JP6011873B2 - Substance introduction method and apparatus - Google Patents
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Description
本発明は、対象細胞内部への導入物質の導入方法に関し、特に、電場を用いた導入物質の導入方法に関する。 The present invention relates to a method for introducing a substance to be introduced into a target cell, and particularly relates to a method for introducing a substance to be introduced using an electric field.
近年、生体細胞に導入物質を導入する技術のニーズは高まっている。例えば、化学物質の生体影響評価を目的としてメダカ等の受精卵へ被検物質を導入することや、遺伝子治療の実験として動物の生体細胞に遺伝子を導入すること等、その応用は医薬分野からバイオ分野まで多岐に渡っている。このような導入物質の導入技術としては、従来からマイクロインジェクション法が知られている。マイクロインジェクション法は、ガラス針を対象細胞に突き刺して導入物質の導入を行う方法であるが、その操作上、物理的な力を加えることから、対象細胞に負荷をかけることや対象細胞を破壊する場合が生じ得る。 In recent years, the need for a technique for introducing a substance to be introduced into living cells has increased. For example, the introduction of test substances into fertilized eggs such as medaka for the purpose of evaluating the biological effects of chemical substances, and the introduction of genes into living cells of animals as gene therapy experiments have been There are many fields. Conventionally, a microinjection method is known as a technique for introducing such an introduced substance. The microinjection method is a method of introducing a substance to be introduced by inserting a glass needle into a target cell. However, since a physical force is applied in the operation, a load is applied to the target cell or the target cell is destroyed. Cases can arise.
このような問題を解決する方法として、電気的な力を用いることによって、対象細胞内に対象物質を導入することが提案されている。例えば、電極間に電気パルスを印加して電場を形成し、当該電場により導入物質の電気泳動が誘引されることによって、導入物質を対象細胞内に導入する方法がある（特許文献１参照）。また、細胞内に薬剤を導入するための電気穿孔法（エレクトロポレーション）として、方形波パルスや指数波パルス等の電界パルスを印加して、細胞内に薬剤を導入する方法（特許文献２参照）や、ポリヌクレオチドを植物細胞に導入することによって、遺伝的に改変された植物を生産する方法も開示されている（特許文献３参照）。また、生体内電気穿孔療法（ＥＰＴ法）として、低電圧長パルス長を利用して細胞を死滅させる方法も開示されている（特許文献４参照）。 As a method for solving such a problem, it has been proposed to introduce a target substance into a target cell by using an electric force. For example, there is a method of introducing an introduced substance into a target cell by applying an electric pulse between electrodes to form an electric field and attracting electrophoresis of the introduced substance by the electric field (see Patent Document 1). Further, as an electroporation method for introducing a drug into a cell (electroporation), a method of introducing a drug into a cell by applying an electric field pulse such as a square wave pulse or an exponential wave pulse (see Patent Document 2) And a method of producing a genetically modified plant by introducing a polynucleotide into a plant cell (see Patent Document 3). In addition, as an in vivo electroporation therapy (EPT method), a method of killing cells using a low voltage long pulse length is also disclosed (see Patent Document 4).
さらに、本発明者らも、これまで主にメダカの受精卵に対して、電気パルスを印加する電気穿孔法により、対象物質の導入を試みている。例えば、電気パルスによるメダカ卵への物質導入における分子量と導入効率についての関連性の調査（非特許文献１）や、当該印加する電気パルスについて、パルス幅５０〜３００ｎｓの電気パルスを用いること（非特許文献２）や、パルス幅１５ｎｓ、電圧値６ｋＶの電気パルスを用いること（非特許文献３）や、高電界矩形波パルスを用いること（非特許文献４、５）を開示している。また、２種類の電気パルスを連続して印加する方法も開示しており（非特許文献６、７）、このうち、パルス幅が１００ナノ秒の高電圧矩形波パルスの印加と、２パルス分の低電圧減衰波パルスの印加を組み合わせる構成も開示している（非特許文献８）。 Furthermore, the present inventors have also attempted to introduce the target substance by electroporation in which an electric pulse is applied mainly to fertilized eggs of medaka. For example, investigation of the relationship between molecular weight and introduction efficiency in substance introduction into medaka eggs by electric pulse (Non-Patent Document 1), and use of an electric pulse with a pulse width of 50 to 300 ns for the applied electric pulse (non- Patent Document 2), using an electric pulse with a pulse width of 15 ns and a voltage value of 6 kV (Non-Patent Document 3), and using a high electric field rectangular wave pulse (Non-Patent Documents 4 and 5) are disclosed. In addition, a method of continuously applying two types of electric pulses is also disclosed (Non-Patent Documents 6 and 7). Among them, the application of a high-voltage rectangular wave pulse having a pulse width of 100 nanoseconds and the amount corresponding to two pulses are disclosed. The structure which combines the application of the low voltage decay wave pulse of this is also disclosed (nonpatent literature 8).
しかし、従来の電気的な力を利用する物質導入方法では、電圧印加の際に最適となり得る様々な電圧値や印加方法が模索されているものの、依然として、電圧印加に伴って対象細胞に及ぶ電気的ダメージが大きく、対象細胞自体が損傷を受けてしまい、電圧によっては、対象細胞（例えば、受精卵等の生体細胞等）自体を破壊してしまうという課題がある。また、上記非特許文献３に示されているように、２種類の異なる電圧印加を組み合わせるという構成も提案されているが、対象細胞に物質を導入することに対する顕著な効果は確認されていない。 However, in the conventional method for introducing a substance using an electric force, various voltage values and application methods that can be optimized when applying a voltage have been sought. There is a problem that the target cell itself is damaged, and the target cell (for example, a living cell such as a fertilized egg) itself is destroyed depending on the voltage. Further, as shown in Non-Patent Document 3, a configuration in which two different voltage applications are combined has been proposed, but a remarkable effect on introducing a substance into a target cell has not been confirmed.
本発明は、上記課題を解決すべく、電気穿孔法を用いて、電気的ダメージを抑制して導入物質を対象細胞に導入する物質導入方法を提供することを目的とする。 In order to solve the above problems, an object of the present invention is to provide a substance introduction method for introducing an introduction substance into a target cell while suppressing electrical damage using an electroporation method.
本願に開示する物質導入方法は、対象細胞（例えば、受精卵等の生体細胞等）の内部に導入物質を導入する物質導入方法において、正負に極性が変化する間に一定電位値レベルを所定時間維持してなる非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルスを、導入物質を含有する溶液中に浸漬された対象細胞（例えば、受精卵等の生体細胞等）に対して、印加するバーストパルス印加工程と、前記バーストパルス印加工程による印加後、前記対象細胞に対して、前記バーストパルスよりも高電圧且つ短時間の高電圧パルスを、１オン時間分印加する高電圧パルス印加工程を含むものである。 The substance introduction method disclosed in the present application is a substance introduction method in which an introduction substance is introduced into a target cell (eg, a living cell such as a fertilized egg). A constant potential value level is set for a predetermined time while the polarity changes positively or negatively. A burst pulse that is applied to a target cell (for example, a living cell such as a fertilized egg) immersed in a solution containing the introduced substance, a burst pulse in which the maintained asymmetric reference pulse is repeated in the same cycle. An application step, and a high-voltage pulse application step of applying a high-voltage pulse that is higher in voltage and shorter than the burst pulse to the target cell for one on-time after the application in the burst pulse application step. .
このように、本願に開示する物質導入方法は、正負に極性が変化する間に一定電位値レベルを所定時間維持してなる非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルスを、導入物質を含有する溶液中に浸漬された対象細胞に対して、印加した後、前記対象細胞に対して、前記バーストパルスを構成する基準パルスよりも高電圧且つ短時間の高電圧パルスを、１オン時間分印加することから、非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルス（非対称バーストパルス）によって、対象細胞（例えば、受精卵の対象生体等）の外膜（例えば、卵膜や細胞膜等）に対して、正負極のいずれか一方に極性が偏った電荷が連続してチャージされることがないため、電気的なダメージを抑制しつつ、一方で、溶液中に浸漬された導入物質が正負極のいずれか一方の方向に移動させられることで、導入物質が導入され易い状況が形成されることとなり、当該状況下において、高電圧パルスが短時間印加されることによって、対象細胞（例えば、受精卵の対象生体等）の外膜（例えば、卵膜や細胞膜等）に一時的な穴を形成し、その影響を最小限に抑えることで外膜内にある組織等を損傷することなく、導入物質を対象細胞（例えば、受精卵の対象生体等）の内部に導入することができる。 As described above, the substance introduction method disclosed in the present application includes a burst pulse in which an asymmetric reference pulse that is maintained at a constant potential level for a predetermined time while polarity changes positively and negatively is repeated in the same cycle. After applying to the target cell immersed in the solution to be applied, a high voltage pulse having a higher voltage and a shorter time than the reference pulse constituting the burst pulse is applied to the target cell for one on time. Therefore, by a burst pulse (asymmetric burst pulse) in which an asymmetric reference pulse is repeated at the same period, an outer membrane (eg, egg membrane or cell membrane) of a target cell (eg, a target organism of a fertilized egg) In addition, since either one of the positive and negative electrodes is not continuously charged with a biased polarity, it is possible to suppress the electrical damage while at the same time introducing the conductive material immersed in the solution. When the substance is moved in either the positive or negative direction, a situation where the introduced substance is easily introduced is formed, and under this situation, a high voltage pulse is applied for a short time, so that the target cell is For example, a temporary hole is formed in the outer membrane (for example, egg membrane, cell membrane, etc.) of the target organism (eg, a target organism of a fertilized egg), and the tissue in the outer membrane is damaged by minimizing the effect. The introduction substance can be introduced into the target cell (for example, the target organism of the fertilized egg).
本願に開示する物質導入方法は、必要に応じて、前記バーストパルスを構成する基準パルスが、正負極性間で異なる波高値を有するものである。このように、本願に開示する物質導入方法は、正負極性間における波高値の違いにより、前記対象細胞に印加されるパルスの強度を、経時的に交互に変えることから、外膜にチャージされる電荷量を調整することで電気的ダメージを抑制しつつ、一方で、溶液中に浸漬された導入物質が正負極のいずれか一方の方向に移動させることで、導入物質がさらに導入され易い状況が形成されることとなり、当該状況下において、高電圧パルスが短時間印加されることによって、対象細胞を損傷することなく、さらに大量の導入物質を一気に対象細胞に導入することができる。 In the substance introduction method disclosed in the present application, the reference pulse constituting the burst pulse has a peak value that differs between positive and negative polarities as necessary. Thus, in the substance introduction method disclosed in the present application, the intensity of the pulse applied to the target cell is alternately changed over time due to the difference in the peak value between the positive and negative polarity, so that the outer membrane is charged. While suppressing electrical damage by adjusting the amount of charge, there is a situation where the introduced substance is more easily introduced by moving the introduced substance immersed in the solution in either the positive or negative direction. In this situation, by applying a high voltage pulse for a short time, a larger amount of introduced substance can be introduced into the target cell at once without damaging the target cell.
本願に開示する物質導入方法は、必要に応じて、前記バーストパルスを構成する基準パルスが、正負極性間で異なるデューティ比を有するものである。このように、本願に開示する物質導入方法は、正負極性間におけるデューティ比の違いにより、前記対象細胞に印加されるパルスの印加タイミングが、経時的に交互に変わることから、外膜にチャージされる電荷量を調整することで電気的ダメージを抑制しつつ、一方で、溶液中に浸漬された導入物質が正負極のいずれか一方の方向に移動させることで、導入物質がさらに導入され易い状況が形成されることとなり、当該状況下において、高電圧パルスが短時間印加されることによって、対象細胞を損傷することなく、さらに大量の導入物質を一気に対象細胞に導入することができる。 In the substance introduction method disclosed in the present application, the reference pulse constituting the burst pulse has a duty ratio different between positive and negative polarities as necessary. As described above, the substance introduction method disclosed in the present application is charged to the outer membrane because the application timing of the pulse applied to the target cell alternately changes with time due to the difference in duty ratio between positive and negative polarity. In the situation where the introduced substance is more easily introduced by moving the introduced substance immersed in the solution in either direction of the positive or negative electrode while suppressing the electrical damage by adjusting the charge amount In this situation, by applying a high voltage pulse for a short time, a larger amount of the introduced substance can be introduced into the target cell at once without damaging the target cell.
本願に開示する物質導入方法は、必要に応じて、前記バーストパルスが、各基準パルスの印加電荷量を順次減衰させて構成されるものである。このように、本願に開示する物質導入方法は、後続する高電圧パルスが印加される直前には、前記バーストパルスの強度が、前記バーストパルス印加初期の基準パルスよりも小さくなることから、前記高電圧パルスと前記バーストパルスの波高値との差異が高められ、対象細胞に対して導入物質をより受け入れ易い状況が形成されることとなり、当該状況下で前記高電圧パルスが印加されることによって、対象細胞を損傷することなく、対象細胞に対してより多くの導入物質を導入することができる。 In the substance introduction method disclosed in the present application, the burst pulse is configured by sequentially attenuating the applied charge amount of each reference pulse as necessary. As described above, in the substance introduction method disclosed in the present application, the intensity of the burst pulse becomes smaller than the reference pulse at the initial stage of the burst pulse application immediately before the subsequent high voltage pulse is applied. The difference between the peak value of the voltage pulse and the burst pulse is increased, and a situation where the introduced substance is more easily accepted for the target cell is formed, and the high voltage pulse is applied under the situation, More introduction substances can be introduced into the target cells without damaging the target cells.
本願に開示する物質導入方法は、必要に応じて、前記バーストパルスを構成する基準パルスが、マイクロ秒オーダーのオン時間、且つ数十〜数百Ｖオーダーの印加電圧を有し、前記高電圧パルスが、ナノ秒オーダーのオン時間、且つｋＶオーダーの印加電圧を有するものである。このように、本願に開示する物質導入方法は、マイクロ秒オーダーのオン時間、且つ数十〜数百Ｖオーダーの印加電圧を有し、前記高電圧パルスが、ナノ秒オーダーのオン時間、且つｋＶオーダーの印加電圧を有することから、当該バーストパルスと高電圧パルスの最適な組み合わせによって、前記バーストパルスにより効率よく溶液中に浸漬された導入物質が正負極のいずれか一方の方向に移動し、対象細胞が導入物質を受容しやすい状況が形成されることとなり、後続する前記高電圧パルスの印加によって、対象細胞を損傷することなく、より多くの導入物質を対象細胞の内部に導入することができる。 In the substance introduction method disclosed in the present application, if necessary, the reference pulse constituting the burst pulse has an on time in the order of microseconds and an applied voltage in the order of several tens to several hundreds V, and the high voltage pulse Have an on-time of nanosecond order and an applied voltage of kV order. Thus, the substance introduction method disclosed in the present application has an on time in the order of microseconds and an applied voltage in the order of several tens to several hundreds V, and the high voltage pulse has an on time in the order of nanoseconds and kV. Since the applied voltage has an order, the optimum combination of the burst pulse and the high-voltage pulse allows the introduced substance that is efficiently immersed in the solution by the burst pulse to move in either the positive or negative direction. A situation in which the cells are likely to receive the introduction substance is formed, and by applying the subsequent high voltage pulse, more introduction substance can be introduced into the target cell without damaging the target cell. .
本願に開示する物質導入方法は、必要に応じて、前記高電圧パルスが、前記バーストパルスを構成する各正負の基準パルスのうち、印加電荷量の少ない極性の側と同極性で印加するものである。このように、前記高電圧パルスが、前記バーストパルスにより対象細胞内にチャージされた電荷の極性と異なる極性で印加されることから、前記バーストパルスにより対象細胞にチャージされた電荷と同じ極性の電荷を前記高電圧パルスが重畳することに起因して対象細胞に余分なダメージを与えることが抑制されることとなり、当該高電圧パルスの印加によって、さらに対象細胞を損傷することなく、より多くの導入物質を対象細胞の内部に導入することができる。 In the substance introduction method disclosed in the present application, the high voltage pulse is applied with the same polarity as that of the polarity side with a small amount of applied charge among the positive and negative reference pulses constituting the burst pulse, as necessary. is there. Thus, since the high voltage pulse is applied with a polarity different from the polarity of the charge charged in the target cell by the burst pulse, the charge having the same polarity as the charge charged in the target cell by the burst pulse. As a result, it is possible to suppress excessive damage to the target cell due to the superposition of the high-voltage pulse, and by introducing the high-voltage pulse, more introduction without damaging the target cell. The substance can be introduced into the target cell.
本願に開示する物質導入方法は、必要に応じて、前記バーストパルスを構成する各正負の基準パルスの印加電荷量が、各正負間で１０：１〜１：１０の比率を有するものである。このように、本願に開示する物質導入方法は、前記バーストパルスを構成する各正負の基準パルスの印加電荷量が、各正負間で１０：１〜１：１０の比率を有することから、外膜にチャージされる電荷量を調整することで電気的ダメージを抑制しつつ、一方で、溶液中に浸漬された導入物質が正負極のいずれか一方の方向に移動させることで、対象細胞が導入物質を受容しやすい最適な状況が形成され、後続する前記高電圧パルスの印加によって、対象細胞を損傷することなく、大量の導入物質を対象細胞の内部に導入することができる。 In the substance introduction method disclosed in the present application, the applied charge amount of each positive and negative reference pulse constituting the burst pulse has a ratio of 10: 1 to 1:10 between the positive and negative as necessary. Thus, in the substance introduction method disclosed in the present application, the applied charge amount of each positive and negative reference pulse constituting the burst pulse has a ratio of 10: 1 to 1:10 between each positive and negative. While adjusting the amount of electric charge charged to the cell, the electrical damage is suppressed, while the introduced substance immersed in the solution moves in either the positive or negative direction, so that the target cell becomes the introduced substance. An optimal situation is formed in which a large amount of introduced substance can be introduced into the target cell without damaging the target cell by the subsequent application of the high voltage pulse.
本願に開示する物質導入装置は、対象細胞の内部に導入物質を導入する物質導入装置において、前記導入物質を含有する溶液及び前記対象細胞を収容する収容手段と、前記収容手段の周囲に配設される一対の対向電極と、前記対向電極間に印加する電圧を生成する直流電流を供給する直流電源と、前記直流電源から供給される直流電流に基づいて、正負に極性が変化する間に一定電位値レベルを所定時間維持してなる非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルス、及び、前記バーストパルスを構成する基準パルスよりも高電圧且つ短時間の高電圧パルスを、前記対象細胞に対して印加する制御を行うパルス制御手段とを備えるものである。 The substance introduction apparatus disclosed in the present application is a substance introduction apparatus that introduces an introduction substance into a target cell, a storage means that contains the solution containing the introduction substance and the target cell, and is disposed around the storage means. A pair of counter electrodes, a DC power source that supplies a DC current that generates a voltage to be applied between the counter electrodes, and a constant while the polarity changes positively or negatively based on the DC current supplied from the DC power source. A burst pulse in which an asymmetric reference pulse having a potential level maintained for a predetermined time is repeated in the same period, and a high voltage pulse having a higher voltage and a shorter time than the reference pulse constituting the burst pulse is applied to the target cell. And a pulse control means for controlling the application.
このように、前記導入物質を含有する溶液及び前記対象細胞を収容する収容手段と、前記収容手段の周囲に配設される一対の対向電極と、前記対向電極間に印加する電圧を生成する直流電流を供給する直流電源と、前記直流電源から供給される直流電流に基づいて、正負に極性が変化する間に一定電位値レベルを所定時間維持してなる非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルス、及び、前記バーストパルスを構成する基準パルスよりも高電圧且つ短時間の高電圧パルスを、前記対象細胞に対して印加する制御を行うパルス制御手段とを備えることから、非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルスによって、対象細胞に対して、正負極のいずれか一方に極性が偏ったパルスが印加されることから、当該極性の偏りによって対象細胞の外膜にチャージされる電荷量を調整することで電気的ダメージを抑制しつつ、一方で、溶液中に浸漬された導入物質が正負極のいずれか一方の方向に移動させることで、対象細胞が導入物質を受容しやすい最適な状況が形成され、後続する前記高電圧パルスの印加によって、対象細胞を損傷することなく、大量の導入物質を対象細胞の内部に導入することができる。 As described above, the storage means for storing the solution containing the introduced substance and the target cell, the pair of counter electrodes arranged around the storage means, and the direct current that generates a voltage to be applied between the counter electrodes A DC power source that supplies current and an asymmetric reference pulse that maintains a constant potential value level for a predetermined time while polarity changes positively and negatively based on the DC current supplied from the DC power source are repeated in the same cycle. Asymmetric reference pulse comprising: a burst pulse; and pulse control means for performing a control to apply a high voltage pulse having a higher voltage and a shorter time than the reference pulse constituting the burst pulse to the target cell. Since a pulse with a polarity biased to either the positive or negative electrode is applied to the target cell by a burst pulse repeated at the same cycle, While the electrical damage is suppressed by adjusting the amount of charge charged to the outer membrane of the target cell due to the bias, the introduced substance immersed in the solution moves in either the positive or negative direction Thus, an optimal situation is formed in which the target cell can easily receive the introduced substance, and a large amount of the introduced substance is introduced into the target cell without damaging the target cell by the subsequent application of the high voltage pulse. Can do.
本願に開示する物質導入装置は、必要に応じて、前記対向電極の少なくとも一方が、他の電極と対向する側に、ピン形状又はレール形状の突起物を備えるものである。このように、本願に開示する物質導入装置は、前記対向電極の少なくとも一方が、他の電極と対向する側に、ピン形状又はレール形状の突起物を備えることから、当該突起物において放電位置の集中性（局所性）が高まることとなり、溶液中に浸漬された導入物質の集中性が高まり、また、対象細胞の外膜にチャージされる電荷量が調整されることによって、対象細胞を損傷することなく、一気に大量の導入物質を対象細胞の内部に導入することができる。 In the substance introduction device disclosed in the present application, as necessary, at least one of the counter electrodes includes a pin-shaped or rail-shaped protrusion on the side facing the other electrode. As described above, in the substance introduction device disclosed in the present application, since at least one of the counter electrodes includes a pin-shaped or rail-shaped protrusion on the side facing the other electrode, Concentration (locality) will increase, the concentration of the introduced substance immersed in the solution will increase, and the target cell will be damaged by adjusting the amount of charge charged to the outer membrane of the target cell It is possible to introduce a large amount of the introduced substance into the target cell at once.
（第１の実施形態）
本実施形態に係る物質導入装置は、図１(a)に示すように、対象細胞１００及び導入物質１１０を含有する溶液１２０を収容する収容手段２１と、この収容手段２１の周囲に配設される一対の対向電極２２及び対向電極２３と、この対向電極２２及び対向電極２３間に印加する電圧（後述のバーストパルス及び高電圧パルス）を生成（例えば、後述のバーストパルス生成部４１及び高電圧パルス生成部４２により生成）する直流電流を供給する直流電源３と、この直流電源３から供給される直流電流に基づいて、正負に極性が変化する間に一定電位値レベルを所定時間維持してなる非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルス、及び、前記バーストパルスよりも高電圧且つ短時間の高電圧パルスを、対象細胞１００に対して印加する制御を行うパルス制御手段４とを備える構成である。
(First embodiment)
As shown in FIG. 1 (a), the substance introduction device according to the present embodiment is arranged around a containing means 21 for containing a target cell 100 and a solution 120 containing the introduced substance 110, and around the containing means 21. A pair of counter electrodes 22 and 23 and a voltage (a burst pulse and a high voltage pulse described later) applied between the counter electrode 22 and the counter electrode 23 (for example, a burst pulse generator 41 and a high voltage described later). Based on the DC power supply 3 that supplies the DC current generated by the pulse generator 42) and the DC current supplied from the DC power supply 3, a constant potential value level is maintained for a predetermined time while the polarity changes between positive and negative. A burst pulse in which the asymmetric reference pulse is repeated at the same period, and a high voltage pulse having a higher voltage and shorter time than the burst pulse are applied to the target cell 100. A configuration and a pulse control unit 4 for controlling the.
対象細胞１００は、生物の受精卵に限らず、各種細胞，小動物，植物等が挙げられる。導入物質１１０は、シクロヘキシミド（ＣＸ）やアクチノマイシンＤ（ＡＤ）等のタンパク質合成を阻害する各種の阻害剤、各種タンパク質，遺伝子（ＤＮＡやＲＮＡ）などが挙げられる。この他、医薬用途として、細胞標識試薬（細胞染色用蛍光標識試薬、酸化ストレス標識試薬等）を対象細胞１００内に導入することもできる。また、例えば、化学物質（例えば、ビスフェノールＡ、エストラジオール等）の生体に対する影響評価にも用いることができる。前記溶液１２０は、導入物質１１０を溶解する媒体であれば、特に制限されず、例えば、水溶液、懸濁液、ゲルなどの形態とすることができる。 The target cell 100 is not limited to a fertilized egg of an organism, and various cells, small animals, plants and the like can be mentioned. Examples of the introduced substance 110 include various inhibitors that inhibit protein synthesis such as cycloheximide (CX) and actinomycin D (AD), various proteins, genes (DNA and RNA), and the like. In addition, a cell labeling reagent (fluorescent labeling reagent for cell staining, oxidative stress labeling reagent, etc.) can also be introduced into the target cell 100 for pharmaceutical use. Further, for example, it can be used for evaluating the influence of a chemical substance (for example, bisphenol A, estradiol, etc.) on a living body. The solution 120 is not particularly limited as long as it is a medium that dissolves the introduction substance 110, and may be in the form of, for example, an aqueous solution, a suspension, or a gel.
前記収容手段２１は、プラスティック製の容器を用いることができる。対向電極２２及び対向電極２３は、一般に用いられている電極素材であれば特に限定されず、例えば、ステンレス，デュラルミン，銅やプラチナが挙げられる。 The container 21 can be a plastic container. The counter electrode 22 and the counter electrode 23 are not particularly limited as long as they are generally used electrode materials, and examples thereof include stainless steel, duralumin, copper, and platinum.
前記直流電源３は、前記対向電極にバーストパルスと高電圧パルスを供給するパルス電源として、後述するバーストパルス生成部４１及び高電圧パルス生成部４２を充電する。即ち、この直流電源３は、例えば、図１(a)に示すように、バーストパルスを生成するためのバーストパルス用電源３１と、高電圧パルスを生成するための高電圧パルス用電源３２とから構成される。 The DC power supply 3 charges a burst pulse generator 41 and a high voltage pulse generator 42, which will be described later, as a pulse power supply that supplies a burst pulse and a high voltage pulse to the counter electrode. That is, the DC power source 3 includes, for example, a burst pulse power source 31 for generating a burst pulse and a high voltage pulse power source 32 for generating a high voltage pulse, as shown in FIG. Composed.
前記パルス制御手段４は、直流電源３の直流電圧のオン時間、デューティ比、及び／又は極性を制御することによって、対向電極２２及び対向電極２３間に、前記バーストパルス又は高電圧パルスを発生させる。このパルス制御手段４は、例えば、図１(a)に示すように、前記バーストパルスを生成するバーストパルス生成部４１と、前記高電圧パルスを生成する高電圧パルス生成部４２と、前記バーストパルス及び前記高電圧パルスを印加するタイミング（前記バーストパルス及び前記高電圧パルスを構成する正負パルスの印加電荷量（パルス幅を含む）、パルス数、前記バーストパルス及び前記高電圧パルス間の出力間隔）を調整するタイミング調整部４３と、対向電極２２及び対向電極２３間に前記バーストパルス及び前記高電圧パルスを出力する出力制御部４４を備える構成とすることができる。 The pulse control means 4 generates the burst pulse or the high voltage pulse between the counter electrode 22 and the counter electrode 23 by controlling the ON time, the duty ratio, and / or the polarity of the DC voltage of the DC power supply 3. . For example, as shown in FIG. 1A, the pulse control means 4 includes a burst pulse generating unit 41 that generates the burst pulse, a high voltage pulse generating unit 42 that generates the high voltage pulse, and the burst pulse. And timing of applying the high voltage pulse (amount of charge applied to the positive and negative pulses (including pulse width), the number of pulses, and the output interval between the burst pulse and the high voltage pulse) And a timing adjustment unit 43 that adjusts the output and an output control unit 44 that outputs the burst pulse and the high voltage pulse between the counter electrode 22 and the counter electrode 23.
上記の物質導入装置を用いた物質導入方法を、図１（ｂ）のフローチャートに沿って、以下説明する。 A substance introduction method using the substance introduction apparatus will be described below with reference to the flowchart of FIG.
先ず、前記収容手段２１の内部で、導入物質１１０を含有する溶液１２０中に対象細胞１００を浸漬させる。この導入物質１１０を含有する溶液１２０中に浸漬された対象細胞１００に対して、正負に極性が変化する間に一定電位値レベルとして零レベルを所定時間維持してなる非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルス（非対称バーストパルスともいう）を印加する（Ｓ１：バーストパルス印加工程）。このように、非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルスによって、対象細胞１００に対して、正負極のいずれか一方に極性が偏った電荷が連続してチャージされることがないため、生体の外膜に対する電気的ダメージを抑制しつつ、一方で、溶液中に浸漬された導入物質が正負極のいずれか一方の方向に移動させられることで、導入物質が導入され易い状況が形成されることとなる。 First, the target cell 100 is immersed in the solution 120 containing the introduction substance 110 inside the housing means 21. The target cell 100 immersed in the solution 120 containing the introduced substance 110 has an asymmetric reference pulse in which the zero level is maintained as a constant potential value level for a predetermined time while the polarity changes positively and negatively in the same period. A burst pulse (also referred to as an asymmetric burst pulse) is applied (S1: burst pulse application step). In this way, the burst pulse in which the asymmetric reference pulse is repeated in the same cycle does not continuously charge the target cell 100 with either negative or positive polarity, and thus the living body On the other hand, the introduction substance immersed in the solution is moved in one direction of the positive and negative electrodes while suppressing electrical damage to the outer membrane of the film, thereby forming a situation where the introduction substance is easily introduced. It will be.
この本実施形態に係る非対称なバーストパルスは、例えば、図２（ａ）に示すように、正極側の基準パルス（図中のＡ）と負極側の基準パルス（図中のＢ）とが異なる波高値をもつように構成することができる。 In the asymmetric burst pulse according to this embodiment, for example, as shown in FIG. 2A, a positive reference pulse (A in the figure) and a negative reference pulse (B in the figure) are different. It can be configured to have a peak value.
波高値としては、例えば、正極側の電圧（Ｖｐ）（波高値）を２０Ｖとして、負極側の電圧（Ｖｎ）（波高値）を−１０Ｖとすることができる。本実施形態に係る非対称なバーストパルスの周期の数（ｎ）は、１〜４００とすることができるが、対象細胞１００に対する電気的ダメージを抑制するという点から、好ましくは１００〜２００であり、例えば、１００とすることができる。 As the peak value, for example, the positive side voltage (Vp) (peak value) can be set to 20V, and the negative side voltage (Vn) (peak value) can be set to -10V. The number (n) of asymmetric burst pulse periods according to the present embodiment can be 1 to 400, but is preferably 100 to 200 from the viewpoint of suppressing electrical damage to the target cell 100. For example, it can be set to 100.
このような構成により、正負極性間における波高値の違いによって、対象細胞１００に印加されるパルスの強度が、経時的に交互に変わることから、正負極のいずれか一方に極性が偏った電荷が連続してチャージされることがないため、電気的なダメージを抑制しつつ、一方で、溶液中に浸漬された導入物質が正負極のいずれか一方の方向にさらに移動させられることで、導入物質１１０がさらに導入され易い状況が形成されることとなり、当該状況下において、高電圧パルスが短時間印加されることによって、対象細胞１００を損傷することなく、さらに大量の導入物質１１０を一気に対象細胞に導入することができる。 With such a configuration, the intensity of the pulse applied to the target cell 100 alternately changes with time due to the difference in the peak value between the positive and negative polarity, so that a charge with a biased polarity is applied to either the positive or negative electrode. Since it is not continuously charged, while the electrical damage is suppressed, on the other hand, the introduced substance immersed in the solution is further moved in one direction of the positive and negative electrodes, thereby introducing the introduced substance. 110 is more easily introduced, and a high voltage pulse is applied for a short time in this situation, so that a larger amount of the introduced substance 110 can be rapidly applied to the target cell without damaging the target cell 100. Can be introduced.
上述したように、本実施形態に係る非対称なバーストパルスは、前記バーストパルスを構成する基準パルスが正負極側で異なる波高値を有する構成とすることができるが、同図（ｂ）に示すように、正負極側のパルスにおけるデューティ比を異ならせる構成とすることもできる。 As described above, the asymmetric burst pulse according to the present embodiment can be configured such that the reference pulse constituting the burst pulse has different peak values on the positive and negative sides, as shown in FIG. In addition, the duty ratio in the positive and negative pulses may be different.
オン時間及びオフ時間は、数マイクロ秒〜数秒とすることができる。オン時間については、例えば、正極側のオン時間（Ｔｐ）を３００マイクロ秒（μｓ）として、負極側のオン時間（Ｔｎ）を３０マイクロ秒（μｓ）以上３００マイクロ秒（μｓ）未満とすることができる。オフ時間については、例えば、正極側のオフ時間（Ｔｐｎ）を１００マイクロ秒（μｓ）、負極側のオン時間（Ｔｎ）を１００マイクロ秒（μｓ）とすることができる。印加される電圧については、例えば、±５０Ｖとすることができ、例えば、正極側の電圧（Ｖｐ）を２０Ｖとして、負極側の電圧（Ｖｎ）を−２０Ｖとすることができる。 The on-time and off-time can be several microseconds to several seconds. Regarding the on-time, for example, the on-time (Tp) on the positive electrode side is set to 300 microseconds (μs), and the on-time (Tn) on the negative electrode side is set to 30 microseconds (μs) or more and less than 300 microseconds (μs). Can do. Regarding the off time, for example, the off time (Tpn) on the positive electrode side can be set to 100 microseconds (μs), and the on time (Tn) on the negative electrode side can be set to 100 microseconds (μs). The applied voltage can be, for example, ± 50 V. For example, the positive voltage (Vp) can be 20 V and the negative voltage (Vn) can be −20 V.
この場合には、正負極側でデューティ比が異なることから、対象細胞１００に与えられるパルス電圧のタイミングが正負極側で異なることにより、パルス電圧が印加されない時間が長短交互に変動することとなり、正負極のいずれか一方に極性が偏った電荷が対象細胞１００に連続してチャージされることがないため、電気的なダメージを抑制しつつ、より効率的に導入物質が移動しさらに導入され易い状況が形成されることとなる。 In this case, since the duty ratio is different on the positive and negative sides, the timing of the pulse voltage applied to the target cell 100 is different on the positive and negative sides. Since the target cell 100 is not continuously charged with a charge having a biased polarity on either the positive or negative electrode, the introduced substance moves more efficiently and is more easily introduced while suppressing electrical damage. A situation will be formed.
また、上記の本実施形態に係る非対称なバーストパルスは、同図（ｃ）に示すように、各基準パルスの印加電荷量を順次減衰させて構成することができる。この場合には、対象細胞１００に与えられるバーストパルスの大きさが経時的に減衰することにより、後続する高電圧パルスが印加される直前には、前記バーストパルスの強度が、バーストパルス印加初期の基準パルスよりも小さくなることから、本実施形態に係るバーストパルスが対象細胞１００及び導入物質１１０に与える上述した作用を維持しつつも、前記高電圧パルスと前記バーストパルスの波高値との差異が高められ、対象細胞に対して導入物質をより受け入れ易い状況が形成されることとなる。 In addition, the asymmetric burst pulse according to the above-described embodiment can be configured by sequentially attenuating the applied charge amount of each reference pulse as shown in FIG. In this case, since the magnitude of the burst pulse given to the target cell 100 decays with time, the intensity of the burst pulse immediately before the subsequent high voltage pulse is applied is the initial value of the burst pulse application. Since it becomes smaller than the reference pulse, the difference between the high voltage pulse and the peak value of the burst pulse is maintained while maintaining the above-described effect that the burst pulse according to this embodiment gives to the target cell 100 and the introduced substance 110. The situation will be increased and the target cell will be more readily acceptable for the introduced substance.
次に、このバーストパルスを印加後、対象細胞１００に対して、このバーストパルスよりも、高電圧且つ短時間の高電圧パルスを、１オン時間分印加する（Ｓ１：高電圧パルス印加工程）。この高電圧パルスは、前記バーストパルスを構成する各正負の基準パルスのうち、印加電荷量の少ない極性の側と同極性で印加することが好ましい。このように、この高電圧パルスが、前記バーストパルスにより対象細胞１００内にチャージされた電荷の極性と異なる極性で印加されることから、前記バーストパルスにより対象細胞１００の外膜にチャージされた電荷と逆の極性の電荷を前記高電圧パルスが重畳することに起因して対象細胞に余分なダメージを与えることが抑制されることとなり、この高電圧パルスの印加によって、さらに対象細胞を損傷することなく、より多くの導入物質を対象細胞の内部に導入することができる。 Next, after applying this burst pulse, a high voltage pulse having a higher voltage and a shorter time than this burst pulse is applied to the target cell 100 for one on time (S1: high voltage pulse application step). The high voltage pulse is preferably applied with the same polarity as that of the polarity side with a smaller amount of applied charge among the positive and negative reference pulses constituting the burst pulse. Thus, since the high voltage pulse is applied with a polarity different from the polarity of the charge charged in the target cell 100 by the burst pulse, the charge charged on the outer membrane of the target cell 100 by the burst pulse. As a result, the target cell is prevented from being excessively damaged by superimposing the charge of the opposite polarity to the high voltage pulse, and the target cell is further damaged by the application of the high voltage pulse. And more introduction substance can be introduced into the target cell.
本実施形態に係る高電圧パルスのオン時間は、特に制限されないが、好ましくは、１５ナノ秒（ｎｓ）〜２００ナノ秒（ｎｓ）であり、例えば、１００ナノ秒（ｎｓ）とすることができる。また、本実施形態に係る高電圧パルスの電圧値は、特に制限されないが、好ましくは、１ｋＶ〜１０ｋＶであり、例えば、３ｋＶとすることができる。 The on-time of the high voltage pulse according to the present embodiment is not particularly limited, but is preferably 15 nanoseconds (ns) to 200 nanoseconds (ns), and can be, for example, 100 nanoseconds (ns). . The voltage value of the high voltage pulse according to the present embodiment is not particularly limited, but is preferably 1 kV to 10 kV, and can be 3 kV, for example.
本実施形態に係る非対称なバーストパルス及び高電圧パルスは、例えば、図３（ａ）に示すように、バーストパルスの印加後、時間間隔（ΔＴ）を空けた後に、高電圧パルスを正極側又は負極側のいずれかの極側で１オン時間分印加する。この時間間隔（ΔＴ）としては、特に制限されないが、好ましくは、１０マイクロ秒以上であり、より好ましくは、１ミリ〜数百ミリ秒であり、例えば、１００ミリ秒（ｍｓ）とすることができる。１ミリ秒以下では電気ダメージが増加する傾向が強くなる。 For example, as shown in FIG. 3A, the asymmetric burst pulse and the high voltage pulse according to the present embodiment are separated from the high voltage pulse on the positive electrode side after a time interval (ΔT) after the application of the burst pulse. Application is made for one on-time on either pole side of the negative electrode side. The time interval (ΔT) is not particularly limited, but is preferably 10 microseconds or more, more preferably 1 to several hundred milliseconds, for example, 100 milliseconds (ms). it can. Below 1 millisecond, the tendency for electrical damage to increase increases.
本実施形態に係るバーストパルス及び高電圧パルスは、上記のように、対象細胞１００に対して、前記バーストパルスを印加後、前記高電圧パルスが印加されることによって、対象細胞１００を損傷することなく、一気に大量の導入物質１１０を対象細胞１００の内部に導入することができる。この顕著な効果を奏するメカニズムは未だ詳細には解明されていないが、非対称なバーストパルスによって、正負極のいずれか一方に極性が偏った電荷が連続してチャージされることがないため、対象生体（の外膜）に対する過度な電気的なダメージが抑制され、一方で溶液中に浸漬された導入物質が正負極のいずれか一方の方向に移動させられることで、導入物質が導入され易い状況が形成されることになり、当該状況下において、高電圧パルスが短時間印加されることによって、非対称なバーストパルスによる重さのある導入物質１１０を動かす作用とこの高電圧パルスによる外膜に対する一時的な穴の形成が相俟って、対象細胞１００を損傷することなく、一気に導入物質１１０が対象細胞１００の内部に導入されるものと推察される。 As described above, the burst pulse and the high voltage pulse according to the present embodiment damage the target cell 100 by applying the high voltage pulse to the target cell 100 after the burst pulse is applied. In addition, a large amount of the introduced substance 110 can be introduced into the target cell 100 at once. Although the mechanism that exerts this remarkable effect has not yet been elucidated in detail, an asymmetric burst pulse does not continuously charge a positive or negative polarity to one of the positive and negative electrodes. Excessive electrical damage to the (outer membrane) is suppressed, while the introduced substance immersed in the solution is moved in one direction of the positive and negative electrodes, so that the introduced substance is easily introduced. In this situation, a high voltage pulse is applied for a short time, thereby moving the heavy introduction substance 110 by the asymmetric burst pulse and the temporary high voltage pulse to the outer membrane. It is presumed that the introduction substance 110 is introduced into the target cell 100 at a stroke without damaging the target cell 100 due to the formation of a large hole.
尚、本実施形態において、このようなバーストパルス及び高電圧パルスという２つの異なるパルスを発生させることは、例えば、図３（ｂ）のような回路構成のシステムを構築することにより、実現することができる。即ち、パルス制御手段４が、２つの異なる極性の出力を持つＲＣ放電回路（同極性、逆極性）の切換制御によって、直流電源３１から供給される電源を元にバーストパルスを生成するバーストパルス生成部４１と、直流高電圧電源３２から供給される電源によって、複数のブルームライン線路から成るブルームラインジェネレータで高電圧矩形波パルスを生成する高電圧パルス生成部４２と、遅延パルス発生器の制御によって、これらバーストパルス及び高電圧パルスを上記の時間間隔（ΔＴ）だけ遅延させて発生させるタイミング調整部４３と、バーストパルス生成部４１と高電圧パルス生成部４２から出力されるバーストパルス及び高電圧パルスを出力する出力制御部４４とを備える構成とすることができる。尚、高電圧パルスを発生させるための電気パルスを遅延パルス発生器からブルームラインジェネレータに伝送する際には、ブルームラインジェネレータが動作するときに発生する電気的な外部影響を抑えるために、Ｅ／Ｏコンバーター等を使用して光ファイバー伝送を用いることが好ましい。 In the present embodiment, the generation of two different pulses such as a burst pulse and a high voltage pulse can be realized by constructing a system having a circuit configuration as shown in FIG. 3B, for example. Can do. That is, the pulse control means 4 generates burst pulses based on the power supplied from the DC power supply 31 by switching control of RC discharge circuits (same polarity and reverse polarity) having two different polar outputs. The high voltage pulse generator 42 that generates a high voltage rectangular wave pulse with a Bloom line generator composed of a plurality of Bloom line lines by the power supplied from the unit 41, the DC high voltage power supply 32, and the control of the delay pulse generator The timing adjustment unit 43 that generates the burst pulse and the high voltage pulse with a delay of the time interval (ΔT), and the burst pulse and the high voltage pulse output from the burst pulse generation unit 41 and the high voltage pulse generation unit 42. And an output control unit 44 that outputs. When an electric pulse for generating a high voltage pulse is transmitted from the delay pulse generator to the bloom line generator, in order to suppress an electrical external influence that occurs when the bloom line generator operates, E / It is preferable to use optical fiber transmission using an O converter or the like.
（第２の実施形態）
第２の実施形態に係る物質導入装置は、上記第１の実施形態における対向電極２２及び対向電極２３の少なくとも一方が、他の電極と対向する側に、ピン形状又はレール形状の突起物を備えるものである。この突起物は、例えば、図４に示されるように、ピン形状のピン型突起物２２ａ、又は、レール形状のレール型突起物２２ｂである。この突起物によって、バーストパルス及び高電圧パルスによる放電位置の集中性（局所性）がこの突起物において高まることとなり、溶液中に浸漬された導入物質の集中性が高まり、また、対象細胞の外膜にチャージされる電荷量を調整されることによって、対象細胞を損傷することなく、一気に大量の導入物質を対象細胞の内部に導入することができる。
(Second Embodiment)
In the substance introduction device according to the second embodiment, at least one of the counter electrode 22 and the counter electrode 23 in the first embodiment includes a pin-shaped or rail-shaped protrusion on the side facing the other electrode. Is. For example, as illustrated in FIG. 4, the protrusion is a pin-shaped pin-shaped protrusion 22 a or a rail-shaped rail-shaped protrusion 22 b. This protrusion increases the concentration (locality) of the discharge position due to the burst pulse and the high voltage pulse in the protrusion, and increases the concentration of the introduced substance immersed in the solution. By adjusting the amount of charge charged to the membrane, a large amount of introduced substance can be introduced into the target cell at once without damaging the target cell.
尚、上記各実施形態において、バーストパルス（非対称バーストパルス）は、正負に極性が変化する間に零レベルを所定時間維持する構成としたが、所定時間維持される電位値レベルは、零レベルに限定されず、当該変化する正負の極性の中間値であれば、任意の電位値レベルを用いることができる。 In each of the above embodiments, the burst pulse (asymmetric burst pulse) is configured to maintain the zero level for a predetermined time while the polarity changes between positive and negative, but the potential value level maintained for the predetermined time is set to the zero level. Any potential value level can be used as long as it is an intermediate value of the changing positive and negative polarities.
以下に、本発明の特徴をさらに具体的に示すために実施例を記すが、本発明は以下の実施例によって制限されるものではない。 EXAMPLES Examples will be described below to more specifically illustrate the features of the present invention, but the present invention is not limited to the following examples.
（実施例１）
上記の物質導入装置を用いて、導入物質をシクロヘキシミド（CX）、アクチノマイシンD （AD）として、これらをそれぞれ混合した溶液中に設置された産卵後のメダカ卵に対して、非対称なバーストパルスと高電圧パルスを印加し、同溶液中に約2時間静置した後、洗浄し、その後の様子を観測した。正極側のパルス幅TP(オン時間（Ｔｐ）) （=300us）と負極側のパルス幅TN(オン時間（Ｔｎ）) （30us〜300us，印加なし）の比による生存率と死亡率の変化を確認した。実験条件を以下に示す（パラメタは上記の図３（ａ）に記載されたものと同じ）。
Example 1
Using the substance introduction device described above, the introduction substances are cycloheximide (CX) and actinomycin D (AD), and the asymmetric burst pulse and the asymmetric burst pulse are applied to the post-laying medaka eggs placed in the mixed solutions. A high voltage pulse was applied, and the plate was allowed to stand in the solution for about 2 hours, washed, and the subsequent state was observed. Change in survival rate and mortality due to the ratio of pulse width TP (ON time (Tp)) (= 300us) on the positive electrode side to pulse width TN (ON time (Tn)) (30us to 300us, no application) on the negative electrode side confirmed. Experimental conditions are shown below (parameters are the same as those described in FIG. 3 (a) above).
上記の実験条件のうち、TP:TN=300μs:150μs、TP:TN=300μs:60μs、TP(300μs)のみ：TN無し、の各場合のバーストパルス及び高電圧パルスについて、各々、図４（ｂ）〜（ｄ）に示す。得られた結果を、図５（ａ）に示す。 Among the above experimental conditions, the burst pulse and the high voltage pulse in each case of TP: TN = 300 μs: 150 μs, TP: TN = 300 μs: 60 μs, and only TP (300 μs): no TN are shown in FIG. ) To (d). The obtained result is shown in FIG.
図５では、バーストパルス及び高電圧パルスを印加後、３日までに死亡が確認された卵の割合（死亡）、パルス印加後、３日目において、死亡・発生の遅れなどの異常が確認されなかった卵の割合（正常）、バーストパルス及び高電圧パルスを印加後、３日目において発生遅れなどの異常が確認された卵の割合（異常）を各々示す（サンプル数：１２個／条件）。また、図中、“control”は導入物質が混合されていない溶液中のメダカ卵にバーストパルスと高電圧パルスを印加しただけのものを指し、“CX”はシクロヘキシミド、“AD”はアクチノマイシンD、“TP:TN ＝ ”は図３（a）で上述した各極側のオン時間を示す。また、“VN無し”は、VPのみを１００回印加したものである。 In FIG. 5, the proportion of eggs whose death was confirmed by 3 days after applying a burst pulse and a high voltage pulse (death), and abnormalities such as death / delay in the 3rd day after applying the pulse were confirmed. The percentage of eggs that were not present (normal), and the percentage of eggs that were confirmed to be abnormal such as delayed development on the third day after application of burst pulse and high voltage pulse (abnormality) are shown (number of samples: 12 / condition) . Also, in the figure, “control” refers to a medaka egg in a solution not mixed with an introduced substance, which is simply a burst pulse and a high voltage pulse applied, “CX” is cycloheximide, “AD” is actinomycin D “TP: TN =” indicates the on-time of each pole side described above with reference to FIG. “No VN” means that only VP is applied 100 times.
この結果から、コントロール（control）では、正極側のパルスのみ［VP（Vp）のみ（VN（Vn）無し）］の場合、正常な個体の割合は8％と低かったことから、電気的ダメージによる影響が大きかったことがわかった。これは、個体の外膜の片側に対するチャージ（蓄積）の電荷量が大きくなることに起因するものと考えられる。また、バーストパルスにおいて、正極側と負極側のパルスを同じ比率にした場合（TP:TN=300μs:300μs）には、個体の死亡はほとんど発生しなかったことから、固体に対して電気的な影響はほとんど与えられなかったことがわかった。これは、バーストパルスの印加によって個体の外膜に生じるチャージ（蓄積）とディスチャージ（放電）の電荷量が同量であったことに起因するものと考えられる。負極側の基準パルス（VN（Vn））を加えた場合には、正常な個体の割合は平均78 ％（67%〜92%）となり、電気的ダメージの影響が抑制された。 From this result, in the case of control (pulse) on the positive side only [VP (Vp) only (no VN (Vn))], the percentage of normal individuals was as low as 8%. It turned out that the influence was great. This is considered to be caused by an increase in the amount of charge (accumulation) on one side of the outer membrane of the individual. In addition, in the burst pulse, when the positive and negative pulses were set to the same ratio (TP: TN = 300μs: 300μs), there was almost no death of the individual. It was found that there was little impact. This is considered to be due to the fact that the amount of charge (accumulation) and discharge (discharge) generated in the outer membrane of the individual by the application of the burst pulse are the same. When the negative reference pulse (VN (Vn)) was applied, the percentage of normal individuals averaged 78% (67% to 92%), and the effect of electrical damage was suppressed.
シクロヘキシミド（CX）の導入については、正常な個体の割合は0 ％で、すべての個体で主にCX導入による異常(発生遅れ)または死亡が発生した。さらに負極側のパルス（負極性パルス）のオン時間（パルス幅；TN（Tn））が短いほど、死亡率が上昇する傾向が見られた（300μs では8%の死亡率が、30μsでは75 %に上昇した）。これは、CXの導入量増加に起因するものと考えられる。これは、非対称なバーストパルス（TP≠TN）の印加によって、個体の外膜で電荷のチャージ（蓄積）とディスチャージ（放電）が各々異なる電荷量で生じ、個体に与える電気的ダメージが抑えられるとともに、当該バーストパルスにより比較的低電圧且つ長時間の電気的エネルギーが印加されることによって、導入物質（ＣＸ）が溶液中で一方向に動かされ、後続する高電圧パルスの印加によって、個体に導入される導入物質（CX）の増加（CXによる死亡率の増加）が引き起こされたものと考えられる。 Regarding the introduction of cycloheximide (CX), the percentage of normal individuals was 0%, and all individuals developed abnormalities (delays) or deaths mainly due to the introduction of CX. Furthermore, the shorter the ON time (pulse width; TN (Tn)) of the negative pulse (negative pulse), the mortality tended to increase (8% mortality at 300μs, 75% at 30μs). ). This is considered due to an increase in the amount of CX introduced. This is because the application of asymmetric burst pulses (TP ≠ TN) causes charge charges (accumulation) and discharges (discharges) to occur in the outer membrane of the individual with different amounts of charge, suppressing electrical damage to the individual. The introduction substance (CX) is moved in one direction in the solution by applying a relatively low voltage and long-term electrical energy by the burst pulse, and is introduced into the individual by the application of the subsequent high voltage pulse. This is thought to be caused by the increase of introduced substances (CX) (increased mortality due to CX).
アクチノマイシンD（AD）の導入については、78％〜92 ％の個体にAD導入による異常（発生遅れ）または死亡が発生した。負極側のパルス（負極性パルス）のオン時間（パルス幅；TN（Tn））が短い（100μs、60μs 、30μs）場合に死亡率が50%を超えた。これらの結果より、非対称なバーストパルスは、導入物質に対する電気的なダメージを抑制しており、導入物質の導入量を増加することができた。 Regarding the introduction of actinomycin D (AD), 78% to 92% of individuals experienced abnormalities (delays in development) or death due to AD introduction. When the on-time (pulse width; TN (Tn)) of the negative pulse (negative pulse) was short (100 μs, 60 μs, 30 μs), the mortality rate exceeded 50%. From these results, the asymmetric burst pulse suppressed the electrical damage to the introduced substance and was able to increase the amount of introduced substance.
（実施例２）
上記の物質導入装置を用いて、産卵後のメダカ卵を、溶液中にシクロヘキシミド（ＣＸ）の有無のケースで、非対称なバーストパルス及び高電圧パルスを印加後、同溶液に2時間静置後、洗浄し、その後の様子を観測した。正極側の電圧（Ｖｐ）（波高値）、負極側の電圧（Ｖｎ）（波高値）を、１２Ｖとし、バーストパルスの数（ｎ）を、１００、２００、４００とした結果を図５（ｂ）に示す。この結果から、非対称なバーストパルスにおけるバーストパルスの数（ｎ）は、１００〜２００の範囲において良好な結果が得られることがわかった。
(Example 2)
Using the above substance introduction apparatus, after laying medaka eggs, in the case of the presence or absence of cycloheximide (CX) in the solution, after applying asymmetric burst pulse and high voltage pulse, left in the solution for 2 hours, Washed and observed afterwards. FIG. 5B shows the results when the positive-side voltage (Vp) (peak value), the negative-side voltage (Vn) (peak value) are 12 V, and the number of burst pulses (n) is 100, 200, and 400. ). From this result, it was found that good results were obtained when the number (n) of burst pulses in the asymmetric burst pulse was in the range of 100 to 200.
（実施例３）
上記の物質導入装置を用いて、産卵後のメダカ卵を、非対称なバーストパルス及び高電圧パルスの有無のケースで、濃度５μＭ、５０μＭのビスフェノールA（ＢＰＡ）および０．３７ｎＭのエストラジオールに2時間暴露後、洗浄した。以下の表に、外液５０μＭでビスフェノールAを取り込ませた場合の卵内液中のビスフェノールＡのガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）による実測値を示す。５０μＭのビスフェノールAにメダカ卵を2時間浸漬しただけでは、取り込み量は極めて少なく、卵内液濃度は約２μＭ程度であったが、非対称なバーストパルス及び高電圧パルスを印加することにより、約９０μＭと飛躍的に内液濃度は上がっており、外液の濃度と同じかそれ以上の濃度になるようにビスフェノールＡをメダカ卵内部に取り込むことができた。
Example 3
Using the substance introduction apparatus described above, medaka eggs after egg laying were exposed to bisphenol A (BPA) and 0.37 nM estradiol at a concentration of 5 μM and 50 μM for 2 hours in the presence or absence of asymmetric burst pulse and high voltage pulse. After that, it was washed. The following table shows the actual measurement values of bisphenol A in the in-vitro solution by gas chromatograph mass spectrometer (GC / MS) when bisphenol A is taken in with 50 μM of the external solution. By simply immersing a medaka egg in 50 μM bisphenol A for 2 hours, the amount of uptake was very small and the concentration in the ovo solution was about 2 μM, but by applying an asymmetric burst pulse and high voltage pulse, about 90 μM The concentration of the inner solution increased dramatically, and bisphenol A could be taken into the medaka egg so that the concentration was equal to or higher than the concentration of the outer solution.
１００ 対象細胞
１１０ 導入物質
１２０ 溶液
２１ 収容手段
２２ 対向電極
２２ａ ピン型突起物
２２ｂ レール型突起物
２３ 対向電極
３ 直流電源
３１ バーストパルス用電源
３２ 高電圧パルス用電源
４ パルス制御手段
４１ バーストパルス生成部
４２ 高電圧パルス生成部
４３ タイミング調整部
４４ 出力制御部
DESCRIPTION OF SYMBOLS 100 Target cell 110 Introduction | transduction substance 120 Solution 21 Storage means 22 Counter electrode 22a Pin type protrusion 22b Rail type protrusion 23 Counter electrode 3 DC power supply 31 Burst pulse power supply 32 High voltage pulse power supply 4 Pulse control means 41 Burst pulse generation part 42 High Voltage Pulse Generation Unit 43 Timing Adjustment Unit 44 Output Control Unit
Claims (10)
正負に極性が変化する間に一定電位値レベルを所定時間維持してなる非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルスを、導入物質を含有する溶液中に浸漬された対象細胞に対して、印加するバーストパルス印加工程と、
前記バーストパルス印加工程による印加後、前記対象細胞に対して、前記バーストパルスを構成する基準パルスよりも高電圧且つ短時間の高電圧パルスを、１オン時間分印加する高電圧パルス印加工程とを含むことを特徴とする
物質導入方法。 In a substance introduction method for introducing an introduction substance into a target cell,
A burst pulse in which an asymmetric reference pulse, which is maintained at a constant potential level for a predetermined time while the polarity changes positively and negatively, is repeated in the same cycle, is applied to a target cell immersed in a solution containing an introduced substance. A burst pulse applying step to be applied;
A high-voltage pulse applying step of applying a high-voltage pulse having a higher voltage and a shorter time than the reference pulse constituting the burst pulse to the target cell after application by the burst pulse application step; Substance introduction method characterized by including.
前記バーストパルスを構成する基準パルスが、正負極性間で異なる波高値を有することを特徴とする
物質導入方法。 The substance introduction method according to claim 1,
The substance introduction method, wherein the reference pulse constituting the burst pulse has different peak values between positive and negative polarities.
前記バーストパルスを構成する基準パルスが、正負極性間で異なるデューティ比を有することを特徴とする
物質導入方法。 In the substance introduction method according to claim 1 or 2,
The substance introduction method, wherein the reference pulse constituting the burst pulse has a different duty ratio between positive and negative polarities.
前記バーストパルスが、各基準パルスの印加電荷量を順次減衰させて構成されることを特徴とする
物質導入方法。 In the substance introduction method according to any one of claims 1 to 3,
The substance introduction method, wherein the burst pulse is configured by sequentially attenuating the applied charge amount of each reference pulse.
前記高電圧パルスが、前記バーストパルスを構成する各正負の基準パルスのうち、印加電荷量の少ない極性の側と同極性で印加することを特徴とする
物質導入方法。 In the substance introduction method according to any one of claims 1 to 4,
The substance introduction method, wherein the high-voltage pulse is applied with the same polarity as that of a polarity side with a small amount of applied charge among positive and negative reference pulses constituting the burst pulse.
前記バーストパルスを構成する基準パルスが、マイクロ秒オーダーのオン時間、且つ数十〜数百Ｖオーダーの印加電圧を有し、
前記高電圧パルスが、ナノ秒オーダーのオン時間、且つｋＶオーダーの印加電圧を有することを特徴とする
物質導入方法。 In the substance introduction method according to any one of claims 1 to 5,
The reference pulse constituting the burst pulse has an on-time of the order of microseconds and an applied voltage of the order of several tens to several hundreds V.
The high voltage pulse has an on-time of nanosecond order and an applied voltage of kV order.
前記バーストパルスを構成する各正負の基準パルスの印加電荷量が、各正負間で１０：１〜１：１０の比率を有することを特徴とする
物質導入方法。 In the substance introduction method according to any one of claims 1 to 6,
The substance introduction method, wherein the applied charge amount of each positive and negative reference pulse constituting the burst pulse has a ratio of 10: 1 to 1:10 between each positive and negative.
前記導入物質を含有する溶液及び前記対象細胞を収容する収容手段と、
前記収容手段の周囲に配設される一対の対向電極と、
前記対向電極間に印加する電圧を生成する直流電流を供給する直流電源と、
前記直流電源から供給される直流電流に基づいて、正負に極性が変化する間に一定電位値レベルを所定時間維持してなる非対称の基準パルスが同一周期で繰り返されるバーストパルス、及び、前記バーストパルスを構成する基準パルスよりも高電圧且つ短時間の高電圧パルスを、前記対象細胞に対して印加する制御を行うパルス制御手段とを備えることを特徴とする
物質導入装置。 In the substance introduction device for introducing the introduction substance into the target cell,
A container containing the solution containing the introduced substance and the target cell;
A pair of counter electrodes disposed around the housing means;
A DC power supply for supplying a DC current for generating a voltage to be applied between the counter electrodes;
A burst pulse in which an asymmetric reference pulse, which is maintained at a constant potential value level for a predetermined time while the polarity changes positively and negatively based on a direct current supplied from the direct current power source, is repeated in the same period, and the burst pulse And a pulse control means for controlling the application of a high-voltage pulse having a higher voltage and a shorter time than the reference pulse constituting the target cell to the target cell.
前記パルス制御手段が、
前記バーストパルスを生成するバーストパルス生成部と、
前記高電圧パルスを生成する高電圧パルス生成部と、
前記バーストパルス及び前記高電圧パルスを印加するタイミングを調整するタイミング調整部を備えることを特徴とする
物質導入装置。 The substance introduction device according to claim 8,
The pulse control means comprises:
A burst pulse generator for generating the burst pulse;
A high voltage pulse generating unit for generating the high voltage pulse;
A substance introduction apparatus comprising: a timing adjustment unit that adjusts the timing of applying the burst pulse and the high voltage pulse.
前記対向電極の少なくとも一方が、他の電極と対向する側に、ピン形状又はレール形状の突起物を備えることを特徴とする
物質導入装置。 The substance introduction device according to claim 8 or 9,
At least one of the counter electrodes is provided with a pin-shaped or rail-shaped projection on the side facing the other electrode.
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