JP2002530090A

JP2002530090A - 核酸の定量的検出方法

Info

Publication number: JP2002530090A
Application number: JP2000582594A
Authority: JP
Inventors: ロカテッリ，ギュセッペ; ロッソ，パオロ; マルナチ，マウロ; サルバトリ，フランセスカ; スカラッチ，ガブリエラ
Original assignee: フォンダジオーネセントロサンラファエロデルモンテタボール
Priority date: 1998-11-17
Filing date: 1999-11-17
Publication date: 2002-09-17
Also published as: US20050239128A1; US7384769B2; DE69936532D1; CA2351740A1; US7029843B1; ATE366822T1; AU1272000A; EP1131466A1; EP1131466B1; IT1303767B1; ITMI982491A1; WO2000029613A1

Abstract

(57)【要約】キャリブレータと、適切なプライマーおよびプローブと、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼとの使用に基づいた、核酸の定量的検出方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、生物流体試料から核酸の定量的検出を行うための方法に関する。本発明の方法は、ウィルス性または他の病原性物質の診断、ならびに水、食料
および食物分野において使用される植物種の安全性および／または遺伝的組成を
監視するために最適に応用することができる。

【０００２】

【従来の技術】

生物流体中の病原体の存在を検出するために一般的に用いられている手法は、
抗原（直接法）またはそれぞれの抗体（間接法）の検出である。しかしながら、
ＥＬＩＳＡ、ＩＦＡまたはウェスタンブロッティングなどの免疫測定技術を用い
て行われるこの手法には、不十分な定量化精度、精密性および感度、異なる抗体
の交差反応、および早期診断が不可能であることから限界がある。

【０００３】他の解決法は、ポリメラーゼ鎖長伸長反応（ＰＣＲ）による増幅を用いて、任
意の生物源から各種分子標的に対する特異的核酸を検出することによるものであ
る。この技術は、そのさらに高度化された形、すなわち定量的競合ＰＣＲ（ｑｃ
ＰＣＲ）によって、患者と病原体とが接触してから短時間に診断を行うことがで
きるだけでなく、高い感度とかなり正確な定量的測定を行うことができる。しか
し、この系の精度および正確さは狭い定量化範囲においてしか保証されておらず
、操作者は、検査中の試料の応答数（典型的には８）を増やすことを余儀なくさ
れ、さらに増幅された産物の検出段階のために長い時間と追加の費用が必要であ
る。

【０００４】ＰＣＲキネティクスをリアルタイムで評価した最初の系は、臭化エチジウムな
どの挿入性物質によるものであった。この物質は重合している２本鎖ＤＮＡに比
例的に結合して、ＵＶ照射に応答してその蛍光を増強する。試料にＵＶ光線を照
射するような設備を持ったサーマルサイクラー内において、挿入されたエチジウ
ム分子の発する蛍光はＣＣＤカメラによって記録され、増幅サイクル数に対して
プロットされる（ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
第１０巻、４１３〜４１７頁）。この技術の主要な限界は、シグナルが非特異的
ＰＣＲ産物からも発せられることである。

【０００５】次に、米国特許第５２１００１５号に記載されたＴａｑＭａｎとして知られる
方法が導入された。この方法は、Ｔａｑポリメラーゼ酵素によって増幅すべき断
片に特異的にハイブリダイズする標識プローブの、新生短鎖ＰＣＲ産物に直接的
に依存する、分解に由来する蛍光をリアルタイムで測定することに基づいている
。ＰＣＲ反応混合物は、２つの蛍光分子、５’末端の環境指示剤および３’末端
の消光剤によって標識された伸長不能のオリゴヌクレオチドプローブを含んでお
り、プローブの配列は、オリゴヌクレオチドプライマーの２つのアニーリング部
位の間に位置する検査対象のＤＮＡ領域と相補的でなければならない。

【０００６】ＰＣＲ増幅反応の間、プライマーによって特異的に活性化されたＴａｑポリメ
ラーゼ酵素は、検査対象のＤＮＡの複製を開始する。ＤＮＡにアニールしたプロ
ーブに酵素が接触すると、その５’ヌクレアーゼ活性によってこれをを切断して
除去し、その結果として蛍光分子を分離するため、環境指示剤の蛍光色素からの
発光が測定可能になる。各ＤＮＡ分子は環境指示剤分子の遊離物に付随しており
、全蛍光は常に増幅されたＤＮＡの量に比例している。配列検出システム７７０
０ＡＢＩＰＲＩＳＭ（パーキンエルマー社によって製造、販売）は、ＤＮＡ
増幅装置として、およびＰＣＲ反応中における試料からの蛍光シグナルの収集装
置としての両方の役割を果たすことができる。これらのシグナルは、既知のＤＮ
Ａ含量を有する試料からの蛍光シグナルにより作成した標準曲線によって、分析
試料中の出発ＤＮＡ量を外挿することのできるソフトウェアによって処理される
。上記のようなシステムは、プライマーの特異的アニーリングおよびプローブの
特異的アニーリングという２つの特異性レベルが与えられることに注目しなけれ
ばならない。

【０００７】

【発明の開示】

本発明者は、核酸ポリメラーゼのポリメラーゼおよび５’ヌクレアーゼ活性に
基づく核酸定量化技術に一般的に適用可能な方法であって、感度、精度および正
確性を高めて測定変量を小さくするとともに、この技術そのものの効率を高める
ような方法を見いだした。

【０００８】本発明の方法は、試料の抽出工程、標的核酸の増幅工程、および、それに続く
キャリブレータおよび標的配列に特異的にハイブリダイズすることのできる適切
なプローブを用いた検出工程の間に、キャリブレータを使用することに基づいて
いる。

【０００９】本発明の方法は、様々な生物源からのあらゆる核酸の絶対的定量化に適用する
ことができる。たとえば、体液（髄液、尿、血漿、血清、滑液）中のウィルス性
または細菌性病原体の定量化、あるいは環境または食物汚染物質の定量化に適用
することができる。

【００１０】

【発明の実施形態】

核酸ポリメラーゼのポリメラーゼおよび５’ヌクレアーゼ活性を用いた核酸定
量化技術は、試料から核酸抽出し、ポリメラーゼと、標的配列に特異的なプライ
マーと、２つのプライマーに相補する領域間に含まれる標的配列に特異的なプロ
ーブとを含む反応混合物を調製し、前記プローブは環境指示剤（この環境指示剤
は好ましくは蛍光物質である）と消光剤とによって標識されており、これらに続
いて、標的核酸にアニールしたプローブの５’末端にポリメラーゼが接触したと
きに遊離される環境指示剤標識からのシグナルを測定することによるものである
。

【００１１】本発明の方法に従えば、定量的に検出しようとする核酸（標的核酸）の抽出に
先立って、以下キャリブレータと呼ぶ鋳型核酸を試料に既知量添加する。キャリ
ブレータは、標的核酸の対応する領域とは異なる配列を有する１つまたはそれ以
上の領域を有する以外は、標的核酸配列と同一の配列を有し、該標的核酸に対し
てランダム化された配列と同様のＴｍを有している。より詳細には、それらの異
なる領域のうちの１つがプローブと相補的でなければならず、Ｔｍは標的核酸の
Ｔｍの±４℃の範囲にあり、好ましくは±２℃の範囲になければならない。キャ
リブレータの他の異なる領域は、標的核酸に対してランダム化された配列と標的
核酸のＴｍの±１℃の範囲のＴｍとを有し、プライマーとアニールするものであ
ればよい。

【００１２】この第２の実施形態が与えられる場合、すなわち、プローブに相補的な領域に
加えて、プライマーに相補するキャリブレータ領域が標的核酸に対して変えられ
た場合、標的鋳型とキャリブレータの間で起こる競合を著しく低減することがで
き、標的鋳型とキャリブレータとを単一の反応チューブ内で同時に測定すること
ができる。

【００１３】抽出後、プライマーと、別に環境指示剤（環境指示剤は異なるプローブ間で同
じであっても異なっていてもよい）および消光剤によって誘導体化したプローブ
とを、抽出された試料−キャリブレータ混合物に添加する。プライマーにアニー
ルするキャリブレータ上に存在する可変領域の数に応じて、反応混合物に２つま
たはそれ以上のプライマーを添加してもよい。好ましくは、３対まで、より好ま
しくは２対までのプライマー（フォワードおよびリバース）が用いられる。さら
に、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ポリメラーゼを添加すること
により、ポリメラーゼ／ヌクレアーゼ反応を開始させる。

【００１４】反応は、ＤＮＡ増幅装置と、ポリメラーゼヌクレアーゼ活性によって遊離され
た環境指示剤標識から発生する蛍光シグナルの収集装置との両方の役割を果たす
ことができる、配列検出システム７７００ＡＢＩＰＲＩＳＭ中で実施する。
実際には、反応は３回平行して実施し、そのうちの１回は標的核酸に特異的なプ
ローブの存在下で実施し、１回はキャリブレータに特異的なプローブ／プライマ
ーの存在下で実施し、１回は両者の存在下で実施する。

【００１５】標的核酸特異的プローブ存在下の反応では、抽出された標的核酸のコピー数（
Ｎ₀）の定量化を行うことができる。キャリブレータ存在下での反応では、抽出
によって回収されたキャリブレータのコピー数（Ｃ₀）の定量化を行うことがで
きる。両者存在下の反応では、標的鋳型とキャリブレータとの総数（Ｔ）を計算
することができる。

【００１６】したがって、キャリブレータ回収率Ｒの百分率を以下のように計算することが
できる。Ｒ＝Ｃ₀／Ｃこれより、較正係数（ｃａｌ）は、ｃａｌ＝１／Ｒしたがって、抽出前の試料中の実際の核酸単位数は、以下のようにして得られる
。

【００１７】Ｎ＝Ｎ₀×Ｃａｌ以下の関係、Ｔ＝Ｎ₀＋Ｃ₀ は、標準およびキャリブレータＤＮＡの増幅効率が同一であることを保証するも
のである。

【００１８】キャリブレータの非増幅は、臨床診断において増幅方法を用いる際の最重要欠
点の１つとなっている、あらゆる偽陰性（技術的ミスまたは阻害物質の存在）の
検出を可能にする。

【００１９】反応条件は、ｑｃＰＣＲ反応において一般的に採用されているものと同じであ
る（ペトリック（Ｐｅｔｒｉｋ．ｊ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
、第６４巻１４７〜１５９頁、１９９７年）。反応条件は、競合を補償するため
に変更することができる。より正確には、プライマー濃度、ポリメラーゼ酵素濃
度、アニーリング／伸長時間、またはＭｇＣｌ₂などの補因子の濃度を変更する
ことができる。

【００２０】標的核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよいが、好ましくはＤＮＡ
であり、プライマーおよびプローブは好ましくはデオキシリボヌクレオチド配列
である。核酸がＲＮＡである場合には、対応するＤＮＡを得るために前レトロ転
写工程が必要になる。プローブは、蛍光環境指示剤標識と、プローブが溶液中で
遊離している際の環境指示剤標識からの蛍光を低減または回避するための消光剤
標識とを含んでいる。

【００２１】環境指示剤の例としては、ＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシ−フルオレ
セイン）、ＪＯＥ（２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフ
ルオレセイン）、ＨＥＸ（ヘキサクロロ−６−カルボキシ−フルオレセイン）が
挙げられ、好ましくはＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン
）およびＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレセイン）が、それぞれ消光剤および
環境指示剤として用いられる。

【００２２】好ましくは、前記プローブの５’末端は、フォワードプライマーの３’末端か
ら１〜３０ヌクレオチドの範囲である。すなわち、核酸重合の非存在下において
環境指示剤標識を遊離させることのできる距離である。好ましくは、プローブは
、ポリメラーゼによる伸長を阻止するためにブロックされた３’末端を有し、プ
ライマーのＴｍよりも高いＴｍを有し、１８〜３０ヌクレオチドから成る。

【００２３】核酸ポリメラーゼは、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ポリメラ
ーゼであり、好ましくはＤＮＡポリメラーゼであり、より好ましくはＴｈｅｒｍ
ｕｓ種に由来するＤＮＡポリメラーゼである。

【００２４】上述の方法の大きな利点は、阻害物質を含む試料の検出を行い、遺伝子材料抽
出の収率を数学的にキャラクタライズすることができるというものである。さら
なる利点は、キャリブレータと標的核酸とを同一の反応チューブ内で同時に測定
することができるというものである。試料から増幅反応の全阻害物質を検出でき
ることにより、既知の技術でしばしば起こる偽陰性を無くすことができる。さら
に、較正には、たとえばＴａｑＭａｎ技術によっては必要とされていた別の評定
を必要としない（シャトラー（ＣｈａｔｅｌｌａｒｄＰ.）ら、Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第７１巻１３７〜１４６頁、１９９８年）。

【００２５】また本発明は、標的核酸に応じて、適切なキャリブレータと、標的核酸に特異
的なプローブと、２つまたはそれ以上のプライマーと、核酸ポリメラーゼとを含
む、上述の方法を実施するためのキットも提供する。

【００２６】好ましい実施形態に従えば、本発明の方法は、試料中のＨＨＶ−６、ＨＨＶ−
７、ＨＨＶ−８およびＨＩＶウィルスのゲノム核酸を定量的に検出するために用
いられる。

【００２７】特に、ＨＨＶ−６の場合、アッセイは次の２段階に分けて行われる。第１段階
において、フェノール／クロロホルムによる標準的な溶菌−精製プロトコールに
従って遺伝子抽出を行い、第２段階において、「プライマーエクスプレス（Ｐｒ
ｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ）」ソフトウェア（パーキンエルマー）によって選択
された特異的プライマーおよびプローブを用いた増幅反応を行う。

【００２８】プライマーおよびプローブは、Ａ型およびＢ型のＨＨＶ−６株の両者を同一の
効率で増幅するように設計されている。この特徴によって、非常に高い診断感度
が得られる。

【００２９】本発明の方法に従う較正は、ＤＮＡ抽出前に、ＨＨＶ−６アンプリコンと同一
の速度論的特性で増幅可能であると同時に、ＨＨＶ−６アンプリコンとは明確に
区別可能な既知量の鋳型ＤＮＡを試料に添加することによるものである。このよ
うにして、ランダム配列ではあるが同一のヌクレオチド組成を保存するように修
飾されたプローブに相補的な領域を除いては、ＨＨＶ−６プライマーによって増
幅されたものと同一であり、同じ融点（Ｔｍ）を有するＤＮＡ断片がクローン化
される。得られたプラスミド（「キャリブレータ」と呼ぶ）を標準プラスミドと
同一のプライマーおよび同一のキネティクスで増幅するが、ＰＣＲ混合物がラン
ダム配列に相補する配列を有するプローブを含んでいる場合のみ７７００ソフト
ウェアによって解明される。

【００３０】キャリブレータプラスミドを伸長し、抽出すべき試料に正確な量の該キャリブ
レータプラスミドを添加するために、分光光度計によって精確に定量化する。Ｄ
ＮＡ抽出を行った結果、試料は、該抽出の全収率に応じて一定量のＨＨＶ−６ゲ
ノムおよびキャリブレータプラスミドコピーを含んでおり、したがって、両分子
種に対して同一の収率であると仮定しての、ＨＨＶ−６ＤＮＡ定量化が可能にな
る。

【００３１】各反応に特異的な条件については、実施例の項で詳細に示す。競合を補償するために、反応条件は以下のように変更した。プライマー濃度を
１０倍に高め、酵素濃度を２倍にし、増幅アニーリング／伸長を当初の６０秒か
ら１サイクルにつき８秒間延ばした。しかしながら、鋳型間の競合は、キャリブ
レータ入力値の上下２、（較正された）絶対定量化範囲を７桁から５桁に狭める
が、（較正されていない）相対定量化範囲および実験的偽陰性の検出能力は変化
しない。

【００３２】代替実施形態によれば、最初のキャリブレータ配列は、２つのオリジナルプラ
イマーの理論Ｔｍ（特別のソフトウェアであるプライマー・エクスプレスＰＥ（
フォスター市、カリフォルニア）によって算出）を維持した領域をコードする２
つのプライマー中にさらにランダム化されている。新しいキャリブレータ分子の
相互配列は、実施例の表２に報告する。標的ＤＮＡ分子およびキャリブレータを
、以下の式によって示されるように、同一のキネティクスで増幅した。標準鋳型の増幅に対しては、ｙ＝３７．８０４＋−３．４４０２×ＬＯＧ（ｘ）
Ｒ＝１０００。キャリブレータ鋳型の増幅に対しては、ｙ＝３８．５４３＋−３．５６８×ＬＯ
Ｇ（ｘ）Ｒ＝０．９９８。

【００３３】同一のチューブに添加した２つの分子は、標準化ＰＣＲ反応を用いて、７桁を
越えるまでに適切に同時増幅され、競合に対する補償を必要としなかった。標的
ＤＮＡとキャリブレータとを単一チューブ内で同時に検出および定量化するため
に、キャリブレータを５’末端において、ＶＩＣ（ＰｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）
によって誘導体化した。ＶＩＣは、標的ＤＮＡ分子の検出に用いられるものとは
異なる発光スペクトルを有する蛍光分子である。

【００３４】２つの色素の発光スペクトルの部分的重複によって発生する干渉を除去するた
めに、プライマーとプローブの濃度を低くする（いずれも最終濃度５０ｎＭ）こ
とにより、キャリブレータＰＣＲ条件変更した。Ｃｔ（サイクル閾値）を変更す
ることなく、ＶＩＣ環境指示剤の発光シグナルの減少を達成することができ、こ
れによりキャリブレータ自体の再現可能な定量化が可能になった。

【００３５】スペクトル干渉は、基準曲線において用いた標準の最大量よりも１対数高い固
定濃度のキャリブレータを添加することにより、完全に回避することができた（
すなわち、標準曲線に対しては１０，０００，０００コピー、標準の最高濃度は
１，０００，０００コピー反応であった）。

【００３６】以下の実施例において、本発明をさらに詳細に説明する。

【００３７】

【実施例】

［実施例１］ＨＨＶ−６，ＨＨＶ−７，ＨＨＶ−８，ＨＩＶ，３５ｓＣＡ
ＭＶおよびミコバクテリア配列の選択Ｕ６７ＨＨＶ−６領域（Ａ変異体、ジーンバンク、アクセション番号Ｘ８３
４１３）および２６ＨＨＶ−８ｏｒｆ領域（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、第２６６巻１８６５〜１８６９頁、１９９４年）、ＨＨＶ−７領域（
ジーンバンクＡＦ０３７２１８）、３５ｓＣＡＭＶ（ジーンバンクＡＦ１４０
６０４）、ＲｅｇＸ−ＳｅｎＸ（ジーンバンクＭＴＹ１３６２８）、および１５
６１１０（ジーンバンクＸ１７８４８）、およびＬＴＲと、配列ＨＸＢ２ＣＧ−
アクセション番号Ｋ０３４５５（ジーンバンク）を用いたヌクレオチド６８４〜
８１０からのｇａｇ領域との間のＨＩＶ領域マッピングが、以下の表１（プライ
マーと、標的核酸のプローブと、キャリブレータプローブ）に示すように報告さ
れている。ＨＨＶ配列（プライマーと、標的のプローブと、キャリブレータのプ
ライマーとプローブ）が以下の表２に示すように報告されている。

【００３８】キャリブレータのプローブ配列（ＨＨＶ−７，ＨＨＶ−８，ＨＩＶ−１，ＣＡ
ＭＶ，Ｍｙｃ．Ｔ）およびキャリブレータのプライマー（ＨＨＶ−６）は、標準
のプローブ領域をランダム化して設計したが、その際以下の１〜４の点を維持し
ていた。

【００３９】１．標準と同一の塩基組成（Ｇ＋Ｃ／Ａ＋Ｔ）２．同一のＴｍ（パーキンエルマーソフトウェアによって計算）３．同一の長さ（同一の増幅効率を有するように）４．交差ハイブリダイゼーションおよび干渉を回避するために、標準（
標的）との相同性を完全に欠いていることを特徴とする。

【００４０】

【表１】

【００４１】

【表２】

【００４２】

【表３】

【００４３】

【表４】［実施例２］ＨＨＶ−６標準（標的核酸）およびキャリブレータのクローニン
グと調製ＨＨＶ−６ウィルス検出系における標準およびキャリブレータＤＮＡ構築のた
めに用いた断片は、図１に模式的に示されている（それぞれ１−Ａおよび１−Ｂ
）。

【００４４】標準断片配列は、ＨＨＶ−６ＧＳ株由来のウィルスＤＮＡを増幅し、これを
ｐＣＲＩＩプラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化するこ
とによって得た。キャリブレータ断片（１３３ｂｐ）は、Ｏｌｉｇｏｓｙｎｔｈ
ｅｔｉｚｅｒ（パーキンエルマー）によって化学的に合成し、上記と同一のベク
ター中にクローン化した。

【００４５】クローニング後、両断片を以下のｉ）およびｉｉ）を同定するために、完全配
列決定した。ｉ）標準断片とオリジナルウィルスＤＮＡとの同一性（共直線性）
。ｉｉ）キャリブレータ断片と人工的に設計された配列との同一性。

【００４６】図１に示されるように、転写方向に向かう矢印は、プライマーとして用いられ
たオリゴヌクレオチド配列を示す。点線は、両構築物内の、２つの構築物を区別
するプローブとして使用された２５ヌクレオチド領域（小文字で記される）を示
しており、残りの１０８ヌクレオチドは同一である。これらの領域は、同一の塩
基組成と非常に類似したＴｍとを有するものの、非相同系として機能するように
設計されており、特異的蛍光量検出において用いられるプローブと標準およびキ
ャリブレータ断片との間での交差ハイブリダイゼーションを防止または最小限に
することができる。

【００４７】［実施例３］ＨＨＶ−６キャリブレータ／標準系の確認（交差ハイブリダイゼーションの欠如）我々は、交差ハイブリダイゼーションによる偽性シグナルが無いことを実験的
に確認した。相同プローブ（標準ＤＮＡに対しては標準プローブ、キャリブレー
タＤＮＡに対してはキャリブレータプローブ）または非相同プローブ（キャリブ
レータＤＮＡに対しては標準プローブ、標準ＤＮＡに対してはキャリブレータプ
ローブ）を用いて、標準およびキャリブレータ断片（各ＰＣＲ反応につき１０１
〜１０６コピー）の濃度増加を測定した。図２Ｂは、測定のための断片と相同す
るプローブを用いた種々の鋳型量の検出結果を示しており、同図において、ａ）
は標準増幅曲線、ｂ）は較正曲線を示す。検出は重複したキネティクスを有する
両構築物に対して行い（曲線１〜５、ａ，ｂ）、さらに鋳型の増幅が測定された
蛍光シグナルに比例することが示された。両鋳型に対して非相同プローブを使用
した場合（図２Ａ）は、系のバックグラウンドノイズよりも測定可能なほど高い
シグナルは発生しなかった。

【００４８】（共直線性）使用した鋳型のコピー数の増加の関数としての閾値サイクルとして得られた値
から得られる２本の回帰直線式を比較することにより、２つの鋳型の増幅の共直
線性を測定した。

【００４９】結果の式は以下の通りである。標準鋳型の増幅に対しては、ｙ＝３７．８０４＋−３．４４０２×ＬＯＧ（ｘ）Ｒ＝１０００。キャリブレータ鋳型の増幅に対しては、ｙ＝３８．５４３＋−３．５６８×ＬＯ
Ｇ（ｘ）Ｒ＝０．９９８。

【００５０】２本の直線の傾斜比は１．０１７であり、このことから、この２つの系は増幅
効率と蛍光検出動力学の両方に関して完全に重複していることが示される。（較正範囲）同一のＰＣＲ反応において２つの鋳型の増幅を行った場合、この系によって検
出された増幅曲線に測定可能な変化が見られた（図３Ａ）。実際のところ、コピ
ー数の増加に対して、すなわち、０、５００、５，０００、５０，０００、５０
０，０００の標準コピー（それぞれ１ａ〜１ｅ）の存在下において共増幅された
唯一の用量内の５００のキャリブレータコピーに対して、蛍光シグナルは、蓄積
のキネティクスおよび遊離産物の最終量のいずれにおいても変化させることがで
きる。閾値サイクルにおいて（Ａ’図）、同等かもしくは１Ｌｏｇだけ高い標準
鋳型の濃度（Ａ’図、曲線１ａ〜１ｃ）は、キャリブレータ定量化の精度に影響
を与えない。より高い濃度（曲線１ｄ，１ｅ）に対しては、定量化は部分的に（
閾値サイクルの著しい遅延、１ｄ）あるいは完全に損なわれる（１ｅ）。ＰＣＲ
条件の最適化、ならびに特にプライマー濃度増加（３００ｎＭから３μＭへ）、
酵素濃度を倍増（ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄユニットを０．６２６から１．２５
に増加）、および各ＰＣＲサイクルの長さの延長（アニーリングおよび伸長段階
のあいだ、１サイクルにつき８秒間延長）の組み合わせ作用により、増幅産物の
蓄積キネティクスと蛍光シグナルの最終収率（図Ｂ、曲線１ａ〜１ｅ）が改善さ
れる。閾値サイクルにおいて（Ｂ’図）、キャリブレータ入力よりも最高で２Ｌ
ｏｇ（５０，０００コピー）高い標準鋳型濃度では、その定量化を修正すること
はない（Ｂ’図、曲線１ｅ〜１ｄ）。より高い濃度においては（５００，０００
コピー）、シグナルの指数関数的増加の欠如がキャリブレータの精確な測定を維
持することはないものの（Ｂ’図、曲線１ｅ）、キャリブレータプローブからの
蛍光シグナルが測定可能である。

【００５１】反対の条件において（図４Ａ）、すなわち、標準に対して最高で２Ｌｏｇ過度
の濃度のキャリブレータを用いた場合（たとえば、標準５コピーに対してキャリ
ブレータ５００コピー）、反応キネティクスの分析は上述の通りである。特に、
最適化された条件下において、閾値サイクル（Ａ’図、「ａ」はキャリブレータ
非存在下における標準の増幅曲線、「ｂ」はキャリブレータ存在下において測定
された曲線）における定量化は、この場合の標準においては、修正されない（Ａ
’図：曲線１ａ〜１ｂ、１００コピーの標準と２５コピーの標準濃度、３ａ〜ｂ
：５コピーの標準濃度）。

【００５２】この最適化により、未知量の鋳型の精確な定量化を行うことがができ、以下の
実用的利点が達成される。（１）少なくとも５Ｌｏｇのダイナミックレンジ（たとえば、各反応につき５
〜５０，０００コピー）での試料の精製および増幅の全処理の絶対制御（定性的
、定量的の両方）。

【００５３】（２）少なくとも７対数のダイナミックレンジでの精製および増幅の定量的制
御（技術的ミスまたはＰＣＲ反応を阻害する汚染物質の存在による偽陰性）。（３）未知試料の系列希釈が不要。

【００５４】（４）ただ１つの既知量のキャリブレータを挿入する（たとえば、５００コピ
ー）。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＨＶ−６ウィルス検出系における標準およびキャリブレータＤＮ
Ａ構築のために用いた断片を示した図。

【図２】標準およびキャリブレータ断片（各ＰＣＲ反応につき１０１〜１０
６コピー）の濃度増加標準増幅曲線（Ａ）及び較正曲線（Ｂ）を示した図。

【図３】ＰＣＲ反応において２つの鋳型の増幅を行った場合の増幅曲線（Ａ
）その閾値サイクル（Ａ’）、増幅産物の蓄積キネティクスと蛍光シグナルの最
終収率（Ｂ）その閾値サイクル（Ｂ’）とを示した図。

【図４】反対の条件において、標準に対して最高で２Ｌｏｇ過度の濃度のキャ
リブレータを用いた場合（Ａ）、最適化された条件下における閾値サイクル（Ａ
’）を示した図。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１１月２７日（２０００．１１．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者マルナチ，マウロイタリア，ミラノアイ−20132，ヴィアオルゲッティナ 58 (72)発明者サルバトリ，フランセスカイタリア，ミラノアイ−20132，ヴィアオルゲッティナ 58 (72)発明者スカラッチ，ガブリエライタリア，ミラノアイ−20132，ヴィアオルゲッティナ 58 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA09 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ06 QQ10 QQ42 QR08 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料から核酸（標的）の定量的検出を行うための方法であって、以下の特徴を
含む方法。（ａ）試料自体に前もって添加された別の核酸（キャリブレータ）によって試
料から核酸を抽出することと、前記キャリブレータは、環境指示剤および消光剤
によって標識されたプローブにハイブリダイズするか、もしくは前記プローブに
加えて２つまたはそれ以上のプライマーにハイブリダイズする標的核酸中の１つ
またはそれ以上の領域を除いて標的核酸と同一の配列を有しており、上記領域は
互いに異なるランダム化された核酸配列と類似したＴｍを有する。（ｂ）抽出された標的核酸およびキャリブレータを、キャリブレータおよび標
的核酸上の対応する領域とアニールするプライマー（フォワードおよびリバース
）と混合するか、あるいは（ａ）において規定したように、キャリブレータ上の
ランダム化された領域にアニールするプライマーに加えて、標的核酸およびキャ
リブレータ上の対応するランダム化された領域にアニールするプローブと混合し
、前記プローブは環境指示剤および消光剤を有し、さらに５’−３’ヌクレアー
ゼ活性を有する核酸ポリメラーゼとも、ポリメラーゼ反応を実施するのに適切な
条件下で混合する。（ｃ）５’ポリメラーザヌクレアーゼ活性によって遊離された環境指示剤に付
随するシグナルを測定する。
【請求項２】前記キャリブレータのＴｍは、標的核酸のＴｍの±４℃の範囲にある、請求項
１に記載の方法。
【請求項３】前記プローブの５’末端はフォワードプライマーの３’末端から１〜３０ヌク
レオチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】前記プローブは、ポリメラーゼによる伸長を防ぐためにブロックされた３’末
端を有することを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】前記核酸，前記プローブおよび前記プライマーはＤＮＡ配列であり、核酸ポリ
メラーゼは５’−３’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで
ある、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】プローブは、プライマーよりも高いＴｍを有する、請求項１〜５の何れかに記
載の方法。
【請求項７】前記プローブは、１８〜３０ヌクレオチドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記プローブは、プローブが溶液中で遊離状態にあるときに環境指示剤標識の
蛍光を低減または回避することのできる消光剤標識を含んでいる、請求項１〜７
の何れかに記載の方法。
【請求項９】標的核酸は、ウィルスＨＨＶ−６，ＨＨＶ−７，ＨＨＶ−８およびＨＩＶのゲ
ノム核酸である、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】ウィルスはＨＨＶ−６であり、フォワードプライマーは配列５’ＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＴＡＴＣＣＡＧＡＧ
ＣＧ３’、リバースプライマーは配列５’ＣＧＣＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＣＧＡ
３’、標的核酸プローブは配列５’ＣＧＣＴＡＧＧＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＣＧＡ３
’、およびキャリブレータプローブは配列５’ＴＡＣＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧ
ＡＣＣＴＡＧＣＧＡ３’を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】ウィルスはＨＨＶ−７であり、フォワードプライマーは配列５’ＡＧＣＧＧＴＡＣＣＴＧＴＡＡＡＡＴＣＡＴ
ＣＣＡ３’、リバースプライマーは配列５’ＡＡＣＡＧＡＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＴ３
’、標的核酸プローブは配列５’ＡＣＣＡＧＴＧＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＴＣＴＡＡ
ＣＴＧＧＡＴＣＡ３’、およびキャリブレータプローブは配列５’ＴＡＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＡＣ
ＧＧＧＴＡＴＡＡＴＡＣＴＡＡ３’を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】ウィルスはＨＨＶ−８であり、フォワードプライマーは配列５’ＧＴＣＣＡＧＡＣＧＡＴＡＴＧＴＧＣＧＣ３
’、リバースプライマーは配列５’ＡＣＴＣＣＡＡＡＡＴＡＴＣＧＧＣＣＧＧ３’
、標的核酸プローブは配列５’ＣＡＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＡＴＡＧＡＴＣＡＡＧ
ＴＴＣＣＧＣＣＡ３’、およびキャリブレータプローブは配列５’ＡＣＴＡＴＴＣＣＡＴＧＣＧＧＡＡ
ＴＴＣＧＡＧＣＡＴＡＧＴＴＧ３’を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】ウィルスはＨＩＶ−１であり、フォワードプライマーは配列５’ＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣ３’
、リバースプライマーは配列５’ＴＣＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧ３’、標的核酸プローブは配列５’ＡＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＧＣＣＴＣＣＧ
ＣＴＡＧＴＣＡＡ３’、およびキャリブレータプローブは配列５’ＡＣＴＣＴＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＣ
ＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＴＡＣＴ３’を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】前出の請求項において規定されるキャリブレータの、核酸試料の定量的検出の
ための方法における使用。
【請求項１５】試料から核酸を定量化するためのキットであって、１つまたはそれ以上のキャ
リブレータと、各標的核酸に特異的なプローブおよびキャリブレータに特異的な
プローブと、２つまたはそれ以上のプライマーと、５’−３’ヌクレアーゼ活性
を有する熱安定性核酸ポリメラーゼとを含むキット。