JP4810425B2 - Apparatus for generating electrical pulses and method of using the apparatus - Google Patents

Apparatus for generating electrical pulses and method of using the apparatus Download PDF

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Description

関連出願の参照
本出願は、2003年7月18日に出願された米国仮出願第60/487,932号、2003年9月4日に出願された米国仮出願第60/499,921号、および2003年12月4日に出願された米国仮出願第60/526,585号の恩典を主張し、これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる。 REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS This application includes US Provisional Application No. 60 / 487,932, filed July 18, 2003, US Provisional Application No. 60 / 499,921, filed September 4, 2003, and December 2003. Claiming the benefit of US Provisional Application No. 60 / 526,585, filed on April 4, the disclosures of which are incorporated herein by reference.

連邦政府が後援する研究および開発の下で為された発明に係る権利に関する声明
本発明は、米国空軍科学研究局により授与されたAFOSR MURI助成第F49620-02-1-0320号の下、政府支援を受けて為された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。 Statement on rights to inventions made under federal-sponsored research and development This invention is supported by government under AFOSR MURI Grant No. F49620-02-1-0320 awarded by the US Air Force Scientific Research Agency Was done. The US government has certain rights in this invention.

発明の背景
医学および生物学における電気/電場の検出および使用は、双方ともに広範囲に及び、よく受け入れられている。心電図記録（EKG）および脳波記録（EEG）はそれぞれ心臓および脳における電気活性を検出するために用いられる。パルス電場の心筋への適用である電気的除細動は、心臓の鼓動を停止、変更、または再開するために日常的に用いられる。低出力電場を骨折に適用して、治癒を促進することもできる。筋電図記録は、筋またはそれらの関連する神経への測定電気パルスの適用であり、筋機能を測定するため、および/または筋損傷の程度を判断するために用いられ得る。生物学では、電場は様々な用途を有し、例えば異なる大きさ（電気泳動）または異なる電荷（等電点電気泳動）の分子を分離するために、および異なる特性を有する細胞を分離する（フローサイトメトリーの間の細胞選別）ために用いられ得る。電場は、電気穿孔と呼ばれる過程を経て、新規なタンパク質または遺伝子を生細胞へ導入するためにも用いられ得る。 BACKGROUND OF THE INVENTION The detection and use of electric / electric fields in medicine and biology are both widely and well accepted. Electrocardiogram recording (EKG) and electroencephalography (EEG) are used to detect electrical activity in the heart and brain, respectively. Cardioversion, the application of a pulsed electric field to the myocardium, is routinely used to stop, change, or resume heartbeat. A low power electric field can also be applied to the fracture to promote healing. Electromyogram recording is the application of measurement electrical pulses to muscles or their associated nerves and can be used to measure muscle function and / or determine the extent of muscle damage. In biology, electric fields have a variety of uses, for example to separate molecules of different sizes (electrophoresis) or different charges (isoelectric focusing) and to separate cells with different properties (flow) Cell sorting during cytometry). An electric field can also be used to introduce new proteins or genes into living cells via a process called electroporation.

電気穿孔において、短時間（1秒の1000分の1から100万分の1のスケールで）で中程度の出力（キロボルト/メーター）の電場の適用は、細胞表面の膜の透過化（漏出）を惹起し、細胞内部に通常はアクセスできない物質/分子が細胞に侵入できる。細胞膜の初期透過化後、細胞は最終的にその正常な「非漏出」状態に戻る。しかし、細胞はこのとき、電気穿孔により細胞内に導入された物質を含み、および/または活用できる。この過程は、例えば経皮的薬物送達（Neumann, E., Kakorin, S., and Toensing, K. (1999), Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes. Bioelectrochem. Bioenerg. 48, 3-16. 1999; Weaver, J.C., Vaughan, T.E., and Chizmadzhev, Y. (1999), Theory of electrical creation of aqueous pathways across skin transport barriers. Adv. Drug Deliv. Rev. 35, 21-39）のために、および電気化学療法を用いた癌治療の治療手段（Belehradek, M., Domenge, C., Luboinski, B., Orlowski, S., Belehradek, J. Jr., and Mir, L.M. (1993), Electrochemotherapy, a new antitumor treatment. First clinical phase I-II trial. Cancer 72, 3694-700. 1993; Heller, R., Jaroszeski, M.J., Glass, L.F., Messina, J.L., Rapaport, D.P., DeConti, R.C., Fenske, N.A., Gilbert, R.A., Mir, L.M., Reintgen, D.S. (1996), Phase I/II trial for the treatment of cutaneous and subcutaneous tumors using electrochemotherapy. Cancer 77, 964-71. 1996; Hofmann, F., Ohnimus, H., Scheller, C., Strupp, W., Zimmermann U., and Jassoy, C. (1999), Electric field pulses can induce apoptosis. J. Membr. Biol. 169, 103-109）として、遺伝子または薬物を細胞に導入するために用いられ得る。電気化学療法または電気穿孔治療（EPT）は、ブレオマイシンなどの透過しにくい化学治療剤を、二つの電極間に適切に配向され得る腫瘍細胞にインビボ送達する方法である（Dev S.B., Hofmann, G.A., Electrochemotherapy - a novel method of cancer treatment. Cancer Treat Rev 20:105-15, 1994; Hofmann et al., Electroporation therapy: a new approach for the treatment of head and neck cancer. IEE Trans Biomed Eng 46:752-9, 1999; Mir, L.M., Orlowski, S. Mechanisms of electrochemotherapy. Adv Drug Deliv Rev., 35:107-118, 1999）。電気穿孔およびEPTはともに、細胞または組織の原形質膜に及ぼす電気的効果に依存する。   In electroporation, the application of an electric field of medium power (kilovolts / meter) in a short time (on a scale of 1 / 1000th to 1 millionth of a second) can result in permeabilization (leakage) of the cell surface membrane. Substances / molecules that are elicited and not normally accessible inside the cell can enter the cell. After initial permeabilization of the cell membrane, the cell eventually returns to its normal “non-leaking” state. However, the cells can now contain and / or take advantage of substances introduced into the cells by electroporation. This process is described, for example, by transdermal drug delivery (Neumann, E., Kakorin, S., and Toensing, K. (1999), Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes. Bioelectrochem. Bioenerg. 48, 3-16. 1999. ; Weaver, JC, Vaughan, TE, and Chizmadzhev, Y. (1999), Theory of electrical creation of aqueous pathways across skin transport barriers. Adv. Drug Deliv. Rev. 35, 21-39) and for electrochemistry Therapeutic treatment of cancer using therapy (Belehradek, M., Domenge, C., Luboinski, B., Orlowski, S., Belehradek, J. Jr., and Mir, LM (1993), Electrochemotherapy, a new antitumor Treatment. First clinical phase I-II trial.Cancer 72, 3694-700.1993; Heller, R., Jaroszeski, MJ, Glass, LF, Messina, JL, Rapaport, DP, DeConti, RC, Fenske, NA, Gilbert, RA, Mir, LM, Reintgen, DS (1996), Phase I / II trial for the treatment of cutaneous and subcutaneous tumors using electrochemotherapy.Cancer 77, 964-71. 1996; Hofmann, F., Ohnimus, H., Scheller, C., Strupp, W., Zimme rmann U., and Jassoy, C. (1999), Electric field pulses can induce apoptosis. J. Membr. Biol. 169, 103-109) can be used to introduce genes or drugs into cells. Electrochemotherapy or electroporation therapy (EPT) is a method of delivering an impermeable chemotherapeutic agent such as bleomycin in vivo to tumor cells that can be properly oriented between two electrodes (Dev SB, Hofmann, GA, Electrochemotherapy-a novel method of cancer treatment.Cancer Treat Rev 20: 105-15, 1994; Hofmann et al., Electroporation therapy: a new approach for the treatment of head and neck cancer.IEE Trans Biomed Eng 46: 752-9, 1999; Mir, LM, Orlowski, S. Mechanisms of electrochemotherapy. Adv Drug Deliv Rev., 35: 107-118, 1999). Both electroporation and EPT depend on the electrical effects on the cell or tissue plasma membrane.

電気穿孔は、0.1ミリ秒から20ミリ秒（「ms」）のオーダーのパルス持続時間で（Dev, S.B., Rabussay, D.A., Widera, G., and Hofmann, G.A. (2000) IEEE Trans. Plasma Sci. 28, 206-223）、ボルトから低キロボルト/センチメーターのオーダーの電場で起こるが、具体的な条件は特定の細胞の種類および細胞懸濁培地に依存する。これらのミリ秒パルスは一過性の膜穿孔（membrane poration）および細胞の生存を促進する。または、電気穿孔は、異なる電気または細胞の条件を用いて細胞の破壊/死を惹起し得る。孔の物理的性質はあまり特徴付けられていないが、良好な細胞生存性で膜非透過性分子を細胞内送達できる実験条件は周知である。最適な電気穿孔の条件は、波形、細胞が懸濁される培地の成分、および細胞の種類に依存する（Weaver, J.C., Electroporation of cells and tissues, in: J.D. Bronzino (Ed.), The Biomedical Engineering Handbook, CRC and IEEE press, Boca Raton, FL, 1995, pp.1431-1440; Djuzenova et al., Effect of medium conductivity and composition on the uptake of propidium iodide into electropermeabilized myeloma cells. Biochim Biophys Acta, 1284:143-52, 1996）。いずれの場合においても、これらのミリ秒低出力適用電場の電気穿孔効果は細胞表面の膜のみで起こる。   Electroporation is performed with pulse durations on the order of 0.1 to 20 milliseconds (“ms”) (Dev, SB, Rabussay, DA, Widera, G., and Hofmann, GA (2000) IEEE Trans. Plasma Sci. 28, 206-223), which occurs in electric fields on the order of volts to low kilovolts / centimeters, but the specific conditions depend on the particular cell type and cell suspension medium. These millisecond pulses promote transient membrane poration and cell survival. Alternatively, electroporation can cause cell destruction / death using different electrical or cellular conditions. Although the physical properties of the pores are not well characterized, experimental conditions that allow intracellular delivery of membrane-impermeable molecules with good cell viability are well known. Optimal electroporation conditions depend on the waveform, the components of the medium in which the cells are suspended, and the cell type (Weaver, JC, Electroporation of cells and tissues, in: JD Bronzino (Ed.), The Biomedical Engineering Handbook , CRC and IEEE press, Boca Raton, FL, 1995, pp.1431-1440; Djuzenova et al., Effect of medium conductivity and composition on the uptake of propidium iodide into electropermeabilized myeloma cells.Biochim Biophys Acta, 1284: 143-52 , 1996). In either case, the electroporation effect of these millisecond low power applied electric fields occurs only in the cell surface membrane.

上記のように、電場および電気穿孔の工程はまた、細胞への遺伝子導入に用いられている。DNAを用いた生細胞のトランスフェクションは、転写研究または一部の疾患の治療における治療目的のため、外来遺伝子を細胞で発現するために用いられる一般的な分子技術である。既知のトランスフェクション方法は、原形質膜と融合するために脂質小胞にDNAを取り込むこと、リン酸カルシウムまたはデキストランで沈殿させたDNAのエンドサイトーシス、関心対象の遺伝子で細胞を感染させるウイルスベクターの使用、および原形質膜に「孔」を形成するパルス電場を用いた電気透過化（electropermeabilization）または電気穿孔を含む。一部の細胞型、特に懸濁液で増殖する型は、電気透過化によってのみ効果的にトランスフェクトされ得る。遺伝子発現の増強または最適化は、長いパルス電場のパルス持続時間を（例えば、1マイクロ秒〜20ミリ秒の範囲内で）変更することにより、古典的な電気穿孔の範囲内（0.1〜5 kV/cm）で電場の強度を変更することにより、および/または緩衝液もしくは培地の伝導性を改変することにより、古典的な電気穿孔パルスを用いて既に達成されている。他のトランスフェクション手法において、遺伝子発現の増強は、トランスフェクション手法で用いられるDNA濃度を変更することにより、トランスフェクション中の物理的/化学的性質（pH、イオン強度など）を変更することにより、異なる性質を有する様々な脂質の組み合わせを用いて、またはトランスフェクション効率を補助するために細胞培養培地もしくは緩衝液に他の成分を添加することにより、達成されてきた。   As mentioned above, electric field and electroporation processes have also been used for gene transfer into cells. Transfection of living cells with DNA is a common molecular technique used to express foreign genes in cells for therapeutic purposes in transcription studies or treatment of some diseases. Known transfection methods include incorporating DNA into lipid vesicles to fuse with the plasma membrane, endocytosis of DNA precipitated with calcium phosphate or dextran, and using viral vectors to infect cells with the gene of interest. , And electropermeabilization or electroporation with a pulsed electric field that forms a “pore” in the plasma membrane. Some cell types, particularly those that grow in suspension, can be effectively transfected only by electropermeabilization. Enhancement or optimization of gene expression can be achieved within the classical electroporation range (0.1-5 kV) by changing the pulse duration of long pulsed electric fields (eg, within the range of 1 microsecond to 20 milliseconds). This has already been achieved using classical electroporation pulses by changing the strength of the electric field at / cm) and / or by modifying the conductivity of the buffer or medium. In other transfection techniques, enhanced gene expression can be achieved by changing the physical / chemical properties (pH, ionic strength, etc.) during transfection by changing the DNA concentration used in the transfection technique. It has been achieved using various lipid combinations with different properties or by adding other components to the cell culture medium or buffer to aid transfection efficiency.

これらの既知の技術でもってさえ、細胞に薬剤を導入する更に効率的な方法および遺伝子発現を増強する新規な方法が依然必要とされている。これらの必要性および様々な他の必要性が、本発明の一つまたは複数の態様により少なくとも部分的に対応される。   Even with these known techniques, there remains a need for more efficient methods of introducing drugs into cells and new methods of enhancing gene expression. These needs and various other needs are at least partially addressed by one or more aspects of the present invention.

発明の概要
本発明は、ナノ秒パルス電場（「nsPEF」）の適用を含む、細胞に薬剤を導入する方法に関する。 SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a method for introducing a drug into a cell, including application of a nanosecond pulsed electric field (“nsPEF”).

本発明の一つまたは複数の態様では、細胞に薬剤を導入する方法は、細胞および薬剤を含む調製物を提供する工程、ならびにナノ秒パルス電場を調製物に適用する工程を含み、核への薬剤の侵入を促進する。nsPEFは、1から1000ナノ秒、好ましくは1から300ナノ秒の時間の範囲であり得る。nsPEFはまた、1から1000 kV/cm、好ましくは10から350 kV/cmの電場強度の範囲であり得る。薬剤は、例えば、薬物、核酸、タンパク質、ペプチド、およびポリペプチドを含む群から選択され得る。   In one or more embodiments of the present invention, a method for introducing a drug into a cell comprises providing a preparation comprising the cell and the drug, and applying a nanosecond pulsed electric field to the preparation, Promote drug invasion. The nsPEF can range from 1 to 1000 nanoseconds, preferably 1 to 300 nanoseconds. The nsPEF can also be in the range of electric field strengths of 1 to 1000 kV / cm, preferably 10 to 350 kV / cm. The agent can be selected, for example, from the group comprising drugs, nucleic acids, proteins, peptides, and polypeptides.

本発明の様々な態様は、薬物が、ブレオマイシン、ダウノマイシン、5-FU、シトシンアラビノシド、コルヒチン、サイトカラシンB、ダウノルビシン、ネオカルシノスタチン、スラミン、ドキソルビシン、カルボプラチン、タキソール、マイトマイシンC、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、およびシスプラチン、ならびにこれらの適切な組み合わせからなる群より選択される抗生剤または化学療法剤であることを許容する。さらに、薬剤は核酸であり得、核酸は、DNA、cDNA、およびRNAを含む群から選択される。本発明に従うと、これらの核酸は相同または非相同な遺伝子産物をコードしてもよく、細胞はこの遺伝子産物が細胞内で発現するようにトランスフェクトされ得る。核酸はまた、発現ベクターであってもよく、発現ベクターは、適切なプロモーター配列に機能的に連結された遺伝子産物をコードする相同または非相同な核酸を含む。核酸はまた、例えば遺伝子の発現を調節し、遺伝子治療を提供し得る。細胞に導入される核酸はまた、細胞増殖を調節し得る、または免疫応答を誘発し得る。本発明の更なる態様は、ポリペプチドの形態であり得る薬剤を提供し、このポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、またはこれらの組み合わせを含む群より選択される。ポリペプチドはまた、抗原または抗体であってもよい。   Various embodiments of the present invention are such that the drug is bleomycin, daunomycin, 5-FU, cytosine arabinoside, colchicine, cytochalasin B, daunorubicin, neocalcinostatin, suramin, doxorubicin, carboplatin, taxol, mitomycin C, vincristine, It is allowed to be an antibiotic or chemotherapeutic agent selected from the group consisting of vinblastine, methotrexate, and cisplatin, and appropriate combinations thereof. Further, the agent can be a nucleic acid, wherein the nucleic acid is selected from the group comprising DNA, cDNA, and RNA. In accordance with the present invention, these nucleic acids may encode a homologous or heterologous gene product, and the cell can be transfected such that the gene product is expressed in the cell. The nucleic acid may also be an expression vector, which includes a homologous or heterologous nucleic acid encoding a gene product operably linked to a suitable promoter sequence. Nucleic acids can also regulate gene expression, for example, and provide gene therapy. A nucleic acid introduced into a cell can also modulate cell proliferation or elicit an immune response. A further aspect of the invention provides an agent that can be in the form of a polypeptide, wherein the polypeptide is selected from the group comprising hormones, cytokines, lymphokines, growth factors, or combinations thereof. The polypeptide may also be an antigen or an antibody.

本発明の更なる態様では、薬剤は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、およびサポリンを含む群から選択される細胞毒性剤であり得る。真核細胞、原核細胞、脂肪細胞、骨細胞、血管細胞、筋細胞、軟骨細胞、幹細胞、造血細胞、肺細胞、気道細胞、肝細胞、腸細胞、皮膚細胞、神経細胞、癌細胞、細菌細胞、およびこれらの組み合わせを含む、任意の種類の細胞が本発明において用いられ得る。   In a further aspect of the invention, the agent may be a cytotoxic agent selected from the group comprising ricin, abrin, diphtheria toxin, and saporin. Eukaryotic cells, prokaryotic cells, adipocytes, bone cells, vascular cells, muscle cells, chondrocytes, stem cells, hematopoietic cells, lung cells, airway cells, hepatocytes, intestinal cells, skin cells, nerve cells, cancer cells, bacterial cells Any type of cell can be used in the present invention, including combinations thereof.

本発明の少なくとも一つの態様では、遺伝子発現を増強する方法は、細胞および細胞に送達されるヌクレオチド配列を含む調製物を提供する工程、ならびにナノ秒パルス電場を調製物に適用する工程を含み、この適用は薬剤の核への侵入を促進する。   In at least one aspect of the present invention, a method of enhancing gene expression comprises providing a preparation comprising a cell and a nucleotide sequence to be delivered to the cell, and applying a nanosecond pulsed electric field to the preparation, This application promotes drug penetration into the nucleus.

本発明の他の形式において、細胞の遺伝子発現を増強する方法は、所望の遺伝子で細胞をトランスフェクトする工程、およびナノ秒パルス電場を細胞に適用する工程を含む。細胞は、電気穿孔、脂質小胞の使用、ウイルスベクターの使用、および/またはリン酸カルシウムもしくはデキストランとの共沈殿を含むが、これらに限定されない任意の公知の方法によりトランスフェクトされ得る。   In another form of the invention, a method of enhancing cellular gene expression comprises transfecting a cell with a desired gene and applying a nanosecond pulsed electric field to the cell. The cells can be transfected by any known method including, but not limited to, electroporation, use of lipid vesicles, use of viral vectors, and / or coprecipitation with calcium phosphate or dextran.

本発明の種々の態様において、細胞の遺伝子発現を増強する方法は、一つまたは複数の長パルスを細胞に適用する工程、および一つまたは複数のナノ秒パルス電場パルスをこの細胞に適用する工程を含む。これらの長パルスは、約0.001ミリ秒から30ミリ秒、好ましくは約0.1ミリ秒から20ミリ秒の持続時間の範囲であり得、約0.1 kV/cmから5 kV/cm、好ましくは0.1 kV/cmから1 kV/cmの範囲の電場強度を有し得る。nsPEFは、1ナノ秒から1000ナノ秒、好ましくは1ナノ秒から300ナノ秒の時間の範囲であり得る。nsPEFはまた、1 kV/cmから1000 kV/cm、好ましくは10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度の範囲であり得る。   In various embodiments of the present invention, a method for enhancing gene expression in a cell comprises applying one or more long pulses to the cell and applying one or more nanosecond pulsed electric field pulses to the cell. including. These long pulses can range in duration from about 0.001 milliseconds to 30 milliseconds, preferably from about 0.1 milliseconds to 20 milliseconds, from about 0.1 kV / cm to 5 kV / cm, preferably 0.1 kV / It can have an electric field strength in the range of cm to 1 kV / cm. The nsPEF can range from 1 nanosecond to 1000 nanoseconds, preferably from 1 nanosecond to 300 nanoseconds. The nsPEF can also be in the range of electric field strengths from 1 kV / cm to 1000 kV / cm, preferably from 10 kV / cm to 350 kV / cm.

他の態様において、腫瘍または他の組織への薬物の送達を増強する方法は、腫瘍または他の組織にナノ秒パルス電場を適用する工程を含む。nsPEFは、1ナノ秒から1000ナノ秒、好ましくは1ナノ秒から300ナノ秒の時間の範囲であり得る。nsPEFはまた、1 kV/cmから1000 kV/cm、好ましくは10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度の範囲であり得る。   In other embodiments, a method of enhancing drug delivery to a tumor or other tissue comprises applying a nanosecond pulsed electric field to the tumor or other tissue. The nsPEF can range from 1 nanosecond to 1000 nanoseconds, preferably from 1 nanosecond to 300 nanoseconds. The nsPEF can also be in the range of electric field strengths from 1 kV / cm to 1000 kV / cm, preferably from 10 kV / cm to 350 kV / cm.

他の態様において、細胞にワクチンを送達する方法は、細胞にナノ秒パルス電場を適用する工程を含む。nsPEFは、1ナノ秒から1000ナノ秒、好ましくは1ナノ秒から300ナノ秒の時間の範囲であり得る。nsPEFはまた、1 kV/cmから1000 kV/cm、好ましくは10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度の範囲であり得る。   In other embodiments, the method of delivering a vaccine to a cell comprises applying a nanosecond pulsed electric field to the cell. The nsPEF can range from 1 nanosecond to 1000 nanoseconds, preferably from 1 nanosecond to 300 nanoseconds. The nsPEF can also be in the range of electric field strengths from 1 kV / cm to 1000 kV / cm, preferably from 10 kV / cm to 350 kV / cm.

他の態様において、ナノ秒パルス電場を適用する方法が提供され、nsPEFはその治療の必要性がある患者に適用される。nsPEFは、1ナノ秒から1000ナノ秒、好ましくは1ナノ秒から300ナノ秒の時間の範囲であり得る。nsPEFはまた、1 kV/cmから1000 kV/cm、好ましくは10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度の範囲であり得る。必要性のある患者は、例えば癌を有し得る。   In other embodiments, a method of applying a nanosecond pulsed electric field is provided and nsPEF is applied to patients in need of that treatment. The nsPEF can range from 1 nanosecond to 1000 nanoseconds, preferably from 1 nanosecond to 300 nanoseconds. The nsPEF can also be in the range of electric field strengths from 1 kV / cm to 1000 kV / cm, preferably from 10 kV / cm to 350 kV / cm. A patient in need may have cancer, for example.

他の態様において、ナノ秒パルス電場を細胞に適用する工程を含む、細胞の遺伝子発現を増強する方法が提供される。nsPEFは、1ナノ秒から1000ナノ秒、好ましくは1ナノ秒から300ナノ秒の時間の範囲であり得る。nsPEFはまた、1 kV/cmから1000 kV/cm、好ましくは10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度の範囲であり得る。   In another aspect, a method is provided for enhancing cellular gene expression comprising applying a nanosecond pulsed electric field to a cell. The nsPEF can range from 1 nanosecond to 1000 nanoseconds, preferably from 1 nanosecond to 300 nanoseconds. The nsPEF can also be in the range of electric field strengths from 1 kV / cm to 1000 kV / cm, preferably from 10 kV / cm to 350 kV / cm.

本発明の一つまたは複数の態様に従って、電気パルスを発生するためにパルス発生器が提供される。パルス発生器は、第一回路、第二回路、および制御回路を含む。第一回路は、長い持続時間および低い電圧振幅を有する第一パルスを発生するために用いられる。第二回路は、短い持続時間および高い電圧振幅を有する第二パルスを発生するために用いられる。制御回路は、第一パルスおよび第二パルスがそれぞれ発生するように、第一回路および第二回路のタイミングを制御するために提供される。   In accordance with one or more aspects of the present invention, a pulse generator is provided for generating electrical pulses. The pulse generator includes a first circuit, a second circuit, and a control circuit. The first circuit is used to generate a first pulse having a long duration and a low voltage amplitude. The second circuit is used to generate a second pulse having a short duration and a high voltage amplitude. A control circuit is provided for controlling the timing of the first circuit and the second circuit such that the first pulse and the second pulse are generated, respectively.

本発明の種々の態様により、第一パルスの長さは0.001ミリ秒から30ミリ秒まで変動できる。第一パルスの電場も0.1 kV/cmから5 kV/cmまで変動し得る。第二パルスの長さは1ナノ秒から1000ナノ秒まで変動し得る一方、その電場強度は1 kV/cmから1000 kV/cmまで変動し得る。さらに、制御回路は第一パルスと第二パルスの間隔を変更できる。   In accordance with various aspects of the present invention, the length of the first pulse can vary from 0.001 milliseconds to 30 milliseconds. The electric field of the first pulse can also vary from 0.1 kV / cm to 5 kV / cm. The length of the second pulse can vary from 1 nanosecond to 1000 nanoseconds, while its electric field strength can vary from 1 kV / cm to 1000 kV / cm. Further, the control circuit can change the interval between the first pulse and the second pulse.

本発明の他の態様は、高圧電源およびこの高圧電源に連結した充電レジスタを含む第一回路を提供する。コンデンサは、第一末端で充電レジスタと連結され、第二末端でロードと連結される。コンデンサのロードへの放電を制御するためにトランジスタが提供される。第二回路は、高圧電源、この高圧電源と連結した充電レジスタ；および第一末端で充電レジスタと連結し、第二末端でロードと連結した伝送線を含むように構成され得る。伝送線はロードに放電するよう機能する。   Another aspect of the present invention provides a first circuit including a high voltage power supply and a charging resistor coupled to the high voltage power supply. The capacitor is connected to the charging resistor at the first end and to the load at the second end. A transistor is provided to control the discharge of the capacitor to the load. The second circuit may be configured to include a high voltage power source, a charging resistor coupled to the high voltage power source; and a transmission line coupled to the charging resistor at the first end and to the load at the second end. The transmission line functions to discharge to the load.

本発明の少なくとも一つの態様では、パルス発生器を用いて遺伝子発現を増強する方法が提供される。本方法は次の段階を含む：パルス発生器の第一回路から長い持続時間および低い電圧振幅を有する第一パルスを誘発する工程；第一パルスを少なくとも一つの細胞に伝送し、この少なくとも一つの細胞の原形質膜で電気穿孔を惹起する工程；パルス発生器の第二回路から長い持続時間および低い電圧振幅を有する第二パルスを誘発する工程；ならびに、第二パルスを前記少なくとも一つの細胞に伝送し、この少なくとも一つの細胞の核膜で電気穿孔を惹起する工程。   In at least one embodiment of the present invention, a method for enhancing gene expression using a pulse generator is provided. The method includes the steps of: inducing a first pulse having a long duration and a low voltage amplitude from a first circuit of a pulse generator; transmitting the first pulse to at least one cell; Inducing electroporation at the plasma membrane of the cell; inducing a second pulse having a long duration and a low voltage amplitude from the second circuit of the pulse generator; and applying a second pulse to the at least one cell Transmitting and inducing electroporation at the nuclear membrane of the at least one cell.

本発明の一つまたは複数の態様に従って、多パルス発生器を用いて細胞の遺伝子発現を増強する方法が提供される。本方法は次の段階を含む：コンデンサを充電する工程；コンデンサに蓄積された電荷を少なくとも一つの細胞へ放電し始めるよう高圧大電流トランジスタを作動させ、この少なくとも一つの細胞の原形質膜で電気穿孔を惹起する工程；所定の長い持続時間の後にコンデンサの放電を停止するよう高圧大電流トランジスタを作動させる工程；スイッチを作動させて、前記少なくとも一つの細胞からコンデンサを分離する工程；伝送線を充電する工程；伝送線に蓄積された電荷を前記少なくとも一つの細胞へ放電し始めるよう高圧スイッチを作動させ、この少なくとも一つの細胞の核膜で電気穿孔を惹起する工程；および、所定の短い持続時間の後に伝送線の放電を停止するよう高圧スイッチを作動させる工程。   In accordance with one or more embodiments of the present invention, a method for enhancing gene expression in a cell using a multipulse generator is provided. The method includes the steps of: charging a capacitor; operating a high voltage, high current transistor to begin discharging the charge stored in the capacitor to at least one cell, and electrically connecting the plasma membrane of the at least one cell. Initiating perforation; activating a high voltage, high current transistor to stop discharging the capacitor after a predetermined long duration; activating a switch to isolate the capacitor from the at least one cell; Charging; activating a high pressure switch to begin discharging the charge accumulated in the transmission line to the at least one cell and inducing electroporation at the nuclear membrane of the at least one cell; and a predetermined short duration Activating the high voltage switch to stop the transmission line discharge after time.

本発明の他の態様で、細胞の遺伝子発現を増強するために二元パルス発生器を提供する。この二元パルス発生器は、第一パルス発生器、第二パルス発生器、および制御回路を含む。第一パルス発生器は、長い持続時間および低い電圧振幅を有する第一パルスを発生するために用いられる。第二パルス発生器は、短い持続時間および高い電圧振幅を有する第二パルスを発生するために用いられる。第一パルスは細胞の細胞原形質膜の電気穿孔を惹起し、一方、第二パルスは細胞の核膜の電気穿孔を惹起する。制御回路は、第一パルス発生器および第二パルス発生器により発生するパルスのタイミングを制御するために用いられる。   In another aspect of the invention, a dual pulse generator is provided to enhance cellular gene expression. The dual pulse generator includes a first pulse generator, a second pulse generator, and a control circuit. The first pulse generator is used to generate a first pulse having a long duration and a low voltage amplitude. The second pulse generator is used to generate a second pulse having a short duration and a high voltage amplitude. The first pulse causes electroporation of the cell's cell plasma membrane, while the second pulse causes electroporation of the cell's nuclear membrane. The control circuit is used to control the timing of the pulses generated by the first pulse generator and the second pulse generator.

本発明は、構成の詳細、および以下に示される、または図面で説明される構成要素の配置の適用において限定されないことが理解されるはずである。本発明はむしろ、他の態様が可能であり、種々の方法で実践および実施できる。また、本明細書で用いられる語法および用語は、説明目的のものであり、限定するものとしてみなされるべきでないことが理解されるはずである。   It should be understood that the invention is not limited in the details of construction and application of the arrangement of components set forth below or illustrated in the drawings. Rather, the invention is capable of other embodiments and of being practiced and carried out in various ways. It should also be understood that the terminology and terminology used herein is for illustrative purposes and should not be considered limiting.

このように、当業者は、この開示が基づく概念が、本発明の幾つかの目的を実施するための他の構造、方法およびシステムの設計の基礎として容易に利用され得ることを理解するであろう。従って、特許請求の範囲は、本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、このような等価の構成を含むものとしてみなされることが重要である。   Thus, those skilled in the art will appreciate that the concepts on which this disclosure is based can be readily utilized as a basis for the design of other structures, methods and systems for carrying out some objects of the present invention. Let's go. It is important, therefore, that the claims be regarded as including such equivalent constructions insofar as they do not depart from the spirit and scope of the present invention.

本発明を特徴付ける新規性のこれらの特性および種々の特性は、特に本開示の一部を形成する添付の特許請求の範囲において示される。本発明、その動作利点およびその使用により得られる具体的な利益のより良い理解のために、本発明を実施するために意図される最良の様態を説明する添付の図面および本発明の好ましい態様を参照するべきである。   These and various other characteristics of novelty that characterize the present invention are set forth with particularity in the appended claims that form a part of this disclosure. For a better understanding of the present invention, its operational advantages and specific benefits obtained by its use, reference is made to the accompanying drawings and preferred embodiments of the present invention, which illustrate the best mode contemplated for carrying out the invention. Should be referenced.

発明の詳細な説明
本発明の原理の理解を促すため、ここで好ましい態様を参照し、これらを説明するために特定の用語を用いるが、本発明の範囲の制限がそれにより意図されないことは理解されるであろう。本発明の当業者が通常思いつくような、本発明の変更および更なる修飾、ならびに本明細書で説明される本発明の原理のこのような更なる適用は、本明細書においてさらに想定されている。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION To facilitate an understanding of the principles of the invention, reference will now be made to preferred embodiments and specific language will be used to describe the same, but it will be understood that no limitation of the scope of the invention is thereby intended Will be done. Further variations and further modifications of the invention and such further applications of the principles of the invention described herein are further envisioned herein, as would normally occur to one skilled in the art. .

例えば、一つの態様の一部として説明または記載される特性は、他の態様に用いられ更なる態様をもたらし得る。その上、ある種の特性は、言及されていないが同一または同様な機能を果たす同様な装置または特性と交換され得る。従って、このような修飾および変化は本発明の全体内に含まれることが意図される。   For example, features described or described as part of one embodiment can be used on other embodiments to yield additional embodiments. Moreover, certain characteristics may be interchanged with similar devices or characteristics that are not mentioned but perform the same or similar functions. Accordingly, such modifications and variations are intended to be included within the scope of the present invention.

本発明の一局面は、細胞へのナノ秒パルス電場（「nsPEF」）の適用を含む、細胞に薬剤を導入する方法を対象にする。本明細書で用いられるように、「薬剤」という用語は、薬物（例えば、化学療法剤）、核酸（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子）、ペプチドおよびポリペプチド（抗体を含む）、ならびに細胞に送達するための他の分子を含む。本明細書で用いられる「nsPEF」は、1 kV/cmから1000 kV/cm、好ましくは10 kV/cmから350 kV/cmの高電場強度を有する、1 nsから1000 ns、好ましくは1 nsから300 nsのナノ秒（「ns」）範囲の電気パルスとして定義される。本明細書で定義されるnsPEF条件は、それらの時間的および電気的な特徴においてだけでなく、特に無傷の細胞および組織に及ぼすそれらの影響において、電気穿孔パルスと明らかに異なる。比較すると、古典的な電気穿孔は、異なるパルス形状（台形の指数関数的減衰）および約0.1 kV/cmから5 kV/cmの強度の電場を有する、マイクロ秒からミリ秒の範囲のパルスを利用する。古典的な電気穿孔パルスの立ち上がり時間は一般的に細胞膜の帯電時間より長いため、電場は細胞内に到達できない。対照的に、nsPEFパルスは、ナノ秒範囲、好ましくは10 nsから300 nsのほぼ方形のパルスであり、外側の細胞膜の帯電時間と比べて短い1 nsから30 nsの範囲の急速な立ち上がり時間、および約1 kV/cmから1000 kV/cm、好ましくは約10 kV/cmから350 kV/cmの範囲の高電場を有する。パルスの速い立ち上がり時間および下降時間を除いて、パルス中の電界強度はほぼ一定レベルのままである。周波数領域において、nsPEFは、1000 ns持続時間のパルスの1 MHzから1 nsパルスの1 GHzの範囲のパルス長の逆数により定義されるカットオフ周波数を有する広帯域放射として記載することができる。しかし、低いカットオフ周波数でさえ、スペクトルは、GHz範囲までの主としてパルス立ち上がり時間により決定される高調波の寄与を示す。さらに、古典的な電気穿孔パルスは、ジュール/cc範囲のエネルギー密度および約500 Wの電力を示す。対照的に、nsPEFパルスはミリジュール/cc範囲のエネルギー密度を示し、全エネルギーは10 J（好ましくは1 J未満）および約180 MWの電力を超えない。nsPEFパルスに含まれるエネルギーの約90％は、カットオフ周波数の60％までの周波数範囲で適用される。nsPEFは、ユニークな短い持続時間および迅速な立ち上がり時間に加えて、非常に低いエネルギーで極めて高い電力であるため、格別である。従って、nsPEFパルスは、電気穿孔パルスより数桁高い電場および電力、ならびにかなり低いエネルギー密度で、5から6桁短くしうる。たとえnsPEFパルスが極めて高い電力を示すとしても、それらの持続時間は非常に短いため、エネルギー密度は有意な熱的効果を惹起しない。   One aspect of the present invention is directed to a method of introducing an agent into a cell, including application of a nanosecond pulsed electric field (“nsPEF”) to the cell. As used herein, the term “agent” is delivered to drugs (eg, chemotherapeutic agents), nucleic acids (eg, polynucleotides, genes), peptides and polypeptides (including antibodies), and cells. Including other molecules for. As used herein, `` nsPEF '' refers to 1 ns to 1000 ns, preferably 1 ns, having a high electric field strength of 1 kV / cm to 1000 kV / cm, preferably 10 kV / cm to 350 kV / cm. Defined as an electrical pulse in the 300 ns nanosecond (“ns”) range. The nsPEF conditions defined herein are distinctly different from electroporation pulses, not only in their temporal and electrical characteristics, but especially in their effects on intact cells and tissues. By comparison, classical electroporation utilizes pulses in the microsecond to millisecond range with different pulse shapes (trapezoidal exponential decay) and electric fields with intensities from about 0.1 kV / cm to 5 kV / cm To do. Since the rise time of a classical electroporation pulse is generally longer than the charging time of the cell membrane, the electric field cannot reach the cell. In contrast, an nsPEF pulse is a nearly square pulse in the nanosecond range, preferably 10 ns to 300 ns, with a rapid rise time in the range of 1 ns to 30 ns, which is short compared to the charging time of the outer cell membrane, And a high electric field in the range of about 1 kV / cm to 1000 kV / cm, preferably about 10 kV / cm to 350 kV / cm. Except for the fast rise and fall times of the pulse, the electric field strength during the pulse remains at a nearly constant level. In the frequency domain, nsPEF can be described as broadband radiation having a cut-off frequency defined by the reciprocal of the pulse length in the range from 1 MHz of pulses of 1000 ns duration to 1 GHz of 1 ns pulses. However, even at low cut-off frequencies, the spectrum shows harmonic contributions determined mainly by the pulse rise time up to the GHz range. Furthermore, classic electroporation pulses exhibit an energy density in the Joule / cc range and a power of about 500 W. In contrast, nsPEF pulses exhibit an energy density in the millijoule / cc range, and the total energy does not exceed 10 J (preferably less than 1 J) and about 180 MW of power. About 90% of the energy contained in the nsPEF pulse is applied in the frequency range up to 60% of the cutoff frequency. nsPEF is exceptional because it has very low energy and extremely high power in addition to its unique short duration and fast rise time. Thus, an nsPEF pulse can be 5 to 6 orders of magnitude shorter with an electric field and power several orders of magnitude higher than an electroporation pulse and a much lower energy density. Even though nsPEF pulses exhibit very high power, their duration is so short that energy density does not cause a significant thermal effect.

さらに、nsPEFパルスおよび古典的な電気穿孔パルスは、全く異なる影響を細胞に及ぼす。これらの差異を理解するためには、細胞に及ぼす電場の基本的影響を理解することが必要である。細胞質は導電体であり、包囲する原形質膜は誘電体層である。細胞が2電極間の導電媒質中に置かれ、単極電圧パルスがこれら電極に適用されると、生じる電流は細胞膜で電荷の蓄積を惹起し、その結果として膜をはさんだ電圧を惹起する。膜電圧が臨界値を超えると、電気穿孔として知られる過程である膜貫通孔形成とともに、表面膜の構造変化が起きる（Weaver, J.C., Electroporation of cells and tissues, in: J.D. Bronzino (Ed.), The Biomedical Engineering Handbook, CRC and IEEE press, Boca Raton, FL, 1995, pp.1431-1440）。膜電圧が過剰でなく、パルスの持続時間が限定される場合、膜穿孔（membrane poration）は可逆であり、細胞は生き残る。表面膜を帯電するために必要な時間は、細胞の直径（D）、細胞質（p）および懸濁培地（pc）の抵抗率、ならびに単位面積当たりの表面膜の静電容量（eR）などのパラメータに依存する。理想的な誘電体である表面膜（漏れ電流なし）、10μmの直径、100 ohm/cmの細胞質および培地の抵抗率、ならびに1μFarad/cm2の膜静電容量を備えた球状細胞には、充電時間定数（τc）は75 nsであろう（Cole, K.S. Electric Impedance of Marine Egg Membranes. Trans Farady Soc 23:966, 1937）[τc(ρc+ρa/2)cmD/2]。充電時間定数は、適用されたパルス電場強度に細胞内部が暴露される時間の尺度である。生細胞の単純な電気モデルにより、電気パルス持続時間がマイクロ秒未満の範囲（時間領域）に減少すると、電場の相互作用が細胞の部分構造のレベルで起きる可能性が増加し、原形質膜が変化する可能性が減少することが予測される。換言すれば、外膜は、振動の角周波数が充電時間の逆数により定められる値を超過する場合、振動する電場について次第に透過性になる。従って、nsPEFパルスの形態における高い周波数および短い持続時間の使用は、細胞内膜の電気穿孔などの細胞内効果に達成する可能性がより高い。 Furthermore, nsPEF pulses and classical electroporation pulses have completely different effects on the cells. In order to understand these differences, it is necessary to understand the fundamental effects of electric fields on cells. The cytoplasm is a conductor, and the surrounding plasma membrane is a dielectric layer. When a cell is placed in a conductive medium between two electrodes and a unipolar voltage pulse is applied to these electrodes, the resulting current causes charge accumulation at the cell membrane, resulting in a voltage across the membrane. When the membrane voltage exceeds a critical value, structural changes of the surface membrane occur along with the formation of transmembrane pores, a process known as electroporation (Weaver, JC, Electroporation of cells and tissues, in: JD Bronzino (Ed.), The Biomedical Engineering Handbook, CRC and IEEE press, Boca Raton, FL, 1995, pp.1431-1440). If the membrane voltage is not excessive and the duration of the pulse is limited, membrane poration is reversible and the cells survive. The time required to charge the surface membrane includes cell diameter (D), cytosolic (p) and suspension medium ( pc ) resistivity, and surface membrane capacitance per unit area (eR) Depends on the parameters. Charging spherical cells with an ideal dielectric surface membrane (no leakage current), 10 μm diameter, 100 ohm / cm cytoplasm and media resistivity, and 1 μFarad / cm 2 membrane capacitance The time constant (τ c ) will be 75 ns (Cole, KS Electric Impedance of Marine Egg Membranes. Trans Farady Soc 23: 966, 1937) [τ c (ρ c + ρ a / 2) cmD / 2]. The charge time constant is a measure of the time the cell interior is exposed to the applied pulsed electric field strength. With a simple electrical model of living cells, when the electrical pulse duration is reduced to a sub-microsecond range (time domain), the potential for electric field interactions to increase at the level of cellular substructure increases, It is expected that the likelihood of change will decrease. In other words, the outer membrane becomes increasingly permeable to the oscillating electric field when the angular frequency of vibration exceeds a value determined by the reciprocal of the charging time. Thus, the use of high frequencies and short durations in the form of nsPEF pulses are more likely to achieve intracellular effects such as intracellular membrane electroporation.

このように、パルス持続時間が減少するにつれ、nsPEFパルスは原形質膜を迂回してミトコンドリアおよび核などの細胞内構造を標的にし、原形質膜は損なわれない。従って、パルス持続時間が十分に短く、電場強度が十分に高い場合、細胞内構造が標的にされるため、nsPEFパルスは電気穿孔パルスの影響と異なる影響を有する（Deng et al., Biophys. J. 84, 2709-2714 (2003); Beebe et al., IEEE Trans. Plasma Sci. 30:1 Part 2, 286-292 (2002); Beebe et al., FASEB J (2003); Vernier et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 310, 286-295 (2003); White et. al., J Biol Chem. 279 (22):22964-72 (2004); Chen et al., Biochem Biophys Res Commun. 317 (2):421-7 (2004)）。細胞に及ぼすnsPEFの影響は、細胞の種類、パルスの持続時間および立ち上がり時間、電場強度、ならびにパルス数などの因子に応じて異なる。   Thus, as the pulse duration decreases, the nsPEF pulse bypasses the plasma membrane and targets intracellular structures such as mitochondria and nuclei, and the plasma membrane is not compromised. Thus, if the pulse duration is sufficiently short and the electric field strength is high enough, the nsPEF pulse has an effect different from that of the electroporation pulse because the intracellular structure is targeted (Deng et al., Biophys. J 84, 2709-2714 (2003); Beebe et al., IEEE Trans.Plasma Sci. 30: 1 Part 2, 286-292 (2002); Beebe et al., FASEB J (2003); Vernier et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 310, 286-295 (2003); White et. Al., J Biol Chem. 279 (22): 22964-72 (2004); Chen et al., Biochem Biophys Res Commun. 317 (2): 421-7 (2004)). The effect of nsPEF on cells depends on factors such as cell type, pulse duration and rise time, electric field strength, and number of pulses.

本発明の一形態において、所望の薬剤は、既知の技法（すなわち、電気穿孔、脂質小胞、ウイルスベクター、リン酸カルシウムまたはデキストランとの共沈殿）を用いて細胞内に導入される。次いで、細胞は、所望する薬剤の細胞核への移行を促進するために、一つまたは複数のnsPEFパルスに暴露される。本発明によると、nsPEFパルスは、1ナノ秒から1000ナノ秒、好ましくは1ナノ秒から300ナノ秒の持続時間の範囲であり得る。nsPEFパルスの場の振幅は、1 kV/cmから1000 kV/cm、好ましくは10 kV/cmから350 kV/cmの範囲であり得る。原形質膜に及ぼすnsPEFの影響についての実験により、nsPEFが、細胞を永続的に損傷することなく、原形質膜の孔の一過的な開口を引き起こすことが証明された（Schoenbach, K.H., Beebe, S.J., Buescher, E.S., Intracellular effect of ultrashort electrical pulses, Bioelectromagnetics 22:440-448, 2001）。nsPEFを用いた他の実験により、細胞の膜に結合した細胞小器官が同じ種類のパルスにより開口し得ることが示された（Schoenbach, K.H., Beebe, S.J., Buescher, E.S., Intracellular effect of ultrashort electrical pulses, Bioelectromagnetics 22:440-448, 2001）。理論的に、nsPEFは極めて十分短いため、これらnsPEFでパルスされた細胞の原形質膜は十分に帯電せず、それにより、（古典的な電気穿孔パルスと違って）有意な原形質膜の影響を回避する。代わりに、nsPEFの細胞への適用は、より大きな影響を細胞内膜にもたらす。従って、特定の理論に束縛されることを意図しないが、nsPEFは細胞を損なうことなく核膜孔を一時的に開口することが推論される。従って、所望する薬剤が細胞の原形質膜を既に通過した後、薬剤が核内に拡散できるほど十分な時間が与えられ、nsPEFパルスが適用される場合、nsPEFパルスは核膜の孔を開口することにより核内への薬剤の流動増進を促す。   In one form of the invention, the desired agent is introduced into the cell using known techniques (ie, electroporation, lipid vesicles, viral vectors, co-precipitation with calcium phosphate or dextran). The cells are then exposed to one or more nsPEF pulses to facilitate the transfer of the desired agent to the cell nucleus. According to the present invention, nsPEF pulses can range in duration from 1 nanosecond to 1000 nanoseconds, preferably from 1 nanosecond to 300 nanoseconds. The field amplitude of the nsPEF pulse can range from 1 kV / cm to 1000 kV / cm, preferably from 10 kV / cm to 350 kV / cm. Experiments on the effects of nsPEF on the plasma membrane have demonstrated that nsPEF causes a transient opening of the plasma membrane pore without permanently damaging cells (Schoenbach, KH, Beebe SJ, Buescher, ES, Intracellular effect of ultrashort electrical pulses, Bioelectromagnetics 22: 440-448, 2001). Other experiments using nsPEF have shown that organelles attached to the cell membrane can be opened by the same type of pulse (Schoenbach, KH, Beebe, SJ, Buescher, ES, Intracellular effect of ultrashort electrical pulses, Bioelectromagnetics 22: 440-448, 2001). Theoretically, nsPEF is so short that the plasma membranes of cells pulsed with these nsPEFs are not fully charged, thereby causing significant plasma membrane effects (unlike classical electroporation pulses). To avoid. Instead, application of nsPEF to cells has a greater impact on the intracellular membrane. Thus, without intending to be bound by any particular theory, it is inferred that nsPEF temporarily opens the nuclear pore without damaging cells. Thus, if the desired drug is already passed through the plasma membrane of the cell and then given enough time to allow the drug to diffuse into the nucleus, and the nsPEF pulse is applied, the nsPEF pulse opens the pores of the nuclear membrane This promotes the flow of drugs into the nucleus.

先に記載したように、本明細書で用いられる「薬剤」という用語は、薬物（例えば、化学療法剤）、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）、ならびにペプチドおよびポリペプチド（抗体を含む）を指す。例えば、本発明の方法で使用されるペプチドまたはポリペプチドは、被験体に免疫応答を惹起する目的で、その細胞内に導入される抗原であり得る。または、ポリペプチドは、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、エリスロポエチン、インスリン、サイトカイン、リンホカイン、成長ホルモン、増殖因子、またはこれらの任意の二つ以上の組み合わせ等のホルモンであり得る。本発明の方法を用いて細胞内に導入され得る更なる例示的ポリペプチドとしては、腫瘍壊死因子、インターロイキン1、2および3、リンホトキシン、マクロファージ活性化因子、遊走阻止因子、コロニー刺激因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、γ-インターフェロン（およびこれらの亜型）などの血液凝固因子およびリンホカインが挙げられる。   As described above, the term “agent” as used herein refers to drugs (eg, chemotherapeutic agents), nucleic acids (eg, polynucleotides), and peptides and polypeptides (including antibodies). For example, the peptide or polypeptide used in the methods of the present invention can be an antigen that is introduced into the cell for the purpose of eliciting an immune response in the subject. Alternatively, the polypeptide can be a hormone such as calcitonin, parathyroid hormone, erythropoietin, insulin, cytokine, lymphokine, growth hormone, growth factor, or any combination of any two or more thereof. Further exemplary polypeptides that can be introduced into cells using the methods of the present invention include tumor necrosis factor, interleukins 1, 2 and 3, lymphotoxin, macrophage activating factor, migration inhibitory factor, colony stimulating factor, α -Blood coagulation factors and lymphokines such as interferon, β-interferon, γ-interferon (and their subtypes).

本明細書で用いられるように、本発明の「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、または「オリゴヌクレオチド」には、全ての型のDNA、cDNA、およびRNA配列が含まれる。例えば、ポリヌクレオチドは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、複合DNA、カプセル化DNA、ゲノムDNA、裸のDNA、カプセル化RNA、DNA-RNAハイブリッド、ヌクレオチドポリマー、およびこれらの組み合わせであり得る。このような薬剤は任意の目的で細胞内に導入され得る。例えば、薬剤は、細胞増殖を調節する量、または核酸もしくは核酸によりコードされるタンパク質産物のいずれかに対して免疫応答を誘発する量で使用され得る。   As used herein, “nucleic acid”, “nucleic acid molecule”, “polynucleotide”, or “oligonucleotide” of the present invention includes all types of DNA, cDNA, and RNA sequences. For example, the polynucleotide can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, composite DNA, encapsulated DNA, genomic DNA, naked DNA, encapsulated RNA, DNA-RNA hybrids, nucleotide polymers, and combinations thereof. Such agents can be introduced into cells for any purpose. For example, the agent can be used in an amount that modulates cell proliferation or an amount that elicits an immune response against either the nucleic acid or the protein product encoded by the nucleic acid.

本発明のポリヌクレオチドは発現ベクターなどのDNA構築物でもあり得る。このような発現ベクターは所望の遺伝子産物（例えば、導入される被験体に相同または非相同な遺伝子産物）をコードし得る。治療用ポリペプチド（治療用遺伝子産物をコードするもの）は、被験体の細胞が治療用ポリペプチドでトランスフェクトされるように、調節配列と機能的に連結され得る。そしてこのポリペプチドは、本発明の方法の一局面に従って導入される細胞で発現する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において知られるような、本発明の方法に従う薬剤による細胞の形質転換を検出する際に役立つ選択マーカーポリペプチドを、さらにコードし得る。   The polynucleotide of the present invention may also be a DNA construct such as an expression vector. Such expression vectors can encode a desired gene product (eg, a gene product that is homologous or heterologous to the subject to be introduced). The therapeutic polypeptide (which encodes a therapeutic gene product) can be operably linked to regulatory sequences such that a subject's cells are transfected with the therapeutic polypeptide. This polypeptide is then expressed in cells that are introduced according to one aspect of the method of the invention. The polynucleotide may further encode a selectable marker polypeptide useful in detecting cell transformation by an agent according to the methods of the invention, as is known in the art.

本発明の方法の種々の態様において、薬剤は、細胞の増殖能を改変する「増殖調節剤」であり得る。増殖調節剤は、細胞毒性剤、タンパク質の存在下で毒性である薬剤または毒性になる薬剤、および化学治療剤を含むが、これらに限定されない。「細胞毒性剤」という用語は、特定の細胞を阻害、殺傷、または溶解する能力を有するタンパク質、ペプチドまたは他の分子を指す。細胞毒性剤は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、サポリンなどのタンパク質を含む。   In various embodiments of the methods of the invention, the agent can be a “growth regulator” that alters the proliferative capacity of a cell. Growth regulators include, but are not limited to, cytotoxic agents, agents that are or become toxic in the presence of proteins, and chemotherapeutic agents. The term “cytotoxic agent” refers to a protein, peptide or other molecule that has the ability to inhibit, kill or lyse a particular cell. Cytotoxic agents include proteins such as ricin, abrin, diphtheria toxin, saporin.

他の態様において、本発明は腫瘍および/または他の組織への薬物送達の増進を促すために用いられ得る。この点において、本発明の方法での使用を意図する薬物は、当技術分野において知られるような抗生剤、および抗腫瘍効果または細胞毒性効果を有する化学治療剤を含む。このような薬物または薬剤は、ブレオマイシン、ダウノマイシン、5-FU、シトシンアラビノシド、コルヒチン、サイトカラシンB、ダウノルビシン、ネオカルシノスタチン、スラミン、ドキソルビシン、カルボプラチン、タキソール、マイトマイシンC、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、およびシスプラチンを含む。他の薬物および化学治療剤は当業者には理解されるであろう（例えば、The Merck Indexを参照のこと）。このような薬剤は、被験体に通常は見出されない「外因性」薬剤（例えば、化学的化合物）であってもよく、または被験体に由来する「内因性」薬剤であってもよく、生物学的反応修飾物質（すなわち、サイトカイン、ホルモン）などの天然に生じる適切な薬剤が含まれる。さらなる化学治療剤としては、微生物または植物起源に由来する細胞毒性剤が挙げられる。   In other embodiments, the present invention can be used to facilitate enhanced drug delivery to tumors and / or other tissues. In this regard, drugs intended for use in the methods of the present invention include antibiotics as known in the art, and chemotherapeutic agents that have anti-tumor or cytotoxic effects. Such drugs or drugs include bleomycin, daunomycin, 5-FU, cytosine arabinoside, colchicine, cytochalasin B, daunorubicin, neocalcinostatin, suramin, doxorubicin, carboplatin, taxol, mitomycin C, vincristine, vinblastine, methotrexate And cisplatin. Other drugs and chemotherapeutic agents will be understood by those skilled in the art (see, for example, The Merck Index). Such an agent may be an “exogenous” agent (eg, a chemical compound) not normally found in a subject, or may be an “endogenous” agent derived from a subject, Included are appropriate naturally occurring agents such as biological response modifiers (ie, cytokines, hormones). Additional chemotherapeutic agents include cytotoxic agents derived from microbial or plant sources.

また、「膜に作用する」薬剤も本発明の方法に従って細胞内に導入され得る。膜に作用する薬剤は、N-アルキルメラミド（alkylmelamide）、およびパラ-クロロ安息香酸水銀など、主に細胞膜を損傷することにより作用する化学治療剤の一部である。または、この組成物は、アジドデオキシチミジン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシトシン、ガンシクロビル、アシクロビル、ビダラビン、リバビリンなどのデオキシリボヌクレオチド類似体、または当技術分野における平均的な技量を有する当業者に知られている任意の化学治療剤を含み得る。   Agents that "act on the membrane" can also be introduced into cells according to the methods of the invention. Drugs that act on the membrane are some of the chemotherapeutic agents that act primarily by damaging the cell membrane, such as N-alkylmelamide and mercury para-chlorobenzoate. Alternatively, the composition can be a deoxyribonucleotide analog such as azidodeoxythymidine, dideoxyinosine, dideoxycytosine, ganciclovir, acyclovir, vidarabine, ribavirin, or any known to those of ordinary skill in the art Chemotherapeutic agents.

更に、他の態様において、本発明の方法および装置は、ワクチンを投与し、その効能を増強するために用いられ得る。従って、本発明の態様において、薬剤はワクチンであり得る。このようなワクチンは、不活性化病原菌、組換えまたは天然のサブユニット、および生弱毒化微生物または生組換え微生物からなり得る。このワクチンはポリヌクレオチドまたはタンパク質成分も含み得る。   Furthermore, in other embodiments, the methods and devices of the invention can be used to administer a vaccine and enhance its efficacy. Thus, in an embodiment of the invention, the drug can be a vaccine. Such vaccines can consist of inactivated pathogens, recombinant or natural subunits, and live attenuated or live recombinant microorganisms. The vaccine may also include a polynucleotide or protein component.

「裸の」DNA、複合DNA、またはカプセル化DNAを用いて防御免疫応答を誘導する方法であるDNA免疫が、米国特許第5,589,466号に示されている。DNA免疫は、例えば規定された微生物または細胞の抗原、および例えばサイトカイン（例えば、ILおよびIFN）の産生をコードするベクターベースのDNAまたは非ベクターDNAの直接的なインビボ投与を伴う。宿主自体の細胞におけるこれら抗原のデノボ産生が抗体の誘発および細胞性免疫応答をもたらし、この応答は攻撃に対する防御を提供し、さらに免疫することなく長期間持続する。この技法のユニークの利点は、生きた感染物質の非経口投与に伴う安全性および安定性の懸念なしに生弱毒化ワクチンの効果を模倣できることである。これらの利点のため、例えば、最大の抗原産生、および結果として最大の免疫応答をもたらす裸のDNAのインビボ送達系を精緻化することに、かなりの研究努力が注力されてきた。このような系はリポソームおよびDNA送達用の他のカプセル化手段も含む。   DNA immunization, a method of inducing a protective immune response using “naked” DNA, composite DNA, or encapsulated DNA, is shown in US Pat. No. 5,589,466. DNA immunization involves the direct in vivo administration of, for example, defined microbial or cellular antigens, and vector-based or non-vector DNA encoding, for example, the production of cytokines (eg, IL and IFN). De novo production of these antigens in the host's own cells results in the induction of antibodies and a cellular immune response that provides protection against attack and persists for long periods without further immunization. The unique advantage of this technique is that it can mimic the effects of a live attenuated vaccine without the safety and stability concerns associated with parenteral administration of live infectious agents. Because of these advantages, considerable research efforts have focused on, for example, elaborating naked DNA in vivo delivery systems that result in maximal antigen production and, as a consequence, maximal immune response. Such systems also include liposomes and other encapsulation means for DNA delivery.

このように、本発明に従って、DNAまたはRNA分子が防御免疫応答を誘起するためにワクチンとして導入され得る。発現される遺伝子産物（すなわち活性剤）をコードすることに加えて、前記分子は、ワクチン接種された被験体の細胞で発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御要素と機能的に連結された開始シグナルおよび終止シグナルも含み得る。ワクチンポリヌクレオチドは任意で、本明細書に記載の薬学的に許容される担体に含まれ得る。   Thus, according to the present invention, DNA or RNA molecules can be introduced as a vaccine to elicit a protective immune response. In addition to encoding the gene product to be expressed (ie, active agent), the molecule is operably linked to regulatory elements including a promoter and a polyadenylation signal that can induce expression in cells of the vaccinated subject. May also include start and stop signals. The vaccine polynucleotide can optionally be included in a pharmaceutically acceptable carrier as described herein.

本明細書で用いられるように、「遺伝子産物」という用語は、処理細胞内でのポリヌクレオチドの発現に起因するタンパク質またはペプチドを指す。遺伝子産物は、例えば、病原菌、または癌細胞もしくは免疫が必要な自己免疫疾患に関与する細胞などの望ましくない細胞型に由来するタンパク質と少なくとも一つのエピトープを共有する免疫原性のタンパク質またはペプチドであり得る。このようなタンパク質およびペプチドは抗原であって、使用する遺伝子ワクチンの型に応じて、病原菌に関連するタンパク質、過剰増殖細胞に関連するタンパク質、または自己免疫疾患に関連するタンパク質のいずれかとエピトープを共有する。抗原エピトープに対する免疫応答は、抗原エピトープが関連する特定の感染または疾患から被験体を保護する。例えば、病原菌に関連する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、病原菌による感染から被験体を保護する免疫応答を誘発するために使用できる。   As used herein, the term “gene product” refers to a protein or peptide resulting from the expression of a polynucleotide in a treated cell. A gene product is an immunogenic protein or peptide that shares at least one epitope with a protein derived from an undesirable cell type, such as, for example, a pathogen or a cell involved in a cancer cell or an autoimmune disease requiring immunity obtain. These proteins and peptides are antigens and share epitopes with either pathogen-related proteins, hyperproliferative cell-related proteins, or autoimmune disease-related proteins, depending on the type of genetic vaccine used. To do. An immune response against an antigenic epitope protects the subject from the specific infection or disease with which the antigenic epitope is associated. For example, a polynucleotide encoding a gene product associated with a pathogen can be used to elicit an immune response that protects a subject from infection by the pathogen.

同様に、例えば腫瘍関連タンパク質などの過剰増殖疾患に関連する抗原エピトープを含む遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、過剰増殖する細胞に対して免疫応答を誘発するために用いられ得る。自己免疫疾患に関与するT細胞受容体または抗体に関連する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドは、標的タンパク質の天然形態が産生されている細胞を除去することにより、自己免疫疾患を抑えようとする免疫応答を誘発するために用いられ得る。本発明に従って活性剤として細胞内に導入される抗原性遺伝子産物は、病原菌に関連するタンパク質、過剰増殖する細胞に関連するタンパク質、自己免疫疾患に関連するタンパク質、または当技術分野における平均的な技量を有する当業者に知られる任意の他のタンパク質もしくはペプチドのいずれかであり得る。   Similarly, a polynucleotide encoding a gene product comprising an antigenic epitope associated with a hyperproliferative disease, such as a tumor associated protein, can be used to elicit an immune response against hyperproliferating cells. Polynucleotides that encode gene products related to T cell receptors or antibodies involved in autoimmune diseases eliminate immunity from autoimmune diseases by removing cells in which the natural form of the target protein is produced. Can be used to elicit a response. Antigenic gene products introduced into cells as active agents according to the present invention include proteins associated with pathogenic bacteria, proteins associated with hyperproliferating cells, proteins associated with autoimmune diseases, or average skill in the art. Can be any other protein or peptide known to those of skill in the art.

従って、本発明の一形態において、所望のワクチンはまず既知の技法を用いて細胞内に導入される。例えば、ワクチンは、まず細胞内に導入された後、核内へのワクチン分子の侵入を促すために一つまたは複数のnsPEFパルスに暴露され、それによりワクチン分子により産生される抗原の分泌を刺激する。   Thus, in one form of the invention, the desired vaccine is first introduced into the cell using known techniques. For example, a vaccine is first introduced into a cell and then exposed to one or more nsPEF pulses to facilitate entry of the vaccine molecule into the nucleus, thereby stimulating the secretion of the antigen produced by the vaccine molecule To do.

さらに、細胞における内因性遺伝子などの遺伝子の発現を調節するポリヌクレオチドを被験体の細胞内に導入することが望ましいかもしれない。「調節」という用語は、遺伝子の発現の抑制または増加を想定する。細胞増殖疾患が遺伝子の発現と関連する場合、翻訳レベルで遺伝子発現を妨げる核酸配列が遺伝子発現を調節するために用いられ得る。このアプローチは、mRNAをアンチセンス核酸もしくは三重鎖形成剤（triplex agent）で遮蔽することにより、あるいはmRNAをリボザイムで切断することにより、特定のmRNAの転写もしくは翻訳を遮断するために、アンチセンス核酸配列、リボザイム、または三重鎖形成剤など、発現を妨害できる活性剤を被験体の細胞内に導入する。   Furthermore, it may be desirable to introduce a polynucleotide that regulates the expression of a gene, such as an endogenous gene, in the cell of the subject. The term “modulation” assumes suppression or increase of gene expression. Where cell proliferation disorders are associated with gene expression, nucleic acid sequences that interfere with gene expression at the translational level can be used to regulate gene expression. This approach uses antisense nucleic acids to block transcription or translation of specific mRNAs by shielding them with antisense nucleic acids or triplex agents, or by cleaving mRNA with a ribozyme. An active agent capable of interfering with expression, such as a sequence, ribozyme, or triplex forming agent, is introduced into the subject's cells.

アンチセンス核酸配列は、特定のmRNA分子の少なくとも一部に相補的なDNAまたはRNAの分子である。細胞において、アンチセンス核酸は、対応するmRNAにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖mRNAを翻訳しないため、アンチセンス核酸はmRNAの翻訳を妨げる。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが、容易に合成され、標的細胞に導入された際に問題を引き起こす可能性が高分子より低いため、好ましい。遺伝子のインビトロ翻訳を阻害するためのアンチセンス方法の使用は当技術分野において周知である。   An antisense nucleic acid sequence is a molecule of DNA or RNA that is complementary to at least a portion of a particular mRNA molecule. In the cell, the antisense nucleic acid hybridizes to the corresponding mRNA to form a double-stranded molecule. Since cells do not translate double-stranded mRNA, antisense nucleic acids prevent mRNA translation. About 15 nucleotide antisense oligomers are preferred because they are easier to synthesize and are less likely to cause problems when introduced into target cells. The use of antisense methods to inhibit in vitro translation of genes is well known in the art.

転写を停頓させるための短いオリゴヌクレオチド配列（すなわち、「三重鎖形成剤」）の使用は、オリゴマーが二重らせんDNAに巻きつき三重鎖らせんを形成するため、三重鎖戦略として知られる。従って、このような三重鎖形成剤は選択遺伝子の特異部位を認識するよう設計され得る（Maher, et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991）。   The use of short oligonucleotide sequences (ie, “triple formers”) to halt transcription is known as a triplex strategy because the oligomer wraps around the double helix DNA to form a triplex helix. Thus, such triplex forming agents can be designed to recognize specific sites of selected genes (Maher, et al., Antisense Res. And Dev., 1 (3): 227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6 (6): 569, 1991).

リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼに類似する様式で他の一本鎖RNAを特異的に切断する能力を所有するRNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレオチド配列の修飾を通して、RNA分子中の特異的なヌクレオチド配列を認識し、それを切断する分子を設計することが可能である（Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1988）。このアプローチの主な利点は、それらが配列特異的であるため、特定配列を有するmRNAのみが不活性化されることである。二つの基本的な型のリボザイム、すなわちテトラヒメナ型（Hasselhoff, Nature, 334:585, 1988）および「ハンマーヘッド」型が存在する。テトラヒメナ型リボザイムは長さ4塩基の配列を認識する一方、「ハンマーヘッド」型リボザイムは長さ11〜18塩基の塩基配列を認識する。認識配列が長くなるほど、この配列が標的mRNA種のみに現れる可能性が高くなる。よって、特定のmRNA種を不活性化するためにはテトラヒメナ型リボザイムよりハンマーヘッド型リボザイムを使用することが好ましく、本発明の一局面の活性剤として、18塩基の認識配列が、それよりも短い認識配列よりも好ましい。   Ribozymes are RNA molecules that possess the ability to specifically cleave other single-stranded RNA in a manner similar to DNA restriction endonucleases. Through modification of the nucleotide sequence encoding these RNAs, it is possible to design molecules that recognize and cleave specific nucleotide sequences in RNA molecules (Cech, J. Amer. Med. Assn., 260: 3030, 1988). The main advantage of this approach is that only mRNAs with a specific sequence are inactivated because they are sequence specific. There are two basic types of ribozymes, the Tetrahymena type (Hasselhoff, Nature, 334: 585, 1988) and the “hammerhead” type. Tetrahymena ribozymes recognize sequences of 4 bases in length, while “hammerhead” ribozymes recognize base sequences of 11-18 bases in length. The longer the recognition sequence, the more likely this sequence will appear only in the target mRNA species. Therefore, in order to inactivate a specific mRNA species, it is preferable to use a hammerhead ribozyme rather than a tetrahymena ribozyme. As an activator of one aspect of the present invention, a recognition sequence of 18 bases is shorter than that. Preferred over recognition sequences.

本発明の方法に従って導入される薬剤はまた、治療用のペプチドまたはポリペプチドであり得る。例えば、免疫調節剤および他の生物学的反応修飾物質が、細胞に取り込まれるように投与され得る。「生物学的反応修飾物質」という用語は、免疫応答を改変する際に関与する物質を包含することを意味する。免疫応答修飾物質の例はリンホカインなどの化合物を含む。リンホカインは、腫瘍壊死因子、インターロイキン1、2および3、リンホトキシン、マクロファージ活性化因子、遊走阻止因子、コロニー刺激因子、αインターフェロン、βインターフェロン、およびγインターフェロン、それらの亜型などを含む。   Agents introduced according to the methods of the invention can also be therapeutic peptides or polypeptides. For example, immunomodulators and other biological response modifiers can be administered to be taken up by cells. The term “biological response modifier” is meant to encompass substances involved in altering the immune response. Examples of immune response modifiers include compounds such as lymphokines. Lymphokines include tumor necrosis factor, interleukins 1, 2 and 3, lymphotoxin, macrophage activating factor, migration inhibitory factor, colony stimulating factor, alpha interferon, beta interferon, and gamma interferon, their subtypes, and the like.

抗血管新生化合物、例えば因子VIIIまたは因子IXを含む代謝酵素およびタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。本発明の薬剤はまた、抗体であり得る。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、無傷の分子、ならびにFabおよびF(ab’)2などのそれらの断片を含むことを意味する。 Also included are polynucleotides encoding metabolic enzymes and proteins, including anti-angiogenic compounds such as factor VIII or factor IX. The agent of the present invention can also be an antibody. The term “antibody” as used herein is meant to include intact molecules and fragments thereof such as Fab and F (ab ′) 2 .

本発明はまた、特定遺伝子またはその欠如により媒介される細胞増殖障害または免疫障害の治療のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、障害を有する細胞内に特定のセンスポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを導入することにより、その治療効果を達成する。細胞内へのポリヌクレオチドの導入は、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターを用いて達成され得る。または、ポリヌクレオチドは、例えば「裸の」DNAとして送達され得る。細胞内へポリヌクレオチドを「導入する」ことは、細胞内に外因性核酸分子を挿入する任意の方法を包含し、標的細胞の形質導入、トランスフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス感染を含むが、これらに限定されない。   The present invention also provides gene therapy for the treatment of cell proliferation disorders or immune disorders mediated by a specific gene or lack thereof. Such treatment achieves its therapeutic effect by introducing a specific sense polynucleotide or antisense polynucleotide into a cell having a disorder. Introduction of the polynucleotide into the cell can be accomplished using a recombinant expression vector such as a chimeric virus. Alternatively, the polynucleotide can be delivered as, for example, “naked” DNA. “Introducing” a polynucleotide into a cell includes any method of inserting an exogenous nucleic acid molecule into the cell, including transduction of target cells, transfection, microinjection, and viral infection. It is not limited to.

本明細書で教示される遺伝子治療に利用できる種々のウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはレトロウイルスなどのRNAウイルスを含む。好ましくは、レトロウイルスベクターはマウスまたは鳥類のレトロウイルスの誘導体である。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳癌ウイルス（MuMTV）、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）が含まれるが、これらに限定されない。被験体がヒトである場合、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）などのベクターが利用できる。更なる多くのレトロウイルスベクターが複数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、選択マーカー遺伝子を移入または組み込むことができ、形質導入細胞を同定し、作製することができる。   Various viral vectors that can be utilized for gene therapy as taught herein include RNA viruses such as adenoviruses, herpesviruses, vaccinia, or preferably retroviruses. Preferably, the retroviral vector is a mouse or avian retroviral derivative. Examples of retroviral vectors into which a single foreign gene can be inserted include Moloney murine leukemia virus (MoMuLV), Harvey murine sarcoma virus (HaMuSV), mouse mammary tumor virus (MuMTV), and Rous sarcoma virus (RSV) However, it is not limited to these. When the subject is a human, a vector such as gibbon leukemia virus (GaLV) can be used. Many additional retroviral vectors can incorporate multiple genes. All of these vectors can transfer or incorporate a selectable marker gene and can identify and generate transduced cells.

本発明の他の局面において、ポリヌクレオチドは、リン酸カルシウムおよびデキストランの共沈殿、原形質膜と融合するための脂質小胞へのポリヌクレオチドの取り込み、ならびに原形質膜に「孔」を形成するためにパルス電場を用いる電気透過化または電気穿孔により、細胞内に導入され得る。理想としては、遺伝子送達系の選択は、効率的な遺伝子導入の方針を留意して、細胞特異的な様式で副作用なしに適切な遺伝子発現のレベルで当業者により為される。   In other aspects of the invention, the polynucleotide is used to co-precipitate calcium phosphate and dextran, to incorporate the polynucleotide into lipid vesicles for fusing with the plasma membrane, and to form a “pore” in the plasma membrane. It can be introduced into cells by electropermeabilization or electroporation using a pulsed electric field. Ideally, the choice of gene delivery system is made by those skilled in the art at the level of appropriate gene expression in a cell-specific manner without side effects, keeping in mind efficient gene transfer strategies.

細胞内に導入される薬剤は、放射性標識または蛍光マーカーなどの検出可能なマーカーも含み得る。または、この組成物はPsoralin C2などの光活性修飾を含み得る。さらにこの組成物は、ブチルアミデート、ピペラジデート、およびモルホリデートなどのホスホラミデート結合を含み得る。またはこの組成物は、ホスホチオレート結合またはリボ核酸を含み得る。これらの結合は、インビボ分解に対するオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの脆弱性を低減する。   The agent introduced into the cell can also include a detectable marker, such as a radioactive label or a fluorescent marker. Alternatively, the composition can include a photoactive modification such as Psoralin C2. In addition, the composition can include phosphoramidate linkages such as butylamidate, piperazidate, and morpholidate. Alternatively, the composition can include phosphothiolate linkages or ribonucleic acids. These bonds reduce the vulnerability of oligonucleotides and polynucleotides to in vivo degradation.

他の局面において、本発明の薬剤は、薬学的薬剤または薬学的に活性な薬剤であり得る。本明細書で用いられる「薬学的薬剤」または「薬学的に活性な薬剤」という用語は、ヒトおよび動物の両方を含む被験体に投与された場合に、治療に有益な薬理反応を生じる任意の物質を包含する。所望であれば、一つよりも多くの薬学的に活性な物質を、本発明の方法で用いられる薬学的組成物に含め得る。   In other aspects, the agent of the present invention can be a pharmaceutical agent or a pharmaceutically active agent. The term “pharmaceutical agent” or “pharmaceutically active agent” as used herein refers to any pharmacological response that produces a therapeutically beneficial pharmacological response when administered to a subject, including both humans and animals. Includes substances. If desired, more than one pharmaceutically active substance can be included in the pharmaceutical composition used in the methods of the invention.

薬学的に活性な薬剤は、分子錯体または薬学的に許容される塩などの様々な形態で利用され得る。このような塩の代表例は、コハク酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、サリチル酸塩、金属塩（例えば、アルカリまたはアルカリ土類）、アンモニウム塩またはアミン塩（例えば、第四級アンモニウム）等である。さらに、所望の保持および放出特性を有するが、生理学的pHまたは酵素によりインビボで容易に加水分解されるエステル、アミド、およびエーテルなどの活性物質の誘導体も利用できる。   Pharmaceutically active agents can be utilized in various forms such as molecular complexes or pharmaceutically acceptable salts. Representative examples of such salts are succinate, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, nitrate, borate, acetate, maleate, tartrate, salicylate, metal salt (For example, alkali or alkaline earth), ammonium salt or amine salt (for example, quaternary ammonium) and the like. In addition, derivatives of active substances such as esters, amides, and ethers that have the desired retention and release properties but are readily hydrolyzed in vivo by physiological pH or enzymes are also available.

本明細書で用いられるように、「治療に有効な量」または「有効量」という用語は、生物学的に活性なまたは薬学的に活性な物質の量が、所望の薬理効果を誘導するのに十分な量および活性であることを意味する。この物質の量は、特定の活性物質の効力、各被験体の年齢、体重、および反応、ならびに被験体の状態または症状の性質および重症度によってかなり変動し得る。従って、被験体の細胞に導入される活性剤の量に上下の臨界値は存在しないが、細胞毒性または組織損傷など、前記細胞またはこのような細胞を含む組織に過度の副作用を惹起するほど大量であるべきではない。細胞の形質転換に必要な量は細胞の種類および組織によって変動し、本明細書の教示を用いて当技術分野の通常の技量を有する当業者により容易に決定できる。本発明の方法の実施において使用されるべき必要量は、当業者により容易に決定され得る。   As used herein, the term “therapeutically effective amount” or “effective amount” means that the amount of a biologically active or pharmaceutically active substance induces a desired pharmacological effect. Means a sufficient amount and activity. The amount of this substance can vary considerably depending on the potency of the particular active substance, the age, weight, and response of each subject, and the nature and severity of the subject's condition or symptoms. Thus, there is no upper or lower critical value for the amount of active agent introduced into a subject's cells, but it is so high as to cause excessive side effects on the cells or tissues containing such cells, such as cytotoxicity or tissue damage. Should not be. The amount required for cell transformation will vary with cell type and tissue and can be readily determined by one of ordinary skill in the art using the teachings herein. The required amount to be used in the practice of the method of the invention can be readily determined by one skilled in the art.

本発明の方法の一態様において、細胞内に導入される遺伝子産物をコードする核酸配列などの活性剤の量は、「形質転換量」である。形質転換量は、有糸***もしくは遺伝子発現などの細胞機能を改変するため、または核酸配列によりコードされる遺伝子産物の少なくとも何らかの発現を惹起するために有効な活性剤の量である。他の態様において、薬剤は、「免疫原性」量、「免疫調節」量、または「治療量」で存在し得る。免疫原性量は、免疫応答を誘発するために有効な活性剤の量である。免疫調節量は、何らかの意味で免疫応答を改変するために有効な活性剤の量である。治療量は、例えば特定の障害を治療するために望ましい免疫応答または生体反応を誘起するのに有効な活性剤の量である。   In one embodiment of the method of the present invention, the amount of active agent such as a nucleic acid sequence encoding a gene product introduced into a cell is a “transformation amount”. A transformation amount is the amount of active agent that is effective to alter cellular functions such as mitosis or gene expression, or to elicit at least some expression of a gene product encoded by a nucleic acid sequence. In other embodiments, the agent may be present in an “immunogenic” amount, an “immunomodulating” amount, or a “therapeutic amount”. An immunogenic amount is the amount of active agent that is effective to elicit an immune response. An immunomodulatory amount is the amount of active agent that is effective in some way to alter the immune response. A therapeutic amount is an amount of active agent effective to elicit an immune or biological response that is desirable, for example, to treat a particular disorder.

皮膚の天然の障壁層を横切る活性剤の導入は、活性剤を放出制御媒体で、または脂質と混合して封入することにより増強され得る。活性剤の調製物または製剤に関して本明細書で用いられるように、「放出制御」という用語は、調製物または製剤が、大部分の活性物質を周囲の媒体に放出するために少なくとも1時間、例えば約1〜24時間、または更に長時間を要することを意味する。   The introduction of the active agent across the natural barrier layer of the skin can be enhanced by encapsulating the active agent in a controlled release medium or mixed with lipids. As used herein with respect to active agent preparations or formulations, the term “controlled release” means that the preparation or formulation releases at least 1 hour, eg, to release most of the active agent into the surrounding medium. Meaning about 1 to 24 hours or even longer.

電気的移入に適する好ましい放出制御媒体はコロイド分散系であり、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および水中油乳剤、ミセル、混合ミセル、リポソーム等を含む脂質系システムが含まれる。例えば一態様において、マイクロインジェクションのために活性剤を含めるために用いられる放出制御媒体は、生分解性マイクロスフェアである。薬学的に活性な薬剤がコアセルベートの被覆により封入されるマイクロスフェアは、「マイクロカプセル」と呼ばれる。   A preferred controlled release medium suitable for electrotransfer is a colloidal dispersion, including polymer composites, nanocapsules, microcapsules, microspheres, beads, and lipid-based systems including oil-in-water emulsions, micelles, mixed micelles, liposomes, and the like. included. For example, in one embodiment, the controlled release medium used to include the active agent for microinjection is a biodegradable microsphere. Microspheres in which a pharmaceutically active agent is encapsulated by a coacervate coating are called “microcapsules”.

通常、陽イオン電荷をもち得るリポソームは、インビトロおよびインビボの送達媒体として有用な人工膜小胞である。サイズが約0.2μmから4.0μmに及ぶ大きな単層小胞（LUV）は、DNAなどの巨大な高分子を含む水性緩衝液の実質的な割合を封入できることが示されている。   In general, liposomes that can have a cationic charge are artificial membrane vesicles useful as delivery vehicles in vitro and in vivo. Large unilamellar vesicles (LUVs) ranging in size from about 0.2 μm to 4.0 μm have been shown to be able to encapsulate a substantial proportion of aqueous buffers containing large macromolecules such as DNA.

リポソームの組成は通常、ステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、通常リン脂質、特に高相転移温度のリン脂質の組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質も使用され得る。リポソームの物理的特性は、pH、イオン強度、および二価陽イオンの存在に依存し、本発明の方法の電気的移入に供される活性剤を封入するための適切な小胞になる。   The composition of the liposome is usually a combination of normal phospholipids, particularly high phase transition temperature phospholipids, in combination with steroids, especially cholesterol. Other phospholipids or other lipids can also be used. The physical properties of the liposomes depend on pH, ionic strength, and the presence of divalent cations, resulting in suitable vesicles for encapsulating active agents that are subject to electrotransfer in the method of the invention.

リポソーム産生に役立つ脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジル化合物、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシドなどが挙げられる。脂質部分が14〜18の炭素原子、特に16〜18の炭素原子を含み、且つ飽和しているジアシルホスファチジルグリセロールが特に有用である。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイル-ホス-ファチジルコリンが挙げられる。   Examples of lipids useful for liposome production include phosphatidyl compounds such as phosphatidylglycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, sphingolipids, cerebrosides, gangliosides and the like. Particularly useful are diacylphosphatidylglycerols in which the lipid moiety contains 14-18 carbon atoms, especially 16-18 carbon atoms and is saturated. Exemplary phospholipids include egg phosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine and distearoyl-phos-fatidylcholine.

電気的移入に適する調製物は、薬剤を「薬学的に許容される担体」とともに含み得る。このような担体は当技術分野において公知であり、水性または非水性の滅菌溶液、懸濁液および乳濁液を含む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。水性担体としては、水、アルコール性/水性の溶液、乳濁液、または懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、不揮発性油などが挙げられる。細胞間または細胞内の注射に適する媒体としては、例えばリンガーデキストロースに基づくもの等の液体および栄養補給剤、電解質補給剤も挙げられる。保存剤および他の添加剤も存在し得る。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスを使用することもできる。   Preparations suitable for electromigration can include the drug together with a “pharmaceutically acceptable carrier”. Such carriers are known in the art and include aqueous or non-aqueous sterile solutions, suspensions and emulsions. Examples of non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate. Aqueous carriers include water, alcoholic / aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline and buffered media. Parenteral vehicles include sodium chloride solution, Ringer dextrose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer, non-volatile oil and the like. Suitable media for intercellular or intracellular injection also include liquid and nutrient replenishers, electrolyte replenishers, such as those based on Ringer's dextrose. Preservatives and other additives may also be present. For example, antibacterial agents, antioxidants, chelating agents, and inert gases can be used.

当業者には、薬剤が、真核細胞および原核細胞を含む任意の望ましい細胞または細胞型に導入され得ることが理解されるであろう。非限定的な例として、脂肪細胞、骨細胞、血管細胞、筋細胞、軟骨細胞、成体、胎児および胚の幹細胞、造血細胞、肺細胞、気道細胞、肝細胞、腸細胞、皮膚細胞、神経細胞、および細菌細胞が挙げられる。本方法は、腺癌、扁平上皮癌、胸、膀胱、結腸、頭、頸、前立腺などを含む器官の癌腫を含む癌腫などの癌；軟骨肉腫、メラノ肉腫（melanosarcoma）などを含む肉腫；および急性リンパ腫白血病（acute lymphomatic leukemia）、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫などを含む白血病およびリンパ腫を含む、癌細胞に薬剤を導入するためにも用いられ得る。本方法は、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、宿主防御の遺伝病、炭水化物代謝の遺伝障害、および脂質代謝の遺伝障害を治療するために、細胞内に薬剤を導入するためにも用いられ得る。   One skilled in the art will appreciate that the agent can be introduced into any desired cell or cell type, including eukaryotic and prokaryotic cells. Non-limiting examples include adipocytes, bone cells, vascular cells, muscle cells, chondrocytes, adults, fetal and embryonic stem cells, hematopoietic cells, lung cells, airway cells, hepatocytes, intestinal cells, skin cells, nerve cells And bacterial cells. The method includes cancers such as carcinomas including carcinomas of organs including adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, breast, bladder, colon, head, neck, prostate, etc .; sarcomas including chondrosarcoma, melanosarcoma, etc .; and acute Can also be used to introduce drugs to cancer cells, including leukemia and lymphoma including acute lymphomatic leukemia, acute myeloid leukemia, non-Hodgkin lymphoma, Burkitt lymphoma, B cell lymphoma, T cell lymphoma, etc. . The method can also be used to introduce drugs into cells to treat autoimmune diseases, cystic fibrosis, genetic disorders of host defense, genetic disorders of carbohydrate metabolism, and genetic disorders of lipid metabolism. .

一つの態様において、本発明は、nsPEFを用いて細胞の遺伝子発現を増強する方法を対象とする。本明細書で用いられる「遺伝子発現」は、遺伝子にコードされる情報が、タンパク質、ペプチド、またはRNAの何らかの形態に変換される過程として定義される。本発明の一形態において、細胞は、細胞内に導入されるポリヌクレオチドの存在下に置かれる。ポリヌクレオチドは、プラスミドDNAなど、細胞内への導入に適する形態にある。細胞およびポリヌクレオチドは、ミリ秒範囲の比較的長いパルスに暴露される。これらの長いパルスは細胞の外膜の開口を惹起することにより、細胞質内へのポリヌクレオチドの移行を促進する。次いで、細胞はnsPEFパルスに暴露され、核内へのポリヌクレオチドの移行が促進される。長パルスでは、場の振幅は低く、何百/数千のV/cmのオーダーである。本発明に従って、これらの長パルスは、0.001ミリ秒から30ミリ秒、好ましくは0.1ミリ秒から20ミリ秒の持続時間の範囲であり得る。長パルスの場の振幅は、0.1 kV/cmから5 kV/cm、好ましくは0.1 kV/cmから1 kV/cmの範囲であり得る。長パルスの適用中、遊離のポリヌクレオチドは原形質膜に可逆的に結合し、電気透過化された膜への可逆的な挿入を開始する。ポリヌクレオチドは、パルス中のみでなく、その後のかなりの時間でも細胞に移行する（Karl H. Schoenbach, Sunao Katsuki, Robert H. Stark, Stephen Beebe, and Stephen Buescher, 「Bioelectrics - New Applications for Pulsed Power Technology」 IEEE Trans. Plasma Science 30, 293 (2002)）。本発明に従って、nsPEFパルスは、1ナノ秒から1000ナノ秒、好ましくは1ナノ秒から300ナノ秒の持続時間の範囲であり得る。nsPEFパルスの場の振幅は、1 kV/cmから1000 kV/cm、好ましくは10 kV/cmから350 kV/cmの範囲であり得る。nsPEFパルスの適用は遺伝子発現の増強をもたらす。   In one embodiment, the present invention is directed to a method of enhancing cellular gene expression using nsPEF. “Gene expression” as used herein is defined as the process by which information encoded by a gene is converted into some form of protein, peptide, or RNA. In one form of the invention, the cell is placed in the presence of a polynucleotide that is introduced into the cell. The polynucleotide is in a form suitable for introduction into a cell, such as plasmid DNA. Cells and polynucleotides are exposed to relatively long pulses in the millisecond range. These long pulses promote the translocation of the polynucleotide into the cytoplasm by causing an opening in the outer membrane of the cell. The cells are then exposed to nsPEF pulses, facilitating the transfer of the polynucleotide into the nucleus. For long pulses, the field amplitude is low, on the order of hundreds / thousands of V / cm. In accordance with the present invention, these long pulses can range in duration from 0.001 milliseconds to 30 milliseconds, preferably from 0.1 milliseconds to 20 milliseconds. The long pulse field amplitude may range from 0.1 kV / cm to 5 kV / cm, preferably from 0.1 kV / cm to 1 kV / cm. During the application of a long pulse, the free polynucleotide binds reversibly to the plasma membrane and initiates reversible insertion into the electropermeabilized membrane. Polynucleotides migrate to cells not only during the pulse, but also for a significant amount of time thereafter (Karl H. Schoenbach, Sunao Katsuki, Robert H. Stark, Stephen Beebe, and Stephen Buescher, “Bioelectrics-New Applications for Pulsed Power Technology "IEEE Trans. Plasma Science 30, 293 (2002)). In accordance with the present invention, nsPEF pulses can range in duration from 1 nanosecond to 1000 nanoseconds, preferably from 1 nanosecond to 300 nanoseconds. The field amplitude of the nsPEF pulse can range from 1 kV / cm to 1000 kV / cm, preferably from 10 kV / cm to 350 kV / cm. Application of nsPEF pulses results in enhanced gene expression.

遺伝子発現が起きるためには、遺伝子が核に侵入することが必要である。長パルスでは、この過程は核膜を通過した拡散により決定されるようである。従って、核膜の孔サイズの増加はいずれも、核内への遺伝子の移行速度の増加をもたらす。これらのパルスが原形質膜の電気透過化後に適用され、遺伝子が核内へ拡散するのに十分な時間が与えられると、nsPEFパルスは核膜を開口することにより核内への遺伝子の流動を増強できる。または、nsPEFが、増強した転写効率および/もしくは増強したRNA転写などの他の不明確な機構、ならびに/またはカルシウム動員に関するもしくは関しない機構による増強したタンパク質の翻訳を通して遺伝子の発現を促進することが可能である。機構にかかわらず、外原形質膜を開口するために電気透過化を用い、続いてnsPEFを用いた初期研究は、HL-60細胞において緑色蛍光タンパク質（「GFP」）レポーター遺伝子の発現の増加をもたらした。これらの実験の方法および結果を以下に述べる。   In order for gene expression to occur, it is necessary for the gene to enter the nucleus. For long pulses, this process appears to be determined by diffusion through the nuclear membrane. Thus, any increase in the pore size of the nuclear membrane results in an increased rate of gene transfer into the nucleus. When these pulses are applied after electropermeabilization of the plasma membrane and given enough time for the gene to diffuse into the nucleus, the nsPEF pulse opens the nuclear membrane to open the flow of the gene into the nucleus. Can be strengthened. Alternatively, nsPEF may promote gene expression through other unclear mechanisms such as enhanced transcription efficiency and / or enhanced RNA transcription and / or enhanced protein translation by mechanisms related to or not related to calcium mobilization Is possible. Regardless of the mechanism, initial studies using electropermeabilization to open the outer plasma membrane, followed by nsPEF, showed increased expression of the green fluorescent protein (“GFP”) reporter gene in HL-60 cells. Brought. The methods and results of these experiments are described below.

他の態様において、nsPEFパルスが遺伝子発現を増強するために単独で用いられ得る。nsPEFは、転写効率の増強、および/またはRNA転写の増強、および/またはタンパク質翻訳の増強をもたらし得るため、細胞の遺伝子発現を増強するためにnsPEFのみを細胞に適用し得る。本発明により増強される単数または複数の遺伝子は細胞自身のものであってもよく、必ずしも細胞にトランスフェクトされる必要はない。他の態様において、nsPEFパルスは、脂質移入、リン酸カルシウムまたはデキストランとのDNA沈殿、およびウイルスベクターを含む、上述の一般に知られる任意の方法を用いてDNAで既にトランスフェクトされた細胞における遺伝子発現を増強するために用いられ得る。トランスフェクション後、nsPEFパルスは細胞の核内へのDNAの輸送をさらに促進する。または、nsPEFは転写および/または翻訳の機構を活性化することにより遺伝子発現を増強し得る。   In other embodiments, nsPEF pulses can be used alone to enhance gene expression. Since nsPEF can result in enhanced transcription efficiency and / or enhanced RNA transcription, and / or enhanced protein translation, only nsPEF can be applied to cells to enhance cellular gene expression. The gene or genes enhanced by the present invention may be the cell itself and need not necessarily be transfected into the cell. In other embodiments, nsPEF pulses enhance gene expression in cells already transfected with DNA using any of the generally known methods described above, including lipid transfer, DNA precipitation with calcium phosphate or dextran, and viral vectors. Can be used to After transfection, nsPEF pulses further facilitate the transport of DNA into the cell nucleus. Alternatively, nsPEF can enhance gene expression by activating transcriptional and / or translational mechanisms.

nsPEFパルス発生器
高周波細胞内効果の適用は、表面膜の帯電時間に匹敵するまたは更に低い時間尺度で大きな細胞内電場を生成するという問題により制限されていた。細胞内膜の電気穿孔（細胞内電気操作、「IEM」）が1 Vのオーダーでこのような膜をわたる電位差を要すると仮定する場合、1μmの特有な寸法を有する細胞内構造の穿孔にkV/cmのオーダーの電場が必要であろう。生体電気実験で用いられてきた単極パルス発生器の大半はマイクロ秒からミリ秒の持続時間のパルスを生じ、立ち上がり時間が非常に遅いため、測定可能な細胞内効果を生成できない。しかしながら、米国特許第6,326,177号に記載されているように、本発明者らは、細胞の懸濁液または組織内でMV/cm近い電場を生成するのに適した電圧振幅を有するナノ秒範囲の電気パルスを発生できる高電圧短持続時間の電気パルスを生成するための技術を開発した（Mankowski, J., Kristiansen, M. A review of Short Pulse Generator Technology. IEEE Trans Plasma Science 28:102-108, 2000）。ナノ秒持続時間のため、これらのパルスにより細胞/組織に転移する平均エネルギーは理論的に無視できる程度であり、熱的効果を伴わずに電気効果をもたらす。 nsPEF pulse generator The application of high-frequency intracellular effects has been limited by the problem of generating a large intracellular electric field on a time scale comparable to or even lower than the charging time of the surface membrane. Assuming that electroporation of intracellular membranes (intracellular electromanipulation, “IEM”) requires a potential difference across such membranes on the order of 1 V, kV for perforating intracellular structures with a characteristic dimension of 1 μm An electric field on the order of / cm would be required. Most unipolar pulse generators that have been used in bioelectric experiments produce pulses with durations from microseconds to milliseconds and the rise time is so slow that they cannot produce measurable intracellular effects. However, as described in U.S. Pat.No. 6,326,177, we have a nanosecond range with a voltage amplitude suitable for generating an electric field close to MV / cm in a cell suspension or tissue. Developed a technique for generating high voltage short duration electrical pulses that can generate electrical pulses (Mankowski, J., Kristiansen, M. A review of Short Pulse Generator Technology. IEEE Trans Plasma Science 28: 102-108, 2000). Due to the nanosecond duration, the average energy transferred to cells / tissue by these pulses is theoretically negligible, resulting in an electrical effect without a thermal effect.

さらに、上述した遺伝子送達の好ましい態様は、古典的な電気穿孔パルス（原形質膜を開口するため）およびnsPEFパルス（核を開口するため）の両方を提供できるパルス発生器を利用する。従って、一つの態様において本発明は、同じ装置で連続して二つの異なるパルス型を伝送できるパルス発生器を対象とする。このパルス発生器はまた、パルスの持続時間、電場、パルス間の間隔、およびパルスのオーダーを変更でき得る。一つのパルス型は、マイクロ秒またはミリ秒の範囲（1マイクロ秒から20ミリ秒）で古典的な電気穿孔パルスの範囲の持続時間を有する。このようなパルス型は本明細書において長パルスとして定義される。第二の型のパルスはナノ秒範囲（1から300ナノ秒）で、本明細書において短パルスとして定義される持続時間を有する。各セットにおける長パルスと短パルスの時間は0.1秒から数分または数時間で変動し得る。長パルスまたは短パルスのいずれかは他方に先行し得る。セット中の長パルスおよび/または短パルスの電場強度（kV/cm）は変動し得る。   Furthermore, the preferred embodiment of gene delivery described above utilizes a pulse generator that can provide both classic electroporation pulses (to open the plasma membrane) and nsPEF pulses (to open the nucleus). Accordingly, in one aspect, the present invention is directed to a pulse generator that can transmit two different pulse types in succession on the same device. The pulse generator can also change the duration of the pulse, the electric field, the interval between pulses, and the order of the pulses. One pulse type has a duration in the range of classic electroporation pulses in the microsecond or millisecond range (1 microsecond to 20 milliseconds). Such a pulse type is defined herein as a long pulse. The second type of pulse is in the nanosecond range (1 to 300 nanoseconds) and has a duration defined herein as a short pulse. The duration of long and short pulses in each set can vary from 0.1 seconds to minutes or hours. Either a long pulse or a short pulse can precede the other. The electric field strength (kV / cm) of long pulses and / or short pulses in the set can vary.

従って本発明の装置は、一つの装置でこれらの大きさの異なる二つのパルスを伝送できる。パルス間の最適時間は、外膜から核への薬剤の拡散により決定され、ms範囲またはより長いことが予期される。拡散時間の決定は当業者の能力内にある。二元パルス発生器は、種々の細胞または組織への薬剤の移行システムを最適化するため、振幅および持続時間、ならびにパルス伝送間の時間差が異なり得るパルスを伝送し得る。伝送は、例えば組織治療用のキュベット（懸濁細胞用）または二つ以上の金属電極であり得る。他の伝送方法、例えばパルスのインビボ伝送も、本発明により想定される。伝送の他の代替方法は、電極もしくはキュベットの代わりにまたはそれらに加えて、パルスを伝送するために一つまたは複数のアンテナを使用することである。一つまたは複数のアンテナは、パルスを伝送するために独立してまたは電極もしくはキュベットと併せて使用され得る。アンテナは例えば、望ましい持続時間の単一パルス、例えば超短波パルスを創出するために複数の非対称単極パルスを重ね合わせて用いられる広帯域アンテナであり得る。   Therefore, the apparatus of the present invention can transmit two pulses having different sizes with one apparatus. The optimal time between pulses is determined by the diffusion of the drug from the outer membrane to the nucleus and is expected to be in the ms range or longer. Determination of the diffusion time is within the abilities of those skilled in the art. Dual pulse generators can transmit pulses that can vary in amplitude and duration, as well as the time difference between pulse transmissions, to optimize the system of drug transfer to various cells or tissues. The transmission can be, for example, a tissue treatment cuvette (for suspension cells) or two or more metal electrodes. Other transmission methods are also envisaged by the present invention, for example in vivo transmission of pulses. Another alternative method of transmission is to use one or more antennas to transmit pulses instead of or in addition to electrodes or cuvettes. One or more antennas can be used independently or in conjunction with electrodes or cuvettes to transmit pulses. The antenna can be, for example, a broadband antenna that is used in a superposition of a plurality of asymmetric monopolar pulses to create a single pulse of a desired duration, eg, an ultrashort pulse.

図7は、本発明の一つまたは複数の態様に従うパルス発生器100の配置を図解する回路図である。図7のパルス発生器100は、同一装置内で連続して一連の複数のパルス型を伝送するよう設計されている。本発明の一つまたは複数の態様に従って、パルス発生器100は二つの異なるパルス型を伝送するよう構成され得る。従って、このような態様のパルス発生器100は二元パルス発生器100とみなされ得る。本発明の他の態様により、パルス発生器100は必要であれば、二つより多くのパルス型を伝送し得る。パルス発生器100は、以下でより詳細に論じられるように、マイクロ秒またはミリ秒の範囲の持続時間を有し且つ低電圧を有する第一パルス型を伝送する。これは長パルスとみなされる。例えば、第一パルス型は1マイクロ秒から20ミリ秒に及ぶ持続時間を有し得る。この範囲は特定の適用に応じて30パーセント（30％）まで任意に増減し得る。第一パルス型は一般に、古典的な電気穿孔パルスと同じ範囲にある。第二パルス型は短パルスとみなされ、第一パルス型より短い持続時間を有する。第二パルスはまた、第一パルスよりも高い電圧を有する。例えば、第一パルスは0.1 kVから4 kVの範囲の低い電圧値を有し得る一方、第二パルスは10 kVから40 kVの範囲の高い電圧値を有し得るが、本発明の一つまたは複数の態様は50 kVまでの範囲に及ぶ値を有し得る。例えば、第二パルス型はナノ秒範囲（例えば、1ナノ秒から1000ナノ秒）の持続時間を有し得る。任意で、第二パルス型の長さ（またはパルス）も、例えば30パーセント（30％）まで増減し得る。一時停止（すなわち、パルス型間の時間）が長パルスおよび短パルスを分離するために与えられる。本発明の一つまたは複数の態様に従って、各セットのパルス間の一時停止は0.1秒から数分または数時間で変動し得る。長パルスまたは短パルスのいずれかは他方に先行できる。更に、任意の数の長パルスまたは短パルスのいずれかが適用できる。その上、セット中の長パルスおよび/または短パルスの電場強度（kV/cm）は、種々の適用の必要に応じて変動し得る。   FIG. 7 is a circuit diagram illustrating the arrangement of the pulse generator 100 according to one or more aspects of the present invention. The pulse generator 100 of FIG. 7 is designed to transmit a series of multiple pulse types in succession within the same device. In accordance with one or more aspects of the present invention, the pulse generator 100 can be configured to transmit two different pulse types. Therefore, the pulse generator 100 having such a configuration can be regarded as a binary pulse generator 100. In accordance with other aspects of the present invention, the pulse generator 100 can transmit more than two pulse types if desired. The pulse generator 100 transmits a first pulse type having a duration in the microsecond or millisecond range and having a low voltage, as will be discussed in more detail below. This is considered a long pulse. For example, the first pulse type may have a duration ranging from 1 microsecond to 20 milliseconds. This range can be arbitrarily increased or decreased to 30 percent (30%) depending on the particular application. The first pulse type is generally in the same range as the classic electroporation pulse. The second pulse type is considered a short pulse and has a shorter duration than the first pulse type. The second pulse also has a higher voltage than the first pulse. For example, the first pulse may have a low voltage value in the range of 0.1 kV to 4 kV, while the second pulse may have a high voltage value in the range of 10 kV to 40 kV. The embodiments can have values ranging up to 50 kV. For example, the second pulse type may have a duration in the nanosecond range (eg, 1 nanosecond to 1000 nanoseconds). Optionally, the length (or pulse) of the second pulse type can be increased or decreased, for example, up to 30 percent (30%). A pause (ie, time between pulse types) is provided to separate the long and short pulses. In accordance with one or more aspects of the present invention, the pause between each set of pulses may vary from 0.1 seconds to minutes or hours. Either a long pulse or a short pulse can precede the other. Furthermore, any number of long pulses or short pulses can be applied. Moreover, the electric field strength (kV / cm) of the long and / or short pulses in the set can vary depending on the needs of various applications.

本発明の少なくとも一つの態様に従うと、パルス間の時間は、外膜から核への薬剤の拡散により決定され得る。通常、この時間間隔はミリ秒範囲またはより長いことが予期されるが、拡散の物理的測定が一時停止の長さを決定する際により良い指針を与えるだろう。二元パルス発生器100は変わり得る振幅および持続時間を有するパルスを伝送し得る。パルスの伝送間の時間差も、異なる細胞または組織への遺伝子移入用システムを構成するために変動し得る。パルスは、例えば懸濁細胞用のキュベット、組織処置用の二つ以上の金属電極などを含む種々の方法で伝送され得る。他の伝送方法、例えばパルスのインビボ伝送等も、本発明に想定され得る。伝送の他の代替方法は、電極もしくはキュベットの代わりにまたはそれに加えて、パルスを伝送するために一つまたは複数のアンテナ（示していない）を使用することである。アンテナはパルスを伝送するために独立して、または電極もしくはキュベットと併せて使用され得る。本発明の一つまたは複数の態様に従って、アンテナは例えば、望ましい持続時間の単一パルスを創出するために複数の非対称単極パルスを重ね合わせて用いられる広帯域アンテナであり得る。この種類のアンテナ配置は短パルスを伝送するために用いられ得る。   According to at least one embodiment of the present invention, the time between pulses can be determined by diffusion of the drug from the outer membrane to the nucleus. Normally, this time interval is expected to be in the millisecond range or longer, but physical measurements of diffusion will give better guidance in determining the length of the pause. The dual pulse generator 100 can transmit pulses with variable amplitude and duration. The time difference between the transmission of the pulses can also vary to construct a system for gene transfer into different cells or tissues. The pulses can be transmitted in a variety of ways including, for example, a cuvette for suspension cells, two or more metal electrodes for tissue treatment, and the like. Other transmission methods, such as in vivo transmission of pulses, can also be envisaged by the present invention. Another alternative method of transmission is to use one or more antennas (not shown) to transmit pulses instead of or in addition to electrodes or cuvettes. The antenna can be used independently to transmit pulses or in conjunction with electrodes or cuvettes. In accordance with one or more aspects of the present invention, the antenna can be, for example, a wideband antenna that is used in a superposition of a plurality of asymmetric monopolar pulses to create a single pulse of a desired duration. This type of antenna arrangement can be used to transmit short pulses.

図7に言及すると、長パルスは、図の左上部に示された、全体に渡って110という数字で示される第一低電圧回路で生成される。例えば1 mFのオーダーの静電容量を有するコンデンサ112は、高圧電源116（HV）を用いて充電レジスタ114により充電される。図7は1 mFの静電容量を示すが、本発明の他の態様は、.1 mFから10 mFまでの範囲に及ぶ静電容量を有するコンデンサを利用できる。様々な他の静電容量の定格（rating）が、特定の適用に応じてコンデンサ112に用いられ得る。レジスタ114は、コンデンサの選択に応じて、例えば10 kOhmから10 MOhmの抵抗を有し得る。好ましくはレジスタ114は、1 MOhmから300 kOhmに定格化される。コンデンサ112は続いて、その抵抗（RL）により図示されるロード118に放電される。ロード118は、例えば懸濁細胞を充填したキュベット、電極間の組織、またはパルスのインビトロ伝送を可能にする装置であり得る。ロード抵抗RLは全般的に、Z=10 Ohmのオーダーであると考えられ、5 Ohmから100 Ohmの範囲であり得る。これはこのような市販のキュベットの増殖培地または緩衝液における細胞の典型的な値を表す。しかしながら、ロード抵抗は、処理される生体試料がどのように提示されるかによって、またロードを伝送するために用いられる装置によって変動し得る。 Referring to FIG. 7, the long pulse is generated by a first low voltage circuit, indicated generally by the numeral 110, shown at the top left of the figure. For example, the capacitor 112 having a capacitance of the order of 1 mF is charged by the charging register 114 using the high voltage power source 116 (HV). Although FIG. 7 shows a capacitance of 1 mF, other embodiments of the present invention can utilize capacitors having capacitances ranging from .1 mF to 10 mF. Various other capacitance ratings can be used for the capacitor 112 depending on the particular application. Resistor 114 may have a resistance of, for example, 10 kOhm to 10 MOhm, depending on the capacitor selection. Preferably, resistor 114 is rated from 1 MOhm to 300 kOhm. The capacitor 112 is subsequently discharged to the load 118 illustrated by its resistance (R L ). The load 118 can be, for example, a cuvette filled with suspended cells, tissue between electrodes, or a device that allows in vitro transmission of pulses. The load resistance R L is generally considered to be on the order of Z = 10 Ohm and can range from 5 Ohm to 100 Ohm. This represents the typical value of cells in the growth medium or buffer of such commercial cuvettes. However, the load resistance can vary depending on how the biological sample to be processed is presented and the equipment used to transmit the load.

放電は、例えば絶縁ゲート・バイポーラ・トランジスタ（「IGBT」）などのトランジスタ120、または低順電圧定格を有する同様な構成要素により制御できる。このようなトランジスタ120は一般に、熱損傷なしに比較的長い時間電流を許容できる。コンデンサ112から放電される電圧および電流をトランジスタ120が操作できる限り、他の型のトランジスタ120（例えば、MOSFET）も使用できる。このようなトランジスタ120の立ち上がり時間および下降時間は、50 nsから100 nsの範囲であり得る。図に示す特定のトランジスタ120モジュールのホールドオフ電圧は、V=1.7 kVである。1 cmの電極間隙を有するキュベットでは、E=1.7 kV/cmの電場を生成することが可能である。間隙距離dが減少する場合、電場は高くなり得る（E=V/d）。スイッチとして作用するトランジスタ120の開閉は、制御システム122（または制御回路）により中央制御される。制御回路は、例えば、遅延発生器、マイクロコントローラ、マイクロプロセッサ、コンピュータ制御回路などであり得る。   The discharge can be controlled by a transistor 120, such as an insulated gate bipolar transistor ("IGBT"), or similar components having a low forward voltage rating. Such a transistor 120 can generally tolerate a relatively long time without thermal damage. Other types of transistors 120 (eg, MOSFETs) can be used as long as the transistor 120 can handle the voltage and current discharged from the capacitor 112. The rise time and fall time of such a transistor 120 can range from 50 ns to 100 ns. The hold-off voltage of the specific transistor 120 module shown in the figure is V = 1.7 kV. A cuvette with an electrode gap of 1 cm can generate an electric field of E = 1.7 kV / cm. If the gap distance d decreases, the electric field can be high (E = V / d). The opening and closing of the transistor 120 acting as a switch is centrally controlled by a control system 122 (or control circuit). The control circuit can be, for example, a delay generator, a microcontroller, a microprocessor, a computer control circuit, and the like.

第二パルス型は、図の左下部に示された、全体に渡って124という数字で示される第二高電圧回路で生成される。第二回路124は、例えば、図7に示されるようなブルムレイン（Blumlein）機器構成で設計され得る。二つの伝送線126または二つの平行平板は、コンデンサと同様のエネルギー貯蔵庫として用いられ得る。伝送線126は、dc電源130（HV）により、例えば50 kVの高電圧に充電レジスタ128を通じて充電される。レジスタ128は、例えば10 MOhmから400 MOhmの抵抗を有し得る。本発明の一つまたは複数の態様に従って、伝送線126の長さは短パルスの持続時間を決定する。持続時間は、伝送線126の長さを伝送線126の誘電体中の光速で割ったものとして算出できる。伝送線126のインピーダンスは、例えばロード抵抗の半分であり得る。例えば10 Ohmのロードの場合、インピーダンスは5 Ohmである。ブルムレイン機器構成の二重線（dual-line）構造は、ロードへのフル充電の伝送を可能にする。例えば、一本のケーブルのみが伝送線126として使用される場合、電源から得る電圧の半分のみが適用される。従って、ロード抵抗を超えて50 kVを伝送するために、伝送線126は100 kVまで充電されることが必要であり、技術的に困難であり得る。二重線伝送線126の使用は、ロードへの最大の充電伝送を可能にする。他のどの二重線型伝送線126もブルムレイン機器構成の代わりに使用され得る。   The second pulse type is generated by a second high voltage circuit indicated by the numeral 124 throughout, shown in the lower left part of the figure. The second circuit 124 may be designed, for example, with a Blumlein device configuration as shown in FIG. Two transmission lines 126 or two parallel plates can be used as an energy storage similar to a capacitor. The transmission line 126 is charged through a charging register 128 to a high voltage of, for example, 50 kV by a dc power supply 130 (HV). Resistor 128 may have a resistance of 10 MOhm to 400 MOhm, for example. In accordance with one or more aspects of the present invention, the length of transmission line 126 determines the duration of the short pulse. The duration can be calculated as the length of the transmission line 126 divided by the speed of light in the dielectric of the transmission line 126. The impedance of the transmission line 126 can be, for example, half of the load resistance. For example, for a 10 Ohm load, the impedance is 5 Ohm. The dual-line structure of the Blumrain equipment configuration allows transmission of a full charge to the load. For example, when only one cable is used as the transmission line 126, only half of the voltage obtained from the power supply is applied. Therefore, in order to transmit 50 kV over the load resistance, the transmission line 126 needs to be charged to 100 kV, which can be technically difficult. The use of a dual line transmission line 126 allows for maximum charge transmission to the load. Any other dual-line transmission line 126 can be used in place of the Blumrain equipment configuration.

第二回路124は、例えばスパークギャップ：約1ナノ秒で閉鎖するよう設計された高速閉鎖スイッチであり得る閉鎖スイッチ132を含み、I=V/Zの高電流を送電できる。例えば、50 kVの電圧および10 Ohmのロード抵抗では、電流は5000 Aである。閉鎖スイッチ132は、第一回路110と同じロード118に短い高電圧パルスを伝送する。先に論じたように、このようなロード118は、例えばキュベット、組織などであり得る。閉鎖スイッチ132はトリガーユニット134により制御され、次にこのユニットが制御回路122により制御される。先に論じたように、制御回路122は、例えば遅延発生器、マイクロコントローラ、マイクロプロセッサ、コンピュータ制御回路などであり得る。また、高電圧のパルスに耐えられる任意のスイッチを、閉鎖スイッチ132の代わりに使用できる。   The second circuit 124 includes a closure switch 132, which can be, for example, a fast gap switch designed to close in a spark gap: about 1 nanosecond, and can transmit a high current of I = V / Z. For example, for a voltage of 50 kV and a load resistance of 10 Ohm, the current is 5000 A. The closure switch 132 transmits a short high voltage pulse to the same load 118 as the first circuit 110. As discussed above, such a load 118 can be, for example, a cuvette, tissue, or the like. The closure switch 132 is controlled by the trigger unit 134, which is then controlled by the control circuit 122. As discussed above, the control circuit 122 can be, for example, a delay generator, a microcontroller, a microprocessor, a computer control circuit, and the like. Also, any switch that can withstand high voltage pulses can be used in place of the closure switch 132.

高電圧パルスが第一回路のトランジスタを損傷および/または破損するのを防ぐために、本発明の少なくとも一つの態様は、長パルスが適用された際の二つの回路（110、124）の分離を提供する。これは、1〜50ミリ秒の範囲の時間内で開口でき、約50 kVを維持できる磁気スイッチ136を用いて為され得る。この開口時間は、長パルスと短パルスの間の最短時間である。トリガーユニット138は磁気スイッチ136を作動するために提供される。トリガーユニット138は、例えば制御回路122により制御できる。本発明の一つまたは複数の態様に従って、高電圧を確実に維持できる任意のスイッチが磁気スイッチの代わりに使用できる（例えば、真空スイッチ）。さらに、パルスの高電圧に耐えられる任意の電気スイッチが機械型スイッチの代わりに使用できる。   In order to prevent high voltage pulses from damaging and / or damaging the transistors of the first circuit, at least one aspect of the present invention provides separation of the two circuits (110, 124) when a long pulse is applied To do. This can be done with a magnetic switch 136 that can open within a time in the range of 1-50 milliseconds and maintain about 50 kV. This opening time is the shortest time between the long pulse and the short pulse. A trigger unit 138 is provided for actuating the magnetic switch 136. The trigger unit 138 can be controlled by the control circuit 122, for example. In accordance with one or more aspects of the present invention, any switch that can reliably maintain a high voltage can be used in place of a magnetic switch (eg, a vacuum switch). In addition, any electrical switch that can withstand the high voltage of the pulse can be used in place of the mechanical switch.

図7で図解されるシステムは、可変の持続時間および振幅を有する二つのパルスの生成を可能にする。長パルスと短パルスの間の時間も変動し得る。それぞれの種類のパルスを一つ提供する代わりに、本発明のパルス発生器はまた、複数のパルス、例えば長パルスと短パルスを両方とも提供できる。本発明の少なくとも一つの態様に従って、パルスは、制御回路122により受信されるプログラミング指示に基づいて制御され得る。本発明の他の態様は、パルス伝送を制御する異なる方法を提供できる。   The system illustrated in FIG. 7 allows the generation of two pulses with variable duration and amplitude. The time between long and short pulses can also vary. Instead of providing one of each type of pulse, the pulse generator of the present invention can also provide multiple pulses, eg, both long and short pulses. In accordance with at least one aspect of the present invention, the pulses may be controlled based on programming instructions received by control circuit 122. Other aspects of the invention can provide different methods of controlling pulse transmission.

パルス発生器100は、図7に示される制御回路122からの一連の指示により制御され得る。コンデンサ112は、最初にその静電容量定格により決定される電圧まで充電できる。この電圧は高圧電源116を通して1.7 kVまで変動し得る。時点t1で、トランジスタ120は閉鎖するよう作動される。この時間中、コンデンサ112は放電される。磁気スイッチ136も閉鎖される場合、電流はロード118（RL）を通じて流れる。長パルスはコンデンサ112の値に応じて指数関数的に下降するか、または方形波であり得る。例えば、方形波はより高い静電容量値に使用され得る。 The pulse generator 100 can be controlled by a series of instructions from the control circuit 122 shown in FIG. Capacitor 112 can initially be charged to a voltage determined by its capacitance rating. This voltage can vary up to 1.7 kV through the high voltage power supply 116. At t 1, the transistor 120 is operated to close. During this time, the capacitor 112 is discharged. If the magnetic switch 136 is also closed, current flows through the load 118 (R L ). The long pulse may fall exponentially depending on the value of the capacitor 112 or may be a square wave. For example, square waves can be used for higher capacitance values.

時点t2で、長パルスは、コンデンサ112の放電を停止するようトランジスタ120を作動することにより終結される。従って、時間間隔（t2〜t1）は長パルスの持続時間を決定する。パルスの振幅は、充電回路、電源、コンデンサ、および充電レジスタを介するものを含む、種々の手段により制御され得る。時点t3で、磁気スイッチ136に連結されたトリガーユニット138が作動され、磁気スイッチ136を開口する。この作用は、第一回路110（低電圧）を第二回路124（高電圧）から分離する。時点t4で、トリガーユニット134が閉鎖（またはスパークギャップ）スイッチ132を作動する。閉鎖スイッチ132はブルムレイン伝送線126のロード118への放電を惹起する。なお、伝送線126は放電前に、電源130および充電レジスタ128により充電される。この過程は、上述の第一回路110のコンデンサ112の充電と同様である。閉鎖スイッチ132の超短波閉鎖時間はロード118への短い高電圧パルスの伝送を可能にする。 Once t 2, the long pulse is terminated by actuating the transistor 120 to stop the discharge of the capacitor 112. Accordingly, the time interval (t 2 ~t 1) determines the duration of the long pulse. The amplitude of the pulse can be controlled by various means, including through a charging circuit, a power source, a capacitor, and a charging resistor. At time t 3 , the trigger unit 138 connected to the magnetic switch 136 is activated and opens the magnetic switch 136. This action isolates the first circuit 110 (low voltage) from the second circuit 124 (high voltage). At time t 4 , the trigger unit 134 activates the close (or spark gap) switch 132. The closure switch 132 causes a discharge of the Blumrain transmission line 126 to the load 118. The transmission line 126 is charged by the power supply 130 and the charging register 128 before discharging. This process is the same as the charging of the capacitor 112 of the first circuit 110 described above. The ultra-short wave closure time of the closure switch 132 allows transmission of short high voltage pulses to the load 118.

パルス伝送のサイクルは所望の回数繰り返すことができる。更に、放電されるパルスの順序は、例えば短パルスが最初に伝送されるように変更することができる。パルス伝送のこの代替オーダーは、磁気スイッチ136が最初に開口位置にあることが必要なだけである。いずれにせよ、先に述べたように、本発明の種々の態様により、任意の数のパルスを本発明のパルス発生器を用いて任意の順序で伝送できる（すなわち、二短、一長；二長、一短；三短、一長；二長、二短など）。   The pulse transmission cycle can be repeated as many times as desired. Furthermore, the order of the discharged pulses can be changed, for example so that the short pulses are transmitted first. This alternative order of pulse transmission only requires that the magnetic switch 136 is initially in the open position. In any case, as noted above, according to various aspects of the present invention, any number of pulses can be transmitted in any order using the pulse generator of the present invention (ie, two short, one long; two Long, one short; three short, one long; two long, two short, etc.).

多くの適用の一つに従って、本発明の様々な態様が細胞内への薬剤の導入方法に適用され得る。本発明のパルス発生器100は、パルスセット内の長パルス型および短パルス型のいずれかまたは両方を用いて、十分に調節可能なパルス条件を提供するために用いられ得る。これらの条件の一部としては、例えば、順序（すなわち、最初または次に短パルス）、持続時間、電場強度、反復数、および/またはセット内のパルス型間の時間が挙げられる。本発明の一つまたは複数の態様では、古典的な電気穿孔因子に基づいて、パルス発生器100のトランスフェクション/発現効率を増強するために、これらの因子（または条件）の少なくとも幾つかを変更することが可能である。最適なトランスフェクション/発現効率の条件は、細胞型によって異なり、過度の実験をすることなく本発明の分野の当業者により容易に決定できる。   In accordance with one of many applications, various embodiments of the invention can be applied to a method of introducing a drug into a cell. The pulse generator 100 of the present invention can be used to provide fully adjustable pulse conditions using either or both of the long pulse type and the short pulse type in the pulse set. Some of these conditions include, for example, order (ie, first or next short pulse), duration, field strength, number of repetitions, and / or time between pulse types in a set. In one or more embodiments of the invention, based on classical electroporation factors, at least some of these factors (or conditions) are modified to enhance the transfection / expression efficiency of pulse generator 100 Is possible. Optimal transfection / expression efficiency conditions will vary from cell type to cell type and can be readily determined by one of ordinary skill in the art without undue experimentation.

前記の詳細な記載は、多数の具体的な詳細を含む。このような詳細は例示目的のために含まれているだけであり、本発明を限定すると理解されるべきではない。加えて、一つの態様の特性は、本発明の他の態様の特性と組み合わされ得る。特許請求の範囲で定義される本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更が為され得る。   The foregoing detailed description includes a number of specific details. Such details are included for illustrative purposes only and are not to be understood as limiting the invention. In addition, the characteristics of one embodiment can be combined with the characteristics of other embodiments of the present invention. Various changes may be made without departing from the scope of the invention as defined in the claims.

一例として、本発明のシステムは、汎用コンピュータ、特別にプログラムされた（特殊用途）コンピュータ、制御回路、制御器などを含み得る。利用者は、種々のシステム、例えばパソコンもしくはPDAを用いて、および/またはインターネット、イントラネット、広域ネットワーク（WAN）などのネットワークでデータ（date）を送信するための種々のプロトコルを遠隔で用いて、パルス発生器と交信し、発生器への入力を提供し得る。さらに、プロセシングは一つまたは複数のコンピュータシステムもしくはプロセッサでソフトウェアプログラムにより制御でき、またはハードウェアで部分的にまたは完全に実行され得る。   By way of example, the system of the present invention may include a general purpose computer, a specially programmed (special purpose) computer, a control circuit, a controller, and the like. Users can use various protocols, such as personal computers or PDAs, and / or remotely using various protocols for sending data (date) over networks such as the Internet, Intranet, Wide Area Network (WAN), It can communicate with the pulse generator and provide input to the generator. Further, the processing can be controlled by a software program on one or more computer systems or processors, or can be performed partially or fully in hardware.

ユーザーインターフェースはHTML表示形式で開発され得る。HTMLは例示目的に用いるが、情報を表示するため、取扱説明書を得るため、およびユーザーインターフェースを提供するために、代替技術（例えば、XML）を利用することが可能である。本発明とともに用いられるシステムは、適切におよび/または必要に応じて、ハードウェアおよびソフトウェアのサーバー、データベースエンジン、および/または他のコンテンツプロバイダーを含む種々の構成要素の統合に依存し得る。この機器構成は好ましくはネットワークに基づくものであり得、少なくとも1ユーザーとの主要インターフェースとしてインターネットを使用する。   The user interface can be developed in an HTML display format. Although HTML is used for example purposes, alternative technologies (eg, XML) can be used to display information, obtain instructions, and provide a user interface. The system used with the present invention may rely on the integration of various components including hardware and software servers, database engines, and / or other content providers as appropriate and / or required. This equipment configuration may preferably be network based and uses the Internet as the primary interface with at least one user.

本発明の一つまたは複数の態様に従うシステムは、一つまたは複数のデータベースに収集された情報および/または情報の索引を保存し得る。適切なデータベースは、標準サーバー、例えばsmall Sun（商標）Sparc（商標）または他の遠隔地で保持され得る。現在利用できる、もしくは将来開発される任意のコンピュータソフトウェア言語、および/またはハードウェア構成要素が、本発明の種々の態様で利用できる。例えば、上述した機能性の少なくとも幾つかは、用いられるプロセッサの観点から適切なVisual Basic、C、C++、C＃、または任意のアセンブリ言語を用いて実行され得る。これはJavaなどの解釈環境で書かれてもよく、様々なユーザーへ複数の送信先に送信され得る。   A system according to one or more aspects of the present invention may store information and / or an index of information collected in one or more databases. A suitable database may be maintained at a standard server, such as a small Sun ™ Sparc ™ or other remote location. Any computer software language and / or hardware component currently available or developed in the future can be used in various aspects of the invention. For example, at least some of the functionality described above can be implemented using Visual Basic, C, C ++, C #, or any assembly language appropriate from the perspective of the processor used. This may be written in an interpretation environment such as Java and can be sent to multiple destinations to various users.

本発明の多数の特性および利点は詳細な説明から明白であり、従って、添付の特許請求の範囲により、このような全ての本発明の特性および利点を網羅することを意図し、これは本発明の真意および範囲内である。さらに、当業者には多数の変更および変形が容易に思いつくため、図解および記載されたそのままの構成に本発明を限定することは望ましくなく、従って、全ての適切な変更および等価物が本発明の範囲に復され、収まり得る。   Numerous features and advantages of the present invention will be apparent from the detailed description, and therefore, it is intended by the appended claims to cover all such features and advantages of the invention. Is within the spirit and scope of Further, since numerous modifications and changes will readily occur to those skilled in the art, it is not desirable to limit the present invention to the exact construction as illustrated and described, and accordingly, all appropriate modifications and equivalents are contemplated by the present invention. Can be restored to range and fit.

ここで、細胞の遺伝子発現を増強する際のnsPEFの使用を説明する具体例に言及する。これら実施例は好ましい態様を説明するために提供され、それにより本発明の範囲の限定は意図されないことが理解されるべきである。   Reference is now made to a specific example illustrating the use of nsPEF in enhancing cellular gene expression. It should be understood that these examples are provided to illustrate preferred embodiments and are not intended to limit the scope of the invention.

実施例1
上記のように、細胞を電気透過化した後に、これら細胞をnsPEFへ暴露する実験を実施した。これらの実験は、HL-60細胞において緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーター遺伝子の発現の増強をもたらした。図1〜6は、HL-60細胞に及ぼす異なるパルスの影響を示す。 Example 1
As described above, experiments were performed in which the cells were exposed to nsPEF after electropermeabilization. These experiments resulted in enhanced expression of the green fluorescent protein (GFP) reporter gene in HL-60 cells. Figures 1-6 show the effect of different pulses on HL-60 cells.

材料および方法
HL-60細胞を増殖培地から取り出し、洗浄し、0.85 mM K2HPO4、0.3 mM K2HPO4(pH 7.2)、および10 mM KCl（22℃で伝導率1.5 mS/cm）を含む低伝導率緩衝液（LCB）に再懸濁した。浸透圧はイノシトールの添加により290 mOsmに調整した。細胞懸濁液（106細胞/ml）を、nsPEFパルス前に、BioRad gene Pulser（登録商標）キュベット（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）に充填した。nsPEFパルスを伝送するためにケーブルパルス発生器を使用した。nsPEFは、ケーブルパルス発生器により、0.1、0.2、または0.4 cm離れた平行平板電極を備えたキュベットに懸濁された細胞に伝送された。簡単に述べると、発生器は10Ωのパルス形成ネットワーク（並列接続で5つの50Ωケーブル）およびナノ秒閉鎖スイッチとしての大気中のスパークギャップからなる。パルス後、細胞懸濁液をパルスキュベットから取り出して検定した。 Materials and methods
HL-60 cells are removed from growth medium, washed, and low conductivity containing 0.85 mM K 2 HPO 4 , 0.3 mM K 2 HPO 4 (pH 7.2), and 10 mM KCl (conductivity at 22 ° C., 1.5 mS / cm) Resuspended in rate buffer (LCB). The osmotic pressure was adjusted to 290 mOsm by adding inositol. Cell suspension (10 6 cells / ml) was loaded into a BioRad gene Pulser® cuvette (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.) Prior to nsPEF pulse. A cable pulse generator was used to transmit nsPEF pulses. nsPEF was transmitted by a cable pulse generator to cells suspended in cuvettes with parallel plate electrodes separated by 0.1, 0.2, or 0.4 cm. Briefly, the generator consists of a 10Ω pulse-forming network (5 50Ω cables in parallel) and an atmospheric spark gap as a nanosecond closure switch. After pulsing, the cell suspension was removed from the pulse cuvette and assayed.

HL-60細胞は、5μgのpEGFP、すなわちサイトメガロウイルス（「CMV」）プロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドの存在下で、種々のパルスに暴露された。下記の種類のパルスを使用した：BioRad Gene Pulserにより投与される古典的な原形質膜電気穿孔（長）パルス、短nsPEFパルス、長パルスの30分後に短nsPEFパルスの組み合わせ、またはパルスなし。例えば、図1に示される実験において、HL-60細胞を、3.5 msec、0.3 kV/cmでの古典的な原形質膜電気穿孔（長）パルス、10 nsec、150 kV/cmでのnsPEFパルス、または長パルスの30分後にnsPEFを適用する両パルス型の組み合わせのいずれかに暴露した。次いで細胞を洗浄し、増殖培地に再懸濁してインキュベートした。24時間後、実験から得た15,000細胞をGFP蛍光についてフローサイトメトリーにより分析した。蛍光は図に示されるように幾何平均蛍光として表した。図1〜6のパルス条件の隣の数は、観察された幾何平均GFP蛍光を示す。例えば、図1に示す実験において、対照細胞は3.73の平均GFP蛍光を有し、短パルスに暴露された細胞は3.58の平均GFP蛍光を有し、長パルスに暴露された細胞は9.67の平均GFP蛍光を有し、パルスの組み合わせに暴露された細胞は33.58の平均GFP蛍光を有した。   HL-60 cells were exposed to various pulses in the presence of 5 μg of pEGFP, a plasmid containing a nucleotide sequence encoding a green fluorescent protein downstream of the cytomegalovirus (“CMV”) promoter. The following types of pulses were used: classic plasma membrane electroporation (long) pulse administered by BioRad Gene Pulser, short nsPEF pulse, combination of short nsPEF pulse 30 minutes after long pulse, or no pulse. For example, in the experiment shown in FIG. 1, HL-60 cells were treated with a classic plasma membrane electroporation (long) pulse at 3.5 msec, 0.3 kV / cm, an nsPEF pulse at 10 nsec, 150 kV / cm, Or exposed to either combination of both pulse types applying nsPEF 30 minutes after long pulse. The cells were then washed, resuspended in growth medium and incubated. After 24 hours, 15,000 cells from the experiment were analyzed by flow cytometry for GFP fluorescence. Fluorescence was expressed as geometric mean fluorescence as shown in the figure. The numbers next to the pulse conditions in FIGS. 1-6 indicate the observed geometric mean GFP fluorescence. For example, in the experiment shown in FIG. 1, control cells have an average GFP fluorescence of 3.73, cells exposed to short pulses have an average GFP fluorescence of 3.58, and cells exposed to long pulses have an average GFP of 9.67. Cells that had fluorescence and were exposed to the pulse combination had an average GFP fluorescence of 33.58.

遺伝子発現実験の結果
図1に見られるように、nsPEFパルス単独ではGFP蛍光に影響はなかったが、古典的な電気穿孔パルスは幾何平均蛍光で測定して約2.6倍まで単独で蛍光を増加させた。しかしながら、細胞の約3分の1のみがGFPを発現した。連続した両パルスの存在下では、GFP蛍光は33.58であった。これは対照（3.73）より約9倍大きく、古典的な電気穿孔パルス単独（9.67）で観察されるものより約3.5倍大きかった。さらに、長パルスおよび短パルスの組み合わせに暴露された基本的に全ての細胞は、古典的な電気穿孔条件に暴露された細胞より高い蛍光強度を有するGFPを発現した。 Results of gene expression experiments As shown in Figure 1, the nsPEF pulse alone had no effect on GFP fluorescence, but the classical electroporation pulse increased fluorescence alone up to about 2.6 times as measured by geometric mean fluorescence. It was. However, only about one third of the cells expressed GFP. In the presence of both successive pulses, the GFP fluorescence was 33.58. This was about 9 times greater than the control (3.73) and about 3.5 times greater than that observed with the classical electroporation pulse alone (9.67). Furthermore, essentially all cells exposed to the combination of long and short pulses expressed GFP with a higher fluorescence intensity than cells exposed to classical electroporation conditions.

図2〜6は、HL-60細胞が（変動する時間範囲の）短パルスおよび（変動する電圧の）長パルスの様々な組み合わせに暴露された同様な実験の結果を示す。短パルスは60 kV/cmおよび150 kV/cmで10ナノ秒から60ナノ秒まで変動した。長パルスは130 V/cmから450 V/cmの範囲で3.5ミリ秒間続いた。これらの図に示される実験は、長パルスおよび短パルスの組み合わせに暴露された細胞は平均GFP蛍光の増加を示したことを同様に証明した。これらの実験において、パルスの組み合わせは電気穿孔パルス単独より約3.2倍GFP蛍光を増した。nsPEFとして60 nsおよび60 kV/cmを含む条件では、GFP蛍光は約3.6倍増加した。図1に示す実験と同様に、図2から図6における長パルスおよび短パルスの組み合わせに暴露された細胞は基本的に全て、古典的な電気穿孔条件に暴露された細胞より高い蛍光強度を有するGFPを発現した。これらの結果は、古典的な電気穿孔パルスとnsPEFとを組み合わせることにより遺伝子発現を増強する可能性を示唆する。   Figures 2-6 show the results of similar experiments in which HL-60 cells were exposed to various combinations of short pulses (of varying time range) and long pulses (of varying voltage). Short pulses varied from 10 ns to 60 ns at 60 kV / cm and 150 kV / cm. The long pulse lasted for 3.5 milliseconds in the range of 130 V / cm to 450 V / cm. The experiments shown in these figures also demonstrated that cells exposed to the combination of long and short pulses showed an increase in average GFP fluorescence. In these experiments, the pulse combination increased GFP fluorescence approximately 3.2 times over the electroporation pulse alone. Under conditions that included 60 ns and 60 kV / cm as nsPEF, GFP fluorescence increased approximately 3.6-fold. Similar to the experiment shown in FIG. 1, essentially all cells exposed to the combination of long and short pulses in FIGS. 2-6 have higher fluorescence intensity than cells exposed to classical electroporation conditions. GFP was expressed. These results suggest the possibility of enhancing gene expression by combining classical electroporation pulses with nsPEF.

本発明の多数の特性および利点は詳細な説明から明白であり、従って、添付の特許請求の範囲は、本発明の真意および範囲内に収まるこのような全ての特性および利点を網羅することを意図する。さらに、当業者には多数の変更および変形が容易に明らかになるため、本発明は図解および記載されたそのままの構成および操作に限定すべきでない。むしろ、全ての適切な変更および等価物が特許請求された本発明の範囲内に収まるものとみなされ得る。   Numerous features and advantages of the present invention will be apparent from the detailed description, and thus, the appended claims are intended to cover all such features and advantages that fall within the spirit and scope of the present invention. To do. Further, since numerous modifications and changes will become apparent to those skilled in the art, the present invention should not be limited to the exact construction and operation as illustrated and described. Rather, all suitable modifications and equivalents may be considered as falling within the scope of the claimed invention.

恒常的サイトメガロウイルス（「CMV」）プロモーターにより駆動する緑色蛍光タンパク質（「GFP」）レポーター遺伝子の存在下で、古典的な原形質膜電気穿孔（長）パルス、短nsPEFパルス、長パルスの30分後に短nsPEFパルスの組み合わせ、または無パルスに暴露したHL-60細胞を用いた典型的な実験を示す。図1に示される細胞は、3.5ミリ秒（「ms」）および0.3 kV/cmの長パルス、10ナノ秒（「ns」）および150 kV/cmの短nsPEFパルス、またはこれら長パルスおよび短パルスの組み合わせに暴露した。GFP蛍光をx軸に示し、蛍光を発する細胞の数をy軸に示す。観察された幾何平均GFP蛍光を各パルス条件の隣に列挙する。30 of classical plasma membrane electroporation (long) pulse, short nsPEF pulse, long pulse in the presence of green fluorescent protein (“GFP”) reporter gene driven by constitutive cytomegalovirus (“CMV”) promoter Shown is a typical experiment using HL-60 cells exposed to a combination of short nsPEF pulses after minutes or no pulse. The cells shown in Figure 1 are 3.5 ms (“ms”) and 0.3 kV / cm long pulses, 10 nanosecond (“ns”) and 150 kV / cm short nsPEF pulses, or these long and short pulses. Exposed to the combination. GFP fluorescence is shown on the x-axis and the number of cells emitting fluorescence is shown on the y-axis. The observed geometric mean GFP fluorescence is listed next to each pulse condition. 450 Vおよび960 uFの長パルス、60 nsおよび60 kV/cmの短nsPEFパルス、またはこれら長パルスおよび短パルスの組み合わせにHL-60細胞を暴露した、同様な実験を示す。観察された幾何平均GFP蛍光を、図面の挿し込みのパルス条件の隣に列挙する。Similar experiments are shown in which HL-60 cells were exposed to 450 V and 960 uF long pulses, 60 ns and 60 kV / cm short nsPEF pulses, or a combination of these long and short pulses. The observed geometric mean GFP fluorescence is listed next to the inset pulse condition in the drawing. 260 Vおよび960 uFの長パルス、60 nsおよび60 kV/cmの短nsPEFパルス、またはこれら長パルスおよび短パルスの組み合わせにHL-60細胞を暴露した、同様な実験を示す。観察された幾何平均GFP蛍光を図面の挿し込みのパルス条件の隣に列挙する。Similar experiments are shown in which HL-60 cells were exposed to 260 V and 960 uF long pulses, 60 ns and 60 kV / cm short nsPEF pulses, or a combination of these long and short pulses. The observed geometric mean GFP fluorescence is listed next to the inset pulse condition in the drawing. 130 Vおよび960 uFの長パルス、60 nsおよび60 kV/cmの短nsPEFパルス、またはこれら長パルスおよび短パルスの組み合わせにHL-60細胞を暴露した、同様な実験を示す。観察された幾何平均GFP蛍光を図面の挿し込みのパルス条件の隣に列挙する。Similar experiments are shown in which HL-60 cells were exposed to 130 V and 960 uF long pulses, 60 ns and 60 kV / cm short nsPEF pulses, or a combination of these long and short pulses. The observed geometric mean GFP fluorescence is listed next to the inset pulse condition in the drawing. 450 Vおよび960 uFの長パルス、10 nsおよび150 kV/cmの短nsPEFパルス、またはこれら長パルスおよび短パルスの組み合わせにHL-60細胞を暴露した、同様な実験を示す。観察された幾何平均GFP蛍光を図面の挿し込みのパルス条件の隣に列挙する。Similar experiments are shown in which HL-60 cells were exposed to 450 V and 960 uF long pulses, 10 ns and 150 kV / cm short nsPEF pulses, or a combination of these long and short pulses. The observed geometric mean GFP fluorescence is listed next to the inset pulse condition in the drawing. 130 Vおよび960 uFの長パルス、10 nsおよび150 kV/cmの短nsPEFパルス、またはこれら長パルスおよび短パルスの組み合わせにHL-60細胞を暴露した、同様な実験を示す。観察された幾何平均GFP蛍光を図面の挿し込みのパルス条件の隣に列挙する。Similar experiments are shown in which HL-60 cells were exposed to 130 V and 960 uF long pulses, 10 ns and 150 kV / cm short nsPEF pulses, or a combination of these long and short pulses. The observed geometric mean GFP fluorescence is listed next to the inset pulse condition in the drawing. 本発明の一つまたは複数の態様による多パルス発生器の回路図である。FIG. 3 is a circuit diagram of a multi-pulse generator according to one or more aspects of the invention.

Claims (36)

インビトロにおいて、遺伝子のヌクレオチド配列を含むプラスミドの存在下で、
一つまたは複数の長パルスを細胞に適用する工程と、一つまたは複数のナノ秒パルス電場パルスを該細胞に適用する工程とを含み、
該長パルスが1マイクロ秒から20ミリ秒の持続時間を有し、
該ナノ秒パルス電場パルスが1ナノ秒から300ナノ秒の持続時間を有する、細胞における前記遺伝子の発現を増強する方法。 In vitro, in the presence of a plasmid containing the nucleotide sequence of the gene,
Applying one or more long pulses to the cell; and applying one or more nanosecond pulsed electric field pulses to the cell;
The long pulse has a duration of 1 microsecond to 20 milliseconds;
A method for enhancing expression of said gene in a cell , wherein said nanosecond pulsed electric field pulse has a duration of 1 nanosecond to 300 nanoseconds . 0.1ミリ秒から20ミリ秒の持続時間を有するとともに、0.1 kV/cmから1 kV/cmの電場強度を有する第一パルスを発生するための第一回路；
1ナノ秒から300ナノ秒の持続時間を有するとともに、10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度を有する第二パルスを発生するための第二回路；および
該第一パルスおよび該第二パルスをそれぞれ発生するために該第一回路および該第二回路のタイミングを制御するための制御回路
を含み、
前記第一回路が、
高圧電源；
該高圧電源と連結した充電レジスタ；
第一末端で該充電レジスタと連結され第二末端でロードと連結されたコンデンサ；および
該コンデンサの該ロードへの放電を制御するためのトランジスタ
を含み；
前記第二回路が、
高圧電源；
該高圧電源と連結した充電レジスタ；および
第一末端で該充電レジスタと連結され第二末端でロードと連結された伝送線を含み、該伝送線がロードへ放電することを含む；
細胞に導入される遺伝子の発現増強用の、電気パルスを発生するためのパルス発生器。 A first circuit for generating a first pulse having a duration of 0.1 ms to 20 ms and an electric field strength of 0.1 kV / cm to 1 kV / cm ;
A second circuit for generating a second pulse having a duration of 1 nanosecond to 300 nanoseconds and an electric field strength of 10 kV / cm to 350 kV / cm ; and the first pulse and the second pulse look including a control circuit for controlling the timing of said first circuit and said second circuit in order to generate respectively,
The first circuit is
High voltage power supply;
A charging register coupled to the high voltage power supply;
A capacitor coupled to the charging resistor at a first end and coupled to a load at a second end; and
Transistor for controlling discharge of the capacitor to the load
Including:
The second circuit is
High voltage power supply;
A charging resistor coupled to the high voltage power source; and
Including a transmission line coupled to the charge resistor at a first end and coupled to a load at a second end, the transmission line including discharging to the load;
A pulse generator for generating electrical pulses for enhancing the expression of genes introduced into cells . 制御回路が第一パルスと第二パルスとの間に1ミリ秒から5時間の間隔を許容する、請求項２記載のパルス発生器。The pulse generator of claim 2 , wherein the control circuit allows an interval of 1 millisecond to 5 hours between the first pulse and the second pulse. 制御回路が第一パルスと第二パルスとの間に1ミリ秒から24時間の間隔を許容する、請求項２記載のパルス発生器。The pulse generator of claim 2 , wherein the control circuit allows an interval of 1 millisecond to 24 hours between the first pulse and the second pulse. 第一パルスおよび第二パルスをロードに伝送するための伝送装置をさらに含む、請求項２〜４のいずれかに記載のパルス発生器。The pulse generator according to claim 2 , further comprising a transmission device for transmitting the first pulse and the second pulse to the load. 伝送装置が一対の電極を含む、請求項５記載のパルス発生器。6. The pulse generator of claim 5 , wherein the transmission device includes a pair of electrodes. ロードが懸濁細胞および生体組織の少なくとも一つを含む、請求項５記載のパルス発生器。The pulse generator of claim 5 , wherein the load comprises at least one of suspended cells and biological tissue. トランジスタが、コンデンサの放電を制御するために制御回路からの少なくとも一つのコマンドに応答する、請求項２〜７のいずれかに記載のパルス発生器。 8. A pulse generator as claimed in any of claims 2 to 7, wherein the transistor is responsive to at least one command from the control circuit to control the discharge of the capacitor. トランジスタが、熱損傷を被ることなく持続大電流に対処するために低い順電圧を有する、請求項２〜７のいずれかに記載のパルス発生器。 8. A pulse generator as claimed in any of claims 2 to 7 , wherein the transistor has a low forward voltage to handle sustained high currents without suffering thermal damage. トランジスタが絶縁ゲート・バイポーラ・トランジスタである、請求項２〜７のいずれかに記載のパルス発生器。The pulse generator according to any one of claims 2 to 7 , wherein the transistor is an insulated gate bipolar transistor. 制御回路に連結され制御される第一スイッチをさらに含み、該第一スイッチがロードから第一回路を連結および分離するよう機能可能である、請求項２〜１０のいずれかに記載のパルス発生器。11. A pulse generator according to any of claims 2 to 10 , further comprising a first switch coupled to and controlled by the control circuit, the first switch operable to couple and disconnect the first circuit from the load. . 第一スイッチが機械スイッチおよび真空スイッチの少なくとも一つである、請求項１１記載のパルス発生器。The pulse generator of claim 11 , wherein the first switch is at least one of a mechanical switch and a vacuum switch. 第一スイッチが磁気スイッチである、請求項１１記載のパルス発生器。The pulse generator of claim 11 , wherein the first switch is a magnetic switch. 制御回路からの第一コマンドに応答する第一スイッチを作動するために該制御回路に連結された第一トリガーユニットをさらに含む、請求項１１〜１３のいずれかに記載のパルス発生器。14. A pulse generator as claimed in any of claims 11 to 13 further comprising a first trigger unit coupled to the control circuit for actuating a first switch responsive to a first command from the control circuit. 伝送線がブルムレイン機器構成の伝送線である、請求項２〜１４のいずれかに記載のパルス発生器。The pulse generator according to any one of claims 2 to 14 , wherein the transmission line is a transmission line having a Blumrain equipment configuration. 制御回路に連結され制御される第二スイッチをさらに含み、該第二スイッチが伝送線を放電するよう機能可能である、請求項２〜１５のいずれかに記載のパルス発生器。The pulse generator according to any of claims 2 to 15 , further comprising a second switch coupled to and controlled by the control circuit, the second switch being operable to discharge the transmission line. 第二スイッチがスパーク・ギャップ・スイッチである、請求項１６記載のパルス発生器。The pulse generator of claim 16 , wherein the second switch is a spark gap switch. 制御回路からの第二コマンドに応答する第二スイッチを作動するために該制御回路に連結された第二トリガーユニットをさらに含む、請求項１６記載のパルス発生器。The pulse generator of claim 16 , further comprising a second trigger unit coupled to the control circuit for actuating a second switch responsive to a second command from the control circuit. 0.1ミリ秒から20ミリ秒の持続時間を有するとともに、0.1 kV/cmから1 kV/cmの電場強度を有する第一パルスを発生するための第一発生器手段；
1ナノ秒から300ナノ秒の持続時間を有するとともに、10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度を有する第二パルスを発生するための第二発生器手段；および
該第一発生器手段および該第二発生器手段により発生するパルスのタイミングを制御するための制御手段
を含み、
前記第一発生器手段が、
高圧電源；
該高圧電源と連結した充電レジスタ；
第一末端で該充電レジスタと連結され第二末端でロードと連結されたコンデンサ；および
該コンデンサの該ロードへの放電を制御するためのトランジスタ
を含み；
前記第二発生器手段が、
高圧電源；
該高圧電源と連結した充電レジスタ；および
第一末端で該充電レジスタと連結され第二末端でロードと連結された伝送線を含み、該伝送線がロードへ放電することを含む；
細胞に導入される遺伝子の発現増強用の、電気パルスを発生するためのパルス発生器。First generator means for generating a first pulse having a duration of 0.1 milliseconds to 20 milliseconds and having an electric field strength of 0.1 kV / cm to 1 kV / cm ;
A second generator means for generating a second pulse having a duration of 1 nanosecond to 300 nanoseconds and an electric field strength of 10 kV / cm to 350 kV / cm ; and the first generator means; look including a control means for controlling the timing of pulses generated by said second generator means,
The first generator means comprises:
High voltage power supply;
A charging register coupled to the high voltage power supply;
A capacitor coupled to the charging resistor at a first end and coupled to a load at a second end; and
Transistor for controlling discharge of the capacitor to the load
Including:
Said second generator means comprises:
High voltage power supply;
A charging resistor coupled to the high voltage power source; and
Including a transmission line coupled to the charge resistor at a first end and coupled to a load at a second end, the transmission line including discharging to the load;
A pulse generator for generating electrical pulses for enhancing the expression of genes introduced into cells . 制御回路が第一パルスと第二パルスとの間に1ミリ秒から5時間の間隔を許容する、請求項１９記載のパルス発生器。20. The pulse generator of claim 19 , wherein the control circuit allows an interval of 1 millisecond to 5 hours between the first pulse and the second pulse. 制御回路が第一パルスと第二パルスとの間に1ミリ秒から24時間の間隔を許容する、請求項１９記載のパルス発生器。20. The pulse generator of claim 19 , wherein the control circuit allows an interval of 1 millisecond to 24 hours between the first pulse and the second pulse. 第一パルスおよび第二パルスをロードに伝送するための伝送手段をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれかに記載のパルス発生器。The pulse generator according to any of claims 19 to 21 , further comprising transmission means for transmitting the first pulse and the second pulse to the load. ロードが懸濁細胞および生体組織の少なくとも一つを含む、請求項２２記載のパルス発生器。23. The pulse generator of claim 22 , wherein the load comprises at least one of suspended cells and biological tissue. インビトロにおいて、遺伝子のヌクレオチド配列を含むプラスミドの存在下で、
パルス発生器の第一回路から0.1ミリ秒から20ミリ秒の持続時間を有するとともに、0.1 kV/cmから1 kV/cmの電場強度を有する第一パルスを誘発する工程；
第一パルスを少なくとも一つの細胞に伝送して、該少なくとも一つの細胞の原形質膜で電気穿孔を惹起する工程；
パルス発生器の第二回路から1ナノ秒から300ナノ秒の持続時間を有するとともに、10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度を有する第二パルスを誘発する工程；および
第二パルスを該少なくとも一つの細胞に伝送して、該少なくとも一つの細胞の核膜で電気穿孔を惹起する工程
の連続工程、不連続工程、および順序に依存しない工程を含む、請求項２〜１８のいずれかに記載のパルス発生器を用いて細胞における前記遺伝子の発現を増強する方法。 In vitro, in the presence of a plasmid containing the nucleotide sequence of the gene,
Inducing from the first circuit of the pulse generator a first pulse having a duration of 0.1 ms to 20 ms and an electric field strength of 0.1 kV / cm to 1 kV / cm ;
Transmitting a first pulse to at least one cell to initiate electroporation at the plasma membrane of the at least one cell;
Inducing a second pulse from the second circuit of the pulse generator having a duration of 1 nanosecond to 300 nanoseconds and having an electric field strength of 10 kV / cm to 350 kV / cm ; and 19. A process according to any of claims 2 to 18, comprising a continuous process, a discontinuous process and a sequence independent process of transmitting to at least one cell and inducing electroporation at the nuclear membrane of said at least one cell. method for enhancing the expression of the gene in a cell using a pulse generator as claimed. 第一パルスを誘発する工程が、
コンデンサを充電する工程；および
コンデンサに蓄積された電荷の放電を開始するよう高圧大電流トランジスタを作動させる工程をさらに含み、
該電荷は少なくとも一つの細胞に伝送される第一パルスである、
請求項２４記載の方法。The step of inducing the first pulse is
Charging the capacitor; and activating the high voltage high current transistor to initiate the discharge of the charge stored in the capacitor;
The charge is a first pulse transmitted to at least one cell;
25. The method of claim 24 . コンデンサの放電を停止するようトランジスタを作動させる工程をさらに含む、請求項２５記載の方法。26. The method of claim 25 , further comprising operating the transistor to stop discharging the capacitor. 第二パルスを誘発する工程が、
伝送線を充電する工程；および
伝送線に蓄積された電荷の放電を開始するよう高圧スイッチを作動させる工程をさらに含み、
該電荷は少なくとも一つの細胞に伝送される第二パルスである、
請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。The step of inducing the second pulse is
Charging the transmission line; and activating the high voltage switch to initiate the discharge of the charge accumulated in the transmission line;
The charge is a second pulse transmitted to at least one cell;
27. A method according to any of claims 24-26 . 伝送線の放電を停止するよう高圧スイッチを作動させる工程をさらに含む、請求項２７記載の方法。28. The method of claim 27 , further comprising activating a high voltage switch to stop the transmission line discharge. 第二パルスを伝送する前に所定の間隔を待機する工程をさらに含む、請求項２４〜２８のいずれかに記載の方法。 29. A method according to any of claims 24-28 , further comprising waiting for a predetermined interval before transmitting the second pulse. 所定の間隔が少なくとも一つの細胞の原形質膜から核膜へのポリヌクレオチドの拡散に基づくものである、請求項２９記載の方法。30. The method of claim 29 , wherein the predetermined interval is based on the diffusion of the polynucleotide from the plasma membrane to the nuclear membrane of at least one cell. 所定の間隔が1ミリ秒から24時間の範囲である、請求項２９記載の方法。30. The method of claim 29 , wherein the predetermined interval ranges from 1 millisecond to 24 hours. インビトロにおいて、遺伝子のヌクレオチド配列を含むプラスミドの存在下で、
コンデンサを充電する工程；
コンデンサに蓄積された電荷を少なくとも一つの細胞へ放電し始めるよう高圧大電流トランジスタを作動させ、該少なくとも一つの細胞の原形質膜で電気穿孔を惹起する工程；
所定の長い持続時間後にコンデンサの放電を停止するよう高圧大電流トランジスタを作動させる工程；
該少なくとも一つの細胞からコンデンサを分離するためのスイッチを作動する工程；
伝送線を充電する工程；
伝送線に蓄積された電荷を該少なくとも一つの細胞へ放電し始めるよう高圧スイッチを作動させ、該少なくとも一つの細胞の核膜で電気穿孔を惹起する工程；および
所定の短い持続時間後に伝送線の放電を停止するよう高圧スイッチを作動させる工程
の連続工程、不連続工程、および順序に依存しない工程を含む、請求項２〜２３のいずれかに記載のパルス発生器を用いて細胞における前記遺伝子の発現を増強する方法。 In vitro, in the presence of a plasmid containing the nucleotide sequence of the gene,
Charging the capacitor;
Actuating a high voltage, high current transistor to begin discharging the charge stored in the capacitor to at least one cell, and causing electroporation in the plasma membrane of the at least one cell;
Activating the high voltage high current transistor to stop discharging the capacitor after a predetermined long duration;
Activating a switch for separating the capacitor from the at least one cell;
Charging the transmission line;
Activating a high pressure switch to begin discharging electric charge accumulated in the transmission line to the at least one cell and inducing electroporation in the nuclear membrane of the at least one cell; and after a predetermined short duration, continuous process the step of activating the high-pressure switch to stop discharging, discontinuous steps, and step a including that does not depend on the order, said in a cell using a pulse generator according to any one of claims 2 to 23 genes To enhance the expression of. 0.1ミリ秒から20ミリ秒の持続時間を有するとともに、0.1 kV/cmから1 kV/cmの電場強度を有する第一パルスを発生するための第一パルス発生器であって、該第一パルスが細胞の細胞原形質膜の電気穿孔を惹起する発生器；
1ナノ秒から300ナノ秒の持続時間を有するとともに、10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度を有する第二パルスを発生するための第二パルス発生器であって、該第二パルスが細胞の核膜の電気穿孔を惹起する発生器；および
該第一パルス発生器および該第二パルス発生器により発生するパルスのタイミングを制御するための制御回路
を含み、
前記第一パルス発生器が、
高圧電源；
該高圧電源と連結した充電レジスタ；
第一末端で該充電レジスタと連結され第二末端でロードと連結されたコンデンサ；および
該コンデンサの該ロードへの放電を制御するためのトランジスタ
を含み；
前記第二パルス発生器が、
高圧電源；
該高圧電源と連結した充電レジスタ；および
第一末端で該充電レジスタと連結され第二末端でロードと連結された伝送線を含み、該伝送線がロードへ放電することを含む；
細胞に導入される遺伝子の発現増強用の二元パルス発生器。 A first pulse generator for generating a first pulse having a duration of 0.1 ms to 20 ms and an electric field strength of 0.1 kV / cm to 1 kV / cm , the first pulse comprising: A generator that triggers electroporation of the cell plasma membrane of cells;
A second pulse generator for generating a second pulse having a duration of 1 nanosecond to 300 nanoseconds and an electric field strength of 10 kV / cm to 350 kV / cm , wherein the second pulse is look including a control circuit for controlling the timing of pulses generated by and said first pulse generator and said second pulse generator; generator eliciting the electroporation of the nuclear membrane of a cell
The first pulse generator is
High voltage power supply;
A charging register coupled to the high voltage power supply;
A capacitor coupled to the charging resistor at a first end and coupled to a load at a second end; and
Transistor for controlling discharge of the capacitor to the load
Including:
The second pulse generator is
High voltage power supply;
A charging resistor coupled to the high voltage power source; and
Including a transmission line coupled to the charge resistor at a first end and coupled to a load at a second end, the transmission line including discharging to the load;
A dual pulse generator for enhancing the expression of genes introduced into cells . 0.1ミリ秒から20ミリ秒の持続時間を有するとともに、0.1 kV/cmから1 kV/cmの電場強度を有する第一パルスを発生するための第一発生器手段であって、該第一パルスが細胞の細胞原形質膜の電気穿孔を惹起する手段；
1ナノ秒から300ナノ秒の持続時間を有するとともに、10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度を有する第二パルスを発生するための第二発生器手段であって、該第二パルスが細胞の核膜の電気穿孔を惹起する手段；および
該第一発生器手段および該第二発生器手段により発生するパルスのタイミングを制御するための制御手段
を含み、
前記第一発生器手段が、
高圧電源；
該高圧電源と連結した充電レジスタ；
第一末端で該充電レジスタと連結され第二末端でロードと連結されたコンデンサ；および
該コンデンサの該ロードへの放電を制御するためのトランジスタ
を含み；
前記第二発生器手段が、
高圧電源；
該高圧電源と連結した充電レジスタ；および
第一末端で該充電レジスタと連結され第二末端でロードと連結された伝送線を含み、該伝送線がロードへ放電することを含む；
細胞に導入される遺伝子の発現増強用の二元パルス発生器。First generator means for generating a first pulse having a duration of 0.1 ms to 20 ms and having an electric field strength of 0.1 kV / cm to 1 kV / cm, the first pulse comprising: Means for inducing electroporation of the cell plasma membrane of cells;
Second generator means for generating a second pulse having a duration of 1 nanosecond to 300 nanoseconds and having an electric field strength of 10 kV / cm to 350 kV / cm, the second pulse comprising: Means for inducing electroporation of the nuclear membrane of the cell; and control means for controlling the timing of the pulses generated by the first generator means and the second generator means,
The first generator means comprises:
High voltage power supply;
A charging register coupled to the high voltage power supply;
A capacitor coupled to the charging resistor at a first end and coupled to a load at a second end; and
Transistor for controlling discharge of the capacitor to the load
Including:
Said second generator means comprises:
High voltage power supply;
A charging resistor coupled to the high voltage power source; and
Including a transmission line coupled to the charge resistor at a first end and coupled to a load at a second end, the transmission line including discharging to the load;
A dual pulse generator for enhancing the expression of genes introduced into cells . 第一高圧電源；
該第一高圧電源と連結した第一充電レジスタ；
第一末端で該第一充電レジスタと連結され第二末端でロードと連結されたコンデンサ；
第一充電レジスタの第二末端およびコンデンサの第一末端と連結されたトランジスタであって、コンデンサの該ロードへの放電を制御するトランジスタ；
第二高圧電源；
該第二高圧電源と連結した第二充電レジスタ；
第一末端で該第二充電レジスタと連結され第二末端でロードと連結された伝送線；
該コンデンサおよび該伝送線の放電を制御するための制御回路；
ロードから該コンデンサを選択的に連結および分離するための第一スイッチ；
該制御回路および該第一スイッチに連結された第一トリガーユニットであって、該制御回路から受信する一つまたは複数のコマンドに応答する該第一スイッチを作動する第一トリガーユニット；
該伝送線を選択的に放電するための第二スイッチ；
該制御回路および該第二スイッチに連結された第二トリガーユニットであって、該制御回路から受信する一つまたは複数のコマンドに応答する該第一スイッチを作動する第二トリガーユニット；および
該コンデンサおよび該伝送線からロードへの放電を伝送するための伝送装置
を含む、細胞に導入される遺伝子の発現増強用の二元パルス発生器であって、
該二元パルス発生器からは、第一パルスおよび第二パルスが発生し、
該第一パルスが、0.1ミリ秒から20ミリ秒の持続時間を有するとともに、0.1 kV/cmから1 kV/cmの電場強度を有し；
該第二パルスが1ナノ秒から300ナノ秒の持続時間を有するとともに、10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度を有する、二元パルス発生器。 First high-voltage power supply;
A first charging resistor coupled to the first high voltage power source;
A capacitor connected to the first charging resistor at a first end and connected to a load at a second end;
A transistor coupled to the second end of the first charging resistor and the first end of the capacitor for controlling discharge of the capacitor to the load;
Second high-voltage power supply;
A second charging resistor coupled to the second high voltage power source;
A transmission line connected to the second charging resistor at a first end and to a load at a second end;
A control circuit for controlling the discharge of the capacitor and the transmission line;
A first switch for selectively connecting and disconnecting the capacitor from the load;
A first trigger unit coupled to the control circuit and the first switch for activating the first switch in response to one or more commands received from the control circuit;
A second switch for selectively discharging the transmission line;
A second trigger unit coupled to the control circuit and the second switch, the second trigger unit activating the first switch in response to one or more commands received from the control circuit; and the capacitor And a dual pulse generator for enhancing expression of a gene introduced into a cell, comprising a transmission device for transmitting a discharge from the transmission line to a load ,
From the binary pulse generator, a first pulse and a second pulse are generated,
The first pulse has a duration of 0.1 ms to 20 ms and an electric field strength of 0.1 kV / cm to 1 kV / cm;
A dual pulse generator, wherein the second pulse has a duration of 1 nanosecond to 300 nanoseconds and an electric field strength of 10 kV / cm to 350 kV / cm. インビトロにおいて、遺伝子のヌクレオチド配列を含むプラスミドの存在下で、
二元パルス発生器から第一パルスを誘発する工程であって、第一パルスが0.1ミリ秒から20ミリ秒の持続時間を有するとともに、0.1 kV/cmから1 kV/cmの電場強度を有する工程；
第一パルスを少なくとも一つの細胞に伝送して、該少なくとも一つの細胞の原形質膜で電気穿孔を惹起する工程；
所定の時間間隔を待機する工程；
二元パルス発生器から第二パルスを誘発する工程であって、第二パルスが1ナノ秒から300ナノ秒の持続時間を有するとともに、10 kV/cmから350 kV/cmの電場強度を有する工程；および
第二パルスを該少なくとも一つの細胞に伝送して、該少なくとも一つの細胞の核膜で電気穿孔を惹起する工程
の連続工程、不連続工程、および順序に依存しない工程を含む、請求項３３〜３５のいずれかに記載の二元パルス発生器を用いて細胞における前記遺伝子の発現を増強する方法。 In vitro, in the presence of a plasmid containing the nucleotide sequence of the gene,
Inducing a first pulse from a dual pulse generator, the first pulse having a duration of 0.1 to 20 milliseconds and an electric field strength of 0.1 to 1 kV / cm ;
Transmitting a first pulse to at least one cell to initiate electroporation at the plasma membrane of the at least one cell;
Waiting for a predetermined time interval;
Inducing a second pulse from a dual pulse generator, the second pulse having a duration of 1 nanosecond to 300 nanoseconds and an electric field strength of 10 kV / cm to 350 kV / cm ;and
Transmitting a second pulse to the at least one cell to induce electroporation at the nuclear membrane of the at least one cell, comprising a continuous step, a discontinuous step, and a sequence independent step . method for enhancing the expression of the gene in a cell using a dual pulse generator as claimed in 35 any one of.
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