JP4807802B2 - Ｖｅｇｆ媒介性活性をブロックすることによるｉ型糖尿病を処置する方法 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明の分野は、一般に、血清グルコースレベルを減少させ得る因子を投与することによって、糖尿病を処置する方法に関する。特に、本発明の分野は、ＶＥＧＦ媒介性活性をブロック、阻害、または緩解（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）し得る因子を投与することによって、Ｉ型糖尿病を処置する方法である。

（関連技術の説明）
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病は、ヒトＩ型糖尿病についての動物モデルとして広範に受容されている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、病理学的状態における脈管形成の一次刺激として認識されている。ＶＥＧＦをブロックする方法に関するアプローチは、例えば、特許文献１に記載されており、それは、ＶＥＧＦに結合およびＶＥＧＦを阻害するＶＥＧＦ特異的融合タンパク質を記載している。
国際公開第００７５３１９号パンフレット Ｓｕｓｚｔａｋら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２００４年、第５３巻、ｐ．７８４〜７９４

（発明の簡単な要旨）
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストの投与が、ヒトＩ型糖尿病の動物モデルにおいて血糖値を正常に戻し得るという観測に部分的に基づく。

従って、第１の局面において、本発明は、被験体におけるＩ型糖尿病を処置する方法を特徴とし、この方法は、ＶＥＧＦ媒介性活性をブロック、阻害、または緩解し得る因子を被験体に投与する工程を包含する。特定の実施形態において、本発明の処置する方法は、血清グルコースレベルの低下、グルコース耐性の改善、および／または血糖コントロールの改善を生じる。

特定の実施形態において、ＶＥＧＦ媒介性活性をブロック、阻害、または緩解し得る因子は、ＶＥＧＦアンタゴニストである。より具体的には、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦトラップアンタゴニストであり、アセチル化されたＦｌｔ−１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３_Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３_ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３_ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１Ｄ２−ＶＥＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、Ｆｌｔ−１Ｄ２−Ｆｌｋ−１Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）からなる群より選択される融合タンパク質である。好ましい実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号１〜２）である。他の実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦ特異的抗体、核酸（例えば、抑制性リボザイムまたはアンチセンス分子）、低分子、アプタマー、炭水化物、ペプチド模倣物、またはハプテンである。

因子の投与は、当該分野における公知の任意の方法によってであり得、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、または経口経路の投与が挙げられる。ＶＥＧＦトラップアンタゴニストを投与する好ましい方法は、皮下投与または静脈内投与によってである。

処置される被験体は、好ましくは、Ｉ型糖尿病を罹患するヒトである、
第２の局面において、本発明は、哺乳動物の被験体におけるＩ型糖尿病を処置または予防するための医薬の調製における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）媒介性活性をブロック、阻害、または緩解し得る第１の因子の使用を特徴とする。より具体的には、第１の因子は、ＶＥＧＦアンタゴニストであり、このＶＥＧＦアンタゴニストは、ポリペプチド、抗体、低分子、または核酸である。より特定の実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、２つの同一の融合タンパク質から構成される二量体タンパク質「トラップ」であり、この融合ポリペプチドは、アセチル化されたＦｌｔ−１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３_Ｒ−＞Ｎ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（１−３_ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３_ΔＢ）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１（２−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ−１Ｄ２−ＶＥＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、Ｆｌｔ−１Ｄ２−Ｆｌｋ−１Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（配列番号２）である。好ましい実施形態において、融合ポリペプチドは、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）である。他の実施形態において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、およびアンチセンス分子から選択される核酸である。第１の因子は、第２の因子（例えば、インスリン）とともに同時投与され得る。

他の目的および利点は、後の詳細な説明の概説から明らかになる。

（詳細な説明）
本方法を記載する前に、本発明は、記載される特定の方法、および実験条件に限定されない（例えば、方法および条件は変化し得る）ことが理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみに限定されるため、本明細書中に使用される専門用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを意図しないこともまた、理解されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の言及を包含する。従って、例えば、「方法」に関する言及は、本明細書中に記載される型の１種以上の方法、および／または工程を包含し、そして／あるいは、このことは、本開示などを読むことにより、当業者に明らかになる。

他に示さない限り、本明細書中に使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される場合と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または等価の任意の方法および物質が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および物質は、ここに記載される。

（一般的説明）
本発明は、ＶＥＧＦ媒介性活性をブロックまたは阻害し得る因子の投与が、ヒトＩ型糖尿病の動物モデルにおける血清グルコースを減少させ得、グルコースの処理を改良し得るという発見に部分的に基づく。これらの発見は、最初、ＶＥＧＦ媒介性活性をブロックまたは阻害し得る因子が、Ｉ型糖尿病を改善することを示したことを表す。従って、本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニストを投与することによって、哺乳動物における糖尿病を処置する方法を提供する。より具体的には、本発明の方法は、以下に示すようなＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦトラップ（配列番号２））、またはＶＥＧＦ特異的抗体を用いて実施され得る。

（定義）
用語「治療的有効量」によっては、投与されて所望の効果を生じる用量を意味する。正確な用量は処置の目的に依存し、公知の技術を用いて当業者によって確かめられる（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。

用語「ブロッカー」、「インヒビター」、または「アンタゴニスト」によっては、化学反応または生理反応あるいは化学応答または生理応答を遅らせるか、または予防する物質を意味する。一般的なブロッカーまたはインヒビターとしては、アンチセンス分子、抗体、アンタゴニストおよびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、ＶＥＧＦブロッカーまたはインヒビターの例は、ＶＥＧＦレセプターベースのアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、またはＶＥＧＦトラップ（例えば、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））（配列番号１〜２）が挙げられる）である。ＶＥＧＦレセプターベースのアンタゴニストの完全な説明のために、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）が挙げられる。

「低分子」は、約５００ダルトン未満の分子量を有すると本明細書中に定義され、化学分子およびペプチド分子を含み得る。

（核酸構築物）
本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質の個々の成分は、本明細書によって提供される指示を用いて当該分野で公知の分子生物学的方法によって構築され得る。これらの成分は、第１の細胞レセプタータンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ１）；第２の細胞レセプタータンパク質（例えば、ＶＥＧＦＲ２）；多量体化成分（例えば、Ｆｃ）から選択される。

本発明の方法に有用なＶＥＧＦ特異的融合タンパク質の特定の実施形態は、融合タンパク質を会合させ得る多量体化成分（例えば、多量体、好ましくは二量体）を含む。好ましくは、多量体化成分は、免疫グロブリン由来のドメインを含む。適切な多量体化成分は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９８２ Ｃｅｌｌ ２９：６７１〜６７９）；免疫グロブリン遺伝子配列、およびそれらの部分をコードする配列である。

本発明の方法に有用な融合タンパク質をコードする核酸構築物は、当該分野に公知の方法によって発現ベクターに挿入され、ここで、この核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結される。タンパク質の発現のために適切な、宿主細胞に導入される発現ベクターを含む、タンパク質を産生するための宿主ベクター系は、当該分野において公知である。適切な宿主細胞は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、または哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＢＨＫ細胞またはＮＳ０細胞）であり得る。

（アンチセンス核酸）
本発明の１つの局面において、ＶＥＧＦ媒介性活性は、ＶＥＧＦアンチセンス核酸の使用によってブロックまたは阻害される。本発明は、ＶＥＧＦまたはその一部をコードする遺伝子またはｃＤＮＡについてのアンチセンスである少なくとも６ヌクレオチドを含む核酸の治療的使用または予防的使用を提供する。本明細書中で使用される場合、ＶＥＧＦ「アンチセンス」核酸とは、ＶＥＧＦをコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の一部に対するいくらかの配列相補性によってハイブリダイズし得る核酸をいう。アンチセンス核酸は、ＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡのコード領域および／または非コード領域について相補的であり得る。このようなアンチセンス核酸は、ＶＥＧＦ発現を防ぐ化合物として有用性を有し、糖尿病の処置に使用され得る。本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはそれらの改変体または誘導体であり、細胞に直接的に投与され得るか、または外因性の導入された配列の転写によって細胞内に生成され得る。

ＶＥＧＦアンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドであり、好ましくは、６〜約５０オリゴヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、または少なくとも２００ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはキメラ混合物あるいはそれらの誘導体または改変された型であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。さらに、アンチセンス分子は、核酸模倣物（例えば、ＰＮＡ、モルホリノオリゴ、およびＬＮＡ）であるポリマーであり得る。アンチセンス分子の他の型としては、短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとして公知）および短いヘアピンＲＮＡ、および長いｄｓＲＮＡ（＞５０ｂｐであるが、通常、≧５００ｂｐ）が挙げられる。

（抑制性リボザイム）
本発明の別の局面において、糖尿病は、ＶＥＧＦをコードする遺伝子のｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するために設計されたリボザイム分子を使用し、標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳、それによる遺伝子産物の発現を防止することによりＶＥＧＦ活性レベルを減少させることによって、そのような疾患を罹患する被験体において処置され得る。

リボザイムは、ＲＮＡの特定の切断を触媒し得る酵素的なＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的な標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、その後のヌクレオチド鎖切断事象を含む。リボザイム分子の組成物は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的な１種以上の配列を含まなければならず、そしてｍＲＮＡ切断を担う周知の触媒作用的な配列を含まなければならない。この配列については、例えば、米国特許出願第５，０９３，２４６号を参照のこと。部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断するリボザイムは、ＶＥＧＦをコードするｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が、好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって指示された部位でｍＲＮＡを切断する。唯一の条件は、標的ｍＲＮＡが、以下の２塩基の配列を有することである：５’−ＵＧ−３’。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は、当該分野において周知である。本発明のリボザイムはまた、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（ＩＶＳ、またはＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして公知）において天然に存在するもののような、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）を含む。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズする８塩基対の活性部位を有し、そこで、標的ＲＮＡの切断が生じる。本発明は、ＶＥＧＦをコードする遺伝子に存在する８塩基対の活性部位配列を標的とするこれらのＣｅｃｈ型リボザイムを含む。

（ＶＥＧＦタンパク質に対する抗体の産生）
本発明の別の局面において、本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体またはＶＥＧＦ活性を結合およびブロックし得る抗体フラグメントを用いて実施され得る。抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、米国特許第６，１２１，２３０号に開示されており、本明細書中に参考として具体的に援用される。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、抗原に特異的に結合して認識する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメント由来のフレームワーク領域を含むポリペプチドをいう。認識された免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、順に、それぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥと定義される。各ＩｇＧクラスの中で、異なるアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２など）が存在する。代表的に、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性を決定する際に最も重要である。

抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、または種々のペプチドを用いる消化によって生成される多くの十分に特徴付けられたフラグメントとして存在する。例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合より下の抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’_２（Ｆａｂの二量体であって、それ自体が、ジスルフィド結合によってＶ_Ｈ−Ｃ_Ｈ１に結合された軽鎖である）を生成する。Ｆ（ａｂ）’_２は、穏和な条件下で還元され、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を分解し得、それによって、Ｆ（ａｂ）’_２二量体をＦａｂ’単量体に変換し得る。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである。種々の抗体フラグメントが、インタクトな抗体の消化に関して規定されているが、当業者は、このようなフラグメントが、化学的または組換えＤＮＡ法を用いることによって、新たに合成され得ることを理解する。従って、本明細書中で使用される場合、用語抗体はまた、完全な抗体の改変によって生成される抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ法を用いて新たに合成される抗体フラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖ）（ｓｃＦＶ）、またはファージディスプレイライブラリーを用いて同定される抗体フラグメント（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２〜５５４を参照のこと）のいずれかの抗体フラグメントを含む。

抗体を調製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５〜４９７；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローン化され得る（例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマからクローン化され得、組換えモノクローナル抗体を生成するために使用される）。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーはまた、ハイブリドーマまたはプラズマ細胞から作製され得る。重鎖遺伝子産物および軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する。単鎖抗体または組換え抗体を生成するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号；米国特許第４，８１６，５６７号）は、融合タンパク質および本発明の方法において使用される抗体を産生するために適用され得る。また、トランスジェニックマウス、または他の生物（例えば、他の哺乳動物）が、ヒト抗体またはヒト化抗体を発現するために使用され得る。あるいは、ファージディスプレイが、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーのＦａｂフラグメントを同定するために使用され得る。

抗体スクリーニングおよび選択：好ましい抗体のスクリーニングおよび選択が、当該分野に公知の種々の方法によって行われ得る。標的抗原に特異的なモノクローナル抗体の存在についての一次スクリーニングは、例えば、ＥＬＩＳＡベースの方法の使用によって行われ得る。二次スクリーニングは、好ましくは、本発明の多特異的融合タンパク質の構築において使用するための所望のモノクローナル抗体を同定および選択するために行われる。二次的なスクリーニングは、当該分野に公知の任意の適切な方法を用いて行われ得る。「Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（「ＢｉａＭＡＰ」）」と呼ばれる１つの好ましい方法は、２００３年１０月３１日に出願された同時係属のＵＳＳＮ １０／６９９，３６１に記載され、その全体が特に本明細書中に参考として援用される。ＢｉａＭＡＰは、所望の特徴を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンの迅速な同定を可能にする。より具体的には、モノクローナル抗体は、抗体：抗原相互作用の評価に基づいて、異なるエピトープ関連群に分類される。

（投与方法）
本発明は、本発明の有効量の因子を被験体に投与する工程を包含する処置方法を提供する。好ましい局面において、因子は、実質的に精製される（例えば、その効果を制限するか、または望ましくない副作用を生じる物質を、実質的に含まない）。被験体は、好ましくは、動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなど）であり、好ましくは、哺乳動物、および最も好ましくは、ヒトである。

種々の送達システムが、公知であり、本発明の因子（例えば、リポソームのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現し得る組換え細胞、レセプター媒介性エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築物など）を投与するために使用され得る。導入の方法は、経腸または非経口であり得、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物は、任意の都合の良い経路（例えば、注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚上皮（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を介する吸収）によって投与され得、他の生物学的活性因子とともに投与され得る。投与は、全身的であっても、局所的であってもよい。投与は、短期間であっても、長期間（例えば、毎日、毎週、毎月など）であってもよく、他の因子と組み合わせてもよい。

別の局面において、活性因子は、小胞、特にリポソームで送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３を参照のこと）。さらに別の実施形態において、活性因子は、制御放出システムにおいて送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが、使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）前出を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー物質が、使用され得る（Ｈｏｗａｒｄら（１９８９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照のこと）。本発明の活性因子が、タンパク質をコードする核酸である別の実施形態において、核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部を構築し、細胞内であるように投与すること（例えば、レトロウイルスベクターの使用（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと））によって、または直接注射によって、または、微粒子ボンバードメントの使用（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）によって、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト因子での被覆によって、または核酸を入れるために公知のホメオボックス様ペプチドに対する結合において投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４〜１８６８を参照のこと）などによって、インビボで投与されてそのコードされたタンパク質の発現を促進し得る。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、相同組換えによって発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込まれ得る。

（細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療）
本発明は、インビトロおよびインビボでの細胞のトランスフェクションのための本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質をコードする核酸の使用を含む。これらの核酸は、標的細胞および生物のトランスフェクションのために任意の多くの周知のベクターに挿入され得る。核酸は、ベクターおよび標的細胞の相互作用を介して、エキソビボおよびインビボで細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞の再導入は、当該分野に公知の任意の方法（カプセル化された細胞の再移植が挙げられる）によって達成され得る。組成物は、治療応答を誘発するのに十分な量で被験体に（例えば、筋肉内への注射によって）投与される。このことを達成するのに適切な量は、「治療有効用量または治療有効量」として定義される。

別の局面において、本発明は、ヒトにおける糖尿病を処置する方法を提供し、この方法は、本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質をコードする核酸で細胞をトランスフェクトする工程を包含し、ここで、この核酸は、ＶＥＧＦ特異的融合タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結される誘導プロモーターを含む。ヒトの疾患の処置または予防における遺伝子治療手順については、例えば、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１４９〜１１５４を参照のこと。

（組み合わせ治療）
いくつかの実施形態において、本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質は、インスリンまたはインスリン誘導体と組み合わせて投与され得る。組み合わせ治療は、ＶＥＧＦ特異的融合タンパク質およびインスリンを含む単一の薬学的投薬処方物の投与；ならびにＶＥＧＦ特異的融合タンパク質の薬学的投薬処方物およびそれ自体別の薬学的投薬処方物におけるインスリンの投与を含む。例えば、本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質およびインスリンは、単一の経口投薬組成物（例えば、錠剤またはカプセル）、あるいは別の経口投薬処方物において投与される各々の因子において、一緒に患者に投与され得る。別の投薬処方物が使用される場合、本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質およびインスリンは、本質的に同じ時間（すなわち、同時）、または別々にずらした時間（すなわち、連続して）に投与され得る。特定の実施形態において、インスリンは、島細胞転移を介して、または注入ポンプを使用して送達され得る。

（薬学的組成物）
本発明の方法の実施に有用な薬学的組成物は、治療的有効量の活性因子および薬学的に受容可能なキャリアを含む。用語「薬学的に受容可能な」とは、動物、およびより具体的にはヒトにおいて使用するために、連邦政府、もしくは州政府の管理機関によって承認されるか、または米国薬局方もしくは他の一般に認められる薬局方において掲載されることを意味する。用語「キャリア」とは、治療的に一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的キャリアは、滅菌された液体、例えば、水および油（石油、動物起源、植物起源または合成起源（例えば、ラッカセイ油、鉱油、ゴマ油など）の油が挙げられる）であり得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望の場合、組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、徐放処方物などの形態をとり得る。組成物は、慣例の結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリド）ともに坐剤として処方され得る。経口処方物としては、標準的なキャリア（例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）が挙げられ得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。

好ましい実施形態において、組成物は、薬学的組成物が、ヒトに対する静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与のために適応される場合、慣習の手順に従って、処方される。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および局部麻酔薬（例えば、注射部位の痛みを緩和するためのリドカイン）を含み得る。組成物が、注入によって投与される場合、滅菌された薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて投薬され得る。組成物が、注射によって投与される場合、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルは、その成分が、投与前に混合され得るように提供され得る。

本発明の活性因子は、中性または塩の形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、遊離アミノ基（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来のもの）とともに形成されるもの、および遊離カルボキシル基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のもの）とともに形成されるものが挙げられる。

糖尿病の処置に効果的である本発明の活性因子の量は、本明細書中の説明に基づく標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じて、最適な投薬範囲を特定することに役立つために使用され得る。処方物に使用される正確な用量はまた、投与経路および状態の重篤度に依存し、開業医の判断および各々の被験体の状況に従って決定されるべきである。有効量は、インビトロまたは動物モデル試験システムに由来する用量応答曲線から推定され得る。

全身投与のために、治療有効用量は、インビトロアッセイから最初に評価され得る。例えば、用量は、細胞培養において決定されるようなＩＣ_５０を含む循環濃度範囲を動物モデルにおいて達成するように処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。初回投与量はまた、インビボデータ（例えば、当該分野で周知の技術を用いる動物モデル）から評価され得る。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を、容易に最適化し得る。

投薬量および投与間隔は、治療効果を維持するのに十分な化合物の血漿レベルを提供するために、個々に調整され得る。当業者は、必要以上の実験をせずに、治療的に有効な局所投薬を最適化し得る。

もちろん、投与される化合物の量は、処置される被験体、被験体の体重、疼痛みの重篤度、投与様式、および処方する医師の判断に依存する。治療は、症状が検出される間、または検出可能でない場合でさえ、断続的に繰り返され得る。治療は、単独または他の薬物と組み合わせて提供され得る。

（キット）
本発明はまた、パッケージング物質およびそのパッケージング物質内に収容される薬学的因子を含む製造物品を提供し、その薬学的因子は、少なくとも１種の本発明のＶＥＧＦ特異的融合タンパク質を含み、そのパッケージング物質は、ＶＥＧＦ特異的融合タンパク質が、糖尿病を処置するために使用され得ることを示すラベルまたは添付文書を含む。

本発明の他の特徴は、本発明の例示のために示され、本発明を制限することを意図しない、以下の例示的な実施形態の説明の過程で明らかになる。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する仕方の完全な開示および説明を当業者に提供するために表され、発明者らが、彼らの発明と見なした範囲を限定することを意図しない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための試みがなされているが、いくらかの実験誤差および偏差が、考慮されるべきである。他に示さない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。

（実施例１．ＶＥＧＦトラップの単回注射は、１型糖尿病のラットモデルにおいて血糖値を減少させる）
成体の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝１６）を、一晩絶食させて、ストレプトゾトシンの単回の腹腔内注射（１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）中に６０ｍｇ／ｋｇ）の投与によって、糖尿病を１２匹のラットにおいて誘発させた。４匹の動物に、クエン酸緩衝液（ＣＢ）単独を注射し、非糖尿病コントロールとして与えた。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置の２４時間以内に、ＳＴＺ注射を与えたラットにおける平均血糖値は、コントロールラットにおける１０３．０±４．５５ｍｇ／ｄＬと比較して、３６７．８±３０．７ｍｇ／ｄＬまで上昇した。インスリンレベルは、ＳＴＺを注射されたラットにおいて検出されず、糖尿病の誘発を確認した。血糖値を、毎週モニタリングして、糖尿病の状態が、ＳＴＺ注射を受けたラットにおいて維持されることを確実にした。ＳＴＺ注射から２週間後、１２匹のＳＴＺを注射されたラットを、２つの群に分けた。１つの群（ｎ＝６）にＶＥＧＦトラップ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）（配列番号２）注射を皮下に与えた。もう一方の群（ｎ＝６）およびコントロールラットの群（ｎ＝４）に、当量の生理食塩水注射を皮下に与えた。全てのラットにおける血糖値を、ＶＥＧＦトラップまたは生理食塩水注射の直前、および注射から４８時間後に測定した。ＡＮＯＶＡおよび対応のあるｔ検定（ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を、統計的分析において用いた。

図１に示すように、ＶＥＧＦトラップ処置されたＳＴＺ誘発糖尿病ラットにおける血糖値は、ＶＥＧＦトラップ処置前の血糖値より有意に低かった。対照的に、生理食塩水注射を受けたＳＴＺ誘発糖尿病ラットにおいて血糖値の顕著な変化はなかった。予想されるように、注射を受けたコントロールラットにおいてもまた、血糖値の変化はなかった。

（実施例２．糖尿病マウスに対するＶＥＧＦトラップの長期投与は、正常な血糖値まで血糖の漸減を生じる）
アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）欠損マウスを、（クエン酸緩衝液中に６０ｍｇ／ｋｇ）の用量にてストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の毎日５日連続した腹腔内注射によって、糖尿病にした。コントロールマウスにクエン酸緩衝液（ＣＢ）のみを与えた。血糖値を、ＳＴＺまたはＣＢの最後の注射から４日後測定し、その後、毎日モニタリングした。血糖値は、コントロールの氷中で比較的変化しないままであるが、ＳＴＺ注射を受けたマウスにおける血糖値は、徐々に上昇し、ＳＴＺ注射から１４日後、２倍より高くなった（図２）。次いで、ＳＴＺ誘発糖尿病マウスを、２群に分けた。１群に、ＶＥＧＦトラップ（１２．５ｍｇ／ｋｇ）（配列番号２）の皮下注射を与え、もう一方の群およびコントロールマウスに、コントロールタンパク質（ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含むｈＦｃ）の皮下注射を、１週につき２回、８週間与えた。血糖値を、２週間ごとに測定した。ＶＥＧＦトラップ処置の開始から２週間後、ＶＥＧＦトラップを受けたこれらのＳＴＺ誘発糖尿病マウス血糖値は、すでに、コントロールタンパク質を受けたこれらのマウスにおける血糖値より顕著に低かった。コントロールＳＴＺ誘発糖尿病マウスにおいて血糖値は、上昇したままであったが、ＶＥＧＦトラップ処置を受けたＳＴＺ誘発糖尿病マウスにおいて血糖値は、徐々に減少し続けた。８週後、ＶＥＧＦトラップ処置を受けたＳＴＺ誘発糖尿病マウスにおける血糖値は、ほとんど、これらの非糖尿病のコントロールマウスにおける値まで減少した（図２）。

本発明は、本発明の精神または本質的な特性から逸脱せずに他の特定の形態において具体化され得る。

ＶＥＧＦトラップアンタゴニストの単回注射は、糖尿病ラットにおける血糖値を顕著に減少させる。正常なコントロールラット（ＣＢ＋生理食塩水、ｎ＝４）；生理食塩水で処置された糖尿病ラット（ＳＴＺ＋生理食塩水、ｎ＝６）；ＶＥＧＦトラップで処置された糖尿病ラット（ＶＧＴ）（１２．５ｍｇ／ｋｇ）（Ｄｉａ＋ＶＧＴ １２．５ｍｇ、ｎ＝６）。 血糖値の変化は、糖尿病マウスにおけるＶＥＧＦトラップの繰り返し投与によって生じた。コントロールタンパク質で処置された正常なコントロールマウス（ＣＢ）（ｈＦｃ、ｎ＝７、−菱形−）；ＶＥＧＦトラップで処置された糖尿病マウス（ＳＴＺ誘発）（ｈＶＴｒａｐ、ｎ＝９、−三角−）；コントロールタンパク質で処置された糖尿病マウス（ＳＴＺ誘発）（ｈＦｃ、ｎ＝９、−四角−）。

Claims (10)

1. 哺乳動物の被験体におけるＩ型糖尿病を処置または予防するための医薬の調製における、ＶＥＧＦアンタゴニストの使用であって、該ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）であるＶＥＧＦトラップである、使用。
2. 前記ＶＥＧＦトラップが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに由来するＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）である、請求項１に記載の使用。
3. 前記ＶＥＧＦトラップが、配列番号１に示される核酸配列を含む核酸によりコードされるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）である、請求項１または２に記載の使用。
4. 前記医薬が、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、または静脈内投与のために処方される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
5. 前記哺乳動物の被験体がヒトである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
6. ＶＥＧＦアンタゴニストを含む、哺乳動物の被験体におけるＩ型糖尿病を処置または予防するための医薬であって、該ＶＥＧＦアンタゴニストが、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）であるＶＥＧＦトラップである、医薬。
7. 前記ＶＥＧＦトラップが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに由来するＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）である、請求項６に記載の医薬。
8. 前記ＶＥＧＦトラップが、配列番号１に示される核酸配列を含む核酸によりコードされるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）である、請求項６または７に記載の医薬。
9. 皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、または静脈内投与のために処方される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬。
10. 前記哺乳動物の被験体がヒトである、請求項６〜９のいずれか１項に記載の医薬。

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