JP4839449B2 - Electrophoresis buffer and electrophoresis method - Google Patents

Description

この発明は、電気泳動に用いる電気泳動用バッファ、及びこの電気泳動用バッファを用いた電気泳動法に関する。   The present invention relates to an electrophoresis buffer used for electrophoresis and an electrophoresis method using the electrophoresis buffer.

近年、ガンや各種疾病の早期発見の重要性が改めて指摘されており、被験者から採取した微量の血液からＤＮＡや発現タンパク質などを調べる手法に注目が集まっている。   In recent years, the importance of early detection of cancer and various diseases has been pointed out again, and attention has been focused on techniques for examining DNA and expressed proteins from a small amount of blood collected from a subject.

この手法の一つとして、マイクロチップ電気泳動法が挙げられる。マイクロチップ電気泳動法では、マイクロメートルオーダの流路（チャネル）が形成された、手のひらサイズの樹脂板（マイクロチップ）を用いる。マイクロチップ電気泳動法では、ゲルなどを含んだ電気泳動用バッファをチャネルに充填し、チャネルの両端に電圧を印加することにより、試料を電気泳動させる。   One of the techniques is microchip electrophoresis. In the microchip electrophoresis method, a palm-sized resin plate (microchip) having a flow path (channel) on the order of micrometers is used. In microchip electrophoresis, a sample is electrophoresed by filling a channel with an electrophoresis buffer containing a gel or the like and applying a voltage to both ends of the channel.

しかしながら、疾病の初期段階で発現するタンパク質などは、極微量であるために、従来型のマイクロチップ電気泳動では十分な検出感度を確保できないという問題点が存在した。   However, since proteins expressed at an early stage of the disease are in a very small amount, there is a problem that sufficient detection sensitivity cannot be ensured by conventional microchip electrophoresis.

この問題点を解決するために、幾つかの新しい方法が提案されている。   In order to solve this problem, several new methods have been proposed.

第１は、チャネルに導入する試料の量を増加させる方法である（例えば、特許文献１参照）。特許文献１に開示された方法では、以下に列記する手法を用いることにより、迅速かつ高い分解能でタンパク質などの高分子化合物の検出を行うことができる。
（ａ）β−グルカン又はメチルセルロースを含む電気泳動用バッファを用いる。
（ｂ）チャネルに試料を導入する際に加圧を行う。 The first is a method of increasing the amount of sample introduced into the channel (see, for example, Patent Document 1). In the method disclosed in Patent Document 1, it is possible to detect a polymer compound such as a protein quickly and with high resolution by using the methods listed below.
(A) An electrophoresis buffer containing β-glucan or methylcellulose is used.
(B) Pressurization is performed when the sample is introduced into the channel.

第２は、マイクロチップ自体を改良する方法である（例えば、特許文献２参照）。特許文献２に開示された方法では、マイクロチップのチャネルを、光散乱機能を有する回折格子などで覆うことにより、試料から発する蛍光を増幅させる。これにより、従来法に比べて試料の検出感度を増加させることができる。   The second is a method for improving the microchip itself (see, for example, Patent Document 2). In the method disclosed in Patent Document 2, the fluorescence emitted from the sample is amplified by covering the channel of the microchip with a diffraction grating having a light scattering function. Thereby, the detection sensitivity of a sample can be increased compared with the conventional method.

また、検出感度の増加には直接関係しないが、電気泳動用バッファに高分子化合物、金属、酸化物、半導体、セラミックス、クレイ又はシリカからなる微粒子を添加することにより、高速かつ高分離に試料の電気泳動分析を行う技術が知られている（例えば、特許文献３参照）。
国際公開第２００２／９７４２１号パンフレット 特開２００５−１７２７７３号公報 特開２００５−１９５５６２号公報 Although not directly related to the increase in detection sensitivity, the addition of fine particles of polymer compounds, metals, oxides, semiconductors, ceramics, clay, or silica to the electrophoresis buffer enables high-speed and high-resolution separation of the sample. A technique for performing electrophoresis analysis is known (see, for example, Patent Document 3).
International Publication No. 2002/97421 Pamphlet JP 2005-172773 A JP 2005-195562 A

しかし、特許文献１及び２に開示された方法では、検出感度の増加は、最大でも従来技術の６倍程度に止まっており、より一層、試料の検出感度を高めることが求められていた。また、一般の被験者への適用を考えた場合に、検査にかかるコストをより低下させることが求められていた。また、特許文献３に開示された技術は、既に述べたように、検出感度を高めることを目的とはしていなかった。   However, in the methods disclosed in Patent Documents 1 and 2, the increase in detection sensitivity is only about six times that of the prior art, and it has been required to further increase the detection sensitivity of the sample. Moreover, when considering application to a general subject, it has been required to further reduce the cost of the examination. Further, as described above, the technique disclosed in Patent Document 3 is not intended to increase detection sensitivity.

この発明の発明者らは鋭意検討の結果、酸化亜鉛微粒子が単独で分散された電気泳動用バッファ、又は、酸化亜鉛微粒子と気泡とが分散された電気泳動用バッファを用いれば、試料の検出感度を増加させることが可能であることに想到した。更に、この電気泳動用バッファを用いて特定の手順で電気泳動を行えば、より一層、試料の検出感度を増加させることが可能であることに想到した。   As a result of intensive studies, the inventors of the present invention have found that the detection sensitivity of a sample can be obtained by using an electrophoresis buffer in which zinc oxide particles are dispersed alone or an electrophoresis buffer in which zinc oxide particles and bubbles are dispersed. It was thought that it is possible to increase. Furthermore, it has been conceived that the detection sensitivity of the sample can be further increased by performing electrophoresis in a specific procedure using this electrophoresis buffer.

従って、この発明の第１の目的は、従来よりも高感度であるにもかかわらず、コストの増加が最小限に止められた電気泳動用バッファを提供することである。   Accordingly, a first object of the present invention is to provide an electrophoresis buffer in which the increase in cost is minimized while the sensitivity is higher than in the prior art.

また、この発明の第２の目的は、この電気泳動用バッファを用いた、従来よりも非常に高感度な電気泳動法を提供することである。   A second object of the present invention is to provide an electrophoresis method using the electrophoresis buffer and having a much higher sensitivity than before.

上述した目的の達成を図るために、この発明の電気泳動用バッファは、下記の構成上の特徴を備えている。   In order to achieve the above object, the electrophoresis buffer of the present invention has the following structural features.

すなわち、この発明の電気泳動用バッファは、ゲルを含んだ水溶液であって、水溶液中に酸化亜鉛微粒子を含むことを特徴とする。   That is, the electrophoresis buffer of the present invention is an aqueous solution containing a gel, and the aqueous solution contains zinc oxide fine particles.

酸化亜鉛微粒子（以下、「ＺｎＯ微粒子」とも称する。）を含む電気泳動用バッファを用いて電気泳動分析を行うことにより、試料の検出感度を増加させることができる。   By performing electrophoretic analysis using an electrophoresis buffer containing zinc oxide fine particles (hereinafter also referred to as “ZnO fine particles”), the detection sensitivity of the sample can be increased.

また、上述の酸化亜鉛微粒子は、さまざまな方法で製造したものを使用できる。例えば、酸素ガスと窒素ガスとを含む混合ガスを雰囲気ガスとして、この雰囲気ガス中で亜鉛を加熱して蒸発させることで、酸化亜鉛微粒子を安価に製造することができる。このようにして製造された酸化亜鉛微粒子は、結晶性が優れているために、耐酸性が比較的強く、電気泳動用バッファ中で溶解しにくい。   Moreover, what was manufactured by the various method can be used for the above-mentioned zinc oxide fine particles. For example, zinc oxide fine particles can be produced at low cost by using a mixed gas containing oxygen gas and nitrogen gas as an atmospheric gas and heating and evaporating zinc in the atmospheric gas. Since the zinc oxide fine particles produced in this manner have excellent crystallinity, the acid resistance is relatively strong and hardly dissolves in the electrophoresis buffer.

また、酸化亜鉛微粒子は、その形態が円柱形であり、その長さが５０〜２５０ｎｍの範囲内にあり、更にその直径が５０〜１２０ｎｍの範囲内にあるものとするのが好ましい。   Moreover, it is preferable that the zinc oxide fine particles have a cylindrical shape, a length in the range of 50 to 250 nm, and a diameter in the range of 50 to 120 nm.

この場合、上述の長さ及び直径の範囲は、多数の酸化亜鉛微粒子の平均の長さ及び直径とする。つまり、酸化亜鉛微粒子は、上述の長さ及び直径の範囲内において、単一の長さ及び直径を有していてもよいし、平均長さ及び平均直径が上述の長さ及び直径の範囲内にあってもよい。   In this case, the above-described length and diameter ranges are the average length and diameter of a large number of zinc oxide fine particles. That is, the zinc oxide fine particles may have a single length and diameter within the above-mentioned length and diameter range, and the average length and average diameter are within the above-mentioned length and diameter range. May be.

このように構成することにより、純度が高く、上述した寸法を有する酸化亜鉛微粒子を得ることができる。   By comprising in this way, the zinc oxide microparticles | fine-particles which have high purity and have the dimension mentioned above can be obtained.

また、酸化亜鉛微粒子は、棒状、粒状又は板状の形態をしていて、一辺が５０〜１０００ｎｍの仮想的な立方体の内部に納まる大きさであることが好ましい。   Moreover, it is preferable that the zinc oxide fine particles have a rod-like shape, a granular shape, or a plate-like shape, and have a size that fits inside a virtual cube having a side of 50 to 1000 nm.

この場合、仮想的な立方体における上述した一辺の長さの範囲は、多数の酸化亜鉛微粒子の平均の長さとする。つまり、酸化亜鉛微粒子は、上述の長さの範囲内において、単一の長さを有していてもよいし、平均長さが上述の長さの範囲内にあってもよい。   In this case, the above-described range of the length of one side in the virtual cube is the average length of a large number of zinc oxide fine particles. That is, the zinc oxide fine particles may have a single length within the above-mentioned length range, or the average length may be within the above-mentioned length range.

また、酸化亜鉛微粒子は、その形態が中心の核から４本以上の棒状結晶が放射状に延在する形状であり、棒状結晶の長さが５０〜１０００ｎｍの範囲内にあるものとするのが好ましい。   Moreover, it is preferable that the zinc oxide fine particles have a shape in which four or more rod-shaped crystals extend radially from the central nucleus, and the length of the rod-shaped crystals is in the range of 50 to 1000 nm. .

この場合においても、棒状結晶の各々における上述した長さの範囲は、多数の棒状結晶の平均の長さとする。つまり、棒状結晶は、上述の長さの範囲内において、単一の長さを有していてもよいし、平均長さが上述の長さの範囲内にあってもよい。   Even in this case, the above-described length range in each of the rod-shaped crystals is an average length of a large number of rod-shaped crystals. That is, the rod-like crystal may have a single length within the above-mentioned length range, or the average length may be within the above-mentioned length range.

また、酸化亜鉛微粒子として、上述した３種類の酸化亜鉛微粒子からなる群より選択された２種類以上の酸化亜鉛微粒子を混合したものを用いてもよい。   Further, as the zinc oxide fine particles, a mixture of two or more types of zinc oxide fine particles selected from the group consisting of the above-mentioned three types of zinc oxide fine particles may be used.

このような酸化亜鉛微粒子を、単独で又は２種類以上混合したものを電気泳動用バッファに分散させることにより、試料の検出感度を増加させることができる。   The detection sensitivity of the sample can be increased by dispersing such zinc oxide fine particles alone or in a mixture of two or more kinds in the electrophoresis buffer.

また、上述の電気泳動用バッファ中における酸化亜鉛微粒子の濃度を、好ましくは０．０２〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の値とするのがよい。   The concentration of the zinc oxide fine particles in the electrophoresis buffer is preferably set to a value within the range of 0.02 to 100 mg / mL.

このように構成することにより、電気泳動分析時に試料の検出感度を従来よりも増加させることができる。   By configuring in this way, it is possible to increase the detection sensitivity of the sample at the time of electrophoretic analysis.

また、上述の電気泳動用バッファ中に、好ましくは酸化亜鉛微粒子が凝集して形成されたコロイド粒子が含まれるのがよい。   Further, the above-mentioned electrophoresis buffer preferably contains colloidal particles formed by aggregation of zinc oxide fine particles.

ここで「コロイド粒子」とは、粒径が１μｍ未満であって、電気泳動用バッファの中に分散している、酸化亜鉛微粒子の凝集体のことを示す。なお、このコロイド粒子は、溶媒である水や、後述する気泡を含んでいてもよい。   Here, the “colloidal particle” means an aggregate of zinc oxide fine particles having a particle size of less than 1 μm and dispersed in the electrophoresis buffer. In addition, this colloidal particle may contain the water which is a solvent, and the bubble mentioned later.

また、上述のコロイド粒子を含む場合、電気泳動用バッファ中における酸化亜鉛微粒子の濃度を、好ましくは５０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の値とするのがよい。   When the above colloidal particles are included, the concentration of the zinc oxide fine particles in the electrophoresis buffer is preferably set to a value within the range of 50 to 100 mg / mL.

このように構成することにより、電気泳動分析時に試料の検出感度を更に増加させることができる。   With this configuration, it is possible to further increase the detection sensitivity of the sample during the electrophoresis analysis.

上述の電気泳動用バッファは、酸化亜鉛微粒子とともに、気泡を含むことが好ましい。   The above-mentioned electrophoresis buffer preferably contains bubbles together with the zinc oxide fine particles.

このように構成することによっても、電気泳動分析時に試料の検出感度を従来よりも増加させることができる。   Also with this configuration, it is possible to increase the detection sensitivity of the sample at the time of electrophoretic analysis as compared with the conventional case.

この場合において、気泡の粒径が３０μｍ未満であることが好ましい。   In this case, the bubble particle size is preferably less than 30 μm.

上述の電気泳動用バッファ中に含まれるゲルは、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなるセルロース誘導体群より選択された一種類のセルロース誘導体又は二種類以上を混合したセルロース誘導体からなり、かつ、ゲルの濃度を０．０１〜３ｗｔ％の範囲内の値とすることが好ましい。   The gel contained in the above-mentioned electrophoresis buffer comprises one kind of cellulose derivative selected from a cellulose derivative group consisting of methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose, or two or more kinds. It is preferably made of a mixed cellulose derivative, and the gel concentration is preferably in the range of 0.01 to 3 wt%.

この場合において、ゲルの濃度が、０．７〜１ｗｔ％の範囲内の値であればより一層好ましい。   In this case, it is even more preferable if the gel concentration is a value within the range of 0.7 to 1 wt%.

また、上述の電気泳動用バッファに、好ましくは、ゲルに加えて、バクテリアセルロース、又はバクテリアセルロース誘導体を材料とする微小網目構造体を添加するのがよい。   In addition to the gel, the above-described electrophoresis buffer is preferably added with a fine mesh structure made of bacterial cellulose or a bacterial cellulose derivative.

この発明の電気泳動法は、マイクロチップ上で上述の電気泳動用バッファを用いて試料を分離する方法であって、以下の工程を有することを特徴とする。   The electrophoresis method of the present invention is a method for separating a sample using the above-described electrophoresis buffer on a microchip, and has the following steps.

（１）まず、マイクロチップの導入チャネルと、この導入チャネルに交差する分離チャネルのそれぞれに電気泳動用バッファを充填する充填工程。   (1) First, a filling step of filling the electrophoresis buffer in each of the introduction channel of the microchip and the separation channel intersecting with the introduction channel.

（２）導入チャネルに導入用電圧を印加して、導入チャネルに試料を導入する導入工程。   (2) An introducing step of introducing a sample into the introducing channel by applying an introducing voltage to the introducing channel.

（３）分離チャネルに分離用電圧を断続的に印加して、試料を分離チャネルに導入する遅延期導入工程。   (3) A delayed phase introduction step of intermittently applying a separation voltage to the separation channel and introducing the sample into the separation channel.

（４）分離チャネルに分離用電圧を印加して、試料を泳動させる本泳動工程。   (4) A main electrophoresis step in which a sample is migrated by applying a separation voltage to the separation channel.

このように遅延期導入工程において、分離チャネルに試料を複数回に分けて導入することにより、試料の検出感度を増加することができる。   In this way, in the delayed phase introduction step, the sample detection sensitivity can be increased by introducing the sample into the separation channel in a plurality of times.

上述の遅延期導入工程は、好ましくは、（ａ）分離チャネルに１７５〜３００Ｖ／ｃｍの範囲内の値の分離用電圧を、分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり２〜２．５秒間内の期間だけ印加する第１サブ工程と、（ｂ）第１サブ工程終了後、０．５〜１秒間内の期間の電圧未印加状態を経て、分離チャネルに分離用電圧を、分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり４〜５秒間内の期間だけ印加する第２サブ工程とを含むことが好ましい。   The above-described delayed phase introduction step preferably comprises (a) applying a separation voltage having a value in the range of 175 to 300 V / cm to the separation channel within 2 to 2.5 seconds per unit length (1 cm) of the separation channel. A first sub-step that is applied only during the period of (b), and (b) after the first sub-step, after passing through a voltage non-applied state for a period of 0.5 to 1 second, a separation voltage is supplied to the separation channel It is preferable to include a second sub-step of applying only for a period of 4 to 5 seconds per length (1 cm).

このように構成することにより、試料の検出感度を従来よりも著しく増加させることができる。   By comprising in this way, the detection sensitivity of a sample can be increased significantly conventionally.

導入工程で、導入チャネルに、３０〜１００Ｖ／ｃｍの範囲内の値の導入用電圧を、導入チャネルの単位長さ（１ｍｍ）当たり６．５〜１０．５秒間内の期間だけ印加することが好ましい。   In the introduction step, an introduction voltage having a value in the range of 30 to 100 V / cm may be applied to the introduction channel for a period of 6.5 to 10.5 seconds per unit length (1 mm) of the introduction channel. preferable.

また、本泳動工程で、分離チャネルに分離用電圧を、分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり４０〜５０秒間内の期間だけ印加することが好ましい。   In this electrophoresis step, it is preferable to apply a separation voltage to the separation channel only for a period of 40 to 50 seconds per unit length (1 cm) of the separation channel.

上述したこの発明の電気泳動用バッファの構成によれば、従来よりも試料の感度を高くすることができる電気泳動用バッファが得られる。また、従来の回折格子を用いる場合（特許文献２）よりも低コストの酸化亜鉛微粒子を用いているので、コストの増加が最小限に抑制された電気泳動用バッファが得られる。   According to the configuration of the electrophoresis buffer of the present invention described above, an electrophoresis buffer capable of increasing the sensitivity of the sample as compared with the conventional one can be obtained. Further, since zinc oxide fine particles having a lower cost than that in the case of using a conventional diffraction grating (Patent Document 2) are used, an electrophoresis buffer in which an increase in cost is suppressed to a minimum can be obtained.

また、上述したこの発明の電気泳動法の構成によれば、この電気泳動用バッファを用いた、従来よりも著しく高感度な電気泳動法が得られる。   In addition, according to the configuration of the electrophoresis method of the present invention described above, an electrophoresis method using the electrophoresis buffer and having significantly higher sensitivity than the conventional one can be obtained.

以下、図を参照して、この発明の実施の形態について説明する。なお、各図は、各構成要素の形状、大きさ及び配置関係について、この発明が理解できる程度に概略的に示したものにすぎない。また、以下、この発明の好適な構成例について説明するが、各構成要素の材質及び数値的条件などは、単なる好適例にすぎない。従って、この発明は、以下の実施の形態に何ら限定されない。   Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings. Each drawing is merely a schematic representation of the shape, size, and arrangement relationship of each component to the extent that the present invention can be understood. Moreover, although the preferable structural example of this invention is demonstrated hereafter, the material of each component, a numerical condition, etc. are only a suitable example. Therefore, the present invention is not limited to the following embodiments.

（１）電気泳動に用いる装置の説明
まず、この発明の実施に適用して好適な電気泳動に用いる装置について説明する。ここで、電気泳動とは、溶液中で電位差により試料としての高分子化合物などを移動させ、試料のサイズの違いにより生じる泳動速度の差を利用して試料を分離する手法のことを意味する。電気泳動法には種々の手法があるが、この項では、この発明を適用して好適なマイクロチップ電気泳動への応用について主に説明する。 (1) Description of Apparatus Used for Electrophoresis First, an apparatus used for electrophoresis suitable for application to the present invention will be described. Here, electrophoresis means a method of separating a sample by using a difference in migration speed caused by a difference in sample size by moving a polymer compound or the like as a sample in a solution due to a potential difference. There are various methods for electrophoresis. In this section, application to the microchip electrophoresis that is suitable by applying the present invention will be mainly described.

（１−１）マイクロチップ
図１を参照して、マイクロチップ電気泳動に用いられる一般的なマイクロチップについて説明する。図１は、マイクロチップの平面図である。 (1-1) Microchip A general microchip used for microchip electrophoresis will be described with reference to FIG. FIG. 1 is a plan view of a microchip.

マイクロチップ１０は、平面形状が略長方形状の透明な板状体である。マイクロチップ１０の大きさは、設計に応じて適当な値を選択可能であるが、例えば、縦方向の長さを約１０〜１２０ｍｍの範囲内の値とし、及び横方向の長さを約１０〜１２０ｍｍの範囲内の値とし、及び厚みを約０．５〜５ｍｍの範囲内の値とする。   The microchip 10 is a transparent plate having a substantially rectangular planar shape. An appropriate value can be selected as the size of the microchip 10 according to the design. For example, the length in the vertical direction is set to a value in the range of about 10 to 120 mm, and the length in the horizontal direction is set to about 10. The value is in the range of ˜120 mm, and the thickness is in the range of about 0.5 to 5 mm.

マイクロチップ１０の材料は、好ましくは、例えばポリメタクリレートとする。マイクロチップ１０の材料は、ポリメタクリレートに限定されず、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、ソーダガラス、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ジメチルシロキサン、ポリエチレンテレフタレートなどから設計に応じて適宜選択することができる。   The material of the microchip 10 is preferably polymethacrylate, for example. The material of the microchip 10 is not limited to polymethacrylate, and can be appropriately selected from quartz glass, borosilicate glass, soda glass, polymethyl methacrylate, polycarbonate, dimethylsiloxane, polyethylene terephthalate, and the like according to the design.

マイクロチップ１０の表面側には、凹条としての導入チャネル１２及び分離チャネル１４が形成されている。導入チャネル１２と分離チャネル１４とは、交差部１６において、直角に交差している。つまり、導入チャネル１２及び分離チャネル１４は、言わば十字架状の平面形状をなして交差している。   On the surface side of the microchip 10, an introduction channel 12 and a separation channel 14 are formed as concave stripes. The introduction channel 12 and the separation channel 14 intersect at a right angle at the intersection 16. That is, the introduction channel 12 and the separation channel 14 intersect with each other in a cruciform plane shape.

導入チャネル１２の両端には、凹部としての試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂがそれぞれ接続されている。また、分離チャネル１４の両端には、凹部としてのバッファ注入口１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂが接続されている。   At both ends of the introduction channel 12, a sample reservoir 12a and an outlet 12b are connected as recesses. In addition, a buffer inlet 14a and a buffer storage hole 14b serving as recesses are connected to both ends of the separation channel 14.

（１−２）導入チャネル
導入チャネル１２は、マイクロチップ１０の表面に形成された、均一な幅と深さとを有する溝である。この導入チャネル１２は、分離チャネル１４と交差する直線的な交差溝部分と、この溝部分の両端部分が、それぞれ逆方向に交差溝部分と直交する方向に屈曲して直線的に延在する端部の溝部分とを有している。 (1-2) Introduction Channel The introduction channel 12 is a groove formed on the surface of the microchip 10 and having a uniform width and depth. The introduction channel 12 has a straight crossing groove portion intersecting with the separation channel 14 and ends where both end portions of the groove portion are bent in a direction perpendicular to the crossing groove portion in a reverse direction and extend linearly. And a groove portion of the portion.

導入チャネル１２には、電気泳動用バッファ（以下、単に「バッファ」と称することもある。）が充填される。なお、このバッファの詳細については後述する。導入チャネル１２は、試料リザーバ１２ａに導入された試料を交差部１６にまで移送させるために用いられる。   The introduction channel 12 is filled with an electrophoresis buffer (hereinafter also simply referred to as “buffer”). Details of this buffer will be described later. The introduction channel 12 is used to transfer the sample introduced into the sample reservoir 12 a to the intersection 16.

導入チャネル１２の全長は、好ましくは、例えば約７ｍｍとする。なお、導入チャネル１２の全長は、電気泳動分析に必要十分な量の試料を交差部１６にまで移送できる長さであれば、７ｍｍには限定されない。導入チャネル１２の全長は、２〜３０ｍｍ、より好ましくは３〜１０ｍｍの範囲内から設計に応じた任意の値に設定可能である。   The total length of the introduction channel 12 is preferably about 7 mm, for example. The total length of the introduction channel 12 is not limited to 7 mm as long as a sufficient amount of sample necessary for electrophoresis analysis can be transferred to the intersection 16. The total length of the introduction channel 12 can be set to an arbitrary value depending on the design from the range of 2 to 30 mm, more preferably 3 to 10 mm.

導入チャネル１２の幅は、好ましくは、例えば約１００μｍとする。なお、導入チャネル１２の幅は、１００μｍには限定されない。導入チャネル１２の幅は、５０〜１００μｍ、より好ましくは８０〜１００μｍの範囲内から設計に応じた任意の値に設定可能である。   The width of the introduction channel 12 is preferably about 100 μm, for example. The width of the introduction channel 12 is not limited to 100 μm. The width of the introduction channel 12 can be set to an arbitrary value depending on the design from the range of 50 to 100 μm, more preferably 80 to 100 μm.

また、導入チャネル１２の深さは、好ましくは、例えば約３０μｍとする。なお、導入チャネル１２の深さは、３０μｍには限定されない。導入チャネル１２の深さは、１０〜１００μｍ、より好ましくは３０〜５０μｍの範囲内から設計に応じた任意の値に設定可能である。   The depth of the introduction channel 12 is preferably about 30 μm, for example. The depth of the introduction channel 12 is not limited to 30 μm. The depth of the introduction channel 12 can be set to an arbitrary value depending on the design from the range of 10 to 100 μm, more preferably 30 to 50 μm.

試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂは、マイクロチップ１０を円柱形に掘り込んだ凹部である。試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂの直径は、好ましくは、例えば約３ｍｍとする。なお、試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂの直径は、試料の容量に応じて適宜変更することが可能である。一般的な容量の試料を扱う場合には、試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂの直径は、試料導入の容易さを考慮すると、直径０．０５ｍｍ以上、好ましくは直径１ｍｍ以上であり、及び、試料の容量を考慮すると、直径５ｍｍ以下、好ましくは直径３ｍｍ以下とするのがよい。   The sample reservoir 12a and the outlet 12b are concave portions in which the microchip 10 is dug into a cylindrical shape. The diameters of the sample reservoir 12a and the outlet 12b are preferably about 3 mm, for example. The diameters of the sample reservoir 12a and the outlet 12b can be changed as appropriate according to the volume of the sample. When handling a sample having a general capacity, the diameter of the sample reservoir 12a and the outlet 12b is 0.05 mm or more, preferably 1 mm or more in consideration of the ease of sample introduction, and the sample capacity. In view of the above, the diameter is 5 mm or less, preferably 3 mm or less.

（１−３）分離チャネル
分離チャネル１４は、マイクロチップ１０の表面に形成された直線的に延在する溝であり、均一な幅と深さとを有している。分離チャネル１４は、交差部１６において導入チャネル１２に直角に交差しており、導入チャネル１２よりも全長が長く形成されている。分離チャネル１４には、後述するバッファが充填される。分離チャネル１４は、交差部１６に存在する試料をバッファ貯留孔１４ｂに向けて電気泳動させて、サイズごとに分離するために用いられる。 (1-3) Separation Channel The separation channel 14 is a linearly extending groove formed on the surface of the microchip 10 and has a uniform width and depth. The separation channel 14 intersects the introduction channel 12 at a right angle at the intersecting portion 16, and is formed longer than the introduction channel 12. The separation channel 14 is filled with a buffer described later. The separation channel 14 is used to cause the sample present at the intersection 16 to be electrophoresed toward the buffer storage hole 14b and to be separated according to size.

分離チャネル１４の全長、すなわちバッファ注入孔１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂ間の長さは、好ましくは、例えば約４．５ｃｍとする。   The total length of the separation channel 14, that is, the length between the buffer injection hole 14a and the buffer storage hole 14b is preferably about 4.5 cm, for example.

ここで、試料が電気泳動される距離、すなわち交差部１６からバッファ貯留孔１４ｂまでの間の分離チャネル１４の長さを「分離長」と称する。このとき、分離長の長さは、好ましくは、例えば約３ｃｍとする。なお、分離長の長さは、何ら３ｃｍに限定されるものではない。分離長は、１ｃｍ〜５ｃｍの範囲内で設計に応じた任意好適な長さに設定することができる。ただし、試料の十分な分解能を得る観点から、分離長は１ｃｍ以上であることが好ましく、及び、高速分離の観点から５ｃｍ以下であることが好ましい。   Here, the distance at which the sample is electrophoresed, that is, the length of the separation channel 14 between the intersection 16 and the buffer storage hole 14b is referred to as “separation length”. At this time, the length of the separation length is preferably about 3 cm, for example. Note that the length of the separation length is not limited to 3 cm. The separation length can be set to any suitable length depending on the design within the range of 1 cm to 5 cm. However, the separation length is preferably 1 cm or more from the viewpoint of obtaining sufficient resolution of the sample, and preferably 5 cm or less from the viewpoint of high-speed separation.

分離チャネル１４の幅及び深さは、既に説明した導入チャネル１２と同様であるので、その詳細な説明は省略する。バッファ注入孔１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂは、マイクロチップ１０を円柱形に掘り込んだ凹部である。バッファ注入口１４ａ及びバッファ貯留孔１４ｂの大きさは、既に説明した試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂと同様であるので、その詳細な説明は省略する。   Since the width and depth of the separation channel 14 are the same as those of the introduction channel 12 already described, a detailed description thereof will be omitted. The buffer injection hole 14a and the buffer storage hole 14b are concave portions in which the microchip 10 is dug into a cylindrical shape. Since the sizes of the buffer inlet 14a and the buffer storage hole 14b are the same as those of the sample reservoir 12a and the outlet 12b already described, detailed description thereof will be omitted.

（２）電気泳動用バッファの説明
続いて、この発明のバッファについて説明する。 (2) Description of Electrophoresis Buffer Next, the buffer of the present invention will be described.

バッファは、試料の電気泳動分離に先立ち、上述の導入チャネル１２及び分離チャネル１４に充填されるものである。   The buffer fills the introduction channel 12 and the separation channel 14 described above prior to the electrophoretic separation of the sample.

この発明のバッファは、電気泳動用バッファ母液（以下、単に「母液」とも称する。）に、後述する“ＺｎＯ微粒子”を分散するか、又は“ＺｎＯ微粒子及び気泡”を分散することで調製される。以下、バッファの構成要素ごとに説明を行う。   The buffer of the present invention is prepared by dispersing “ZnO fine particles”, which will be described later, or “ZnO fine particles and bubbles” in an electrophoresis buffer mother liquor (hereinafter also simply referred to as “mother liquor”). . Hereinafter, each buffer component will be described.

（２−１）電気泳動用バッファ母液
母液は、親水性のゲルを含んだ水溶液として調製される。 (2-1) Electrophoretic buffer mother liquor The mother liquor is prepared as an aqueous solution containing a hydrophilic gel.

ここで、親水性ゲルの材料物質としては、電気泳動に一般的に用いられる物質を選択することができるが、特に、各種のセルロース誘導体が好適である。より具体的には、セルロース誘導体としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＭＣ）又はヒドロキシプロピルメチルセルロースが好適である。なお、このゲルを構成する材料として、これらセルロース誘導体の内、一種類を用いてもよいし、又は、二種類以上を混合したものを用いてもよい。   Here, as a material substance of the hydrophilic gel, a substance generally used for electrophoresis can be selected, and various cellulose derivatives are particularly suitable. More specifically, as the cellulose derivative, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose (HPMC) or hydroxypropylmethylcellulose is suitable. In addition, as a material which comprises this gel, one type may be used among these cellulose derivatives, or what mixed 2 or more types may be used.

これらの材料物質を溶解する水としては、超純水又は脱イオン水などを用いることができるが、特に超純水が好適である。なお、この水としては、これらの水の内、一種類を用いてもよいし、又は、二種類以上を混合したものを用いてもよい。   As water for dissolving these material substances, ultrapure water or deionized water can be used, and ultrapure water is particularly preferable. In addition, as this water, 1 type may be used among these waters, or what mixed 2 or more types may be used.

また、母液のｐＨは、電気泳動分離すべき試料の種類により適宜調整される。より具体的には、試料がタンパク質の場合には、母液のｐＨを２〜９の範囲内の任意好適な値、より好ましくは６．８〜８．６の範囲内の任意好適な値に調整する。また、試料がペプチドの場合には、母液のｐＨを２〜１１の範囲内の任意好適な値、より好ましくは２．５〜３．１の範囲内の任意好適な値に調整する。更に、試料が核酸の場合には、母液のｐＨを６．８〜９．２の範囲内の任意好適な値、より好ましくは７．５〜８．５の範囲内の任意好適な値に調整する。ただし、ＺｎＯ微粒子は、強酸性下（およそｐＨ３以下）で、バッファに溶解するおそれがある。そのため、試料としてペプチドを用いる際には、できるだけ中性（ｐＨ≒７）に近いｐＨのバッファを用いることが好ましい。   The pH of the mother liquor is appropriately adjusted depending on the type of sample to be electrophoretically separated. More specifically, when the sample is a protein, the pH of the mother liquor is adjusted to any suitable value within the range of 2 to 9, more preferably within the range of 6.8 to 8.6. To do. When the sample is a peptide, the pH of the mother liquor is adjusted to any suitable value within the range of 2 to 11, more preferably within the range of 2.5 to 3.1. Furthermore, when the sample is a nucleic acid, the pH of the mother liquor is adjusted to any suitable value within the range of 6.8 to 9.2, more preferably to any suitable value within the range of 7.5 to 8.5. To do. However, the ZnO fine particles may be dissolved in the buffer under strong acidity (approximately pH 3 or less). Therefore, when using a peptide as a sample, it is preferable to use a buffer having a pH as close to neutrality (pH≈7) as possible.

母液におけるゲルの濃度は、０．０１〜３ｗｔ％の範囲内の任意好適な値とすることが好ましい。この濃度は、主に、分離すべき試料のサイズを勘案して決定される。後述する実施例ではゲル濃度で０．７〜１ｗｔ％とすることで良い結果が得られている。   The concentration of the gel in the mother liquor is preferably any suitable value within the range of 0.01 to 3 wt%. This concentration is mainly determined in consideration of the size of the sample to be separated. In the examples described later, good results are obtained by setting the gel concentration to 0.7 to 1 wt%.

下記表１に、ゲルとしてＨＰＭＣを用い、及び試料としてＤＮＡを用いた場合の好適なゲル濃度と試料サイズとの関係を、ゲル網目のサイズとともに示す。   Table 1 below shows the relationship between a suitable gel concentration and sample size when HPMC is used as the gel and DNA is used as the sample, together with the size of the gel network.

（２−２）ＺｎＯ微粒子
ＺｎＯ微粒子は、この発明のバッファの必須構成要件である。 (2-2) ZnO fine particles ZnO fine particles are an essential constituent of the buffer of the present invention.

ＺｎＯ微粒子としては、酸素ガスと窒素ガスとを含む混合ガスを雰囲気ガスとして、この雰囲気ガスの中で亜鉛を加熱して蒸発させることで製造されたものを用いている。   As the ZnO fine particles, a gas produced by heating and evaporating zinc in the atmosphere gas using a mixed gas containing oxygen gas and nitrogen gas as the atmosphere gas is used.

以下、図２を参照してＺｎＯ微粒子の製造方法について概説する。図２は、ＺｎＯ微粒子の製造装置の構成を概略的に示す模式図である。なお、ここで説明するＺｎＯ微粒子の製造方法については、特開２００５−６０１４５号公報に詳述されている。   Hereinafter, a method for producing ZnO fine particles will be outlined with reference to FIG. FIG. 2 is a schematic view schematically showing a configuration of a ZnO fine particle manufacturing apparatus. In addition, the manufacturing method of ZnO microparticles | fine-particles demonstrated here is explained in full detail in Unexamined-Japanese-Patent No. 2005-60145.

製造装置２０は、チャンバ２２と、チャンバ２２内に設けられたカーボン電極２４と、導電性ハース２６とを備えている。また、チャンバ２２には、チャンバ２２内を減圧するための真空排気系２８、及びチャンバ２２内に所定のガスを導入するためのガス導入系３０が接続されている。   The manufacturing apparatus 20 includes a chamber 22, a carbon electrode 24 provided in the chamber 22, and a conductive hearth 26. The chamber 22 is connected to an evacuation system 28 for reducing the pressure inside the chamber 22 and a gas introduction system 30 for introducing a predetermined gas into the chamber 22.

ＺｎＯ微粒子を製造するに当っては、チャンバ２２内を減圧する。そして、チャンバ２２内に、酸素ガスと窒素ガスとを含む混合ガス（ここでは、大気を用いている。）を２０×１０^３Ｐａの圧力で導入する。 In producing the ZnO fine particles, the pressure in the chamber 22 is reduced. Then, a mixed gas containing oxygen gas and nitrogen gas (here, air is used) is introduced into the chamber 22 at a pressure of 20 × 10 ³ Pa.

その後、導電性ハース２６上に載置された原料であるＺｎ（亜鉛）インゴット３２（純度４Ｎ：９９．９９％）とカーボン電極２４との間でアーク放電を発生させ、Ｚｎを連続的に蒸発させる。   Thereafter, an arc discharge is generated between the carbon electrode 24 and a Zn (zinc) ingot 32 (purity 4N: 99.99%) which is a raw material placed on the conductive hearth 26, and Zn is continuously evaporated. Let

蒸発したＺｎは、チャンバ２２内の酸素と反応してＺｎＯ微粒子となり、チャンバ２２の内壁面に堆積する。   The evaporated Zn reacts with oxygen in the chamber 22 to become ZnO fine particles and is deposited on the inner wall surface of the chamber 22.

このようにして製造されたＺｎＯ微粒子のＴＥＭ（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）写真（撮影倍率：１万倍）を、スケールとともに図３（Ａ）に示す。なお、ＴＥＭとしては、ＪＥＭ−４０００ＥＸ（日本電子株式会社製）を用いた。   FIG. 3A shows a TEM (Transmission Electron Microscope) photograph (photographing magnification: 10,000 times) of the ZnO fine particles thus produced, together with the scale. In addition, as TEM, JEM-4000EX (made by JEOL Ltd.) was used.

図３（Ａ）によれば、ＺｎＯ微粒子の各々は、略円柱形の形態をしており、その長さが５０〜２５０ｎｍの範囲内であって、その直径が５０〜１２０ｎｍの範囲内にある。   According to FIG. 3 (A), each of the ZnO fine particles has a substantially cylindrical shape, the length thereof is in the range of 50 to 250 nm, and the diameter thereof is in the range of 50 to 120 nm. .

詳しくは後述する実施例の項で説明するが、このようにして得られたＺｎＯ微粒子が分散したバッファを用いることにより、電気泳動分析時に試料の検出感度を増加させることができる。なお、特に断らない限り、以下の記載で「ＺｎＯ微粒子」とは、上述した略円柱形のＺｎＯ微粒子を指す。   Although details will be described later in the Examples section, the detection sensitivity of the sample can be increased during the electrophoretic analysis by using the thus obtained buffer in which the ZnO fine particles are dispersed. Unless otherwise specified, in the following description, “ZnO fine particles” refers to the substantially cylindrical ZnO fine particles described above.

また、ＺｎＯ微粒子の写真は添付しないが、上述の雰囲気ガス中で、例えばアーク放電の電流値などの製造条件を変更することにより、図３（Ａ）とは異なった形状のＺｎＯ微粒子を得ることができる。このようにして得られたＺｎＯ微粒子は、棒状、粒状又は板状の形態をしていて、一辺が５０〜１０００ｎｍの仮想的な立方体の内部に納まる大きさである。このような形状のＺｎＯ微粒子が分散したバッファを用いることでも、電気泳動分析時に試料の検出感度を増加させることができる。   In addition, although a photograph of ZnO fine particles is not attached, ZnO fine particles having a shape different from that in FIG. 3A can be obtained by changing the manufacturing conditions such as the current value of arc discharge in the above atmospheric gas. Can do. The ZnO fine particles obtained in this way have a rod-like, granular or plate-like form, and are sized to fit inside a virtual cube having a side of 50 to 1000 nm. By using a buffer in which ZnO fine particles having such a shape are dispersed, the detection sensitivity of the sample can be increased during the electrophoretic analysis.

なお、ＺｎＯ微粒子の製造に当って、窒素ガスの代わりにアルゴンガスを用いることにより、図３（Ａ）とは異なった形態のＺｎＯ微粒子を得ることができる。   In manufacturing the ZnO fine particles, by using argon gas instead of nitrogen gas, ZnO fine particles having a form different from that in FIG. 3A can be obtained.

アルゴンガスを用いて得られたＺｎＯ微粒子のＳＥＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）写真（撮影倍率：１万倍）を図３（Ｂ）に示す。   An SEM (Scanning Electron Microscope) photograph (photographing magnification: 10,000 times) of ZnO fine particles obtained using argon gas is shown in FIG.

このようにして得られたＺｎＯ微粒子は、中心の核から４本以上の棒状結晶が放射状に延在する形態であり、棒状結晶の長さが５０〜１０００ｎｍの範囲内にある。このＺｎＯ微粒子は、言わば各突起の長さが長い金平糖状の形態を有する。このような形状のＺｎＯ微粒子が分散したバッファを用いることでも、電気泳動分析時に試料の検出感度を増加させることができる。   The ZnO fine particles thus obtained have a form in which four or more rod-like crystals extend radially from the central nucleus, and the length of the rod-like crystals is in the range of 50 to 1000 nm. The ZnO fine particles have a confetti-like form in which each protrusion has a long length. By using a buffer in which ZnO fine particles having such a shape are dispersed, the detection sensitivity of the sample can be increased during the electrophoretic analysis.

これらの方法で製造されたＺｎＯ微粒子は、単独でバッファに分散させてもよいし、２種類以上を混合してバッファに分散させてもよい。このようにすることでも、電気泳動分析時に試料の検出感度を増加させることができる。   The ZnO fine particles produced by these methods may be dispersed alone in the buffer, or two or more kinds may be mixed and dispersed in the buffer. This also increases the sample detection sensitivity during the electrophoretic analysis.

また、ＺｎＯ微粒子は、上述の方法で安価に製造できることから、バッファに添加したとしても、そのコスト増加を最小限に抑制することができる。   In addition, since the ZnO fine particles can be manufactured at a low cost by the above-described method, even if added to the buffer, the cost increase can be suppressed to the minimum.

ＺｎＯ微粒子を母液に添加するには大きく分けて、以下に列記する２種類の方法がある。
（ａ）ＺｎＯ微粒子を分散させた分散液を母液に添加して攪拌する方法（以降、「希釈法」と称する）。
（ｂ）ＺｎＯ微粒子を母液に直接添加して攪拌する（以降、「直接添加法」と称する）。 In order to add ZnO fine particles to the mother liquor, there are roughly two methods listed below.
(A) A method in which a dispersion in which ZnO fine particles are dispersed is added to a mother liquor and stirred (hereinafter referred to as “dilution method”).
(B) ZnO fine particles are directly added to the mother liquor and stirred (hereinafter referred to as “direct addition method”).

以下、（ａ）の「希釈法」について更に詳細に説明する。   Hereinafter, the “dilution method” of (a) will be described in more detail.

ＺｎＯ微粒子を分散させる溶媒としては、水、Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）及びＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）などを用いることができる。   As a solvent for dispersing ZnO fine particles, water, Tris-Borate-EDTA (TBE), isopropyl alcohol (IPA), Phosphate-Buffered Saline (PBS), or the like can be used.

これらの溶液に、下記表２に示した濃度以下の濃度となるようにＺｎＯ微粒子を添加して、分散機により分散させる。これによりＺｎＯ微粒子が液中で均一に分散した透明な分散液を得ることができる。この分散液は、透明（肉眼で白濁が確認されない）ことから、後述するコロイド粒子は生成していないものと推測される。なお、分散機としては、例えば、ボールミル回転装置ＡＶ−１（アサヒ理化製作所製）などの一般的な分散機を用いることができる。   ZnO fine particles are added to these solutions so as to have a concentration equal to or less than the concentration shown in Table 2 below, and are dispersed by a disperser. Thereby, a transparent dispersion liquid in which ZnO fine particles are uniformly dispersed in the liquid can be obtained. Since this dispersion is transparent (no white turbidity is confirmed with the naked eye), it is presumed that colloidal particles described later are not generated. As the disperser, for example, a general disperser such as a ball mill rotating device AV-1 (manufactured by Asahi Rika Seisakusho) can be used.

下記表２に、上述の分散液において、ＺｎＯ微粒子が透明な状態で分散することができる限界濃度を、溶媒ごとに示す。   Table 2 below shows, for each solvent, the limit concentration at which ZnO fine particles can be dispersed in a transparent state in the above-described dispersion.

これらの分散液を、試料の電気泳動を阻害しない割合で母液と混合することにより、ＺｎＯ微粒子が添加された透明なバッファを得ることができる。   By mixing these dispersions with the mother liquor at a ratio that does not inhibit the electrophoresis of the sample, a transparent buffer to which ZnO fine particles have been added can be obtained.

なお、「試料の電気泳動を阻害しない割合」とは、（ａ）分散液の添加の前後で試料の泳動速度に実質的に差がなく、かつ（ｂ）試料と結合して蛍光を発する蛍光色素標識がゲル中で実用上十分な濃度に保たれる割合であることを意味する。この割合は、溶媒の種類により異なるが、水を溶媒とする分散液の場合には、母液：分散液＝１８〜２２：１の範囲内の設計に応じた任意好適な体積比で混合することが好ましい。   The “ratio not inhibiting the electrophoresis of the sample” means (a) the sample has substantially no difference in the migration speed before and after the addition of the dispersion, and (b) the fluorescence that emits fluorescence when combined with the sample. It means that the dye label is in a ratio that is kept at a practically sufficient concentration in the gel. This ratio varies depending on the type of solvent, but in the case of a dispersion using water as a solvent, the mixture should be mixed at any suitable volume ratio according to the design within the range of mother liquor: dispersion = 18-22: 1. Is preferred.

次に、ＺｎＯ微粒子のバッファ中での濃度について説明する。   Next, the concentration of ZnO fine particles in the buffer will be described.

希釈法又は直接添加法の別にかかわらず、ＺｎＯ微粒子の濃度は、０．０２〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内で設計に応じた任意好適な値とすることが好ましい。ＺｎＯ微粒子の濃度をこの範囲とすることにより、試料の検出感度が有意に増加する。   Regardless of the dilution method or the direct addition method, the concentration of the ZnO fine particles is preferably set to any suitable value depending on the design within the range of 0.02 to 100 mg / mL. By setting the concentration of the ZnO fine particles within this range, the detection sensitivity of the sample is significantly increased.

更に好適には、ＺｎＯ微粒子の濃度を５０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内の値とすることが好ましい。ＺｎＯ微粒子の濃度をこの範囲内の値とすることにより、バッファ中でＺｎＯ微粒子が凝集して、コロイド粒子が形成される。コロイド粒子の存在は、バッファが薄く白濁することにより確認できる。詳しくは後述する実施例で説明するが、バッファ中でコロイド粒子が形成される場合、試料の検出感度がより一層増加する。   More preferably, the concentration of the ZnO fine particles is preferably set to a value within the range of 50 to 100 mg / mL. By setting the concentration of the ZnO fine particles within this range, the ZnO fine particles are aggregated in the buffer to form colloidal particles. The presence of colloidal particles can be confirmed by the fact that the buffer is thin and cloudy. Although details will be described in Examples described later, when colloidal particles are formed in the buffer, the detection sensitivity of the sample is further increased.

（２−３）気泡
この発明の好適な実施例によれば、バッファは、ＺｎＯ微粒子とともに気泡を含むのがよい。以下、この気泡について説明する。 (2-3) Bubbles According to a preferred embodiment of the present invention, the buffer may contain bubbles together with ZnO fine particles. Hereinafter, the bubbles will be described.

気泡は、バッファを攪拌することにより、バッファ中に分散される。より詳細には、ボルテックスミキサなどにより、バッファを震蕩して攪拌する。これにより、バッファ中に大気が巻き込まれ、すなわち取り込まれ、気泡が分散される。   Air bubbles are dispersed in the buffer by agitating the buffer. More specifically, the buffer is shaken and stirred with a vortex mixer or the like. As a result, the atmosphere is entrained in the buffer, that is, taken in and the bubbles are dispersed.

気泡の粒径（直径）は、導入チャネル１２及び分離チャネル１４のサイズよりも小さいサイズとする。具体的には、導入チャネル１２及び分離チャネル１４の最小サイズが３０μｍ（深さ）であるので、気泡の粒径は、この最小サイズ未満の大きさであることが好ましい。なお、気泡のサイズが３０μｍ未満であることから、周知の通り気泡を肉眼で確認することはできない。   The particle diameter (diameter) of the bubbles is set to be smaller than the sizes of the introduction channel 12 and the separation channel 14. Specifically, since the minimum size of the introduction channel 12 and the separation channel 14 is 30 μm (depth), the particle size of the bubbles is preferably smaller than the minimum size. Since the size of the bubbles is less than 30 μm, the bubbles cannot be confirmed with the naked eye as is well known.

気泡の粒径をこの範囲とすることにより、導入チャネル１２及び分離チャネル１４で、気泡が目詰まりすることがない。その結果、両チャネル１２及び１４中において、試料をスムーズに泳動させることができる。また、電気的絶縁体である気泡の目詰まりが生じないことから、両チャネル１２及び１４に対して確実に所定の電圧を印加することができる。   By setting the bubble particle size within this range, bubbles are not clogged in the introduction channel 12 and the separation channel 14. As a result, the sample can be smoothly migrated in both channels 12 and 14. In addition, since clogging of bubbles, which are electrical insulators, does not occur, a predetermined voltage can be reliably applied to both channels 12 and 14.

詳しくは後述する実施例で説明するが、ＺｎＯ微粒子と気泡とを含むバッファを単独で用いて試料の電気泳動を行うことにより、約２倍の検出感度増加が見られた。   As will be described in detail in the examples described later, when the sample was electrophoresed using a buffer containing ZnO fine particles and bubbles alone, an increase in detection sensitivity of about 2 times was observed.

（２−４）バクテリアセルロース
バッファは、ＺｎＯ微粒子又はＺｎＯ微粒子＋気泡の他に、バクテリアセルロース又はバクテリアセルロース誘導体を材料とする微小網目構造体を含んでいてもよい。ここで、バクテリアセルロースとは、セルロース生産菌によって生産されたセルロースのことを意味する。このバクテリアセルロースは、太さが１０〜１００ｎｍの範囲内にある繊維がランダムに絡み合っている。その結果、バクテリアセルロースは、網目のサイズが０．１〜１μｍの範囲内にある３次元の微小網目構造体を形成している。 (2-4) Bacterial cellulose The buffer may contain a fine network structure made of bacterial cellulose or a bacterial cellulose derivative in addition to ZnO fine particles or ZnO fine particles + bubbles. Here, bacterial cellulose means cellulose produced by cellulose-producing bacteria. In this bacterial cellulose, fibers having a thickness in the range of 10 to 100 nm are randomly entangled. As a result, the bacterial cellulose forms a three-dimensional fine mesh structure having a mesh size in the range of 0.1 to 1 μm.

バッファに、このようなバクテリアセルロースを添加することによって、試料の検出感度を増加させることができる。   By adding such bacterial cellulose to the buffer, the detection sensitivity of the sample can be increased.

（３）電気泳動法
続いて、この発明の電気泳動法について、遅延期導入法を中心に説明する。この発明の電気泳動法では、充填工程、導入工程、遅延期導入工程及び本泳動工程をこの順序で実施する。以下、それぞれの工程について詳細に説明する。 (3) Electrophoresis Next, the electrophoresis method of the present invention will be described focusing on the delayed phase introduction method. In the electrophoresis method of the present invention, the filling step, the introducing step, the delayed phase introducing step and the main electrophoresis step are performed in this order. Hereinafter, each process will be described in detail.

（３−１）充填工程
電気泳動を行うに当っては、まず、マイクロチップ１０の導入チャネル１２と、これに交差する分離チャネル１４のそれぞれにバッファを充填する充填工程を実施する。具体的には、導入チャネル１２及び分離チャネル１４の双方に、この発明のバッファを公知の方法により充填する。その後に、試料リザーバ１２ａにマイクロピペットなどを用いて、適当量の試料を導入する。 (3-1) Filling Step In performing electrophoresis, first, a filling step of filling a buffer into each of the introduction channel 12 of the microchip 10 and the separation channel 14 intersecting with the introduction channel 12 is performed. Specifically, both the introduction channel 12 and the separation channel 14 are filled with the buffer of the present invention by a known method. Thereafter, an appropriate amount of sample is introduced into the sample reservoir 12a using a micropipette or the like.

（３−２）導入工程
導入工程においては、導入チャネル１２に対して導入用電圧を印加する。一般に、試料（核酸、タンパク質又はペプチドなど）はバッファ中でマイナス（−）に帯電している。従って、アウトレット１２ｂを正極（＋）とし、及び試料リザーバ１２ａを負極（−）として、導入チャネル１２に導入用電圧を印加することにより、試料を、試料リザーバ１２ａから導入チャネル１２へと導入することができる。 (3-2) Introduction Step In the introduction step, an introduction voltage is applied to the introduction channel 12. In general, a sample (such as a nucleic acid, protein, or peptide) is negatively charged in a buffer. Therefore, the sample is introduced from the sample reservoir 12a to the introduction channel 12 by applying the introduction voltage to the introduction channel 12 with the outlet 12b as the positive electrode (+) and the sample reservoir 12a as the negative electrode (−). Can do.

なお、導入用電圧の大きさは、設計に応じて適当な値を選択できるが、３０〜１００Ｖ／ｃｍの範囲内の値の電圧であることが好ましい。   In addition, although the magnitude | size of the voltage for introduction can select a suitable value according to design, it is preferable that it is a voltage of the value within the range of 30-100V / cm.

また、導入用電圧は、試料リザーバ１２ａ中の試料組成を正確に反映した試料が交差部１６で観測されるようになるまでの間、印加し続けることが好ましい。導入用電圧の印加時間の絶対値は、導入チャネル１２の長さによって変化するために、一概に規定することはできない。しかし、経験的に、導入用電圧は、導入チャネル１２の単位長さ（１ｍｍ）当たり６．５〜１０．５秒間内の設計に応じた任意好適な期間だけ印加することが好ましいことが明らかとなっている。つまり、導入チャネル１２の全長が７ｍｍの場合には、導入用電圧の印加時間を、４５．５秒（＝６．５秒×７）から７３．５秒（＝１０．５秒×７）内で定めた時間とする。   The introduction voltage is preferably continuously applied until a sample that accurately reflects the sample composition in the sample reservoir 12 a is observed at the intersection 16. Since the absolute value of the application time of the introduction voltage varies depending on the length of the introduction channel 12, it cannot be generally defined. However, empirically, it is clear that the introduction voltage is preferably applied for any suitable period depending on the design within 6.5 to 10.5 seconds per unit length (1 mm) of the introduction channel 12. It has become. That is, when the total length of the introduction channel 12 is 7 mm, the application time of the introduction voltage is within 45.5 seconds (= 6.5 seconds × 7) to 73.5 seconds (= 10.5 seconds × 7). The time determined in.

（３−３）遅延期導入工程
導入工程の終了後、分離チャネル１４に分離用電圧を断続的に印加して、試料を分離チャネル１４に導入する遅延期導入工程を実施する。具体的には、導入工程の終了後、約１秒の電圧切り替え時間（電圧未印加期間）を経て、分離チャネル１４に分離用電圧を印加する。 (3-3) Delay Phase Introduction Step After the introduction step is completed, a delay phase introduction step is performed in which the separation voltage is intermittently applied to the separation channel 14 to introduce the sample into the separation channel 14. Specifically, after the introduction process is completed, a separation voltage is applied to the separation channel 14 after a voltage switching time (voltage non-application period) of about 1 second.

遅延期導入工程は、第１サブ工程と第２サブ工程とに分かれている。   The delayed phase introduction process is divided into a first sub-process and a second sub-process.

第１サブ工程においては、分離チャネル１４に１７５〜３００Ｖ／ｃｍの範囲内の設計に応じた任意好適な値の分離用電圧を、分離チャネル１４の単位長さ（１ｃｍ）当たり２〜２．５秒間内の設計に応じた任意好適な期間だけ印加する。   In the first sub-step, the separation channel 14 is applied with a separation voltage having any suitable value according to the design within the range of 175 to 300 V / cm, and 2 to 2.5 per unit length (1 cm) of the separation channel 14. Apply for any suitable period depending on the design within seconds.

より詳細には、バッファ注入口１４ａを負極（−）とし、及びバッファ貯留孔１４ｂを正極（＋）として、分離チャネル１４の全長に上述の分離用電圧を印加する。   More specifically, the above-described separation voltage is applied to the entire length of the separation channel 14 with the buffer inlet 14a as the negative electrode (−) and the buffer storage hole 14b as the positive electrode (+).

分離用電圧の印加時間は、分離チャネル１４の全長に依存するが、発明者らの経験によれば、分離チャネル１４の単位長さ（１ｃｍ）当たり２〜２．５秒間内の設計に応じた任意好適な期間だけ印加することが好ましい。つまり、分離チャネルの全長が４．５ｃｍの場合には、第１サブ工程における分離用電圧の印加時間を、９秒（２秒×４．５）〜１１．２５秒（２．５秒×４．５）内で定めた時間とする。   The application time of the separation voltage depends on the total length of the separation channel 14, but according to the inventors' experience, it depends on the design within 2 to 2.5 seconds per unit length (1 cm) of the separation channel 14. It is preferable to apply for any suitable period. That is, when the total length of the separation channel is 4.5 cm, the application time of the separation voltage in the first sub-process is set to 9 seconds (2 seconds × 4.5) to 11.25 seconds (2.5 seconds × 4 .5) The time specified in (5).

第１サブ工程においては、上述した分離チャネル１４への電圧印加と同時に、導入チャネル１２にも電圧を印加する。より詳細には、試料リザーバ１２ａ及びアウトレット１２ｂの両者を正極（＋）として、導入チャネル１２に戻し電圧を印加する。これにより、分離チャネル１４への過剰な試料の流れ込みを防止する。ここで、戻し電圧の大きさは、設計により適当な値を選択できるが、１３０〜５００Ｖの範囲内の値とするのが好ましい。   In the first sub-step, a voltage is applied to the introduction channel 12 simultaneously with the voltage application to the separation channel 14 described above. More specifically, a return voltage is applied to the introduction channel 12 with both the sample reservoir 12a and the outlet 12b as positive electrodes (+). This prevents excessive sample flow into the separation channel 14. Here, as the magnitude of the return voltage, an appropriate value can be selected by design, but it is preferable to set the value within the range of 130 to 500V.

第２サブ工程においては、第１サブ工程における分離用電圧印加終了後、０．５〜１秒間内の期間の電圧未印加状態を経て、分離チャネル１４に分離用電圧を、分離チャネル１４の単位長さ（１ｃｍ）当たり４〜５秒間内の期間だけ印加する。なお、「電圧未印加状態」を間に挟んで第１及び第２サブ工程で分離チャネル１４に分離用電圧を印加することが、上述した「断続的」に対応する。   In the second sub-step, after the voltage application for separation in the first sub-step is completed, the voltage for separation is applied to the separation channel 14 after the voltage is not applied for a period of 0.5 to 1 second. Apply for a period of 4-5 seconds per length (1 cm). Note that applying the separation voltage to the separation channel 14 in the first and second sub-steps with the “no voltage applied state” in between corresponds to the “intermittent” described above.

第２サブ工程の具体的な手順は、分離用電圧の印加時間を除いて、第１サブ工程と同様であるので、その詳細な説明は省略する。   Since the specific procedure of the second sub-process is the same as that of the first sub-process except for the application time of the separation voltage, detailed description thereof is omitted.

第２サブ工程における分離用電圧の印加時間は、第１サブ工程（単位長さ（１ｃｍ）当たり２〜２．５秒）よりも長時間であることが好ましい。具体的には、分離チャネル１４の単位長さ（１ｃｍ）当たり４〜５秒間内の設計に応じた任意好適な期間だけ印加することが好ましい。つまり、分離チャネル１４の全長が４．５ｃｍの場合には、第２サブ工程における分離用電圧の印加時間を、１８秒（４秒×４．５）〜２２．５秒（５秒×４．５）内で定めた時間とする。   The application time of the separation voltage in the second sub-process is preferably longer than that in the first sub-process (2-2.5 seconds per unit length (1 cm)). Specifically, it is preferable to apply only an arbitrary suitable period according to the design within 4 to 5 seconds per unit length (1 cm) of the separation channel 14. That is, when the total length of the separation channel 14 is 4.5 cm, the application time of the separation voltage in the second sub-process is 18 seconds (4 seconds × 4.5) to 22.5 seconds (5 seconds × 4. 5) The time set in the above.

詳しくは後述する実施例において説明するが、この発明のバッファを用い、更に遅延期導入工程を実施した後に、本泳動工程を行うことにより、試料の検出感度を最大で約１７倍にまで高めることができる。   Although details will be described in the examples described later, the detection sensitivity of the sample is increased up to about 17 times by using the buffer of the present invention and further performing the lag phase introduction step and then performing the main migration step. Can do.

また、遅延期導入工程において、分離チャネル１４に２回にわたって試料を導入しているにもかかわらず、本泳動終了後の試料のピークは、分離せずに１本のままに保たれる。   In addition, in the lag phase introduction step, although the sample is introduced twice into the separation channel 14, the peak of the sample after the end of the electrophoresis is kept as one without being separated.

これは、第１及び第２サブ工程において、交差部１６近傍の分離チャネル１４中、つまり、分離チャネル１４の入口に、試料が高濃度に蓄積することが原因と推測される。つまり、分離チャネル１４の交差部１６近傍に存在するコロイド粒子（ＺｎＯ微粒子由来）や気泡などに、遅延期導入工程で分離チャネル１４に導入される試料がトラップされるものと推測される。その結果、分離チャネル１４の入口付近（交差部１６付近）で、試料は、１本のピークのまま高濃度に濃縮するものと推測される。   This is presumably because the sample accumulates at a high concentration in the separation channel 14 near the intersection 16, that is, at the entrance of the separation channel 14 in the first and second sub-steps. That is, it is presumed that the sample introduced into the separation channel 14 in the delayed phase introduction step is trapped in colloidal particles (derived from ZnO fine particles) or bubbles existing in the vicinity of the intersection 16 of the separation channel 14. As a result, it is presumed that the sample concentrates to a high concentration with one peak near the entrance of the separation channel 14 (near the intersection 16).

（３−４）本泳動工程
遅延期導入工程の終了後、分離チャネル１４に分離用電圧を印加して、試料を泳動させる本泳動工程を実施する。 (3-4) Main migration step After the completion of the delayed phase introduction step, a main migration step is performed in which a separation voltage is applied to the separation channel 14 to migrate the sample.

より詳細には、分離用電圧の印加時間が長時間である以外は、既に説明した第１サブ工程と同様にして、分離チャネル１４に分離用電圧を、及び導入チャネル１２に戻し電圧を印加する。これにより、交差部１６に存在する試料を分離チャネル１４に沿って電気泳動させることができる。   More specifically, the separation voltage is applied to the separation channel 14 and the return voltage is applied to the introduction channel 12 in the same manner as the first sub-process described above, except that the application time of the separation voltage is long. . Thereby, the sample existing at the intersection 16 can be electrophoresed along the separation channel 14.

本泳動工程における分離用電圧の印加時間は、分離チャネル１４の単位長さ（１ｃｍ）当たり４０〜５０秒の範囲内の設計に応じた任意好適な期間とすることが好ましい。つまり、分離チャネルの全長が４．５ｃｍの場合には、本泳動工程における分離用電圧の印加時間を、１８０秒（４０秒×４．５）〜２２５秒（５０秒×４．５）内で定めた時間とする。   The application time of the separation voltage in this migration step is preferably any suitable period according to the design within the range of 40 to 50 seconds per unit length (1 cm) of the separation channel 14. That is, when the total length of the separation channel is 4.5 cm, the application time of the separation voltage in this electrophoresis step is within 180 seconds (40 seconds × 4.5) to 225 seconds (50 seconds × 4.5). Set the time.

これにより、分離用チャネル１４の中で、試料はサイズごとに分離される。   Thereby, the sample is separated according to size in the separation channel 14.

以下、実施例により、この発明をより詳細に説明するが、この発明は、以下の実施例により何ら限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited at all by the following example.

（１）実験の概要の説明
実験は大きく分けて、（実験群１）、（実験群２）及び（実験群３）に分類される。 (1) Description of the outline of the experiment The experiment is roughly classified into (Experiment group 1), (Experiment group 2) and (Experiment group 3).

（実験群１）では、この発明のバッファの効果を主に確認している。図４に示すように、（実験群１）には、実験Ａ〜Ｄが含まれる。   In (Experimental group 1), the effect of the buffer of this invention is mainly confirmed. As shown in FIG. 4, (Experiment Group 1) includes Experiments A to D.

（実験群２）では、この発明の電気泳動法の効果を主に確認している。図４に示すように、（実験群２）には、実験Ｅ〜Ｉが含まれる。   (Experimental group 2) mainly confirms the effect of the electrophoresis method of the present invention. As shown in FIG. 4, (Experiment Group 2) includes Experiments E to I.

（実験群３）では、気泡の分散条件及び遅延期導入法の好適条件を主に確認している。（実験群３）には、実験Ｊ〜Ｌが含まれる。   In (Experiment group 3), the bubble dispersion conditions and suitable conditions for the delayed phase introduction method are mainly confirmed. (Experiment group 3) includes Experiments J to L.

（２）各実験に共通した条件の説明
重複した説明を避けるために、この項においては、各実験に共通した条件を以下の各項にまとめる。 (2) Explanation of conditions common to each experiment In order to avoid redundant explanation, conditions common to each experiment are summarized in the following sections in this section.

（ａ）電気泳動には、日立ＳＶ１１００マイクロチップ電気泳動装置コスモアイ用ＤＮＡ鎖長分析キット（日立化成工業株式会社）を用いた。なお、この装置は、一旦、マイクロチップがセットされたならば、試料の蛍光分析までを自動的に実施することが可能である。後述する（ｍ）項で説明する生データは、この装置により測定された試料のピークの蛍光強度を示す。   (A) For electrophoresis, Hitachi SV1100 microchip electrophoresis apparatus DNA chain length analysis kit for Cosmoeye (Hitachi Chemical Industry Co., Ltd.) was used. Note that this apparatus can automatically carry out the fluorescence analysis of the sample once the microchip is set. The raw data described in the section (m) described later indicates the peak fluorescence intensity of the sample measured by this apparatus.

（ｂ）母液としては、（ａ）項で説明した装置に付属されたＨＰＭＣを超純水で０．７ｗｔ％に希釈したものを用いた。   (B) As the mother liquor, HPMC attached to the apparatus described in the section (a) was diluted to 0.7 wt% with ultrapure water.

（ｃ）蛍光色素標識としては、（ｂ）項のＨＰＭＣ中に予め添加されているエチジウムブロマイドを用いた。なお、エチジウムブロマイドは、波長が４７０ｎｍの励起光で励起されて、波長が５８０ｎｍの蛍光を発する。   (C) As a fluorescent dye label, ethidium bromide previously added to HPMC in the item (b) was used. In addition, ethidium bromide is excited by excitation light having a wavelength of 470 nm and emits fluorescence having a wavelength of 580 nm.

（ｄ）各実験に用いた母液の量は２００μＬとした。   (D) The amount of mother liquor used in each experiment was 200 μL.

（ｅ）試料として、共通のＤＮＡ標準サンプル（Φ×１７４−Ｈｉｎｃ ＩＩ ｄｉｇｅｓｔ，Ｔａｋａｒａ）を用いた。この標準サンプルには、予め決められた数種類の長さのＤＮＡ鎖が、それぞれ決められた濃度で含まれている。そして、ＤＮＡ鎖の長さに応じて、分離チャネル１４中で異なった位置でピークを取る。   (E) A common DNA standard sample (Φ × 174-Hinc II digest, Takara) was used as a sample. This standard sample contains several predetermined lengths of DNA strands at predetermined concentrations. Then, peaks are taken at different positions in the separation channel 14 according to the length of the DNA strand.

（ｆ）マイクロチップとしては、図１を参照して説明したマイクロチップ１０に相当するマイクロチップであって、（ａ）項で説明した装置に適合するものを用いた。具体的には、マイクロチップ１０は、導入チャネル１２の長さが７ｍｍ、分離チャネル１４の全長が４．５ｃｍ、及び分離長が３ｃｍである。なお、このマイクロチップ１０は、「発明を実施するための最良の形態」の項で説明したものである。   (F) As the microchip, a microchip corresponding to the microchip 10 described with reference to FIG. 1 and suitable for the apparatus described in the section (a) was used. Specifically, in the microchip 10, the length of the introduction channel 12 is 7 mm, the total length of the separation channel 14 is 4.5 cm, and the separation length is 3 cm. The microchip 10 has been described in the section “Best Mode for Carrying Out the Invention”.

（ｇ）ＺｎＯ微粒子及び気泡をバッファに分散させるために、ボルテックスミキサ（ＭＳ２Ｓ９ Ｍｉｎｉｓｈａｋａｒ ＩＫＡ ＷｏｒｋｓＩｎｃ．）を用いた。   (G) A vortex mixer (MS2S9 Minishakar IKA Works Inc.) was used to disperse ZnO fine particles and bubbles in the buffer.

（ｈ）特に断らない限り、母液にＺｎＯ微粒子及び気泡を分散させるに当っては、ボルテックスミキサの回転数を２４００ｒｐｍとし、及び約１０秒ごとにインターバルを挟みながら合計２分間、震蕩攪拌した。   (H) Unless otherwise specified, when dispersing the ZnO fine particles and bubbles in the mother liquor, the rotation speed of the vortex mixer was set to 2400 rpm, and the agitation was stirred for 2 minutes in total with an interval of about every 10 seconds.

（ｉ）バッファの調製に用いたビーカとしては、シリコナイズアシストチューブ（１．５ミリリットル容積）（ＣａｔＮｏ．２１５０Ｚ，ＡＳＳＩＳＴ Ｔｒａｄｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を用いた。   (I) As a beaker used for preparing the buffer, a siliconized assist tube (1.5 ml capacity) (Cat No. 2150Z, ASSIST Trading Co., Ltd) was used.

（ｊ）試料を導入チャネル１２に導入する導入工程において、３００Ｖの導入用電圧を６０秒間印加した。   (J) In the introduction step of introducing the sample into the introduction channel 12, an introduction voltage of 300 V was applied for 60 seconds.

（ｋ）遅延期導入工程及び本泳動工程における分離用電圧を７５０Ｖとした。また、本泳動工程における分離用電圧の印加時間を１８０秒とした。   (K) The separation voltage in the delayed phase introduction step and the main migration step was set to 750V. In addition, the application time of the separation voltage in the electrophoresis process was set to 180 seconds.

（ｌ）特に断らない限り、遅延期導入工程は、（ｋ）項の分離用電圧を分離チャネル１４に１０秒間印加する第１サブ工程と、第１サブ工程終了後、１秒の電圧未印加状態を経て、分離用電圧を分離チャネル１４に２０秒間印加する第２サブ工程とで構成される。   (L) Unless otherwise specified, the delay period introducing step includes a first sub-step in which the separation voltage of (k) is applied to the separation channel 14 for 10 seconds, and no voltage is applied for 1 second after the completion of the first sub-step. And a second sub-process in which a separation voltage is applied to the separation channel 14 for 20 seconds through the state.

（ｍ）特に断らない限り、各実験はそれぞれ４〜５回実施した。そして、実験ごとの相対蛍光強度（表３及び図４参照）を以下の手順で算出した。
（Ａ）第ｉ回目（ｉは１≦ｉ≦各実験の実施回数Ｎ）の測定で検出される第ｊピーク（ｊは１≦ｊ≦（１試料で検出されるピークの本数ＰＮ））の蛍光強度Ｉ_ｊ（ｉ）（生データ）を、実施回数Ｎで平均して、第ｊ平均ピーク強度ＡｖＩ_ｊ（＝（ΣＩ_ｊ（ｉ＝１〜Ｎ））／Ｎ）を求めた。
（Ｂ）ピーク位置ごとに、各実験の平均ピーク強度ＡｖＩ_ｊを、対照実験（実験Ａ）の平均ピーク強度（ＡｖＣＩ_ｊ）で除して、平均ピーク強度比率ＲＩ_ｊ（＝ＡｖＩ_ｊ／ＡｖＣＩ_ｊ）を求めた。
（Ｃ）この平均ピーク強度比率ＲＩ_ｊを、更に、１試料で検出されるピークの本数ＰＮで平均して、後述する図４や表３〜７に示した相対蛍光強度（＝（ΣＲＩ_ｊ（ｊ＝１〜ＰＮ））／ＰＮ）とした。 (M) Unless otherwise specified, each experiment was performed 4 to 5 times. And the relative fluorescence intensity (refer Table 3 and FIG. 4) for every experiment was computed in the following procedures.
(A) of the j-th peak (j is 1 ≦ j ≦ (number of peaks PN detected in one sample)) detected in the i-th measurement (i is 1 ≦ i ≦ number of times N of each experiment) The fluorescence intensity I _j (i) (raw data) was averaged at the number of executions N to obtain the j-th average peak intensity AvI _j (= (ΣI _j (i = 1 to N)) / N).
(B) For each peak position, the average peak intensity AvI _j of each experiment is divided by the average peak intensity (AvCI _j ) of the control experiment (experiment A), and the average peak intensity ratio RI _j (= AvI _j / AvCI _j )
(C) The average peak intensity ratio RI _j is further averaged by the number of peaks PN detected in one sample, and the relative fluorescence intensity (= (ΣRI _j ( j = 1 to PN)) / PN).

（３）実験群１及び実験群２についての説明
（実験群１）及び（実験群２）に属する実験Ａ〜Ｉは、ほぼ同様の手順で行われている。そこでこの項においては、両実験群についてまとめて説明する。 (3) Description of Experiment Group 1 and Experiment Group 2 Experiments A to I belonging to (Experiment Group 1) and (Experiment Group 2) are performed in substantially the same procedure. Therefore, in this section, both experimental groups will be described together.

以下の表３に、各実験の条件及び結果をまとめた。なお、表３中の「結果」の欄の数値は、グラフとして図４に示してある。   Table 3 below summarizes the conditions and results of each experiment. The numerical values in the “Result” column in Table 3 are shown in FIG. 4 as a graph.

（３−１）実験条件
以下、実験Ａ〜Ｉについて、詳細な実験条件を説明する。 (3-1) Experimental Conditions Hereinafter, detailed experimental conditions for Experiments A to I will be described.

（実験Ａ：実験群１）
実験Ａは、従来法で行った電気泳動である。すなわち、バッファには、ＺｎＯ微粒子及び気泡は分散されていない。また、試料の遅延期導入を行っていない。従って、実験Ａは「比較例」に対応する。また、実験Ａは、その他の実験において相対蛍光強度を求める際の基準値を与える対照実験である。 (Experiment A: Experiment Group 1)
Experiment A is electrophoresis performed by a conventional method. That is, ZnO fine particles and bubbles are not dispersed in the buffer. Moreover, the introduction of the delayed phase of the sample is not performed. Therefore, Experiment A corresponds to “Comparative Example”. Experiment A is a control experiment that provides a reference value for determining the relative fluorescence intensity in other experiments.

（実験Ｂ：実験群１）
実験Ｂは、気泡が分散されたバッファの効果を確認するための実験である。つまり、バッファには気泡のみが分散されている。また、バッファ単体の効果を確認するために、試料の遅延期導入を行っていない。従って、実験Ｂは「比較例」に対応する。 (Experiment B: Experiment Group 1)
Experiment B is an experiment for confirming the effect of a buffer in which bubbles are dispersed. That is, only bubbles are dispersed in the buffer. In addition, in order to confirm the effect of the buffer alone, the delay period of the sample was not introduced. Therefore, Experiment B corresponds to “Comparative Example”.

バッファへの気泡の分散は、ビーカに入れた母液を、ボルテックスミキサを用いて震蕩攪拌することにより行った。この震蕩攪拌によって、母液中に大気すなわち空気が気泡として巻き込まれ、分散される。   The bubbles were dispersed in the buffer by shaking the mother liquor in a beaker using a vortex mixer. By this shaking stirring, the atmosphere, that is, air is entrained and dispersed in the mother liquor as bubbles.

（実験Ｃ：実験群１）
実験Ｃは、ＺｎＯ微粒子が分散されたバッファの効果を確認するための実験である。つまり、バッファには、ＺｎＯ微粒子のみが低濃度で分散されている。また、バッファ単体の効果を確認するために、試料の遅延期導入を行っていない。従って、実験Ｃは「実施例」に対応する。 (Experiment C: Experiment Group 1)
Experiment C is an experiment for confirming the effect of a buffer in which ZnO fine particles are dispersed. That is, only ZnO fine particles are dispersed at a low concentration in the buffer. In addition, in order to confirm the effect of the buffer alone, the delay period of the sample was not introduced. Experiment C therefore corresponds to “Example”.

以下、ＺｎＯ微粒子のバッファへの分散方法について説明する。実験Ｃにおいては、既に説明した希釈法により、母液にＺｎＯ微粒子を分散させて含ませた。具体的には、まず、水（Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ，ＧＩＢＣＯ）に０．３６ｍｇ／ｍＬの濃度で均一にＺｎＯ微粒子が分散された分散液を調製した。そして、分散液：母液＝１：２０の体積比で、ビーカ中の母液に分散液をマイクロピペットで添加した。その後、マイクロピペットの先端部で、バッファを十分に攪拌することによりＺｎＯ微粒子を液中で均一に分散させた。なお、目視で観察する限りにおいてバッファは透明であった。   Hereinafter, a method for dispersing ZnO fine particles in the buffer will be described. In Experiment C, ZnO fine particles were dispersed and contained in the mother liquor by the dilution method described above. Specifically, first, a dispersion liquid in which ZnO fine particles were uniformly dispersed at a concentration of 0.36 mg / mL in water (Ultra Pure Distilled Water, GIBCO) was prepared. The dispersion was added to the mother liquor in the beaker with a micropipette at a volume ratio of dispersion: mother liquor = 1: 20. Thereafter, the ZnO fine particles were uniformly dispersed in the liquid by sufficiently stirring the buffer at the tip of the micropipette. The buffer was transparent as far as it was visually observed.

（実験Ｄ：実験群１）
実験Ｄは、ＺｎＯ微粒子及び気泡の両者が分散されたバッファの効果を確認するための実験である。つまり、バッファには、ＺｎＯ微粒子と気泡とが分散されて含まれている。なお、実験ＤにおけるＺｎＯ微粒子の濃度は、実験Ｃよりも高濃度とした。また、バッファ単体の効果を確認するために、試料の遅延期導入は行っていない。従って、実験Ｄは「実施例」に対応する。 (Experiment D: Experiment Group 1)
Experiment D is an experiment for confirming the effect of a buffer in which both ZnO fine particles and bubbles are dispersed. That is, the buffer contains dispersed ZnO fine particles and bubbles. Note that the concentration of the ZnO fine particles in Experiment D was higher than that in Experiment C. In addition, in order to confirm the effect of the buffer alone, the sample was not introduced into the delay period. Experiment D therefore corresponds to “Example”.

以下、ＺｎＯ微粒子及び気泡の分散方法について説明する。既に説明した直接添加法により、母液にＺｎＯ微粒子を分散させて含ませた。具体的には、ＺｎＯ微粒子の濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるように、ＺｎＯ微粒子をビーカ中の母液に添加した。そして、ＺｎＯ微粒子が添加された母液を、ボルテックスミキサで震蕩攪拌することにより、ＺｎＯ微粒子を均一に分散させるとともに、バッファ中に大気すなわち空気の気泡を均一に分散させて含ませた。   Hereinafter, a method for dispersing ZnO fine particles and bubbles will be described. ZnO fine particles were dispersed and contained in the mother liquor by the direct addition method already described. Specifically, the ZnO fine particles were added to the mother liquor in the beaker so that the concentration of the ZnO fine particles was 50 mg / mL. Then, the mother liquid to which the ZnO fine particles were added was shaken and stirred with a vortex mixer to uniformly disperse the ZnO fine particles and to uniformly contain air, that is, air bubbles in the buffer.

なお、実験Ｄにおけるバッファは、薄く白濁していた。これは、バッファ中で、ＺｎＯ微粒子が水や気泡を内包しながら凝集して、コロイド粒子が形成されたためである。   Note that the buffer in Experiment D was thin and cloudy. This is because colloidal particles were formed by agglomerating ZnO fine particles while containing water and bubbles in the buffer.

（実験Ｅ：実験群２）
実験Ｅは、遅延期導入の効果を確認するための実験である。つまり、バッファとして母液（ＺｎＯ微粒子及び気泡が添加されていない）を用い、この発明の遅延期導入を行った。従って、実験Ｅは、「比較例」に対応する。 (Experiment E: Experiment group 2)
Experiment E is an experiment for confirming the effect of introduction of the lag phase. In other words, the mother liquor (ZnO fine particles and bubbles were not added) was used as a buffer, and the delayed phase introduction of the present invention was performed. Therefore, Experiment E corresponds to “Comparative Example”.

（実験Ｆ：実験群２）
実験Ｆは、遅延期導入の効果を確認するための実験である。つまり、この発明の遅延期導入工程の効果を確認するために、第１及び第２サブ工程における電圧印加時間を、この発明の範囲外の値に変更した。具体的には、実験Ｆでは、第１サブ工程の電圧印加時間を２０秒とし、及び第２サブ工程の電圧印加時間を１０秒とした。 (Experiment F: Experiment group 2)
Experiment F is an experiment for confirming the effect of introduction of the lag phase. That is, in order to confirm the effect of the delay phase introduction process of the present invention, the voltage application time in the first and second sub-processes was changed to a value outside the range of the present invention. Specifically, in Experiment F, the voltage application time in the first sub-process was 20 seconds, and the voltage application time in the second sub-process was 10 seconds.

なお、実験Ｆでは、バッファとして母液のみを用いた。従って、実験Ｆは、「比較例」に対応する。   In Experiment F, only the mother liquor was used as the buffer. Therefore, Experiment F corresponds to “Comparative Example”.

（実験Ｇ：実験群２）
実験Ｇは、この発明の電気泳動法の効果を確認するための実験である。つまり、バッファとして、ＺｎＯ微粒子及び気泡が分散されたものを用いて遅延期導入を行った。 (Experiment G: Experiment Group 2)
Experiment G is an experiment for confirming the effect of the electrophoresis method of the present invention. That is, the delay period was introduced using a buffer in which ZnO fine particles and bubbles were dispersed.

実験Ｇにおいて、ＺｎＯ微粒子の母液への添加条件は、実験Ｃと同様である。ただし、実験Ｃとは異なり、実験ＧではＺｎＯ微粒子の母液への添加後、気泡を分散させるために、ボルテックスミキサによる震蕩攪拌を行っている。   In Experiment G, the conditions for adding ZnO fine particles to the mother liquor are the same as in Experiment C. However, unlike Experiment C, in Experiment G, after the addition of ZnO fine particles to the mother liquor, shaking is stirred with a vortex mixer to disperse the bubbles.

なお、実験ＧのバッファにおいてＺｎＯ微粒子の濃度は、次に説明する実験Ｈよりも低濃度とした。また、実験Ｇのバッファは、白濁しておらず透明である。従って、実験Ｇは、「実施例」に対応する。   Note that the concentration of the ZnO fine particles in the buffer of Experiment G was lower than that of Experiment H described below. Moreover, the buffer of Experiment G is not cloudy and is transparent. Therefore, Experiment G corresponds to “Example”.

（実験Ｈ：実験群２）
実験Ｈは、この発明の電気泳動法の効果を確認するための実験である。つまり、バッファとして、ＺｎＯ微粒子及び気泡が分散されたものを用いて遅延期導入を行った。 (Experiment H: Experiment Group 2)
Experiment H is an experiment for confirming the effect of the electrophoresis method of the present invention. That is, the delay period was introduced using a buffer in which ZnO fine particles and bubbles were dispersed.

実験Ｈで用いたバッファの調製法は、実験Ｄと同様である。つまり、実験Ｈのバッファにおいて、ＺｎＯ微粒子の濃度は実験Ｇよりも高濃度とした。また、実験Ｈのバッファは、既に説明したコロイド粒子を含んでおり、薄く白濁している。従って、実験Ｈは、「実施例」に対応する。   The method for preparing the buffer used in Experiment H is the same as in Experiment D. That is, in the buffer of Experiment H, the concentration of ZnO fine particles was higher than that of Experiment G. Further, the buffer of Experiment H contains the colloidal particles already described, and is thin and cloudy. Therefore, Experiment H corresponds to “Example”.

（実験Ｉ：実験群２）
実験Ｉは、この発明の電気泳動法の効果を確認するための実験である。つまり、実験Ｈと同様のバッファを用いてはいるが、遅延期導入をこの発明の範囲外の方法で行っている。 (Experiment I: Experiment Group 2)
Experiment I is an experiment for confirming the effect of the electrophoresis method of the present invention. That is, although the same buffer as in Experiment H is used, the delay period is introduced by a method outside the scope of the present invention.

具体的には、実験Ｉにおける遅延期導入は、実験Ｆと同様の方法で行った。従って、実験Ｉは、「比較例」に対応する。   Specifically, the delayed phase introduction in Experiment I was performed in the same manner as in Experiment F. Therefore, Experiment I corresponds to “Comparative Example”.

（３−２）実験結果
表３及び図４に実験結果を示す。また、下記表４に、気泡、ＺｎＯ微粒子及びこの発明の遅延期導入の３条件の有無と、検出感度の増加の程度との関係を示す。なお、表４の一番左側の列に、上述の３条件の中で幾つの条件が満足されているかを“○”の数で示している。 (3-2) Experimental results Table 3 and Fig. 4 show the experimental results. Table 4 below shows the relationship between the presence or absence of bubbles, ZnO fine particles, and the three conditions for introducing the delayed phase of the present invention, and the degree of increase in detection sensitivity. In the leftmost column of Table 4, the number of “◯” indicates how many conditions among the above three conditions are satisfied.

図４，表３及び表４より、以下に列記することが明らかである。   From FIG. 4, Table 3 and Table 4, it is clear that the following is listed.

（ａ）図４及び表３から、この発明の範囲に含まれる実験Ｈにおいては、実験Ａ（対照実験）に比較して、約１７倍の蛍光強度の増加が見られる。   (A) From FIG. 4 and Table 3, in Experiment H included in the scope of the present invention, an increase in fluorescence intensity of about 17 times is seen as compared with Experiment A (control experiment).

（ｂ）図４及び表３から、この発明の範囲に含まれる実験Ｃ，Ｄ及びＧでは、実験Ａ（対照実験）に比較して、２倍を超える蛍光強度の増加が見られる。これは、実験誤差を考慮したとしても有意な差である。   (B) From FIG. 4 and Table 3, in Experiments C, D, and G included in the scope of the present invention, an increase in fluorescence intensity of more than 2 times is seen compared to Experiment A (control experiment). This is a significant difference even when experimental errors are taken into account.

（ｃ）図４及び表３から、この発明の範囲外である実験Ａ，Ｂ，Ｅ，Ｆ及びＩでは、実験誤差を考慮すると、蛍光強度の増加は見られない。   (C) From FIG. 4 and Table 3, in Experiments A, B, E, F and I, which are outside the scope of the present invention, no increase in fluorescence intensity is observed in consideration of experimental errors.

（ｄ）表４の条件番号１〜３から、気泡、ＺｎＯ微粒子又は遅延期導入を単独で実施したとしても、その感度増加効果は、最大でも２倍程度である。   (D) From Condition Nos. 1 to 3 in Table 4, even if bubbles, ZnO fine particles, or delayed phase introduction is carried out alone, the sensitivity increasing effect is about twice as much as the maximum.

（ｅ）表４の条件番号４〜６より、２条件を満足する場合（○が２個の場合）には、遅延期導入を行わないと、感度増加効果は最大でも２倍程度である。しかし、遅延期導入と他の条件を組み合わせたときの感度増加の程度は、現段階では不明である。   (E) From condition numbers 4 to 6 in Table 4, when the two conditions are satisfied (when there are two circles), the sensitivity increase effect is about twice as long as the delay period is not introduced. However, the degree of sensitivity increase when combining the delayed phase introduction with other conditions is unknown at this stage.

（ｆ）表４の条件番号７及び８より、「３条件を満たせば、感度が一桁以上増加する場合がある。」ことが現段階で少なくとも言える（表４）。   (F) From the condition numbers 7 and 8 in Table 4, it can be said at least at this stage that the sensitivity may increase by one digit or more if the three conditions are satisfied (Table 4).

（ｇ）表４の条件番号７及び８より、感度増加の程度は、ＺｎＯ微粒子の濃度に依存する可能性があることがわかる。   (G) From condition numbers 7 and 8 in Table 4, it can be seen that the degree of sensitivity increase may depend on the concentration of the ZnO fine particles.

これらのことより、この発明のバッファ（実験Ｃ及びＤ）、及びこの発明の電気泳動法（実験Ｇ及びＨ）により、試料の検出感度を増加させることが可能であることがわかる。特に、気泡と高濃度のＺｎＯ微粒子とを含むバッファを用い、この発明の範囲に含まれる遅延期導入を行った実験Ｈでは、試料の検出感度を従来よりも１桁以上増加させることができる。   From these results, it can be seen that the detection sensitivity of the sample can be increased by the buffer of the present invention (experiments C and D) and the electrophoresis method of the present invention (experiments G and H). In particular, in Experiment H in which a buffer containing bubbles and high-concentration ZnO fine particles was used and the delayed phase introduction included in the scope of the present invention was performed, the sample detection sensitivity can be increased by an order of magnitude or more.

なお、実験Ｈにおいて、試料の検出感度が大きく増加する理由は、現段階では明確ではない。しかし、発明者らは、下記の（ａ）〜（ｃ）の相乗効果により、検出感度の増加が生じていると推測している。   In Experiment H, the reason why the sample detection sensitivity greatly increases is not clear at this stage. However, the inventors presume that an increase in detection sensitivity occurs due to the following synergistic effects (a) to (c).

（ａ）遅延期導入工程の実施により、交差部１６に高濃度に試料が蓄積する。その結果、本泳動工程において分離チャネル１４へ導入される試料の絶対量が増加する。   (A) The sample accumulates at a high concentration at the intersection 16 due to the implementation of the delayed phase introduction step. As a result, the absolute amount of the sample introduced into the separation channel 14 in the electrophoresis process increases.

（ｂ）試料に照射される励起光が、溶媒や気泡を内包したＺｎＯ微粒子由来のコロイド粒子で、いろいろな方向に散乱される。その結果、１個の蛍光色素標識が、散乱されて種々の方向から伝播してくる励起光により何度も励起され、蛍光を発することとなる。よって、蛍光色素標識１個当たりの蛍光強度が増加する。   (B) Excitation light applied to the sample is scattered in various directions by colloidal particles derived from ZnO fine particles enclosing a solvent and bubbles. As a result, one fluorescent dye label is excited many times by excitation light scattered and propagated from various directions, and emits fluorescence. Therefore, the fluorescence intensity per fluorescent dye label increases.

（ｃ）コロイド粒子に内包される気泡の存在により、バッファの実効屈折率が減少し、分離チャネル１４の光閉じ込め能力が低下する。その結果、蛍光色素標識から発する蛍光が分離チャネル１４から出射しやすくなる。よって、分離チャネル１４から出射する蛍光強度が増加する。   (C) Due to the presence of bubbles included in the colloidal particles, the effective refractive index of the buffer decreases, and the optical confinement ability of the separation channel 14 decreases. As a result, the fluorescence emitted from the fluorescent dye label is easily emitted from the separation channel 14. Therefore, the fluorescence intensity emitted from the separation channel 14 increases.

（４）実験群３についての説明
（４−１）実験Ｊ
実験Ｊにおいては、気泡の分散条件を変化させて、試料の検出感度を比較した。具体的には、ボルテックスミキサの攪拌時間を１〜５分の間で変化させた以外は、既に説明した実験Ｂと同様にして実験Ｊ１〜Ｊ５を行った。その結果を下記表５に示す。 (4) Explanation of Experiment Group 3 (4-1) Experiment J
In experiment J, the detection sensitivity of the sample was compared by changing the dispersion condition of the bubbles. Specifically, Experiments J1 to J5 were performed in the same manner as Experiment B described above, except that the stirring time of the vortex mixer was changed between 1 and 5 minutes. The results are shown in Table 5 below.

表５によると、ボルテックスミキサの攪拌時間を変えて、気泡の分散条件を変更したとしても、蛍光強度の増加は見られないことがわかる。   According to Table 5, it can be seen that even if the agitation time of the vortex mixer is changed and the bubble dispersion condition is changed, no increase in fluorescence intensity is observed.

（４−２）実験Ｋ
実験Ｋは、遅延期導入の好適条件を確認するための実験である。つまり、遅延期導入工程において、第１サブ工程の分離用電圧の印加時間を種々に変更した実験Ｋ１〜Ｋ６を行った。なお、実験Ｋ１〜Ｋ６において、第１サブ工程の電圧印加時間以外の条件は、既に説明した実験Ｅと同様である。その結果を下記表６に示す。 (4-2) Experiment K
Experiment K is an experiment for confirming suitable conditions for the introduction of the lag phase. That is, in the delay period introduction process, Experiments K1 to K6 were performed in which the application time of the separation voltage in the first sub-process was variously changed. In Experiments K1 to K6, conditions other than the voltage application time in the first sub-process are the same as in Experiment E already described. The results are shown in Table 6 below.

表６によると、第１サブ工程の分離用電圧の印加時間が１０秒を超えると、蛍光強度の増加効果が見られないことが示唆される。正確な結論を得るためには更に実験を行う必要があるが、実験Ｋ１及びＫ２より、第１サブ工程の電圧印加時間の好適値が１０秒以上かつ２０秒未満であることが示唆される。   According to Table 6, it is suggested that when the application time of the separation voltage in the first sub-step exceeds 10 seconds, the effect of increasing the fluorescence intensity is not seen. Further experiments are necessary to obtain an accurate conclusion, but experiments K1 and K2 suggest that the preferred value of the voltage application time in the first sub-step is 10 seconds or more and less than 20 seconds.

（４−３）実験Ｌ
実験Ｌは、遅延期導入の好適条件を確認するための実験である。つまり、遅延期導入工程において、第２サブ工程の繰り返し回数を０〜３回の間で変更した実験Ｌ１〜Ｌ４を行った。なお、実験Ｌ１〜Ｌ４において、第２サブ工程の繰り返し回数以外の条件は、既に説明した実験Ｅと同様である。 (4-3) Experiment L
Experiment L is an experiment for confirming suitable conditions for the introduction of the lag phase. That is, in the delayed phase introduction process, experiments L1 to L4 were performed in which the number of repetitions of the second sub-process was changed between 0 and 3 times. In Experiments L1 to L4, conditions other than the number of repetitions of the second sub-process are the same as in Experiment E already described.

具体的には、実験Ｌ１は、遅延期導入工程において、第２サブ工程を実施しなかった。すなわち、第１サブ工程終了後、直ちに本泳動工程を行った。   Specifically, in Experiment L1, the second sub-step was not performed in the delayed phase introduction step. That is, the main electrophoresis process was performed immediately after the first sub-process.

実験Ｌ２は、遅延期導入工程において、１回だけ第２サブ工程を実施した。すなわち、実験Ｌ２は、実験Ｅと全く同じ条件である。   In Experiment L2, the second sub-step was performed only once in the delayed phase introduction step. That is, the experiment L2 has exactly the same conditions as the experiment E.

実験Ｌ３は、遅延期導入工程において、第２サブ工程を２回実施した。すなわち、“第１サブ工程→第２サブ工程→第２サブ工程”との処理の後に、本泳動工程を実施した。なお、どちらの第２サブ工程においても、分離用電圧印加時間は２０秒で共通とした。また、１回目の第２サブ工程と２回目の第２サブ工程との間には、１秒の電圧未印加時間を挿入している。   In Experiment L3, the second sub-step was performed twice in the delayed phase introduction step. That is, this electrophoresis step was performed after the processing of “first sub-step → second sub-step → second sub-step”. In both of the second sub-steps, the separation voltage application time is 20 seconds and common. Further, a voltage non-application time of 1 second is inserted between the first second sub-process and the second second sub-process.

実験Ｌ４では、遅延期導入工程において、第２サブ工程を３回実施した。すなわち、“第１サブ工程→第２サブ工程→第２サブ工程→第２サブ工程”との処理の後に、本泳動工程を実施した。なお、全ての第２サブ工程において、分離用電圧印加時間は２０秒で共通とした。また、連続した第２サブ工程と第２サブ工程との間には、１秒の電圧未印加時間を挿入している。   In Experiment L4, the second sub-step was performed three times in the delayed phase introduction step. That is, the main migration step was performed after the processing of “first sub-step → second sub-step → second sub-step → second sub-step”. In all the second sub-steps, the separation voltage application time is 20 seconds and common. Further, a voltage non-application time of 1 second is inserted between the continuous second sub-process and the second sub-process.

その結果を下記表７に示す。   The results are shown in Table 7 below.

表７によると、第２サブ工程の繰り返し回数が０回、２回及び３回では、蛍光強度の増加効果が見られないことが示唆される。正確な結論を得るためには更に実験を行う必要があるが、実験Ｌからは、第２サブ工程を１回のみ行うことが有効であることが示唆される。   According to Table 7, it is suggested that the effect of increasing the fluorescence intensity is not observed when the number of repetitions of the second sub-process is 0, 2, and 3. In order to obtain an accurate conclusion, it is necessary to perform further experiments. However, the experiment L suggests that it is effective to perform the second sub-step only once.

マイクロチップの平面図である。It is a top view of a microchip. ＺｎＯ微粒子の製造装置の構成を概略的に示す模式図である。It is a schematic diagram which shows roughly the structure of the manufacturing apparatus of ZnO microparticles | fine-particles. （Ａ）及び（Ｂ）は、ＺｎＯ微粒子のＴＥＭ写真を示す図である。(A) And (B) is a figure which shows the TEM photograph of ZnO microparticles | fine-particles. 実施例の説明に供する図である。It is a figure where it uses for description of an Example.

符号の説明Explanation of symbols

１０ マイクロチップ
１２ 導入チャネル
１２ａ 試料リザーバ
１２ｂ アウトレット
１４ 分離チャネル
１４ａ バッファ注入孔
１４ｂ バッファ貯留孔
１６ 交差部
２０ 製造装置
２２ チャンバ
２４ カーボン電極
２６ 導電性ハース
２８ 真空排気系
３０ ガス導入系
３２ Ｚｎインゴット 10 Microchip 12 Introduction channel 12a Sample reservoir 12b Outlet 14 Separation channel 14a Buffer injection hole 14b Buffer storage hole 16 Crossing portion 20 Manufacturing device 22 Chamber 24 Carbon electrode 26 Conductive hearth 28 Vacuum exhaust system 30 Gas introduction system 32 Zn ingot

Claims (18)

ゲルを含んだ水溶液であって、
該水溶液中に酸化亜鉛微粒子を含むことを特徴とする電気泳動用バッファ。 An aqueous solution containing a gel,
An electrophoresis buffer comprising zinc oxide fine particles in the aqueous solution. 前記酸化亜鉛微粒子が、酸素ガスと窒素ガスとを含む混合ガスを雰囲気ガスとして、該雰囲気ガス中で亜鉛を加熱して蒸発させることで製造されたものであること特徴とする請求項１に記載の電気泳動用バッファ。   The zinc oxide fine particles are produced by heating and evaporating zinc in an atmosphere gas using a mixed gas containing oxygen gas and nitrogen gas as an atmosphere gas. Electrophoresis buffer. 前記酸化亜鉛微粒子が、円柱形の形態をしていて、その長さが５０〜２５０ｎｍの範囲内にあって、その直径が５０〜１２０ｎｍの範囲内にあることを特徴とする請求項１又は２に記載の電気泳動用バッファ。   The zinc oxide fine particles have a cylindrical shape, the length thereof is in the range of 50 to 250 nm, and the diameter thereof is in the range of 50 to 120 nm. The electrophoresis buffer according to 1. 前記酸化亜鉛微粒子が、棒状、粒状又は板状の形態をしていて、一辺が５０〜１０００ｎｍの仮想的な立方体の内部に納まる大きさであることを特徴とする請求項１又は２に記載の電気泳動用バッファ。   The zinc oxide fine particles have a rod-like, granular or plate-like form, and have a size that fits inside a virtual cube having a side of 50 to 1000 nm. Electrophoresis buffer. 前記酸化亜鉛微粒子が、中心の核から４本以上の棒状結晶が放射状に延在する形態をしていて、前記棒状結晶の長さが５０〜１０００ｎｍの範囲内にあることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用バッファ。   The zinc oxide fine particles have a form in which four or more rod-shaped crystals extend radially from a central nucleus, and the length of the rod-shaped crystals is in the range of 50 to 1000 nm. 2. The electrophoresis buffer according to 1. 前記酸化亜鉛微粒子として、（１）円柱形の形態をしていて、その長さが５０〜２５０ｎｍの範囲内にあって、その直径が５０〜１２０ｎｍの範囲内にある酸化亜鉛微粒子、（２）棒状、粒状又は板状の形態をしていて、一辺が５０〜１０００ｎｍの仮想的な立方体の内部に納まる大きさの酸化亜鉛微粒子、及び（３）中心の核から４本以上の棒状結晶が放射状に延在する形態をしていて、前記棒状結晶の長さが５０〜１０００ｎｍの範囲内にある酸化亜鉛微粒子からなる群より選択された２種類以上の当該酸化亜鉛微粒子を混合したものを用いることを特徴とする請求項１に記載の電気泳動用バッファ。 As the zinc oxide fine particles, (1) zinc oxide fine particles having a cylindrical shape, the length being in the range of 50 to 250 nm, and the diameter being in the range of 50 to 120 nm, (2) Zinc oxide fine particles that are in the form of rods, grains, or plates and fit inside a virtual cube with sides of 50 to 1000 nm, and (3) four or more rod-like crystals radiate from the core at the center. And a mixture of two or more types of zinc oxide fine particles selected from the group consisting of zinc oxide fine particles having a rod-like crystal length in the range of 50 to 1000 nm. The electrophoresis buffer according to claim 1. 前記酸化亜鉛微粒子の濃度が、０．０２〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内にあることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の電気泳動用バッファ。   The concentration of the zinc oxide fine particles is in the range of 0.02 to 100 mg / mL, and the electrophoresis buffer according to any one of claims 1 to 6. 前記酸化亜鉛微粒子が凝集して形成されたコロイド粒子を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の電気泳動用バッファ。   The electrophoresis buffer according to claim 1, comprising colloidal particles formed by aggregation of the zinc oxide fine particles. 前記酸化亜鉛微粒子の濃度が、５０〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲内にあることを特徴とする請求項８に記載の電気泳動用バッファ。   9. The electrophoresis buffer according to claim 8, wherein the concentration of the zinc oxide fine particles is in the range of 50 to 100 mg / mL. 前記酸化亜鉛微粒子とともに、気泡を含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の電気泳動用バッファ。   The electrophoresis buffer according to any one of claims 1 to 9, wherein the zinc oxide fine particles contain bubbles. 前記気泡の粒径が３０μｍ未満であることを特徴とする請求項１０に記載の電気泳動用バッファ。   The electrophoresis buffer according to claim 10, wherein a particle diameter of the bubbles is less than 30 μm. 前記ゲルが、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースからなるセルロース誘導体群より選択された一種類のセルロース誘導体又は二種類以上を混合したセルロース誘導体からなり、
前記ゲルの濃度が０．０１〜３ｗｔ％の範囲内にあることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか一項に記載の電気泳動用バッファ。 The gel comprises one cellulose derivative selected from a cellulose derivative group consisting of methylcellulose, hydroxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose, or a cellulose derivative in which two or more types are mixed,
The electrophoresis buffer according to claim 1, wherein the gel concentration is in the range of 0.01 to 3 wt%. 前記ゲルの濃度が、０．７〜１ｗｔ％の範囲内にあることを特徴とする請求項１２に記載の電気泳動用バッファ。   The electrophoresis buffer according to claim 12, wherein the gel concentration is in a range of 0.7 to 1 wt%. 前記ゲルに加えて、バクテリアセルロース、又はバクテリアセルロース誘導体を材料とする微小網目構造体が添加されていることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の電気泳動用バッファ。   The electrophoresis buffer according to claim 12 or 13, wherein a micro-network structure made of bacterial cellulose or a bacterial cellulose derivative is added in addition to the gel. マイクロチップ上で請求項１〜１４のいずれか一項に記載の電気泳動用バッファを用いて試料を分離する方法であって、以下の工程を有することを特徴とする電気泳動法。
（１）前記マイクロチップの導入チャネルと、該導入チャネルに交差する分離チャネルのそれぞれに前記電気泳動用バッファを充填する充填工程。
（２）前記導入チャネルに導入用電圧を印加して、該導入チャネルに試料を導入する導入工程。
（３）前記分離チャネルに分離用電圧を断続的に印加して、前記試料を該分離チャネルに導入する遅延期導入工程。
（４）前記分離チャネルに前記分離用電圧を印加して、前記試料を泳動させる本泳動工程。 A method for separating a sample using the electrophoresis buffer according to any one of claims 1 to 14 on a microchip, comprising the following steps.
(1) A filling step of filling the electrophoresis buffer in each of the introduction channel of the microchip and the separation channel intersecting with the introduction channel.
(2) An introducing step of introducing a sample into the introduction channel by applying an introduction voltage to the introduction channel.
(3) A delay phase introduction step of intermittently applying a separation voltage to the separation channel and introducing the sample into the separation channel.
(4) A main electrophoresis step of applying the separation voltage to the separation channel and causing the sample to migrate. 前記導入工程で、前記導入チャネルに、３０〜１００Ｖ／ｃｍの範囲内の値の前記導入用電圧を、該導入チャネルの単位長さ（１ｍｍ）当たり６．５〜１０．５秒間内の期間だけ印加することを特徴とする請求項１５に記載の電気泳動法。   In the introduction step, the introduction voltage having a value within a range of 30 to 100 V / cm is applied to the introduction channel only for a period of 6.5 to 10.5 seconds per unit length (1 mm) of the introduction channel. The electrophoresis method according to claim 15, which is applied. 前記遅延期導入工程は、前記分離チャネルに１７５〜３００Ｖ／ｃｍの範囲内の値の前記分離用電圧を、該分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり２〜２．５秒間内の期間だけ印加する第１サブ工程と、
該第１サブ工程終了後、０．５〜１秒間内の期間の電圧未印加状態を経て、前記分離チャネルに前記分離用電圧を、該分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり４〜５秒間内の期間だけ印加する第２サブ工程とを含むことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の電気泳動法。 In the delay period introducing step, the separation voltage having a value in the range of 175 to 300 V / cm is applied to the separation channel for a period of 2 to 2.5 seconds per unit length (1 cm) of the separation channel. A first sub-step,
After completion of the first sub-process, the voltage for separation is applied to the separation channel after a voltage non-applied state within a period of 0.5 to 1 second, and the separation channel is supplied for 4 to 5 seconds per unit length (1 cm). The electrophoretic method according to claim 15, further comprising a second sub-step of applying only during the period. 前記本泳動工程で、前記分離チャネルに前記分離用電圧を、該分離チャネルの単位長さ（１ｃｍ）当たり４０〜５０秒間内の期間だけ印加することを特徴とする請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の電気泳動法。   18. The method according to claim 15, wherein, in the main migration step, the separation voltage is applied to the separation channel only for a period of 40 to 50 seconds per unit length (1 cm) of the separation channel. The electrophoresis method according to one item.