JP4839449B2 - 電気泳動用バッファ及び電気泳動法 - Google Patents

Description

この発明は、電気泳動に用いる電気泳動用バッファ、及びこの電気泳動用バッファを用いた電気泳動法に関する。

近年、ガンや各種疾病の早期発見の重要性が改めて指摘されており、被験者から採取した微量の血液からＤＮＡや発現タンパク質などを調べる手法に注目が集まっている。

この手法の一つとして、マイクロチップ電気泳動法が挙げられる。マイクロチップ電気泳動法では、マイクロメートルオーダの流路（チャネル）が形成された、手のひらサイズの樹脂板（マイクロチップ）を用いる。マイクロチップ電気泳動法では、ゲルなどを含んだ電気泳動用バッファをチャネルに充填し、チャネルの両端に電圧を印加することにより、試料を電気泳動させる。

しかしながら、疾病の初期段階で発現するタンパク質などは、極微量であるために、従来型のマイクロチップ電気泳動では十分な検出感度を確保できないという問題点が存在した。

この問題点を解決するために、幾つかの新しい方法が提案されている。

第１は、チャネルに導入する試料の量を増加させる方法である（例えば、特許文献１参照）。特許文献１に開示された方法では、以下に列記する手法を用いることにより、迅速かつ高い分解能でタンパク質などの高分子化合物の検出を行うことができる。
（ａ）β−グルカン又はメチルセルロースを含む電気泳動用バッファを用いる。
（ｂ）チャネルに試料を導入する際に加圧を行う。

第２は、マイクロチップ自体を改良する方法である（例えば、特許文献２参照）。特許文献２に開示された方法では、マイクロチップのチャネルを、光散乱機能を有する回折格子などで覆うことにより、試料から発する蛍光を増幅させる。これにより、従来法に比べて試料の検出感度を増加させることができる。

また、検出感度の増加には直接関係しないが、電気泳動用バッファに高分子化合物、金属、酸化物、半導体、セラミックス、クレイ又はシリカからなる微粒子を添加することにより、高速かつ高分離に試料の電気泳動分析を行う技術が知られている（例えば、特許文献３参照）。
国際公開第２００２／９７４２１号パンフレット 特開２００５−１７２７７３号公報 特開２００５−１９５５６２号公報

しかし、特許文献１及び２に開示された方法では、検出感度の増加は、最大でも従来技術の６倍程度に止まっており、より一層、試料の検出感度を高めることが求められていた。また、一般の被験者への適用を考えた場合に、検査にかかるコストをより低下させることが求められていた。また、特許文献３に開示された技術は、既に述べたように、検出感度を高めることを目的とはしていなかった。

この発明の発明者らは鋭意検討の結果、酸化亜鉛微粒子が単独で分散された電気泳動用バッファ、又は、酸化亜鉛微粒子と気泡とが分散された電気泳動用バッファを用いれば、試料の検出感度を増加させることが可能であることに想到した。更に、この電気泳動用バッファを用いて特定の手順で電気泳動を行えば、より一層、試料の検出感度を増加させることが可能であることに想到した。

従って、この発明の第１の目的は、従来よりも高感度であるにもかかわらず、コストの増加が最小限に止められた電気泳動用バッファを提供することである。

また、この発明の第２の目的は、この電気泳動用バッファを用いた、従来よりも非常に高感度な電気泳動法を提供することである。

上述した目的の達成を図るために、この発明の電気泳動用バッファは、下記の構成上の特徴を備えている。

すなわち、この発明の電気泳動用バッファは、ゲルを含んだ水溶液であって、水溶液中に酸化亜鉛微粒子を含むことを特徴とする。

酸化亜鉛微粒子（以下、「ＺｎＯ微粒子」とも称する。）を含む電気泳動用バッファを用いて電気泳動分析を行うことにより、試料の検出感度を増加させることができる。

また、上述の酸化亜鉛微粒子は、さまざまな方法で製造したものを使用できる。例えば、酸素ガスと窒素ガスとを含む混合ガスを雰囲気ガスとして、この雰囲気ガス中で亜鉛を加熱して蒸発させることで、酸化亜鉛微粒子を安価に製造することができる。このようにして製造された酸化亜鉛微粒子は、結晶性が優れているために、耐酸性が比較的強く、電気泳動用バッファ中で溶解しにくい。

また、酸化亜鉛微粒子は、その形態が円柱形であり、その長さが５０〜２５０ｎｍの範囲内にあり、更にその直径が５０〜１２０ｎｍの範囲内にあるものとするのが好ましい。

この場合、上述の長さ及び直径の範囲は、多数の酸化亜鉛微粒子の平均の長さ及び直径とする。つまり、酸化亜鉛微粒子は、上述の長さ及び直径の範囲内において、単一の長さ及び直径を有していてもよいし、平均長さ及び平均直径が上述の長さ及び直径の範囲内にあってもよい。

このように構成することにより、純度が高く、上述した寸法を有する酸化亜鉛微粒子を得ることができる。

また、酸化亜鉛微粒子は、棒状、粒状又は板状の形態をしていて、一辺が５０〜１０００ｎｍの仮想的な立方体の内部に納まる大きさであることが好ましい。

この場合、仮想的な立方体における上述した一辺の長さの範囲は、多数の酸化亜鉛微粒子の平均の長さとする。つまり、酸化亜鉛微粒子は、上述の長さの範囲内において、単一の長さを有していてもよいし、平均長さが上述の長さの範囲内にあってもよい。

また、酸化亜鉛微粒子は、その形態が中心の核から４本以上の棒状結晶が放射状に延在する形状であり、棒状結晶の長さが５０〜１０００ｎｍの範囲内にあるものとするのが好ましい。

この場合においても、棒状結晶の各々における上述した長さの範囲は、多数の棒状結晶の平均の長さとする。つまり、棒状結晶は、上述の長さの範囲内において、単一の長さを有していてもよいし、平均長さが上述の長さの範囲内にあってもよい。

また、酸化亜鉛微粒子として、上述した３種類の酸化亜鉛微粒子からなる群より選択された２種類以上の酸化亜鉛微粒子を混合したものを用いてもよい。

このような酸化亜鉛微粒子を、単独で又は２種類以上混合したものを電気泳動用バッファに分散させることにより、試料の検出感度を増加させることができる。

また、上述の電気泳動用バッファ中における酸化亜鉛微粒子の濃度を、好ましくは０．０２〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の値とするのがよい。

このように構成することにより、電気泳動分析時に試料の検出感度を従来よりも増加させることができる。

また、上述の電気泳動用バッファ中に、好ましくは酸化亜鉛微粒子が凝集して形成されたコロイド粒子が含まれるのがよい。

ここで「コロイド粒子」とは、粒径が１μｍ未満であって、電気泳動用バッファの中に分散している、酸化亜鉛微粒子の凝集体のことを示す。なお、このコロイド粒子は、溶媒である水や、後述する気泡を含んでいてもよい。

また、上述のコロイド粒子を含む場合、電気泳動用バッファ中における酸化亜鉛微粒子の濃度を、好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の値とするのがよい。

このように構成することにより、電気泳動分析時に試料の検出感度を更に増加させることができる。

上述の電気泳動用バッファは、酸化亜鉛微粒子とともに、気泡を含むことが好ましい。

このように構成することによっても、電気泳動分析時に試料の検出感度を従来よりも増加させることができる。

この場合において、気泡の粒径が３０μｍ未満であることが好ましい。

上述の電気泳動用バッファ中に含まれるゲルは、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなるセルロース誘導体群より選択された一種類のセルロース誘導体又は二種類以上を混合したセルロース誘導体からなり、かつ、ゲルの濃度を０．０１〜３ｗｔ％の範囲内の値とすることが好ましい。

この場合において、ゲルの濃度が、０．７〜１ｗｔ％の範囲内の値であればより一層好ましい。

また、上述の電気泳動用バッファに、好ましくは、ゲルに加えて、バクテリアセルロース、又はバクテリアセルロース誘導体を材料とする微小網目構造体を添加するのがよい。

この発明の電気泳動法は、マイクロチップ上で上述の電気泳動用バッファを用いて試料を分離する方法であって、以下の工程を有することを特徴とする。

（１）まず、マイクロチップの導入チャネルと、この導入チャネルに交差する分離チャネルのそれぞれに電気泳動用バッファを充填する充填工程。

（２）導入チャネルに導入用電圧を印加して、導入チャネルに試料を導入する導入工程。

（３）分離チャネルに分離用電圧を断続的に印加して、試料を分離チャネルに導入する遅延期導入工程。

（４）分離チャネルに分離用電圧を印加して、試料を泳動させる本泳動工程。

このように遅延期導入工程において、分離チャネルに試料を複数回に分けて導入することにより、試料の検出感度を増加することができる。

上述の遅延期導入工程は、好ましくは、（ａ）分離チャネルに１７５〜３００Ｖ／ｃｍの範囲内の値の分離用電圧を、分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり２〜２．５秒間内の期間だけ印加する第１サブ工程と、（ｂ）第１サブ工程終了後、０．５〜１秒間内の期間の電圧未印加状態を経て、分離チャネルに分離用電圧を、分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり４〜５秒間内の期間だけ印加する第２サブ工程とを含むことが好ましい。

このように構成することにより、試料の検出感度を従来よりも著しく増加させることができる。

導入工程で、導入チャネルに、３０〜１００Ｖ／ｃｍの範囲内の値の導入用電圧を、導入チャネルの単位長さ（１ｍｍ）当たり６．５〜１０．５秒間内の期間だけ印加することが好ましい。

また、本泳動工程で、分離チャネルに分離用電圧を、分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり４０〜５０秒間内の期間だけ印加することが好ましい。

上述したこの発明の電気泳動用バッファの構成によれば、従来よりも試料の感度を高くすることができる電気泳動用バッファが得られる。また、従来の回折格子を用いる場合（特許文献２）よりも低コストの酸化亜鉛微粒子を用いているので、コストの増加が最小限に抑制された電気泳動用バッファが得られる。

また、上述したこの発明の電気泳動法の構成によれば、この電気泳動用バッファを用いた、従来よりも著しく高感度な電気泳動法が得られる。

以下、図を参照して、この発明の実施の形態について説明する。なお、各図は、各構成要素の形状、大きさ及び配置関係について、この発明が理解できる程度に概略的に示したものにすぎない。また、以下、この発明の好適な構成例について説明するが、各構成要素の材質及び数値的条件などは、単なる好適例にすぎない。従って、この発明は、以下の実施の形態に何ら限定されない。

（１）電気泳動に用いる装置の説明
まず、この発明の実施に適用して好適な電気泳動に用いる装置について説明する。ここで、電気泳動とは、溶液中で電位差により試料としての高分子化合物などを移動させ、試料のサイズの違いにより生じる泳動速度の差を利用して試料を分離する手法のことを意味する。電気泳動法には種々の手法があるが、この項では、この発明を適用して好適なマイクロチップ電気泳動への応用について主に説明する。

（１−１）マイクロチップ
図１を参照して、マイクロチップ電気泳動に用いられる一般的なマイクロチップについて説明する。図１は、マイクロチップの平面図である。

マイクロチップ１０は、平面形状が略長方形状の透明な板状体である。マイクロチップ１０の大きさは、設計に応じて適当な値を選択可能であるが、例えば、縦方向の長さを約１０〜１２０ｍｍの範囲内の値とし、及び横方向の長さを約１０〜１２０ｍｍの範囲内の値とし、及び厚みを約０．５〜５ｍｍの範囲内の値とする。

マイクロチップ１０の材料は、好ましくは、例えばポリメタクリレートとする。マイクロチップ１０の材料は、ポリメタクリレートに限定されず、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、ソーダガラス、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ジメチルシロキサン、ポリエチレンテレフタレートなどから設計に応じて適宜選択することができる。

マイクロチップ１０の表面側には、凹条としての導入チャネル１２及び分離チャネル１４が形成されている。導入チャネル１２と分離チャネル１４とは、交差部１６において、直角に交差している。つまり、導入チャネル１２及び分離チャネル１４は、言わば十字架状の平面形状をなして交差している。

導入チャネル１２の両端には、凹部としての試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂがそれぞれ接続されている。また、分離チャネル１４の両端には、凹部としてのバッファ注入口１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂが接続されている。

（１−２）導入チャネル
導入チャネル１２は、マイクロチップ１０の表面に形成された、均一な幅と深さとを有する溝である。この導入チャネル１２は、分離チャネル１４と交差する直線的な交差溝部分と、この溝部分の両端部分が、それぞれ逆方向に交差溝部分と直交する方向に屈曲して直線的に延在する端部の溝部分とを有している。

導入チャネル１２には、電気泳動用バッファ（以下、単に「バッファ」と称することもある。）が充填される。なお、このバッファの詳細については後述する。導入チャネル１２は、試料リザーバ１２ａに導入された試料を交差部１６にまで移送させるために用いられる。

導入チャネル１２の全長は、好ましくは、例えば約７ｍｍとする。なお、導入チャネル１２の全長は、電気泳動分析に必要十分な量の試料を交差部１６にまで移送できる長さであれば、７ｍｍには限定されない。導入チャネル１２の全長は、２〜３０ｍｍ、より好ましくは３〜１０ｍｍの範囲内から設計に応じた任意の値に設定可能である。

導入チャネル１２の幅は、好ましくは、例えば約１００μｍとする。なお、導入チャネル１２の幅は、１００μｍには限定されない。導入チャネル１２の幅は、５０〜１００μｍ、より好ましくは８０〜１００μｍの範囲内から設計に応じた任意の値に設定可能である。

また、導入チャネル１２の深さは、好ましくは、例えば約３０μｍとする。なお、導入チャネル１２の深さは、３０μｍには限定されない。導入チャネル１２の深さは、１０〜１００μｍ、より好ましくは３０〜５０μｍの範囲内から設計に応じた任意の値に設定可能である。

試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂは、マイクロチップ１０を円柱形に掘り込んだ凹部である。試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂの直径は、好ましくは、例えば約３ｍｍとする。なお、試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂの直径は、試料の容量に応じて適宜変更することが可能である。一般的な容量の試料を扱う場合には、試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂの直径は、試料導入の容易さを考慮すると、直径０．０５ｍｍ以上、好ましくは直径１ｍｍ以上であり、及び、試料の容量を考慮すると、直径５ｍｍ以下、好ましくは直径３ｍｍ以下とするのがよい。

（１−３）分離チャネル
分離チャネル１４は、マイクロチップ１０の表面に形成された直線的に延在する溝であり、均一な幅と深さとを有している。分離チャネル１４は、交差部１６において導入チャネル１２に直角に交差しており、導入チャネル１２よりも全長が長く形成されている。分離チャネル１４には、後述するバッファが充填される。分離チャネル１４は、交差部１６に存在する試料をバッファ貯留孔１４ｂに向けて電気泳動させて、サイズごとに分離するために用いられる。

分離チャネル１４の全長、すなわちバッファ注入孔１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂ間の長さは、好ましくは、例えば約４．５ｃｍとする。

ここで、試料が電気泳動される距離、すなわち交差部１６からバッファ貯留孔１４ｂまでの間の分離チャネル１４の長さを「分離長」と称する。このとき、分離長の長さは、好ましくは、例えば約３ｃｍとする。なお、分離長の長さは、何ら３ｃｍに限定されるものではない。分離長は、１ｃｍ〜５ｃｍの範囲内で設計に応じた任意好適な長さに設定することができる。ただし、試料の十分な分解能を得る観点から、分離長は１ｃｍ以上であることが好ましく、及び、高速分離の観点から５ｃｍ以下であることが好ましい。

分離チャネル１４の幅及び深さは、既に説明した導入チャネル１２と同様であるので、その詳細な説明は省略する。バッファ注入孔１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂは、マイクロチップ１０を円柱形に掘り込んだ凹部である。バッファ注入口１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂの大きさは、既に説明した試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂと同様であるので、その詳細な説明は省略する。

（２）電気泳動用バッファの説明
続いて、この発明のバッファについて説明する。

バッファは、試料の電気泳動分離に先立ち、上述の導入チャネル１２及び分離チャネル１４に充填されるものである。

この発明のバッファは、電気泳動用バッファ母液（以下、単に「母液」とも称する。）に、後述する“ＺｎＯ微粒子”を分散するか、又は“ＺｎＯ微粒子及び気泡”を分散することで調製される。以下、バッファの構成要素ごとに説明を行う。

（２−１）電気泳動用バッファ母液
母液は、親水性のゲルを含んだ水溶液として調製される。

ここで、親水性ゲルの材料物質としては、電気泳動に一般的に用いられる物質を選択することができるが、特に、各種のセルロース誘導体が好適である。より具体的には、セルロース誘導体としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＭＣ）又はヒドロキシプロピルメチルセルロースが好適である。なお、このゲルを構成する材料として、これらセルロース誘導体の内、一種類を用いてもよいし、又は、二種類以上を混合したものを用いてもよい。

これらの材料物質を溶解する水としては、超純水又は脱イオン水などを用いることができるが、特に超純水が好適である。なお、この水としては、これらの水の内、一種類を用いてもよいし、又は、二種類以上を混合したものを用いてもよい。

また、母液のｐＨは、電気泳動分離すべき試料の種類により適宜調整される。より具体的には、試料がタンパク質の場合には、母液のｐＨを２〜９の範囲内の任意好適な値、より好ましくは６．８〜８．６の範囲内の任意好適な値に調整する。また、試料がペプチドの場合には、母液のｐＨを２〜１１の範囲内の任意好適な値、より好ましくは２．５〜３．１の範囲内の任意好適な値に調整する。更に、試料が核酸の場合には、母液のｐＨを６．８〜９．２の範囲内の任意好適な値、より好ましくは７．５〜８．５の範囲内の任意好適な値に調整する。ただし、ＺｎＯ微粒子は、強酸性下（およそｐＨ３以下）で、バッファに溶解するおそれがある。そのため、試料としてペプチドを用いる際には、できるだけ中性（ｐＨ≒７）に近いｐＨのバッファを用いることが好ましい。

母液におけるゲルの濃度は、０．０１〜３ｗｔ％の範囲内の任意好適な値とすることが好ましい。この濃度は、主に、分離すべき試料のサイズを勘案して決定される。後述する実施例ではゲル濃度で０．７〜１ｗｔ％とすることで良い結果が得られている。

下記表１に、ゲルとしてＨＰＭＣを用い、及び試料としてＤＮＡを用いた場合の好適なゲル濃度と試料サイズとの関係を、ゲル網目のサイズとともに示す。

（２−２）ＺｎＯ微粒子
ＺｎＯ微粒子は、この発明のバッファの必須構成要件である。

ＺｎＯ微粒子としては、酸素ガスと窒素ガスとを含む混合ガスを雰囲気ガスとして、この雰囲気ガスの中で亜鉛を加熱して蒸発させることで製造されたものを用いている。

以下、図２を参照してＺｎＯ微粒子の製造方法について概説する。図２は、ＺｎＯ微粒子の製造装置の構成を概略的に示す模式図である。なお、ここで説明するＺｎＯ微粒子の製造方法については、特開２００５−６０１４５号公報に詳述されている。

製造装置２０は、チャンバ２２と、チャンバ２２内に設けられたカーボン電極２４と、導電性ハース２６とを備えている。また、チャンバ２２には、チャンバ２２内を減圧するための真空排気系２８、及びチャンバ２２内に所定のガスを導入するためのガス導入系３０が接続されている。

ＺｎＯ微粒子を製造するに当っては、チャンバ２２内を減圧する。そして、チャンバ２２内に、酸素ガスと窒素ガスとを含む混合ガス（ここでは、大気を用いている。）を２０×１０^３Ｐａの圧力で導入する。

その後、導電性ハース２６上に載置された原料であるＺｎ（亜鉛）インゴット３２（純度４Ｎ：９９．９９％）とカーボン電極２４との間でアーク放電を発生させ、Ｚｎを連続的に蒸発させる。

蒸発したＺｎは、チャンバ２２内の酸素と反応してＺｎＯ微粒子となり、チャンバ２２の内壁面に堆積する。

このようにして製造されたＺｎＯ微粒子のＴＥＭ（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）写真（撮影倍率：１万倍）を、スケールとともに図３（Ａ）に示す。なお、ＴＥＭとしては、ＪＥＭ−４０００ＥＸ（日本電子株式会社製）を用いた。

図３（Ａ）によれば、ＺｎＯ微粒子の各々は、略円柱形の形態をしており、その長さが５０〜２５０ｎｍの範囲内であって、その直径が５０〜１２０ｎｍの範囲内にある。

詳しくは後述する実施例の項で説明するが、このようにして得られたＺｎＯ微粒子が分散したバッファを用いることにより、電気泳動分析時に試料の検出感度を増加させることができる。なお、特に断らない限り、以下の記載で「ＺｎＯ微粒子」とは、上述した略円柱形のＺｎＯ微粒子を指す。

また、ＺｎＯ微粒子の写真は添付しないが、上述の雰囲気ガス中で、例えばアーク放電の電流値などの製造条件を変更することにより、図３（Ａ）とは異なった形状のＺｎＯ微粒子を得ることができる。このようにして得られたＺｎＯ微粒子は、棒状、粒状又は板状の形態をしていて、一辺が５０〜１０００ｎｍの仮想的な立方体の内部に納まる大きさである。このような形状のＺｎＯ微粒子が分散したバッファを用いることでも、電気泳動分析時に試料の検出感度を増加させることができる。

なお、ＺｎＯ微粒子の製造に当って、窒素ガスの代わりにアルゴンガスを用いることにより、図３（Ａ）とは異なった形態のＺｎＯ微粒子を得ることができる。

アルゴンガスを用いて得られたＺｎＯ微粒子のＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）写真（撮影倍率：１万倍）を図３（Ｂ）に示す。

このようにして得られたＺｎＯ微粒子は、中心の核から４本以上の棒状結晶が放射状に延在する形態であり、棒状結晶の長さが５０〜１０００ｎｍの範囲内にある。このＺｎＯ微粒子は、言わば各突起の長さが長い金平糖状の形態を有する。このような形状のＺｎＯ微粒子が分散したバッファを用いることでも、電気泳動分析時に試料の検出感度を増加させることができる。

これらの方法で製造されたＺｎＯ微粒子は、単独でバッファに分散させてもよいし、２種類以上を混合してバッファに分散させてもよい。このようにすることでも、電気泳動分析時に試料の検出感度を増加させることができる。

また、ＺｎＯ微粒子は、上述の方法で安価に製造できることから、バッファに添加したとしても、そのコスト増加を最小限に抑制することができる。

ＺｎＯ微粒子を母液に添加するには大きく分けて、以下に列記する２種類の方法がある。
（ａ）ＺｎＯ微粒子を分散させた分散液を母液に添加して攪拌する方法（以降、「希釈法」と称する）。
（ｂ）ＺｎＯ微粒子を母液に直接添加して攪拌する（以降、「直接添加法」と称する）。

以下、（ａ）の「希釈法」について更に詳細に説明する。

ＺｎＯ微粒子を分散させる溶媒としては、水、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）及びＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）などを用いることができる。

これらの溶液に、下記表２に示した濃度以下の濃度となるようにＺｎＯ微粒子を添加して、分散機により分散させる。これによりＺｎＯ微粒子が液中で均一に分散した透明な分散液を得ることができる。この分散液は、透明（肉眼で白濁が確認されない）ことから、後述するコロイド粒子は生成していないものと推測される。なお、分散機としては、例えば、ボールミル回転装置ＡＶ−１（アサヒ理化製作所製）などの一般的な分散機を用いることができる。

下記表２に、上述の分散液において、ＺｎＯ微粒子が透明な状態で分散することができる限界濃度を、溶媒ごとに示す。

これらの分散液を、試料の電気泳動を阻害しない割合で母液と混合することにより、ＺｎＯ微粒子が添加された透明なバッファを得ることができる。

なお、「試料の電気泳動を阻害しない割合」とは、（ａ）分散液の添加の前後で試料の泳動速度に実質的に差がなく、かつ（ｂ）試料と結合して蛍光を発する蛍光色素標識がゲル中で実用上十分な濃度に保たれる割合であることを意味する。この割合は、溶媒の種類により異なるが、水を溶媒とする分散液の場合には、母液：分散液＝１８〜２２：１の範囲内の設計に応じた任意好適な体積比で混合することが好ましい。

次に、ＺｎＯ微粒子のバッファ中での濃度について説明する。

希釈法又は直接添加法の別にかかわらず、ＺｎＯ微粒子の濃度は、０．０２〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内で設計に応じた任意好適な値とすることが好ましい。ＺｎＯ微粒子の濃度をこの範囲とすることにより、試料の検出感度が有意に増加する。

更に好適には、ＺｎＯ微粒子の濃度を５０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の値とすることが好ましい。ＺｎＯ微粒子の濃度をこの範囲内の値とすることにより、バッファ中でＺｎＯ微粒子が凝集して、コロイド粒子が形成される。コロイド粒子の存在は、バッファが薄く白濁することにより確認できる。詳しくは後述する実施例で説明するが、バッファ中でコロイド粒子が形成される場合、試料の検出感度がより一層増加する。

（２−３）気泡
この発明の好適な実施例によれば、バッファは、ＺｎＯ微粒子とともに気泡を含むのがよい。以下、この気泡について説明する。

気泡は、バッファを攪拌することにより、バッファ中に分散される。より詳細には、ボルテックスミキサなどにより、バッファを震蕩して攪拌する。これにより、バッファ中に大気が巻き込まれ、すなわち取り込まれ、気泡が分散される。

気泡の粒径（直径）は、導入チャネル１２及び分離チャネル１４のサイズよりも小さいサイズとする。具体的には、導入チャネル１２及び分離チャネル１４の最小サイズが３０μｍ（深さ）であるので、気泡の粒径は、この最小サイズ未満の大きさであることが好ましい。なお、気泡のサイズが３０μｍ未満であることから、周知の通り気泡を肉眼で確認することはできない。

気泡の粒径をこの範囲とすることにより、導入チャネル１２及び分離チャネル１４で、気泡が目詰まりすることがない。その結果、両チャネル１２及び１４中において、試料をスムーズに泳動させることができる。また、電気的絶縁体である気泡の目詰まりが生じないことから、両チャネル１２及び１４に対して確実に所定の電圧を印加することができる。

詳しくは後述する実施例で説明するが、ＺｎＯ微粒子と気泡とを含むバッファを単独で用いて試料の電気泳動を行うことにより、約２倍の検出感度増加が見られた。

（２−４）バクテリアセルロース
バッファは、ＺｎＯ微粒子又はＺｎＯ微粒子＋気泡の他に、バクテリアセルロース又はバクテリアセルロース誘導体を材料とする微小網目構造体を含んでいてもよい。ここで、バクテリアセルロースとは、セルロース生産菌によって生産されたセルロースのことを意味する。このバクテリアセルロースは、太さが１０〜１００ｎｍの範囲内にある繊維がランダムに絡み合っている。その結果、バクテリアセルロースは、網目のサイズが０．１〜１μｍの範囲内にある３次元の微小網目構造体を形成している。

バッファに、このようなバクテリアセルロースを添加することによって、試料の検出感度を増加させることができる。

（３）電気泳動法
続いて、この発明の電気泳動法について、遅延期導入法を中心に説明する。この発明の電気泳動法では、充填工程、導入工程、遅延期導入工程及び本泳動工程をこの順序で実施する。以下、それぞれの工程について詳細に説明する。

（３−１）充填工程
電気泳動を行うに当っては、まず、マイクロチップ１０の導入チャネル１２と、これに交差する分離チャネル１４のそれぞれにバッファを充填する充填工程を実施する。具体的には、導入チャネル１２及び分離チャネル１４の双方に、この発明のバッファを公知の方法により充填する。その後に、試料リザーバ１２ａにマイクロピペットなどを用いて、適当量の試料を導入する。

（３−２）導入工程
導入工程においては、導入チャネル１２に対して導入用電圧を印加する。一般に、試料（核酸、タンパク質又はペプチドなど）はバッファ中でマイナス（−）に帯電している。従って、アウトレット１２ｂを正極（＋）とし、及び試料リザーバ１２ａを負極（−）として、導入チャネル１２に導入用電圧を印加することにより、試料を、試料リザーバ１２ａから導入チャネル１２へと導入することができる。

なお、導入用電圧の大きさは、設計に応じて適当な値を選択できるが、３０〜１００Ｖ／ｃｍの範囲内の値の電圧であることが好ましい。

また、導入用電圧は、試料リザーバ１２ａ中の試料組成を正確に反映した試料が交差部１６で観測されるようになるまでの間、印加し続けることが好ましい。導入用電圧の印加時間の絶対値は、導入チャネル１２の長さによって変化するために、一概に規定することはできない。しかし、経験的に、導入用電圧は、導入チャネル１２の単位長さ（１ｍｍ）当たり６．５〜１０．５秒間内の設計に応じた任意好適な期間だけ印加することが好ましいことが明らかとなっている。つまり、導入チャネル１２の全長が７ｍｍの場合には、導入用電圧の印加時間を、４５．５秒（＝６．５秒×７）から７３．５秒（＝１０．５秒×７）内で定めた時間とする。

（３−３）遅延期導入工程
導入工程の終了後、分離チャネル１４に分離用電圧を断続的に印加して、試料を分離チャネル１４に導入する遅延期導入工程を実施する。具体的には、導入工程の終了後、約１秒の電圧切り替え時間（電圧未印加期間）を経て、分離チャネル１４に分離用電圧を印加する。

遅延期導入工程は、第１サブ工程と第２サブ工程とに分かれている。

第１サブ工程においては、分離チャネル１４に１７５〜３００Ｖ／ｃｍの範囲内の設計に応じた任意好適な値の分離用電圧を、分離チャネル１４の単位長さ（１ｃｍ）当たり２〜２．５秒間内の設計に応じた任意好適な期間だけ印加する。

より詳細には、バッファ注入口１４ａを負極（−）とし、及びバッファ貯留孔１４ｂを正極（＋）として、分離チャネル１４の全長に上述の分離用電圧を印加する。

分離用電圧の印加時間は、分離チャネル１４の全長に依存するが、発明者らの経験によれば、分離チャネル１４の単位長さ（１ｃｍ）当たり２〜２．５秒間内の設計に応じた任意好適な期間だけ印加することが好ましい。つまり、分離チャネルの全長が４．５ｃｍの場合には、第１サブ工程における分離用電圧の印加時間を、９秒（２秒×４．５）〜１１．２５秒（２．５秒×４．５）内で定めた時間とする。

第１サブ工程においては、上述した分離チャネル１４への電圧印加と同時に、導入チャネル１２にも電圧を印加する。より詳細には、試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂの両者を正極（＋）として、導入チャネル１２に戻し電圧を印加する。これにより、分離チャネル１４への過剰な試料の流れ込みを防止する。ここで、戻し電圧の大きさは、設計により適当な値を選択できるが、１３０〜５００Ｖの範囲内の値とするのが好ましい。

第２サブ工程においては、第１サブ工程における分離用電圧印加終了後、０．５〜１秒間内の期間の電圧未印加状態を経て、分離チャネル１４に分離用電圧を、分離チャネル１４の単位長さ（１ｃｍ）当たり４〜５秒間内の期間だけ印加する。なお、「電圧未印加状態」を間に挟んで第１及び第２サブ工程で分離チャネル１４に分離用電圧を印加することが、上述した「断続的」に対応する。

第２サブ工程の具体的な手順は、分離用電圧の印加時間を除いて、第１サブ工程と同様であるので、その詳細な説明は省略する。

第２サブ工程における分離用電圧の印加時間は、第１サブ工程（単位長さ（１ｃｍ）当たり２〜２．５秒）よりも長時間であることが好ましい。具体的には、分離チャネル１４の単位長さ（１ｃｍ）当たり４〜５秒間内の設計に応じた任意好適な期間だけ印加することが好ましい。つまり、分離チャネル１４の全長が４．５ｃｍの場合には、第２サブ工程における分離用電圧の印加時間を、１８秒（４秒×４．５）〜２２．５秒（５秒×４．５）内で定めた時間とする。

詳しくは後述する実施例において説明するが、この発明のバッファを用い、更に遅延期導入工程を実施した後に、本泳動工程を行うことにより、試料の検出感度を最大で約１７倍にまで高めることができる。

また、遅延期導入工程において、分離チャネル１４に２回にわたって試料を導入しているにもかかわらず、本泳動終了後の試料のピークは、分離せずに１本のままに保たれる。

これは、第１及び第２サブ工程において、交差部１６近傍の分離チャネル１４中、つまり、分離チャネル１４の入口に、試料が高濃度に蓄積することが原因と推測される。つまり、分離チャネル１４の交差部１６近傍に存在するコロイド粒子（ＺｎＯ微粒子由来）や気泡などに、遅延期導入工程で分離チャネル１４に導入される試料がトラップされるものと推測される。その結果、分離チャネル１４の入口付近（交差部１６付近）で、試料は、１本のピークのまま高濃度に濃縮するものと推測される。

（３−４）本泳動工程
遅延期導入工程の終了後、分離チャネル１４に分離用電圧を印加して、試料を泳動させる本泳動工程を実施する。

より詳細には、分離用電圧の印加時間が長時間である以外は、既に説明した第１サブ工程と同様にして、分離チャネル１４に分離用電圧を、及び導入チャネル１２に戻し電圧を印加する。これにより、交差部１６に存在する試料を分離チャネル１４に沿って電気泳動させることができる。

本泳動工程における分離用電圧の印加時間は、分離チャネル１４の単位長さ（１ｃｍ）当たり４０〜５０秒の範囲内の設計に応じた任意好適な期間とすることが好ましい。つまり、分離チャネルの全長が４．５ｃｍの場合には、本泳動工程における分離用電圧の印加時間を、１８０秒（４０秒×４．５）〜２２５秒（５０秒×４．５）内で定めた時間とする。

これにより、分離用チャネル１４の中で、試料はサイズごとに分離される。

以下、実施例により、この発明をより詳細に説明するが、この発明は、以下の実施例により何ら限定されるものではない。

（１）実験の概要の説明
実験は大きく分けて、（実験群１）、（実験群２）及び（実験群３）に分類される。

（実験群１）では、この発明のバッファの効果を主に確認している。図４に示すように、（実験群１）には、実験Ａ〜Ｄが含まれる。

（実験群２）では、この発明の電気泳動法の効果を主に確認している。図４に示すように、（実験群２）には、実験Ｅ〜Ｉが含まれる。

（実験群３）では、気泡の分散条件及び遅延期導入法の好適条件を主に確認している。（実験群３）には、実験Ｊ〜Ｌが含まれる。

（２）各実験に共通した条件の説明
重複した説明を避けるために、この項においては、各実験に共通した条件を以下の各項にまとめる。

（ａ）電気泳動には、日立ＳＶ１１００マイクロチップ電気泳動装置コスモアイ用ＤＮＡ鎖長分析キット（日立化成工業株式会社）を用いた。なお、この装置は、一旦、マイクロチップがセットされたならば、試料の蛍光分析までを自動的に実施することが可能である。後述する（ｍ）項で説明する生データは、この装置により測定された試料のピークの蛍光強度を示す。

（ｂ）母液としては、（ａ）項で説明した装置に付属されたＨＰＭＣを超純水で０．７ｗｔ％に希釈したものを用いた。

（ｃ）蛍光色素標識としては、（ｂ）項のＨＰＭＣ中に予め添加されているエチジウムブロマイドを用いた。なお、エチジウムブロマイドは、波長が４７０ｎｍの励起光で励起されて、波長が５８０ｎｍの蛍光を発する。

（ｄ）各実験に用いた母液の量は２００μＬとした。

（ｅ）試料として、共通のＤＮＡ標準サンプル（Φ×１７４−Ｈｉｎｃ ＩＩ ｄｉｇｅｓｔ，Ｔａｋａｒａ）を用いた。この標準サンプルには、予め決められた数種類の長さのＤＮＡ鎖が、それぞれ決められた濃度で含まれている。そして、ＤＮＡ鎖の長さに応じて、分離チャネル１４中で異なった位置でピークを取る。

（ｆ）マイクロチップとしては、図１を参照して説明したマイクロチップ１０に相当するマイクロチップであって、（ａ）項で説明した装置に適合するものを用いた。具体的には、マイクロチップ１０は、導入チャネル１２の長さが７ｍｍ、分離チャネル１４の全長が４．５ｃｍ、及び分離長が３ｃｍである。なお、このマイクロチップ１０は、「発明を実施するための最良の形態」の項で説明したものである。

（ｇ）ＺｎＯ微粒子及び気泡をバッファに分散させるために、ボルテックスミキサ（ＭＳ２Ｓ９ Ｍｉｎｉｓｈａｋａｒ ＩＫＡ ＷｏｒｋｓＩｎｃ．）を用いた。

（ｈ）特に断らない限り、母液にＺｎＯ微粒子及び気泡を分散させるに当っては、ボルテックスミキサの回転数を２４００ｒｐｍとし、及び約１０秒ごとにインターバルを挟みながら合計２分間、震蕩攪拌した。

（ｉ）バッファの調製に用いたビーカとしては、シリコナイズアシストチューブ（１．５ミリリットル容積）（ＣａｔＮｏ．２１５０Ｚ，ＡＳＳＩＳＴ Ｔｒａｄｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を用いた。

（ｊ）試料を導入チャネル１２に導入する導入工程において、３００Ｖの導入用電圧を６０秒間印加した。

（ｋ）遅延期導入工程及び本泳動工程における分離用電圧を７５０Ｖとした。また、本泳動工程における分離用電圧の印加時間を１８０秒とした。

（ｌ）特に断らない限り、遅延期導入工程は、（ｋ）項の分離用電圧を分離チャネル１４に１０秒間印加する第１サブ工程と、第１サブ工程終了後、１秒の電圧未印加状態を経て、分離用電圧を分離チャネル１４に２０秒間印加する第２サブ工程とで構成される。

（ｍ）特に断らない限り、各実験はそれぞれ４〜５回実施した。そして、実験ごとの相対蛍光強度（表３及び図４参照）を以下の手順で算出した。
（Ａ）第ｉ回目（ｉは１≦ｉ≦各実験の実施回数Ｎ）の測定で検出される第ｊピーク（ｊは１≦ｊ≦（１試料で検出されるピークの本数ＰＮ））の蛍光強度Ｉ_ｊ（ｉ）（生データ）を、実施回数Ｎで平均して、第ｊ平均ピーク強度ＡｖＩ_ｊ（＝（ΣＩ_ｊ（ｉ＝１〜Ｎ））／Ｎ）を求めた。
（Ｂ）ピーク位置ごとに、各実験の平均ピーク強度ＡｖＩ_ｊを、対照実験（実験Ａ）の平均ピーク強度（ＡｖＣＩ_ｊ）で除して、平均ピーク強度比率ＲＩ_ｊ（＝ＡｖＩ_ｊ／ＡｖＣＩ_ｊ）を求めた。
（Ｃ）この平均ピーク強度比率ＲＩ_ｊを、更に、１試料で検出されるピークの本数ＰＮで平均して、後述する図４や表３〜７に示した相対蛍光強度（＝（ΣＲＩ_ｊ（ｊ＝１〜ＰＮ））／ＰＮ）とした。

（３）実験群１及び実験群２についての説明
（実験群１）及び（実験群２）に属する実験Ａ〜Ｉは、ほぼ同様の手順で行われている。そこでこの項においては、両実験群についてまとめて説明する。

以下の表３に、各実験の条件及び結果をまとめた。なお、表３中の「結果」の欄の数値は、グラフとして図４に示してある。

（３−１）実験条件
以下、実験Ａ〜Ｉについて、詳細な実験条件を説明する。

（実験Ａ：実験群１）
実験Ａは、従来法で行った電気泳動である。すなわち、バッファには、ＺｎＯ微粒子及び気泡は分散されていない。また、試料の遅延期導入を行っていない。従って、実験Ａは「比較例」に対応する。また、実験Ａは、その他の実験において相対蛍光強度を求める際の基準値を与える対照実験である。

（実験Ｂ：実験群１）
実験Ｂは、気泡が分散されたバッファの効果を確認するための実験である。つまり、バッファには気泡のみが分散されている。また、バッファ単体の効果を確認するために、試料の遅延期導入を行っていない。従って、実験Ｂは「比較例」に対応する。

バッファへの気泡の分散は、ビーカに入れた母液を、ボルテックスミキサを用いて震蕩攪拌することにより行った。この震蕩攪拌によって、母液中に大気すなわち空気が気泡として巻き込まれ、分散される。

（実験Ｃ：実験群１）
実験Ｃは、ＺｎＯ微粒子が分散されたバッファの効果を確認するための実験である。つまり、バッファには、ＺｎＯ微粒子のみが低濃度で分散されている。また、バッファ単体の効果を確認するために、試料の遅延期導入を行っていない。従って、実験Ｃは「実施例」に対応する。

以下、ＺｎＯ微粒子のバッファへの分散方法について説明する。実験Ｃにおいては、既に説明した希釈法により、母液にＺｎＯ微粒子を分散させて含ませた。具体的には、まず、水（Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ，ＧＩＢＣＯ）に０．３６ｍｇ／ｍＬの濃度で均一にＺｎＯ微粒子が分散された分散液を調製した。そして、分散液：母液＝１：２０の体積比で、ビーカ中の母液に分散液をマイクロピペットで添加した。その後、マイクロピペットの先端部で、バッファを十分に攪拌することによりＺｎＯ微粒子を液中で均一に分散させた。なお、目視で観察する限りにおいてバッファは透明であった。

（実験Ｄ：実験群１）
実験Ｄは、ＺｎＯ微粒子及び気泡の両者が分散されたバッファの効果を確認するための実験である。つまり、バッファには、ＺｎＯ微粒子と気泡とが分散されて含まれている。なお、実験ＤにおけるＺｎＯ微粒子の濃度は、実験Ｃよりも高濃度とした。また、バッファ単体の効果を確認するために、試料の遅延期導入は行っていない。従って、実験Ｄは「実施例」に対応する。

以下、ＺｎＯ微粒子及び気泡の分散方法について説明する。既に説明した直接添加法により、母液にＺｎＯ微粒子を分散させて含ませた。具体的には、ＺｎＯ微粒子の濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるように、ＺｎＯ微粒子をビーカ中の母液に添加した。そして、ＺｎＯ微粒子が添加された母液を、ボルテックスミキサで震蕩攪拌することにより、ＺｎＯ微粒子を均一に分散させるとともに、バッファ中に大気すなわち空気の気泡を均一に分散させて含ませた。

なお、実験Ｄにおけるバッファは、薄く白濁していた。これは、バッファ中で、ＺｎＯ微粒子が水や気泡を内包しながら凝集して、コロイド粒子が形成されたためである。

（実験Ｅ：実験群２）
実験Ｅは、遅延期導入の効果を確認するための実験である。つまり、バッファとして母液（ＺｎＯ微粒子及び気泡が添加されていない）を用い、この発明の遅延期導入を行った。従って、実験Ｅは、「比較例」に対応する。

（実験Ｆ：実験群２）
実験Ｆは、遅延期導入の効果を確認するための実験である。つまり、この発明の遅延期導入工程の効果を確認するために、第１及び第２サブ工程における電圧印加時間を、この発明の範囲外の値に変更した。具体的には、実験Ｆでは、第１サブ工程の電圧印加時間を２０秒とし、及び第２サブ工程の電圧印加時間を１０秒とした。

なお、実験Ｆでは、バッファとして母液のみを用いた。従って、実験Ｆは、「比較例」に対応する。

（実験Ｇ：実験群２）
実験Ｇは、この発明の電気泳動法の効果を確認するための実験である。つまり、バッファとして、ＺｎＯ微粒子及び気泡が分散されたものを用いて遅延期導入を行った。

実験Ｇにおいて、ＺｎＯ微粒子の母液への添加条件は、実験Ｃと同様である。ただし、実験Ｃとは異なり、実験ＧではＺｎＯ微粒子の母液への添加後、気泡を分散させるために、ボルテックスミキサによる震蕩攪拌を行っている。

なお、実験ＧのバッファにおいてＺｎＯ微粒子の濃度は、次に説明する実験Ｈよりも低濃度とした。また、実験Ｇのバッファは、白濁しておらず透明である。従って、実験Ｇは、「実施例」に対応する。

（実験Ｈ：実験群２）
実験Ｈは、この発明の電気泳動法の効果を確認するための実験である。つまり、バッファとして、ＺｎＯ微粒子及び気泡が分散されたものを用いて遅延期導入を行った。

実験Ｈで用いたバッファの調製法は、実験Ｄと同様である。つまり、実験Ｈのバッファにおいて、ＺｎＯ微粒子の濃度は実験Ｇよりも高濃度とした。また、実験Ｈのバッファは、既に説明したコロイド粒子を含んでおり、薄く白濁している。従って、実験Ｈは、「実施例」に対応する。

（実験Ｉ：実験群２）
実験Ｉは、この発明の電気泳動法の効果を確認するための実験である。つまり、実験Ｈと同様のバッファを用いてはいるが、遅延期導入をこの発明の範囲外の方法で行っている。

具体的には、実験Ｉにおける遅延期導入は、実験Ｆと同様の方法で行った。従って、実験Ｉは、「比較例」に対応する。

（３−２）実験結果
表３及び図４に実験結果を示す。また、下記表４に、気泡、ＺｎＯ微粒子及びこの発明の遅延期導入の３条件の有無と、検出感度の増加の程度との関係を示す。なお、表４の一番左側の列に、上述の３条件の中で幾つの条件が満足されているかを“○”の数で示している。

図４，表３及び表４より、以下に列記することが明らかである。

（ａ）図４及び表３から、この発明の範囲に含まれる実験Ｈにおいては、実験Ａ（対照実験）に比較して、約１７倍の蛍光強度の増加が見られる。

（ｂ）図４及び表３から、この発明の範囲に含まれる実験Ｃ，Ｄ及びＧでは、実験Ａ（対照実験）に比較して、２倍を超える蛍光強度の増加が見られる。これは、実験誤差を考慮したとしても有意な差である。

（ｃ）図４及び表３から、この発明の範囲外である実験Ａ，Ｂ，Ｅ，Ｆ及びＩでは、実験誤差を考慮すると、蛍光強度の増加は見られない。

（ｄ）表４の条件番号１〜３から、気泡、ＺｎＯ微粒子又は遅延期導入を単独で実施したとしても、その感度増加効果は、最大でも２倍程度である。

（ｅ）表４の条件番号４〜６より、２条件を満足する場合（○が２個の場合）には、遅延期導入を行わないと、感度増加効果は最大でも２倍程度である。しかし、遅延期導入と他の条件を組み合わせたときの感度増加の程度は、現段階では不明である。

（ｆ）表４の条件番号７及び８より、「３条件を満たせば、感度が一桁以上増加する場合がある。」ことが現段階で少なくとも言える（表４）。

（ｇ）表４の条件番号７及び８より、感度増加の程度は、ＺｎＯ微粒子の濃度に依存する可能性があることがわかる。

これらのことより、この発明のバッファ（実験Ｃ及びＤ）、及びこの発明の電気泳動法（実験Ｇ及びＨ）により、試料の検出感度を増加させることが可能であることがわかる。特に、気泡と高濃度のＺｎＯ微粒子とを含むバッファを用い、この発明の範囲に含まれる遅延期導入を行った実験Ｈでは、試料の検出感度を従来よりも１桁以上増加させることができる。

なお、実験Ｈにおいて、試料の検出感度が大きく増加する理由は、現段階では明確ではない。しかし、発明者らは、下記の（ａ）〜（ｃ）の相乗効果により、検出感度の増加が生じていると推測している。

（ａ）遅延期導入工程の実施により、交差部１６に高濃度に試料が蓄積する。その結果、本泳動工程において分離チャネル１４へ導入される試料の絶対量が増加する。

（ｂ）試料に照射される励起光が、溶媒や気泡を内包したＺｎＯ微粒子由来のコロイド粒子で、いろいろな方向に散乱される。その結果、１個の蛍光色素標識が、散乱されて種々の方向から伝播してくる励起光により何度も励起され、蛍光を発することとなる。よって、蛍光色素標識１個当たりの蛍光強度が増加する。

（ｃ）コロイド粒子に内包される気泡の存在により、バッファの実効屈折率が減少し、分離チャネル１４の光閉じ込め能力が低下する。その結果、蛍光色素標識から発する蛍光が分離チャネル１４から出射しやすくなる。よって、分離チャネル１４から出射する蛍光強度が増加する。

（４）実験群３についての説明
（４−１）実験Ｊ
実験Ｊにおいては、気泡の分散条件を変化させて、試料の検出感度を比較した。具体的には、ボルテックスミキサの攪拌時間を１〜５分の間で変化させた以外は、既に説明した実験Ｂと同様にして実験Ｊ１〜Ｊ５を行った。その結果を下記表５に示す。

表５によると、ボルテックスミキサの攪拌時間を変えて、気泡の分散条件を変更したとしても、蛍光強度の増加は見られないことがわかる。

（４−２）実験Ｋ
実験Ｋは、遅延期導入の好適条件を確認するための実験である。つまり、遅延期導入工程において、第１サブ工程の分離用電圧の印加時間を種々に変更した実験Ｋ１〜Ｋ６を行った。なお、実験Ｋ１〜Ｋ６において、第１サブ工程の電圧印加時間以外の条件は、既に説明した実験Ｅと同様である。その結果を下記表６に示す。

表６によると、第１サブ工程の分離用電圧の印加時間が１０秒を超えると、蛍光強度の増加効果が見られないことが示唆される。正確な結論を得るためには更に実験を行う必要があるが、実験Ｋ１及びＫ２より、第１サブ工程の電圧印加時間の好適値が１０秒以上かつ２０秒未満であることが示唆される。

（４−３）実験Ｌ
実験Ｌは、遅延期導入の好適条件を確認するための実験である。つまり、遅延期導入工程において、第２サブ工程の繰り返し回数を０〜３回の間で変更した実験Ｌ１〜Ｌ４を行った。なお、実験Ｌ１〜Ｌ４において、第２サブ工程の繰り返し回数以外の条件は、既に説明した実験Ｅと同様である。

具体的には、実験Ｌ１は、遅延期導入工程において、第２サブ工程を実施しなかった。すなわち、第１サブ工程終了後、直ちに本泳動工程を行った。

実験Ｌ２は、遅延期導入工程において、１回だけ第２サブ工程を実施した。すなわち、実験Ｌ２は、実験Ｅと全く同じ条件である。

実験Ｌ３は、遅延期導入工程において、第２サブ工程を２回実施した。すなわち、“第１サブ工程→第２サブ工程→第２サブ工程”との処理の後に、本泳動工程を実施した。なお、どちらの第２サブ工程においても、分離用電圧印加時間は２０秒で共通とした。また、１回目の第２サブ工程と２回目の第２サブ工程との間には、１秒の電圧未印加時間を挿入している。

実験Ｌ４では、遅延期導入工程において、第２サブ工程を３回実施した。すなわち、“第１サブ工程→第２サブ工程→第２サブ工程→第２サブ工程”との処理の後に、本泳動工程を実施した。なお、全ての第２サブ工程において、分離用電圧印加時間は２０秒で共通とした。また、連続した第２サブ工程と第２サブ工程との間には、１秒の電圧未印加時間を挿入している。

その結果を下記表７に示す。

表７によると、第２サブ工程の繰り返し回数が０回、２回及び３回では、蛍光強度の増加効果が見られないことが示唆される。正確な結論を得るためには更に実験を行う必要があるが、実験Ｌからは、第２サブ工程を１回のみ行うことが有効であることが示唆される。

マイクロチップの平面図である。 ＺｎＯ微粒子の製造装置の構成を概略的に示す模式図である。 （Ａ）及び（Ｂ）は、ＺｎＯ微粒子のＴＥＭ写真を示す図である。 実施例の説明に供する図である。

符号の説明

１０ マイクロチップ
１２ 導入チャネル
１２ａ 試料リザーバ
１２ｂ アウトレット
１４ 分離チャネル
１４ａ バッファ注入孔
１４ｂ バッファ貯留孔
１６ 交差部
２０ 製造装置
２２ チャンバ
２４ カーボン電極
２６ 導電性ハース
２８ 真空排気系
３０ ガス導入系
３２ Ｚｎインゴット

Claims (18)

1. ゲルを含んだ水溶液であって、
   該水溶液中に酸化亜鉛微粒子を含むことを特徴とする電気泳動用バッファ。
2. 前記酸化亜鉛微粒子が、酸素ガスと窒素ガスとを含む混合ガスを雰囲気ガスとして、該雰囲気ガス中で亜鉛を加熱して蒸発させることで製造されたものであること特徴とする請求項１に記載の電気泳動用バッファ。
3. 前記酸化亜鉛微粒子が、円柱形の形態をしていて、その長さが５０〜２５０ｎｍの範囲内にあって、その直径が５０〜１２０ｎｍの範囲内にあることを特徴とする請求項１又は２に記載の電気泳動用バッファ。
4. 前記酸化亜鉛微粒子が、棒状、粒状又は板状の形態をしていて、一辺が５０〜１０００ｎｍの仮想的な立方体の内部に納まる大きさであることを特徴とする請求項１又は２に記載の電気泳動用バッファ。
5. 前記酸化亜鉛微粒子が、中心の核から４本以上の棒状結晶が放射状に延在する形態をしていて、前記棒状結晶の長さが５０〜１０００ｎｍの範囲内にあることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用バッファ。
6. 前記酸化亜鉛微粒子として、（１）円柱形の形態をしていて、その長さが５０〜２５０ｎｍの範囲内にあって、その直径が５０〜１２０ｎｍの範囲内にある酸化亜鉛微粒子、（２）棒状、粒状又は板状の形態をしていて、一辺が５０〜１０００ｎｍの仮想的な立方体の内部に納まる大きさの酸化亜鉛微粒子、及び（３）中心の核から４本以上の棒状結晶が放射状に延在する形態をしていて、前記棒状結晶の長さが５０〜１０００ｎｍの範囲内にある酸化亜鉛微粒子からなる群より選択された２種類以上の当該酸化亜鉛微粒子を混合したものを用いることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用バッファ。
7. 前記酸化亜鉛微粒子の濃度が、０．０２〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内にあることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の電気泳動用バッファ。
8. 前記酸化亜鉛微粒子が凝集して形成されたコロイド粒子を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の電気泳動用バッファ。
9. 前記酸化亜鉛微粒子の濃度が、５０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内にあることを特徴とする請求項８に記載の電気泳動用バッファ。
10. 前記酸化亜鉛微粒子とともに、気泡を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の電気泳動用バッファ。
11. 前記気泡の粒径が３０μｍ未満であることを特徴とする請求項１０に記載の電気泳動用バッファ。
12. 前記ゲルが、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなるセルロース誘導体群より選択された一種類のセルロース誘導体又は二種類以上を混合したセルロース誘導体からなり、
    前記ゲルの濃度が０．０１〜３ｗｔ％の範囲内にあることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の電気泳動用バッファ。
13. 前記ゲルの濃度が、０．７〜１ｗｔ％の範囲内にあることを特徴とする請求項１２に記載の電気泳動用バッファ。
14. 前記ゲルに加えて、バクテリアセルロース、又はバクテリアセルロース誘導体を材料とする微小網目構造体が添加されていることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の電気泳動用バッファ。
15. マイクロチップ上で請求項１〜１４のいずれか一項に記載の電気泳動用バッファを用いて試料を分離する方法であって、以下の工程を有することを特徴とする電気泳動法。
    （１）前記マイクロチップの導入チャネルと、該導入チャネルに交差する分離チャネルのそれぞれに前記電気泳動用バッファを充填する充填工程。
    （２）前記導入チャネルに導入用電圧を印加して、該導入チャネルに試料を導入する導入工程。
    （３）前記分離チャネルに分離用電圧を断続的に印加して、前記試料を該分離チャネルに導入する遅延期導入工程。
    （４）前記分離チャネルに前記分離用電圧を印加して、前記試料を泳動させる本泳動工程。
16. 前記導入工程で、前記導入チャネルに、３０〜１００Ｖ／ｃｍの範囲内の値の前記導入用電圧を、該導入チャネルの単位長さ（１ｍｍ）当たり６．５〜１０．５秒間内の期間だけ印加することを特徴とする請求項１５に記載の電気泳動法。
17. 前記遅延期導入工程は、前記分離チャネルに１７５〜３００Ｖ／ｃｍの範囲内の値の前記分離用電圧を、該分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり２〜２．５秒間内の期間だけ印加する第１サブ工程と、
    該第１サブ工程終了後、０．５〜１秒間内の期間の電圧未印加状態を経て、前記分離チャネルに前記分離用電圧を、該分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり４〜５秒間内の期間だけ印加する第２サブ工程とを含むことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の電気泳動法。
18. 前記本泳動工程で、前記分離チャネルに前記分離用電圧を、該分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり４０〜５０秒間内の期間だけ印加することを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の電気泳動法。