JP4805158B2 - 核酸増幅系に用いる内部コントロール核酸分子 - Google Patents
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Description
本発明は、全て無作為に作製した、少なくとも1のフォワードプライマー結合部位、少なくとも1のリバースプライマー結合部位および少なくとも1の増幅可能領域を含む内部コントロール核酸分子を提供する。
本発明は核酸分子を含み、該分子は本明細書にて、内部コントロール核酸分子(internal control nucleic acid molecule)、内部コントロール分子または内部コントロールとも称する。
gacatcgata tgggtgccg [配列番号1]
cgatatgggt gccgttcg [配列番号2]
atgggtgccg ttcgagc [配列番号3]。
gagacgatgc agccattcg [配列番号4]
cgagacgatg cagccattc [配列番号5]
aatattcgcg agacgatgca g [配列番号6]
gagccaagtc agatgatggt acg [配列番号7]
gacatgagcc aagtcagatg atg [配列番号8]。
Vibrio parahaemolyticus (Vp)は、米国における細菌性胃腸炎の貝類関連型症状の主な原因である河口性細菌であり、感染のほとんどは生または処理を誤った海産物の消費に起因する。Vpを検出するための以前の方法は、各種表現系アッセイにより個々の単離物を集中的に試験する人手と資金を必要とした (Myers, ML et al., Appl Environ Microbiol. 2003 69(4):2194-200; Hara-Kudo, Y. et al., Appl Environ Microbiol. 2001 Dec;67(12):5819-23.)。tl (易熱性溶血毒(thermolabile hemolysin))遺伝子はVpの種特異的マーカーであり、一方tdh (耐熱性溶血毒(thermostable direct hemolysin))およびtrh (耐熱性溶血毒類似毒(thermostable-related hemolysin))遺伝子はVpの2つの病原性マーカーである。tdhには多くの変異体が存在し、それらは全て病気を引き起こすのに十分なTDHを産生できる可能性がある。プロモーター効率関連型のtdh1およびtdh2遺伝子変異体は、K+株と関係している。tdh2は、K+株において溶血活性を起こす。tdhはまた、V. hollisae、V. fluvialis、V. mimicus、 V. cholerae、および他の病原性微生物にも見られる。病原性に関係するtrhは、tdhと関連して病原性株に存在することが多い。trh1、trh2その他の幾つかのtrh変異体も存在し、それらは84%を超えるヌクレオチド同一性を有する。trhは、tdhと約70%のヌクレオチド同一性を有する。tdhとtrhは、tdh+trh+株において染色体上で近接している。tlはVp特異的マーカーであるが、その遺伝子の幾つかの領域においてtdhおよびtrhと顕著な類似性を有する。Smart Cycler(登録商標)システム (Cepheid, Sunnyvale, CA)を用いて、4-チャンネルリアルタイム多重PCRアッセイを開発した。このアッセイは本発明の内部コントロール核酸分子を含み、天然(非濃縮)試料中の全Vpおよび病原性Vpの同時計数のためのアッセイを最適化するよう設計された。
本発明の外来内部コントロール核酸分子をこのアッセイに導入した。本アッセイに使用した例示的内部コントロール核酸分子の完全長配列を以下に示す:
cgcatgtggt cacagccctg acgaagctgt catcaagttc ataatgacat cgatatgggt 60
gccgttcgag cagtttagcc ctaaatcacc ctaccggcag acgtatgtca cattcaccag 120
ggagacgcat gagattggat gctgttgtgc gccctcaaca atgtaacgaa tggctgcatc 180
gtctcgcgaa tattgtcgta ccatcatctg acttggctca tgtctgcaag aggcttcgca 240
ctgggcttta tg 252
[配列番号9]。
この核酸分子にハイブリダイズするプローブを以下の配列番号10に示す。
tctcatgcgt ctccctggtg aatgtg 26
[配列番号10]。
リアルタイムPCR細菌計数実験に使用した、選択したV. parahaemolyticus (Vp) 株 (FIHES98、TX2103、AQ4037および91A-4950) は、5 mLのアルカリ性ペプトン水 (APW) (1.0% ペプトン、1.0% NaCl、pH 8.5 ± 0.2)にて35℃で6時間培養した。これら各培養液の1 mLのアリコートを1.5 mLの遠心チューブで15分間煮沸することによって、粗製細胞溶解液を調製した。これら溶解液に含まれるゲノムDNAを、その後のリアルタイムPCRアッセイにおいて鋳型として使用した。各6時間培養液の塗布希釈物を含むT1N3プレート (1.0% トリプトン、3.0% NaCl、2.0% 寒天)の一晩菌数より、各煮沸後鋳型調製物のもとのcfu/mLを決定した。利用したさらなるVibrio株は全て、APW中35℃で一晩培養し、一方他の全ての細菌株は、Tryptic Soy Broth (1.7% カゼイン膵液消化物、0.3% 大豆酵素消化物、0.25% D形グルコース、0.5% NaCl、2.5 g/L K2HPO4、pH 7.3±0.2)中、35℃で一晩培養した。MagNA Pure LC ロボット型 DNA 抽出装置 (Roche, Indianapolis, IN)を用いて、多くの株から精製ゲノムDNAを調製した。Bacterial DNA Isolation Kit (III)を抽出工程に使用し、100μlの濃縮培養液から100μlの溶出DNA試料を作成した。各DNA試料の純度および濃度は、それぞれUV分光光度法およびPicoGreen (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)を用いる蛍光定量法により測定した。
Vpのtl、tdh、およびtrh遺伝子のすべての既報の変異体の完全ヌクレオチド配列 (オープンリーディングフレーム領域のみ)を整列させ、DNASTAR (Madison, WI)のLasergene MegAlign(商標)ソフトウェア (クラスタルアライメント、PAM250距離表(PAM250 distance tables))用いて比較した。前記アライメントには、さらに非公知のtrh遺伝子変異体(原稿執筆中)も含まれた。Applied Biosystems (Foster City, CA)のPrimer Express Softwareを使用して、アライメントによりこれら遺伝子の各々に特徴的であると同定された領域を標的とするオリゴヌクレオチドプライマーおよびTaqMan(登録商標)またはTaqMan(登録商標)MGB蛍光プローブを設計した。複数のプライマーセットを設計し、特異性および適合性について重ねて試験した。アッセイに利用したプライマーおよびプローブについての情報は、以下の表1に見られる。
Vp のtl、tdh、およびtrh遺伝子の同時検出および定量のため、リアルタイムPCRサイクリングプロトコール、蛍光検出パラメーター、および反応成分濃度を注意深く最適化した。PCRは、容量25μlにて、以下の反応成分を用いて行った(最終濃度を示す): 1X PCR Amplification Buffer [10X バッファーが200 mM Tris-HCl (pH 8.4)および500 mM KClからなる] (Invitrogen)、5mM MgCl2、400 nMの各dNTP (Roche, Indianapolis, IN)、200 nMの各プライマー(前述)、150 nMの4種類の各蛍光プローブ (tl、tdh、trh、および内部コントロール)、および2.25 U Platinum(商標)Taqポリメラーゼ(Invitrogen)。反応容量の残りは、PCRグレートのH2O、Vp標的DNA鋳型(2μlの煮沸後細胞または5 ngの精製DNAのいずれか)、および内部コントロール試薬で構成された。リアルタイムPCRサーマルサイクリングは、Cepheid (Sunnyvale, CA)のSmart Cycler(登録商標)IIシステムを用いて行った。利用した2ステップタッチダウンサイクリングパラメーターを以下に示す。
サイクリングパラメーター
95℃60秒 x 1サイクル - 変性/taq活性化
95℃5秒、64℃45秒 x 1サイクル - タッチダウン
95℃5秒、63℃45秒 x 1サイクル - タッチダウン
95℃5秒、62℃45秒 x 1サイクル - タッチダウン
95℃5秒、61℃45秒 x 1サイクル - タッチダウン
95℃5秒、60℃45秒 x 1サイクル - タッチダウン
95℃5秒、59℃45秒 x 40サイクル - 増幅
アッセイ感度、ダイナミックレンジ、および定量能力を測定するため、多重リアルタイムPCR増幅の間に、V. parahaemolyticus (Vp)株 91A-4950 (tl、tdh、およびtrh陽性)を使用して各標的について検量線を作成した。既知のcfu/ml値(上記参照)を有する6h培養液に由来する煮沸後細胞をPBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4・7H2O、1.4 mM KH2PO4、pH 7.3 ± 0.2)により希釈(10-1〜10-7)した。アッセイは、各反応につき2μlの鋳型を用いて、各希釈についてデュプリケートで行った。
以下を含む100以上の細菌単離物の一団に対する特異性について、煮沸後細胞および/または精製DNAを用いてアッセイを試験した:Escherichia coli、Vibrio alginolyticus、V. cholerae、V. fluvialis、V. hollisae、V. metschnikovii、V. mimicus、V. parahaemolyticus、V. vulnificus、Listeria monocytogenes、L. innocua、L. ivanovii、L. seeligeri、L. welshimeri、およびSalmonella sp(図5)。アッセイの信頼性は、Vpをスパイクしたカキホモジネート(図12)、カキマントル液(図13)、およびエビホモジネート(図14)の濃縮物を使用して評価した。典型的には、Vpをスパイクした試料を試験前にその重量の9倍のAPWと90秒間混合し、35℃で一晩インキュベートした。
本発明の内部コントロール核酸分子により、Vpの全株(tl+)および病原可能性株(tdh+またはtrh+)の信頼性ある同時検出および定量が示された。
本アッセイの特異性を、13種類の異なる細菌種を代表する100株以上の一団に対して試験した。適当な標的遺伝子を有するVp株のみから標的が増幅され、蛍光シグナルが生じた。アッセイの信頼性は、以下のマトリックスに懸濁した純粋培養Vp鋳型を用いて確認した:PBS、直接および濃縮カキマントル液、カキ組織濃縮物、エビ組織濃縮物、およびカニ組織濃縮物。本アッセイは、tdh、trh、またはtdhおよびtrhの両方を有する各種Vp株の純粋培養を用いて試験した場合に、検出のダイナミックレンジが各反応につき>106 CFU〜1 CFU (各標的遺伝子を同時検出)であることが示され、また検出の正確さが2倍以内で定量性があることが示された。このリアルタイムPCRアッセイを、迅速かつ反復可能な試料や鋳型の調製および濃縮方法と組み合わせれば、環境または海産物由来の全Vpおよび病原可能性Vpを、同日に直接計数することが可能であろう。
図15は、本発明の内部コントロール核酸分子の他の使用を表す。本実施例は、実施例1と同様の方法で実施した。
Claims (37)
- a)少なくとも1のフォワードプライマー結合部位、少なくとも1のリバースプライマー結合部位および少なくとも1の増幅可能領域を含む少なくとも1の内部コントロール核酸分子;
b)配列番号1、配列番号2および配列番号3からなる群から選択される配列を含む、前記内部コントロール核酸分子の少なくとも1のフォワードプライマー結合部位に相補的に設計された少なくとも1のフォワードプライマー;および
c)前記内部コントロール核酸分子の少なくとも1のリバースプライマー結合部位に相補的に設計された少なくとも1のリバースプライマー
を含むキットであって、ここで該内部コントロール核酸分子は配列番号9の配列を含むキット。 - 複数個の内部コントロール核酸分子を含む、請求項1に記載のキット。
- 複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーを含む、請求項1または2に記載のキット。
- 少なくとも1のリバースプライマーが、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8からなる群から選択される配列を含む、請求項1から3のいずれかに記載のキット。
- 少なくとも1の内部コントロール核酸分子がプローブ結合部位を含む、請求項1から4のいずれかに記載のキット。
- 少なくとも1のプローブをさらに含む、請求項5に記載のキット。
- 前記プローブが配列番号10の配列を含む、請求項6に記載のキット。
- 前記プローブが標識化されている、請求項7に記載のキット。
- 前記内部コントロール核酸分子が線状プラスミドDNA分子である、請求項1から8のいずれかに記載のキット。
- 前記内部コントロール核酸分子が環状プラスミドDNA分子である、請求項1から8のいずれかに記載のキット。
- 前記内部コントロール核酸分子がRT-PCRに用いる一本鎖RNA分子である、請求項1から8のいずれかに記載のキット。
- 前記内部コントロール核酸分子のフォワードプライマー結合部位およびリバースプライマー結合部位がそれぞれ15から25核酸長である、請求項1から11のいずれかに記載のキット。
- 前記内部コントロール核酸分子の増幅可能領域が15から1000核酸長である、請求項1から12のいずれかに記載のキット。
- 前記内部コントロール核酸分子の少なくとも1のフォワードプライマー結合部位、少なくとも1のリバースプライマー結合部位および増幅可能領域が、20%から80%の間のGC含量を有する、請求項1から13のいずれかに記載のキット。
- 前記内部コントロール核酸分子の少なくとも1のフォワードプライマー結合部位、少なくとも1のリバースプライマー結合部位および増幅可能領域の配列が、5塩基対より多い同一塩基反復配列を持たない配列である、請求項1から14のいずれかに記載のキット。
- 前記複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーが、個別の温度でアニーリングするように選択される、請求項3に記載のキット。
- 前記複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーが、前記内部コントロール核酸分子内に一連の個別の大きさの増幅可能領域が得られるように選択される、請求項3に記載のキット。
- 前記プローブが蛍光色素およびクエンチャーの両方で標識されている、請求項8に記載のキット。
- 前記クエンチャーが非蛍光クエンチャーである、請求項18に記載のキット。
- a)少なくとも1のフォワードプライマー結合部位、少なくとも1のリバースプライマー結合部位および少なくとも1の増幅可能領域を含む少なくとも1の内部コントロール核酸分子;
b)前記内部コントロール核酸分子の少なくとも1のフォワードプライマー結合部位に相補的に設計された少なくとも1のフォワードプライマー;および
c)配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8からなる群から選択される配列を含む、前記内部コントロール核酸分子の少なくとも1のリバースプライマー結合部位に相補的に設計された少なくとも1のリバースプライマー
を含むキットであって、ここで該内部コントロール核酸分子は配列番号9の配列を含むキット。 - 少なくとも1のフォワードプライマーが、配列番号1、配列番号2および配列番号3からなる群から選択される配列を含む、請求項20に記載のキット。
- 複数個の内部コントロール核酸分子を含む、請求項20または21に記載のキット。
- 複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーを含む、請求項20から22のいずれかに記載のキット。
- 少なくとも1の内部コントロール核酸分子がプローブ結合部位を含む、請求項20から23のいずれかに記載のキット。
- 少なくとも1のプローブをさらに含む、請求項24に記載のキット。
- 前記プローブが配列番号10の配列を含む、請求項25に記載のキット。
- 前記プローブが標識化されている、請求項25または26に記載のキット。
- 前記内部コントロール核酸分子のフォワードプライマー結合部位およびリバースプライマー結合部位がそれぞれ15から25核酸長である、請求項20から27のいずれかに記載のキット。
- 前記内部コントロール核酸分子の増幅可能領域が15から1000核酸長である、請求項20から28のいずれかに記載のキット。
- 前記複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーが、個別の温度でアニーリングするように選択される、請求項23に記載のキット。
- 前記複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーが、前記内部コントロール核酸分子内に一連の個別の大きさの増幅可能領域が得られるように選択される、請求項23に記載のキット。
- 配列番号9の配列を含む、内部コントロール核酸分子。
- 複数個のフォワードプライマー結合部位および複数個のリバースプライマー結合部位を含む、請求項32に記載の内部コントロール核酸分子。
- 前記複数個のフォワードプライマー結合部位および複数個のリバースプライマー結合部位が、複数個のフォワードプライマーおよび複数個のリバースプライマーと相補的である、請求項33に記載の内部コントロール核酸分子。
- 配列番号10の配列を含む、プローブ。
- 前記プローブが標識化されている、請求項35に記載のプローブ。
- 前記プローブが蛍光色素およびクエンチャーの両方で標識されている、請求項36に記載のプローブ。
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