JP2002515816A - Apparatus for optimally introducing a nucleic acid vector into an in vivo tissue - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、低い電界を使用して細胞、特に筋肉細胞及び腫瘍細胞への核酸ベクターのｉｎ ｖｉｖｏ導入を顕著に増進し、導入効率を向上させるシステム及び装置に関する。本発明装置は、細胞または組織の損傷を惹起することなく細胞内への核酸ベクターの移動を増進するために最適な電圧勾配を与えるように設計されている。このような装置の特徴は、特有の電極配置を有すること及び最大電圧設定値によって規定された特有の電力限界を有することである。   (57) [Summary] The present invention relates to systems and devices that significantly enhance the in vivo introduction of nucleic acid vectors into cells, particularly muscle cells and tumor cells, using a low electric field, and improve the efficiency of introduction. The device of the present invention is designed to provide an optimal voltage gradient to enhance the transfer of a nucleic acid vector into a cell without causing cell or tissue damage. The features of such a device are that they have a unique electrode arrangement and that they have a unique power limit defined by the maximum voltage setting.

Description

【発明の詳細な説明】 ｉｎ ｖｉｖｏ組織に核酸ベクターを最適に電気導入する装置 発明の分野 本発明の目的は、低い電界を使用して細胞、特に筋肉細胞に対する核酸ベクタ ーのｉｎ ｖｉｖｏ導入を顕著に増進し、導入効率を向上させることである。よ り詳細には本発明は、遺伝子治療のためにこのような核酸ベクターの導入を行う 方法、装置及び組成物に関する。本発明装置は、細胞または組織を損傷すること なく細胞への核酸ベクターの移動を増進させる最適の電圧勾配を与えるように設 計されている。このような装置は、特有の電極配置及び最大電圧設定値によって 規定される特有の電力限界を特徴とする。 発明の背景 遺伝子デリバリー用ベクター及び方法 所与の細胞に遺伝子を導入することが遺伝子治療の基礎である。しかしなから 、治療すべき宿主の細胞に十分な量の核酸を導入することが問題の１つである。 有益な遺伝子を、トランスフェクト細胞中で発現させなければならないからであ る。この ために考察された方法の１つは、ウイルスベクター、特にレトロウイルス、アデ ノウイルスまたはアデノウイルス関連ウイルスのようなウイルスベクターに核酸 を組込む方法である。これらの系はウイルスの細胞侵入メカニズムと分解防御性 とを利用している。しかしながらこの方法には幾つかの問題がある。その１つは 、宿主生物の体内に伝播し易い感染性ウイルス粒子が産生される危険性があり、 また、レトロウイルスベクターの場合には挿入性突然変異誘発の危険性があるこ とである。更に、ウイルスゲノムに挿入できる治療用遺伝子またはワクチン用遺 伝子の容量が限られている。最後に、ウイルスベクターに対しては免疫応答がし ばしば発生し、免疫クリアランスが生じるのでウイルスの再投与が無効になり、 また炎症が生じることもある。 別の方法では（Ｗｏｌｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，１４６５−６８，１９ ９０；Ｄａｖｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３， ７２１３−１８，１９９６；Ｆｅｌｇｎｅｒらの米国特許第５，５８０，８５９ 号）、プラスミドの形態の核酸を、優れたｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクショ ン促進物質であるタンパク質、リポソーム、荷電脂質またはカチオン性 ポリマー例えばポリエチレンイミンのようなトランスフェクション促進化合物に 任意に結合させ、筋肉内または血流内に投与している（Ｂｅｈｒら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，６９８２−６，19８９；Ｆｅｌｇ ｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，７４１３− ７，１９８７；Ｂｏｕｓｓｉｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ９２，７２９７−３０１，１９９５；米国特許第５，６７６，９５４号及 び欧州特許第４２５，４７５号）。 筋肉に関しては、筋肉組織が遊離プラスミドの形態で注入されたＤＮＡを取込 む能力を有することを初めて示した前出のＷｏｌｆｆらの刊行物以来、多くの研 究者がこの方法の改良を試みた（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４，４１９−４３１；Ｗｏｌｆｆら，１９９１，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１，４７４−４８５）。これらの研究は以下のような 幾つかの傾向に集約される： −ＤＮＡをビーズに吸着させ次いでこのビーズを組織に推進することによって ＤＮＡを細胞内部に強制的に侵入させる機械的解決方法（"遺伝子ガン"）（Ｓａ ｎｄｅｒｓ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８，２７２６ −２７３０；Ｆｙｎａｎら，１９９３，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１，４ ７４−４８５）。これらの方法は、ワクチン接種戦略には有効であることが判明 したが、組織の表層にしか到達しない。粒子は皮膚組織を貫通することができな いので、これらの方法を筋肉に使用する場合には粒子が筋肉に接近できるように 外科的処置が必要である； −ＤＮＡを、遊離プラスミドの形態でなく、複合体を細胞に侵入させ易いビヒ クルとして機能し得る分子に結合させて注入する方法。別の多くのトランスフェ クション方法で使用されているカチオン性脂質は現時点では期待外れである。何 故なら、これまで試験されたカチオン性脂質は筋肉に対してはトランスフェクシ ョン阻害性を示したからである（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，１９９６，Ｇｅｎｅ Ｔ ｈｅｒ．３，４Ｏ５−４１１）。カチオン性のペプチド及びポリマーについても 同様の結果が観察された（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｇｅ ｎｅ Ｔｈｅｒ．４，４１９−４３１）。ポリビニルアルコールまたはポリビニ ルピロリドンとＤＮＡとの混合物だけが好ましい結合であると考えられる。しか しながら、これらの混合物を使用したときにも、 ヌードＤＮＡを注入したときの１０倍未満の増加しか得られない（Ｍｕｍｐｅｒ ら，１９９６，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３，７０ １−７０９）； −ＤＮＡの拡散性及び／または安定性を改善する溶液で注入対象組織を前処置 するか（Ｄａｖｉｓら，１９９３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４，１５１− １５９）、または、核酸侵入を促進する溶液例えば細胞の増殖現象または再生現 象を誘発する溶液で前処置する方法。これらの処置では特に、局部麻酔薬、心毒 素、血管収縮薬、内毒素またはその他の分子を使用する（Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら ，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４，４１９−４３１；Ｄａｎｋ ｏら，１９９４，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１，１１４−１２１；Ｖｉｔａｄｅｌｌ ｏら，１９９４，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５，１１−１８）。これらの前 処置プロトコルは管理が難しい。特にブピバカインの場合には、有効な効果を得 るために必要な用量は致死量に極めて近い量である。高浸透圧ショ糖の前注入は 、拡散性を改善するが、筋肉中のトランスフェクションレベルを向上させる効果 はない（Ｄａｖｉｓら，１９９３）。 プラスミドＤＮＡを単独または合成ベクターに結合させて使 用することによって他の組織のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションを行った（ Ｃｏｔｔｅｎ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ（１９９４），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ ｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４，７０５；Ｇａｏ ａｎｄｈ Ｈｕａｎｇ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２，７１０；Ｌｅｄｌｅ ｙ（１９９５），Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６，１１２９）。試 験した主な組織は肝臓、肺胞上皮、血管壁、中枢神経系及び腫癩であった。これ らのすべての組織中のトランスジーンの発現レベルは治療的用途を期待できるほ ど高くはなかったが（例えば、肝臓、Ｃｈａｏら（１９９６），Ｈｕｍａｎ Ｇ ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７，９０１）、血管壁に対するプラスミドＤＮＡの導 入に関しては最近になって幾つかの期待できる結果が得られた（Ｉｉｒｅｓら（ １９９６），Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７，９５９及び９８９） 。脳に対しては導入効果は極めて小さく、腫瘍に対しても同様である（Ｓｃｈｗ ａｒｔｚら，１９９６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３，４０５；Ｌｕら,１９ ９４,Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １,２４５；Ｓｏｎら，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｃｉ．ＵＳＡ９１，１２６６９）。遺伝子デリバリー用電気穿孔及びイオン泳動法 また、培養細胞へのＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションを促進す るために、電気穿孔、即ち、細胞の透過性を高める電界が常用されている。この 現象は閾値電界強度の達成に依存する。動物細胞の場合には８００〜１，２００ ボルト／ｃｍのオーダの比較的高い強度の電界で電気透過性が観察された。しか もこの技術は、ヒトの固形腫瘍に対するブレオマイシンのような抗腫瘍剤のｉｎ ｖｉｖｏにおける薬効を増進するために提案されたものである（米国特許第５ ，４６８，２２８号、Ｌ．Ｍ．Ｍｉｒ）。上記の範囲の電気的条件（８００〜１ ，２００ボルト／ｃｍ）は、極めて短い持続時間（１００マイクロ秒）のパルス を使用するときは、小分子の細胞内導入に極めて好適である。電界を１，０００ ボルト／ｃｍ未満にしてこのような条件（１００マイクロ秒のパルス）を肝臓に 対する核酸のｉｎ ｖｉｖｏ導入に使用したときは、電気パルスの非存在下のＤ ＮＡ注入に比較して導入の増進は全く見られす、阻害的にもなり得ることが判明 した（国際特許ＷＯ９７／０７８２６及びＨｅｌｌｅｒら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ｅｒｓ，３８９，２２５−８，１９９６）。 この技術はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ利用が難しい。何故なら、このような強度の 電界を作用させると広範囲の組織損傷が惹起されるからである。ターゲット組織 の損傷は癌患者の治療では問題にならないが、腫瘍組織以外の組織、特に横紋筋 に核酸が投与される場合には著しい欠点となる。 電気泳動及びイオン泳動を惹起する電気パルスを投与するために基本的に３種 類のシステム、即ち、外部電極システム、内部電極システム（カテーテルを含む ）及び外部電極と内部電極とを組合せたシステムが存在する。 外部電極 １つの種類の装置では、電極を患者の体外に配置する。例えば、Ｈｏｆｍａｎ ｎの米国特許第５，３１８，５１４号；Ｈｏｆｍａｎｎの第５，４３９，４４０ 号、Ｈｏｆｍａｎｎの第５，４６２，５２０号、Ｈｏｆｍａｎｎの第５，４６４ ，３８６号、Ｈｏｆｍａｎｎらの米国特許第５，６８８，２３３号及びＷｅａｖ ｅｒらの第５，０１９，０３４号を参照するとよい。これらの特許の記載内容は 参照によって本発明に含まれるものとする。外部電極装置では電極を患者の表面 組織領域に接触させる。装置は、患者の皮膚に電極を貼付することによって非侵 入的に使用してもよくまたは外科手術で露出させた器官の表面に電極を貼付する ことによって侵入的に使用してもよい。 Ｈｏｆｍａｎｎの’５１４特許は、遺伝子、ＤＮＡまたは医薬のような巨大分 子を患者の予め選択された表面組織領域に植え込むために使用される装置を開示 している。装置はヘッドアセンブリを有しており、第一の実施態様によればヘッ ドアセンブリは、連続気泡エラストマーの上に配置されたサーパンタイン（ｓｅ ｒｐｉｎｔｉｎｅ）導体を含み、双方がほぼ平坦な支持部材に担持されている。 サーパンタイン導体の隣合う平行なセグメントが電極として機能する。患者に電 気パルスを投与するために、ヘッドアセンブリを患者の予め選択した表面組織領 域に接触させて配置し、導体を皮膚に接触させて配置する。エラストマーに吸収 または含浸される液体をエラストマーに供給し、巨大分子を含む液体媒体を患者 の皮膚に導入する。次にスイッチを操作して信号発生器から電極に高電圧パルス を送出し、電極間に電界を発生させる。皮膚の内部の電界の深度は電極間ギャッ プに比例する。電界が液体を組織領域に注入する。 別の実施態様においては、ヘッドアセンブリが平坦な支持部材にほぼ垂直に延 びる複数の細い針を含む。針は列状に配置さ れ、隣合う針の各々が反対の極性を有するように信号発生器の出力に交互に接続 されている。針は皮膚細胞の最も外側の層に侵入し、ターゲットエリアに対する 電気パルスの投与を促進する。 Ｈｏｆｍａｎｎの’４４０特許は、調整自在な間隔をもつ電界発生用電極を含 む装置を開示している。電極は可動連結手段に装着されており、ユーザーが電極 を操作してクランプのジョーのように互いに接近させたり離間させたりすること ができる。使用の際には電極のジョーを開き、治療すべく選択された組織を電極 ジョー間に把持する。電極に接続された信号発生器を適当なスイッチング装置に よって起動して電極間の組織に電界を発生させる。 内部電極 第二の種類の電気導入システムは、植え込み可能または挿入可能な電極を使用 する。植え込まれ／挿入された電極の近傍エリアに電界を供給するために電極を 患者の体内に配置する。例えばＣｒａｎｄｅｌｌらの米国特許第５，３０４，１ ２０号；Ｈｏｆｍａｎｎらの第５，５０７，７２４号；Ｈｏｆｍａｎｎの第５， ５０１，６６２号；Ｈｏｆｍａｎｎらの第５，７０２，３５９ 号及びＨｏｆｍａｎｎの第５，２７３，５２５号参照。これらの特許の記載内容 は参照によって本発明に含まれるものとする。 Ｃｒａｎｄｅｌｌの’１２０特許は、患者の選択された血管に挿入されるカテ ーテルを開示している。カテーテルは円周上に間隔を隔てて軸方向に伸びる複数 の電極を含み、これらの電極が血管の内壁に接触して配置される。次に、巨大分 子を含有する液体媒体を電極の近傍で血管に注入し、所定の電気導入用電気信号 を印加するために電極を励起する。離間した電極は所望の電界を創出するために 励起されるサーペンタインまたは平行ストリップでよい。 Ｈｏｆｍａｎｎの’７２４特許は、離間した電極を有するカテーテル主体の電 気導入装置の別の実例であり、電極は、治療される血管の壁に接触するように血 管に挿入されるカテーテルの外部に配置される。 Ｈｏｆｍａｎｎの’６６２特許は、円筒状の誘電性支持体の内部に装着された 一対の離間した電極を開示している。電極は、血管内を流れる血液が電極間を通 過するように血管の中心の周囲で互いに所定の均一間隔を隔てて血管の中心の近 傍に配置されいる。円筒状の誘電性支持体は外科手術によって周囲血管に 植え込まれる。電極間を流れる血液中で電界が生じるように所定の電気信号が電 極に印加される。 Ｈｏｆｍａｎｎの’５２５特許は、針が電気導入電極の機能を果たす二針注射 器を開示している。針をターゲットエリアに挿入し、ターゲットエリアに電界を 与える電気信号を電極に印加する。 Ｈｏｆｍａｎｎらの’３５９特許もまた、電気導入に使用するための針主体の 電極を開示している。 外部電極と内部電極との組合せ 第三の種類の電気導入装置は、上記のシステムの特徴を組合せたものである。 この種の装置は、内部に配置される少なくとも１つの電極と外部に配置される少 なくとも１つの電極とを使用して所望の組織エリアに電界を供給する。例えば、 Ｓｈａｐｌａｎｄらの米国特許第５，２８６，２５４号；Ｓｈａｐｌａｎｄらの 第５，４９９，９７１号；Ｓｈａｐｌａｎｄらの第５，４９８，２３８号；Ｓｈ ａｐｌａｎｄらの第５，２８２，７８５号及びＳｈａｐｌａｎｄらの第５，６２ ８，７３０号参照。これらの特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるも のとする。 これらの装置の典型はＳｈａｐｌａｎｄ’７８５特許に記載 された装置である。該特許は薬剤デリバリー壁（例えば、薬剤またはその他の巨 大分子を通し得る透過性または半透性の璧）をもつ薬剤室とカテーテルの内部に 薬剤デリバリー壁に向き合って配置された電極とを有するカテーテルを開示して いる。第二電極は患者の皮膚から速い部位に配置されている。電流が供給された ときに２つの電極間に生じる電界の内部に配置される薬剤室に所望の巨大分子を 含有する液体がデリバリーされる。このようにして巨大分子がターゲットエリア にデリバリーされる。 上記の種々の特許に開示された他の特徴：余剰の巨大分子をデリバリー方向の 反対方向に駆動するために電極の極性を反転させる（例えば、Ｓｈａｐｌａｎｄ ’２３８及びＳｈａｐｌａｎｄ’７８５特許）；電極に対する電流のデリバリー を心室の減極と同期させ、電気的に誘発される不整脈または不自然な心律動を防 止する（例えば、Ｆｅｉｒｉｎｇの米国特許第５，２３６，４１３号と第５，４ ２５，７０３号及びＳｈａｐｌａｎｄの米国特許第５，６３４，８９９号参照） ；巨大分子デリバリー用駆動力として音波を発生させるために音伝達（ｐｈｏｎ ｏｐｈｒｅｓｉｓ）として知られた超音波圧電変換器を電極の代わりに使用する （例えば、Ｓｈａｐｌａｎｄ’２３８特許及びＳｈａｐｌａｎｄ’７３０特許） 。 発明の概要 上記に引用したすべての論文は、ｉｎ ｖｉｖｏで有効であるためには１，０ ００ボルト／ｃｍのオーダの高い電界が必要であると記載している。出願人はこ こで、例えば１００ボルト／ｃｍまたは２００ボルト／ｃｍの比較的低い強度（ ６００ボルト／ｃｍ未満）で比較的長い持続時間の電気パルスを組織に作用させ ることによって、望ましくない副作用を伴うことなく筋肉へのｉｎ ｖｉｖｏ核 酸導入を極めて顕著に増進できるという全く予想外の注目すべき知見を得た。出 願人は更に、プラスミドに担持されたトランスジーン発現について、従来技術に よる筋肉へのＤＮＡ導入で観察されたような大きい統計的分散が本発明方法によ って顕著に減少することを知見した。 従って本発明は、組織に直接投与するかまたは局所的もしくは全身的に投与す ることによって導入すべき核酸を組織細胞に接触させ、筋肉には１〜４００ボル ト／ｃｍ、腫瘍のような組織には１〜６００ボルト／ｃｍの範囲の強度をもつ１ つまたは複数の電気パルスを組織に印加することによって導入が確保さ れるような、ｉｎ ｖｉｖｏ組織例えば１つまたは複数の横紋筋または腫瘍への 核酸導入方法及び装置に関する。 従って本発明は、組織に直接投与するかまたは局所的もしくは全身的に投与す ることによって導入すべき核酸を組織細胞に接触させ、所定の強度を与えるよう に設定された本発明の装置によって供給された１つまたは複数の電気パルスを組 織に印加することによって導入確保することを特徴とする、多細胞真核生物の細 胞に核酸をｉｎ ｖｉｖｏ導入する改良装置のようなシステムを提供する。より 特定的には、電界強度は、腫瘍細胞に核酸をデリバリーするためには１〜６００ ボルト／ｃｍの範囲、筋肉に核酸をデリバリーするためには１〜４００ボルト／ ｃｍの範囲である。本発明のシステム（または装置）は、電気パルス発生器（ま たは電気パルス発生手段）と電極とから成り、電気パルス発生器は、１ミリ秒よ りも長いパルス時間、１〜４００または６００ボルト／ｃｍの範囲の強度の電気 パルスを０．１〜１００Ｈｚの周波数で発生する。電極は電極に接触したｉｎ ｖｉｖｏ組織に電界を生じさせるために電気パルス発生器に接続されている。１ つの特定実施態様によれば、電気パルス発生器は、（筋肉に導入するためには） ３０〜３００ボルト／ｃｍ の範囲、腫瘍細胞及びその他の小細胞に導入するためには４００〜６００ボルト ／ｃｍの範囲の強度のパルスを発生する。別の特定実施態様によれば、電気パル ス発生器は１０ミリ秒よりも長い時間のパルスを発生する。更に別の実施態様に よれば、電気パルス発生器は２〜１０００のパルスを発生する。 本発明によれば、システムまたは改良装置は、電気パルス発生器は互いに不規 則なパルスを発生でき、システムまたは装置がいかなる場合にも上記に設定した パラメーターよりも大きい（または小さい）電界を供給することはできないとい う条件で、パルス時間に依存する電界強度の関数は変数である。例えば、電界の 経時的変化を表す関数の積分は１ｋＶ・ｍｓｅｃ／ｃｍよりも高い値であり、別 の実施態様では５ｋＶ・ｍｓｅｃ／ｃｍ以上の値である。 電気パルス発生器（パルス発生手段）は、方形波パルス、指数関数的減衰波、 短い持続時間の振動性単極波、短い持続時間の振動性二極波から成るグループか ら選択されたパルスを発生し得る。好ましくは、電気パルス発生器は方形波パル スを発生する。 本発明によれば、種々の電極構成が可能である。例えば、電 極は、例えば患者の表面組織の細胞に核酸を導入するために治療すべき組織の上 に配置される外部電極でもよい。あるいは、電極は、治療すべき組織に植え込み 可能な内部電極即ち組織侵入電極でもよい。このような内部電極は針でもよく、 核酸と電界とを同時に投与できるインゼクターシステムとして構成されてもよい 。別の実施態様では、本発明は外部電極と内部電極との双方を使用する。 本発明の外部電極は、大きい筋肉の極めて近傍で患者の体外の一部分に接触す るような寸法でよい。このような電極は１つの実施態様によれば平坦な平面電極 であり別の実施態様によれば半円筒状平面電極である。 更に別の実施態様によれば、電極は動脈内または静脈内電極、例えば、本発明 によって改造された可撓性カテーテル装置である。 本発明の電極の好ましい材料はステンレススチールである。 本発明の改良装置は、従来技術の装置の改造、特に、このような装置の電界発 生手段を本発明の電界を発生するように改造することによって製造される。例え ば、電気パルス発生手段は、４００または６００ボルト／ｃｍに対応する電圧を 超過しない ように電圧ゲートを改造することによって１〜４００または６００ボルト／ｃｍ の範囲のパルスを発生するように改造できる。このような改造装置の特定実施態 様において、電圧は一定電圧に設定され、電極は一定の電極間距離に設定され得 る。あるいは、電気パルス発生手段が、４００または６００ボルト／ｃｍに対応 する電圧を超過しないように装置をラベリングすることによって１〜４００また は６００ボルト／ｃｍの範囲のパルスを発生するように改造されてもよい。 従って本発明の目的は、核酸の導入に最適であることが知見された電圧勾配、 パルス幅及びパルス数をもつ電界を組織を損傷することなく供給するようなシス テムを提供すること、またはこのような電界を供給するように既存の装置を改良 することである。 本発明のより特定的な目的は、電気穿孔に使用される電圧条件（電圧勾配が６ ００ボルト／ｃｍ以上、通常は１，０００ホルト／ｃｍ以上）よりも損傷を生じ 難い穏やかな条件下で核酸を電気導入することである。 本発明の更に別の特定的な目的は、イオン泳動に使用される極めて低い強度の 電界の作用下で得られるよりも著しく効果的 な核酸の細胞内デリバリーを達成することである。 本発明の更に別の利点は、効率的及び再現的に核酸が筋肉細胞にデリバリーさ れることである。 本発明の上記の目的及びその他の目的が上記の記載、並びに、発明の詳細な説 明の項及び溺付図面を参照した実施例の項のより詳細な記載によって達成される ことは明らかであろう。 図面の簡単な説明 図１は、マウスの脛骨上端筋へのプラスミドＤＮＡ ｐＸＬ２７７４のトラン スフェクションに対して高い電界強度の電気パルスが与える効果を平均値±ＳＥ Ｍで表す。 図２は、マウスの脛骨上端筋へのプラスミドＤＮＡ ｐＸＬ２７７４のトラン スフェクションに対して中間の電界強度の電気パルスが与える効果を平均値±Ｓ ＥＭで表す。 図３は、マウスの脛骨上端筋へのプラスミドＤＮＡ ｐＸＬ２７７４のトラン スフェクションに対して低い電界強度及び種々の持続時間の電気パルスが与える 効果を平均値±ＳＥＭで表す。 図４は、マウスの脛骨上端筋へのプラスミドＤＮＡ ｐＸＬ２７７４のトラン スフェクションに対して低い電界強度及び 種々の持続時間の電気パルスが与える効果を平均値±ＳＥＭで表す。 図５は、低い電界強度を用いたときのマウスの脛骨上端筋へのプラスミドＤＮ Ａ ｐＸＬ２７７４の電気導入効率を平均値±ＳＥＭで表す。 図６は、マウスの脛骨上端筋におけるルシフェラーゼの発現の動力学を表す。 プラスミドｐＸＬ２７７４を電気導入使用（■）または非使用（×）で投与した 。平均値±ＳＥＭ。 図７は、発現レベルを電気導入使用（●）及び非使用（□）で投与したＤＮＡ の用量の関数として表す。 図８は、様々な種類の電極の電気導入効率に対する効果を示す。 図９は、分泌アルカリホスファターゼの血清濃度の動力学を表す。プラスミド ｐＸＬ３０１０を電気導入使用（■）または非使用（◆）で投与した。平均値± ＳＥＭ。 図１０は、電気導入使用（白抜き棒グラフ）及び非使用（黒色棒グラフ）の筋 肉中のａＦＧＦの発現の動力学を表す。 図１１は、プラスミドｐＸＬ３１７９及びｐＸＬ３２１２のマップを表す。 図１２は、プラスミドｐＸＬ３３８８及びｐＸＬ３０３１のマップを表す。 図１３は、プラスミドｐＸＬ３００４及びｐＸＬ３０１０のマップを表す。 図１４は、プラスミドｐＸＬ３１４９及びｐＸＬ３０９６のマップを表す。 図１５は、プラスミドｐＸＬ３３５３及びｐＸＬ３３５４のマップを表す。 図１６は、プラスミドｐＸＬ３３４８のマップを表す。 発明の詳細な説明 上記に指摘したように、本発明は、低強度の電気パルスを組織に作用させるこ とによって組織に対する核酸のｉｎ ｖｉｖｏ導入を著しく増進させる。例えば 、６００ボルト／ｃｍ未満の電界は腫癩に対する核酸の導入を増進し、４００ボ ルト／ｃｍ未満、好ましくは電極間距離約０．５〜１ｃｍの１００〜２００ボル ト／ｃｍ未満の電界は筋肉に対する核酸の導入を増進することが知見された。こ れらの電界は比較的長い時間印加される。出願人は更に、従来技術では筋肉に対 するＤＮＡ導入で観察されたトランスジーンの発現の広い統計的分散が本発明の 方法に よって顕著に狭められることを知見した。最後に、発現が長期間持続されること 、例えば６０日間以上持続されることも知見された。特定実施例では、高レベル 発現が６３日間検出された。 本文中の記載から容易に判断できるように、出願人はこれらの条件下のｉｎ ｖｉｖｏ細胞への核酸の導入を"電気導入"と呼ぶ。本文中で使用された“エレク トロトランスフェクション”は同じ意味を表す代替用語である。これらの２つの 用語で表される処理では、核酸の導入に最適な条件が、“電気穿孔”（８００Ｖ ／ｃｍ以上の電界の使用）及びイオン泳動（極めて低い強度の電界の使用）とは 明らかに異なっている。 従って、本発明は、組織に直接投与するかまたは局所的もしくは全身的に投与 することによって導入すべき核酸を組織細胞に接触させ、（例えば腫瘍細胞には ）１〜６００ボルト／ｃｍまたは筋肉細胞には１〜４００ボルト／ｃｍの範囲の 強度の１つまたは複数の電気パルスを組織に印加することによって導入を確保す ることを特徴とする、組織、特に横紋筋に核酸をｉｎ ｖｉｖｏ導入する方法、 システム、デバイス（または装置）及び組成物に関する。言い換えると、本発明 は特に、電気導入システム（例えばデバイスまたは装置）に関する。 １つの好ましい実施態様によれば、本発明方法は、例えば、大きいサイズの細 胞及び／または細長い形状の細胞及び／または電位に天然に応答する細胞及び／ または特定形態をもつ細胞のような特定の幾何学的形状をもつ細胞から成る組織 に使用される。 好ましくは、電界の強度は筋肉に対しては４〜４００ボルト／ｃｍ、腫瘍に対 しては６００ボルト／ｃｍ以下の範囲であり、印加時間の合計は１０ミリ秒（ｍ ｓｅｃ）よりも長く、好ましくは１０ｍｓｅｃである。特定の実施例では持続時 間の合計は８ｍｓｅｃまたはそれ以上である。多くの実施例で、パルス持続時間 は２０ｍｓｅｃであり、４０ｍｓｅｃよりも長い持続時間が有効であることが知 見された。パルスの使用数は例えば１〜１，０００パルスであり、好ましくは２ 〜１００、より好ましくは４〜２０であり、パルス周波数は０．１〜１，０００ へルツ（Ｈｚ）、より好ましくは、０．２〜１００Ｈｚの範囲である。特定実施 態様では、２、３及び４Ｈｚの周波数が有効であることが知見された。パルスが 不規則に送出されてもよく、時間に依存する電界強度の変化を表す関数が変数で もよい。電界強度の経時的変化を表す関数の積分は１ｋＶ・ｍｓｅｃ／ ｃｍよりも大きい。本発明の好ましい実施態様によれば、積分は５ｋＶ・ｍｓｅ ｃ／ｃｍ以上である。しかしながら、この積分関数が前述のような電気泳動電圧 以下の電圧で得られる必要があることは当業者には容易に理解されよう。 本発明の範囲から発展した特定実施例では、本発明のデバイスが、少なくとも １つの短時間（１ｍｓｅｃ未満）の高電圧パルス（４００Ｖ／ｃｍ以上、好まし くは５００〜８００Ｖ／ｃｍ）とその後の１つまたは複数のより長い持続時間（ １ｍｓｅｃ以上）のはるかに低い電界強度（２００Ｖ／ｃｍ未満）のパルスとの 組合せを供給し得る。 本発明の好ましい実施態様によれば、パルスの電界強度は３０〜３００ボルト ／ｃｍである。 電気パルスは、方形波パルスから選択され、電界は、指数関数的減衰波、短い 持続時間の振動性単極波、短い持続時間の振動性二極波、または他の波形を発生 させる。本発明の好ましい実施態様によれば、電気パルスは方形波パルスである 。 電気パルスの投与は、以下に挙げるような当業者に公知の任意の方法で行う： −治療すべき組織の両側に配置された外部電極系、特に皮膚 に接触して配置された非侵入性電極系； −組織に植え込まれた電極系； −核酸と電界とを同時に投与し得る電極／インゼクター系。 ｉｎ ｖｉｖｏ投与のためには、非侵入性外部電極との電気連続性を確保する 中間物質を援用することがときには必要である。例えばゲル形態の電解質を使用 する。ゲルの好適例は、後出の実施例に使用されたゲル、心電図または除細動器 に使用されるような電気接触を強化する医療用ゲルである。 核酸は適当な任意の手段によって投与できるが、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏ組 織に直接に注入するか、または、電界の印加部位に核酸を導入し得る別の局所的 もしくは全身的経路を用いて投与できる。前述のように、核酸は、核酸を導入さ せ得る物質または導入を促進する物質と共に投与できる。より特定的には、これ らの核酸は、溶液中で遊離状態でもよく、合成物質に結合されていてもよく、ま たはウイルスベクターに担持されていてもよい。合成物質は当業者に公知の脂質 もしくはポリマーでもよく、または、ターゲット組織の膜に定着し得るターゲッ ティング要素でもよい。これらの要素の例としては、糖、ペプチド、抗体、レセ プター及びリガンドを担持するベクターがあ る。 このような本発明の条件下で、核酸の投与は電界の印加前、印加と同時、また は印加後のいずれの時期に行ってもよい。但し、核酸の投与後に電界の印加を継 続する必要があることは勿論である。 従って、本発明の目的はまた、哺乳類細胞、特にヒト細胞に同時的にまたは時 間を隔ててもしくは時間をずらせてｉｎ ｖｉｖｏ投与するための核酸と１〜６ ００ボルト／ｃｍ（好ましくは４００ボルト／ｃｍ）の強度の電界との組合せ使 用を提案することである。電界強度は好ましくは４〜４００ボルト／ｃｍの範囲 であり、より好ましくは筋肉に導入するときの電界の強度は３０〜３００ボルト ／ｃｍの範囲である。同様の電気導入受容性をもつ腫瘍及び細胞に導入するため の好ましい電界強度は４００〜６００Ｖ／ｃｍであり、好ましくは約５００（即 ち、５００±１０％、好ましくは５％）Ｖ／ｃｍである。このような組合せは、 核酸が電界に対して特定方向に配向されるように核酸構造を規定し、また、電界 の存在下の特定の二次構造及び三次構造を規定することは平均的な当業者に容易 に理解されよう。更に、ＤＮＡはターゲット組織中に見出される細胞外 成分に結合し、これは、低電界のアガロースゲル電気泳動またはその他の実験室 条件下のＤＮＡとは著しく異なる。 電気導入システム及び装置 任意の電気導入システム（即ち、装置またはデバイス、本文中ではこれらの用 語を互換的に使用する）の第一構成要素は６００Ｖ／ｃｍ以下のパルスを供給す るように設計または改造された電気パルス発生器と電極とから成る。特に筋肉に 核酸をデリバリーするための本発明のシステムまたは装置は４００Ｖ／ｃｍ以下 のパルスを供給する。当然、実効電圧は電極間距離に依存する。当業界で公知の ように、この距離はターゲット組織の比抵抗（抵抗率）に影響を与える。従って 、印加される実効電圧は抵抗に依存し、その結果、電流、従って総電力は許容レ ベル以内に維持される。本文中で使用された“許容レベル”なる用語は、総電力 が不可逆的な組織損傷、特に組織火傷を生じないことを意味する。従って、好ま しい観点からは、本発明の装置は、電圧と電極間距離とを固定することによって 許容電流をコントロールするかまたは電極間距離に対して高過ぎる電圧、従って 多すぎる電流の印加を防止するフィードバック手段を含む。本発明のシステムは 、オシロスコープまたはその他の電圧、 電流または双方の計測デバイスを含む。 １つの実施態様によれば、本発明のシステムは市販の装置を使用して製造され る。好ましくは、本文中で最適であると規定された特定の電気導入条件を与える ように市販の装置を改造する。別の実施態様では、本発明の目的を果たす新しい 装置を設計して製造する。改造または製造されるパルス発生器の設計仕様は非限 定的に、所望の電圧勾配、即ち６００または４００Ｖ／ｃｍ未満、筋肉に投与す る場合には好ましくは２００Ｖ／ｃｍ未満を維持するための機械的または電気的 コントローラを組み込んでいる。機械的コントロールは例えば、電圧選択ダイア ルに配置され高過ぎる電界を生じさせる電圧の選択を防止するストップから成る 。あるいは、このような電圧が選択されないように装置を製造または改造しても よい。更に別の実施態様では、装置が、電圧（従って電流）が本発明のパラメー ターを超過したときに起動されるブレーカーまたはヒューズを含み得る。更に別 の実施態様では、マイクロプロセッサコントロールが高過ぎる電圧の選択を防止 または抹消する。更に別の実施態様では、パルス発生器の改造は、本発明の電界 強度を供給する特定の電圧範囲の使用を指令するラベルを使用するだけである。 これら の改造の全部が当業界では定型的な手段であり、標準的な電気的及び機械的技術 を使用する。 上述のように、本文中で最適であると規定された電界強度を生じるために本発 明のシステムによって供給される実効電圧は、電極間スペースに部分的に依存す る。電極間スペースが固定されている場合、（所定の組織、例えば筋肉、肝臓、 心臓または腫瘍に対する）電圧は予め規定された定数であろう。しかしなから、 電極間スペースを変更できるのか望ましい場合、一定の電圧勾配を維持するため には電圧を調整する必要かある。このような電圧は、電極間距離を測定するか、 調整後の電極間スペースの値を示す測定手段を電極に配備するか、または、正し い電圧を全自動的に供給するようにパルス発生器にフィードバックする全自動測 定手段によって決定される（Ｈｏｆｍａｎｎの米国特許第５，４３９，４４０号 参照）。 以下の項は、本発明に従って改造できる従来技術のパルス発生器、電極及び装 置をより詳細に説明する。 パルス発生器 パルス発生器（“電圧発生器”及び“パルスまたは電圧発生手段”とも呼ぶ） は、規定された電圧、持続時間、パルス幅、 デューテイサイクル（パルス放出時間及び静止時間の合計）及びパルス周波数の 電流を発生する電気装置である。このような装置は当業界で公知であり、市販の パルス発生器としては、例えば米国特許第５，７０４，９０８号に記載されてい るＢＴＸ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｒｏ ｎｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｇｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販され ているＥＬＥＣＴＲＯＣＥＬＬ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＯＲモデルＥＣＭ６００、 Ｔ８００Ｌ及びＴ８２０電圧発生器がある。該特許の記載内容はその全部が参照 によって本発明に含まれるものとする。あるいは、パルス発生器は、以下の実施 例で開示するようなＪｏｕａｎ，Ｆｒａｎｃｅから市販されているエレクトロパ ルセーターＰＳ１５であってもよい。更に別の実施態様では、米国特許第５，６ ３４，８９９号に記載されている１つまたは複数の波形を発生し得る電圧発生器 を使用してもよい。該特許の記載内容はその全部が参照によって本発明に含まれ るものとする。電圧は、可変の形状、強度及び持続時間のパルスを発生するよう に設計できる。例えば、２００Ｖ／ｃｍまたは４００Ｖ／ｃｍ、５−２０ｍｓｅ ｃのパルスの後に、もっと低い強度でもっと長 いパルスを発生するように設計できる。装置は更に、本発明の電界と組合せてイ オン泳動電界を供給し得る。 本発明のパルス発生器は以下の仕様を有している： −１〜６００または４００Ｖ／ｃｍ、好ましくは４〜４００Ｖ／ｃｍ、より好 ましくは３０〜３００Ｖ／ｃｍの電圧勾配を発生する。筋肉に電気導入する場合 に本発明の装置の特定的な電圧勾配は約１００Ｖ／ｃｍ及び２００Ｖ／ｃｍ、好 ましくは２００Ｖ／ｃｍ未満である。腫瘍細胞または同様の細胞に電気導入する 場合には予想外にも４００−６００Ｖ／ｃｍ、最適には約５００Ｖ／ｃｍの電界 が好ましいことが知見された； −０．１〜１，０００ヘルツ（Ｈｚ）のパルス周波数。特定実施態様では、周 波数は約２Ｈｚ以上で１０Ｈｚ以下、好ましくは１Ｈｚよりも高い。好ましい実 施態様では、周波数は３または４Ｈｚである； −パルス時間（持続時間）は１ミリ秒（ｍｓｅｃ）よりも長く、デューテイ時 間は可変である。好ましくはパルス時間は５ｍｓｅｃよりも長く、より好ましく は１０ｍｓｅｃよりも長く、いっそう好ましくは２０ｍｓｅｃよりも長い。 好ましい観点では、本発明のパルス発生器は少なくとも２パ ルス、好ましくは４、６または８パルスを発生する。例えば、８〜１，０００パ ルスを発生する。患者に副作用が生じ始めたり電界強度がコントロール不能にな った場合にはパルス発生器の無効化または遮断が可能でなければならない。この ような無効化は手動または全自動または双方で行うことができる。 平均的な当業者には、別の装置、コンピユータなどのような外部信号によって パルスを発生できることが明らかであろう。例えば、核酸を心組織にデリバリー するためには、パルス発生器は、パルスを心拍に同期させるように患者の心電図 と最適のインタフェースをとる。このようなシステムは好ましくは、例えばペー スメーカーによる患者の心律動の能動的調整を含む（Ｓｈａｐｌａｎｄの米国特 許第５，６３４，８９９号）。 電極 本発明の電極は組織に電界を供給する。１つの電極、カソードは負電荷を有し ている。アノードは正電荷を有している。本発明によれば概して、一方の電極か ら他方の電極に正味のイオン流または束が流れる（イオン流は勿論、イオン種の 実効電荷と電極の極性とに依存する）。一般に、核酸は強い実効負電荷を有する のでアノード方向に移動するであろう。 本発明で使用される電極は、電気を効率的に導通し、好ましくは使用条件下で 不活性、非反応性及び無毒性でなければならない。より特定的には、内部使用電 極は、電極が有害または有毒な金属イオンを放出したりまたは電極効率を低下さ せる酸化を生じてはならないので、生物材料に対して検出できる程度の反応を生 じてはならない。本発明の好ましい電極材料は、十分に非反応性で、適正な電気 伝導効率を有し、妥当なコストで製造できるように十分に廉価なステンレススチ ールである。特に理想的な内部使用電極は金または白金である。しかしながらこ のような貴金属電極は極めて高価である。これらの材料は、他の導体にメッキす ることによってコストを引き下げることができる。その他の導電性金属としては 、銅、銀または塩化銀、スズ、ニッケル、リチウム、アルミニウム及び鉄とそれ らのアマルガムがある。しかしなから、アルミニウムのような幾つかの材料は、 内部使用してはならない。また、ジルコニウム、イリジウム、チタン及び炭素の いくつかの形態から電極を製造してもよい。 銀及び銅のようないくつかの電極は抗菌活性を有しており、感染防止のための 内部投与に望ましい。 電極はターゲット組織に好適な任意の構造に形成できる。非限定例としては、 直線型ワイヤ、コイル型ワイヤ（カテーテルに使用するためには直線型及びコイ ル型のワイヤ電極が理想的である）、導電性表面（例えば、カテーテルまたはバ ルーンカテーテルの表面、米国特許第５，７０４，９０８号参照。該特許の記載 内容はその全部が参照によって本発明に含まれるものとする）、金属ストリップ 、針（またはプローブ）、針アレイ、表面電極またはそれらの組合せがある。考 えられる電極の組合せとしては、（１）カテーテル電極と針電極、（２）カテー テル電極と表面電極、（３）針電極と表面電極、がある。特定の実施態様では、 針電極をＤＮＡデリバーリ用注射器と共に使用できる。このような針電極は、そ の長さに沿って核酸溶液がデリバリーされ得るように軸の全長を貫通する開孔を 有し得る。大きい器官、特に大きい筋肉に核酸をデリバリーするためには２つの 表面電極を使用し得る。前述のように例えば皮膚に対する良好な接触及び導通を 確保するために表面電極は電解質組成物と組合せて使用するのが好ましい。 １つの内部電極と１つの外部電極とを有する特定実施態様では、外部電極が内 部電極の周囲に配置された多数の"ヘッド"を 有し得る。実際、上記の構造のいずれに関しても一般には、一方の電極が多数の "ヘッド"を有し得る。 本発明は更に、電極アレイ、軸に沿った開孔をもつ針、（組織への針の侵入深 度に関わりなく組織内部に一定の再現可能な導電性エリアを与えるように）規定 され校正された長さの導電通路をもつ針、組織内部で点点電気アークを防止する ために絶縁点をもつ針、及び針の周囲の産生物を収容する任意の種類のパウチ／ リザーバも考察する。 針電極に関して上述したように、平面電極は絶縁された周辺余白を有し得る。 一般に、電極は、ターゲット組織が電極間に直接存在するように配置される。 この場合、核酸に最大の電界強度が作用する。しかしながら、電界束は電極の全 周囲に存在するので、電極間で周辺的に発生する電界及び電極間で直接発生する 電界を使用することも可能である。 改造された従来技術の装置 特定実施態様によれば、電極を患者の体外に配置する装置（例えばＨｏｆｍａ ｎｎの米国特許第５，３１８，５１４号、Ｈｏｆｍａｎｎの第５，４３９，４４ ０号、Ｈｏｆｍａｎｎの 第５，４６２，５２０号、Ｈｏｆｍａｎｎの第５，４６４，３８６号、Ｈｏｆｍ ａｎｎらの第５，６８８，２３３号、及び、Ｗｅａｖｅｒらの第５，０１９，０ ３４号参照）は、本発明に従って改造され、即ち、規定条件下の電界を供給する ように改造されて、本発明の改良装置を提供する。改良装置は、電極を患者の皮 膚に貼付することによって非侵入的に使用されてもよく、または、電極を外科的 に露出された器官の表面に貼付することによって侵入的に使用されてもよい。 同様に、植え込み／挿入電極に隣接のエリアに電界を供給するために患者の体 内に配置される植え込み可能または挿入可能な電極、特にカテーテル電極（例え ば、Ｃｒａｎｄｅｌｌらの米国特許第５，３０４，１２０号、Ｈｏｆｍａｎｎら の第５，５０７，７２４号、Ｈｏｆｍａｎｎら第５，５０１，６６２号、Ｈｏｆ ｍａｎｎらの第５，７０２，３５９号及びＨｏｆｍａｎｎの第５，２７３，５２ ５号参照）を使用する電気導入システムは、本発明の改良装置を提供するように 本発明に従って改造され得る。 当然ながら、上記システムの特徴を組合せた電気導入装置、例えば、所望の組 織エリアに電界を供給するために体内に配置 された少なくとも１つの電極と体外に配置された少なくとも１つの電極とを利用 する電気導入装置（例えば、Ｓｈａｐｌａｎｄらの米国特許第５，２８６，２５ ４号、Ｓｈａｐｌａｎｄらの第５，４９９ ９７１号、Ｓｈａｐｌａｎｄらの第 ５，４９８，２３８号及びＳｈａｐｌａｎｔらの第５，６２８，７３０号参照） は、本発明の改良システムを提供するように本発明に従って改造され得る。 電気導入システムを使用する遺伝子治療 本発明の方法は、遺伝子治療、即ち、導入された遺伝子の発現または該遺伝子 の調節もしくは阻害が特定の病理の治療を確保するような治療方法に有効である 。 好ましくは以下のような効果を得るために組織細胞を遺伝子療法で治療する： −細胞自体の機能不全を矯正する効果（例えば、膵線維症、筋ジストロフィー のような遺伝的欠失に関連した疾病の治療）； −トランスジーンによって産生される栄養因子、神経栄養因子、血管新生促進 因子または抗炎症性因子によって筋肉のような組織、器官または骨の血管新生ま たは神経支配を保護及び／ または再生する効果； −筋肉を形質転換し、治療効果に導く物質の分泌器官とする効果。このような 物質としては、遺伝子自体の産生物（例えば、血栓及び止血の調節因子、栄養因 子、ホルモン例えばインスリン、エリトロポエチン、レプチン、など）、または 、治療用遺伝子の添加によって筋肉内で合成される活性代謝産物があり、例えば 治療用物質の分泌によって遺伝病を矯正する； −腫瘍サプレッサー（網膜芽腫タンパク質、ｐ５３、ｐ７１）、自殺遺伝子（ 例えば、ＨＳＶ−チミジンキナーゼ）、抗血管新生促進遺伝子（例えば、アンキ オスタチン、エンドスタチン、ウロキナーゼのアミノ末端フラグメント）、細胞 周期ブロッカー、アポプトーシス遺伝子（例えばＢＡＸ）細胞内一本鎖抗体、及 び、免疫促進遺伝子のような抗腫瘍遺伝子のデリバリー； −核酸ワクチンまたは免疫促進効果。 全身的問題に関する遺伝子治療において筋肉内発現によって電気導入を使用す ることは以下のような多くの要因から特に有利である： −トランスジーンの発現が数カ月以上にもわたって極めて安定であり、筋肉内 の治療用タンパク質及び分泌治療用タンパク 質が安定に持続的に産生される； −筋肉組織には接近が容易なので生気のない器官に直接、迅速かつ安全に投与 できる； −筋肉は体積が大きいので多数の投与部位を利用できる； −筋肉の分泌容量が大きいことが証明されている。 上記の利点に加えて、局所的なターゲット化した電界を使用して局所治療を行 うので安全性が高いという利点がある。 低い電界の使用に伴う安全性が得られるので、本発明は、例えば安全な電気導 入を確保するために心拍調整を使用する心臓病を治療するために心筋に使用でき る（米国特許第５，６３４，８９９号参照）。また、ＧＡＸタンパク質のような 平滑筋細胞の増殖を阻害する遺伝子の発現によって再発狭窄症の治療に使用でき る。 特に長い持続時間の低強度の電界と投与とのｉｎ ｖｉｖｏ組織への組合せ使 用は、顕著な組織損傷を生じることなく核酸のトランスフェクションを増進する 。これらの結果は、核酸を使用する遺伝子治療におけるＤＮＡ導入効率を向上さ せる。 従って、本発明に伴う利点は、生理的及び／または治療的用量の物質が組織の 内部もしくはその近傍に産生されるかまたは 血流もしくはリンパ循環中で全身的に分泌されることである。更に、本発明は、 例えば多数の投与部位によってトランスフェクトすべき組織の体積を調節するこ とができ、また、電極の数、形状、表面積及び配置を調節することができるので 、発現されるトランスジーンの有効量の微調整及びコントロールを初めて可能に した。トランスフェクション効率を調節できる付加的なコントロール要素として は、電界強度、パルスの数、持続時間及び周波数並びに当業界で明らかな核酸の 量及び投与容量の変更がある。本発明の特別な利点は、ＤＮＡ導入について従来 技術のどの方法もなし得なかった優れた用量−応答曲線が得られることである。 その結果として、所望の組織内産生レベルまたは分泌レベルに適したトランスフ ェクションレベルが得られる。最後に本発明の方法は、ターゲット器官以外の器 官に到着することを完全には排除またはコントロールできない化学的またはウイ ルス的な遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏ導入方法を凌駕する安全性を有している。実際 、一方では本発明の方法によって（局所的電気パルスの作用を受ける組織の体積 に厳密に関連させて）トランスフェクト組織の局在性をコントロールでき、他方 では筋肉の場合にのようにいくつかの組織は生気がないかまたは再 生能力を有しているかまたはその双方の状態なので、組織の全体的または部分的 切除によって初期状態を回復させることが可能である。このように柔軟な使用適 性を有するので動物の種類（ヒト及び脊椎動物）、患者の年齢、患者の生理的及 び／または病理的状態に応じて最適な条件で方法を使用し得る。 本発明方法は更に、トランスジーンのサイズがキャプシドに適合するウイルス ゲノムのサイズによって制約を受けるウイルス的方法と違って、大きいサイズの 核酸のトランスフェクションを初めて可能にした。このような可能性は、ジスト ロフィンの遺伝子のような極めて大きいサイズの遺伝子の導入に必須であり、ま た、例えばホルモンを生理的に調節された量で産生させる場合に必要なイントロ ン及び／または大きいサイズの調節要素をもつ遺伝子の導入に必須である。この ような可能性はまた、人工の酵母エピソームもしくは染色体またはミニクロモソ ームの導入に必須である。 本発明の別の目的は、組織に接近できるように外用、皮膚、経口、膣内、非経 口、鼻孔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、などの経路で投与されるよう に配合された核酸を含む組成物と１つの電界の電気パルスとを組合せ使用するこ とである。 本発明の医薬組成物は、注射剤、特に所望の器官の処に直接注入される注射剤の 形態または他の任意の投与形態を得るための医薬として許容されるビヒクルを含 有する。このようなビヒクルとしては特に、無菌等張性溶液、または、滅菌水も しくは生理的食塩水を適宜添加することによって注射可能な溶液にできるる乾燥 組成物、特に凍結乾燥組成物がある。注射に使用される核酸の用量及び投与回数 と注射剤の容量は、種々のパラメーター、特に、使用される投与方法、対象とな る疾病、発現させる遺伝子または所望の治療期間などに応じて調節され得る。 ターゲット組織 本発明の発明者らは、本発明の遺伝子導入の最適条件がターゲット組織次第で 異なることを知見した。例えば、２００ボルト／ｃｍの電界は筋肉細胞への遺伝 子導入を顕著に増進することが判明した。これらの条件下で腫瘍細胞に対しても 有意な遺伝子導入が進行するが（具体的な実験では、遺伝子導入が３倍に増加す ることが観察された）、４００ボルト／ｃｍの電界中では腫瘍細胞に対する遺伝 子導入効率がはるかに高い（遺伝子導入効率が２ｌｏｇ増加）。別の実験では、 腫瘍細胞に対する遺伝子導入には５００ボルト／ｃｍの電界強度が最適であった 。 従って、本発明によれば、システムまたは改良装置が核酸を筋肉細胞（または 他の大きい細胞）にデリバリーするように構成でき、種々の電界強度パラメータ ーをもつシステムまたは改良装置が腫瘍細胞（及び他の小さい細胞）に遺伝子を デリバリーするように開発できる。 核酸を筋肉細胞にデリバリーするために、本発明のシステムまたは装置は、１ 〜４００ボルト／ｃｍ、好ましくは４〜４００ボルト／ｃｍ、より好ましくは３ ０〜３００ボルト／ｃｍの電圧勾配を生じるであろう。特定実施態様では、電圧 勾配が１００〜２００ボルト／ｃｍである。２００ボルト／ｃｍを超過しない電 圧勾配を与えるシステムまたは装置が特に好適である。 核酸を腫瘍細胞にデリバリーするために、本発明のシステムまたは装置は、１ 〜６００ボルト／ｃｍ、好ましくは１００〜６００ボルト／ｃｍ、より好ましく は４００〜６００ボルト／ｃｍの電圧勾配を生じるであろう。特定実施態様では 、電圧勾配が４００〜５００ボルト／ｃｍであり、好ましくは約５００Ｖ／ｃｍ である。６００ボルト／ｃｍを超過しない電圧勾配を与えるシステムまたは装置 が特に好適である。 核酸 核酸は、合成核酸もしくは生合成核酸でもよく、ウイルス、原核細胞、または 、単細胞生物（例えば酵母）もしくは多細胞生物に由来の真核細胞でもよい。核 酸を、出発生物及び／または合成系の構成成分の全部または一部に結合させて投 与してもよい。 核酸は、デオキシリボ核酸でもよくまたはリボ核酸でもよい。核酸は天然起原 配列でもよくまたは人工配列でもよい。特に、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮ Ａ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡ、ハイブリッド配列または修飾もしくは非修飾のオリ ゴヌクレオチドの合成配列もしくは半合成配列でもよい。これらの核酸は当業者 に公知の任意の方法、特に、クローニング、化学合成または、クローニングによ って得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む混成方法によって得られる 。核酸は化学的に修飾され得る。 より特定的には、核酸はセンスもしくはアンチセンス特性またはリボザイムの ような触媒特性を有するＤＮＡもしくはＲＮＡでよい。"アンチセンス"なる用語 は、ターゲット配列に相補的な配列をもつ核酸、例えばターゲット配列とのハイ ブリダイゼ ーションによって核酸のｍＲＮＡの発現を阻害するような核酸を意味する。"セ ンス"なる用語は、ターゲット配列に同種または同型の配列をもつ核酸、例えば タンパク質転写因子に結合し所与の遺伝子の発現に関与する配列を有する核酸を 意味する。１つの好ましい実施態様によれば、核酸は有益な遺伝子とこの有益な 遺伝子を発現させ得る要素とを含む。核酸フラグメントがプラスミドの形態を有 しているのが有利である。 デオキシリボ核酸は一本鎖または二重鎖で、短いオリゴヌクレオチドでもよく 、もっと長い配列でもよい。デオキシリボ核酸は、遺伝子、転写または複製の調 節配列、他の細胞成分との結合領域、などを保有し得る。このような遺伝子とし ては、マーカー遺伝子、即ち、細胞機能、移動または遺伝子機能を研究するため の検出可能なマーカーを産生する遺伝子；治療用遺伝子；防御抗原または免疫原 遺伝子；などがある。本発明で使用された"治療用遺伝子"なる用語は特に、治療 効果を有しているＲＮＡまたはタンパク質産物をコードする任意の遺伝子を意味 する。コードされたタンパク質産物はタンパク質、ペプチド、などである。この タンパク質産物はターゲット細胞に同種（ホモロガス）であってもよい（即ちタ ーゲット細胞が全く病因を 有していないときにターゲット細胞内部で正常に発現される産生物）。この場合 、トランスジーンの発現は例えば、細胞内部の不適正な発現もしくは修飾によっ て失活したり活性が低下したタンパク質の発現を解決するか、または、このよう なタンパク質を超発現させる。治療用遺伝子はまた、安定性が強化されるかまた は安定性が修飾された細胞性タンパク質の突然変異体をコードし得る。タンパク 質産物はまた、ターゲット細胞に対して異種（ヘテロロガス）であってもよい。 この場合、発現されたタンパク質は、例えば細胞の欠損活性を補完もしくは付与 するか（ミオパシーまたは酵素欠損の治療）、または、例えば腫瘍の治療におい て病気に対する抵抗力を強化するかもしくは免疫応答を刺激する。これは、癌ま たは再発狭窄症を治療する自殺遺伝子（ヘルペスのチミジンキナーゼ）を包含し 得る。 核酸は好ましくは更に、治療用遺伝子及び／または抗原性ペプチドをコードす る遺伝子を組織内で発現させ得る配列及び／または発現を促進する配列を包含す る。これは、配列がトランスフェクト細胞中で機能し得るならば考察される遺伝 子の発現を天然に担当する配列であってもよい。また、異なる起原の配列（他の タンパク質の発現を担当する配列または合成配列）で あってもよい。特に、真核性またはウイルス性のプロモーター配列であってもよ い。例えば、トランスフェクトを望む細胞のゲノムに由来のプロモーター配列で あってもよい。真核細胞プロモーターとしては、遺伝子を特異的に発現させる誘 導配列または抑制配列を使用し得る。プロモーターは強弱に関わりなくまたは構 成性であるか誘導性であるかに関わりなく使用し得る。遍在性（構成性）プロモ ーターとしてはＨＰＲＴ、ビメンチン、α−アクチン、チューブリンなどのプロ モーターがある。（延長因子−１−α、ｆｌｔ，ｆｌｋのような）組織特異的プ ロモーターも使用し得る。誘導性プロモーターとしては、ホルモン応答性プロモ ーター（ステロイドレセプター、レチノール酸レセプター、など）のようなホル モン応答性プロモーター、または、抗生物質（テトラサイクリン、ラパマイシン 、など）もしくは他の天然もしくは合成の分子によって調節されるプロモーター がある。また、ウイルスのゲノムに由来のプロモーター配列がある。これに関し ては例えば、ＥＩＡ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ遺伝子などのプロモーターがある 。更に、これらの発現配列は、条件付き、一過性または一時的発現、組織特異的 発現または普遍的発現などを許容する活性化、調節配列の付加によ って修飾できる。 更に、核酸はまた、特に治療用遺伝子の上方に、合成された治療用物質をター ゲット細胞の分泌ダクトに案内するシグナル配列を含み得る。このシグナル配列 は治療用物質の天然シグナル配列でもよいが、任意の他の機能性シグナルまたは 人工シグナル配列でもよい。核酸はまた、合成された治療用物質を特定の細胞区 画、例えばミトコンドリア性遺伝病の治療のためにはミトコンドリアに案内する シグナル配列を含む。 治療用遺伝子及び遺伝子産物 本発明の治療用物質としては特に、酵素、血液タンパク質、インスリンまたは 成長ホルモンのようなホルモン、リンホカイン、インターロイキン、インターフ ェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など（フランス特許第９２０３１２０号）、増 殖因子、例えばＶＥＧＦまたはＦＧＦのような血管新生促進因子がある。 神経障害治療用には、神経伝達物質もしくはそれらの前駆物質をコードする遺 伝子、または、神経伝達物質、栄養因子、特に神経変性疾患、外傷もしくは傷害 によって生じた神経系の損傷、網膜変性の治療用の神経栄養因子を合成する酵素 をコードする遺伝子を本発明のシステムによってデリバリーできる。例 えば、神経栄養因子のファミリーに属する因子の非限定例は、神経増殖因子（Ｎ ＧＦ）、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ３ ）、ＮＴ４／５、ＮＴ６（対立形質変異体及び同じ遺伝子ファミリーの因子を含 む）である。他のニューロトロフィンは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ア キソカイン、白血病阻害因子のような毛様体神経栄養因子のファミリーに属する 因子を包含する。その他の因子としては、ＩＬ６及び近縁のサイトカイン；カル ジオトロフィン及びその近縁遺伝子；グリア由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）及 びその近縁遺伝子；ＩＧＦ−１、ＩＦＧＦ−２のようなインスリン様増殖因子（ ＩＧＦ）のファミリーに属する因子；ＦＧＦ１（酸性ＦＧＦ）、ＦＧＦ２、ＦＧ Ｆ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９などのよ うな線維芽細胞増殖因子のファミリーに属する因子；ＴＧＦβのような腫瘍増殖 因子のファミリーに属する因子；ＨＡＲＰ／プレイオトロフィンまたは骨成長因 子：造血因子などがある。 他の有益な遺伝子は、ジストロフィンまたはミニジストロフィン（フランス特 許第９１１１９４７号）またはα−１−アンチトリプシンのような分泌型及び非 分泌型の治療に有益な筋肉 タンパク質をコードしている。 他の有益な遺伝子は、血液凝固に関与する因子即ちＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子 、ＩＸ因子；自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）；ヘモグ ロビン遺伝子または他のタンパク質キャリアをコードしている。 更に別の実施態様では、脂質の代謝に関与するタンパク質、例えば、アポリポ タンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、Ｂ、Ｃ−Ｉ、Ｃ−ＩＩ、Ｃ−ＩＩＩ、 Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びａｐｏ（ａ）から選択されたアポリポタンパク質に 対応する遺伝子、あるいは、代謝調節酵素、例えば、リポタンパク質リパーゼ、 肝性リパーゼ、レシチンコレステロールアシルトランスフエラーゼ、７−アルフ ァーコレステロールヒドロキシラーゼ、ホスファチジン酸ホスファターゼに対応 する遺伝子、あるいは、コレステロールエステル運搬タンパク質、リン脂質運搬 タンパク質のような脂質運搬タンパク質、ＨＤＬ結合タンパク質に対応する遺伝 子、あるいは、ＬＤＬレセプター、キロミクロンレムナントのレセプター、スカ ベンジャーレセプター、などのようなレセプターから選択されたレセプター、な どに対応する遺伝子をデリバリーし得る。更に、肥満症治療用レプチンもある。 またｐ５３抗腫瘍遺伝子またはＨＳＶ−ｔｋのような他の腫瘍サプレッサー、ま たは平滑筋中の細胞増殖を制限するＧＡＸタンパク質（再発狭窄症の治療）があ る。 他の有益な遺伝子は、血管新生促進因子、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧ Ｆ、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−３、血小板増殖因子）及びアンギオスタチンであ る。また、血管新生ｋインヒビター、特に腫瘍血管新生のインヒビター、例えば 、血管新生促進因子の可溶性レセプター、血管新生促進因子レセプターの特異的 インヒビター（Ｔｉｅ２、ウロキナーゼレセプター、ｆｌｔ１、ＫＤＲ）、血管 新生促進因子に対する抗体（一本鎖Ｆｖ抗体を含む）（例えば抗−ＶＥＧＦまた は抗−ＦＧＦ）、抗インテグリン抗体、内皮腫瘍特異的毒素、血管新生のポリペ プチドインヒビター（ウロキナーゼのアミノ末端フラグメント−ＡＴＦ、アンギ オスタチン、エンドスタチン、インターフェロンαまたはβ、インターロイキン −１２、血小板因子４、ＴＮＦα、トロンボスボンジン、血小板活性化因子（Ｐ ＡＩ）−１、ＰＡＩ２、ＴＩＭＰ１、プロラクチンフラグメントなどをコードす る遺伝子をデリバリーできる。 組織によって分泌されるかまたは組織によって産生され得る 別のタンパク質またはペプチドとしては特に、抗体、一本鎖抗体の可変フラグメ ント（ＳｃＦｖ）、または、例えば感染性疾患、腫瘍、多発性硬化症のような自 己免疫疾患を治療する免疫療法に使用できる認識能力をもつ他の任意の抗体フラ グメント（抗イディオタイプ抗体）がある。他の有益なタンパク質の別の非限定 例としては、例えば、ＣＤ４可溶性レセプターまたは抗−ＨＩＶ治療用のＴＮＦ 可溶性レセプター、リューマチ様関節炎治療用の可溶性ＴＮＦレセプター（特に 可溶性ＴＮＦαレセプター）及び筋無力症の治療用のアセチルコリン可溶性レセ プター；基質ペプチドもしくは酵素インヒビター、または、喘息、血栓症、再発 狭窄症、転移もしくは炎症を治療するためのレセプターアゴニストペプチドまた はアンタゴニストペプチドもしくは接着タンパク質（例えば、Ｔｈ１細胞応答を 低下させるＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３）；人工タンパク質、キメラタ ンパク質もしくは末端欠失タンパク質がある。 有益な必須ホルモンとしては、糖尿病の場合のインスリン、成長ホルモン及び カルシトニンがある。 また、抗腫瘍性または抗感染性の免疫応答を促進するためには、ＩＬ−２、Ｉ Ｌ−１２のような免疫促進サイトカイン、コ ロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦＮＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ炎 症性因子（ＭＩＰ１、ＭＩＰ２）、樹状細胞活性化因子（ｆｌｔ３リガンド）を コードする遺伝子を供給し得る。 その他の有益な遺伝子は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｖ．Ａ．Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ（ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ ｍａｎ，ｃａｔａｌｏｇｓ ｏｆ ａｕｔｏｓ ｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ，ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ，ａｎ ｄ Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｅｉｇｈｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ．Ｊｏｈｎ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８） ）、及び、Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ｊ．Ｂ．ら（Ｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂａｓ ｉｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄｄｉｓｅａｓｅ，Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ ．ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９８３））によって記載されている。有益な遺伝 子は、アミノ酸、脂質及びその他の細胞構成成分の代謝に関与するタンパク質を 包含する。 従って有益な遺伝子の非限定例としては、フルクトース−１−ホスフェートア ルドラーゼ、フルクトース−１，６−ジホスファターゼ、グルコース−６−ホス ファターゼ、リソソーム− ａ−１，４−グルコシダーゼ、アミロ−１，６−グルコシダーゼ、アミロー（１ ，４：１，６）−トランスグルコシダーゼ、筋ホスホリラーゼ、筋ホスホフルク トキナーゼ、ホスホリラーゼ−ｂ−キナーゼ、ガラクトース−１−ホスフェート ウリジルトランスフェラーゼのような糖質の代謝異常に関係する遺伝子、ピルビ ン酸デヒドロケナーゼ複合体、ピルビン酸カルボキシラーゼ、２−オキソグルタ レートグリオキシラーゼカルボキシラーゼ、Ｄ−グリセレートデヒドロゲナーゼ のようなすべての酵素に関係する遺伝子がある。 有益な遺伝子としてはまた： −アミノ酸の代謝異常に関係する遺伝子、例えば、フェニルアラニンヒドロキ シラーゼ、ジヒドロビオプテリンシンテターゼ、チロシンアミノトランスフェラ ーゼ、チロシナーゼ、ヒスチジナーゼ、フマリルアセトーアセターゼ、グルタチ オンシンテターゼ、ｇ−グルタミルシステインシンテターゼ、オルニチン−ｄ− アミノトランスフェラーゼ、カルバモイルホスフェートシンテターゼ、オルニチ ンカルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノスクシネートシンテターゼ、ア ルギニノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−リシンデヒドロゲナーゼ、 Ｌ −リシンケトグルタレートレダクターゼ、バリントランスアミナーゼ、ロイシン イソロイシントランスアミナーゼ、分枝鎖をもつ２−ケト酸デカルホキシラーゼ 、イソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、 ３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡリアーゼ、アセトアセチル−Ｃ ｏＡ−３−ケトチオラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマ ロニル−ＣｏＡムターゼ、ＡＴＰ：コバラミンアデノシルトランスフェラーゼ、 ジヒドロ葉酸レダクターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、シスタチ オニンβ−シンテターゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ複合体、グリシン開裂系 に属するタンパク質、β−アラニントランスアミナーゼ、血清カルノシナーゼ、 脳ホモカルノシナーゼ； −脂肪及び脂肪酸の代謝異常に関係する遺伝子、例えば、リポタンパク質リパ ーゼ、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、その他のアポリポ タンパク質、レシチンコレステロールアセチルトランスフェラーゼ、ＬＤＬレセ プター、肝ステロールヒドロキシラーゼ、"フィタン酸"ａ−ヒドロキシラーゼ； −リソソーム欠損に関係する遺伝子、例えば、リソソーム− ａ−Ｌ−イズロニダーゼ、リソソームイズロネートスルファターゼ、リソソーム ヘパラン−Ｎ−スルファターゼ、リソソーム−Ｎ−アセチル−ａ−Ｄ−グルコサ ミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ：リソソームａ−グルコサミン−Ｎ−アセチルト ランスフェラーゼ、リソソーム−Ｎ−アセチル−ａ−Ｄ−グルコサミン−６−ス ルファターゼ、リソソームガラクトサミン−６−スルフェートスルファターゼ、 リソソーム−β−ガラクトシダーゼ、リソソームアリールスルファターゼＢ、リ ソソーム−β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニル−ホスホロトラ ンスフェラーゼ、リソソーム−ａ−Ｄ−マンノシダーゼ、リソソーム−ａ−ノイ ラミニダーゼ、リソソームアスパルチルグルコサミニダーゼ、リソソーム−ａ− Ｌ−フコシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、リソソーム酸セラミダーゼ、リソソ ームスフィンゴミエリナーゼ、リソソームグルコセレブロシダーゼ及びリソソー ムガラクトセレブロシダーゼ、リソソームガラクトシルセラミダーゼ、リソソー ムアリールスルファターゼＡ、ａ−ガラクトシダーゼＡ、リソソーム酸−β−ガ ラクトシダーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡのα鎖がある。 有益な遺伝子の非限定例としてはまた、ステロイド及び脂質 の代謝異常に関係する遺伝子、プリン及びピリミジンの代謝異常に関係する遺伝 子、ポルフィリン及びヘムの代謝異常に関係する遺伝子、結合組織、筋肉及び骨 の代謝異常に関係する遺伝子、血液疾患、造血器官疾患、筋疾患（ミオパシー） 、神経系疾患（神経変性疾患）または循環系疾患（例えば虚血及び狭窄症）に関 係する遺伝子がある。 上記及び下記の多くの実施例は、本発明の可能な適用範囲を示す。以下の実施 例は以下の因子の各々の発現を証明する。 ＮＴ３の電気導入 筋肉組織への電気導入に極めて望ましい遺伝子はニューロトロフィン３（ＮＴ ３）である。アデノウイルスベクターまたは非ウイルスベクター中の筋肉内にデ リバリーされたＮＴ３がｐｍｎマウスの生存率を向上させることは既に知見され ている（Ｈａａｓｅら,Ｎａｔｕｒｅ ３：４２９−４３６，１９９７）。この マウスは"ルー・ケーリッグ病"という通称で知られた筋萎縮性側索硬化症（ＡＬ Ｓ）の有用な動物モデルである。この潜行性疾患のＮＴ３遺伝子治療は、この栄 養因子の適正な再現的発現を確保するＮＴ３の電気導入によって大いに促進され ると期待されている。 酸性ＦＧＦまたはＶＥＧＦの電気導入 筋肉組織に対する電気導入に極めて望ましい別の遺伝子は酸性ＦＧＦ（ａＦＧ Ｆ；ＥＣＧＦ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。これらの因子はい ずれも動脈閉塞性疾患の治療に有効であることが知見されている。この疾患に対 する電気導入増進を伴うａＦＧＦまたはＶＥＧＦによる遺伝子治療は血管増殖の 効率を更に向上させると期待されている。調整的に、特に活性心臓調整を介して 電界を印加することによって心臓動脈閉塞性疾患の治療が可能であろう。 治療用核酸はまた、ターゲット細胞中で発現するとターゲット細胞が細胞ｍＲ ＮＡ転写の遺伝子発現をコントロールできるようになる遺伝子またはアンチセン ス配列でもよい。このような配列は例えば、細胞ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡター ゲット細胞に転写され、欧州特許第１４０，３０８号に記載の方法に従ってタン パク質の翻訳を阻止する。治療用遺伝子としてはまた、ターゲットＲＮＡを選択 的に破壊し得るリボザイムをコードする配列がある（欧州特許第３２１，２０１ 号）。 免疫原性遺伝子及びワクチン 上述のように、核酸は更に、ヒトまたは動物の体内で免疫応 答を誘発し得る免疫原性または抗原性のペプチドをコードする１つまたは複数の 遺伝子を含み得る。この特定実施態様によれば、本発明は、ヒトまたは動物に使 用するための、特に微生物、ウイルスまたは癌に対するワクチンを製造したり免 疫治療を行うことが可能である。このようなワクチンとしては、エプスタイン・ バールウイルス、ＨＩＶウイルス、肝炎Ｂ型ウイルス（欧州特許第１８５，５７ ３号）、偽狂犬病ウイルス、“合胞体形成ウイルス”、他のウイルスの特異的抗 原性ペプチドまたはＭＡＧＥタンパク質のような腫瘍特異的抗原（欧州特許第２ ５９，２１２号）、または、細菌性熱ショックタンパク質のような抗主要応答を 刺激し得る抗原がある。 ベクター 本発明の方法においては、遺伝子の導入を増進し得る任意の種類のベクターま たは複数ベクターの組合せに核酸を結合し得る。これらのベクターの非限定例は 、ウイルスベクター、合成もしくは生合成物質（例えば脂質、ポリペプチド、グ リコシドまたポリマー）、または、推進薬添加もしくは非添加のビーズである。 また、遺伝子導入を増進する処置、例えば局所的もしくは全身的な適用のような 薬理的処置または酵素的、透過的（界 面活性剤の使用）、外科的、機械的、熱的もしくは物理的処置を組織に施した後 で核酸を注入してもよい。 以下の実施例は本発明を非限定的に説明する。 実施例 実施例１：標準的電気穿孔条件 例えば米国特許第５，４６８，２２３号、第５，３０４，１２０号、第５，５ ０７，７２４号、第５，２７３，５２５号、第５，３１８，５１４号、第５，４ ３９，４４０号、第５，４６２，５２０号、第５，４６４，３８６号、第５，０ １９，０３４号及び第５，３８９，０６９号並びに国際特許公開ＷＯ９７／０７ ８２６で使用される標準的電気穿孔条件を試験した。試験したこれらの条件は、 より詳細に後述するように、横紋筋への核酸（プラスミドＤＮＡ）導入の効率が 低いこと、ときには阻害性であることが判明した。 材料及び方法 この実施例では以下の材料を使用した。 ＤＮＡ ｐＸＬ２７７４（特許ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１４１４）は、ルシフェ ラーゼのリポーター遺伝子を含むプラスミドＤＮＡである。他の材料は、ケタミ ン、キシラジン、生理的食塩水 （０．９％ＮａＣｌ）などの市販品として入手し得る。 オシロスコープ及び市販の電気パルス（矩形または方形パルス）発生器（エレ クトロパルセーターＰＳ １５，Ｊｏｕａｎ，フランス）を使用した。使用した 電極は、電極間距離５．３ｍｍのステンレススチールの平面電極である。 実験はＣ５７Ｂｌ／６マウスで実施した。種々のケージのマウスを実験前に無 作為に分配した（"ランダム化"）。 ケタミンとキシラジンとの混合物でマウスに麻酔をかけた。プラスミド溶液（ ０．９％ＮａＣｌ中に濃度５００μｇ／ｍｌの溶液を３０μｌ）をハミルトン注 射器で皮膚から左右の後肢の脛骨上端筋に体長方向で注入した。２つの電極に導 電性ゲルを塗布し、プラスミド注入後の後肢を電極に接触させて電極間に配置し た。 注入の１分後、方形パルスの発生器を使用して筋肉の軸に垂直に電気パルスを 印加した。電界の強度（ボルト）（実施例に示した値は最大値を表す）、１Ｈｚ で送出されるパルスの持続時間（ミリ秒）及び周波数（ヘルツ）をオシロスコー プによって確認し得る。８パルスを連続的に印加した。 筋肉のトランスフェクションを評価するために、プラスミド 投与の７日後にマウスを安楽死させた。左右の後肢の脛骨上端筋を摘出し、計量 し、溶解バッファに入れて粉砕した。得られた懸濁液を遠心して透明な上清を得 た。基質が溶液に全自動的に添加される市販の光度計を使用して１０μｌの上清 のルシフェラーゼ活性を測定した。全量の懸濁液を使用したときの筋肉の発光反 応の強度をＲＬＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｕｎｉｔ， 相対的光量）で表す。５匹の動物に両側性注入を行うことによって各実験条件を １０点で試験した。ノンパラメトリックテストによって統計的比較を行った。 結果及び考察 一次目盛または対数目盛の２つの図によって結果を表す。 この第一実験では、腫瘍の電気穿孔に使用される条件である８００〜１，２０ ０ボルト／ｃｍの電界の効果を試験した（Ｍｉｒら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２７，６８，１９９１；米国特許第５，４６８，２２３号）。 図１によれば、電気パルス非使用でＤＮＡを注入した対照グループに比較する と： １，２００ボルト／ｃｍで持続時間０．１ミリ秒の８パルスを印加した場合、 ルシフェラーゼ活性の平均値が極めて顕著に 低下した； １，２００ボルト／ｃｍで１ミリ秒のパルスを印加した場合、３匹の動物が死 亡し、ルシフェラーゼ活性の平均値が極めて顕著に低下した； ８００ボルト／ｃｍで１ミリ秒のパルスを印加した場合もルシフェラーゼ活性 の平均値が有意に低下した； ことが観察される。 電界の作用を受けた筋肉はその大部分が肉眼に明らかな変質を生じていた（砕 け易く白っぽい外観）。実施例２：核酸の電気導入 この実験はＣ５７Ｂ１／６マウスで実施した。パルスの電界強度及びパルスの 持続時間以外の処理条件は実施例１の条件であった。 結果を図２に示す。実施例１の結果が再現された。即ち、８００ボルト／ｃｍ で持続時間１ミリ秒の８パルスのシリーズは筋肉内で検出されるルシフェラーゼ 活性に阻害効果を与えた。６００ボルト／ｃｍの電界でも同じ阻害及び筋肉組織 の同じ変質が観察された。しかしながら、この電圧でパルス幅を短縮すると、Ｄ ＮＡ導入が増進され、しかも、組織損傷が容易に回避 される。他方で、極めて予想外の注目すべき結果として、より低い電圧を印加し た場合に肉眼で観察できる筋肉の変質が生じない。更に、４００〜２００ボルト ／ｃｍでは筋肉の平均トランスフェクションレベルが、電界を作用させない筋肉 の平均トランスフェクションレベルを上回ることが観察された。注目すべきは、 ２００ボルト／ｃｍの電界を印加した場合のルシフェラーゼ活性の値の分散が、 （電界を作用させない）対照グループよりも有意に低下していたことである（こ の電界の存在下のＳＥＭは平均値の２０．５９％であり、電界の非存在下では４ ３．３２％であった（図２Ａ））。 当業者には容易に確認できるであろうが、これらのデータは、本発明のシステ ム及び装置を提供するように従来技術の電気導入装置を本発明の知見に従って改 造できることを示す。改造は容易であるが、改造によってもたらされた結果は予 想をはるかに上回る。本発明のシステムまたは装置は核酸導入の効率及び再現性 の双方で本実施例及び以下の実施例で報告されたような予想外の増進を生じる。実施例３：電気導入はトランスジーンの発現を増進する。 この実験はＣ５７Ｂｌ／６マウスで実施した。パルスの電界 強度とパルスの持続時間及びＤＮＡ注入の２５秒後にパルスを供給すること以外 の処理条件は先行実施例と同じであった。 結果を図３に示す。発現されたルシフェラーゼトランスジーンの平均値は、２ ００ボルト／ｃｍで持続時間５ミリ秒のパルス以後増加し、１００ボルト／ｃｍ で持続時間２０ミリ秒のパルスによって顕著に増加した。 この実験もまた、筋肉へのＤＮＡエレクトロトランスフェクションによって得 られたルシフェラーゼ活性の平均値が、２００〜１００ボルト／ｃｍの電圧を使 用したときに電気パルスの持続時間の関数であることを示す。また、エレクトロ トランスフェクトされた筋肉のグループでは数値の分散が顕著に小さいことも観 察される（図３Ａ）。電気パルスの非存在下（対照）のＳＥＭは平均値の７７． ４３％であるが、相対的ＳＥＭは、２００ボルト／ｃｍ、パルス時間５ミリ秒の 電界条件下で１４％に低下し、２００ボルト／ｃｍ、パルス時間２０ミリ秒の電 界条件下で４１．２７％に減少し、１００ボルト／ｃｍで電気導入したときは３ ０％〜４８％の範囲である。 この実験を最適条件下で行うとき、トランスジーンの発現は電気パルスの非存 在下で注入を行った対照の８９．７倍に増加 した。実施例４：２００倍の発現増加 この実験はＤＢＡ２マウスで実施し、電界強度２００ボルト／ｃｍで種々の持 続時間の電気パルスを使用した。この実験のその他の条件は実施例３の条件に等 しい。 この実施例は、ルシフェラーゼ活性のトランスフェクションが２００ボルト／ ｃｍでパルスの持続時間５ミリ秒から増加を開始し、持続時間の延長に伴って増 加が継続することを示す（図４及び図５）。また、ＳＥＭによって表される個体 間の分散がエレクトロトランスフェクトされない対照に比べて小さいことが観察 された。ＳＥＭの相対値は対照では３５％に等しいが、それぞれ１、５、１０、 １５、２０及び２４ミリ秒のパルスシリーズを使用した場合には２５、２２、１ ６、１８、１６及び２６％である。この実験を最適条件下で行うとき、トランス ジーンの発現は電気パルスの非存在下で注入を行った対照の２０５倍に増加した 。これらの結果は、これらの実施例に記載の条件下の電気導入が効率及び再現性 の双方を大きく改良することを証明する。実施例５：電気導入効率の定量化 図５は、“パルス数×電界強度×各パルスの持続時間”の積に対応するパラメ ーターの重要性を表す。このパラメーターは実際には、電界の変化を表す関数の 時間依存性の積分に対応する。 図５のデータは、実験２、３及び５によって得られた結果を表す。電界強度２ ００Ｖ／ｃｍ及び１００Ｖ／ｃｍまたは電界非存在下で評価した。データは、ト ランスフェクション効率が電界の印加時間の合計と電界強度との積の関数として 増加することを示す。“電界×パルスの持続時間の合計”の積が１ｋＶ・ｍｓｅ ｃ／ｃｍを上回る値のとき増進効果が得られる。好ましい実施態様によれば、" 電界×パルスの持続時間の合計"の積が５ｋＶ・ｍｓｅｃ／ｃｍ以上の値になる と促進効果が得られる。実施例６：電気導入の広い使用適性 上記の実施例２−５の結果を確認するために更に実験を行った。実際、マウス 、ラット及びウサギにおいて低電圧の電気パルスの使用によって顕著で再現的な 遺伝子導入の増進が観察された。使用した条件は、腫瘍、皮膚または肝細胞のよ うな他の試験細胞型に対して従来は無効であると記載されていた条件で ある。 この実施例では以下のパラメーターを変更して試験した： −電界の特性値：マウス脛骨筋に対する最適条件を電圧／ｃｍ、パルスの数、周 波数、持続時間を、２００Ｖ／ｃｍ、２０ミリ秒、１〜２Ｈｚの８パルスと規定 する。 −電極の形状／種類：殆どの実験には非侵入性の平面電極を使用した。針電極の 良否をウサギの実験で証明した。 −ＤＮＡの量（マウス脛骨筋に対する最適導入条件を使用したとき）； −種々のＤＮＡバッチ； −種々のリポーター遺伝子：ルシフェラーゼ、ＬａｃＺ（マウス）、ＦＧＦ（ラ ット）； −種々の動物種：マウス、ラット、ウサギ； −種々の注入部位：マウスの脛骨筋、腓腹筋、四頭筋、ラットの脛骨筋、ウサギ の脛骨筋、四頭筋及び三頭筋； −パルス部位と注入部位との間隔； −電気パルス印加と注入とのタイミング； −複数の実験者による注入及びパルス印加。 観察結果を以下に示す： −ヌードＤＮＡの単独注入に比較して遺伝子導入の有意な増加：対照のレベル次 第で、マウス筋肉では５−１０から１００倍以上、ラットでは１００倍から２５ ０倍の増加、ウサギでは１００倍から５０，０００倍の増加； −結果の動物間分散／変動の有意な減少：電気パルスはＤＮＡ注入直後に同じ部 位に注入しなければならない。ＤＮＡベクターはパルスの３０分前以内に投与す れば応答が顕著に減少しない。従って、近接の多数部位にＤＮＡの多数注入を行 った後で単一パルスを供給し得る； −マウスをＬａｃＺで試験し、次いで組織学的分析を行うと、この手順で遺伝子 を発現する筋肉線維が１０倍に増加したことが確認された。ラットをＦＧＦで試 験したデータも発現細胞数の有意な増加を示した； −分泌アルカリホスファターゼ、分泌リポータータンパク質遺伝子を使用した実 験は、血清中で定量した分泌タンパク質の増加率が対数２であることを示した； −トランスフェクション効率のサイズ逆依存性：小さいプラスミドの方が効率的 にトランスフェクトされる。しかしながら、電気導入装置はＤＮＡのサイズに関 わりなくＤＮＡ導入効率を 劇的に向上させ、従って、ＹＡＣ、コスミドまたは人工染色体によるトランスフ ェクションの重大な障害を克服する； −プロモーター及びタンパク質プロセシングに対する依存性：電気導入効率は遺 伝子発現の別のレベルの調節を行うトランスジーンプロモーターに全く依存しな い。更に、遺伝子産物中の分泌または他の調節／プロセシング配列は電気導入効 率に全く影響を与えない。 これらの実験は、電気導入にある程度の副作用は伴うが、電気穿孔条件に比べ て副作用が最小であることを示す。局部的炎症反応及び再生過程はパルスの７日 後に報告された。この炎症は軽微で可逆性であった。電気パルスはマウスに全身 的収縮を誘発する。ラットではこの効果ははるかに小さく、後肢に局限されてい る。ウサギの予備実験は、パルスを受けた筋肉グループだけが収縮を生じること を示す。麻酔をかけたラットまたはウサギは明らかな疼痛反応（悲鳴）を全く示 さなかった。麻酔から覚醒中の動物はいすれも、治療した後肢の明らかな疼痛を 示さなかった。 これらの実験は、本願に記載の条件下で使用した電気導入装置が核酸導入、実 験間分散の減少、副作用の抑制または除去、 などの点で優れていることを示す。これらの結果を以下の実施例でより詳細に記 載する。実施例７：パルス持続時間の関数として示されるトランスフェクション この実施例は、電気導入条件下のパルス持続時間の延長がトランスフェクショ ン効率に与える効果を示す。 Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ／ＢＴＸ Ｔ８２０パルス発生器（ＢＴＸ、Ｇｅｎｅ ｔｒｏｎｉｃｓの子会社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用した以外は、Ｃ５ ７Ｂｌ／６マウスに対して実施例１と同じ実験条件を使用した。ＢＴＸパルス発 生器は持続時間１００ミリ秒以下の方形パルスの印加が可能であった。プラスミ ドｐＸＬ２７７４（ＷＯ９７／１０３４３）を注入した（１５μｇ）。２００Ｖ ／ｃｍの一定の電界強度でパルス持続時間（Ｔ）の延長がトランスフェクション 効率を向上させることが表１から判明する。 これらのデータは、筋肉に核酸をデリバリーする電気導入装置の最適パラメー ターを設定する。このような装置は好ましくは、２０ミリ秒以上のパルスを少な くとも４パルス、好ましくは８パルスで供給する。 表１：電気導入効率のパルス持続時間依存性 筋肉あたりのルシフェラーゼ活性の平均値±ＳＥＭを１００万ＲＬＵで表す。 Ｎ＝１０。電気導入条件：電界強度２００Ｖ／ｃｍ、周波数１Ｈｚ。 これらのデータは、電気導入装置が本願に記載の最適電界強度条件下で、パル ス持続時間の延長によってＤＮＡ導入効率を更に向上させることを示す。例えば 、８パルスのシリーズでは少なくとも４０ミリ秒まで、４パルスのシリーズでは 少なくとも５０ミリ秒までの持続時間の延長は２００Ｖ／ｃｍのトランスフェク ション効率を有意に向上させる。他の電界強度に関しても同様にして装置の最適 化が可能である。実施例８：パルス数の関数として示されるトランスフェクション この実施例は、電気導入条件下のパルス数の増加がトランスフェクション効率 に与える効果を示す。 実験条件は実施例１の記載と同じであり、Ｃ５７Ｂｌ／６マ ウスを使用した。表２は、２００ボルト／ｃｍでパルス持続時間２０ミリ秒のと き、パルス数を１から２、４、６、８、１２及び１６に増加させるに伴ってトラ ンスフェクション効率が対照（電界非印加）に比べて顕著に改善され、８〜１６ パルスの範囲で最適値が得られたことを示す。また、エレクトロトランスフェク トされた全部のグループで対照（０パルス）に比べて分散（Ｓ．Ｅ．Ｍ）が減少 している。 表２：トランスフェクション効率対パルス数 筋肉あたりのルシフェラーゼ活性の平均値±ＳＥＭを１００万ＲＬＵで表す。 各グループのＮ＝１０。電界強度２００Ｖ／ｃｍ、周波数１Ｈｚ。 これらのデータは、電気導入装置がパルス数の増加に伴ってＤＮＡ導入効率を 向上させることを示す。試験した電界条件下（２００Ｖ／ｃｍ）で、装置は好適 には４パルス以上、より好ましくは８パルス以上を供給する。パルス数を増減す ることに よって、電気導入装置は核酸導入効率を調節し、これによって発現レベルを調節 し得る。実施例９：周波数の関数として示されるトランスフェクション この実施例は、パルスの周波数の増加がトランスフェクション効率を向上させ ることを示す。臨床使用においては、より高い周波数のパルスを印加する電気導 入装置は電界印加の合計時間を短縮するので患者の苦痛を軽減し得る。従って、 周波数を増加させることによって、導入効率の向上及び患者の苦痛軽減の双方が 達成される。 実験条件は実施例１の記載と同じであり、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを使用した。 プラスミドｐＸＬ２７７４（１５μｇ）を注入した。電界強度２００ボルト／ｃ ｍ、持続時間は２０ミリ秒の４または８パルスの周波数を０．１から４ヘルツま で変更した。結果を表３に示す。 表３：トランスフェクション効率対周波数（Ｈｚ） 筋肉あたりのルシフェラーゼ活性の平均値±ＳＥＭを１００万ＲＬＵで表す。 各グループのＮ＝１０。電界強度２００Ｖ／ｃｍ、パルス長さ２０ミリ秒。 結果は、試験した電気導入条件下で高い周波数（１Ｈｚ以上、好ましくは２Ｈ ｚ以上）がトランスフェクション効率を向上させることを示す。 実施例１０：時間に伴って指数関数的に減衰する電界を用いたエレクトロトラン スフェクション この実施例は、指数関数的に減衰する電界の印加がｉｎ ｖｉｖｏ核酸導入効 率に与える効果を示す。 この実験ではＣ５７Ｂ１／６マウスを使用した。修飾された Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（ｐＧＬ３；Ｇｅｎｂａｎｋ アクセス番号ＣＶＵ４７２９５）を、サイトメガロウイルスの初期（ＣＭＶ ＩＥ）プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＨＳ５ＩＥＥ）及びＳＶ４０ ウイルス（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＳＶ４ＣＧ）のポリアデニル化シグナル のコントロール下に導入することによってプラスミドｐＸＬ２７７４から得られ たプラスミドｐＸＬ３０３１（図１２）をこの実験に使用した。１０μｇのＤＮ Ａを注入した。 使用した市販の電気パルス発生器（Ｅｑｕｉｂｉｏエレクトロパルセーター， モデルｅａｓｙｊｅｃｔＴ Ｐｌｕｓ，ＫｅｎｔＵＫ）を、時間に伴って指数関 数的に減衰する電界のパルスを発生するように設計した。記録された印加電圧は 指数関数のピーク電圧である。調整自在な第二のパラメーターはキャパシタンス （μＦ）であり、これは、送出されるエネルギー量を調節し得る。 表４は、指数関数的に減衰する電界のパルスを印加すると、電界非印加の場合 に比べてトランスジーンの発現の極めて顕著な増加が得られることを示す。この 結果は種々の電圧で指数関数の種々の時定数に対応する種々のエネルギーに対し て得られ る。エネルギーは器具の調整自在なキャパシタンスによって増減できる。この実 験で確定されたパラメーターを電気導入装置に応用できる。 表４：時間に伴って指数関数的に減衰する電界を用いたトランスフェクションの 効率（対照に比べたルシフェラーゼ活性） 電気導入非使用条件下のプラスミドｐＸＬ３０３１の注入によって得られた対 照レベルに比べたルシフェラーゼ発現レベルの増加。発現レベルの増加の平均値 を表す。試験あたりのマウス数Ｎ＝４〜６。 比較によれば、２００Ｖ／ｃｍ、各２０ミリ秒、周波数１Ｈｚの８パルスの方 形波パルスを用いたルシフェラーゼ活性の増加は４４であった。 これらのデータは、時間に伴って指数関数的に減衰する電界を印加する電気導 入装置が、低い電界強度及び高いキャパシタンス（例えば２００Ｖ／ｃｍ、３， ０００μファラッドのキャパシタンス）で発現を増進し得ることを示す。実施例１１：１つの短い高電圧パルスと複数の長い低電圧パルスとの組合せ この実施例は、送出される電界が、短い持続時間例えば５０または１００μ秒 の持続時間で５００〜８００ボルト／ｃｍの少なくとも１つの高い電界と、より 長い持続時間、この実施例では例えば１ミリ秒以上で９０ミリ秒未満の少なくと も１つの低い電界（＜１００ボルト／ｃｍ）との組合せから成ってもよいことを 示す。低い電界値は８０Ｖ／ｃｍであり、各々の持続時間９０ミリ秒で１ヘルツ の４パルスとして印加される。この実験には２つの市販の電気パルス発生器を使 用した（Ｊｏｕａｎ及びＧｅｎｔｒｏｎｉｘ）。一方のパルス発生器によって電 圧を送出し、次いで動作構成を手動で変更することによって１秒以内に他方のパ ルス発生器によって電極板に電圧を印加した。使用したルシフェラーゼをコード するプラスミドはプラスミドｐＸＬ３０３１であり、注入した量は３μｇであっ た。電界強 度の値を表５に示すように変更した。この実験のその他の条件は実施例１に記載 の条件にした。 表５に実験をまとめる。データは、対照グループ（電界非印加）に比べて１つ の短い高電圧パルスまたは連続する４つの長い低電圧パルス、または、低電界パ ルスの印加後の高電界パルスの印加の組合せは、トランスフェクション効率を殆 ど向上させなかったことを示す。逆に、１つの短い高電圧パルスの印加後の８０ Ｖ／ｃｍ、９０ミリ秒の持続時間、１Ｈｚの４パルスを組合せた実験では、対照 グループに比べてＤＮＡの導入効率が極めて顕著に向上した。これらのデータか ら、好ましい電気導入装置は、より高い電界強度のより短いパルスのシリーズを 供給すると考えられる。 表５：種々の強度及び時間のパルスの組合せ 前出の実施例１に示したように、６００、８００または１，２００ボルト／ｃ ｍ、１ミリ秒、周波数１Ｈｚの８パルスの印加は筋肉の病変を惹起しトランスフ ェクションを阻害した。この実施例で得られた結果は、特定条件下では病変を惹 起することなく高電圧の電界強度を使用できることを示す。実際、筋肉の肉眼観 察によって検出できる病変は全く明らかでなかった。短い持続時間の高い電界の 後に長い持続時間の低い電界を使用することは、ＤＮＡの導入効率を調節する代 替的手段となり得る。実施例１２：筋肉中のルシフェラーゼ発現の動力学 本願の電気導入装置の使用は、核酸のトランスフェクション及び核酸の安定な 高レベル発現を少なくとも４カ月間持続させ 得る。 この実験にはＣ５７Ｂｌ／６マウスを使用した。プラスミドｐＸＬ２７７４（ １５μｇ）をマウスの筋肉内に注入した。ＤＮＡの注入後、以下の条件で電界を 印加した：２００Ｖ／ｃｍ；２０ミリ秒の８パルス；周波数１Ｈｚ。他の条件は 実施例１に記載の条件にした。ＤＮＡ注入後の種々の時点で１０匹のグループの マウスを殺し、ルシフェラーゼ活性を測定した。対照マウスには電界を作用させ なかった。 図６のデータは、プラスミド注入の３時間後からルシフェラーゼの発現が検出 され、３日後（Ｄ３）まで増加することを示す。ルシフェラーゼの発現は３５日 以後に減少し始める。電界で処理したグループでは、発現レベルの測定時期に関 わりなくトランスフェクションが極めて明らかに増加したことは注目に値する。 電気導入後にはトランスフェクトＤＮＡの発現が維持されていたが対照筋肉では 発現が低下し、１２１日後（Ｄ１２１）の対照グループと処理グループとの差は いっそう顕著であった。 更に注目すべきは、トランスジーンの発現レベルが１２１日後まで安定であっ た。この結果は、治療用遺伝子による長期間の臨床治療の観点から特に有利であ る。実施例１３：エレクトロトランスフェクトマウスの組織学 動力学試験の過程の組織学的分析によって、危機的な炎症応答が存在しないこ とが確認された。マクロファージ及びリンパ球の存在によって示される中程度の 炎症は観察された。この炎症反応はＤ１２１までに顕著に減少したが、トランス ジーンの発現レベルは図６に示すような安定な高い値を維持していた。 プラスミドｐＸＬ３００４（図１３）を使用した以外はこれらの条件下で組織 学的分析を確認した。このプラスミドは、β−ガラクトシダーゼをコードするプ ラスミドｐＣＯＲ（ｐＸＬ２７７４；ＷＯ９７／１０３４３参照）である。核局 在シグナル配列（Ｍｏｕｖｅｌら，１９９４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４：１８ ０−１８９参照）で修飾したｌａｃＺ遺伝子を、プラスミドｐＣＤＮＡ３（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ，オランダ）から得られたＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ポ リアデニル化シグナル（Ｇｅｎｂａｎｋ アクセス番号ＳＶ４ＣＧ）のコントロ ール下に導入することによって、プラスミドｐＸＬ２７７４を修飾した。プラス ミド投与の７日後に動物を殺した。組織学的分析によってβ−ガラクトシダーゼ トランスフェクト細胞を検出し（Ｘｇａｌ組織化学）、また、アルミ化（ａｌｕ ｍｉｚｅｄ） カラミン染色によって炎症病巣を検出し、ヘマチン−エオシン染色によって筋肉 組織状態のキャクラタリゼーションを行った。対照マウスには電界を作用させな かった。 電気透過筋肉と非透過筋肉は以下のような違いを示した： −β−ガラクトシダーゼを発現する筋原線維の数は、エレクトロトランスフェク ト筋肉（平均７６、Ｎ＝６マウス）では対照（平均８．５、Ｎ＝８マウス）の９ 倍に増加していた。これらの筋肉線維の殆どは核が周縁に局在する静止組織であ る。極めて少数の中心核をもつ筋原線維（再生中）がβ−ガラクトシダーゼを発 現している。 −電気透過筋肉中のβ−ガラクトシダーゼ発現エリアは対照の２倍（４ｍｍ）で あり、発現勾配は注入部位から下降する。 −この試験では、電気透過筋肉が、可逆数の浸潤物（マクロファージ及びリンパ 球）、中心に核をもつ多数の再生中の筋肉線維、食作用性マクロファージが充満 した多数の壊死線維を有することが注目される。炎症、壊死及び再生のゾーンは トランスフェクト筋原線維の周囲のゾーンに対応する。この応答は２週間まで継 続し、自然に回復した。筋肉の非トランスフェクト部分は良好な状態に維持され ている。 −電気非透過筋肉中では、少数の壊死筋原線維と他の再生中の筋原線維とが少数 の炎症病巣をもつ注入部位の周囲に局在している。 要約すると、これらのデータは、電気導入条件は観察可能な炎症を生じさせる が、炎症が有意でないこと、特に核酸導入効率の劇的な増進に比べれば有意でな いことを示す。更に、動力学試験のデータは、トランスジーン発現が高レベルで 安定に維持されながらも炎症が自然に回復することを示す。 実施例１４：電界印加時点に対する核酸注入時点の影響 この実施例は、組織（この場合、筋肉）に対する核酸の注入を電界印加の少な くとも３０分前に行えばよいこと、また、少なくとも１時間前でもよいことを示 す。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにプラスミドｐＸＬ２７７４（１５μｇまたは１．５μ ｇ）を筋肉内注入した。電界印加前１２０分以内または６０秒後にＤＮＡを注入 した。使用した電界条件は、２００Ｖ／ｃｍ、持続時間２０ミリ秒の８パルス、 周波数１Ｈｚであった。対照マウスには、電界を作用させないでプラスミドを注 入した。他の実験条件は実施例１の条件と同じにした。 データを表６に示す。電界印加前１時間以内にＤＮＡを注入 すると、ルシフェラーゼ発現によって検出されるトランスフェクション効率の向 上が達成された。筋肉あたり１５μｇのプラスミドという用量でも１．５μｇと いう１／１０の用量でも同様の傾向が観察された。電界印加後にプラスミドを注 入したときにはＤＮＡトランスフェクション効率の増進は全く観察されなかった 。 表６：電界の印加前及び印加後に注入されたプラスミドの電気導入効率 表６Ａ：電界の非存在下のＤＮＡ注入（対照） 表６Ｂ：電界の印加前のＤＮＡ注入 表６Ｃ：電界の印加後のＤＮＡ注入 電界の印加前１時間以内のプラスミドＤＮＡの注入がプラスミドの高レベル発 現を生じたこの観察結果と対照的に、多くの研究者はｉｎ ｖｉｔｒｏ電気穿孔 の場合には電界の印加時点にプラスミドを与える必要があることを観察していた 。実施例１５：電気導入による用量−応答 この実施例に示した統計的分析は、電気導入条件下の用量−応答を比較し得る 。この試験は、電気導入装置の使用がプラスミドの発現レベルの分散を極めて顕 著に減少させることを証明した。 ５週齢のＣ５７ＢＩｌ６マウスを使用し、細胞質発現用ルシフェラーゼトラン スジーンをＣＭＶｈプロモーターのコントロール下に含む０．２５〜３２μｇの 種々の用量のＤＮＡ（プラスミドｐＣＯＲ−ｐＸＬ３０３１）を、各ＤＮＡ用量 あたり１０匹の割合で、マウスの脛骨上端筋に両側的に注入した。ＤＮＡ の用量を０．２５から３２μｇまで変更した。注入直後に、片方の後肢に２５０ Ｖ／ｃｍの電界を２０ミリ秒及び周波数１Ｈｚの４パルスで作用させた。処理の ５日後に動物を殺し、各筋肉の組織抽出物中のトランスジーンの発現を実施例１ に記載のプロトコルで検査した。これらの電気導入条件下で、筋肉の肉眼観察に よって、処理した１５０の筋肉の組織のうちで２つの組織に僅かな熱損傷の痕跡 が存在することが判明した。 各組のマウス（ｎ＝１０）の平均の変化の関数として示される分散の変化を比 較すると、トランスジーンの発現の分布が対数正規分布であることが示される。 計算で確認した結果を示すグラフ（図７）の分析によって、発現が注入ＤＮＡの 用量の対数に対して線形変化することが確認された。 Ｃｏｃｈｒａｎテストは、どの回帰（電気導入使用及び非使用）でも分散が均 一的であるため、剰余分散を使用してすべての計算ができることを示す。線形性 に対する分散は、許容範囲５％とする場合、電気導入条件下で有意ではなかった 。これに反して、標準条件（電気導入非使用条件）下では線形性に対する分散か 極めて大きく（ｐ＜０．０１）、これは、ＤＮＡのトランスフェクション効率が 極めて不均一的であることを示す。 データは、電気導入非使用の場合の剰余分散が電気導入を使用した場合の５倍で あることを示す。 剰余分散の算定値に基づいて考えると、トランスフェクション効率の比較試験 で同じ信頼度の結果を得るために、電気導入非使用条件下では電気導入使用条件 下に比較して５倍の数の動物が必要であろう。この分析は電気導入装置を使用す る利点を明らかに示す。また、信頼度９５％でトランスジーンの発現の２、５ま たは１０倍の分散をそれぞれ証明するために必要な注入動物の数は、電気導入非 使用条件下では１６５、４０または２５匹であるのに、電気導入条件下では３３ 、８または５匹でよい。この種の計算を以下の表７にまとめる。 表７：電気導入装置による統計的な有意なプラスミド発現に必要な動物の数の計 算 これらのデータは、電気導入技術がトランスフェクション効率を顕著に向上さ せるだけでなく、応答の分散を有意に減少さ せることを示す。この方法及びこの方法の実施装置は、組織トランスフェクショ ンのより厳密な分析検査を可能にし、治療的処置の範囲内で治療用遺伝子の再現 可能なデリバリーを可能にする。 各回帰について得られた勾配の比較試験は有意でない。従って、２つの回帰は 許容範囲５％で相似であると考えることができる。相対的効力の計算は、同じ効 果を得るために、電気導入装置の使用に比較して標準条件下では筋肉あたり約２ ５０倍のＤＮＡを注入する必要があることを示す（２４３±８５；信頼区間Ｐ＝ ９５％）。この結果は、標準ＤＮＡ注入に比較して電気導入下で注入された同じ 用量のＤＮＡのトランスジーンの発現が約５００倍に増加することによって示さ れる。 この実施例は、ルシフェラーゼをコードする２つのプラスミドによってプラス ミドの注入量とエレクトロトランスフェクションとの間の有意な線形相関関係を 確認し得ることを示す。この相関関係は電気導入の非存在下でははるかに小さい 。統計的分析はまた、エレクトロトランスフェクトグループでは分散が有意に減 少していることを示す。従って、本発明の電気導入装置を使用し、プラスミドの 注入量を増減することによってトラ ンスジーンの発現レベルを有効にかつ予測的に調節することが可能である。実施例１６：種々の電極による電気導入 この実施例は、２種類の電極、即ち、平面電極及び針電極の一方を備えた電気 導入装置が核酸導入効率に与える効果を比較する。針電極は更に、種々の刺し込 み方向で試験した。 プラスミドｐＸＬ２７７４（１５０μｇ）をラットの三頭筋に注入した。平面 電極を実施例１に記載のように電極間距離１．２ｃｍで配置した。針電極の場合 、電極間距離は０．９ｃｍであった。針電極を注入部位の両側で筋肉線維の軸に 平行または垂直な方向で等しい長さだけ筋肉組織に刺し込んだ。電極の種類また はその方向に関わりなく、強度２００Ｖ／ｃｍ、２０ミリ秒の８パルス、周波数 ２Ｈｚという電界条件で試験した。 この実験の結果を図８に示す。データは、エレクトロトランスフェクションが 電界の印加方法に関わりなく同等であることを示した。針電極及び平面電極によ って同等のトランスフェクションレベルが得られた。更に、電気導入効率は筋肉 線維の方向に対する針電極の方向に左右されないと考えられた。 これらのデータは、電気導入装置が、ターゲット組織に対す る電極の方向に関わりなく平面電極または針電極を使用し得ることを示す。本発 明方法では、外部電極または侵入電極を使用することによって電極の方向に関わ りなく核酸を電気導入できることを示す。大きいサイズの筋肉に核酸を投与する ためには、例えば１００Ｖという中間強度の総電圧で２００Ｖ／ｃｍの電界強度 に好適な０．５ｃｍ以内に電極を確実に配置できる針電極の使用か好ましい。し かしながら、関節炎の遺伝子治療のデリバリーのように例えば指のような小さい 筋肉の場合には非侵入性の平面電極が好ましい。実施例１７：種々の筋肉及び種属に対する電気導入 この実施例は、電気導入装置が、様々な動物種の多くの異なる種類の筋肉に核 酸を電気導入するために使用され得ることを示す。 各動物属に対して表８に規定の条件を与えるように電気導入装置を調整した。 結果も表８に示す。 表８：様々な種及び筋肉に対する核酸トランスフェクションの電気導入増進 電気導入装置を使用したルシフェラーゼの発現レベルが対照（電気導入非使用 ）に比べて相対的に増加していることが示される。エレクトロトランスフェクシ ョンで得られたルシフェラーゼの発現増加率。データはグループあたり１０個の 筋肉の平均である。プラスミド投与の７日後にルシフェラーゼ活性を測定した。 また、電気導入をサル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で試験し た。線維芽細胞増殖因子１（酸性線維芽細胞増殖因子） （ＦＧＦ１またはａＦＧＦ）をコードする遺伝子を含むプラスミドｐＸＬ３１７ ９（図１１）は、ａＦＧＦのｃＤＮＡに融合したヒト線維芽細胞のインターフェ ロンのシグナルペプチド（ｓｐ−ＦＧＦ１，Ｊｏｕａｎｎｅａｕら，１９９１， ＰＮＡＳ８８：２８９３−２８９７）が、、ヒトＣＭＶ−ＩＥプロモーター及び ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのコントロール下に導入されたプラスミドｐＸ Ｌ２７７４（ＷＯ９７／１０３４３）由来のプラスミドであった。ａＦＧＦの発 現を免疫組織化学によって測定した。５００μｇのプラスミドｐＸＬ３１７９の 筋肉内注入の３日後の陽性細胞数（ａＦＧＦ発現細胞）を評価した。電界条件は 、２００Ｖ／ｃｍ、各２０ミリ秒の８パルス、周波数１Ｈｚであった。対照は電 界で処理しなかった（電気導入）。 この実験の結果を表９に示す。データは、筋肉組織へのＤＮＡ導入の効率を向 上させるために電気導入装置を使用した後にだけａＦＧＦタンパク質発現が検出 できたことを示す。注目すべきは、これらの条件下で電気導入の非存在下では発 現が全く検出できなかったことである。 表９：サル筋肉中のａＦＧＦ発現の免疫組織化学分析 サルの種々の筋肉中のａＦＧＦの発現の免疫組織化学分析。数値はａＦＧＦを コードする５００μｇのプラスミドｐＸＬ３１７９を電界印加（＋）または非印 加（−）で筋肉内に注入した３日後の陽性サンプルの数を表す。実施例１８：ラット横隔膜筋肉に対する電気導入 本発明の電気導入装置の使用によってトランスジーンを持続的にかつ安定的に 発現できるようになったことは、横隔膜の機能に影響を及ぼすある種の変性疾患 特に筋ジストロフィーの治療に重要な関係を有している。 これらの実験では、（１ｍｇ／ｋｇのラルガクチルと１５０ｍｇ／ｋｇのケタ ミンとの混合物を用いて）麻酔をかけ、横隔膜に近づくために胸骨に沿って切開 した。片側横隔膜に注入した（２０ｍＭのＮａＣｌと５％のグルコースとの溶液 ５０μｌ 中の５０μｇのプラスミドｐＸＬ２７７４）。次に、注入軌道に沿って横隔膜の 平面の両側に平面電極を電極間距離１ｍｍで配置した。以下の電界条件を使用し た：１６０Ｖ／ｃｍまたは３００Ｖ／ｃｍ、持続時間各２０ミリ秒の８パルス、 周波数１Ｈｚ。注入後１分以内に筋肉に電界を印加した。次いで動物の切開部を 縫合した。 結果を表１０に示す。 表１０：ラット横隔膜筋肉への電気導入 ルシフェラーゼ発現の値は、筋肉あたりのルシフェラーゼ活性の平均値±ＳＥ Ｍを１００万ＲＬＵで表したものである。各グループのＮ＝１２。 この実施例は、電界強度１６０Ｖ／ｃｍ、２０ミリ秒の８パルスの印加後に横 隔膜中のトランスジーンの発現が有意に向上したことを示す（マン−ホィットニ ーのノンパラメトリックテストでｐ＜０．００３）。実施例２０：分泌アルカリホスファターゼ遺伝子の電気導入 この実施例は、分泌タンパク質をコードする遺伝子をトランスフェクト及び発 現させる能力を示す。分泌タンパク質は例えば、全身性遺伝子治療の方法で使用 され、また、免疫応答を誘発するために使用される（ＤＡＮワクチン）。この実 施例で示す分泌遺伝子は血流中に高濃度で存在し、その存在が安定であることが 見された。 この実施例では、アルカリホスファターゼをコードするプラスミドｐＸＬ３０ １０（図１３）を、Ｃ５７Ｂｌ／６成体マウスの２つの脛骨上端筋のうちの片方 に注入した。プラスミドｐＸＬ３０１０は、ｐＳＥＡＰ−ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎ ｔｅｃｈ，Ｇｅｎｂａｎｋ アクセス番号ＣＶＵ０９６６０）に由来の分泌アル カリホスファターゼ（ＳｅＡＰ）をコードする遺伝子が、ＣＭＶプロモーター（ ｐＣＤＮＡ３；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，オランダ）及びＳＶ４０ポリアデニル化 シグナルのコントロール下に導入されたＣｏｌＥ１から得られた。電界の印加は 標準条件下で行った。即ち、持続時間２０ミリ秒、周波数１Ｈｚ、２００Ｖ／ｃ ｍで８個の方形パルスを、プラスミド注入の２０秒後に印加した。７日後に眼（ 眼窩後方叢の穿刺）から採取し た血液サンプルの血清アルカリホスファターゼの濃度を市販の化学発光アッセイ （ｐｈｏｓｐｈａｌｉｇｈｔ，Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈ ｕｓｅｔｔｓ，ＵＳ）で測定した。電界印加または非印加で非コーディングプラ スミド（バラストＤＮＡ）を少数の筋肉に注入すると、トランスジーンの発現に 由来しない血清アルカリホスファターゼが存在しないことが確認された。 これらの条件下の電界の印加によるトランスジーンの発現の改善効果は、プラ スミドの種々の注入量に対して明らかであった（表１１）。プラスミドの注入量 を増加することによって血清アルカリホスファターゼ濃度を増加させることが可 能であった。従来のトランスフェクションを上回る値がこの実験では注入後長期 間維持されていた。 表１１：電気導入使用または非使用のマウス筋肉によるＳｅＡＰの発現 この表は血清中のＳｅＡＰの平均値±ＳＥＭをｎｇ／ｍｌで表す。 ４００μｇのプラスミドの注入（５４μｌ中の１００μｇのＤＮＡを両側的に ３０分の間隔をおいて２回注入する）によって得られた血清アルカリホスファタ ーゼ濃度は、対照では０．０１６μｇ／ｍｌであるのに電気導入使用の場合には ２．２μｇ／ｍｌに達した。更に、プラスミドの量に関わりなくＤＮＡが一定量 （マウスあたりのＤＮＡ総量１０μｇ）となるようにバラストＤＮＡを使用する と、少量のプラスミドｐＸＬ３０１０を注入した場合（≦１μｇ）のエレクトロ トランスフェクションレベ ルが更に改善される。 また、ＳｅＡＰの発現の動力学を追跡した。ＤＮＡの用量を片側筋肉あたり１ ５μｇにして両側的に投与した（マウスあたり３０μｇ）。結果を図９に示す。 トランスフェクションの７日後にｐＸＬ３０１０の電気導入の結果として有意で 安定な血消ＳｅＡＰ濃度が観察される（少なくとも２カ月間）。 これらの結果から、本発明装置を使用して筋肉に核酸を導入すると、分泌トラ ンスジーンの安定な高レベル発現が得られることが確認される。従って筋肉を有 益な分泌タンパク質の産生器官として使用することが可能であり、また、（ジス トロフィン遺伝子または血管新生促進因子のような）筋肉自体に直接に作用する 治療用遺伝子の発現を指令することが可能である。実施例２１：エリトロポエチン遺伝子の電気導入 この実施例は、本発明の装置を使用して治療用遺伝子を筋肉に導入できること 、及び、遺伝子産物の発現が検出可能で有意な生理的応答を生じることを示す。 この場合、エリトロポエチンの発現を検出でき、発現されたタンパク質はレシピ エント動物のヘマトクリットの増加を誘発する。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの成体の脛骨上端筋にエリトロポエチンをコードする遺 伝子を含むプラスミドｐＸＬ３３４８（図１６） を片側的に注入した。プラスミドｐＸＬ３３４８は、ネズミのエリトロポエチン 遺伝子（ＮＣＢＩ；１９３０８６）が、ヒトＣＭＶ−ＩＥプロモーター及びＳＶ ４０ウイルスポリアデニル化シグナルのコントロール下に導入されたプラスミド ｐＸＬ２７７４から得られた。 プラスミドＤＮＡの注入直後に電界（２００Ｖ／ｃｍ、持続時間２０ミリ秒及 び周波数１Ｈｚの８パルス）を印加した。 この実験の結果を表１２に示す。 表１２：エリトロポエチンの発現及び効果 平均値±ＳＥＭ。グループあたりのマウス数Ｎ＝４〜５。 ２４日後、１μｇのプラスミドの注入は、従来の方法でトランスフェクトした マウスのヘマトクリットを中程度に増加させ、エレクトロトランスフェクトした マウスのヘマトクリットを極めて大きく増加させた。１０μｇのプラスミドを用 いると、対照グループのヘマトクリットが増加した。エレクトロトランスフェク トしたグループでは、ヘマトクリットが明らかに増加し、分散は減少していた。 より少ない量のＤＮＡ（１μｇ）の場合にも同様の増加が観察された。実施例２２：ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）遺伝子の電気導入 Ｃ５７Ｂｌ／６またはＳＣＩＤマウスの脛骨上端筋に１５μｇのプラスミドｐ ＸＬ３２１２（図１１）、ＶＥＧＦをコードするプラスミドｐＣ０Ｒ ｈＶＥＧ Ｆを両側的に注入した。プラスミドｐＸＬ３２１２は、ＶＥＧＦ（Ｇｅｎｂａｎ ｋ アクセス番号ＨＵＭＥＧＦＡＡ）をコードするｃＤＮＡを、ヒトＣＭＶ−Ｉ Ｅプロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのコントロール下に導入す ることによってプラスミドｐＸＬ２７７４から得られた。市販のエレクトロパル サー（Ｊｏｕａｎ）を使用し、持続時間２０ミリ秒、２５０Ｖ／ｃｍ、周波数２ Ｈｚの ８パルスでエレクトロトランスフェクションを実施した。眼窩後方叢から乾燥試 験管に血液サンプルを採取した。プラスミド注入の１日前及び７日後に血液サン プルを採取した。Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用 してヒトＶＥＧＦの免疫酵素アッセイを行った。追加のヒトＶＥＧＦシリーズを マウス血清中で実施した。このシリーズの結果を表１３に示す。 表１３：マウス血清中のヒトＶＥＧＦの発現 Ｃ５７Ｂｌ／６マウス及びＳＣＩＤマウスの血清ＶＥＧＦ濃度（ｎｇ／リット ル）。対照マウス血清はプラスミド注入の１日前に採取した。実施例２３：血液凝固ＩＸ因子の遺伝子のエレクトロトランスフェクション Ｃ５７ＢＬ６マウスまたはＳＣＩＤマウスに筋肉あたり１５ μｇの血液凝固ＩＸ因子をコードするプラスミドｐＣｏｒｈＦＩＸ（ｐＸＬ３３ ８８；図１２）を注入したこと以外は実施例２２と同じ実験条件にした。プラス ミドｐＸＬ３３８８は、ヒトＩＸ因子（クリスマス因子，Ｇｅｎｂａｎｋ アク セス番号ＨＵＭＦＩＸＡ）をコードするｃＤＮＡを、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター 及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのコントロール下に導入することによって プラスミドｐＸＬ２７７４から得られた。電気導入条件は、持続時間２０ミリ秒 、２００Ｖ／ｃｍ、周波数２Ｈｚの８パルスであった。プラスミド注入の７日後 にＩＸ因子のレベルを測定した。眼窩後方叢からクエン酸三ナトリウムを入れた 試験管に血液サンプルを採取し、試験管を冷蔵した。 以下の表（表１４）は、脛骨上端筋にｐＸＬ３３８８を注入し、本発明の電気 導入装置を使用して電界を印加したＣ５７ＢＬ６マウス及びＳＣＩＤマウスの血 液中でだけヒトＴＸ因子が検出されたことを示す。 表１４：ヒトＩＸ因子の発現 Ｃ５７Ｂｌ／６マウス及びＳＣＩＤマウスの体内のＴＸ因子の濃度 本発明の電気導入装置を使用しない場合にはマウス血液中でヒトＩＸ因子が検 出されない。実施例２４：酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）の遺伝子の電気導入 Ｃ５７ＢＬ６マウスまたはＳＣＩＤマウスに筋肉あたり１５μｇのｐＣｏｒ ＣＭＶ ａＦＧＦ（ｐＸＬ３０９６；図１４）を注入したこと以外は実施例２２ と同じ実験条件である。プラスミドｐＸＬ３０９６は、ＣＭＶ−ＴＥプロモータ ーのコントロール下のヒト線維芽細胞インターフェロンのシグナルペプチドとＦ ＧＦ１のコーディングｃＤＮＡとの融合物(ｓｐ−ＦＧＦ１，Ｊｏｕａｎｎｅａ ｕら，前出)をコードする遺伝子の下流に、 ＨＳＶのチミジンキナーゼの転写され翻訳されないリーダー配列とＳＶ４０ポリ アデニル化シグナルとが連結された三重螺旋形成配列（ＴＨ，Ｗｉｌｓら，１９ ９７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：３２３−３３０）の導入によってプラスミドｐ ＸＬ２７７４から得られた。以下の電気導入条件を使用した：持続時間２０ミリ 秒、２００Ｖ／ｃｍ、周波数２Ｈｚの８パルス。免疫組織化学によってＦＧＦの 存在を証明した。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのトランスフェクションの結果を図１０に示す。ＳＣＩ Ｄマウスの結果を表15に示す。ランダムに選択された切片中のＦＧＦ発現線維の 数に関して、ｐＸＬ３０９６の注入だけを行った対照筋肉に比べてエレクトロト ランスフェクトした筋肉は常に明らかに高い値を示した。エレクトロトランスフ ェクション後のＦＧＦの発現は８日後に最大値に達した。２１日後及び３５日後 に対照グループではＦＧＦの存在は実質的に検出不可能であったが、エレクトロ トランスフェクトしたグループでは多数の陽性線維が観察された。 表１５：ＳＣＩＤマウス体内のａＦＧＦの発現 マウス個体の各々について、免疫組織化学によって検出された筋肉切片中のａ ＦＧＦ陽性線維の数を測定した。筋肉切片は筋肉の中央部から採取した。 免疫組織化学によって判明した陽性線維数によって判定されるａＦＧＦの発現 は、電気導入装置で処理したマウスだけに検出された。ＤＮＡをより低い用量で 使用したときもより高い用量で使用したときもａＦＧＦ発現が検出された。実施例２５：神経栄養因子−３（ＮＴ３）の遺伝子の電気導入 ５週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウス及び幼若Ｘｔ／ｐｍｎマウス の脛骨上端筋に、神経栄養因子ＮＴ３をコードする１２．５μｇのプラスミドｐ ＸＬ３１４９（図１４）を片側的に注入した。ｐｍｎマウスは、運動ニューロン の急激な早期変性及び予測平均寿命約４０日を特徴とする筋萎縮性側索硬化症（ ＡＬＳ；ルー・ケーリッグ病）のモデルである。プラスミドｐＸＬ３１４９は、 ネズミのＮＴ３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ アクセス番号ＭＭＮＴ３）を、ヒトＣ ＭＶ−ＩＥプロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのコントロール下 に導入することによってプラスミドｐＸＬ２７７４から得られた。マウスの処理 の７日後にＰＢＳバッファ中の筋肉粉砕物を遠心（１２，０００ｇ）して得られ た上清中のＮＴ３の発現を検査し、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａキット ）によって定量した。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに対しては１２．５μｇのプラスミドＤＮＡを注入した 。半数のマウスには注入直後に電界（２５０Ｖ／ｃｍ、２０ミリ秒、周波数１Ｈ ｚの４パルス）を作用させた。２０の筋肉の平均について計算した９５％信頼区 間は、電気導入非使用では７７±１１ｐｇ／筋肉であり、電気導入使用では２． ７±０．９ｎｇ／筋肉であった。内因性ＮＴ３レベル は測定しなかった。 ４〜５日齢のＸｔ／ｐｍｎ異種接合マウス体内のＮＴ３の発現に関しても同様 のデータが得られた。これらのマウスには動物あたり１３０μｇのＤＮＡを注入 し、種々の筋肉に多数部位注入（腓腹筋に２５μｇ、脛骨上端筋に１２．５μｇ ）を行った。以下の電気導入条件を使用した：持続時間２０ミリ秒、５００Ｖ／ ｃｍ、１Ｈｚの４パルス。プラスミド投与及び電界印加の７日後にこれらのマウ スの体内のＮＴ３を検出した。この実験の結果を表１６に示す。 表１６：Ｘｔ／ｐｍｎマウス体内のＮＴ３の発現ＮＴ３の平均値±ＳＥＭ（筋肉あたりのｐｇまたは血漿１ｍｌあたりのｐｇ）。 ここで試験した実験条件下で、腓腹筋及び脛骨上端筋中で基底レベルのＮＴ３ を検出した。標準ＤＮＡ導入条件下でプラス ミドｐＸＬ３１４９の注入はＮＴ３遺伝子の発現レベルを向上させた。本発明装 置を使用したとき、組織及び血漿中のＮＴ３の極めて顕著な増量が観察された。 従って、投与されるプラスミドＤＮＡの量に関わりなく、トランスフェクション 効率を向上させるために本発明装置を使用すると、筋肉中でも血漿中でもトラン スジーンの発現産物の量が著しく増加する。この増加は、神経栄養性遺伝子治療 を目的とするＮＴ３発現に特に重要である。実施例２６：ヒト成長ホルモン遺伝子の電気導入 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの脛骨上端筋にプラスミドｐＸＬ３３５３（図１５）ま たはプラスミドｐＸＬ３３５４（図１５）（１０μｇ）を片側的に注入した。プ ラスミドｐＸＬ３３５３（図１５）は、ゲノムヒト成長ホルモン遺伝子（転写開 始シグナルからＢａｍＨ１部位まで伸びるＸｂａＩ／ＳｐｈＩ ｈＧＨフラグメ ント、ポリアデニル化シグナルの２２４ｂｐ下流にある）を、ヒトＣＭＶ−ＩＥ プロモーター及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのコントロール下に導入する ことによってプラスミドｐＸＬ２７７４から得られる。ｈＧＨ ｃＤＮＡは、ヒ ト下垂体のｍＲＮＡライブラリーからの逆転写によって以下のオリゴ ヌクレオチドを用いた３０回の増幅サイクル後に得られた。 ５’相補的オリゴ： このオリゴヌクレオチドはコザック（ｋｏｚａｋ）ＸｂａＩ配列を含む。 ３’相補的オリゴ： このオリゴヌクレオチドはＮｓｉＩ部位と終止コドンとを含む。 増幅されたフラグメントをプラスミドｐＣＲ２．１（ＴＡクローニングキット 、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。ｈＧＨ ｃＤＮＡ を含む６８１塩基対のＸｂａＩ／ＮｓｉＩフラグメントをｐＸＬ３３５３のＸｂ ａＩ／ＮｓｉＩフラグメントに結合して、プラスミドｐＸＬ３３５４を作製した 。 電気導入条件は、２００Ｖ／ｃｍ、持続時間２０ミリ秒、周波数１Ｈｚの８パ ルスであった。プラスミドＤＮＡの注入直後に電界を印加した。マウスの処理の ７日後に、ＰＢＳバッファ中の筋肉粉砕物を１２，０００×ｇで遠心して得られ た上 清中のｈＧＨの存在を検出した。ｈＧＨの量をＥＬＩＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）によって定量した。 この実験の結果を表１７に示す。 表１７：ヒト成長ホルモンの発現 ｈＧＨ発現（ピコグラム／筋肉）の平均値±ＳＥＭ これらの結果は、本発明の電気導入装置の使用によってヒト成長ホルモン発現 が極めて顕著に増進されることを示す。この発現増加はゲノムクローンまたはｈ ＧＨコーディングｃＤＮＡのいずれを投与した場合にも観察される。実施例２７：ワクチン用トランスジーンの電気導入 この実施例は、本発明の電気導入装置が遺伝子（またはＤＮＡ）ワクチン用遺 伝子のデリバリーを増進することを示す。この実施例では以下の材料を使用した ：ＶＲ−ＨＡは、インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４菌株）のヘマグ ルチニンの遺伝子を含むプラスミドＤＮＡである。ｍＶＲｇＢＤＴは、ヒト サイトメガロウイルス（Ｔｏｗｎｅ菌株）の糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の遺伝子を 含むプラスミドＤＮＡである。その他の材料は市販の製造業者から入手した：ケ タミン、キシラジン及び生理的食塩水溶液（０．９％ＮａＣｌ）。９週齢の雌の Ｂａｌｂ／ｃマウスで実験した。実験に先立って種々のケージのマウスを無作為 に分配した（ランダム化）。 オシロスコープと市販の電気パルス（矩形または方形）発生器（エレクトロパ ルサーＰＳ １５，Ｊｏｕａｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用した。使用した電極は電 極間距離５ｍｍのステンレススチールの平面電極であった。 ケタミンとキシラジンとの混合物を用いてマウスに麻酔をかけた。プラスミド の溶液（０．９％ＮａＣｌ中に２０μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌの濃度の 溶液を５０μｌ）をハミルトン注射器で皮膚から左肢の脛骨上端筋に体長方向で 注入した。２つの電極に導電性ゲルを塗布し、注入された肢を電極間に電極に接 触させて配置した。注入の２０秒後に方形パルス発生器によって筋肉の軸に垂直 に電気パルスを印加した。オシロスコープによって、電界２００Ｖ／ｃｍ、持続 時間２０ミリ秒、周波数１Ｈｚの連続する８パルスをモニターした。 免疫応答の促進を評価するために、以下の免疫感作プロトコルを実施した： ０日後 プレ免疫血清サンプルの採取； １日後 電気導入使用または非使用で初回注射； ２１日後 免疫血清サンプルの採取； ２２日後 電気導入使用または非使用でブースター注射； ４２日後 免疫血清サンプルの採取； ６３日後 免疫血清サンプルの採取。 血清サンプルは眼窩後方叢から採取した。特異的抗体の量をＥＬＩＳＡで定量 した。１０匹の動物に片側的に注入することによって各実験条件を１０点で試験 した。 インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体価の測定結果を表１８ に示す。 表１８：抗インフルエンザウイルスのヘマグルチニン抗体応答 電界の非存在下（−）または存在下（＋）で１μｇまたは１０μｇのＶＲ−Ｈ Ａ ＤＮＡの注入後に得られたインフルエンザのヘマグルチニンに対する抗体価 。結果はグループあたり１０匹（１μｇのＤＮＡを注入し電界を作用させ６３日 後に採血したグループでは８匹）の動物の幾何平均±標準偏差で表す。マン−ホ イットニーのノンパラメトリックテストを使用し、ＤＮＡを注入し次いで電界処 理または非処理のグループを２つずつ比較することによってｐの値を得た。 これらの結果は、電気導入装置で処理したグループでは、インフルエンザウイ ルスのヘマグルチニンに対する抗体価が約１０倍も増加したことを示す。実際、 １μｇという少量のＤＮＡを 注入し電気導入装置で処理したマウスは、１０μｇのＤＮＡを注入したが電界で 処理しなかったマウスよりも高い抗ヘマグルチニン抗体価を有していた。 ＣＭＶ糖タンパク質Ｂに対する抗体応答の結果を表１９に示す。 表１９：抗−ＣＭＶ糖タンパク質Ｂ抗体応答 電気導入装置によって供給された電界の非存在下（−）または存在下（＋）で １０μｇのＶＲ−ｇＢ ＤＮＡの注入後に得られたＣＭＶ糖タンパク質Ｂに対す る抗体価。結果はグループあたり１０匹（電界を作用させたグループでは９匹） の動物の幾何平均±標準偏差である。マン−ホイットニーのノンパラメトリック テストを使用して、ＤＮＡを注入し次いで電界処理または非処理のグループを２ つずつ比較することによってｐの値を得た。 これらの結果は、電界処理グループは対照グループに比べて抗−ｇＢ抗体価が ４２日後に４倍に増加したことを示す。また、既に観察されたように、電気導入 装置で処理したマウスでは非処理（対照）マウスに比べて分散（標準偏差）が顕 著に小さい。実施例２８：腫瘍細胞トランスフェクション用電気導入装置 以下の実施例は、腫瘍組織に対する核酸のデリバリーを増進するための電気導 入装置の使用を示す。より特定的には、筋肉に対する核酸の電気導入に好ましい 電圧よりも高い電圧を供給するように電気導入装置を改造することによって、ｉ ｎ ｖｉｖｏ腫瘍細胞（及び多くの他の細胞）の効率的なトランスフェクション が得られる。この実施例は、ヌードマウス（免疫不全）に植え込まれたヒト起原 の種々の腫瘍またはＣ５７Ｂｌ／６マウス（免疫適格）に植え込まれたマウス起 原の種々の腫瘍に対する電気導入の効果を証明する。低強度の電界は、（Ａ）腫 瘍内注入によるプラスミドＤＮＡトランスフェクション、及び、（Ｂ）腫瘍内注 入後にトランスジーンによってコードされたタンパク質の血漿中への分泌、の双 方に効果をもつことが証明された。材料及び方法 体重１８〜２０ｇの雌のヌードマウスまたはＣ５７Ｂｌ／６マウスに腫瘍の移 植片を片側的に植え込んだ。ヒト肺癌（Ｈ１２９９）または結腸腺癌（ＨＴ２９ ）については２０ｍｍ³の腫瘍をヌードマウスに植え込んだ。ネズミの線維肉腫 （ＬＢＰ）細胞（１０⁶細胞）または黒色腫（Ｂ１６）または肺癌（３ＬＬ）の 腫瘍（２０ｍｍ³）はＣ５７Ｂｌ／６マウスに植え込んだ。腫瘍のサイズに基づ いてマウスを分類し、均質なロットに分配した。 ケタミンとキシラジンとの混合物でマウスに麻酔をかけた。腫瘍が目標体積に 達した後、プラスミドｐＸＬ３０３１（細胞質ルシフェラーゼ）またはｐＸＬ３ ０１０（分泌アルカリホスファターゼ）を腫瘍内に注入した。プラスミド溶液（ ２０ｍＭのＮａＣｌ、５％グルコース中に２５０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む４０ μｌの溶液）をハミルトン注射器で腫瘍の中央に体長方向で注入した。腫瘍の両 側面に導電性ゲルを塗布し、腫瘍を２つの電極間に配置した。注入の２０〜３０ 秒後に方形パルス発生器を使用して電気パルスを印加した。オシロスコープは、 送出される８パルスの電圧強度、ミリ秒で表される持続時間、 ヘルツで表される周波数を２００〜８００ボルト／ｃｍ、２０ミリ秒、１ヘルツ に調節した。オシロスコープと市販の電気パルス（矩形または方形）発生器（エ レクトロパルセーターＰＳ１５，Ｊｏｕａｎ，フランス）とを使用した。電極は 電極間距離０．４５〜０．７ｃｍのステンレススチールの平面電極であった。 腫瘍のトランスフェクションをルシフェラーゼによって評価するために、プラ スミド注入の２日後にマウス（条件次第であるが通常は実験グループあたり１０ 匹）を安楽死させた。腫瘍を摘出し、計量し、溶解バッファ中で粉砕した。得ら れた懸濁液を遠心して透明な上清を得た。基質が全自動的に添加される市販の光 度計を使用して１０μｌの上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。結果を腫瘍 あたりの総ＲＬＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ，相対的光量）で表 した。 ＤＮＡ注入の１日後、２日後及び８日後（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ８）の分泌アルカリ ホスファターゼの血漿レベル（ＳｅＡＰ）を前出の実施例２０に記載の手順で測 定した。結果及び考察 ヒト肺癌への電気導入 第一実験では、電界強度２００Ｖ／ｃｍ、周波数１ヘルツの８パルスという遺 伝子の筋肉内電気導入に常用の条件を使用し、得られた結果を３００〜５００ボ ルト／ｃｍの範囲のより高い電圧で得られた結果に比較した。第二実験の目的は 、最大トランスフェクションを得るために印加すべき最適電圧条件を決定するこ とであり、４００〜８００ボルト／ｃｍの電圧を試験した。結果を表２０に示す 。 表２０：ヒト肺癌に対する電気導入 雌のヌードマウスの体内で目標体積２００−３００ｍｍ³に到達したヒト肺癌 Ｈ１２９９腫瘍にプラスミドｐＸＬ３０３１ を注入した。ルシフェラーゼ発現の平均値±ＳＥＭを表す。 表２０によれば、ＤＮＡを注入し、後で電界を印加しない対照グループに比較 して：、 −２００〜４００ボルト／ｃｍでは印加電圧に依存的に遺伝子導入が増進され 、５００ボルト／ｃｍで最大トランスフェクションに対応する平坦域に到達した ； −より高い電圧（６００〜８００ボルト／ｃｍ）では、トランスジーンの発現 は低下しなかったが、皮膚火傷またはより深部の火傷が生じた； −遺伝子導入は電気導入によって約２４０〜３２０倍に増加した。 ヒト結腸腺癌に対する電気導入 ２つの実験の結果を表２に示す。電気導入非使用の対照グループに比較して、 強度６００ボルト／ｃｍの電界の印加は、電気導入非使用のトランスフェクショ ンレベルに関わりなく最適トランスフェクション率を達成した。それぞれの実験 でトランスフェクションは６倍及び２３倍に増加し、４００〜６００ボルト／ｃ ｍの値は比較的類似していた。 表２１：ヒト結腸腺癌への電気導入 雌のヌードマウスの体内で目標体積１００−２００ｍｍ³に達したヒト結腸腺 癌ＨＴ２９腫瘍にプラスミドｐＸＬ３０３１を注入した。のトランスフェクショ ンに種々の電界強度の電気パルスが与える効果。ルシフェラーゼ発現の平均値± ＳＥＭを表す。この実験の電極間距離は０．４５ｃｍであった。 ネズミの線維肉腫に対する電気導入 ２つの実験の結果を表２２に示す。電気導入非使用の対照グループに比較して 、強度３００〜６００ボルト／ｃｍの電界を印加したグループでは印加電圧の値 に関わりなく遺伝子の導入が３０〜７０倍に増加した。 表２２：ネズミの線維肉腫に対する電気導入 雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスの体内で目標体積１００−２００ｍｍ³に達したネ ズミＬＰＢ線維肉腫にプラスミドｐＸＬ３０３１を注入した。ルシフェラーゼ発 現の平均値±ＳＥＭを表す。 ネズミの黒色腫の電気導入 結果を表２３に示す。電気導入非使用の対照グループに比較して、強度５００ ボルト／ｃｍの電界を印加したグループでは遺伝子の導入が２４倍に増加した。 表２３：ネズミの黒色腫の電気導入 雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスの体内で目標体積１００−２００ｍｍ³に達したネ ズミの黒色腫Ｂ１６腫瘍にプラスミドｐＸＬ３０３１を注入した。ルシフェラー ゼ発現の平均値±ＳＥＭを表す。 ネズミの肺癌の電気導入 この実験の結果を表２４に示す。 表２４：ネズミの肺癌の電気導入 雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスの体内で５日間の増殖後に目標体積３０ｍｍ³に達 したネズミの肺癌３ＬＬ腫瘍にプラスミドｐＸＬ３０３１を注入した。ルシフェ ラーゼ発現の平均値±ＳＥＭを表す。 強度５００ボルト／ｃｍの電界を印加した場合、遺伝子の発現が３８８５倍に 増加した。これらの結果は、これらの腫瘍が先に試験した他の腫瘍に比べて電気 導入非使用条件下でヌード ＤＮＡによってトランスフェクトされ難いことを示す。 ヒト肺癌への分泌トランスジーンの電気導入 この実験の結果を表２５に示す。 表２５：ヒト肺癌への分泌トランスジーンの電気導入 雌のヌードマウスの体内で目標体積２００−３００ｍｍ³に達したヒト肺癌Ｈ １２９９腫瘍にプラスミドｐＸＬ３０１０（ＳｅＡＰ発現）を注入した。ルシフ ェラーゼ発現の平均値±ＳＥＭを表す。５００Ｖ／ｃｍという単一の電界を印加 し、プラスミド注入の１日、２日及び８日後に血漿中のＳｅＡＰレベルを検出し た。 この実験の結果は、電気導入条件下の腫瘍細胞のトランスフェクション後に血 漿中のＳｅＡＰレベルが劇的な一過性の増加を生じることを示す。ＧＭ−ＣＳＦ またはＩＬ−２のような免疫促進遺伝子を腫瘍に投与すると、有効量のサイトカ インが産 生され易い。更に、これらのデータは上記に示したルシフェラーゼ発現データと 共に、ＨＳＶ−チミジンキナーゼのような自殺遺伝子と分泌サイトカインとの併 用投与が、確実な抗腫瘍応答を生じるさせことを示唆する。あるいは、ＳｅＡＰ に関するデータは、ウロキナーゼ（ＡＴＦ）またはアンギオスタチン（またはエ ンドスタチン）のアミノ末端フラグメントのような抗血管新生促進因子の電気導 入トランスフェクションは、腫瘍に対する有効な遺伝子治療であることを示唆す る。 データは更に、腫瘍細胞に治療用遺伝子を電気導入する装置が、４００〜６０ ０ボルト／ｃｍの最適電界強度を有すること、最適値は５００Ｖ／ｃｍ±１０％ （即ち、４５０−５５０Ｖ／ｃｍ）であると考えられることを示す。 本発明の範囲は本文中に記載の特定実施例に限定されない。本文中に記載の変 形以外にも本文中の記載及び添付図面から種々の変形が可能であることは当業者 に明らかであろう。このような変形が請求の範囲に包含されることは理解されよ う。 また、核酸またはポリペプチドに関して示したすべての塩基サイズ、アミノ酸 サイズ、すべての分子量及び分子質量の値は概数であり、記載の便宜のために示 した値であることを理解さ れたい。 種々の刊行物を本文中に引用した。これらの刊行物の記載内容はその全部が参 照によって本発明に含まれるものとする。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION         Apparatus for optimally introducing a nucleic acid vector into an in vivo tissue Field of the invention   An object of the present invention is to provide a nucleic acid vector for cells, particularly muscle cells, using a low electric field. To significantly increase the in vivo introduction of the drug and improve the introduction efficiency. Yo More particularly, the present invention provides for the introduction of such nucleic acid vectors for gene therapy. Methods, devices and compositions. The device of the present invention can damage cells or tissues. To provide an optimal voltage gradient that enhances the transfer of the nucleic acid vector to the cell. Is being measured. Such devices rely on unique electrode configurations and maximum voltage settings. It is characterized by specific power limits that are defined.                                Background of the Invention Vectors and methods for gene delivery   The introduction of a gene into a given cell is the basis of gene therapy. But for some reason One of the problems is to introduce a sufficient amount of nucleic acid into the cells of the host to be treated. Beneficial genes must be expressed in transfected cells. You. this One of the methods considered for this purpose is the use of viral vectors, especially retroviruses and adenoviruses. Nucleic acid in a viral vector such as a virus or adenovirus-associated virus It is a method of incorporating. These systems are responsible for viral cell entry mechanisms and protection against degradation And use. However, this method has several problems. One of them is There is a risk of producing infectious virus particles that are easily transmitted to the body of the host organism, In the case of retroviral vectors, there is a risk of insertional mutagenesis. And In addition, therapeutic genes or vaccine genes that can be inserted into the viral genome The capacity of the gene is limited. Finally, there is an immune response against the viral vector. Occasionally, immune clearance occurs, and readministration of the virus is ineffective, Inflammation may also occur.   Another method (Wolf et al., Science 247, 1465-68, 19). 90; Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, U.S. Pat. No. 5,580,859 to Felgner et al. No.), excellent in vitro transfection of nucleic acids in the form of plasmids Proteins, liposomes, charged lipids or cationic For transfection-enhancing compounds such as polymers such as polyethyleneimine Arbitrarily coupled and administered intramuscularly or in the bloodstream (Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6, 1989; Felg ner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,7413- 7, 1987; Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 92,7297-301,1995; U.S. Patent No. 5,676,954 and And European Patent No. 425,475).   For muscle, muscle tissue takes up injected DNA in the form of free plasmid Since the earlier publication by Wolff et al. Researchers have attempted to improve this method (Manthorpe et al., 1993, Human).   Gene Ther. 4,419-431; Wolff et al., 1991, Bio. Technologies 11, 474-485). These studies include: Summarized into several trends:   By adsorbing the DNA to the beads and then driving the beads into the tissue Mechanical solution for forcing DNA into cells ("gene cancer") (Sa nders Williams Et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,2726 -2730; Fynan et al., 1993, BioTechniques 11,4. 74-485). These methods prove effective in vaccination strategies However, it only reaches the surface of the organization. Particles cannot penetrate skin tissue When using these methods on muscles, make sure that the particles can access the muscles. Surgery is required;   -The DNA is not in the form of a free plasmid, but rather a vehicle that allows the complex to enter the cell; A method of injecting a molecule by binding to a molecule that can function as a circle. Many different transfer The cationic lipids used in the traction method are currently disappointing. what Therefore, the cationic lipids tested so far are not transfected in muscle. (Schwartz et al., 1996, Gene T). her. 3,4O5-411). For cationic peptides and polymers Similar results were observed (Manthorpe et al., 1993, Human Ge. ne Ther. 4,419-431). Polyvinyl alcohol or polyvinyl alcohol Only mixtures of lupyrrolidone and DNA are considered to be the preferred bonds. Only However, when using these mixtures, Only less than a 10-fold increase is obtained when nude DNA is injected (Mumper Et al., 1996, Pharmaceutical Research 13, 70. 1-709);   -Pretreatment of the tissue to be injected with a solution that improves the diffusivity and / or stability of the DNA (Davis et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4, 151-). 159) or a solution that promotes nucleic acid entry, such as cell proliferation or regeneration Pretreatment with a solution that induces elephants. These procedures include, among others, local anesthetics, cardiotoxin Use elements, vasoconstrictors, endotoxins or other molecules (Manthorpe et al.) , 1993, Human Gene Ther. 4,419-431; Dank o et al., 1994, Gene Ther. 1,114-121; Vitadell o et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5, 11-18). Before these Treatment protocols are difficult to manage. Especially effective for bupivacaine The dose required for this is very close to the lethal dose. Pre-infusion of hyperosmolar sucrose Improves diffusivity but increases transfection levels in muscle No (Davis et al., 1993).   Use plasmid DNA alone or in combination with a synthetic vector. In vivo transfection of other tissues was performed using Cotten and Wagner (1994), Current Opin ion in Biotechnology 4,705; Gao andh Huang (1995), Gene Therapy, 2,710; Ledle. y (1995), Human Gene Therapy 6, 1129). Trial The major tissues examined were liver, alveolar epithelium, vascular wall, central nervous system and leprosy. this The expression levels of the transgene in all of these tissues may be promising for therapeutic use. (See, eg, Liver, Chao et al. (1996), Human G. ene Therapy 7,901), Introduction of plasmid DNA to vascular wall Recently, several promising results have been obtained (Iires et al. ( 1996), Human Gene Therapy 7, 959 and 989). . The induction effect is extremely small on the brain, and the same is true for tumors (Schw artz et al., 1996, Gene Therapy 3,405; Lu et al., 19 94, Cancer Gene Therapy 1,245; Son et al., Pro. c. Natl. Acad. ci. USA 91, 12669).Electroporation and iontophoresis for gene delivery   It also promotes in vitro transfection of DNA into cultured cells. To this end, electroporation, ie, an electric field that enhances cell permeability, is commonly used. this The phenomenon depends on achieving the threshold field strength. 800 to 1,200 for animal cells Electrical permeability was observed at relatively high intensity electric fields on the order of volts / cm. Only This technique also involves the incorporation of antitumor agents such as bleomycin against human solid tumors.   It has been proposed to enhance the efficacy in vivo (U.S. Pat. No. 468,228, L.R. M. Mirror). The above range of electrical conditions (800 to 1 , 200 volts / cm) is a very short duration (100 microsecond) pulse Is very suitable for introducing small molecules into cells. Electric field of 1,000 Applying such conditions (100 microsecond pulse) to the liver at less than volts / cm When used for in vivo transfer of nucleic acids, D in the absence of an electrical pulse Enhancement of introduction is seen at all compared to NA injection, it turns out that it can be inhibitory (International Patent WO 97/07826 and Heller et al., FEBS Lett. ers, 389, 225-8, 1996).   This technique is also difficult to use in vivo. Because of such strength This is because the application of an electric field causes a wide range of tissue damage. Target organization Damage is not a problem in the treatment of cancer patients, but non-tumor tissues, especially striated muscle This is a significant drawback when nucleic acids are administered to a human.   There are basically three types to administer electric pulses to trigger electrophoresis and iontophoresis. Systems, ie, external electrode systems, internal electrode systems (including catheters) ) And systems combining external and internal electrodes.                                 External electrode   In one type of device, the electrodes are placed outside the patient. For example, Hofman US Patent No. 5,318,514; Hofmann US Patent No. 5,439,440. No. 5,462,520 to Hofmann, 5,464 to Hofmann U.S. Patent No. 5,688,233 to Hofmann et al. And Weav. No. 5,019,034 to er et al. The contents of these patents are Included in the present invention by reference. In external electrode devices, the electrodes are Contact tissue area. The device is non-invasive by applying electrodes to the patient's skin. Affix electrodes to surfaces of organs that may be used conservatively or that have been surgically exposed May be used invasively.   Hofmann's' 514 patent covers macromolecules such as genes, DNA or pharmaceuticals. Disclosed is a device used to implant a child into a preselected surface tissue area of a patient are doing. The device has a head assembly and, according to a first embodiment, a head assembly. The solder assembly includes a serpentine (se) placed on top of the open cell elastomer. rpintine) conductors, both of which are carried on a substantially flat support member. Adjacent parallel segments of the serpentine conductor function as electrodes. Electric to patient In order to administer the air pulse, the head assembly is moved to a preselected surface tissue region of the patient. The conductor is placed in contact with the skin and the conductor is placed in contact with the skin. Absorbed by elastomer Alternatively, the liquid to be impregnated is supplied to the elastomer and a liquid medium containing macromolecules is supplied to the patient. Into the skin. Next, operate the switch to apply a high-voltage pulse from the signal generator to the electrode. To generate an electric field between the electrodes. The depth of the electric field inside the skin depends on the gap between the electrodes. Is proportional to An electric field injects liquid into the tissue region.   In another embodiment, the head assembly extends substantially perpendicular to the flat support member. Includes multiple thin needles. The needles are arranged in rows Alternately connected to the output of the signal generator so that each of the adjacent needles has the opposite polarity Have been. The needle penetrates the outermost layer of skin cells and Facilitates administration of electrical pulses.   Hofmann's' 440 patent includes electrodes for generating electric fields with adjustable spacing. Device is disclosed. The electrode is attached to the movable connection means, and the user To move them closer or farther apart like jaws on a clamp Can be. In use, open the jaws of the electrode and remove the tissue selected for treatment. Hold between jaws. Switch the signal generator connected to the electrode into a suitable switching device Thus, it is activated to generate an electric field in the tissue between the electrodes.                                 Internal electrode   A second type of electrical delivery system uses implantable or insertable electrodes I do. Electrodes are used to supply an electric field to the area near the implanted / inserted electrode. Place in patient's body. See, for example, Crandell et al., US Pat. No. 5,304,1. No. 20, Hofmann et al., No. 5,507,724; Hofmann No. 5, No. 501,662; Hofmann et al., 5,702,359. No. 5,273,525 to Hofmann. Description of these patents Are included in the present invention by reference.   Crandell's' 120 patent discloses a catheter that is inserted into selected blood vessels of a patient. Disclosure. A plurality of catheters that extend in the axial direction at intervals around the circumference Electrodes are placed in contact with the inner wall of the blood vessel. Next, the huge A liquid medium containing a probe is injected into a blood vessel near the electrode, and a predetermined electric signal Excite the electrodes to apply Separate electrodes are used to create the desired electric field. It may be an excited serpentine or a parallel strip.   Hofmann's' 724 patent discloses a catheter-based electrode having spaced electrodes. Another example of an insufflation device is an electrode in which blood is brought into contact with the wall of a blood vessel to be treated. It is located outside the catheter inserted into the tube.   Hofmann's' 662 patent is mounted inside a cylindrical dielectric support. A pair of spaced electrodes is disclosed. The electrodes allow blood flowing in the blood vessels to pass between the electrodes. Near the center of the blood vessel at a predetermined uniform distance from each other around the center of the blood vessel It is located beside. Cylindrical dielectric support is applied to surrounding blood vessels by surgery. Be implanted. A predetermined electric signal is applied so that an electric field is generated in the blood flowing between the electrodes. Applied to the poles.   Hofmann's' 525 patent discloses a two-needle injection in which the needle acts as an electrical lead-in electrode. Discloses a vessel. Insert the needle into the target area and apply an electric field to the target area. An applied electric signal is applied to the electrodes.   The '359 patent of Hofmann et al. Also discloses a needle-based An electrode is disclosed.                       Combination of external and internal electrodes   A third type of electrical introduction device combines the features of the above systems. This type of device has at least one electrode located internally and a few located externally. An electric field is applied to a desired tissue area using at least one electrode. For example, U.S. Patent No. 5,286,254 to Shapland et al .; No. 5,499,971; Shapland et al., No. 5,498,238; Sh. No. 5,282,785 to Appland et al. and No. 5,62 to Shapland et al. See 8,730. The contents of these patents are incorporated herein by reference. And   Typical of these devices are described in the Shapland '785 patent. Device. The patent discloses a drug delivery wall (eg, a drug or other bulk material). Inside the drug chamber and catheter with a permeable or semi-permeable wall that can pass large molecules A catheter having an electrode disposed opposite a drug delivery wall; I have. The second electrode is located at a location that is fast from the patient's skin. Current supplied Sometimes a desired macromolecule is placed in a drug chamber located inside an electric field generated between two electrodes. The containing liquid is delivered. In this way, the macromolecule is Will be delivered to   Other features disclosed in the various patents mentioned above: Invert the polarity of the electrodes to drive in the opposite direction (e.g., Shapland '238 and Shapland' 785 patent); Delivery of current to electrodes Synchronizing with ventricular depolarization to prevent electrically induced arrhythmias or unnatural heart rhythms (E.g., Feiring U.S. Patent Nos. 5,236,413 and 5,4 No. 25,703 and Shapland US Pat. No. 5,634,899). Sound transmission (phon) to generate sound waves as driving force for macromolecule delivery use an ultrasonic piezo-electric transducer, known as (E.g., Shapland'238 and Shaland'730) .                                Summary of the Invention   All articles cited above must be 1,0 in order to be valid in vivo. It states that a high electric field of the order of 00 volts / cm is required. This is the applicant Here, for example, a relatively low strength of 100 volts / cm or 200 volts / cm ( A relatively long duration electrical pulse at less than 600 volts / cm) to the tissue. In vivo nucleation into muscle without undesired side effects A completely unexpected and remarkable finding has been obtained that the acid introduction can be very significantly enhanced. Out Applicants have further developed the prior art for plasmid-borne transgene expression. Large statistical variance as observed with DNA transfer into muscle by the method of the present invention. Was found to be significantly reduced.   Thus, the present invention is directed to administration directly to tissues or locally or systemically. The cells to be introduced are brought into contact with the tissue cells by G / cm, with a strength in the range of 1-600 volts / cm for tissues such as tumors. One or more electrical pulses are applied to the tissue to ensure delivery To in vivo tissue such as one or more striated muscles or tumors The present invention relates to a method and an apparatus for introducing a nucleic acid.   Thus, the present invention is directed to administration directly to tissues or locally or systemically. The nucleic acid to be introduced is brought into contact with tissue cells by Group one or more electrical pulses supplied by the device of the invention set to Of multicellular eukaryotes, characterized in that their introduction is ensured by applying to the tissue. A system such as an improved device for introducing nucleic acids into cells in vivo is provided. Than Specifically, the electric field strength is between 1 and 600 to deliver nucleic acids to tumor cells. Volts / cm range, 1-400 volts / cm to deliver nucleic acids to muscle cm. The system (or device) of the present invention comprises an electric pulse generator (or Or an electric pulse generating means) and an electrode. Long pulse times, electricity with intensities ranging from 1 to 400 or 600 volts / cm The pulses are generated at a frequency between 0.1 and 100 Hz. The electrode is in contact with the electrode It is connected to an electric pulse generator to generate an electric field in vivo tissue. 1 According to one particular embodiment, the electric pulse generator comprises (for introduction into a muscle) 30-300 volts / cm Range, 400-600 volts to introduce into tumor cells and other small cells / Cm pulses are generated. According to another particular embodiment, the electric pallet The pulse generator generates pulses for a time longer than 10 milliseconds. In yet another embodiment According to the electric pulse generator, it generates 2 to 1000 pulses.   According to the present invention, the system or the improved device is such that the electric pulse generators are irregular with respect to each other. Can generate a regular pulse and the system or equipment is set above Can't supply electric field larger (or smaller) than parameter In this condition, the function of the electric field strength depending on the pulse time is a variable. For example, the electric field The integral of the function representing the change over time is a value higher than 1 kV · msec / cm. In the embodiment, the value is 5 kV · msec / cm or more.   The electric pulse generator (pulse generation means) is composed of a square wave pulse, an exponential decay wave, Group consisting of short-duration oscillatory monopoles, short-duration oscillatory dipoles? A selected pulse can be generated. Preferably, the electric pulse generator is a square wave pulse Cause a problem.   According to the present invention, various electrode configurations are possible. For example, The pole is above the tissue to be treated, for example, to introduce the nucleic acid into cells of the patient's superficial tissue. The external electrodes may be arranged at the same time. Alternatively, the electrodes are implanted in the tissue to be treated Possible internal electrodes, ie, tissue-penetrating electrodes, may be used. Such an internal electrode may be a needle, It may be configured as an injector system that can simultaneously administer nucleic acid and electric field . In another embodiment, the present invention uses both external and internal electrodes.   The external electrode of the present invention contacts a portion outside the patient's body very close to the large muscle. The size may be such that Such an electrode is, according to one embodiment, a flat planar electrode. And according to another embodiment is a semi-cylindrical planar electrode.   According to yet another embodiment, the electrode is an intra-arterial or intra-venous electrode, such as the present invention. FIG.   A preferred material for the electrode of the present invention is stainless steel.   The improved device of the present invention is a modification of prior art devices, in particular, the electric field generation of such devices. Manufactured by modifying the raw means to generate the electric field of the present invention. example For example, the electric pulse generating means generates a voltage corresponding to 400 or 600 volts / cm. Do not exceed 1 to 400 or 600 volts / cm by modifying the voltage gate Can be modified to generate pulses in the range Specific embodiments of such retrofit devices In such a case, the voltage can be set to a constant voltage and the electrodes can be set to a constant inter-electrode distance. You. Alternatively, the electric pulse generating means corresponds to 400 or 600 volt / cm By labeling the device so that it does not exceed May be modified to generate pulses in the range of 600 volts / cm.   Therefore, an object of the present invention is a voltage gradient that has been found to be optimal for introducing nucleic acids, A system that supplies an electric field with pulse width and pulse number without damaging the tissue Providing existing systems or modifying existing equipment to supply such electric fields It is to be.   A more specific object of the present invention is to provide a voltage condition (voltage gradient of 6) for electroporation. 00 volts / cm or more, usually 1,000 holts / cm or more) Electrotransfer of nucleic acids under mild and difficult conditions.   Yet another specific object of the present invention is the use of extremely low intensity Significantly more effective than can be obtained under the action of an electric field And to achieve intracellular delivery of the nucleic acid.   Yet another advantage of the present invention is that nucleic acids can be efficiently and reproducibly delivered to muscle cells. It is to be.   The above object and other objects of the present invention will be described in the above description, and the detailed description of the invention. Achieved by a more detailed description of the Examples section with reference to the Ming section and the drowning drawings It should be clear.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows the transfection of plasmid DNA pXL2774 into the mouse upper tibia muscle. Mean value ± SE of the effect of electric pulse with high electric field strength on sfecting Expressed by M.   FIG. 2 shows the transfection of plasmid DNA pXL2774 into the mouse upper tibia muscle. Average effect of electric pulse of intermediate electric field strength on sfecting is ± S Expressed as EM.   FIG. 3 shows the transfection of plasmid DNA pXL2774 into the mouse upper tibia muscle. Gives electric pulses of low electric field strength and various durations to the infection Effects are expressed as mean ± SEM.   FIG. 4 shows the transfection of plasmid DNA pXL2774 into the mouse upper tibia muscle. Low electric field strength against infection The effect of electrical pulses of various durations is expressed as mean ± SEM.   FIG. 5 shows plasmid DN into the superior muscle of the tibia of mice when using low field strength. ApXL2774 represents the electrophoretic efficiency as mean ± SEM.   FIG. 6 depicts the kinetics of luciferase expression in the upper tibia muscle of mice. Plasmid pXL2774 was administered with electrophoresis (■) or without (x) . Mean ± SEM.   FIG. 7 shows the expression levels of DNA administered with electrophoresis (●) and without electrophoresis (□). Expressed as a function of dose.   FIG. 8 shows the effect of various types of electrodes on the efficiency of electricity introduction.   FIG. 9 depicts the kinetics of serum concentration of secreted alkaline phosphatase. Plasmid pXL3010 was administered with electroinduction (非) or without (導入). Mean ± SEM.   FIG. 10 is a graph showing the use of electricity introduction (open bar graph) and non-use (black bar graph). Figure 2 shows the kinetics of expression of aFGF in meat.   FIG. 11 shows a map of plasmids pXL3179 and pXL3212.   FIG. 12 shows a map of plasmids pXL3388 and pXL3031.   FIG. 13 shows a map of plasmids pXL3004 and pXL3010.   FIG. 14 shows a map of plasmids pXL3149 and pXL3096.   FIG. 15 shows a map of plasmids pXL3353 and pXL3354.   FIG. 16 shows a map of plasmid pXL3348.                             DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION   As noted above, the present invention provides for the application of low intensity electrical pulses to tissue. This significantly enhances the in vivo transfer of the nucleic acid to the tissue. For example , An electric field of less than 600 volts / cm enhances the introduction of nucleic acids to 100-200 vol., Less than lt / cm, preferably about 0.5-1 cm between electrodes It has been found that electric fields of less than 10 g / cm enhance the introduction of nucleic acids into muscle. This These electric fields are applied for a relatively long time. Applicant further states that the prior art The wide statistical variance in transgene expression observed with the transfecting DNA On the way Therefore, it was found that it was significantly narrowed. Lastly, long-term expression , For example, for more than 60 days. In certain embodiments, the high level Expression was detected for 63 days.   As can be readily determined from the description provided herein, Applicants The introduction of a nucleic acid into a vivo cell is called "electrotransfer". "Elect used in the text "Trotransfection" is an alternative term that has the same meaning. In the process expressed in terms, the optimal conditions for the introduction of nucleic acids are "electroporation" (800 V / Electrophoresis (use of electric field of extremely low intensity) Obviously different.   Thus, the present invention is directed to administration directly to tissues or locally or systemically. The nucleic acid to be introduced is brought into contact with tissue cells by performing ) 1-600 volts / cm or 1-400 volts / cm for muscle cells Ensuring induction by applying one or more intense electrical pulses to the tissue A method for introducing a nucleic acid into a tissue, particularly a striated muscle, in vivo, It relates to systems, devices (or devices) and compositions. In other words, the present invention In particular, it relates to an electrical introduction system (eg, a device or apparatus).   According to one preferred embodiment, the method according to the invention comprises, for example, Vesicles and / or elongated cells and / or cells that naturally respond to electrical potential Or tissue consisting of cells with a specific geometric shape, such as cells with a specific morphology Used for   Preferably, the strength of the electric field is 4-400 volts / cm for muscles and Is 600 volts / cm or less, and the total application time is 10 milliseconds (m sec), preferably 10 msec. In certain embodiments, duration The sum between is 8 msec or more. In many embodiments, the pulse duration Is 20 msec, and it is known that a duration longer than 40 msec is effective. Was seen. The number of pulses used is, for example, 1 to 1,000 pulses, preferably 2 pulses. -100, more preferably 4-20, and the pulse frequency is 0.1-1,000. Hertz (Hz), more preferably in the range of 0.2 to 100 Hz. Specific implementation In embodiments, frequencies of 2, 3 and 4 Hz have been found to be effective. Pulse Variables may be sent out irregularly, and the function representing the time-dependent change in electric field strength is a variable. Is also good. The integral of the function representing the change over time in the electric field strength is 1 kV · msec / larger than cm. According to a preferred embodiment of the present invention, the integral is 5 kV · mse c / cm or more. However, this integral function is Those skilled in the art will readily understand that they need to be obtained at the following voltages:   In certain embodiments evolving from the scope of the present invention, the device of the present invention comprises at least One short-time (less than 1 msec) high-voltage pulse (400 V / cm or more, preferably 500-800 V / cm) followed by one or more longer durations ( 1 msec or more) with a much lower electric field strength (less than 200 V / cm) Combinations may be supplied.   According to a preferred embodiment of the present invention, the electric field strength of the pulse is between 30 and 300 volts / Cm.   The electric pulse is selected from a square wave pulse, the electric field is an exponential decay wave, a short Generates oscillatory monopolar waves of short duration, oscillatory bipolar waves of short duration, or other waveforms Let it. According to a preferred embodiment of the present invention, the electric pulse is a square wave pulse .   The administration of the electric pulse is performed by any method known to those skilled in the art, including:   -External electrode systems located on both sides of the tissue to be treated, especially the skin A non-intrusive electrode system arranged in contact with the electrode;   An electrode system implanted in the tissue;   An electrode / injector system capable of simultaneously administering a nucleic acid and an electric field.   Ensures electrical continuity with non-invasive external electrodes for in vivo administration It is sometimes necessary to employ intermediates. For example, use gel-type electrolyte I do. Preferred examples of gels are gels, electrocardiograms or defibrillators used in the examples below. A medical gel that enhances electrical contact as used in medical gels.   The nucleic acid can be administered by any suitable means, but is preferably in vivo. Injected directly into the tissue, or another localized area where the nucleic acid can be introduced at the site of application of the electric field. Alternatively, it can be administered using a systemic route. As described above, the nucleic acid is introduced with the nucleic acid. It can be administered together with a substance that can be administered or that facilitates introduction. More specifically, this These nucleic acids may be free in solution, bound to synthetic substances, or Alternatively, it may be carried on a viral vector. Synthetic substances are lipids known to those skilled in the art. Or a polymer or a target that can settle on the membrane of the target tissue. Element. Examples of these elements include sugars, peptides, antibodies, Vectors that carry both the You.   Under the conditions of the present invention, the administration of the nucleic acid is performed before, simultaneously with, or simultaneously with the application of the electric field. May be performed at any time after application. However, the application of an electric field is continued after nucleic acid administration. Needless to say, it is necessary to continue.   Thus, the object of the present invention is also directed to mammalian cells, in particular human cells, either simultaneously or at the same time. Nucleic acids for in vivo administration at intervals or staggered with 1-6 Use in combination with an electric field of intensity of 00 volt / cm (preferably 400 volt / cm) It is to propose a use. Electric field strength is preferably in the range of 4 to 400 volts / cm And more preferably the strength of the electric field when introduced into the muscle is 30-300 volts / Cm range. For introduction into tumors and cells with similar electrotransduction receptivity Is preferably 400 to 600 V / cm, and preferably about 500 (immediately). (500 ± 10%, preferably 5%) V / cm. Such a combination The nucleic acid structure is defined so that the nucleic acid is oriented in a specific direction with respect to the electric field. It is easy for the average person skilled in the art to define specific secondary and tertiary structures in the presence of Will be understood. In addition, DNA is extracellular found in target tissues. Binds to the components, which can be applied to low-field agarose gel electrophoresis or other laboratory It is significantly different from DNA under conditions.                         Electric introduction system and equipment   Any electrical introduction system (ie, an apparatus or device, for which The first component provides a pulse of 600 V / cm or less. It consists of an electric pulse generator and electrodes designed or modified in such a way. Especially for muscles The system or device of the present invention for delivering nucleic acids is less than 400 V / cm Is supplied. Naturally, the effective voltage depends on the distance between the electrodes. Known in the art Thus, this distance affects the specific resistance (resistivity) of the target tissue. Therefore The effective voltage applied depends on the resistance, so that the current and thus the total power is at an acceptable level. Will be maintained within the bell. The term "acceptable level" as used in the text is the total power Does not cause irreversible tissue damage, especially tissue burns. Therefore, preferred From a new point of view, the device of the present invention can fix the voltage and the distance between the electrodes by fixing Control the allowable current or voltage that is too high for the distance between the electrodes, thus Includes feedback means to prevent application of too much current. The system of the present invention , Oscilloscope or other voltage, Includes current or both measurement devices.   According to one embodiment, the system of the invention is manufactured using commercially available equipment. You. Preferably, it provides a specific electricity introduction condition defined as being optimal in the text. To modify commercially available equipment. In another embodiment, a new Design and manufacture the equipment. Modified or manufactured pulse generators have unlimited design specifications Typically, the desired voltage gradient, ie, less than 600 or 400 V / cm, is administered to the muscle. Mechanical or electrical to maintain less than 200 V / cm Incorporates a controller. Mechanical controls are, for example, voltage selection dialogs. Stop that prevents the selection of a voltage placed in the . Alternatively, if the device is manufactured or modified so that such a voltage is not selected, Good. In yet another embodiment, the device is configured such that the voltage (and thus the current) is a parameter of the invention. Breakers or fuses that are activated when the power is exceeded. Yet another In an embodiment, the microprocessor control prevents selection of a voltage that is too high Or delete it. In yet another embodiment, the modification of the pulse generator comprises the electric field of the present invention. It only uses labels that dictate the use of a particular voltage range to provide strength. these All modifications are routine in the industry and include standard electrical and mechanical techniques. Use   As described above, the present invention was developed to produce the electric field strength specified as optimal in the text. The effective voltage provided by the light-emitting system depends in part on the space between the electrodes. You. If the space between the electrodes is fixed, (predetermined tissue, such as muscle, liver, The voltage (for the heart or tumor) will be a predefined constant. But for some reason To maintain a constant voltage gradient when it is desirable or possible to change the space between electrodes Need to adjust the voltage? Such voltage can be measured by measuring the distance between the electrodes, Equip the electrodes with measuring means to indicate the value of the interelectrode space after adjustment, or Automatic measurement that feeds back to the pulse generator so that (Hofmann, US Pat. No. 5,439,440). reference).   The following sections describe prior art pulse generators, electrodes and devices that can be modified in accordance with the present invention. The arrangement will be described in more detail.                               Pulse generator   Pulse generator (also called "voltage generator" and "pulse or voltage generating means") Is the specified voltage, duration, pulse width, Duty cycle (total of pulse release time and rest time) and pulse frequency An electrical device that generates a current. Such devices are known in the art and are commercially available. A pulse generator is described, for example, in US Pat. No. 5,704,908. BTX Instruments Division of Genetro nics Inc. , Commercially available from San Giego California ELECTROCELL MANIPULATOR model ECM600, There are T800L and T820 voltage generators. Refer to the entire contents of the patent Is included in the present invention. Alternatively, the pulse generator performs the following: Electropaths commercially available from Jouan, France as disclosed in the examples It may be a sweater PS15. In yet another embodiment, US Pat. Voltage generator capable of generating one or more waveforms as described in US Pat. May be used. The entire contents of the patent are incorporated herein by reference. Shall be. The voltage is to generate pulses of variable shape, intensity and duration Can be designed. For example, 200 V / cm or 400 V / cm, 5-20 mse After c pulse, lower intensity and longer It can be designed to generate a new pulse. The device may further comprise an An on-migration electric field may be provided.   The pulse generator of the present invention has the following specifications:   -1 to 600 or 400 V / cm, preferably 4 to 400 V / cm, more preferably Preferably, a voltage gradient of 30 to 300 V / cm is generated. When introducing electricity into muscle In particular, the specific voltage gradient of the device according to the invention is about 100 V / cm and 200 V / cm, preferably. Preferably, it is less than 200 V / cm. Electrotransfer into tumor cells or similar cells In some cases unexpectedly an electric field of 400-600 V / cm, optimally about 500 V / cm Was found to be preferred;   A pulse frequency of 0.1 to 1,000 Hertz (Hz). In certain embodiments, the circumference The wave number is about 2 Hz to 10 Hz, preferably higher than 1 Hz. Favorable fruit In embodiments, the frequency is 3 or 4 Hz;   -The pulse time (duration) is longer than 1 millisecond (msec) The interval is variable. Preferably the pulse time is longer than 5 msec, more preferably Is longer than 10 msec, more preferably longer than 20 msec.   In a preferred aspect, the pulse generator of the present invention has at least two pulses. Generate a pulse, preferably 4, 6 or 8 pulses. For example, 8-1,000 Luss occurs. Patients begin to experience side effects or lose control of field strength In such a case, it must be possible to disable or shut down the pulse generator. this Such invalidation can be performed manually, fully automatically, or both.   The average person skilled in the art will be familiar with external signals, such as another device, computer, etc. It will be clear that pulses can be generated. For example, delivery of nucleic acids to heart tissue In order to do so, the pulse generator will synchronize the pulse to the heartbeat And take the best interface. Such a system is preferably Includes active coordination of the patient's heart rhythm by the manufacturer (Shaland's US No. 5,634,899).                                   electrode   The electrodes of the present invention supply an electric field to tissue. One electrode, the cathode has a negative charge ing. The anode has a positive charge. According to the invention, generally one electrode A net ion flow or flux flows from the other electrode to the other electrode. Depending on the effective charge and the polarity of the electrodes). In general, nucleic acids have a strong net negative charge So it will move in the direction of the anode.   The electrodes used in the present invention conduct electricity efficiently and preferably under the conditions of use. It must be inert, non-reactive and non-toxic. More specifically, The poles cause the electrodes to release harmful or toxic metal ions or reduce electrode efficiency. Should not produce a detectable reaction to biological material because Don't be afraid. Preferred electrode materials of the present invention are sufficiently non-reactive and Stainless steel that has conduction efficiency and is inexpensive enough to be manufactured at a reasonable cost It is a rule. Particularly ideal internal electrodes are gold or platinum. However, this Noble metal electrodes are extremely expensive. These materials are plated on other conductors. By doing so, costs can be reduced. Other conductive metals include With copper, silver or silver chloride, tin, nickel, lithium, aluminum and iron They have amalgam. However, some materials, such as aluminum, Do not use internally. In addition, zirconium, iridium, titanium and carbon Electrodes may be manufactured from several forms.   Some electrodes, such as silver and copper, have antimicrobial activity, Desirable for internal administration.   The electrodes can be formed in any structure suitable for the target tissue. Non-limiting examples include: Straight wire, coiled wire (straight and coiled for use in catheters) Wire electrodes are ideal), conductive surfaces (eg, catheters or See Rune Catheter Surface, US Pat. No. 5,704,908. Description of the patent The contents of which are hereby incorporated by reference in their entirety), metal strips , Needles (or probes), needle arrays, surface electrodes or combinations thereof. Consideration The resulting electrode combinations include (1) catheter electrode and needle electrode, and (2) catheter electrode. There are tellurium electrodes and surface electrodes, and (3) needle electrodes and surface electrodes. In certain embodiments, A needle electrode can be used with a DNA delivery syringe. Such a needle electrode is An opening through the entire length of the shaft to allow nucleic acid solution to be delivered along the length of the shaft. Can have. There are two ways to deliver nucleic acids to large organs, especially large muscles. Surface electrodes may be used. As mentioned above, for example, good contact and continuity with the skin In order to ensure, it is preferable to use the surface electrode in combination with the electrolyte composition.   In certain embodiments having one internal electrode and one external electrode, the external electrode is an internal electrode. Multiple "heads" arranged around the electrodes Can have. In fact, for any of the above structures, one electrode is generally May have a "head".   The present invention further provides an electrode array, a needle with an axial aperture, a depth of penetration of the needle into tissue. To provide a constant and reproducible conductive area inside the tissue regardless of the degree) Needle with calibrated and calibrated length of conductive path, prevents point-point electric arc inside tissue Needle with an insulation point, and any kind of pouch / Consider also the reservoir.   As described above with respect to the needle electrode, the planar electrode may have an insulated peripheral margin.   Generally, the electrodes are positioned such that the target tissue is directly between the electrodes. In this case, the maximum electric field strength acts on the nucleic acid. However, the electric field flux is Because it exists in the periphery, it is generated directly between the electrodes and the electric field generated peripherally between the electrodes It is also possible to use an electric field.                         Modified prior art device   According to certain embodiments, a device for placing the electrodes outside the patient (eg, Hofma) nn US Patent 5,318,514; Hofmann 5,439,44. No. 0, Hofmann's 5,462,520; Hofmann's 5,464,386, Hofmann No. 5,688,233 to Ann et al. and No. 5,019,0 to Weaver et al. No. 34) is modified in accordance with the invention, ie it supplies an electric field under defined conditions Thus, the modified apparatus of the present invention is provided. The improved device uses the electrodes It may be used non-invasively by applying it to the skin, or the electrode may be used surgically. It may be used invasively by applying it to the surface of an organ that has been exposed.   Similarly, the body of the patient to supply an electric field to the area adjacent to the implantation / insertion electrode. Implantable or insertable electrodes, particularly catheter electrodes (e.g., See, e.g., Crandell et al., U.S. Patent No. 5,304,120; Hofmann et al. No. 5,507,724, Hofmann et al., No. 5,501,662, Hof. No. 5,702,359 to Mann et al. and No. 5,273,52 to Hofmann. (See No. 5) to provide an improved device of the present invention. It can be modified according to the invention.   Of course, an electrical introduction device combining the features of the above systems, for example, the desired set Placed inside the body to supply an electric field to the weaving area Using at least one electrode arranged outside and at least one electrode arranged outside the body (See, eg, Shapland et al., US Pat. No. 5,286,25). No. 4, Shapland et al., No. 5,499 971, Shapland et al. No. 5,498,238 and Shaplant et al., No. 5,628,730). Can be modified in accordance with the present invention to provide an improved system of the present invention.                   Gene therapy using electroinduction systems   The method of the present invention provides for gene therapy, ie, expression of the introduced gene or Modulation or inhibition is effective for treatment methods that ensure treatment of specific pathologies .   Preferably, the tissue cells are treated with gene therapy to achieve the following effects:   The effect of correcting the dysfunction of the cells themselves (eg pancreatic fibrosis, muscular dystrophy) Treatment of diseases associated with genetic deletions such as   -Trophic factors produced by the transgene, neurotrophic factors, promoting angiogenesis Factors or anti-inflammatory factors may cause vascularization of tissues, organs or bones such as muscle. Or protect innervation and / or Or regeneration effect;   -The effect of transforming muscle and making it a secretory organ of substances that lead to therapeutic effects. like this Substances include products of the genes themselves (eg, thrombotic and hemostatic regulators, nutrients Offspring, hormones such as insulin, erythropoietin, leptin, etc.), or There are active metabolites synthesized in muscle by the addition of therapeutic genes, for example Correcting genetic disorders by secretion of therapeutic substances;   -Tumor suppressor (retinoblastoma protein, p53, p71), suicide gene ( For example, HSV-thymidine kinase), an anti-angiogenic gene (for example, Ostatin, endostatin, amino-terminal fragment of urokinase), cell Cycle blockers, apoptosis gene (eg, BAX) intracellular single-chain antibodies, and And delivery of anti-tumor genes such as immunostimulatory genes;   A nucleic acid vaccine or an immunostimulatory effect.   Using electroinduction with intramuscular expression in gene therapy for systemic problems Is particularly advantageous for a number of factors, including:   -Transgene expression is extremely stable for more than a few months, Therapeutic protein and secretory therapeutic protein Quality is produced stably and continuously;   -Immediate and safe administration directly to non-animal organs due to easy access to muscle tissue it can;   -Muscle is large in volume, so multiple sites of administration are available;   -It has been demonstrated that the muscle has a large secretory capacity.   In addition to the advantages described above, local treatment can be performed using a localized, targeted electric field. Therefore, there is an advantage that the safety is high.   The present invention provides, for example, safe electrical conduction because of the safety associated with the use of low electric fields. Can be used on myocardium to treat heart disease using heart rate coordination to ensure access (See U.S. Pat. No. 5,634,899). Also, like GAX protein Can be used to treat restenosis by expressing a gene that inhibits smooth muscle cell proliferation You.   Particularly combined use of long duration, low intensity electric field and administration to tissue in vivo Enhances transfection of nucleic acids without causing significant tissue damage . These results indicate that DNA transduction efficiency in gene therapy using nucleic acids is improved. Let   Thus, an advantage with the present invention is that physiological and / or therapeutic doses of a substance Produced inside or near it, or It is secreted systemically in the bloodstream or lymph circulation. Further, the present invention provides For example, adjusting the volume of tissue to be transfected by multiple sites of administration. And the number, shape, surface area and arrangement of the electrodes can be adjusted. Enables, for the first time, fine-tuning and control of the effective amount of expressed transgene did. As an additional control element that can adjust transfection efficiency Depends on the field strength, number of pulses, duration and frequency, as well as nucleic acid There are variations in the amount and dosage volume. A special advantage of the present invention is that The result is an excellent dose-response curve that none of the techniques could do. As a result, the transfection appropriate for the desired tissue production or secretion level Action level. Finally, the method of the present invention relates to organs other than the target organ. Chemicals or wisdom that cannot be completely excluded or controlled from reaching government officials It has safety that surpasses that of a gene-like in vivo gene transfer method. Actual On the one hand, the volume of the tissue affected by the local electrical pulse Control the localization of the transfected tissue (strictly related to Some tissues may be dead or repopulated, as in the case of muscle. Viable or both, so that the whole or partial organization It is possible to recover the initial state by excision. This flexible use Animal type (human and vertebrate), patient age, patient physiological The method may be used under optimal conditions depending on the condition and / or pathological condition.   The method of the present invention further comprises a virus whose transgene size is compatible with the capsid. Unlike viral methods, which are constrained by the size of the genome, Transfection of nucleic acids was made possible for the first time. Such a possibility is It is essential for the introduction of very large genes, such as the lophine gene, Introduced when producing hormones in physiologically regulated amounts, for example. Essential for the introduction of genes with regulatory elements of large size and / or large size. this Such possibilities also include artificial yeast episomes or chromosomes or minichromosomes. It is indispensable to introduce a team.   Another object of the present invention is to provide topical, dermal, oral, intravaginal, Oral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. Combination of a composition containing nucleic acid mixed with an electric pulse of one electric field And The pharmaceutical composition of the present invention can be used for injection, particularly for injection directly injected into a desired organ. Form or a pharmaceutically acceptable vehicle to obtain any other form of administration. Have. In particular, such vehicles include sterile isotonic solutions or sterile water. Or injectable solution by adding physiological saline as appropriate There are compositions, especially lyophilized compositions. Dosage and number of doses of nucleic acid used for injection And the volume of the injection will depend on various parameters, in particular the administration method used, Depending on the disease, the gene to be expressed or the desired duration of treatment.                              Target organization   The inventors of the present invention suggest that the optimal conditions for the gene transfer of the present invention depend on the target tissue. We found that they were different. For example, an electric field of 200 volts / cm It was found that child introduction was significantly enhanced. Under these conditions, even for tumor cells Significant gene transfer progresses (in a specific experiment, gene transfer increased threefold) In the field of 400 volts / cm. Transfection efficiency is much higher (gene transfer efficiency increased by 2 logs). In another experiment, Electric field strength of 500 volts / cm was optimal for gene transfer to tumor cells .   Thus, according to the present invention, a system or improved device converts nucleic acids into muscle cells (or Other large cells) and can be configured with various field strength parameters System or improved device to transfer genes to tumor cells (and other small cells) Can be developed to deliver.   To deliver nucleic acids to muscle cells, the system or device of the present invention comprises: ~ 400 volts / cm, preferably 4-400 volts / cm, more preferably 3 It will produce a voltage gradient of 0-300 volts / cm. In certain embodiments, the voltage The gradient is between 100 and 200 volts / cm. Electricity not exceeding 200 volts / cm Systems or devices that provide a pressure gradient are particularly suitable.   To deliver nucleic acids to tumor cells, the system or device of the present invention comprises: ~ 600 volts / cm, preferably 100-600 volts / cm, more preferably Will produce a voltage gradient of 400-600 volts / cm. In certain embodiments The voltage gradient is between 400 and 500 volts / cm, preferably about 500 V / cm It is. System or apparatus for providing a voltage gradient not exceeding 600 volts / cm Is particularly preferred.                                   Nucleic acid   The nucleic acid may be a synthetic or biosynthetic nucleic acid, a virus, a prokaryotic cell, or Or a eukaryotic cell derived from a unicellular organism (eg, yeast) or a multicellular organism. Nuclear The acid is bound to all or some of the starting organisms and / or components of the synthetic system and injected. May be given.   The nucleic acid may be a deoxyribonucleic acid or a ribonucleic acid. Nucleic acids are of natural origin It may be a sequence or an artificial sequence. In particular, genomic DNA, cDNA, mRN A, tRNA and rRNA, hybrid sequences or modified or unmodified It may be a synthetic or semi-synthetic sequence of a gonucleotide. These nucleic acids are Any method known in the art, in particular by cloning, chemical synthesis or cloning. Obtained by a hybrid method involving chemical or enzymatic modification of the sequence obtained . Nucleic acids can be chemically modified.   More specifically, the nucleic acids have sense or antisense properties or ribozymes. DNA or RNA having such catalytic properties may be used. The term "antisense" Is a nucleic acid having a sequence complementary to the target sequence, for example, Bridize A nucleic acid that inhibits the expression of the mRNA of the nucleic acid by the solution. "S The term "sense" refers to nucleic acids having a homologous or homologous sequence to the target sequence, for example, A nucleic acid having a sequence that binds to a protein transcription factor and is involved in the expression of a given gene; means. According to one preferred embodiment, the nucleic acid is associated with the beneficial gene and the beneficial gene. And an element capable of expressing the gene. The nucleic acid fragment has the form of a plasmid Advantageously.   Deoxyribonucleic acids can be single-stranded or double-stranded, and can be short oligonucleotides , Longer arrays are acceptable. Deoxyribonucleic acid regulates the regulation of genes, transcription or replication. It may carry a nodal sequence, a binding region with other cellular components, and the like. Such a gene To study marker genes, ie cell function, migration or gene function A gene that produces a detectable marker of a gene; a therapeutic gene; a protective antigen or immunogen Gene; The term "therapeutic gene" as used in the context of the present invention specifically refers to therapeutic Means any gene encoding an RNA or protein product that has an effect I do. The encoded protein product is a protein, peptide, etc. this The protein product may be homologous (ie, homologous) to the target cells. -Get cells have no etiology Product that is normally expressed inside target cells when not present). in this case Transgene expression can be caused, for example, by inappropriate expression or modification inside the cell. To resolve the expression of inactivated or reduced-activity proteins, or To overexpress the most important protein. Therapeutic genes may also have enhanced stability or May encode a mutant of a cellular protein with altered stability. Protein The quality product may also be heterologous to the target cell. In this case, the expressed protein complements or imparts, for example, cell deficiency activity. Do (treatment of myopathy or enzyme deficiency) or, for example, in the treatment of tumors To enhance disease resistance or stimulate the immune response. This is cancer Or suicide gene (herpes thymidine kinase) to treat restenosis obtain.   The nucleic acid preferably further encodes a therapeutic gene and / or an antigenic peptide. And / or sequences that promote expression of the gene in tissues. You. This is the genetic consideration considered if the sequence can function in transfected cells. It may be a sequence naturally responsible for expression of the offspring. Also, sequences of different origins (other The sequence responsible for protein expression or a synthetic sequence) There may be. In particular, it may be a eukaryotic or viral promoter sequence. No. For example, a promoter sequence derived from the genome of the cell to be transfected There may be. As a eukaryotic cell promoter, an inducible gene Derivative or suppressor sequences may be used. Promoters can be strong or weak It can be used regardless of whether it is adult or inducible. Ubiquity (composition) promo As for the promoters, such as HPRT, vimentin, α-actin, tubulin, etc. There is a motor. Tissue-specific programs (such as elongation factor-1-α, flt, flk) A motor can also be used. Inducible promoters include hormone-responsive promoters. (Such as steroid receptors, retinoic acid receptors, etc.) Mon-responsive promoter or antibiotics (tetracycline, rapamycin , Etc.) or promoters regulated by other natural or synthetic molecules There is. There is also a promoter sequence derived from the genome of the virus. In this regard For example, there are promoters such as EIA, MLP, CMV, and RSV genes. . In addition, these expression sequences can be conditional, transient or transient, tissue-specific. Activation or addition of regulatory sequences that allow expression or universal expression Can be modified.   In addition, nucleic acids can also target synthesized therapeutics, especially above therapeutic genes. It may contain a signal sequence that directs the secretory duct of the get cell. This signal sequence May be the natural signal sequence of the therapeutic, but may be any other functional signal or It may be an artificial signal sequence. Nucleic acids can also convert synthesized therapeutics into specific cell compartments. Guide to mitochondria for treatment of mitochondrial genetic diseases Includes signal sequence.                        Therapeutic genes and gene products   In particular, the therapeutic substance of the present invention includes enzymes, blood proteins, insulin or Hormones like growth hormone, lymphokines, interleukins, Eron, tumor necrosis factor (TNF), etc. (French Patent No. 9203120), Growth factors, for example, pro-angiogenic factors such as VEGF or FGF.   For the treatment of neurological disorders, a gene encoding neurotransmitters or their precursors Genes or neurotransmitters, trophic factors, especially neurodegenerative diseases, trauma or injury Enzymes that synthesize neurotrophic factors for the treatment of nervous system damage and retinal degeneration caused by Can be delivered by the system of the present invention. An example For example, a non-limiting example of a member of the family of neurotrophic factors is the nerve growth factor (N GF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT3 ), NT4 / 5, NT6 (including allelic variants and factors of the same gene family). ). Other neurotrophins include ciliary neurotrophic factor (CNTF), Belongs to a family of ciliary neurotrophic factors like xoxokines, leukemia inhibitors Factors. Other factors include IL6 and related cytokines; Geotrophin and its closely related genes; glial-derived neurotrophic factor (GDNF) and And their closely related genes; insulin-like growth factors such as IGF-1 and IFGF-2 ( FGF1 (acidic FGF), FGF2, FG F3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9 etc. Belonging to the family of fibroblast growth factors, such as tumor growth such as TGFβ Factors belonging to the family of factors; HARP / pleiotrophin or bone growth factor Offspring: Hematopoietic factors.   Other useful genes include dystrophin or mini-dystrophin (French No. 9111947) or secreted and non-secreted such as α-1-antitrypsin. Muscles useful for secretory treatment Encodes a protein.   Other beneficial genes include factors involved in blood coagulation, namely factor VII, factor VIII Suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase); hemog Encodes a robin gene or other protein carrier.   In yet another embodiment, proteins involved in lipid metabolism, such as apolipoproteins, Proteins AI, A-II, A-IV, B, CI, C-II, C-III, Apolipoprotein selected from D, E, F, G, H, J and apo (a) Corresponding genes, or metabolic regulatory enzymes, such as lipoprotein lipase, Hepatic lipase, lecithin cholesterol acyltransferase, 7-alph Corresponds to cholesterol hydroxylase and phosphatidic acid phosphatase Gene, or cholesterol ester transfer protein, phospholipid transfer Genes corresponding to HDL binding proteins, lipid-carrying proteins such as proteins Or LDL receptor, receptor of kilomicron remnant, A receptor selected from receptors such as a benger receptor, etc. The corresponding gene can be delivered. There are also leptins for treating obesity. Also other tumor suppressors such as p53 anti-tumor gene or HSV-tk, or Or GAX protein, which limits cell proliferation in smooth muscle (treatment of restenosis) You.   Other beneficial genes include pro-angiogenic factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF) F, VEGF-2, VEGF-3, platelet growth factor) and angiostatin. You. Also, angiogenesis k inhibitors, especially inhibitors of tumor angiogenesis, for example, , A soluble receptor for angiogenesis promoting factor, specific for angiogenesis promoting factor receptor Inhibitors (Tie2, urokinase receptor, flt1, KDR), blood vessels Antibodies (including single-chain Fv antibodies) to pro-genesis factors (eg, anti-VEGF or Is anti-FGF), anti-integrin antibody, endothelial tumor-specific toxin, angiogenesis polypeptide Peptide inhibitors (amino-terminal fragment of urokinase-ATF, Ostatin, endostatin, interferon α or β, interleukin -12, platelet factor 4, TNFα, thrombosbondin, platelet activating factor (P AI) -1, PAI2, TIMP1, prolactin fragment, etc. Gene can be delivered.   Can be secreted or produced by tissue Other proteins or peptides include, inter alia, antibodies, single-chain antibody variable fragments. (ScFv) or autologous cells such as infectious diseases, tumors, multiple sclerosis, etc. Any other cognitively competent antibody flags that can be used in immunotherapy to treat autoimmune diseases Fragment (anti-idiotype antibody). Another non-limiting of other beneficial proteins Examples include, for example, CD4 soluble receptor or TNF for anti-HIV therapy Soluble receptors, soluble TNF receptors for the treatment of rheumatoid arthritis (especially Soluble TNFα receptor) and acetylcholine soluble receptor for the treatment of myasthenia Putter; substrate peptide or enzyme inhibitor, or asthma, thrombosis, recurrence A receptor agonist peptide for treating stenosis, metastasis or inflammation; Are antagonist peptides or adhesion proteins (eg, IL-4, IL-10 and IL-13 to reduce); artificial proteins, chimeras There are proteins or truncated proteins.   Beneficial essential hormones include insulin in the case of diabetes, growth hormone and There is calcitonin.   Also, to promote an anti-tumor or anti-infective immune response, IL-2, I Immunostimulating cytokines such as L-12, Ronnie stimulating factor (GM-CSF, G-CSFNM-CSF), macrophage inflammation Symptomatic factor (MIP1, MIP2), dendritic cell activating factor (flt3 ligand) An encoding gene may be provided.   Other useful genes are described in McKusick, V. et al. A. Mendelian ( Inheritance in man, catalogs of autos omal dominant, autosomal receive, an d X-linked phenotypes. Eightth edition . John Hopkins University Press (1988) ) And Stanbury, J .; B. Et al. (Themetabolic bas is of inherited disease, Fifth edition . McGraw-Hill (1983)). Beneficial genetics Offspring are proteins involved in the metabolism of amino acids, lipids and other cellular components. Include.   Thus, non-limiting examples of useful genes include fructose-1-phosphate Rudolase, fructose-1,6-diphosphatase, glucose-6-phos Phatase, lysosome- a-1,4-glucosidase, amylo-1,6-glucosidase, amylose (1 , 4: 1, 6) -transglucosidase, muscle phosphorylase, muscle phosphofruc Tokinase, phosphorylase-b-kinase, galactose-1-phosphate Pyrbi, a gene involved in carbohydrate metabolism disorders such as uridyltransferase Acid dehydrokenase complex, pyruvate carboxylase, 2-oxogluta Rate glyoxylase carboxylase, D-glycerate dehydrogenase There are genes related to all enzymes like.   Useful genes also include:   -Genes related to amino acid metabolism disorders such as phenylalanine hydroxy Sylase, dihydrobiopterin synthetase, tyrosine aminotransferase , Tyrosinase, histidinase, fumarylacetoacetase, glutachi On synthetase, g-glutamylcysteine synthetase, ornithine-d- Aminotransferase, carbamoyl phosphate synthetase, ornichi Carbamoyltransferase, argininosuccinate synthetase, Luginino succinate lyase, arginase, L-lysine dehydrogenase, L -Lysine ketoglutarate reductase, valine transaminase, leucine Isoleucine transaminase, branched 2-keto acid decarboxylase , Isovaleryl-CoA dehydrogenase, acyl-CoA dehydrogenase, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase, acetoacetyl-C oA-3-ketothiolase, propionyl-CoA carboxylase, methylamine Ronyl-CoA mutase, ATP: cobalamin adenosyltransferase, Dihydrofolate reductase, methylenetetrahydrofolate reductase, cystati Onin β-synthetase, sarcosine dehydrogenase complex, glycine cleavage system Proteins belonging to, β-alanine transaminase, serum carnosinase, Brain homocarnosinase;   -Genes involved in fat and fatty acid metabolism disorders, such as lipoprotein lipa , Apolipoprotein C-II, apolipoprotein E, and other apolipoproteins Protein, lecithin cholesterol acetyltransferase, LDL receptor Puter, liver sterol hydroxylase, "phytanic acid" a-hydroxylase;   -Genes associated with lysosomal deficiency, for example, lysosome- a-L-iduronidase, lysosomal iduronate sulfatase, lysosome Heparan-N-sulfatase, lysosomal-N-acetyl-a-D-glucosa Minidase, acetyl-CoA: lysosomal a-glucosamine-N-acetyl Transferase, lysosomal-N-acetyl-a-D-glucosamine-6-su Lupatase, lysosomal galactosamine-6-sulfate sulfatase, Lysosomal-β-galactosidase, lysosomal arylsulfatase B, Sosome-β-glucuronidase, N-acetylglucosaminyl-phosphorotra Transferase, lysosomal-a-D-mannosidase, lysosomal-a-neu Laminidase, lysosomal aspartyl glucosaminidase, lysosome-a- L-fucosidase, lysosomal acid lipase, lysosomal acid ceramidase, lysosome Moosphingomyelinase, lysosomal glucocerebrosidase and lysosomes Mugalactocerebrosidase, lysosomal galactosylceramidase, lysoso Muarylsulfatase A, a-galactosidase A, lysosomal acid-β-gal There are lactosidase and the α-chain of lysosomal hexosaminidase A.   Non-limiting examples of useful genes also include steroids and lipids. Genes related to metabolic abnormalities in rice, genes related to metabolic abnormalities in purines and pyrimidine Genes related to metabolic abnormalities of offspring, porphyrin and heme, connective tissue, muscle and bone Genes related to metabolic abnormalities in blood, hematologic disorders, hematopoietic organ disorders, muscular disorders (myopathy) Nervous system disorders (neurodegenerative disorders) or circulatory disorders (eg ischemia and stenosis) There are genes involved.   Many of the above and below examples illustrate the possible scope of the invention. Perform the following The examples demonstrate the expression of each of the following factors. Introduction of NT3 electricity   A highly desirable gene for electrotransfer into muscle tissue is neurotrophin 3 (NT) 3). Intramuscularly in adenoviral or non-viral vectors It has been previously found that livery NT3 improves survival of pmn mice. (Haase et al., Nature 3: 429-436, 1997). this In mice, amyotrophic lateral sclerosis (AL), commonly known as "Lou Kelig's disease" S) is a useful animal model. NT3 gene therapy for this insidious disease Greatly facilitated by the introduction of NT3 electricity to ensure proper reproducible expression of nutrients Is expected. Electric introduction of acidic FGF or VEGF   Another gene that is highly desirable for electrotransduction into muscle tissue is acidic FGF (aFG). F; ECGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). Yes for these factors Deviation has also been found to be effective in treating arterial occlusive disease. Against this disease Gene therapy with aFGF or VEGF with enhanced electrical transduction It is expected to further improve efficiency. Coordinatively, especially via active cardiac coordination By applying an electric field, treatment of cardiac arterial occlusive disease may be possible.   The therapeutic nucleic acid may also be expressed in the target cell so that the target cell Genes or antisense that can control gene expression of NA transcription It may be an array. Such sequences may be, for example, RNA targets complementary to cellular mRNA. Transcribed into a get cell and tanned according to the method described in EP 140,308. Block translation of parkin. Also select target RNA for therapeutic gene There is a sequence encoding a ribozyme that can be destroyed (EP 321, 201). issue).                        Immunogenic genes and vaccines   As noted above, the nucleic acids may also be immunoreactive in a human or animal body. One or more encoding an immunogenic or antigenic peptide capable of eliciting an answer May contain genes. According to this particular embodiment, the invention is used in humans or animals. Manufacture or immunize vaccines, especially against microorganisms, viruses or cancer It is possible to perform epidemic treatment. Such vaccines include Epstein Burr virus, HIV virus, hepatitis B virus (EP 185,57 No. 3), pseudorabies virus, “syncytium forming virus”, specific anti-virus of other viruses Tumor-specific antigens such as a progenic peptide or a MAGE protein (EP 2 59,212) or anti-major responses such as bacterial heat shock proteins. There are antigens that can be stimulated.                                 vector   In the method of the present invention, any type of vector or vector that can enhance gene transfer is used. Alternatively, the nucleic acid can be linked to a combination of multiple vectors. Non-limiting examples of these vectors are , Viral vectors, synthetic or biosynthetic substances (eg, lipids, polypeptides, Lycoside or polymer) or beads with or without propellant. Also, measures to enhance gene transfer, such as local or systemic application Pharmacological treatment or enzymatic, transparent (field Use of surfactants), after surgical, mechanical, thermal or physical treatment of the tissue May be used to inject nucleic acids.   The following examples illustrate the invention without limitation.                                  Example Example 1: Standard electroporation conditions   For example, U.S. Patent Nos. 5,468,223, 5,304,120 and 5,5. Nos. 07,724, 5,273,525, 5,318,514, 5,4 Nos. 39,440, 5,462,520, 5,464,386, 5,0 19,034 and 5,389,069, and International Patent Publication WO 97/07 The standard electroporation conditions used at 826 were tested. These conditions tested were: As described in more detail below, the efficiency of nucleic acid (plasmid DNA) introduction into striated muscle is It was found to be low and sometimes inhibitory.                               Materials and methods   In this example, the following materials were used.   DNA pXL2774 (patent PCT / FR96 / 01414) is lucifer It is a plasmid DNA containing a reporter gene for the enzyme. The other material is Ketami , Xylazine, saline (0.9% NaCl).   Oscilloscope and commercially available electric pulse (rectangular or square pulse) generator (element (Cutropal sweater PS 15, Jouan, France) was used. used The electrodes are stainless steel flat electrodes with a 5.3 mm distance between the electrodes.   The experiments were performed on C57B1 / 6 mice. Pre-experiment mice in various cages Distributed randomly ("randomized").   Mice were anesthetized with a mixture of ketamine and xylazine. Plasmid solution ( 30 μl of a solution having a concentration of 500 μg / ml in 0.9% NaCl) was injected into Hamilton. A projectile was injected into the upper tibia muscle of the left and right hind limbs from the skin in the body length direction. Lead to two electrodes After applying the conductive gel, the hind limbs after plasmid injection were brought into contact with the electrodes and placed between the electrodes. Was.   One minute after the injection, an electrical pulse is applied perpendicular to the muscle axis using a square pulse generator. Applied. Electric field strength (volts) (values shown in the examples represent maximum values), 1 Hz The duration (milliseconds) and frequency (hertz) of the pulse sent by the oscilloscope Can be confirmed by Eight pulses were continuously applied.   Plasmids to assess muscle transfection Mice were euthanized 7 days after dosing. Extract and measure the upper tibia muscles of the left and right hind legs And ground in a dissolution buffer. Centrifuge the obtained suspension to obtain a clear supernatant Was. 10 μl of supernatant using a commercial photometer where the substrate is added to the solution fully automatically Was measured for luciferase activity. Muscle luminescence response when using all suspensions RLU (Relative Luminescence Unit, (Relative light intensity). Each experimental condition was determined by performing bilateral injections on five animals. Tested at 10 points. Statistical comparisons were made by non-parametric tests.                               Results and discussion   The results are represented by two figures, a primary scale or a logarithmic scale.   In this first experiment, the conditions used for tumor electroporation were 800-1 The effect of an electric field of 0 volt / cm was tested (Mir et al., Eur. J. Cancer).   27, 68, 1991; U.S. Pat. No. 5,468,223).   According to FIG. 1, compared to a control group injected with DNA without using electric pulse. When:   When 8 pulses with a duration of 0.1 millisecond at 1200 volts / cm are applied, The average value of luciferase activity is extremely remarkable Decreased;   When 1 millisecond pulse is applied at 1200 volts / cm, 3 animals die Died, and the mean value of luciferase activity dropped very markedly;   Luciferase activity even when a 1 ms pulse is applied at 800 volts / cm Mean significantly decreased; It is observed that   Most of the muscles affected by the electric field had obvious deterioration to the naked eye (crushed). Easy-to-white appearance).Example 2: Electrotransfer of nucleic acid   This experiment was performed on C57B1 / 6 mice. The electric field strength of the pulse and the pulse The processing conditions other than the duration were those of Example 1.   The results are shown in FIG. The results of Example 1 were reproduced. That is, 800 volts / cm Series of 8 pulses with a duration of 1 millisecond are luciferase detected in muscle Had an inhibitory effect on the activity. Same inhibition and muscle tissue at 600 volt / cm electric field The same alteration was observed. However, if the pulse width is reduced at this voltage, D Increased NA introduction and easy to avoid tissue damage Is done. On the other hand, a very unexpected and notable consequence is that lower voltages can be applied. In this case, there is no muscle deterioration that can be observed with the naked eye. In addition, 400-200 volts / Cm means that the average transfection level of the muscle is Above the average transfection level. Notable is that The dispersion of the luciferase activity value when an electric field of 200 volts / cm is applied, This was significantly lower than the control group (without applying the electric field). The SEM in the presence of the electric field was 20.59% of the mean value, 3.32% (FIG. 2A)).   As will be readily apparent to those skilled in the art, these data are The prior art electricity introduction device was modified in accordance with the knowledge of the present invention to provide a system and equipment. It can be built. Modification is easy, but the consequences are Far more than you think. The system or device of the present invention is efficient and reproducible Both produce unexpected enhancements as reported in this and the following examples.Example 3: Electrotransduction enhances transgene expression.   This experiment was performed on C57B1 / 6 mice. Pulse electric field Other than intensity and pulse duration and pulse delivery 25 seconds after DNA injection The processing conditions were the same as in the preceding example.   The results are shown in FIG. The average value of the expressed luciferase transgene was 2 Increased after a pulse of 5 ms duration at 00 volts / cm and increased to 100 volts / cm Significantly increased by a pulse of 20 ms duration.   This experiment was also performed by DNA electrotransfection of muscle. The average value of the luciferase activity measured is between 200 and 100 volts / cm. Indicates that it is a function of the duration of the electrical pulse when used. Also, electro We also see that the variance of the numbers was significantly smaller in the transfected muscle group. (FIG. 3A). The SEM in the absence of the electrical pulse (control) is the mean of 77. 43%, but the relative SEM is 200 volts / cm, pulse time 5 ms. It drops to 14% under electric field conditions, and 200 volts / cm, pulse time 20 ms To 41.27% under field conditions and 3 when electricity is introduced at 100 volts / cm. It is in the range of 0% to 48%.   When this experiment is performed under optimal conditions, transgene expression is absent of electrical pulses. 89.7 fold increase over controls injected in the presence did.Example 4: 200-fold increase in expression   This experiment was performed with a DBA2 mouse, with various holdings at an electric field strength of 200 volts / cm. A duration electric pulse was used. Other conditions of this experiment were the same as those of Example 3. New   This example demonstrates that transfection of luciferase activity was 200 volts / cm, starting with a pulse duration of 5 milliseconds and increasing with increasing duration This indicates that the addition is continued (FIGS. 4 and 5). Individuals represented by SEM Observed lower variance between samples compared to non-electrotransfected controls Was done. The relative value of the SEM is equal to 35% for the control, but 1, 5, 10, 25, 22, 1 when using 15, 20, and 24 ms pulse series 6, 18, 16 and 26%. When performing this experiment under optimal conditions, the transformer Gene expression was increased 205-fold compared to controls injected in the absence of electrical pulses . These results indicate that electricity introduction under the conditions described in these examples is efficient and reproducible. It proves that both are greatly improved.Example 5: Quantification of electricity introduction efficiency   FIG. 5 shows the parameters corresponding to the product of “number of pulses × electric field strength × duration of each pulse”. The importance of the data. This parameter is actually a function of the change in electric field. Corresponds to time-dependent integration.   The data in FIG. 5 represents the results obtained from experiments 2, 3 and 5. Electric field strength 2 Evaluation was performed at 00 V / cm and 100 V / cm or in the absence of an electric field. The data is Transfection efficiency is a function of the product of the total field application time and the field strength. Indicates an increase. The product of “electric field × total of pulse duration” is 1 kV · mse When the value exceeds c / cm, the enhancement effect is obtained. According to a preferred embodiment, " The product of “electric field × total of pulse duration” becomes a value of 5 kV · msec / cm or more. And a promoting effect can be obtained.Example 6: Wide useability of electricity introduction   Further experiments were performed to confirm the results of Example 2-5 above. In fact, the mouse Remarkable and reproducible in rats and rabbits by using low voltage electrical pulses Enhanced gene transfer was observed. The conditions used were for tumor, skin or hepatocytes. Under conditions previously described as ineffective for other test cell types, such as is there.   This example was tested with the following parameters changed: -Electric field characteristic values: Optimal conditions for the mouse tibialis muscle are voltage / cm, number of pulses, The wave number and duration are specified as 8 pulses of 200 V / cm, 20 ms, 1-2 Hz. I do. -Electrode shape / type: Non-invasive planar electrodes were used for most experiments. Needle electrode The quality was proved in rabbit experiments. The amount of DNA (when using optimal transduction conditions for mouse tibialis); -Various DNA batches; -Various reporter genes: luciferase, LacZ (mouse), FGF (la ); Various animal species: mice, rats, rabbits; Various injection sites: tibialis, gastrocnemius, quadriceps, mouse tibialis, rabbits Tibialis, quadriceps and triceps muscles; The distance between the pulse site and the injection site; -Timing of application and injection of electric pulses; -Injection and pulse application by multiple experimenters.   The observations are shown below: -Significant increase in gene transfer compared to single injection of nude DNA: below control level First, 5-10 to 100 times or more in mouse muscle and 100 to 25 times in rat. 0-fold increase, 100- to 50,000-fold increase in rabbits; -Significant reduction in inter-animal variance / fluctuation: the electrical pulse is in the same area immediately after DNA injection Must be injected into the place. DNA vector is administered within 30 minutes before pulse Response does not decrease significantly. Therefore, multiple injections of DNA are performed at multiple adjacent sites. A single pulse can be supplied after -When mice are tested with LacZ and then subjected to histological analysis, It was confirmed that the number of muscle fibers expressing 増 加 increased 10-fold. Rats tested with FGF The data tested also showed a significant increase in the number of expressing cells; -Realization using secreted alkaline phosphatase, secreted reporter protein gene Experiments showed that the rate of increase of secreted protein quantified in serum was log 2; -Inverse size dependence of transfection efficiency: smaller plasmids are more efficient Transfected. However, the electrophoresis device is not Instead, increase DNA transduction efficiency Dramatically improved, and therefore transfected with YACs, cosmids or artificial chromosomes Overcoming serious obstacles to operation; -Dependence on promoter and protein processing: Efficiency of electrotransfer remains It is completely independent of the transgene promoter that regulates another level of gene expression. No. In addition, secretory or other regulatory / processing sequences in the gene product may Has no effect on rates.   These experiments have some side effects associated with electroinduction, To show that side effects are minimal. Local inflammatory response and regeneration process is 7 days after pulse Later reported. The inflammation was minor and reversible. Electric pulse is whole body to mouse Induces contraction. In rats, this effect is much smaller and is localized to the hind limbs. You. Preliminary rabbit experiments show that only pulsed muscle groups produce contractions Is shown. Anesthetized rat or rabbit shows no apparent pain response (screams) I didn't. All animals awake from anesthesia have apparent pain in the treated hind limbs. Not shown.   In these experiments, the electrotransfer device used under the conditions described in this application Reduced inter-experiment variability, reduced or eliminated side effects, It shows that it is excellent in such points. These results are described in more detail in the following examples. Put on.Example 7: Transfection as a function of pulse duration   In this example, the extension of the pulse duration under the conditions It shows the effect on the efficiency.   Genetronics / BTX T820 pulse generator (BTX, Gene C5, except for the use of C.Tronics subsidiary San Diego, CA). The same experimental conditions as in Example 1 were used for 7Bl / 6 mice. BTX pulse emission The creature was capable of applying a square pulse with a duration of less than 100 ms. Plasmi PXL2774 (WO97 / 10343) was injected (15 μg). 200V Transfection with extended pulse duration (T) at a constant field strength of / cm Table 1 shows that the efficiency is improved.   These data provide the optimal parameters for an electrophoresis device to deliver nucleic acids to muscle. Set the parameters. Such a device preferably produces fewer pulses of 20 ms or more. At least four pulses, preferably eight pulses are supplied. Table 1: Pulse duration dependence of electricity introduction efficiency  Mean luciferase activity per muscle ± SEM is expressed as 1 million RLU. N = 10. Electricity introduction conditions: electric field strength 200 V / cm, frequency 1 Hz.   These data indicate that, under the conditions of the optimal electric field strength described in this application, 2 shows that the DNA transduction efficiency is further improved by extending the duration of the DNA transfer. For example , Up to at least 40 ms for an 8-pulse series, for a 4-pulse series Extension of duration up to at least 50 milliseconds with 200 V / cm transfect Significantly improve the efficiency of the application. For other electric field intensities Is possible.Example 8: Transfection as a function of pulse number   In this example, the transfection efficiency was The effect on   The experimental conditions were the same as described in Example 1, except that the C57B1 / 6 A mouse was used. Table 2 shows that the pulse duration was 200 milliseconds at 200 volts / cm. And the number of pulses increases from one to two, four, six, eight, twelve and sixteen. The transfection efficiency was remarkably improved as compared with the control (no electric field applied), This shows that the optimum value was obtained in the range of the pulse. Also, electrotransfect Variance (SEM) decreased compared to control (0 pulse) in all groups tested are doing. Table 2: Transfection efficiency vs. pulse number  Mean luciferase activity per muscle ± SEM is expressed as 1 million RLU. N = 10 for each group. Electric field strength 200 V / cm, frequency 1 Hz.   These data show that the electrotransducer increases DNA transduction efficiency as the number of pulses increases. Indicates to improve. Under the tested electric field conditions (200 V / cm), the device is suitable Is supplied with 4 pulses or more, more preferably 8 pulses or more. Increase or decrease the number of pulses To be Therefore, the electrophoresis device regulates the nucleic acid transduction efficiency, thereby regulating the expression level I can do it.Example 9: Transfection as a function of frequency   This example demonstrates that increasing the frequency of the pulse improves transfection efficiency. Indicates that In clinical use, an electrical conductor that applies higher frequency pulses The input device may reduce the patient's pain as it reduces the total time of applying the electric field. Therefore, Increasing the frequency will both increase delivery efficiency and reduce patient distress. Achieved.   The experimental conditions were the same as described in Example 1, and C57B1 / 6 mice were used. Plasmid pXL2774 (15 μg) was injected. Electric field strength 200 volt / c m, with a duration of 20 milliseconds, 4 or 8 pulse frequency from 0.1 to 4 Hz. Was changed. Table 3 shows the results. Table 3: Transfection efficiency versus frequency (Hz)  Mean luciferase activity per muscle ± SEM is expressed as 1 million RLU. N = 10 for each group. Electric field strength 200 V / cm, pulse length 20 ms.   The results show that high frequency (> 1 Hz, preferably 2H z or more) improves transfection efficiency. Example 10: Electrotransformer using an electric field that decays exponentially with time Sfection   In this example, the exponentially decaying electric field was applied to the nucleic acid introduction effect in vivo. Shows the effect on rates.   In this experiment, C57B1 / 6 mice were used. Qualified Photinus pyralis luciferase (pGL3; Genbank   Access number CVU47295) to the early days of the cytomegalovirus (CMV IE) Promoter (Genbank accession number HS5IEEE) and SV40 Polyadenylation signal of virus (Genbank access number SV4CG) Obtained from plasmid pXL2774 by introducing Plasmid pXL3031 (FIG. 12) was used in this experiment. 10 μg of DN A was injected.   The commercially available electric pulse generator used (Equibio electropulsator, The model easyjectT Plus, KentUK) is indexed over time It was designed to generate a pulse of a numerically attenuating electric field. The recorded applied voltage is Exponential peak voltage. The second adjustable parameter is capacitance (ΜF), which can regulate the amount of energy delivered.   Table 4 shows that when an exponentially decaying electric field pulse is applied, no electric field is applied. Shows that a very significant increase in transgene expression is obtained as compared to. this The result is that for different energies corresponding to different time constants of the exponential function at different voltages Obtained You. Energy can be increased or decreased by the adjustable capacitance of the instrument. This fruit The parameters determined in the experiment can be applied to the electroinduction device. Table 4: Transfection using an electric field that decays exponentially with time Efficiency (luciferase activity compared to control)   Pairs obtained by injection of plasmid pXL3031 under non-electrotransfer conditions. Increased luciferase expression level relative to control level. Mean increase in expression level Represents Number of mice per test N = 4-6.   According to comparison, 8 pulses of 200 V / cm, 20 ms each, 1 Hz frequency The increase in luciferase activity using the shape pulse was 44.   These data are derived from electrical conductivity applying an electric field that decays exponentially with time. The input device has low field strength and high capacitance (eg, 200 V / cm, 3, 000 μFarad).Example 11: Combination of one short high voltage pulse and multiple long low voltage pulses   This embodiment shows that the delivered electric field has a short duration, for example 50 or 100 μsec. At least one high electric field of 500-800 volts / cm for a duration of Long duration, in this embodiment at least 1 ms and less than 90 ms May also consist of a combination with one low electric field (<100 volts / cm) Show. The low electric field value is 80 V / cm, 1 Hz for each 90 ms duration Are applied as four pulses. This experiment used two commercially available electric pulse generators. (Jouan and Gentronix). Power is supplied by one of the pulse generators. Pressure and then manually change the operating configuration within one second to A voltage was applied to the electrode plate by a loose generator. Code for luciferase used The plasmid to be injected was plasmid pXL3031, and the amount injected was 3 μg. Was. Electric field strength The degree values were changed as shown in Table 5. Other conditions for this experiment are described in Example 1. Condition.   Table 5 summarizes the experiments. One data compared to the control group (no electric field applied) Short high-voltage pulse or four consecutive long low-voltage pulses or low-field pulse The combination of the application of the high electric field pulse after the application of the It shows that it did not improve. Conversely, 80 after the application of one short high voltage pulse In experiments combining V / cm, 90 ms duration, and 1 Hz 4 pulses, the control The transfection efficiency of DNA was extremely remarkably improved as compared with the group. These data Thus, a preferred electrointroducer would use a series of shorter pulses of higher field strength. It is thought to supply. Table 5: Combinations of pulses of various intensities and times  As shown in Example 1 above, 600, 800 or 1200 volts / c Application of 8 pulses of m, 1 millisecond, and frequency of 1 Hz causes muscular lesions and transfection. Inhibition. The results obtained in this example show that under certain conditions It shows that high voltage electric field strength can be used without causing. In fact, the naked eye of the muscle No detectable lesions were apparent. Short duration of high electric field Later use of a long duration, low electric field is an alternative to regulating DNA transfer efficiency. It can be an alternative.Example 12: Kinetics of luciferase expression in muscle   The use of the electrotransducer of the present application is useful for transfection of nucleic acids and stable Sustain high level expression for at least 4 months obtain.   C57B1 / 6 mice were used for this experiment. Plasmid pXL2774 ( 15 μg) was injected intramuscularly into mice. After DNA injection, apply an electric field under the following conditions: Applied: 200 V / cm; 8 pulses of 20 ms; frequency 1 Hz. Other conditions are The conditions were as described in Example 1. Groups of 10 animals at various time points after DNA injection Mice were killed and luciferase activity was measured. An electric field was applied to the control mouse. Did not.   The data in FIG. 6 shows that luciferase expression was detected 3 hours after plasmid injection. And increased to 3 days later (D3). Luciferase expression is 35 days After that it starts to decrease. In the group treated with the electric field, It is noteworthy that the transfection instead increased very clearly. Expression of transfected DNA was maintained after electrotransfer, but in control muscle Expression decreased, and the difference between the control group and the treated group after 121 days (D121) was It was even more pronounced.   More notably, the transgene expression levels were stable until 121 days later. Was. This result is particularly advantageous in terms of long-term clinical treatment with therapeutic genes. You.Example 13: Histology of electrotransfected mice   Histological analysis of the course of the kinetic test indicates that no critical inflammatory response is present. And was confirmed. Moderate as indicated by the presence of macrophages and lymphocytes Inflammation was observed. This inflammatory response was significantly reduced by D121, The gene expression level maintained a stable high value as shown in FIG.   Tissue was obtained under these conditions except that plasmid pXL3004 (FIG. 13) was used. Analysis was confirmed. This plasmid contains a plasmid encoding β-galactosidase. Rasmid pCOR (pXL2774; see WO97 / 10343). Nuclear station Signal sequence (Mouvel et al., 1994, Virology 204: 18). LacZ gene modified with plasmid pCDNA3 (In vitrogen, The Netherlands) and the SV40 promoter obtained from Control of the rearenylation signal (Genbank access number SV4CG) Plasmid pXL2774 was modified by introducing it under plus Animals were sacrificed 7 days after mid administration. Β-galactosidase by histological analysis Transfected cells were detected (Xgal histochemistry) and aluminized (alu). mixed) Inflammatory foci were detected by calamine staining, and muscular by hematin-eosin staining. Characterization of the tissue state was performed. Do not apply an electric field to control mice won.   Electrically permeable and non-permeable muscles showed the following differences: The number of myofibrils expressing β-galactosidase was determined by electrotransfection. Muscle (mean 76, N = 6 mice) and control (mean 8.5, N = 8 mice) Had increased twice. Most of these muscle fibers are stationary tissues with nuclei localized at the periphery. You. Myofibrils with very few central nuclei (regenerating) emit β-galactosidase Is showing. -The area of β-galactosidase expression in the electropermeable muscle is twice (4 mm) of the control. Yes, the expression gradient descends from the injection site. -In this test, the electropermeable muscle was reversible in number of infiltrates (macrophages and lymphocytes). Spheres), many regenerating muscle fibers with a central nucleus, filled with phagocytic macrophages It is noted that it has a large number of necrotic fibers. Zones of inflammation, necrosis and regeneration Corresponds to the zone around transfected myofibrils. This response can be continued for up to two weeks. He continued to recover naturally. The untransfected part of the muscle is kept in good condition ing. -In electrically impermeable muscles, a small number of necrotic and other regenerating myofibrils Localized around the injection site with inflammatory foci.   In summary, these data indicate that electroinduction conditions cause observable inflammation However, inflammation is not significant, especially when compared to the dramatic increase in nucleic acid transfer efficiency. To indicate that In addition, kinetic data show that transgene expression is It shows that inflammation recovers spontaneously while being kept stable. Example 14: Effect of nucleic acid injection time on electric field application time   In this embodiment, the injection of nucleic acid into tissue (in this case, muscle) is performed with a small electric field At least 30 minutes before, and at least 1 hour before You.   Plasmid pXL2774 (15 μg or 1.5 μg) was introduced into C57B1 / 6 mice. g) was injected intramuscularly. Inject DNA within 120 minutes or 60 seconds before applying electric field did. The electric field conditions used were 200 V / cm, 8 pulses of 20 ms duration, The frequency was 1 Hz. Control mice were injected with plasmid without electric field. I entered. Other experimental conditions were the same as those in Example 1.   The data is shown in Table 6. Inject DNA within 1 hour before applying electric field This improves the transfection efficiency detected by luciferase expression. The above has been achieved. A dose of 15 μg of plasmid per muscle is 1.5 μg. A similar trend was observed at the 1/10 dose. Inject plasmid after applying electric field No increase in DNA transfection efficiency was observed when transfected . Table 6: Electrotransfer efficiency of plasmid injected before and after application of electric field Table 6A: DNA injection in absence of electric field (control) Table 6B: DNA injection before application of electric field Table 6C: DNA injection after application of electric field   Injection of plasmid DNA within 1 hour before application of electric field generates high level of plasmid In contrast to this observation that gave birth, many researchers found in vitro electroporation In the case of, it was observed that the plasmid had to be given at the time of applying the electric field. .Example 15: Dose-response by electroinduction   Statistical analysis shown in this example can compare dose-response under electrotransduction conditions . This test shows that the use of an electrointroduction device can significantly disperse the level of plasmid expression. It has proved to be significantly reduced.   Using 5-week-old C57BI16 mice, luciferase transcript for cytoplasmic expression was used. 0.25-32 μg containing the gene under control of the CMVh promoter Various doses of DNA (plasmid pCOR-pXL3031) were added to each DNA dose. Mice were bilaterally injected into the upper tibia muscle of mice at a rate of 10 per animal. DNA Was varied from 0.25 to 32 μg. Immediately after injection, 250 An electric field of V / cm was applied with four pulses of 20 ms and a frequency of 1 Hz. Processing Animals were sacrificed 5 days later and the expression of the transgene in the tissue extract of each muscle was determined as in Example 1. Inspection was performed according to the protocol described in (1). Under these conditions, the naked eye observation of muscle Thus, two of the 150 muscle tissues that were processed showed slight signs of thermal damage. Was found to exist.   The change in variance, shown as a function of the change in mean for each set of mice (n = 10), is compared Comparison shows that the distribution of transgene expression is lognormal. Analysis of the graph (FIG. 7) showing the results of the calculations confirms that the expression A linear change was confirmed with the log of the dose.   The Cochran test shows that the variance is equal for all regressions (with and without electricity induction). This shows that all calculations can be performed using the residual variance because they are unique. Linearity Was not significant under the conditions of electricity introduction when the allowable range was 5%. . On the other hand, under standard conditions (non-electric use conditions), the variance for linearity Extremely large (p <0.01), which means that the transfection efficiency of DNA Indicates very non-uniform. The data show that the surplus variance when electricity is not used is five times that when electricity is used. Indicates that there is.   Considering the calculated value of the residual variance, a comparative test of transfection efficiency In order to obtain the same reliability result, use the electricity Five times the number of animals will be required compared to below. This analysis uses an electrical induction device. Clearly show the benefits. In addition, with the 95% confidence, the transgene expression Or the number of infused animals needed to demonstrate a 10-fold dispersion, respectively, 165, 40 or 25 animals under the use condition, but 33 , 8 or 5 animals. This type of calculation is summarized in Table 7 below. Table 7: Total number of animals required for statistically significant plasmid expression by electrotransducer Arithmetic   These data show that electrotransduction technology significantly improves transfection efficiency. As well as significantly reduce the variance of the response. Indicates that The method and apparatus for performing the method include: Allows for more rigorous analytical testing of genes and replicates therapeutic genes within therapeutic procedures Enables possible delivery.   The comparison of the slopes obtained for each regression is not significant. So the two regressions are It can be considered similar in the allowable range of 5%. The calculation of relative potency is the same Under standard conditions, compared to the use of an electroinduction device, about 2 per muscle Indicates that 50-fold DNA injection is required (243 ± 85; confidence interval P = 95%). This result is the same as that injected under electrophoresis compared to the standard DNA injection. Indicated by an approximately 500-fold increase in expression of the transgene at the dose of DNA It is.   This example is further enhanced by the two luciferase-encoding plasmids. Significant linear correlation between amide injection volume and electrotransfection Indicates that it can be confirmed. This correlation is much smaller in the absence of electricity introduction . Statistical analysis also showed that variance was significantly reduced in the electrotransfected group. Show that you are a little. Therefore, using the electrointroduction device of the present invention, By increasing or decreasing the injection volume, It is possible to effectively and predictively regulate expression levels of the transgene.Example 16: Electricity introduction by various electrodes   This embodiment provides an electrical system with one of two types of electrodes, a planar electrode and a needle electrode. The effects of the introduction device on the nucleic acid introduction efficiency will be compared. The needle electrode can also be The test was performed in the right direction.   Plasmid pXL2774 (150 μg) was injected into the triceps of rats. Plane The electrodes were arranged as described in Example 1 with a distance between the electrodes of 1.2 cm. Needle electrode The distance between the electrodes was 0.9 cm. Needle electrodes on the muscle fiber axis on both sides of the injection site The muscle tissue was pierced by equal lengths in parallel or perpendicular directions. The type of electrode Is 200 V / cm, 8 pulses of 20 ms, frequency The test was performed under an electric field condition of 2 Hz.   FIG. 8 shows the results of this experiment. Data is for electrotransfection It is shown that they are equivalent regardless of the method of applying the electric field. By needle electrode and flat electrode As a result, equivalent transfection levels were obtained. In addition, the efficiency of electricity introduction is muscular It was not considered to be dependent on the direction of the needle electrode relative to the direction of the fiber.   These data indicate that the electrical introducer is It shows that a flat electrode or a needle electrode can be used regardless of the direction of the electrode. Departure The light method involves controlling the orientation of the electrodes by using external or interstitial electrodes. This indicates that nucleic acid can be electrotransferred. Administer nucleic acids to large muscles For example, an electric field strength of 200 V / cm at a total voltage of an intermediate strength of 100 V, for example. It is preferable to use a needle electrode which can securely arrange the electrode within 0.5 cm, which is suitable for the above. I However, as in the delivery of gene therapy for arthritis For muscles, non-invasive planar electrodes are preferred.Example 17: Electrical delivery to various muscles and species   In this embodiment, the electroinduction device is used to nucleate many different types of muscles of various animal species. It shows that acids can be used to electrointroduce.   The electroinduction device was adjusted to give the conditions specified in Table 8 for each animal genus. The results are also shown in Table 8. Table 8: Enhanced electrotransduction of nucleic acid transfection for various species and muscles   Control the luciferase expression level using the electrophoresis device (without electrophoresis) ) Is relatively increased. Electrotransfection The rate of increase in luciferase expression obtained by the method. Data is 10 per group The average of the muscle. Luciferase activity was measured 7 days after plasmid administration.   In addition, electricity introduction was tested in monkeys (Macaca fascicularis). Was. Fibroblast growth factor 1 (acid fibroblast growth factor) Plasmid pXL317 containing the gene encoding (FGF1 or aFGF) 9 (FIG. 11) shows the interface of human fibroblasts fused to aFGF cDNA. Ron signal peptide (sp-FGF1, Jouanneau et al., 1991, PNAS88: 2893-2897) is a human CMV-IE promoter and Plasmid pX introduced under control of the SV40 polyadenylation signal It was a plasmid derived from L2774 (WO97 / 10343). Development of aFGF The appearance was determined by immunohistochemistry. 500 μg of plasmid pXL3179 The number of positive cells (aFGF-expressing cells) 3 days after intramuscular injection was evaluated. The electric field condition is , 200 V / cm, 8 pulses of 20 ms each, frequency 1 Hz. The control is Not processed in the world (electricity introduction).   Table 9 shows the results of this experiment. The data improve the efficiency of DNA transfer into muscle tissue. AFGF protein expression is detected only after using an electrophoresis device Show what was done. It should be noted that under these conditions, in the absence of electricity introduction, The fact was that it could not be detected at all. Table 9: Immunohistochemical analysis of aFGF expression in monkey muscle   Immunohistochemical analysis of aFGF expression in various muscles of monkeys. The numerical value is aFGF 500 μg of plasmid pXL3179 encoding was applied with an electric field (+) or unmarked. The number of positive samples 3 days after intramuscular injection in addition (-).Example 18: Electrical induction into rat diaphragm muscle   Sustains and stably transgenes by using the electroinduction device of the present invention Being able to express certain degenerative diseases that affect diaphragm function In particular, it has important implications for the treatment of muscular dystrophy.   In these experiments, (1 mg / kg Largactyl and 150 mg / kg digit Anesthetize (using a mixture with Min) and dissect along the sternum to access the diaphragm did. Injected into the hemidiaphragm (solution of 20 mM NaCl and 5% glucose) 50 μl 50 μg of plasmid pXL2774 in). Next, along the injection trajectory, Plane electrodes were arranged on both sides of the plane with a distance between the electrodes of 1 mm. Using the following electric field conditions 8 pulses of 160 V / cm or 300 V / cm, 20 ms each, Frequency 1 Hz. An electric field was applied to the muscle within one minute after injection. Then the incision in the animal Sutured.   Table 10 shows the results. Table 10: Electrical induction into rat diaphragm muscle   The value of luciferase expression is the mean ± SE of luciferase activity per muscle. M is represented by 1,000,000 RLU. N = 12 for each group.   In this embodiment, after applying eight pulses of electric field strength of 160 V / cm and 20 milliseconds, the horizontal This shows that the expression of the transgene in the septum was significantly improved (Man-Whitney). P <0.003 in non-parametric test.Example 20: Electrotransfer of secreted alkaline phosphatase gene   This example demonstrates transfection and expression of a gene encoding a secreted protein. Indicates the ability to manifest. Secreted proteins used, for example, in methods of systemic gene therapy And used to elicit an immune response (DAN vaccine). This fruit The secretory genes shown in the examples are present in high concentrations in the bloodstream and their presence is stable. Was seen.   In this example, the plasmid pXL30 encoding alkaline phosphatase was used. 10 (FIG. 13) was used for one of the two upper tibia muscles of adult C57B1 / 6 mice. Was injected. Plasmid pXL3010 was constructed from pSEAP-basic (Clon tech, Genbank Accession number CVU09660) The gene encoding kaliphosphatase (SeAP) is the CMV promoter ( pCDNA3; Invitrogen, Netherlands) and SV40 polyadenylation. Obtained from ColE1 introduced under control of the signal. The application of an electric field Performed under standard conditions. That is, a duration of 20 milliseconds, a frequency of 1 Hz, and 200 V / c. Eight square pulses at m were applied 20 seconds after plasmid injection. Seven days later the eyes ( From the retro-orbital plexus) Commercial chemiluminescence assay for serum alkaline phosphatase concentration in isolated blood samples (Phosphalight, Tropix, Bedford, Massachus usets, US). Non-coding plug with or without electric field applied Injection of a sumid (ballast DNA) into a small number of muscles causes transgene expression It was confirmed that there was no serum alkaline phosphatase not derived.   The effect of improving the transgene expression by applying an electric field under these conditions is It was evident for various injections of Smid (Table 11). Plasmid injection volume Can increase serum alkaline phosphatase concentration by increasing Noh. Longer post-injection values in this experiment than traditional transfection For a while. Table 11: Expression of SeAP by mouse muscle with and without electroinduction  This table shows the mean value of SeAP in serum ± SEM in ng / ml.   Injection of 400 μg of plasmid (100 μg of DNA in 54 μl Serum alkaline phosphatase obtained by injecting twice with an interval of 30 minutes) The concentration of the enzyme was 0.016 μg / ml in the control, but in the case of electrophoresis, Reached 2.2 μg / ml. In addition, a fixed amount of DNA, regardless of the amount of plasmid (Total amount of DNA per mouse: 10 μg) And electrolysis when a small amount of plasmid pXL3010 was injected (≦ 1 μg) Transfection level Is further improved.   Also, the kinetics of SeAP expression was tracked. DNA dose 1 per muscle It was dosed bilaterally at 5 μg (30 μg per mouse). FIG. 9 shows the results. Significantly 7 days after transfection as a result of pXL3010 electrotransfer A stable blood scavenging SeAP concentration is observed (for at least 2 months).   From these results, when nucleic acid is introduced into muscle using the device of the present invention, secretory trauma It is confirmed that stable high-level expression of the transgene can be obtained. Therefore have muscle It can be used as an organ for production of beneficial secreted proteins, Acts directly on the muscle itself (such as the trophin gene or pro-angiogenic factor) It is possible to direct the expression of a therapeutic gene.Example 21: Electrotransfer of erythropoietin gene   This example demonstrates that a therapeutic gene can be introduced into muscle using the device of the present invention. And that expression of the gene product results in a detectable and significant physiological response. In this case, the expression of erythropoietin can be detected and the expressed protein Induces an increase in hematocrit of the ent animal.   Remains encoding erythropoietin in the upper tibia muscle of adult C57B1 / 6 mice Plasmid pXL3348 containing the gene (FIG. 16) Was injected unilaterally. Plasmid pXL3348 is a mouse erythropoietin Gene (NCBI; 193086) contains the human CMV-IE promoter and SV Plasmid introduced under control of 40 virus polyadenylation signal Obtained from pXL2774.   Immediately after the injection of plasmid DNA, an electric field (200 V / cm, duration 20 ms And 8 pulses at a frequency of 1 Hz).   Table 12 shows the results of this experiment. Table 12: Expression and effects of erythropoietin  Mean ± SEM. Number of mice per group N = 4-5.   24 days later, an injection of 1 μg of plasmid was transfected in a conventional manner. Moderately increased mouse hematocrit and electrotransfected The hematocrit of the mouse was greatly increased. Use 10μg of plasmid Increased the hematocrit of the control group. Electrotransfection The hematocrit increased significantly and the variance decreased in the affected groups. A similar increase was observed with smaller amounts of DNA (1 μg).Example 22: Electrotransfer of VEGF (vascular endothelial growth factor) gene   15 μg of plasmid p was added to the upper tibia muscle of C57B1 / 6 or SCID mice. XL3212 (FIG. 11), plasmid pC0R hVEG encoding VEGF F was injected bilaterally. Plasmid pXL3212 is VEGF (Genban k accession number HUMEGFAA) was replaced with human CMV-I Introduced under control of E promoter and SV40 polyadenylation signal From plasmid pXL2774. Commercial Electropal Using Joan, duration 20 ms, 250 V / cm, frequency 2 Hz Electrotransfection was performed with 8 pulses. Drying test from retro-orbital plexus Blood samples were collected in test tubes. One day before and seven days after plasmid injection The pull was collected. Use Quantikine kit (R & D System) Then, an immunoenzymatic assay for human VEGF was performed. Additional human VEGF series Performed in mouse serum. Table 13 shows the results of this series. Table 13: Expression of human VEGF in mouse serum   Serum VEGF concentration (ng / lit) of C57B1 / 6 mice and SCID mice Le). Control mouse serum was collected one day prior to plasmid injection.Example 23: Electrotransfection of blood coagulation factor IX gene   15 per muscle in C57BL6 or SCID mice μg of the plasmid pCorhFIX (pXL33) encoding blood coagulation factor IX. 88; the same experimental conditions as in Example 22 were used, except that Fig. 12) was injected. plus Mid pXL3388 is a human factor IX (Christmas factor, Genbank Accession). Accession number HUMFIXA) was converted to a CMV-IE promoter. And under the control of the SV40 polyadenylation signal Obtained from plasmid pXL2774. Electricity introduction condition, duration 20 ms , 200 V / cm, frequency 2 Hz. 7 days after plasmid injection The level of factor IX was measured. Trisodium citrate from the retro-orbital plexus Blood samples were collected in test tubes and the tubes were refrigerated.   The following table (Table 14) shows that pXL3388 was injected into the tibia superior muscle and the electrical Blood of C57BL6 mouse and SCID mouse to which an electric field was applied using an introduction device This shows that human TX factor was detected only in the liquid. Table 14: Expression of human factor IX   TX factor concentration in the body of C57B1 / 6 mice and SCID mice   When the electrophoresis device of the present invention was not used, human factor IX was detected in mouse blood. Not issued.Example 24: Electrotransfer of acid fibroblast growth factor (aFGF) gene   15 μg of pCor per muscle in C57BL6 or SCID mice Example 22 except that CMV aFGF (pXL3096; FIG. 14) was injected. These are the same experimental conditions. Plasmid pXL3096 is a CMV-TE promoter Of human interferon signal peptide and F under control Fusion of GF1 with coding cDNA (sp-FGF1, Joannenea) u et al., supra) downstream of the gene encoding HSV thymidine kinase transcribed and untranslated leader sequence and SV40 poly Triple helix forming sequence linked to an adenylation signal (TH, Wils et al., 19 97 Gene Ther 4: 323-330). XL2774. The following electroinduction conditions were used: 20 mm duration 8 pulses of second, 200V / cm, frequency 2Hz. Of FGF by immunohistochemistry Proven existence.   FIG. 10 shows the results of transfection of C57B1 / 6 mice. SCI The results for D mice are shown in Table 15. Of FGF-expressing fibers in randomly selected sections In terms of number, electrophoresis was compared to control muscle injected with pXL3096 only. Transfected muscle always showed clearly higher values. Electrotransf The expression of FGF after injection reached a maximum after 8 days. 21 days and 35 days later In the control group, the presence of FGF was virtually undetectable, Many positive fibers were observed in the transfected group. Table 15: Expression of aFGF in SCID mice   For each of the mouse individuals, a in the muscle section detected by immunohistochemistry The number of FGF positive fibers was measured. Muscle sections were taken from the center of the muscle.   AFGF expression as determined by the number of positive fibers revealed by immunohistochemistry Was detected only in mice treated with the electrophoresis device. DNA at lower doses AFGF expression was detected both when used and when used at higher doses.Example 25: Electrotransfer of neurotrophic factor-3 (NT3) gene   5 week old C57B1 / 6 mice and juvenile Xt / pmn mice 12.5 μg of plasmid p encoding neurotrophic factor NT3 XL3149 (FIG. 14) was injected unilaterally. pmn mice are motor neurons Amyotrophic lateral sclerosis characterized by rapid early degeneration and a predicted life expectancy of about 40 days ALS; Lou Kaleig's disease). Plasmid pXL3149 is The murine NT3 gene (Genbank accession number MMNT3) was Under control of MV-IE promoter and SV40 polyadenylation signal And obtained from plasmid pXL2774. Mouse handling 7 days after the centrifugation, the crushed muscle in PBS buffer is obtained by centrifugation (12,000 g). The expression of NT3 in the supernatant was examined, and an ELISA assay (Promega kit) was performed. ).   For C57B1 / 6 mice, 12.5 μg of plasmid DNA was injected. . Half of the mice had an electric field (250 V / cm, 20 ms, frequency 1H immediately after injection). (4 pulses of z). 95% CI calculated for the average of 20 muscles The interval was 77 ± 11 pg / muscle without electricity induction and 2.10 with electricity induction. It was 7 ± 0.9 ng / muscle. Endogenous NT3 levels Was not measured.   The same applies to NT3 expression in 4-5 day old Xt / pmn heterozygous mice Data was obtained. These mice were injected with 130 μg DNA per animal And multiple injections into various muscles (25 μg for gastrocnemius muscle, 12.5 μg for upper tibia muscle) ) Was done. The following electricity delivery conditions were used: 20 ms duration, 500 V / cm, 1 Hz 4 pulses. Seven days after plasmid administration and electric field application, these mice were NT3 in the human body. Table 16 shows the results of this experiment. Table 16: Expression of NT3 in Xt / pmn miceMean of NT3 ± SEM (pg per muscle or pg per ml plasma).   Under the experimental conditions tested here, basal levels of NT3 in gastrocnemius and upper tibia muscles. Was detected. Plus under standard DNA transfer conditions Injection of midpXL3149 increased the expression level of the NT3 gene. The present invention When using the device, a very significant increase in NT3 in tissue and plasma was observed. Therefore, regardless of the amount of plasmid DNA administered, transfection The use of the device of the present invention to improve efficiency allows the The amount of expression product of the gene is significantly increased. This increase is due to neurotrophic gene therapy It is particularly important for NT3 expression aimed at.Example 26: Electrotransfer of human growth hormone gene   Plasmid pXL3353 (Fig. 15) was placed in the upper tibia muscle of C57B1 / 6 mice Alternatively, plasmid pXL3354 (FIG. 15) (10 μg) was injected unilaterally. Step Rasmid pXL3353 (FIG. 15) contains the genomic human growth hormone gene (transcriptional release). XbaI / SphI hGH fragment extending from the initiation signal to the BamH1 site 224 bp downstream of the polyadenylation signal). Introduced under control of promoter and SV40 polyadenylation signal From the plasmid pXL2774. hGH cDNA is Reverse transcription from the pituitary mRNA library Obtained after 30 amplification cycles with nucleotides.   5 'complementary oligo:  This oligonucleotide contains a Kozak XbaI sequence.   3 'complementary oligos:   This oligonucleotide contains an NsiI site and a stop codon.   The amplified fragment was transferred to plasmid pCR2.1 (TA cloning kit). , Invitrogen) and sequenced. hGH cDNA The 681 base pair XbaI / NsiI fragment containing Ligation to the aI / NsiI fragment created plasmid pXL3354 .   The power supply conditions were 200 V / cm, duration 20 milliseconds, and frequency of 1 Hz. It was Luz. An electric field was applied immediately after the injection of the plasmid DNA. Mouse handling After 7 days, the crushed muscle in PBS buffer is obtained by centrifugation at 12,000 xg. On The presence of hGH in Qing was detected. The amount of hGH was determined by ELISA (Boehringe r Manheim).   Table 17 shows the results of this experiment. Table 17: Expression of human growth hormone Mean value of hGH expression (picogram / muscle) ± SEM   These results indicate that human growth hormone expression can be Is significantly enhanced. This increased expression is due to the genomic clone or h It is observed when any of the GH coding cDNAs is administered.Example 27: Transduction of vaccine transgene   In this embodiment, the electrotransfer device of the present invention is used for a gene (or DNA) vaccine. Indicates that delivery of the gene is enhanced. In this example, the following materials were used: : VR-HA is the hemag of influenza virus (A / PR / 8/34 strain) It is a plasmid DNA containing a rutinin gene. mVRgBDT is human Cytomegalovirus (Towne strain) glycoprotein B (gB) gene Containing plasmid DNA. Other materials were obtained from commercial manufacturers: Tamine, xylazine and saline solution (0.9% NaCl). 9 week old female Experiments were performed on Balb / c mice. Randomize mice in various cages prior to experiment (Randomized).   An oscilloscope and a commercially available electrical pulse (rectangular or square) generator Luther PS 15, Jouan, France) was used. The electrodes used are It was a stainless steel flat electrode with a distance between the electrodes of 5 mm.   Mice were anesthetized with a mixture of ketamine and xylazine. Plasmid Solution (at a concentration of 20 μg / ml or 200 μg / ml in 0.9% NaCl) 50 μl of the solution) with a Hamilton syringe from the skin to the upper tibia muscle of the left limb in the length direction. Injected. A conductive gel is applied to the two electrodes, and the injected limb is connected to the electrodes between the electrodes. Touched and placed. 20 seconds after injection, perpendicular to muscle axis by square pulse generator Was applied with an electrical pulse. Electric field 200V / cm, sustained by oscilloscope Eight consecutive pulses at a frequency of 1 Hz were monitored for a time of 20 ms.   The following immunization protocol was performed to evaluate the enhancement of the immune response: 0 days later Collection of pre-immune serum samples; 1 day after the first injection with or without electric induction; 21 days later Collection of immune serum samples; 22 days later Booster injection with or without electricity induction; 42 days later collection of immune serum samples; 63 days later An immune serum sample was collected.   Serum samples were taken from the retro-orbital plexus. Quantification of specific antibody by ELISA did. Test each experimental condition at 10 points by unilaterally injecting 10 animals did.   Table 18 shows the results of measuring the antibody titer of influenza virus against hemagglutinin. Shown in Table 18: Anti-influenza virus hemagglutinin antibody response   1 μg or 10 μg of VR-H in the absence (−) or presence (+) of an electric field Antibody titer to hemagglutinin in influenza obtained after A DNA injection . The results were as follows: 10 animals per group (1 μg of DNA was injected, an electric field was applied and 63 days It is expressed as the geometric mean ± standard deviation of 8) animals in the later blood collection group. Man-ho Using Itney's nonparametric test, inject DNA and then subject to electric field The value of p was obtained by comparing the treated or untreated groups in duplicate.   These results indicate that influenza virus This shows that the antibody titer of Rus to hemagglutinin increased about 10-fold. In fact, A small amount of DNA Mice injected and treated with an electrointroducer were injected with 10 μg of DNA but with an electric field It had higher anti-hemagglutinin antibody titers than untreated mice.   Table 19 shows the results of the antibody response to CMV glycoprotein B. Table 19: Anti-CMV glycoprotein B antibody response   In the absence (-) or presence (+) of the electric field supplied by the electroinduction device For CMV glycoprotein B obtained after injection of 10 μg of VR-gB DNA Antibody titer. Results are 10 per group (9 in the group with the applied electric field) Is the geometric mean ± standard deviation of Mann-Whitney nonparametric Using the test, DNA was injected and then two groups with or without electric field treatment were added. The value of p was obtained by comparing one by one.   These results indicate that the anti-gB antibody titer was higher in the electric field treatment group than in the control group. It shows a 4-fold increase after 42 days. Also, as already observed, electricity introduction The variance (standard deviation) was greater in the mice treated with the device than in the untreated (control) mice. Significantly small.Example 28: Electrotransfer device for tumor cell transfection   The following examples illustrate the use of electrical conductors to enhance the delivery of nucleic acids to tumor tissue. 3 illustrates the use of the input device. More specifically, preferred for the electrotransfer of nucleic acids into muscle By modifying the electrical introduction device to supply a higher voltage than the voltage, Efficient transfection of n vivo tumor cells (and many other cells) Is obtained. This example demonstrates human origin implanted in nude mice (immunodeficiency). Of various tumors or mice implanted in C57B1 / 6 mice (immune competent) Demonstrates the effect of electroinduction on various tumors in the original. The low intensity electric field is (A) Plasmid DNA transfection by intratumoral injection and (B) intratumoral injection Secretion of the protein encoded by the transgene into plasma after transfection. Proved to be more effective.Materials and methods   Transfer of tumors to female nude or C57B1 / 6 mice weighing 18-20 g Plants were implanted unilaterally. Human lung cancer (H1299) or colon adenocarcinoma (HT29) ) Is 20mm^ThreeWas implanted in nude mice. Murine fibrosarcoma (LBP) cells (10⁶Cells) or melanoma (B16) or lung cancer (3LL) Tumor (20mm^Three) Were implanted in C57B1 / 6 mice. Based on tumor size Mice were sorted and distributed into homogeneous lots.   Mice were anesthetized with a mixture of ketamine and xylazine. Tumor reaches target volume After reaching plasmid pXL3031 (cytoplasmic luciferase) or pXL3 010 (secreted alkaline phosphatase) was injected into the tumor. Plasmid solution ( 40 mM containing 250 μg / ml DNA in 20 mM NaCl, 5% glucose μl of the solution) was injected lengthwise into the center of the tumor with a Hamilton syringe. Both tumors A conductive gel was applied to the sides and the tumor was placed between the two electrodes. 20-30 of injection Seconds later, an electrical pulse was applied using a square pulse generator. The oscilloscope is The voltage intensity of the eight pulses delivered, duration in milliseconds, 200 Hz to 800 volts / cm, 20 ms, 1 Hz Was adjusted to An oscilloscope and a commercially available electrical pulse (rectangular or square) generator (d Lectro pulsator PS15, Jouan, France). The electrodes are It was a stainless steel flat electrode having a distance between electrodes of 0.45 to 0.7 cm.   To assess tumor transfection by luciferase, Two days after the injection of Smid, mice (depending on conditions, usually 10 per experimental group) Were euthanized. Tumors were excised, weighed and triturated in lysis buffer. Get The obtained suspension was centrifuged to obtain a clear supernatant. Commercial light to which the substrate is added automatically Luciferase activity in 10 μl of the supernatant was measured using a densitometer. Tumor results Per unit RLU (relative light unit, relative light intensity) did.   Secreted alkali 1 day, 2 days and 8 days after DNA injection (D1, D2, D8) Phosphatase plasma levels (SeAP) were measured by the procedure described in Example 20 above. Specified.Results and discussion Electricity delivery to human lung cancer   In the first experiment, the field intensity was 200 V / cm and the frequency was 1 Hz. Using conventional conditions for intramuscular electrical induction of the gene, the obtained results were Compared to the results obtained at higher voltages in the range of lt / cm. The purpose of the second experiment is Determine the optimal voltage conditions to apply to obtain maximum transfection. And a voltage of 400-800 volts / cm was tested. The results are shown in Table 20 . Table 20: Electrical induction for human lung cancer   Target volume 200-300mm in female nude mouse^ThreeHuman lung cancer reached Plasmid pXL3031 in H1299 tumor Was injected. Mean luciferase expression ± SEM.   According to Table 20, the DNA was injected and compared with the control group to which no electric field was applied later. do it:,   At -200 to 400 volts / cm, gene transfer is enhanced depending on the applied voltage. Reached a plateau corresponding to maximum transfection at 500 volts / cm ;   -At higher voltages (600-800 volts / cm), transgene onset Did not decrease, but skin burns or deeper burns occurred;   -Gene transfer increased about 240-320-fold by electrotransfer. Electrical induction for human colon adenocarcinoma   Table 2 shows the results of the two experiments. Compared to the control group without electricity introduction, The application of an electric field of 600 volts / cm strength Optimal transfection rates were achieved regardless of the transfection level. Each experiment Increases transfection by 6-fold and 23-fold, from 400 to 600 volts / c The values of m were relatively similar. Table 21: Electricity delivery to human colon adenocarcinoma   Target volume 100-200mm in the body of a female nude mouse^ThreeHuman colon gland reached Plasmid pXL3031 was injected into cancer HT29 tumors. Transfection Effect of electric pulses of various electric field strengths on the Mean luciferase expression ± Represents SEM. The distance between the electrodes in this experiment was 0.45 cm. Electrical induction for murine fibrosarcoma   Table 22 shows the results of the two experiments. Compared to the control group without electricity , The value of the applied voltage in the group to which an electric field with an intensity of 300 to 600 volts / cm was applied. Regardless, the gene transfer increased 30- to 70-fold. Table 22: Electrical induction for murine fibrosarcoma   Target volume 100-200mm in the body of female C57Bl / 6 mouse^ThreeReached Plasmid pXL3031 was injected into murine LPB fibrosarcoma. Luciferase Represents the current mean ± SEM. Electrical induction of murine melanoma   The results are shown in Table 23. Intensity 500 compared to control group without electricity induction In the group to which the electric field of volt / cm was applied, gene introduction was increased by 24 times. Table 23: Electrical induction of murine melanoma   Target volume 100-200mm in the body of female C57Bl / 6 mouse^ThreeReached Murine melanoma B16 tumors were injected with plasmid pXL3031. Luciferer The mean ± SEM of ze expression is shown. Electrical induction of murine lung cancer   Table 24 shows the results of this experiment. Table 24: Electrical induction of murine lung cancer  Target volume 30 mm after 5 days of growth in female C57B1 / 6 mice^ThreeReached Plasmid pXL3031 was injected into a murine lung cancer 3LL tumor. Lucifer The mean value of the expression of the enzyme ± SEM is shown.   When an electric field with an intensity of 500 volts / cm is applied, the gene expression increases 3885 times. Increased. These results indicate that these tumors were more electrical than the other tumors tested earlier. Nude under non-use conditions Indicates that it is difficult to transfect with DNA. Electrotransduction of secretory transgenes into human lung cancer   Table 25 shows the results of this experiment. Table 25: Electrotransfer of secretory transgenes into human lung cancer   Target volume 200-300mm in female nude mouse^ThreeHuman lung cancer H reached The 1299 tumor was injected with plasmid pXL3010 (SeAP expression). Lucif The mean ± SEM of expression of cellulase is shown. Apply a single electric field of 500 V / cm Then, at day 1, 2 and 8 after plasmid injection, plasma SeAP level was detected. Was.   The results of this experiment show that blood transfection FIG. 4 shows that SeAP levels in plasma result in a dramatic transient increase. GM-CSF Alternatively, when an immunostimulatory gene such as IL-2 is administered to a tumor, an effective amount Inn is born Easy to be born. In addition, these data correspond to the luciferase expression data shown above. Both combine suicide genes such as HSV-thymidine kinase with secreted cytokines. It is suggested that the administration of a solution produces a robust anti-tumor response. Or SeAP Data on urokinase (ATF) or angiostatin (or Electrical conduction of anti-angiogenic factors such as amino-terminal fragments of Transfection suggests effective gene therapy for tumors You.   The data further shows that a device for electrotransfer of therapeutic genes into tumor cells could Having an optimal electric field strength of 0 volt / cm, the optimal value is 500 V / cm ± 10% (I.e., 450-550 V / cm).   The scope of the present invention is not limited to the specific embodiments described herein. Changes described in the text It is understood by those skilled in the art that various modifications can be made from the description in the text and the attached drawings other than the shape. It will be obvious. It is understood that such variations fall within the scope of the appended claims. U.   In addition, all base sizes and amino acids shown for nucleic acids or polypeptides Size, all molecular weight and molecular mass values are approximate and are shown for convenience of description. Understand that I want to be.   Various publications are cited in the text. The contents of these publications are all referenced. It is intended to be included in the present invention by reference.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０６７，４８７ (32)優先日 平成９年12月１日(1997．12．1) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６７，４８８ (32)優先日 平成９年12月１日(1997．12．1) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０８３，８５８ (32)優先日 平成10年５月１日(1998．5．1) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ (72)発明者 ビユロー，ミシエル フランス国、エフ―92210・サン・クル、 スクエア・サント・クロチルド、１ (72)発明者 ミル，リユイス フランス国、エフ―91370・ベリエール・ ル・ビユイソン、アレ・デ・ボペパン、22 (72)発明者 シエルマン，ダニエル フランス国、エフ―75012・パリ、リユ・ エラール、10 (72)発明者 シユバルツ，ベルトラン フランス国、エフ―94700・メゾン・アル フオール、リユ・ポール・ベール、13―15────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (31) Priority claim number 60 / 067,487 (32) Priority date December 1, 1997 (Dec. 1, 1997) (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 60 / 067,488 (32) Priority date December 1, 1997 (Dec. 1, 1997) (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 60 / 083,858 (32) Priority Date May 1, 1998 (1998.5.1) (33) Priority country United States (US) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, I T, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ , CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, L S, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ , BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL , AU, BA, BB, BG, BR, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, GW, HU, ID, IL, IS, J P, KR, LC, LK, LR, LT, LV, MG, MK , MN, MX, NO, NZ, PL, RO, SG, SI, SK, SL, TR, TT, UA, US, UZ, VN, Y U (72) Inventor Byuro, Michel             France, F-92210 Saint Cru,             Square Santo Crotildo, 1 (72) Inventor Mill, Reyuis             F-91370 Bériere, France             Le Beuysson, Are de Bopepin, 22 (72) Inventors Cielman and Daniel             France, France 75012Paris, Rille             Erard, 10 (72) Inventor Schwald and Bertrand             France, F-94700 Maison Al             Foull, Liu Paul Bale, 13-15

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．導入すべき核酸を組織への直接投与または局所的もしくは全身的投与によっ て組織細胞に接触させ、１〜６００ボルト／ｃｍの強度の１つまたは複数の電気 パルスを組織に印加することによって導入を確保する処理から成る多細胞真核生 物の細胞へのｉｎ ｖｉｖｏ核酸導入システムであって、 （ａ）１ミリ秒よりも長いパルス時間及び１〜６００ボルト／ｃｍの強度の電気 パルスを０．１〜１，０００Ｈｚの周波数で発生する電気パルス発生器と、 （ｂ）電極に接触している組織内部で電界を発生させるために電気パルス発生器 に接続される電極と、 から成るシステム。 ２．電気パルス発生器が１〜４００ボルト／ｃｍの強度のパルスを発生する請求 項１に記載のシステム。 ３．電気パルス発生器が３０〜３００ボルト／ｃｍの強度のパルスを発生する請 求項１に記載のシステム。 ４．電気パルス発生器が１０ミリ秒よりも長い時間のパルスを発生する請求項１ に記載のシステム。 ５．電気パルス発生器が２〜１，０００パルスを発生する請求項１に記載のシス テム。 ６．電気パルス発生器が亙いに不規則にパルスを発生し、パルス時間依存的な電 界強度の変化を表す関数が変数である請求項１に記載のシステム。 ７．電界強度の経時的変化を表す関数の積分が１ｋＶ・ｍｓｅｃ／ｃｍよりも大 きいことを特徴とする請求項６に記載のシステム。 ８．前記積分が５ｋＶ・ｍｓｅｃ／ｃｍ以上であることを特徴とする請求項７に 記載のシステム。 ９．電気パルス発生器が、方形波パルス、指数関数的減衰波、短い持続時間の振 動性単極波、短い持続時間の振動性二極波から成るグループから選択されたパル スを発生する請求項１に記載のシステム。 １０．電気パルス発生器か方形波パルスを発生する請求項１に記載のシステム。 １１．電極が治療すべき組織の上に配置される外部電極である請求項１に記載の システム。 １２．電極が治療すべき組織に植え込まれる内部電極である請 求項１に記載のシステム。 １３．１つの電極が治療すべき組織の上に配置される外部電極であり、１つの電 極が治療すべき組織に植え込まれる内部電極であることを特徴とする請求項１に 記載のシステム。 １４．外部電極か大きい筋肉に極めて近接して患者の身体の外側部分に接触する ような寸法であることを特徴とする請求項１３に記載のシステム。 １５．電極が平坦な平面電極である請求項１４に記載のシステム。 １６．電極が半円筒状の平面電極である請求項１４に記載のシステム。 １７．電極が動脈内または静脈内の電極である請求項１に記載のシステム。 １８．内部電極が、核酸と電界とを同時投与し得るインゼクターシステムである ことを特徴とする請求項１２に記載のシステム。 １９．電極が治療すべき組織の上に配置される外部電極であることを特徴とする 請求項１８に記載のシステム。 ２０．電極がステンレススチール電極である請求項１に記載の システム。 ２１．多細胞真核生物の細胞に核酸をｉｎ ｖｉｖｏ導入するための改良装置で あって、装置が、ｉｎ ｖｉｖｏ組織内で電界を発生すべく電極に接続された電 気パルス発生手段を含み、電気パルス発生手段が、１ミリ秒を上回る時間及び１ 〜６００ボルト／ｃｍの強度のパルスを０．１〜１，０００Ｈｚの周波数で発生 するように改良されていることを特徴とする改良装置。 ２２．電気パルス発生器が１〜４００ボルト／ｃｍの強度のパルスを発生するこ とを特徴とする請求項２１に記載の装置。 ２３．可撓性カテーテル装置であることを特徴とする請求項２１に記載の装置。 ２４．組織侵入電極によって組織に核酸を植え込む装置であることを特徴とする 請求項２１に記載の装置。 ２５．組織侵入電極が針であることを特徴とする請求項２４に記載の装置。 ２６．患者の表面組織の細胞に核酸を導入する装置であることを特徴とする請求 項２１に記載の装置。 ２７．電気パルス発生手段が、６００ボルト／ｃｍに対応する電圧を超過しない ように電圧ゲートを改造することによって１ 〜６００ボルト／ｃｍの範囲のパルスを発生するように改造されていることを特 徴とする詰求項２１に記載の装置。 ２８．電圧が一定電圧に設定され、電極が一定の電極間距離に設定されているこ とを特徴とする請求項２７に記載の装置。 ２９．電気パルス発生手段が、６００ボルト／ｃｍに対応する電圧を超過しない ように装置をラベリングすることによって１〜６００ボルト／ｃｍの範囲のパル スを発生するように改造されていることを特徴とする請求項２１に記載の装置。 ３０．電気パルス発生手段が３０〜３００ボルト／ｃｍの強度のパルスを発生す ることを特徴とする請求項２１に記載の装置。 ３１．電気パルス発生手段が４００〜６００ボルト／ｃｍの強度のパルスを発生 することを特徴とする請求項２１に記載の装置。 ３２．電気パルス発生手段が１０ミリ秒よりも時間のパルスを発生することを特 徴とする請求項２１に記載の装置。 ３３．電気パルス発生手段が２〜１，０００パルスを発生することを特徴とする 請求項２１に記載の装置。 ３４．電気パルス発生手段が互いに不規則にパルスを発生し、パルス時間依存的 な電界強度の変化を表す関数が変数であるこ とを特徴とする請求項２１に記載の装置。 ３５．電気パルス発生手段が、方形波パルス、指数関数的減衰波、短い持続時間 の振動性単極波、短い持続時間の振動性二極波から成るグループから選択された パルスを発生することを特徴とする請求項２１に記載の装置。 ３６．電気パルス発生手段が方形波パルスを発生することを特徴とする請求項２ １に記載の装置。 ３７．電極がステンレススチール電極であることを特徴とする請求項２１に記載 の装置。[Claims] 1. The nucleic acid to be introduced can be administered directly to the tissue or locally or systemically. Contact one or more tissue cells with one or more Multicellular eukaryote consisting of a process that ensures transduction by applying pulses to tissue An in vivo nucleic acid transfer system for introducing a substance into cells, (A) electricity with pulse times longer than 1 millisecond and intensities between 1 and 600 volts / cm An electric pulse generator for generating pulses at a frequency of 0.1 to 1,000 Hz; (B) an electric pulse generator for generating an electric field inside the tissue in contact with the electrode An electrode connected to System consisting of 2. Claims wherein the electrical pulse generator generates a pulse with an intensity of 1 to 400 volts / cm. Item 2. The system according to Item 1. 3. An electric pulse generator for generating a pulse having an intensity of 30 to 300 volts / cm. The system of claim 1. 4. 2. The electrical pulse generator according to claim 1, wherein said electrical pulse generator generates a pulse having a time longer than 10 milliseconds. System. 5. 2. The system according to claim 1, wherein the electric pulse generator generates 2-1,000 pulses. Tem. 6. An electric pulse generator generates pulses randomly over a The system of claim 1, wherein the function representing the change in field strength is a variable. 7. The integral of the function representing the change over time in the electric field strength is greater than 1 kV · msec / cm. 7. The system according to claim 6, wherein the threshold is set. 8. 8. The method according to claim 7, wherein the integral is 5 kV · msec / cm or more. The described system. 9. The electric pulse generator generates square-wave pulses, exponentially Pal selected from the group consisting of dynamic monopoles, short duration oscillatory dipoles 2. The system of claim 1, wherein the system generates the traffic. 10. The system of claim 1 wherein the electric pulse generator generates a square wave pulse. 11. 2. The method according to claim 1, wherein the electrode is an external electrode disposed on the tissue to be treated. system. 12. The electrode is an internal electrode implanted in the tissue to be treated. The system of claim 1. 13. One electrode is an external electrode placed on the tissue to be treated and one electrode 2. The method of claim 1, wherein the pole is an internal electrode implanted in the tissue to be treated. The described system. 14． Touching the outer parts of the patient's body in close proximity to external electrodes or large muscles 14. The system of claim 13, sized as such. 15. 15. The system according to claim 14, wherein the electrodes are flat planar electrodes. 16. 15. The system of claim 14, wherein the electrodes are semi-cylindrical planar electrodes. 17． The system according to claim 1, wherein the electrode is an intra-arterial or intra-venous electrode. 18. Internal electrode is an injector system that can co-administer nucleic acid and electric field 13. The system according to claim 12, wherein: 19. Characterized in that the electrode is an external electrode placed on the tissue to be treated The system according to claim 18. 20. 2. The method according to claim 1, wherein the electrode is a stainless steel electrode. system. 21. An improved device for introducing nucleic acids into cells of multicellular eukaryotes in vivo Wherein the device is connected to an electrode to generate an electric field within the tissue in vivo. Air pulse generating means, wherein the electric pulse generating means has a time greater than 1 millisecond and Generates an intensity pulse of ~ 600 volts / cm at a frequency of 0.1 ~ 1,000Hz An improved device characterized by being improved to: 22. The electric pulse generator generates a pulse having an intensity of 1 to 400 volt / cm. The device according to claim 21, characterized in that: 23. 22. The device of claim 21, wherein the device is a flexible catheter device. 24. Characterized as a device for implanting nucleic acid into tissue by means of a tissue penetration electrode An apparatus according to claim 21. 25. The device according to claim 24, wherein the tissue invasion electrode is a needle. 26. A device for introducing a nucleic acid into cells of a surface tissue of a patient. Item 22. The apparatus according to Item 21. 27. The electric pulse generating means does not exceed a voltage corresponding to 600 volts / cm By modifying the voltage gate to Note that it has been modified to generate pulses in the range of ~ 600 volts / cm. 23. The apparatus according to claim 21, wherein the apparatus is characterized in that: 28. The voltage is set to a constant voltage and the electrodes are set to a fixed distance between the electrodes. 28. The device according to claim 27, characterized in that: 29. The electric pulse generating means does not exceed a voltage corresponding to 600 volts / cm Pallets in the range of 1-600 volts / cm by labeling the device as 22. The apparatus of claim 21, wherein the apparatus is modified to generate a source. 30. An electric pulse generating means generates a pulse having an intensity of 30 to 300 volt / cm. 22. The device according to claim 21, wherein 31. Electric pulse generating means generates pulses with an intensity of 400 to 600 volts / cm 22. The device according to claim 21, wherein 32. It is characterized in that the electric pulse generating means generates a pulse with a time longer than 10 milliseconds. 22. The device according to claim 21, wherein the device comprises: 33. The electric pulse generating means generates 2 to 1,000 pulses. An apparatus according to claim 21. 34. Electric pulse generation means generate pulses irregularly to each other, and depend on pulse time Function representing the change in the electric field strength is a variable. The device according to claim 21, characterized in that: 35. Electric pulse generator means square pulse, exponential decay wave, short duration Selected from the group consisting of oscillatory monopolar waves and short-duration oscillatory bipolar waves 22. The device according to claim 21, wherein the device generates a pulse. 36. 3. An electric pulse generating means for generating a square pulse. An apparatus according to claim 1. 37. The electrode of claim 21, wherein the electrode is a stainless steel electrode. Equipment.