質（ＡおよびＢ）は、同じ株由来である。
【００１９】
このハイブリッドにおける融合されたタンパク質は、直接連結され得るか、またはリンカーペプチド（例えば、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｎ（ここでｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である）））またはクローングを容易にする短いペプチド配列を介して連結され得る。ポリグリシンリンカーのＣ末端にΔＧタンパク質を結合しないことが明らかに好ましい。
【００２０】
この融合タンパク質は、ネイティブのリーダーペプチドを欠き得るか、またはＮ末端融合パートナーのリーダーペプチド配列を含み得る。
【００２１】
（宿主）
異種宿主を利用することが好ましい。その異種宿主は、原核生物であってもまたは真核生物であってもよい。その異種宿主は、適切なＥ．ｃｏｌｉであるが、他の好ましい宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられる。
【００２２】
（ベクター、宿主など）
上記の方法と同様に、本発明は、以下を提供する：（ａ）これらの方法に有用な核酸およびベクター、（ｂ）上記ベクターを含む宿主細胞、（ｃ）上記方法によって発現されたタンパク質または発現可能なタンパク質、（ｄ）これらのタンパク質を含む組成物であり、例えばワクチン、または診断試薬または免疫原性の組成物として適切であり得る組成物、（ｅ）医薬（例えば、ワクチン）または診断試薬としての使用のためのこれらの組成物（ｆ）以下の（１）〜（３）の製造においてのこれらの組成物の使用：（１）ナイセリア属細菌に起因する感染の処置または予防のための医薬、（２）ナイセリア属細菌の存在の検出またはナイセリア属細菌に対して惹起される抗体の存在の検出のための診断試薬、および／または（３）ナイセリア属細菌に対する抗体を惹起し得る試薬、および（ｇ）患者の処置方法であって、これらの組成物の治療的有効量を患者に投与する工程を含む方法。
【００２３】
（配列）
本発明はまた、以下の実施例に示されるいずれかの配列を有するタンパク質または核酸を提供する。本発明はまた、これらに対する配列同一性を有するタンパク質および核酸も提供する。上記のように、「配列同一性」の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。
【００２４】
（本明細書の用語）
ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、およびＷＯ９９／５７２８０に開示される２１６６個のタンパク質配列は、本明細書において以下の配列番号により言及される：
【００２５】
【表３】
この配列番号の番号付けに加えて、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、およびＷＯ９９／５７２８０において使用される命名規則もまた使用される（例えば、ＷＯ９９／２４５７８およびＷＯ９９／３６５４４において使用されるような「ＯＲＦ４」、「ＯＲＦ４０」、「ＯＲＦ４０−１」など；ＷＯ９９／５７２８０において使用されるような「ｍ９１９」、「ｇ９１９」、および「ａ９１９」など）。
【００２６】
Ｔｅｔｔｅｌｉｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９〜１８１５）に由来する２１６０個のタンパク質ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０は、配列番号２１６７〜４３２６として本明細書にて呼ばれる（ＷＯ００／６６７９１もまた参照）。
【００２７】
本明細書で使用される用語「本発明のタンパク質」は、以下を含むタンパク質をいう：
（ａ）配列番号１〜４３２６の配列の１つ；または
（ｂ）配列番号１〜４３２６の１つに対して配列同一性を有する配列；または
（ｃ）配列番号１〜４３２６の１つのフラグメント。
【００２８】
（ｂ）において言及される「配列同一性」の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。これは、変異体および対立遺伝子改変体（例えば、ＷＯ００／６６７４１を参照のこと）を含む。同一性は、好ましくは、パラメーター（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１２，およびｇａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１）でのを用いるａｆｆｉｎｅ ｇａｐ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。代表的には、２つのタンパク質の間の５０％以上の同一性は、機能的等価物であることの指標であると考えられる。
【００２９】
（ｃ）において言及される「フラグメント」は、配列番号１〜４３２６の１つからの少なくともｎ個の連続したアミノ酸を含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）である。好ましくは、このフラグメントは、配列番号１〜４３２６の１つからのエピトープを含む。好ましいフラグメントは、ＷＯ００／７１５７４およびＷＯ０１／０４３１６に開示されるフラグメントである。
【００３０】
本発明の好ましいタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂにおいて見出される。
【００３１】
本発明に従う使用に好ましいタンパク質は、血清型Ｂ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２９９６株または３９４／９８株（ニュージーランド株）のタンパク質である。他のように言及のない限り、本明細書において言及されるタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ２９９６株由来である。しかし、本発明が一般的に、株により限定されないことが理解される。特定のタンパク質（例えば、「２８７」、「９１９」など）についての言及は、任意の株由来のそのタンパク質を含むと受け取られ得る。
【００３２】
「核酸」に対する言及が、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むこと、そしておよびこれらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むもの）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）なども含むことが理解される。
【００３３】
（本発明の実施様式）
（実施例１ ＯＲＦ４６のハイブリッド）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清型Ｂ、２９９６株）由来の完全なＯＲＦ４６タンパク質は、以下の配列を有する：
【００３４】
【表４】
リーダーペプチドは下線が引かれている。
【００３５】
他の株由来のＯＲＦ４６の配列が、ＷＯ００／６６７４１に見出され得る。
【００３６】
ＯＲＦ４６を、そのＣ末端およびＮ末端において、２８７、９１９およびＯＲＦ１と、融合した。このハイブリッドタンパク質は、一般に不溶性であったが、（同種の２９９６株に対して）いくつか良好なＥＬＩＳＡおよび殺菌成績を与えた：
【００３７】
【表５】
比較のために、ＯＲＦ４６．１、２８７（ＧＳＴ融合物としてかまたはΔＧ２８７形態においてのいずれか）、および９１９の「三重」ハイブリッドを構築し、そして種々の株（同種の２９９６株を含む）に対して、この３つの抗原の単純混合物と対比して試験した。ＦＣＡをアジュバントとして用いた：
【００３８】
【表６】
また、このハイブリッドは、等価であるかまたは優れた免疫学的活性を示す。
【００３９】
２つのタンパク質（２９９６株）のハイブリッドを、種々の異種株に対して、個々のタンパク質と比較した。
【００４０】
【表７】
また、このハイブリッドは、等価であるかまたは優れた免疫学的活性を示す。
【００４１】
（実施例２ ΔＧ２８７のハイブリッド）
２８７における（Ｇｌｙ）６配列の欠失は、タンパク質発現に対して劇的な影響を有することが見出された。ＧＧＧＧＧＧまでのＮ末端アミノ酸を欠くこのタンパク質は、「ΔＧ２８７」と呼ばれる。ＭＣ５８株において、この基本配列（下線部のリーダーペプチド）は：
【００４２】
【表８】
である。Ｈｉｓタグを有するかまたは有さないΔＧ２８７（それぞれ「ΔＧ２８７−Ｈｉｓ」および「ΔＧ２８７Ｋ」）は、「２８７−Ｈｉｓ」または「２８７タグなし」に比較して非常によいレベルで発現される。
【００４３】
遺伝子変動性データに基づいて、多くのＭｅｎＢ株（特に２９９６株、ＭＣ５８株、１０００株、およびＢＺ２３２株）由来のΔＧ２８７−Ｈｉｓの改変体をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現した。この結果もまた、良かった（つまり、これらのそれぞれが、高いＥＬＩＳＡ力価を与え、そしてまた８１９２より大きい血清殺菌力価を与えた。ｐＥＴ−２４ｂから発現されたΔ２８７Ｋは、ＥＬＩＳＡおよび血清殺菌アッセイにおいて優れた力価を与えた）。
【００４４】
ポリＧｌｙ配列の欠失もまた、Ｔｂｐ２（ＮＭＢ０４６０）、７４１（ＮＭＢ１８７０）および９８３（ＮＭＢ１９６９）に適用可能である。リーダーペプチドをコードする配列を含まず、そしてポリＧｌｙを伴わず（すなわち、「ΔＧ形態」として）ｐＥＴベクターにクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた場合、同じ効果が観察された（ポリグリシンストレッチの欠失を保有するクローンにおいて、発現は良好であり、そしてこのグリシンが発現タンパク質中に存在する場合は、発現は乏しいかまたは存在しなかった）。
【００４５】
ΔＧ２８７を、９１９、９５３、９６１の上流に直接インフレーム融合し、（以下に配列を示す）、およびＯＲＦ４６．１の上流に直接インフレーム融合した。
【００４６】
【表９】
【００４７】
【表１０】
このハイブリッドタンパク質に対して惹起された抗体の殺菌効力（同種株）を、９１９およびＯＲＦ４６．１に対する成分抗原（２８７−ＧＳＴを使用）の単純混合物に対し惹起された抗体と比較した：
【００４８】
【表１１】
異種ＭｅｎＢ株および血清型Ａおよび血清型Ｃに対しての殺菌活性についてのデータもまた得た：
【００４９】
【表１２】
従って、Ｎ末端でのΔＧ２８７とのハイブリッドタンパク質は、免疫学的に単純混合物より優れており、ΔＧ２８７−ＯＲＦ４６．１が特に効果的であり、異種株に対してさえも効果的である。ΔＧ２８７−ＯＲＦ４６．１は、ｐＥＴ−２４ｂにおいて発現され得る
同じハイブリッドタンパク質を２９９６ではなくニュージーランド株３９４／９８を用いて作製した：
【００５０】
【表１３】
（実施例３ ΔＧ９８３のハイブリッド）
タンパク質９８３は、以下の配列を有する：
【００５１】
【表１４】
従って、ΔＧ９８３は、以下の基本配列を有する：
【００５２】
【表１５】
ΔＧ９８３は、そのＣ末端でのＯＲＦ４６．１、７４１、９６１、または９６１ｃを伴うハイブリッドとして発現された：
【００５３】
【表１６】
（実施例４−ΔＧ７４１のハイブリッド）
タンパク質７４１は以下の配列を有する：
【００５４】
【表１７】
従って、ΔＧ７４１は、以下の塩基配列を有する：
【００５５】
【表１８】
ΔＧ７４１を、タンパク質９６１、９６１ｃ、９８３およびＯＲＦ４６．１の上流にインフレームで直接融合した。
【００５６】
【表１９】
（実施例５−２８７のハイブリッド）
Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するか、またはそのリーダーペプチドを有さないがＣ末端Ｈｉｓタグを有する全長としての２８７の発現は、かなり低い発現レベルを示す。より良い発現は、Ｎ末端ＧＳＴ融合物を用いて達成される。Ｎ末端融合物のパートナーとしてＧＳＴを用いる代替として、２８７を、タンパク質９１９（「９１９−２８７」）、タンパク質９５３（「９５３−２８７」）およびタンパク質ＯＲＦ４６．１（「ＯＲＦ４６．１−２８７」）のＣ末端に配置した。いずれ場合においても、リーダーペプチドを除去し、そしてハイブリッドは直接的なインフレーム融合物であった。
【００５７】
９５３−２８７ハイブリッドを生成するために、この２つのタンパク質のリーダーペプチドを、各配列のリーダーから下流への順方向プライマーを設計することによって除外し；終止コドン配列を、９５３逆方向プライマーにおいて除いたが、２８７逆方向プライマーにおいて含有された。９５３遺伝子について、増幅のために使用した５’および３’プライマーは、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ含み、一方、２８７遺伝子の増幅について、５’および３’のプライマーは、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位をそれぞれ含んだ。このように、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ（第一の遺伝子をクローン化するために）および引き続いてＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ（第二の遺伝子をクローン化するために）を使用して、ｐＥＴ２１＋における２つの遺伝子の連続方向クローニングを達成し得た。
【００５８】
９１９−２８７ハイブリッドを、２８７の成熟部分をコードする配列を、ｐＥＴ２１ｂ＋における９１９−Ｈｉｓクローンの３’末端のＸｈｏＩ部位にクローニングすることによって得た。２８７遺伝子の増幅のために使用するプライマーを、そのＰＣＲフラグメントの５’側にＳａｌＩ制限部位および３’側にＸｈｏＩ部位を導入するために設計した。ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ制限酵素によって生じた付着末端は適合性を有するため、ＳａｌＩ−ＸｈｏＩを用いて消化した２８７ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩを用いて切断したｐＥＴ２１ｂ−９１９クローン中に挿入し得た。
【００５９】
ＯＲＦ４６．１−２８７ハイブリッドを同様に得た。
【００６０】
ハイブリッドタンパク質に対して惹起した抗体の殺菌性効力（同種株）を、その成分抗原の単純な混合物に対して惹起した抗体と比較した：
【００６１】
【表２０】
異種ＭｅｎＢ株ならびに血清型ＡおよびＣに対する殺菌性活性に関するデータもまた、９１９−２８７および９５３−２８７について得た：
【００６２】
【表２１】
ＯＲＦ４６．１および９１９のハイブリッドもまた構築した。最良の結果（４倍高い力価）を、Ｎ末端側で９１９を用いて達成した。
【００６３】
ハイブリッド９１９−５１９Ｈｉｓ、ＯＲＦ９７−２２５Ｈｉｓおよび２２５−ＯＲＦ９７Ｈｉｓもまた試験した。これらは、中程度のＥＬＩＳＡ力価および殺菌性抗体応答を示した。
【００６４】
２つのタンパク質ＡおよびＢのハイブリッドは、ＮＨ２−Ａ−Ｂ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−Ｂ−Ａ−ＣＯＯＨのいずれかであるので、Ｎ末端側に２８７を有する「逆」ハイブリッドもまたΔＧ２８７を使用して作製した。同種株２９９６を含むＡパネルの株を使用した。ＦＣＡ株をアジュバントとして使用した：
【００６５】
【表２２】
より良い殺菌性力価は、一般に、Ｎ末端側で２８７を用いて確認される。
【００６６】
タンパク質９６１に融合した場合、［ＮＨ２−ΔＧ２８７−９６１−ＣＯＯＨ−上記の配列］、得られるタンパク質は、不溶性であり、そして精製のために変性および再生されなければならない。再生後、約５０％のタンパク質が、不溶性のまま見出された。可溶性および不溶性タンパク質を比較し、そしてさらに良い殺菌性力価を、可溶性タンパク質（アジュバントとしてＦＣＡ）を用いて得た：
【００６７】
【表２３】
しかし、不溶性形態での力価は、ミョウバンアジュバントを代わりに用いることによって改善された：
【００６８】
【表２４】
９６１ｃをまた、ハイブリッドタンパク質において使用した（上記を参照のこと）。９６１およびそのドメイン改変体は、効率的な発現を指向するので、それらは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端部分として理想的に適する。
【００６９】
（実施例２３−さらなるハイブリッド）
本発明のさらなるハイブリッドタンパク質を図面に示し、そしてそれらは以下に示す配列を有する。個々のタンパク質と比較した場合、これらは有益である：
【００７０】
【表２５】
本発明は、例示目的でのみ記載され、そして本発明の範囲および精神内にある限りは改変がなされ得ることが理解される。例えば、他の株由来のタンパク質の使用が想定される［例えば、ＯＲＦ４、ＯＲＦ４０、ＯＲＦ４６、２２５、２３５、２８７、５１９、７２６、９１９および９５３の多型配列については、ＷＯ００／６６７４１を参照のこと］。
【００７１】
（実験の詳細）
（クローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチド設計）
目的の抗原をコードする遺伝子を、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ ＭＣ５８のゲノム配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドを使用する、ＰＣＲによって増幅した。他に示されない限り、２９９６株由来のゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ反応におけるテンプレートとして常に使用し、そしてその増幅したフラグメントを、発現ベクターのｐＥＴ２１ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化して、Ｃ末端Ｈｉｓタグ化産物としてタンパク質を発現させるか、またはｐＥＴ−２４ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化して、「非タグ化」形態（例えば、ΔＧ ２８７Ｋ）のタンパク質を発現させた。
【００７２】
タンパク質を、融合パートナーを伴わずにそれ自体のリーダーペプチド（存在する場合）を伴って発現させる場合、オープンリーディングフレーム（ＡＴＧコドン〜終止コドン）の増幅を行った。
【００７３】
タンパク質を「非タグ化」形態で発現させる場合、そのリーダーペプチドを、推定リーダー配列から下流の５’末端の増幅プライマーを設計することによって除外した。
【００７４】
ＰＣＲに使用されたプライマーの融解温度は、プライマー全体のハイブリダイズするヌクレオチドの数および型に依存し、そして以下の式を使用して決定した：
Ｔｍ１＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ） （テールを除外）
Ｔｍ２＝６４．９＋０．４１（％ＧＣ）−６００／Ｎ （プライマー全体）。
【００７５】
選択したオリゴヌクレオチドの融解温度は、オリゴ全体について通常６５〜７０℃であり、そしてハイブリダイズ領域単独では５０〜６０℃であった。
【００７６】
オリゴヌクレオチドを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて合成し、２．０ｍｌのＮＨ４ＯＨ中でカラムから溶出し、そして５６℃での５時間のインキュベートにより脱保護した。これらのオリゴを、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノールの添加によって沈殿させた。このサンプルを遠心分離し、そしてそのペレットを水に再懸濁した。
【００７７】
【表２６】
＊このプライマーを、Ｈｉｓタグに対する２８７の全てのＣ末端融合物のための逆方向プライマーとして使用した。
【００７８】
§２８７−Ｈｉｓ逆方向プライマーと組み合わせて使用した順方向プライマー。
【００７９】
ＮＢ−全ＰＣＲ反応は、他に規定がない限り、２９９６株（例えば、ＮＣ５８株）を使用した。
【００８０】
その後ろに特有のＮｈｅＩ部位がないＡＴＧで開始する全ての構築物において、そのＡＴＧコドンは、クローニングのために使用されるＮｄｅＩ部位の一部分である。５’末端のクローニング部位としてＮｈｅＩを用いて作製した構築物（例えば、Ｎ末端に２８７を含む全ての構築物）は、抗原のコード配列に融合された２つのさらなるコドン（ＧＣＴＡＧＣ）を有する。
【００８１】
（染色体のＤＮＡテンプレートの調製）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株 ２９９６、ＭＣ５８、３９４．９８、１０００およびＢＺ２３２（ならびに他の株）を、１００ｍｌのＣＧ培地中に対数期まで増殖し、遠心分離によって収集し、そして５ｍｌの緩衝液（２０％ ｗ／ｖスクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁した。氷上で１０分間のインキュベーション後、この細菌を１０ｍｌの溶解溶液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ Ｎａ−Ｓａｒｋｏｓｙｌ、５０μｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）を添加することによって溶解し、そしてこの懸濁液を、３７℃で２時間インキュベートした。２回のフェノール抽出（ｐＨ８に平衡化した）および１回のＣＨＣｌ３／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行った。ＤＮＡを、０．３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノールの添加によって沈殿させ、そして遠心分離によって収集した。このペレットを、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで一回洗浄し、そして４．０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再溶解した。ＤＮＡ濃度を、ＯＤ２６０の読み取りによって測定した。
【００８２】
（ＰＣＲ増幅）
この標準ＰＣＲプロトコルは以下の通りであった：２９９６、ＭＣ５８１０００もしくはＢＺ２３２株由来の２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、または組換えクローンの１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ調製物を、４０μＭの各オリゴヌクレオチドプライマー、４００〜８００μＭのｄＮＴＰ溶液、１×ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）、２．５ユニットのＴａｑＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡｍｐｌｉＴａＱ、Ｂｏｅｒｈｉｎｇｈｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｎ ＥｘｐａｎｄＴＭ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ）の存在下でテンプレートとして使用した。
【００８３】
全混合物を９５℃で予め３分間インキュベーションした後に、各サンプルを、二工程増幅に供した：最初の５サイクルを、プライマーの制限酵素のテールを除外したハイブリダイゼーション温度（Ｔｍ１）を使用して行った。これに続いて、全長オリゴについて算出されたハイブリダイゼーション温度（Ｔｍ２）によって３０サイクルを行った。伸長時間（６８℃または７２℃で行う）は、増幅されるＯｒｆの長さによって変化した。Ｏｒｆ１の場合において、伸長時間は、３分から開始して、各サイクル１５秒で減少した。このサイクルは、７２℃での１０分間の伸長によって完了した。
【００８４】
この増幅したＤＮＡを、１％アガロースゲルに直接ロードした。正確なサイズのバンドに対応するＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、製造業者のプロトコルに従ってゲルから精製した。
【００８５】
（ＰＣＲフラグメントおよびクローニングベクターの消化）
増幅したフラグメントに対応する精製したＤＮＡを、ｐＥＴ−２１ｂ＋、ｐＥＴ−２２ｂ＋またはｐＥＴ−２４ｂ＋へのクローニングに適切な制限酵素を用いて消化した。消化したフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを（製造業者の指示に従って）使用して精製し、そして、Ｈ２Ｏまたは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）のいずれかで溶出した。プラスミドベクターを適切なこれらの制限酵素を用いて消化し、１％アガロースゲルにロードし、そして消化したベクターに対応するバンドを、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。
【００８６】
（クローニング）
予め消化および精製した、各遺伝子に対応するフラグメントを、ｐＥＴ２１ｂ＋、ｐＥＴ２２ｂ＋またはｐＥＴ２４ｂ＋中に連結した。３：１のモル比のフラグメント／ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと共に、製造業者によって供給される連結緩衝液中で用いた。
【００８７】
組換えプラスミドを、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５またはＨＢ１０１中に、連結反応溶液および細菌を氷上で４０分間インキュベートし、次いで３７℃にて３分間インキュベートすることによって、形質転換した。これに続いて、８００μｌのＬＢブロスを添加し、そして３７℃にて２０分間インキュベートした。細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの微量遠心機において最大速度で遠心分離し、約２００μｌの上清に再懸濁し、そしてＬＢアンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）寒天上にプレートした。
【００８８】
組換えクローンのスクリーニングを、無作為に選択したコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた４．０ｍｌのＬＢブロスにおいて３７℃で一晩増殖させて行った。細胞をペレットにし、そしてＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを製造業者の指示に従って使用して、プラスミドＤＮＡを抽出した。約１μｇの各々個々のミニプレップを、適切な制限酵素を用いて消化し、そして消化物を、１〜１．５％アガロースゲル（予想されるインサートサイズに依存する）に、分子量マーカー（１ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＧＩＢＣＯ）と並行してロードした。陽性クローンを、インサートのサイズに基づいて選択した。
【００８９】
（発現）
各遺伝子を発現ベクター中にクローニングした後、組換えプラスミドを、組換えタンパク質の発現に適したＥ．ｃｏｌｉ株中に形質転換した。各構築物の１μｌを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３を、上記のように形質転換した。単一の組換えコロニーを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）を加えた２ｍｌのＬＢに播種し、３７℃で一晩でインキュベートし、次いで、１００ｍｌのフラスコ中でＡｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）を加えた２０ｍｌのＬＢ中に１：３０で希釈し、０．１と０．２との間のＯＤ６００を得た。このフラスコを、ＯＤ６００が発現の誘導に適した対数増殖を示すまで（０．４〜０．８のＯＤ）、回転型水浴振とう機中で３０℃または３７℃でインキュベートした。タンパク質発現を、１．０ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって誘導した。３０℃または３７℃での３時間のインキュベーションの後、ＯＤ６００を測定し、そして発現を試験した。１．０ｍｌの各サンプルを微量遠心機で遠心分離し、ペレットをＰＢＳ中で再懸濁し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって分析した。
【００９０】
（Ｈｉｓタグ化タンパク質の精製）
２８７の種々の形態を、２９９６およびＭＣ５８株からクローン化した。それらは、Ｃ末端Ｈｉｓタグ化融合物と共に構築され、そしてそれらは、成熟形態（アミノ酸１８〜４２７）、欠失（Δ１、Δ２、Δ３およびΔ４）を伴う構築物ならびにＢドメインまたはＣドメインのいずれかから構成されるクローンを含んだ。Ｈｉｓ融合物として精製される各クローンについて、単一のコロニーをストリークし、そしてＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）寒天プレート上で３７℃にて一晩増殖させた。このプレートから単離されたコロニーを、２０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）液体培地中に播種し、そして攪拌しながら３７℃で一晩増殖させた。この一晩培養物を、１．０ＬのＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）液体培地中に１：３０で希釈し、そしてＯＤ５５０が０．６〜０．８に達するまで最適な温度（３０〜３７℃）で増殖させた。組換えタンパク質の発現をＩＰＴＧの添加（最終濃度１．０ｍＭ）によって誘導し、そして培養物をさらに３時間インキュベートした。細菌を、８０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離することによって回収した。細菌のペレットを、（ｉ）可溶性タンパク質のための冷却緩衝液Ａ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸緩衝液、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）または（ｉｉ）不溶性タンパク質のための緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ８．８および必要に応じて８Ｍの尿素）のいずれかの７．５ｍｌ中に再懸濁した。可溶性形態において精製されたタンパク質には、２８７−Ｈｉｓ、Δ１、Δ２、Δ３およびΔ４２８７−Ｈｉｓ、Δ４２８７ＭＣ５８−Ｈｉｓ、２８７ｃ−Ｈｉｓならびに２８７ｃＭＣ５８−Ｈｉｓが含まれた。タンパク質２８７ｂＭＣ５８−Ｈｉｓは、不溶性であり、従って精製した。細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０を使用し、氷上で、３０秒間、４０Ｗでの４回の超音波処理により破砕し、そして４℃で３０分間、１３０００×ｇで遠心分離した。不溶性タンパク質について、ペレットを２．０ｍｌ 緩衝液Ｃ（６Ｍ 塩酸グアニジン、１００ｍＭ リン酸緩衝液、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｉｓ、ｐＨ７．５）中に再懸濁し、そしてダンス型ホモジナイザー中に１０回通して処理した。このホモジネートを、１３０００ｇで３０分間遠心分離し、そして上清を保持した。可溶性および不溶性調製物の両方についての上清を、１５０μｌのＮｉ２＋−樹脂（適切なように、緩衝液Ａまたは緩衝液Ｂのいずれかで予め平衡化した）と混合し、そして３０分間穏やかに撹拌をしながら、室温でインキュベートした。この樹脂は、製造者プロトコルに従って調製された、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）であった。このバッチ式調製物を、７００ｇで５分間、４℃で遠心分離し、そして上清を破棄した。この樹脂を１０ｍｌの緩衝液Ａまたは緩衝液Ｂを用いて１０分間、２回洗浄し（バッチ式）、１ｍｌの緩衝液ＡまたはＢ中に再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を、（ｉ）４℃で緩衝液Ａを、または（ｉｉ）室温で緩衝液Ｂを用いて、フロースルーのＯＤ２８０が０．０２〜０．０１に達するまで洗浄し続けた。この樹脂を、（ｉ）冷却緩衝液Ｃ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸緩衝液、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）または（ｉｉ）緩衝液Ｄ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．３および必要に応じて８Ｍの尿素）のいずれかで、フロースルーのＯＤ２８０が０．０２〜０．０１に達するまでさらに洗浄した。このＨｉｓ融合タンパク質を、（ｉ）冷却溶出緩衝液Ａ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸緩衝液、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）または（ｉｉ）溶出緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ４．５および必要に応じて８Ｍの尿素）のいずれかの７００μｌを添加することによって溶出し、そしてＯＤ２８０が全ての組換えタンパク質が得られたことを示すまで、画分を回収した。各溶出画分の２０μｌのアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイを用いて評価した。
【００９１】
（変性したＨｉｓ融合タンパク質の再生）
２８７ｂＭＣ８を可溶化するために変性が必要とされるので、免疫の前に再生工程を用いた。グリセロールを、上記で得られた変性した画分に添加し、１０％ ｖ／ｖの最終濃度を得た。このタンパク質を透析緩衝液Ｉ（１０％ ｖ／ｖ グリセロール、０．５Ｍ アルギニン、５０ｍＭ リン酸緩衝液、５．０ｍＭ 還元型グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン、２．０Ｍ 尿素、ｐＨ８．８）を使用して２００μｇ／ｍｌに希釈し、そして同じ緩衝液に対して、４℃で１２〜１４時間透析した。さらなる透析を、緩衝液ＩＩ（１０％ ｖ／ｖ グリセロール、０．５Ｍ アルギニン、５０ｍＭ リン酸緩衝液、５．０ｍＭ 還元型グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン、ｐＨ８．８）を用いて４℃で１２〜１４時間実行した。タンパク質濃度を、以下の式を用いて推定した：
タンパク質（ｍｇ／ｍｌ）＝（１．５５×ＯＤ２８０）−（０．７６×ＯＤ２６０）
（免疫化）
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、０日目、２１日目および３５日目に抗原で免疫し、そして血清を、４９日目に分析した。
【００９２】
（血清分析−ＥＬＩＳＡ）
無莢膜化Ｍｅｎ Ｍ７および莢膜化株を、チョコレートアガープレートにプレートし、そして５％ＣＯ２で３７℃において一晩インキュベーションした。細菌のコロニーを、滅菌ドラコン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを使用してアガープレートから回収し、そして０．２５％のグルコースを含むＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）に播種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ６２０を追跡することによりモニターした。ＯＤが０．４〜０．５の値に達するまで増殖させた。この培養物を、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この上清を捨て、そして細菌を、ＰＢＳで２回洗浄し、０．０２５％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に懸濁し、そして３７℃で１時間インキュベーションし、次いで攪拌しながら４℃で一晩インキュベーションした。１００μｌの細菌細胞を９６ウェル Ｇｒｅｉｎｅｒプレートの各ウェルに添加し、そして４℃で一晩インキュベーションした。次いで、各ウェルを、ＰＢＴ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中に０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。２００μｌの飽和緩衝液（水中に２．７％のポリビニルピロリドン１０）を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを３７℃で２時間インキュベーションした。ウェルを、ＰＢＴで３回洗浄した。２００μｌの希釈血清（希釈緩衝液：ＰＢＳ中に１％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．１％のＮａＮ３）を、各ウェルに添加し、このプレートを３７℃で２時間インキュベーションした。ウェルを、ＰＢＴで３回洗浄した。希釈緩衝液に１：２０００に希釈した１００μｌのＨＲＰ結合化ウサギ抗マウス（Ｄａｋｏ）血清を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを、３７℃で９０分間インキュベーションした。ウェルをＰＢＴ緩衝液で３回洗浄した。ＨＲＰに対する１００μｌの基質緩衝液（２５ｍｌのクエン酸緩衝液ｐＨ５、１０ｍｇのＯ−フェニルジアミンおよび１０μｌのＨ２Ｏ２）を各ウェルに添加し、そしてこのプレートを、２０分間室温で放置した。１００μｌの１２．５％Ｈ２ＳＯ４を、各ウェルに添加し、ＯＤ４９０を追跡した。このＥＬＩＳＡ力価を、免疫前のレベルより上の０．４のＯＤ４９０値を与えた血清の希釈として任意で計算された。このＥＬＩＳＡを、０．４のＯＤ４９０での血清の希釈が１：４００より高い場合、陽性と見なした。
【００９３】
（血清分析−ＦＡＣＳスキャン細菌結合アッセイ）
無莢膜化Ｍｅｎ Ｍ７株を、チョコレートアガープレートにプレートし、そして５％ＣＯ２で３７℃において一晩インキュベーションした。細菌コロニーを、滅菌ドラコンスワッブを使用してアガープレートから回収し、そして０．２５％のグルコースを含むＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を各８ｍｌ含有する４つのチューブに播種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ６２０を追跡することによりモニターした。この細菌を、ＯＤが０．３５〜０．５の値に達するまで増殖させた。この培養物を、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この上清を捨て、そしてこのペレットを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．４％のＮａＮ３）に再懸濁し、そして４０００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を０．０５のＯＤ６２０に達するようにブロッキング緩衝液に再懸濁した。１００μｌの細菌細胞を、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。（ブロッキング緩衝液中の）１００μｌの希釈血清（１：１００、１：２００、１：４００）を、各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃で２時間インキュベーションした。細胞を４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を吸引し、そして細胞を、各ウェルに２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加することによって洗浄した。１：１００に希釈された、１００μｌのＲ−フィコエリトリン結合化Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗マウスを、各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃で１時間インキュベーションした。細胞を、４０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によってスピンダウンし、そして２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液の添加によって洗浄した。この上清を、吸引し、そして細胞を、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ（０．２５％のホルムアルデヒド）中で再懸濁した。サンプルをＦＡＣＳｃａｎチューブに移して、そして読み取った。ＦＡＣＳｃａｎ設定の条件（Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ １５ｍＷ）は、以下のとおりである：ＦＬ２オン；ＦＳＣ−Ｈ閾値：９２；ＦＳＣ ＰＭＴ電圧：Ｅ ０１；ＳＳＣ ＰＭＴ：４７４；増幅利得 ６．１：ＦＬ−２ ＰＭＴ：５８６；補償値：０。
【００９４】
（血清分析−細菌アッセイ）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を、５％ＣＯ２で３７℃においてチョコレートアガープレート上で一晩増殖した（凍結ストックから開始した）。コロニーを、回収しそして０．０５から０．０８のＯＤ６２０に達するように０．２５％のグルコースを含む７ｍｌのＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈへの播種に使用した。この培養物を、ＯＤ６２０が０．２３〜０．２４の値に達するまで攪拌しながら３７℃で約１．５時間インキュベーションした。細菌を、１０５のＣＦＵ／ｍｌの作用希釈において１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＣａＣｌ２および０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（アッセイ緩衝液）を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．２に希釈した。最終反応混合物の総量は、試験血清の段階２倍希釈の２５μｌ、作用希釈における細菌の１２．５μｌ、乳仔ウサギ補体の１２．５μｌ（最終濃度２５％）を有する５０μｌであった。
【００９５】
コントロールは、補体血清でインキュベーションされた細菌、細菌でおよび５６℃で３０分間の加熱により不活性化された補体インキュベーションされた免疫血清を含んでいた。乳仔ウサギ補体の添加後、即座に、１０μｌのコントロールを、チルト方法を使用してＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレートにプレートした（時間０）。９６−ウェルプレートを、回転しながら３７℃で１時間インキュベーションした。７μｌの各サンプルを、スポットとしてＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレートにプレートし、それに対し、１０μｌのコントロールを、チルト方法を使用してＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレートにプレートした（時間１）。アガープレートを、３７℃で１８時間インキュベーションし、そして時間０および時間１に対応するコロニーを計数した。
【００９６】
（血清分析−ウェスタンブロッティング）
ＭｅｎＢ株２９９６由来の精製タンパク質（５００ｎｇ／レーン）、外膜小胞（５μｇ）および全細胞抽出物（２５μｇ）を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、そしてニトロセルロース膜上に転写した。この転写を、２時間、１５０ｍＡ、４℃で転写緩衝液（０．３％ Ｔｒｉｓベース、１．４４％ グリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノール）中で行った。この膜を飽和緩衝液（ＰＢＳ中の１０％ スキムミルク、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）中での４℃の一晩のインキュベートにより飽和させた。この膜を洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の３％ スキムミルク、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）を用いて２回洗浄し、そして洗浄緩衝液中に１：２００に希釈したマウス血清とともに、２時間３７℃でインキュベートした。この膜を２回洗浄し、そして１：２０００希釈の西洋わさびペルオキシダーゼ標識化抗マウスＩｇとともに９０分間インキュベートした。この膜をＰＢＳ中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を用いて２回洗浄し、そしてＯｐｔｉ−４ＣＮ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、発色させた。この反応を、水を添加して停止した。
【００９７】
ＯＭＶを以下のように調製した：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を、５ＧＣプレート上で、５％ＣＯ２で３７℃において一晩増殖し、ループを用いて回収し、そして１０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁した。５６℃、４５分の熱不活化を行い、そして細菌を５分間氷上で超音波処理することにより破壊した（５０％ 衝撃係数、５０％ 出力、Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ ３ｍｍマイクロチップ）。未破壊細胞を５０００ｇ、１０分間の遠心分離によって除去し、そして全細胞エンベロープ画分を含む上清を回収し、そして５００００ｇ、４℃の一晩さらに遠心分離した。メンブレンを含むペレットを、２％サルコシル、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ中で再懸濁し、そして２０分間室温でインキュベーションして、内膜を溶解した。この懸濁液を、１００００ｇで１０分間遠心分離して、凝集体を除去し、上清を、５００００ｇで３時間さらに遠心分離した。外膜を含むペレットをＰＢＳで洗浄し、同じ緩衝液で再懸濁した。タンパク質濃度を、スタンダードとしてＢＳＡを使用してＤ．Ｃ．Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（改変Ｌｏｗｒｙ法）によって測定した。
【００９８】
全細胞抽出物を、以下のように調製した：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を、ＧＣプレート上で一晩増殖させ、ループを用いて回収し、そして１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁した。５６℃で３０分間熱不活化を行った。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２】 図２は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図３】 図３は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図４】 図４は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図５】 図５は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図６】 図６は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図７】 図７は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図８】 図８は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図９】 図９は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１０】 図１０は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１１】 図１１は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１２】 図１２は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１３】 図１３は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１４】 図１４は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１５】 図１５は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１６】 図１６は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１７】 図１７は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１８】 図１８は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１９】 図１９は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２０】 図２０は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２１】 図２１は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２２】 図２２は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２３】 図２３は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２４】 図２４は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２５】 図２５は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２６】 図２６は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
本明細書に引用される全ての文献は、その全体において参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、タンパク質発現の分野に存在する。特に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、または好ましくはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のタンパク質の異種発現に関する。
【０００３】
（背景技術）
国際特許出願ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０およびＷＯ００／２２４３０は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のタンパク質を開示する。これらのタンパク質は、Ｎ末端ＧＳＴ融合物またはＣ末端Ｈｉｓタグ融合物のいずれかとして、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現される（すなわち、異種発現）ように、典型的に記載されるが、他の発現系（ネイティブのＮｅｉｓｓｅｒｉａでの発現を含む）もまた開示される。
【０００４】
これらのタンパク質の異種発現のための代替的かつ改善されたアプローチを提供することが本発明の目的である。これらのアプローチは、典型的に発現レベル、精製の容易さ、発現の細胞内局在、および／または発現タンパク質の免疫学的特性に影響する。
【０００５】
（発明の開示）
本発明にしたがって、２つ以上（例えば、３，４，５，６、またはそれ以上）の本発明のタンパク質が、単一のハイブリッドタンパク質として発現される。非ナイセリア属融合パートナー（例えば、ＧＳＴまたはポリＨｉｓ）が使用されないことが好ましい。
【０００６】
これは、２つの利点を提供する。第１に、それ自体では不安定またはほとんど発現され得ないタンパク質は、その問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することによって支援され得る。第２に商業生産が簡素化される（２つの別個に有用なタンパク質を生成するために、たった１つの発現および精製しか使用される必要がない）。
【０００７】
したがって、本発明は、２つ以上の本発明のタンパク質の同時異種発現のための方法を提供し、この方法において、その２つ以上の本発明のタンパク質は融合される（すなわち、それらは、単一ポリペプチド鎖として翻訳される）。
【０００８】
この方法は、典型的に以下の工程を含む：本発明の第１のタンパク質をコードする第１の核酸を得る工程；本発明の第２のタンパク質をコードする第２の核酸を得る工程；その第１の核酸と第２の核酸とを連結する工程。生じた核酸は、発現ベクターに挿入され得るか、または既に発現ベクターの一部であり得る。
【０００９】
ちょうど２つのタンパク質が連結される場合、そのハイブリッドタンパク質は、単に式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−ＣＯＯＨによって示され得る。ＡおよびＢは、それぞれ任意のナイセリア属タンパク質から、そして特に配列番号１〜４３２６によって示されるものから選択され得る。この方法は、タンパク質ｏｒｆ１、ｏｒｆ４、ｏｒｆ２５、ｏｒｆ４０、Ｏｒｆ４６／４６．１、ｏｒｆ８３、２３３、２８７、２９２Ｌ、５６４、６８７、７４１、９０７、９１９、９５３、９６１、および９８３の発現によく適している。
【００１０】
式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−ＣＯＯＨの以下の表における「Ｘ」によって示される４２個のハイブリッドが好ましい：
【００１１】
【表１】
したがって、ハイブリッドとして発現される好ましいタンパク質は、ＯＲＦ４６．１、２８７、７４１、９１９、９５３、９６１および９８３である。これらは、基本的に全長の形において使用され得るか、またはポリグリシン欠損（ΔＧ）形態が使用され得る（例えば、ΔＧ−２８７、ΔＧＴｂｐ２、ΔＧ７４１、ΔＧ９８３など）か、または短縮型が使用され得る（例えば、Δ１〜２８７、Δ２〜２８７などか、またはドメイン欠損バージョンが使用され得る（例えば、２８７Ｂ、２８７Ｃ、２８７ＢＣ、ＯＲＦ４６１〜４３３、ＯＲＦ４６４３３〜６０８、ＯＲＦ４６、９６１ｃなど）。
【００１２】
特に好ましいものは、以下である：（ａ）９１９および２８７を含むハイブリッドタンパク質；（ｂ）９５３および２８７を含むハイブリッドタンパク質；（ｃ）２８７およびＯＲＦ４６．１を含むハイブリッドタンパク質；（ｄ）ＯＲＦ１およびＯＲＦ４６．１を含むハイブリッドタンパク質；（ｅ）９１９およびＯＲＦ４６．１を含むハイブリッドタンパク質；（ｆ）ＯＲＦ４６．１および９１９を含むハイブリッドタンパク質；（ｇ）ＯＲＦ４６．１、２８７および９１９を含むハイブリッドタンパク質；（ｈ）９１９および５１９を含むハイブリッドタンパク質；および（ｉ）ＯＲＦ９７および２２５を含むハイブリッドタンパク質。
【００１３】
さらなる実施形態が、図面において示され、そして以下を含む：
【００１４】
【表２】
２８７が使用される場合それは、ハイブリッドのＣ末端にあるのが好ましい；これがＮ末端で使用される場合、２８７ΔＧ形態の使用が好ましい（例えば、ＯＲＦ４６．１、９１９、９５３、または９６１とのハイブリッドのＮ末端として）。
【００１５】
２８７が使用される場合、これは、２９９６株または３９４／９８株由来であることが好ましい。
【００１６】
９６１が使用される場合、これは、Ｎ末端にあることが好ましい。９６１のドメイン形態が使用され得る。
【００１７】
ＯＲＦ４６、２８７、９１９、および９５３の多型形態のアライメントが、ＷＯ００／６６７４１において開示される。これらの多型のいずれもが本発明に従って使用され得る。
【００１８】
好ましくは、本発明に従うハイブリッドタンパク質における構成タンパク質（ＡおよびＢ）は、同じ株由来である。
【００１９】
このハイブリッドにおける融合されたタンパク質は、直接連結され得るか、またはリンカーペプチド（例えば、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｎ（ここでｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である）））またはクローングを容易にする短いペプチド配列を介して連結され得る。ポリグリシンリンカーのＣ末端にΔＧタンパク質を結合しないことが明らかに好ましい。
【００２０】
この融合タンパク質は、ネイティブのリーダーペプチドを欠き得るか、またはＮ末端融合パートナーのリーダーペプチド配列を含み得る。
【００２１】
（宿主）
異種宿主を利用することが好ましい。その異種宿主は、原核生物であってもまたは真核生物であってもよい。その異種宿主は、適切なＥ．ｃｏｌｉであるが、他の好ましい宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられる。
【００２２】
（ベクター、宿主など）
上記の方法と同様に、本発明は、以下を提供する：（ａ）これらの方法に有用な核酸およびベクター、（ｂ）上記ベクターを含む宿主細胞、（ｃ）上記方法によって発現されたタンパク質または発現可能なタンパク質、（ｄ）これらのタンパク質を含む組成物であり、例えばワクチン、または診断試薬または免疫原性の組成物として適切であり得る組成物、（ｅ）医薬（例えば、ワクチン）または診断試薬としての使用のためのこれらの組成物（ｆ）以下の（１）〜（３）の製造においてのこれらの組成物の使用：（１）ナイセリア属細菌に起因する感染の処置または予防のための医薬、（２）ナイセリア属細菌の存在の検出またはナイセリア属細菌に対して惹起される抗体の存在の検出のための診断試薬、および／または（３）ナイセリア属細菌に対する抗体を惹起し得る試薬、および（ｇ）患者の処置方法であって、これらの組成物の治療的有効量を患者に投与する工程を含む方法。
【００２３】
（配列）
本発明はまた、以下の実施例に示されるいずれかの配列を有するタンパク質または核酸を提供する。本発明はまた、これらに対する配列同一性を有するタンパク質および核酸も提供する。上記のように、「配列同一性」の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。
【００２４】
（本明細書の用語）
ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、およびＷＯ９９／５７２８０に開示される２１６６個のタンパク質配列は、本明細書において以下の配列番号により言及される：
【００２５】
【表３】
この配列番号の番号付けに加えて、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、およびＷＯ９９／５７２８０において使用される命名規則もまた使用される（例えば、ＷＯ９９／２４５７８およびＷＯ９９／３６５４４において使用されるような「ＯＲＦ４」、「ＯＲＦ４０」、「ＯＲＦ４０−１」など；ＷＯ９９／５７２８０において使用されるような「ｍ９１９」、「ｇ９１９」、および「ａ９１９」など）。
【００２６】
Ｔｅｔｔｅｌｉｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９〜１８１５）に由来する２１６０個のタンパク質ＮＭＢ０００１〜ＮＭＢ２１６０は、配列番号２１６７〜４３２６として本明細書にて呼ばれる（ＷＯ００／６６７９１もまた参照）。
【００２７】
本明細書で使用される用語「本発明のタンパク質」は、以下を含むタンパク質をいう：
（ａ）配列番号１〜４３２６の配列の１つ；または
（ｂ）配列番号１〜４３２６の１つに対して配列同一性を有する配列；または
（ｃ）配列番号１〜４３２６の１つのフラグメント。
【００２８】
（ｂ）において言及される「配列同一性」の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上）。これは、変異体および対立遺伝子改変体（例えば、ＷＯ００／６６７４１を参照のこと）を含む。同一性は、好ましくは、パラメーター（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１２，およびｇａｐ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ＝１）でのを用いるａｆｆｉｎｅ ｇａｐ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。代表的には、２つのタンパク質の間の５０％以上の同一性は、機能的等価物であることの指標であると考えられる。
【００２９】
（ｃ）において言及される「フラグメント」は、配列番号１〜４３２６の１つからの少なくともｎ個の連続したアミノ酸を含むべきであり、そして特定の配列に依存して、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上）である。好ましくは、このフラグメントは、配列番号１〜４３２６の１つからのエピトープを含む。好ましいフラグメントは、ＷＯ００／７１５７４およびＷＯ０１／０４３１６に開示されるフラグメントである。
【００３０】
本発明の好ましいタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂにおいて見出される。
【００３１】
本発明に従う使用に好ましいタンパク質は、血清型Ｂ Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの２９９６株または３９４／９８株（ニュージーランド株）のタンパク質である。他のように言及のない限り、本明細書において言及されるタンパク質は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ２９９６株由来である。しかし、本発明が一般的に、株により限定されないことが理解される。特定のタンパク質（例えば、「２８７」、「９１９」など）についての言及は、任意の株由来のそのタンパク質を含むと受け取られ得る。
【００３２】
「核酸」に対する言及が、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むこと、そしておよびこれらのアナログ（例えば、改変された骨格を含むもの）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）なども含むことが理解される。
【００３３】
（本発明の実施様式）
（実施例１ ＯＲＦ４６のハイブリッド）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清型Ｂ、２９９６株）由来の完全なＯＲＦ４６タンパク質は、以下の配列を有する：
【００３４】
【表４】
リーダーペプチドは下線が引かれている。
【００３５】
他の株由来のＯＲＦ４６の配列が、ＷＯ００／６６７４１に見出され得る。
【００３６】
ＯＲＦ４６を、そのＣ末端およびＮ末端において、２８７、９１９およびＯＲＦ１と、融合した。このハイブリッドタンパク質は、一般に不溶性であったが、（同種の２９９６株に対して）いくつか良好なＥＬＩＳＡおよび殺菌成績を与えた：
【００３７】
【表５】
比較のために、ＯＲＦ４６．１、２８７（ＧＳＴ融合物としてかまたはΔＧ２８７形態においてのいずれか）、および９１９の「三重」ハイブリッドを構築し、そして種々の株（同種の２９９６株を含む）に対して、この３つの抗原の単純混合物と対比して試験した。ＦＣＡをアジュバントとして用いた：
【００３８】
【表６】
また、このハイブリッドは、等価であるかまたは優れた免疫学的活性を示す。
【００３９】
２つのタンパク質（２９９６株）のハイブリッドを、種々の異種株に対して、個々のタンパク質と比較した。
【００４０】
【表７】
また、このハイブリッドは、等価であるかまたは優れた免疫学的活性を示す。
【００４１】
（実施例２ ΔＧ２８７のハイブリッド）
２８７における（Ｇｌｙ）６配列の欠失は、タンパク質発現に対して劇的な影響を有することが見出された。ＧＧＧＧＧＧまでのＮ末端アミノ酸を欠くこのタンパク質は、「ΔＧ２８７」と呼ばれる。ＭＣ５８株において、この基本配列（下線部のリーダーペプチド）は：
【００４２】
【表８】
である。Ｈｉｓタグを有するかまたは有さないΔＧ２８７（それぞれ「ΔＧ２８７−Ｈｉｓ」および「ΔＧ２８７Ｋ」）は、「２８７−Ｈｉｓ」または「２８７タグなし」に比較して非常によいレベルで発現される。
【００４３】
遺伝子変動性データに基づいて、多くのＭｅｎＢ株（特に２９９６株、ＭＣ５８株、１０００株、およびＢＺ２３２株）由来のΔＧ２８７−Ｈｉｓの改変体をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現した。この結果もまた、良かった（つまり、これらのそれぞれが、高いＥＬＩＳＡ力価を与え、そしてまた８１９２より大きい血清殺菌力価を与えた。ｐＥＴ−２４ｂから発現されたΔ２８７Ｋは、ＥＬＩＳＡおよび血清殺菌アッセイにおいて優れた力価を与えた）。
【００４４】
ポリＧｌｙ配列の欠失もまた、Ｔｂｐ２（ＮＭＢ０４６０）、７４１（ＮＭＢ１８７０）および９８３（ＮＭＢ１９６９）に適用可能である。リーダーペプチドをコードする配列を含まず、そしてポリＧｌｙを伴わず（すなわち、「ΔＧ形態」として）ｐＥＴベクターにクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた場合、同じ効果が観察された（ポリグリシンストレッチの欠失を保有するクローンにおいて、発現は良好であり、そしてこのグリシンが発現タンパク質中に存在する場合は、発現は乏しいかまたは存在しなかった）。
【００４５】
ΔＧ２８７を、９１９、９５３、９６１の上流に直接インフレーム融合し、（以下に配列を示す）、およびＯＲＦ４６．１の上流に直接インフレーム融合した。
【００４６】
【表９】
【００４７】
【表１０】
このハイブリッドタンパク質に対して惹起された抗体の殺菌効力（同種株）を、９１９およびＯＲＦ４６．１に対する成分抗原（２８７−ＧＳＴを使用）の単純混合物に対し惹起された抗体と比較した：
【００４８】
【表１１】
異種ＭｅｎＢ株および血清型Ａおよび血清型Ｃに対しての殺菌活性についてのデータもまた得た：
【００４９】
【表１２】
従って、Ｎ末端でのΔＧ２８７とのハイブリッドタンパク質は、免疫学的に単純混合物より優れており、ΔＧ２８７−ＯＲＦ４６．１が特に効果的であり、異種株に対してさえも効果的である。ΔＧ２８７−ＯＲＦ４６．１は、ｐＥＴ−２４ｂにおいて発現され得る
同じハイブリッドタンパク質を２９９６ではなくニュージーランド株３９４／９８を用いて作製した：
【００５０】
【表１３】
（実施例３ ΔＧ９８３のハイブリッド）
タンパク質９８３は、以下の配列を有する：
【００５１】
【表１４】
従って、ΔＧ９８３は、以下の基本配列を有する：
【００５２】
【表１５】
ΔＧ９８３は、そのＣ末端でのＯＲＦ４６．１、７４１、９６１、または９６１ｃを伴うハイブリッドとして発現された：
【００５３】
【表１６】
（実施例４−ΔＧ７４１のハイブリッド）
タンパク質７４１は以下の配列を有する：
【００５４】
【表１７】
従って、ΔＧ７４１は、以下の塩基配列を有する：
【００５５】
【表１８】
ΔＧ７４１を、タンパク質９６１、９６１ｃ、９８３およびＯＲＦ４６．１の上流にインフレームで直接融合した。
【００５６】
【表１９】
（実施例５−２８７のハイブリッド）
Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するか、またはそのリーダーペプチドを有さないがＣ末端Ｈｉｓタグを有する全長としての２８７の発現は、かなり低い発現レベルを示す。より良い発現は、Ｎ末端ＧＳＴ融合物を用いて達成される。Ｎ末端融合物のパートナーとしてＧＳＴを用いる代替として、２８７を、タンパク質９１９（「９１９−２８７」）、タンパク質９５３（「９５３−２８７」）およびタンパク質ＯＲＦ４６．１（「ＯＲＦ４６．１−２８７」）のＣ末端に配置した。いずれ場合においても、リーダーペプチドを除去し、そしてハイブリッドは直接的なインフレーム融合物であった。
【００５７】
９５３−２８７ハイブリッドを生成するために、この２つのタンパク質のリーダーペプチドを、各配列のリーダーから下流への順方向プライマーを設計することによって除外し；終止コドン配列を、９５３逆方向プライマーにおいて除いたが、２８７逆方向プライマーにおいて含有された。９５３遺伝子について、増幅のために使用した５’および３’プライマーは、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位をそれぞれ含み、一方、２８７遺伝子の増幅について、５’および３’のプライマーは、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位をそれぞれ含んだ。このように、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ（第一の遺伝子をクローン化するために）および引き続いてＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ（第二の遺伝子をクローン化するために）を使用して、ｐＥＴ２１＋における２つの遺伝子の連続方向クローニングを達成し得た。
【００５８】
９１９−２８７ハイブリッドを、２８７の成熟部分をコードする配列を、ｐＥＴ２１ｂ＋における９１９−Ｈｉｓクローンの３’末端のＸｈｏＩ部位にクローニングすることによって得た。２８７遺伝子の増幅のために使用するプライマーを、そのＰＣＲフラグメントの５’側にＳａｌＩ制限部位および３’側にＸｈｏＩ部位を導入するために設計した。ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ制限酵素によって生じた付着末端は適合性を有するため、ＳａｌＩ−ＸｈｏＩを用いて消化した２８７ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩを用いて切断したｐＥＴ２１ｂ−９１９クローン中に挿入し得た。
【００５９】
ＯＲＦ４６．１−２８７ハイブリッドを同様に得た。
【００６０】
ハイブリッドタンパク質に対して惹起した抗体の殺菌性効力（同種株）を、その成分抗原の単純な混合物に対して惹起した抗体と比較した：
【００６１】
【表２０】
異種ＭｅｎＢ株ならびに血清型ＡおよびＣに対する殺菌性活性に関するデータもまた、９１９−２８７および９５３−２８７について得た：
【００６２】
【表２１】
ＯＲＦ４６．１および９１９のハイブリッドもまた構築した。最良の結果（４倍高い力価）を、Ｎ末端側で９１９を用いて達成した。
【００６３】
ハイブリッド９１９−５１９Ｈｉｓ、ＯＲＦ９７−２２５Ｈｉｓおよび２２５−ＯＲＦ９７Ｈｉｓもまた試験した。これらは、中程度のＥＬＩＳＡ力価および殺菌性抗体応答を示した。
【００６４】
２つのタンパク質ＡおよびＢのハイブリッドは、ＮＨ２−Ａ−Ｂ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−Ｂ−Ａ−ＣＯＯＨのいずれかであるので、Ｎ末端側に２８７を有する「逆」ハイブリッドもまたΔＧ２８７を使用して作製した。同種株２９９６を含むＡパネルの株を使用した。ＦＣＡ株をアジュバントとして使用した：
【００６５】
【表２２】
より良い殺菌性力価は、一般に、Ｎ末端側で２８７を用いて確認される。
【００６６】
タンパク質９６１に融合した場合、［ＮＨ２−ΔＧ２８７−９６１−ＣＯＯＨ−上記の配列］、得られるタンパク質は、不溶性であり、そして精製のために変性および再生されなければならない。再生後、約５０％のタンパク質が、不溶性のまま見出された。可溶性および不溶性タンパク質を比較し、そしてさらに良い殺菌性力価を、可溶性タンパク質（アジュバントとしてＦＣＡ）を用いて得た：
【００６７】
【表２３】
しかし、不溶性形態での力価は、ミョウバンアジュバントを代わりに用いることによって改善された：
【００６８】
【表２４】
９６１ｃをまた、ハイブリッドタンパク質において使用した（上記を参照のこと）。９６１およびそのドメイン改変体は、効率的な発現を指向するので、それらは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端部分として理想的に適する。
【００６９】
（実施例２３−さらなるハイブリッド）
本発明のさらなるハイブリッドタンパク質を図面に示し、そしてそれらは以下に示す配列を有する。個々のタンパク質と比較した場合、これらは有益である：
【００７０】
【表２５】
本発明は、例示目的でのみ記載され、そして本発明の範囲および精神内にある限りは改変がなされ得ることが理解される。例えば、他の株由来のタンパク質の使用が想定される［例えば、ＯＲＦ４、ＯＲＦ４０、ＯＲＦ４６、２２５、２３５、２８７、５１９、７２６、９１９および９５３の多型配列については、ＷＯ００／６６７４１を参照のこと］。
【００７１】
（実験の詳細）
（クローニングストラテジーおよびオリゴヌクレオチド設計）
目的の抗原をコードする遺伝子を、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ ＭＣ５８のゲノム配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドを使用する、ＰＣＲによって増幅した。他に示されない限り、２９９６株由来のゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ反応におけるテンプレートとして常に使用し、そしてその増幅したフラグメントを、発現ベクターのｐＥＴ２１ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化して、Ｃ末端Ｈｉｓタグ化産物としてタンパク質を発現させるか、またはｐＥＴ−２４ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローン化して、「非タグ化」形態（例えば、ΔＧ ２８７Ｋ）のタンパク質を発現させた。
【００７２】
タンパク質を、融合パートナーを伴わずにそれ自体のリーダーペプチド（存在する場合）を伴って発現させる場合、オープンリーディングフレーム（ＡＴＧコドン〜終止コドン）の増幅を行った。
【００７３】
タンパク質を「非タグ化」形態で発現させる場合、そのリーダーペプチドを、推定リーダー配列から下流の５’末端の増幅プライマーを設計することによって除外した。
【００７４】
ＰＣＲに使用されたプライマーの融解温度は、プライマー全体のハイブリダイズするヌクレオチドの数および型に依存し、そして以下の式を使用して決定した：
Ｔｍ１＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ） （テールを除外）
Ｔｍ２＝６４．９＋０．４１（％ＧＣ）−６００／Ｎ （プライマー全体）。
【００７５】
選択したオリゴヌクレオチドの融解温度は、オリゴ全体について通常６５〜７０℃であり、そしてハイブリダイズ領域単独では５０〜６０℃であった。
【００７６】
オリゴヌクレオチドを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて合成し、２．０ｍｌのＮＨ４ＯＨ中でカラムから溶出し、そして５６℃での５時間のインキュベートにより脱保護した。これらのオリゴを、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノールの添加によって沈殿させた。このサンプルを遠心分離し、そしてそのペレットを水に再懸濁した。
【００７７】
【表２６】
＊このプライマーを、Ｈｉｓタグに対する２８７の全てのＣ末端融合物のための逆方向プライマーとして使用した。
【００７８】
§２８７−Ｈｉｓ逆方向プライマーと組み合わせて使用した順方向プライマー。
【００７９】
ＮＢ−全ＰＣＲ反応は、他に規定がない限り、２９９６株（例えば、ＮＣ５８株）を使用した。
【００８０】
その後ろに特有のＮｈｅＩ部位がないＡＴＧで開始する全ての構築物において、そのＡＴＧコドンは、クローニングのために使用されるＮｄｅＩ部位の一部分である。５’末端のクローニング部位としてＮｈｅＩを用いて作製した構築物（例えば、Ｎ末端に２８７を含む全ての構築物）は、抗原のコード配列に融合された２つのさらなるコドン（ＧＣＴＡＧＣ）を有する。
【００８１】
（染色体のＤＮＡテンプレートの調製）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株 ２９９６、ＭＣ５８、３９４．９８、１０００およびＢＺ２３２（ならびに他の株）を、１００ｍｌのＣＧ培地中に対数期まで増殖し、遠心分離によって収集し、そして５ｍｌの緩衝液（２０％ ｗ／ｖスクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に再懸濁した。氷上で１０分間のインキュベーション後、この細菌を１０ｍｌの溶解溶液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ Ｎａ−Ｓａｒｋｏｓｙｌ、５０μｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ）を添加することによって溶解し、そしてこの懸濁液を、３７℃で２時間インキュベートした。２回のフェノール抽出（ｐＨ８に平衡化した）および１回のＣＨＣｌ３／イソアミルアルコール（２４：１）抽出を行った。ＤＮＡを、０．３Ｍの酢酸ナトリウムおよび２容量のエタノールの添加によって沈殿させ、そして遠心分離によって収集した。このペレットを、７０％（ｖ／ｖ）エタノールで一回洗浄し、そして４．０ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中に再溶解した。ＤＮＡ濃度を、ＯＤ２６０の読み取りによって測定した。
【００８２】
（ＰＣＲ増幅）
この標準ＰＣＲプロトコルは以下の通りであった：２９９６、ＭＣ５８１０００もしくはＢＺ２３２株由来の２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、または組換えクローンの１０ｎｇのプラスミドＤＮＡ調製物を、４０μＭの各オリゴヌクレオチドプライマー、４００〜８００μＭのｄＮＴＰ溶液、１×ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）、２．５ユニットのＴａｑＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡｍｐｌｉＴａＱ、Ｂｏｅｒｈｉｎｇｈｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｎ ＥｘｐａｎｄＴＭ Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ）の存在下でテンプレートとして使用した。
【００８３】
全混合物を９５℃で予め３分間インキュベーションした後に、各サンプルを、二工程増幅に供した：最初の５サイクルを、プライマーの制限酵素のテールを除外したハイブリダイゼーション温度（Ｔｍ１）を使用して行った。これに続いて、全長オリゴについて算出されたハイブリダイゼーション温度（Ｔｍ２）によって３０サイクルを行った。伸長時間（６８℃または７２℃で行う）は、増幅されるＯｒｆの長さによって変化した。Ｏｒｆ１の場合において、伸長時間は、３分から開始して、各サイクル１５秒で減少した。このサイクルは、７２℃での１０分間の伸長によって完了した。
【００８４】
この増幅したＤＮＡを、１％アガロースゲルに直接ロードした。正確なサイズのバンドに対応するＤＮＡフラグメントを、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、製造業者のプロトコルに従ってゲルから精製した。
【００８５】
（ＰＣＲフラグメントおよびクローニングベクターの消化）
増幅したフラグメントに対応する精製したＤＮＡを、ｐＥＴ−２１ｂ＋、ｐＥＴ−２２ｂ＋またはｐＥＴ−２４ｂ＋へのクローニングに適切な制限酵素を用いて消化した。消化したフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを（製造業者の指示に従って）使用して精製し、そして、Ｈ２Ｏまたは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）のいずれかで溶出した。プラスミドベクターを適切なこれらの制限酵素を用いて消化し、１％アガロースゲルにロードし、そして消化したベクターに対応するバンドを、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。
【００８６】
（クローニング）
予め消化および精製した、各遺伝子に対応するフラグメントを、ｐＥＴ２１ｂ＋、ｐＥＴ２２ｂ＋またはｐＥＴ２４ｂ＋中に連結した。３：１のモル比のフラグメント／ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと共に、製造業者によって供給される連結緩衝液中で用いた。
【００８７】
組換えプラスミドを、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５またはＨＢ１０１中に、連結反応溶液および細菌を氷上で４０分間インキュベートし、次いで３７℃にて３分間インキュベートすることによって、形質転換した。これに続いて、８００μｌのＬＢブロスを添加し、そして３７℃にて２０分間インキュベートした。細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの微量遠心機において最大速度で遠心分離し、約２００μｌの上清に再懸濁し、そしてＬＢアンピシリン（１００ｍｇ／ｍｌ）寒天上にプレートした。
【００８８】
組換えクローンのスクリーニングを、無作為に選択したコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた４．０ｍｌのＬＢブロスにおいて３７℃で一晩増殖させて行った。細胞をペレットにし、そしてＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを製造業者の指示に従って使用して、プラスミドＤＮＡを抽出した。約１μｇの各々個々のミニプレップを、適切な制限酵素を用いて消化し、そして消化物を、１〜１．５％アガロースゲル（予想されるインサートサイズに依存する）に、分子量マーカー（１ｋｂ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、ＧＩＢＣＯ）と並行してロードした。陽性クローンを、インサートのサイズに基づいて選択した。
【００８９】
（発現）
各遺伝子を発現ベクター中にクローニングした後、組換えプラスミドを、組換えタンパク質の発現に適したＥ．ｃｏｌｉ株中に形質転換した。各構築物の１μｌを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３を、上記のように形質転換した。単一の組換えコロニーを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）を加えた２ｍｌのＬＢに播種し、３７℃で一晩でインキュベートし、次いで、１００ｍｌのフラスコ中でＡｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）を加えた２０ｍｌのＬＢ中に１：３０で希釈し、０．１と０．２との間のＯＤ６００を得た。このフラスコを、ＯＤ６００が発現の誘導に適した対数増殖を示すまで（０．４〜０．８のＯＤ）、回転型水浴振とう機中で３０℃または３７℃でインキュベートした。タンパク質発現を、１．０ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって誘導した。３０℃または３７℃での３時間のインキュベーションの後、ＯＤ６００を測定し、そして発現を試験した。１．０ｍｌの各サンプルを微量遠心機で遠心分離し、ペレットをＰＢＳ中で再懸濁し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色によって分析した。
【００９０】
（Ｈｉｓタグ化タンパク質の精製）
２８７の種々の形態を、２９９６およびＭＣ５８株からクローン化した。それらは、Ｃ末端Ｈｉｓタグ化融合物と共に構築され、そしてそれらは、成熟形態（アミノ酸１８〜４２７）、欠失（Δ１、Δ２、Δ３およびΔ４）を伴う構築物ならびにＢドメインまたはＣドメインのいずれかから構成されるクローンを含んだ。Ｈｉｓ融合物として精製される各クローンについて、単一のコロニーをストリークし、そしてＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）寒天プレート上で３７℃にて一晩増殖させた。このプレートから単離されたコロニーを、２０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）液体培地中に播種し、そして攪拌しながら３７℃で一晩増殖させた。この一晩培養物を、１．０ＬのＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）液体培地中に１：３０で希釈し、そしてＯＤ５５０が０．６〜０．８に達するまで最適な温度（３０〜３７℃）で増殖させた。組換えタンパク質の発現をＩＰＴＧの添加（最終濃度１．０ｍＭ）によって誘導し、そして培養物をさらに３時間インキュベートした。細菌を、８０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離することによって回収した。細菌のペレットを、（ｉ）可溶性タンパク質のための冷却緩衝液Ａ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸緩衝液、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）または（ｉｉ）不溶性タンパク質のための緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ８．８および必要に応じて８Ｍの尿素）のいずれかの７．５ｍｌ中に再懸濁した。可溶性形態において精製されたタンパク質には、２８７−Ｈｉｓ、Δ１、Δ２、Δ３およびΔ４２８７−Ｈｉｓ、Δ４２８７ＭＣ５８−Ｈｉｓ、２８７ｃ−Ｈｉｓならびに２８７ｃＭＣ５８−Ｈｉｓが含まれた。タンパク質２８７ｂＭＣ５８−Ｈｉｓは、不溶性であり、従って精製した。細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ ４５０を使用し、氷上で、３０秒間、４０Ｗでの４回の超音波処理により破砕し、そして４℃で３０分間、１３０００×ｇで遠心分離した。不溶性タンパク質について、ペレットを２．０ｍｌ 緩衝液Ｃ（６Ｍ 塩酸グアニジン、１００ｍＭ リン酸緩衝液、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｉｓ、ｐＨ７．５）中に再懸濁し、そしてダンス型ホモジナイザー中に１０回通して処理した。このホモジネートを、１３０００ｇで３０分間遠心分離し、そして上清を保持した。可溶性および不溶性調製物の両方についての上清を、１５０μｌのＮｉ２＋−樹脂（適切なように、緩衝液Ａまたは緩衝液Ｂのいずれかで予め平衡化した）と混合し、そして３０分間穏やかに撹拌をしながら、室温でインキュベートした。この樹脂は、製造者プロトコルに従って調製された、Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）であった。このバッチ式調製物を、７００ｇで５分間、４℃で遠心分離し、そして上清を破棄した。この樹脂を１０ｍｌの緩衝液Ａまたは緩衝液Ｂを用いて１０分間、２回洗浄し（バッチ式）、１ｍｌの緩衝液ＡまたはＢ中に再懸濁し、そして使い捨てカラムにロードした。この樹脂を、（ｉ）４℃で緩衝液Ａを、または（ｉｉ）室温で緩衝液Ｂを用いて、フロースルーのＯＤ２８０が０．０２〜０．０１に達するまで洗浄し続けた。この樹脂を、（ｉ）冷却緩衝液Ｃ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸緩衝液、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）または（ｉｉ）緩衝液Ｄ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ６．３および必要に応じて８Ｍの尿素）のいずれかで、フロースルーのＯＤ２８０が０．０２〜０．０１に達するまでさらに洗浄した。このＨｉｓ融合タンパク質を、（ｉ）冷却溶出緩衝液Ａ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸緩衝液、２５０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８．０）または（ｉｉ）溶出緩衝液Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ４．５および必要に応じて８Ｍの尿素）のいずれかの７００μｌを添加することによって溶出し、そしてＯＤ２８０が全ての組換えタンパク質が得られたことを示すまで、画分を回収した。各溶出画分の２０μｌのアリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイを用いて評価した。
【００９１】
（変性したＨｉｓ融合タンパク質の再生）
２８７ｂＭＣ８を可溶化するために変性が必要とされるので、免疫の前に再生工程を用いた。グリセロールを、上記で得られた変性した画分に添加し、１０％ ｖ／ｖの最終濃度を得た。このタンパク質を透析緩衝液Ｉ（１０％ ｖ／ｖ グリセロール、０．５Ｍ アルギニン、５０ｍＭ リン酸緩衝液、５．０ｍＭ 還元型グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン、２．０Ｍ 尿素、ｐＨ８．８）を使用して２００μｇ／ｍｌに希釈し、そして同じ緩衝液に対して、４℃で１２〜１４時間透析した。さらなる透析を、緩衝液ＩＩ（１０％ ｖ／ｖ グリセロール、０．５Ｍ アルギニン、５０ｍＭ リン酸緩衝液、５．０ｍＭ 還元型グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化型グルタチオン、ｐＨ８．８）を用いて４℃で１２〜１４時間実行した。タンパク質濃度を、以下の式を用いて推定した：
タンパク質（ｍｇ／ｍｌ）＝（１．５５×ＯＤ２８０）−（０．７６×ＯＤ２６０）
（免疫化）
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、０日目、２１日目および３５日目に抗原で免疫し、そして血清を、４９日目に分析した。
【００９２】
（血清分析−ＥＬＩＳＡ）
無莢膜化Ｍｅｎ Ｍ７および莢膜化株を、チョコレートアガープレートにプレートし、そして５％ＣＯ２で３７℃において一晩インキュベーションした。細菌のコロニーを、滅菌ドラコン（ｄｒａｃｏｎ）スワブを使用してアガープレートから回収し、そして０．２５％のグルコースを含むＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）に播種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ６２０を追跡することによりモニターした。ＯＤが０．４〜０．５の値に達するまで増殖させた。この培養物を、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この上清を捨て、そして細菌を、ＰＢＳで２回洗浄し、０．０２５％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に懸濁し、そして３７℃で１時間インキュベーションし、次いで攪拌しながら４℃で一晩インキュベーションした。１００μｌの細菌細胞を９６ウェル Ｇｒｅｉｎｅｒプレートの各ウェルに添加し、そして４℃で一晩インキュベーションした。次いで、各ウェルを、ＰＢＴ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中に０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。２００μｌの飽和緩衝液（水中に２．７％のポリビニルピロリドン１０）を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを３７℃で２時間インキュベーションした。ウェルを、ＰＢＴで３回洗浄した。２００μｌの希釈血清（希釈緩衝液：ＰＢＳ中に１％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．１％のＮａＮ３）を、各ウェルに添加し、このプレートを３７℃で２時間インキュベーションした。ウェルを、ＰＢＴで３回洗浄した。希釈緩衝液に１：２０００に希釈した１００μｌのＨＲＰ結合化ウサギ抗マウス（Ｄａｋｏ）血清を、各ウェルに添加し、そしてこのプレートを、３７℃で９０分間インキュベーションした。ウェルをＰＢＴ緩衝液で３回洗浄した。ＨＲＰに対する１００μｌの基質緩衝液（２５ｍｌのクエン酸緩衝液ｐＨ５、１０ｍｇのＯ−フェニルジアミンおよび１０μｌのＨ２Ｏ２）を各ウェルに添加し、そしてこのプレートを、２０分間室温で放置した。１００μｌの１２．５％Ｈ２ＳＯ４を、各ウェルに添加し、ＯＤ４９０を追跡した。このＥＬＩＳＡ力価を、免疫前のレベルより上の０．４のＯＤ４９０値を与えた血清の希釈として任意で計算された。このＥＬＩＳＡを、０．４のＯＤ４９０での血清の希釈が１：４００より高い場合、陽性と見なした。
【００９３】
（血清分析−ＦＡＣＳスキャン細菌結合アッセイ）
無莢膜化Ｍｅｎ Ｍ７株を、チョコレートアガープレートにプレートし、そして５％ＣＯ２で３７℃において一晩インキュベーションした。細菌コロニーを、滅菌ドラコンスワッブを使用してアガープレートから回収し、そして０．２５％のグルコースを含むＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を各８ｍｌ含有する４つのチューブに播種した。細菌の増殖を３０分毎に、ＯＤ６２０を追跡することによりモニターした。この細菌を、ＯＤが０．３５〜０．５の値に達するまで増殖させた。この培養物を、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この上清を捨て、そしてこのペレットを、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．４％のＮａＮ３）に再懸濁し、そして４０００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞を０．０５のＯＤ６２０に達するようにブロッキング緩衝液に再懸濁した。１００μｌの細菌細胞を、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。（ブロッキング緩衝液中の）１００μｌの希釈血清（１：１００、１：２００、１：４００）を、各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃で２時間インキュベーションした。細胞を４０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を吸引し、そして細胞を、各ウェルに２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加することによって洗浄した。１：１００に希釈された、１００μｌのＲ−フィコエリトリン結合化Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗マウスを、各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃で１時間インキュベーションした。細胞を、４０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によってスピンダウンし、そして２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液の添加によって洗浄した。この上清を、吸引し、そして細胞を、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ（０．２５％のホルムアルデヒド）中で再懸濁した。サンプルをＦＡＣＳｃａｎチューブに移して、そして読み取った。ＦＡＣＳｃａｎ設定の条件（Ｌａｓｅｒ Ｐｏｗｅｒ １５ｍＷ）は、以下のとおりである：ＦＬ２オン；ＦＳＣ−Ｈ閾値：９２；ＦＳＣ ＰＭＴ電圧：Ｅ ０１；ＳＳＣ ＰＭＴ：４７４；増幅利得 ６．１：ＦＬ−２ ＰＭＴ：５８６；補償値：０。
【００９４】
（血清分析−細菌アッセイ）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を、５％ＣＯ２で３７℃においてチョコレートアガープレート上で一晩増殖した（凍結ストックから開始した）。コロニーを、回収しそして０．０５から０．０８のＯＤ６２０に達するように０．２５％のグルコースを含む７ｍｌのＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ ｂｒｏｔｈへの播種に使用した。この培養物を、ＯＤ６２０が０．２３〜０．２４の値に達するまで攪拌しながら３７℃で約１．５時間インキュベーションした。細菌を、１０５のＣＦＵ／ｍｌの作用希釈において１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＣａＣｌ２および０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（アッセイ緩衝液）を含む５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．２に希釈した。最終反応混合物の総量は、試験血清の段階２倍希釈の２５μｌ、作用希釈における細菌の１２．５μｌ、乳仔ウサギ補体の１２．５μｌ（最終濃度２５％）を有する５０μｌであった。
【００９５】
コントロールは、補体血清でインキュベーションされた細菌、細菌でおよび５６℃で３０分間の加熱により不活性化された補体インキュベーションされた免疫血清を含んでいた。乳仔ウサギ補体の添加後、即座に、１０μｌのコントロールを、チルト方法を使用してＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレートにプレートした（時間０）。９６−ウェルプレートを、回転しながら３７℃で１時間インキュベーションした。７μｌの各サンプルを、スポットとしてＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレートにプレートし、それに対し、１０μｌのコントロールを、チルト方法を使用してＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレートにプレートした（時間１）。アガープレートを、３７℃で１８時間インキュベーションし、そして時間０および時間１に対応するコロニーを計数した。
【００９６】
（血清分析−ウェスタンブロッティング）
ＭｅｎＢ株２９９６由来の精製タンパク質（５００ｎｇ／レーン）、外膜小胞（５μｇ）および全細胞抽出物（２５μｇ）を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にロードし、そしてニトロセルロース膜上に転写した。この転写を、２時間、１５０ｍＡ、４℃で転写緩衝液（０．３％ Ｔｒｉｓベース、１．４４％ グリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノール）中で行った。この膜を飽和緩衝液（ＰＢＳ中の１０％ スキムミルク、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）中での４℃の一晩のインキュベートにより飽和させた。この膜を洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の３％ スキムミルク、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）を用いて２回洗浄し、そして洗浄緩衝液中に１：２００に希釈したマウス血清とともに、２時間３７℃でインキュベートした。この膜を２回洗浄し、そして１：２０００希釈の西洋わさびペルオキシダーゼ標識化抗マウスＩｇとともに９０分間インキュベートした。この膜をＰＢＳ中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を用いて２回洗浄し、そしてＯｐｔｉ−４ＣＮ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、発色させた。この反応を、水を添加して停止した。
【００９７】
ＯＭＶを以下のように調製した：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を、５ＧＣプレート上で、５％ＣＯ２で３７℃において一晩増殖し、ループを用いて回収し、そして１０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ中に再懸濁した。５６℃、４５分の熱不活化を行い、そして細菌を５分間氷上で超音波処理することにより破壊した（５０％ 衝撃係数、５０％ 出力、Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ ３ｍｍマイクロチップ）。未破壊細胞を５０００ｇ、１０分間の遠心分離によって除去し、そして全細胞エンベロープ画分を含む上清を回収し、そして５００００ｇ、４℃の一晩さらに遠心分離した。メンブレンを含むペレットを、２％サルコシル、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ ＥＤＴＡ中で再懸濁し、そして２０分間室温でインキュベーションして、内膜を溶解した。この懸濁液を、１００００ｇで１０分間遠心分離して、凝集体を除去し、上清を、５００００ｇで３時間さらに遠心分離した。外膜を含むペレットをＰＢＳで洗浄し、同じ緩衝液で再懸濁した。タンパク質濃度を、スタンダードとしてＢＳＡを使用してＤ．Ｃ．Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（改変Ｌｏｗｒｙ法）によって測定した。
【００９８】
全細胞抽出物を、以下のように調製した：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株２９９６を、ＧＣプレート上で一晩増殖させ、ループを用いて回収し、そして１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁した。５６℃で３０分間熱不活化を行った。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２】 図２は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図３】 図３は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図４】 図４は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図５】 図５は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図６】 図６は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図７】 図７は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図８】 図８は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図９】 図９は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１０】 図１０は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１１】 図１１は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１２】 図１２は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１３】 図１３は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１４】 図１４は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１５】 図１５は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１６】 図１６は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１７】 図１７は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１８】 図１８は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図１９】 図１９は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２０】 図２０は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２１】 図２１は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２２】 図２２は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２３】 図２３は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２４】 図２４は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２５】 図２５は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
【図２６】 図２６は、本発明に従うハイブリッドタンパク質を示す。
Claims (5)
- 式ＮＨ２−Ａ−Ｂ−ＣＯＯＨのハイブリッドタンパク質であって、
Ａは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質ΔＧ２８７を含み、
Ｂは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａタンパク質９５３を含み、
該ハイブリッドタンパク質のアミノ酸配列は、以下の配列：
タンパク質。 - 請求項１に記載のタンパク質であって、ΔＧ２８７が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ２９９６株またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ３９４／９８株に由来する、タンパク質。
- 請求項１に記載のタンパク質であって、９５３が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ２９９６株またはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ３９４／９８株に由来する、タンパク質。
- 請求項１に記載のタンパク質であって、ＡおよびＢが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの同じ株に由来する、タンパク質。
- 請求項１に記載のタンパク質であって、
以下の配列：
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