JP4804665B2 - レーザ顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１つの波長を有するレーザビームもしくはそれぞれ波長の異なる複数のレーザビームを２次元的に走査させ、対物レンズを介してレーザビームを標本上で集光させて、この標本から得られる光を検出するレーザ顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
このような顕微鏡を用いて観察するためには、現在では様々な蛍光試薬で標本が染色されて行なわれている。このため、複数の蛍光試薬を用いて同一の生体細胞組織（標本）を多重染色し、波長の異なる複数のレーザビームを標本上に照射して、多重蛍光観察を行なうことによって、生体細胞組織の様々な形態や機能の解析が可能となっている。
【０００３】
また、単一の波長（以下、１波長という）の励起光（レーザビーム）を標本に照射して２つの異なる波長（以下、２波長という）の蛍光を発生させる、１波長励起２波長蛍光を発生させる試薬や、励起された蛍光色素のエネルギで別の蛍光色素を励起させるエナジートランスファー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）など、１波長の励起光に対して２波長の蛍光を測定して、これら蛍光の蛍光量のレシオを求める手法も行なわれている。
【０００４】
一方、近年では、超短パルスレーザにより出射されたレーザビームによる多光子励起現象を利用したレーザ顕微鏡が実用化されている。この多光子励起現象を発生させる超短パルスレーザにより標本を励起するには、近赤外波長で紫外光励起用の蛍光試薬を励起させて蛍光を発生させることができるので、標本への光障害が少なく、標本深部の観察ができるなどの利点がある。しかし、通常の共焦点光学系と同様の光学系を使って蛍光を検出するのは、幾つものレンズやミラーなどを経由させる必要があるために損失が大きく、検出光（蛍光）が非常に弱くなってしまうという欠点がある。
【０００５】
このため、特開２０００−３３００２９号公報による技術は、蛍光を走査光学系および共焦点ピンホールに戻さずに分離して、短い光路で損失を少なくし、効率的に検出する顕微鏡を提案したものである。
【０００６】
この技術による顕微鏡は、共焦点用のレーザ光源および光検出器と、多光子励起現象を発生させるレーザビームを出射させる超短パルスレーザ光源および光検出器とを備えているが、対物レンズと走査光学系との間に配置された波長分離ミラーは、共焦点検出用と多光子励起現象で発せられた蛍光の検出用とがそれぞれ別に用意され、この波長分離ミラーを切り替えて、共焦点を用いる場合と多光子励起現象により発せられた蛍光を検出する場合とで選択して光を検出している。
【０００７】
また、例えば、１波長励起２波長蛍光を発生させる試薬としては、ＳＮＡＲＦ−１として知られているものがあり、これはｐＨ測定用に用いられている。このＳＮＡＲＦ−１を励起させるレーザビームの波長は５３０ｎｍ、発生される蛍光の波長は５８０ｎｍ、６３０ｎｍである。また、近年、カメレオン（商標）というプローブを用いて２つの蛍光タンパク質であるＣＦＰ蛍光およびＹＦＰ蛍光のエナジートランスファーを利用するカルシウムイオン濃度測定が行なわれるようになってきている。これは、波長４４２ｎｍのレーザビームでＣＦＰ蛍光を励起させ、この励起されたＣＦＰ蛍光のエネルギでＹＦＰ蛍光を励起させる手法で、ＣＦＰ蛍光の波長４８５ｎｍ、およびＹＦＰ蛍光の波長５３０ｎｍから得られる蛍光量のレシオを測定するものである。
【０００８】
これらＳＮＡＲＦ−１およびカメレオンで標本を多重染色した場合に、この標本から発せられる複数の蛍光を検出するレーザ顕微鏡の光学系について図９を用いて説明する。
【０００９】
図９に示すように、レーザ光源１０１ａ，１０１ｂからそれぞれ出射されたレーザビーム１０３ａ，１０３ｂは、ダイクロイックミラー１２３によって合成される。この合成されたレーザビーム１０６は、波長分離ミラー１０７によって反射され、ガルバノミラー１０８によって２次元的に走査される。そして、このレーザビーム１０６は、投影レンズ１０９、反射ミラー１１０、結像レンズ１１２、対物レンズ１１３を介して標本１１４上に集光され、標本１１４が励起される。
【００１０】
このレーザビーム１０３ａによって励起された標本１１４からは、それぞれ異なる波長を有する蛍光１１５ａ，１１５ｂが発せられる。また、レーザビーム１０３ｂによって励起された標本１１４からは、同様に蛍光１１５ｃ，１１５ｄが発せられる。そして、これら蛍光１１５ａ，１１５ｂ，１１５ｃ，１１５ｄは、対物レンズ１１３、結像レンズ１１２などを順に遡って波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）１０７に入射される。
【００１１】
これら蛍光１１５ａ，１１５ｂがそれぞれＣＦＰ蛍光およびＹＦＰ蛍光であり、また、蛍光１１５ｃ，１１５ｄがそれぞれＳＮＡＲＦ−１の蛍光であるとすると、検出される蛍光は、図１０の１点鎖線および２点鎖線に示す特性が得られる。このため、図１０には、これらＣＦＰ蛍光１１５ａ、ＹＦＰ蛍光１１５ｂ、およびＳＮＡＲＦ−１の蛍光１１５ｃ，１１５ｄが透過され、レーザビーム１０３ａ，１０３ｂが反射されるのに必要なダイクロイックミラー１０７の特性が示されている。ここで、ＳＮＡＲＦ−１の励起レーザは、波長５４３ｎｍのＧｒｅｅｎ Ｈｅ：Ｎｅレーザとしている。
【００１２】
このため、これらＣＦＰ蛍光１１５ａ、ＹＦＰ蛍光１１５ｂ、およびＳＮＡＲＦ−１の蛍光１１５ｃ，１１５ｄは、このダイクロイックミラー１０７を透過して、ミラー１１９によって反射され、ダイクロイックミラー１２４ａに入射される。ダイクロイックミラー１２４ａはＣＦＰ蛍光１１５ａを反射、分離し、以下同様に、ダイクロイックミラー１２４ｂはＹＦＰ蛍光１１５ｂを、ダイクロイックミラー１２４ｃはＳＮＡＲＦ−１の蛍光１１５ｃを順番に反射、分離し、最後に、ＳＮＡＲＦ−１の蛍光１１５ｄを透過、分離させる特性をそれぞれ有している。そして、これら蛍光１１５ａ，１１５ｂ，１１５ｃ，１１５ｄは、それぞれ共焦点レンズ１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ、ピンホール１２１ａ，１２１ｂ，１２１ｃ，１２１ｄを介して、フォトマルチプライヤ１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，１２２ｄに入射され、光電変換される。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、このような複雑な特性を有するダイクロイックミラー１０７は、非常に製作が困難で、高価になり得る。また、ＹＦＰ蛍光の波長５３０ｎｍ近傍で、蛍光が相当量カットされてしまうという不具合があり、現実的ではない。
【００１４】
したがって、多重染色、特に、１波長励起２波長蛍光および／もしくはエナジートランスファーをいくつか組み合わせて行なおうとすると、複数のレーザ光源を必要とするので、複数のレーザビームと、これらレーザビームの数よりもさらに多くの蛍光とを分離させる必要がある。また、従来の１光子励起現象による共焦点レーザ走査型顕微鏡で行なおうとすると、近接するいくつものレーザビームの波長および蛍光の波長を分離させる波長分離ミラーの設計が困難で高価になる。そして、検出すべき蛍光の多くが波長分離ミラーによってカットされてしまい、明るい観察および精度の高い測定が困難であるという問題があった。
【００１５】
また、特開２０００−３３００２９号公報の技術では、出射されるレーザビームおよび波長分離ミラーなどを切り替えて蛍光を検出しなければならないので、生体細胞組織の複数の形態および機能をリアルタイムで観測および測定することが困難であるという問題があった。
【００１６】
本発明は、このような課題を解決するためになされ、生体細胞組織（標本）からの複数の光を同時に検出することが可能で、標本の複数の形態および機能をリアルタイムで観察および測定することが可能となる、特に、多重染色標本から発せられるそれぞれ異なる波長を有する複数の蛍光を同時に効率よく検出することができるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明の、互いに異なる波長の蛍光を発する複数種類の蛍光色素で染色された多重染色標本の蛍光観察を行なうレーザ顕微鏡は、それぞれ標本上で、前記複数の蛍光色素のうちの第１の蛍光色素に線形現象を発生させるのに用いる少なくとも１つのレーザ光源と、前記第１の蛍光色素とは異なる第２の蛍光色素に非線形現象を発生させるのに用いる少なくとも１つの短パルスレーザ光源とから出射されるレーザビームを合成させるレーザビーム合成光学系と、前記レーザビーム合成光学系で合成されたレーザビームを２次元的に走査させる走査光学系と、この走査光学系により走査されたレーザビームを標本上に集光させるとともに、この標本からの光が入射される対物レンズと、前記レーザビーム合成光学系と前記走査光学系との間の光軸上に配設され、合成された前記線形現象用と非線形現象用の各レーザビームから、前記レーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの線形現象による蛍光を波長に基づいて選択的に分離させる第１の波長分離ミラーと、この第１の波長分離ミラーで分離された前記第１の蛍光色素からの蛍光を検出する第１の光検出器と、前記対物レンズと前記走査光学系との間の光軸上に配設され、前記レーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの線形現象による蛍光および合成された前記線形現象用と非線形現象用の各レーザビームから、前記短パルスレーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの非線形現象による蛍光を波長に基づいて選択的に分離させる第２の波長分離ミラーと、この第２の波長分離ミラーで分離された前記第２の蛍光色素からの蛍光を検出する第２の光検出器とを備えていることを特徴とするものである。
【００２０】
このような構成にすることにより、レーザ光源から出射されたレーザビームにより標本から発生した線形現象による蛍光を第１の光検出器で共焦点検出すると同時に、超短パルスレーザ光源から出射されたレーザビームにより標本から発生した非線形現象による蛍光を第２の光検出器で検出することが可能となる。
【００２１】
また、上記課題を解決するために、前記第１の波長分離ミラーと前記第１の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第１の波長分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長の光に分離させる少なくとも１つの第３の波長分離ミラーと、前記第３の波長分離ミラーで分離された光を検出する第３の光検出器とをさらに備えていることが好ましい。
【００２２】
また、上記課題を解決するために、前記第２の波長分離ミラーと前記第２の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第２の波長分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長の光に分離させる少なくとも１つの第４の波長分離ミラーと、前記第４の波長分離ミラーで分離された光を検出する第４の光検出器とをさらに備えていることが好ましい。
【００２３】
このような構成にすることにより、レーザビームにより励起された線形現象と非線形現象により標本から発生した、異なる２つ以上の波長を有する蛍光を検出することが可能となり、複数のレシオ測定を同時に行なうことができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００２５】
本実施の形態では、非線形現象、例えば２光子励起現象を利用している。この２光子励起現象は、一般に、後述の線形現象と比較して、やや高出力の長波長光で標本を励起して、この標本から前記長波長光よりも波長の短い蛍光が放出されるものである。これに対し、線形現象、例えば、１光子励起現象は、短波長光で標本を励起して、この標本から前記短波長光よりも波長の長い蛍光が放出されるものである。
【００２６】
（第１の実施の形態）
まず、第１の実施の形態について図１を用いて説明する。
本実施の形態によるレーザ顕微鏡は、パルス幅が数十ｆｓないし数百ｆｓ、繰り返し周波数が数十ＭＨｚないし数百ＭＨｚのチタンサファイアレーザーが一般に使用される、標本１４上で２光子励起現象を発生させる、極短パルスレーザ等の短パルスレーザ光源（レーザ出射手段）２を備えている。このレーザ光源２から出射されたレーザビーム４は、予め偏光性を備えていてもよく、出射された後に図示しない光学系によって偏光性が付与されてもよい。この偏光性を有するレーザビーム４の光路上には、偏光ビームスプリッタからなる第１のビームスプリッタ２８がこの光路に対して好ましくは４５°傾けられて配設されている。なお、この第１のビームスプリッタ２８は、レーザ光源２から出射され、所定の偏光性を有するレーザビーム４を所定の方向に反射させる特性を備えている。この反射されたレーザビーム４は、第１のビームスプリッタ２８によって直角に反射される。
【００２７】
このビーム４の光路上には、１／４波長板２９が設けられ、この波長板２９に入射されたビーム４は円偏光とされて、レーザビーム（以下、ビームという）６を出射させる。この出射されたビーム６の光路上には、ガルバノミラー８が設けられている。このガルバノミラー８は、入射されたビーム６を図示しない２次元（Ｘ−Ｙ）的に偏向走査して所定の方向に反射させる。
【００２８】
反射されたビーム６の光路上には、投影レンズ９、ミラー１０、および結像レンズ１２が順次設けられ、ビーム６がこの投影レンズ９に入射されて透過し、ミラー１０で反射され、結像レンズ１２に入射される。この結像レンズ１２を出射されたビーム６の光路上には、ダイクロイックミラーからなる第２のビームスプリッタ１１がこの光路に対して好ましくは４５°傾けられて設けられている。この第２のビームスプリッタ１１に入射されたビーム６は、この第２のビームスプリッタ１１を透過する。なお、この第２のビームスプリッタ１１の特性については後述する。
【００２９】
そして、この第２のビームスプリッタを出射されたビーム６の光路上には、対物レンズ１３が設けられている。この対物レンズ１３の前方には、生体組織（以下、標本という）１４が設けられ、この標本１４上で対物レンズ１３を出射されたビーム６が焦点を結ぶようになっている。
したがって、標本１４上にビーム６が集光、照射されて、この標本１４から反射される反射光３０と、２光子励起現象（非線形現象）が生じることによる蛍光１６とが発生される。
【００３０】
反射光３０と蛍光１６とは、対物レンズ１３を介して第２のビームスプリッタ（ダイクロイックミラー）１１に入射される。なお、このダイクロイックミラー１１は、レーザビーム４およびその反射光３０を透過させ、２光子励起現象により発せられた蛍光１６を反射させる特性を備えている。このため、この蛍光１６のみ、第２のビームスプリッタ１１でほぼ直角に反射されて、反射光３０から分離される。
【００３１】
反射された蛍光１６の光路上には、レンズ１７が設けられている。このレンズ１７の前方には、フォトマルチプライヤからなる第２の光検出器１８が配設されている。このレンズ１７を透過した蛍光１６は、第２の光検出器１８に入射されて、光電変換される。
【００３２】
一方、反射光３０は、第２のビームスプリッタ１１を透過し、結像レンズ１２、ミラー１０、投影レンズ９、ガルバノミラー８を経て、再び１／４波長板２９に入射される。前記標本１４から円偏光の状態で反射された反射光３０は、１／４波長板２９によって前記レーザビーム４に対して偏光方向が９０°ずれた直線偏光にされる。このため、第１のビームスプリッタ（偏光ビームスプリッタ）２８に再び入射され、透過される。
【００３３】
この反射光３０の光路上には、この反射光３０を所定の方向に反射させるミラー１９が設けられ、反射光３０が反射される。この反射光３０の光路上には、反射光３０を集光させるレンズ２０およびピンホール２１が順に配置されている。反射光３０は、レンズ２０によってピンホール２１に集光される。なお、このピンホール２１は、前記対物レンズ１３の焦点位置と共役な位置に配置され、反射光３０は、ピンホール２１面に結像し、焦点位置で反射された光のみがピンホール２１を通過される。
このピンホール２１を通過した反射光３０の光路上には、フォトマルチプライヤからなる第１の光検出器２２が配設されている。反射光３０は、第１の光検出器２２に入射されて、光電変換される。
【００３４】
それぞれ光電変換された２光子励起現象により発生された蛍光１６および反射光３０から得られる電気信号は、図示しないコンピュータで処理され、データとして処理および／もしくは画像として構築される。
【００３５】
したがって、本実施の形態によれば、共焦点反射光像と、２光子励起現象により発生された蛍光像とを同時に得ることができる。
【００３６】
（第２の実施の形態）
次に、第２の実施の形態について図２および図３を用いて説明する。以下、同様な作用および機能を有する部材には、第１の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略する。
レーザ顕微鏡は、それぞれ標本１４上で、１光子励起現象を発生させるレーザ光源１と、２光子励起現象を発生させる、極短パルスレーザ等の短パルスレーザ光源２とを備えている。これらレーザ光源１，２の前方には、それぞれのレーザ光源１，２から出射されるレーザビーム３，４の光路に対して傾けられ、これらレーザビーム３，４を合成する機能を有するダイクロイックミラー５（レーザビーム合成光学系）が配設されている。このダイクロイックミラー５は、１光子励起現象を発生させるレーザ光源１から出射されたレーザビーム３を所定の方向に反射させ、２光子励起現象を発生させる短パルスレーザ光源２から出射されたレーザビーム４を透過させる。このため、このダイクロイックミラー５に入射されたレーザビーム３，４は合成され、１つの合成されたレーザビーム（以下、ビームという）６にされる。
【００３７】
このビーム６の光路上には、ダイクロイックミラーからなる第１の波長分離ミラー７がこのビーム６に対して好ましくは４５°傾けられて配設されている。この第１の波長分離ミラー７の特性については後述する。そして、入射されたビーム６は、直角に偏向される。また、このビーム６は、ガルバノミラー８によって２次元に走査され、投影レンズ９に入射される。また、この投影レンズ９によってミラー１０に入射されて所定の方向に反射される。反射されたビーム６の光路上には、結像レンズ１２、およびダイクロイックミラーからなる第２の波長分離ミラー１１が順次設けられている。この第２の波長分離ミラー１１の特性については後述する。入射されたビーム６は、この第２の波長分離ミラー１１を透過し、対物レンズ１３によって標本１４上で焦点を結ぶようになっている。
【００３８】
標本１４上では、１光子励起現象を発生させるレーザビーム３で発せられた蛍光（以下、１光子励起蛍光と称する）１５（線形現象）と、２光子励起現象を発生させるレーザビーム４で発せられた蛍光（以下、２光子励起蛍光と称する）１６（非線形現象）とが発生される。このとき、図３の（ａ）に示すように、１光子励起蛍光１５は、レーザビーム３が通過（透過）した領域全体から発生されるのに対し、２光子励起蛍光１６は、図３の（ｂ）に示すように、レーザビーム４の対物レンズ１３の焦点位置のみから発生される。したがって、２光子励起蛍光１６は、光軸方向（Ｚ方向）の分解能を備えている。
【００３９】
また、図２に示すように、１光子励起蛍光１５と２光子励起蛍光１６とは、対物レンズ１３を介して第２の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）１１に入射される。
【００４０】
このダイクロイックミラー１１は、前記レーザビーム３，４（ビーム６）、および１光子励起蛍光１５を透過させ、２光子励起蛍光１６を反射させる特性を備えている。このため、２光子励起蛍光１６のみ、第２の波長分離ミラー１１によって反射（偏向）されて、１光子励起蛍光１５から分離される。
偏向された２光子励起蛍光１６は、レンズ１７によって第２の光検出器１８に入射され、光電変換される。なお、２光子励起現象（多光子励起現象）は、対物レンズの焦点位置のみで発生されるので、検出側にピンホールを配置しなくても共焦点と同等の光軸方向の分解能を得ることができる。したがって、２光子励起蛍光１６を検出するには、その発生時点でＺ方向の分解能を備えているので、共焦点ピンホールは不要である。
【００４１】
一方、１光子励起蛍光１５は、第２の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）１１を透過し、結像レンズ１２、ミラー１０、投影レンズ９、ガルバノミラー８を順次介して第１の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）７に入射される。
【００４２】
この第１の波長分離ミラー７は、前記レーザビーム３，４（ビーム６）を反射させ、１光子励起蛍光１５を透過させる特性を備えている。このため、１光子励起蛍光１５は、第１の波長分離ミラー７を透過した後、ミラー１９で偏向され、レンズ２０に入射される。なお、１光子励起蛍光１５は、Ｚ方向の分解能を備えていないため、対物レンズ１３の焦点位置と共役な位置に共焦点ピンホール２１が配置されている。１光子励起蛍光１５は、レンズ２０によってピンホール２１面に結像され、対物レンズ１３の焦点位置から発生した蛍光のみがピンホール２１を通過して、第１の光検出器２２に入射されて光電変換される。
それぞれ光電変換された１光子励起蛍光１５および２光子励起蛍光１６の信号は、図示しないコンピュータで処理されて、データとして処理および／もしくは画像として構築される。
【００４３】
したがって、本実施の形態によれば、１光子励起現象による共焦点蛍光像と、２光子励起現象による２光子励起蛍光像とを同時に得ることができる。
【００４４】
なお、本実施の形態において、線形現象は、１光子励起蛍光１５に限ることはなく、標本からの光が、入射されたレーザビームの出力にほぼ正比例して増加するものであれば、構わない。また、非線形現象は、２光子励起された蛍光１６に限ることはなく、３光子励起された蛍光、ラマン光、第２高調波、第３高調波などでも構わない。
【００４５】
（第３の実施の形態）
次に、第３の実施の形態について図４を用いて説明する。以下、同様な作用および機能を有する部材には、第１および第２の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略する。
レーザ顕微鏡は、それぞれ標本１４上で、１光子励起現象を発生させる２つのレーザ光源１ａ，１ｂと、２光子励起現象を発生させる、極短パルスレーザ等の短パルスレーザ光源２とを備えている。
レーザ光源１ｂから出射されるレーザビーム３ｂの光路上には、ミラー２３ａが設けられている。このミラー２３ａは、入射されたレーザビーム３ｂを所定の方向に反射させる。
【００４６】
そして、これらレーザビーム３ａ，３ｂの光路上には、それぞれレーザビーム３ａ，３ｂの光路に対して傾けられ、これらレーザビーム３ａ，３ｂを合成する機能を有するダイクロイックミラー２３が配設されている。このダイクロイックミラー２３は、レーザビーム３ａを透過させ、レーザビーム３ｂを所定の方向に反射させるようになっている。このため、このダイクロイックミラー２３に入射されたレーザビーム３ａ，３ｂは、１つの合成されたレーザビーム３にされる。
【００４７】
また、短パルスレーザ光源２から出射されたレーザビーム４と、レーザビーム３との光路上には、これらレーザビーム３，４を合成させる機能を有するダイクロイックミラー５が配設されている。このダイクロイックミラー５は、レーザビーム３を所定の方向に反射させ、レーザビーム４を透過させて、これらレーザビーム３，４を合成させる。この合成されたレーザビーム６は、第１の波長分離ミラー７、ガルバノミラー８、投影レンズ９、ミラー１０、結像レンズ１２、第２の波長分離ミラー１１、および対物レンズ１３を順に介して標本１４上に集光、照射される。
【００４８】
この標本１４からは、１光子励起現象を発生させるレーザビーム３ａ，３ｂで発せられた蛍光１５ａ，１５ｂ（以下、１光子励起蛍光と称する）と、２光子励起現象を発生させるレーザビーム４で発せられた蛍光（以下、２光子励起蛍光と称する）１６とが発生される。
これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂおよび２光子励起蛍光１６は、対物レンズ１３を介して第２の波長分離ミラー１１に入射される。
【００４９】
この第２の波長分離ミラー１１により偏向された２光子励起蛍光１６は、第２の実施の形態と同様に、レンズ１７によって第２の光検出器１８で検出される。
【００５０】
一方、１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、第２の波長分離ミラー１１を透過し、さらに、結像レンズ１２、ミラー１０、投影レンズ９、ミラー８を介して第１の波長分離ミラー７に入射される。
【００５１】
この第１の波長分離ミラー７は、前記レーザビーム６を反射させ、これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂを透過させる特性を備えている。このため、１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、第１の波長分離ミラー７を透過した後、ミラー１９で偏向される。これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂの光路上には、ダイクロイックミラーからなる第３の波長分離ミラー２４が所定の角度傾けられて設けられている。この第３の波長分離ミラー２４は、蛍光１５ａの波長と蛍光１５ｂの波長とを互いに分離させる特性を備えている。すなわち、蛍光１５ａを透過し、蛍光１５ｂを反射する特性を備えている。このため、互いに分離された蛍光１５ａ，１５ｂは、それぞれレンズ２０ａ，２０ｂ、共焦点ピンホール２１ａ，２１ｂを介してフォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂに入射され、光電変換される。
【００５２】
（第４の実施の形態）
次に、第４の実施の形態について図５および図６を用いて説明する。以下、同様な作用および機能を有する部材には、第１ないし第３の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略する。
標本１４は、１波長励起２波長蛍光の試薬Ａ，Ｂで２重染色されている。試薬Ａの励起波長に近い発振波長を有するレーザ光源１と、試薬Ｂの励起波長の２倍近くの発振波長を有する短パルスレーザ光源２とから、それぞれレーザビーム３とレーザビーム４とが出射され、第２および第３の実施の形態と同様に合成されたレーザビーム６が標本１４上に集光、照射される。
【００５３】
標本１４からは、１光子励起現象を発生させるレーザビーム３で試薬Ａが発せられた１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂが発生され、２光子励起現象を発生させるレーザビーム４で試薬Ｂが発せられた２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂが発生される。
【００５４】
前記第２の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）１１は、レーザビーム３，４および１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂを透過させ、２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂを反射させる特性を備えている。分離偏向された蛍光１６ａ，１６ｂは、レンズ１７に入射される。このレンズ１７を出射された２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂの前方には、ダイクロイックミラーからなる第４の波長分離ミラー２５が所定の角度傾けられて設けられている。この第４の波長分離ミラー２５は、蛍光１６ａと蛍光１６ｂとを互いに分離させる特性を備えている。すなわち、蛍光１６ａを透過させ、蛍光１６ｂを反射させる特性を備えている。互いに分離された２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂの光路上には、それぞれバンドパスフィルタ２６ａ，２６ｂが配設されている。これら２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂは、それぞれバンドパスフィルタ２６ａ，２６ｂによってこれら蛍光１６ａ，１６ｂの波長成分のみを透過させて、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂで検出され、光電変換される。
【００５５】
一方、第２の波長分離ミラーを透過した１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、第３の実施の形態と同様に、第３の波長分離ミラー２４に入射される。この蛍光１５ａは、このミラー２４を透過し、蛍光１５ｂは、反射される。これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、レンズ２０ａ，２０ｂ、共焦点ピンホール２１ａ，２１ｂに順次入射される。
【００５６】
そして、これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂの光路上には、それぞれバンドパスフィルタ２７ａ，２７ｂが配置されている。１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、それぞれバンドパスフィルタ２７ａ，２７ｂによって１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂの波長成分のみが透過して、フォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで検出され、光電変換される。
【００５７】
本実施の形態では、測定精度を向上させるため、１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂ、および２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂがフォトマルチプライヤに入射される直前に前記バンドパスフィルタ２６ａ，２６ｂ，２７ａ，２７ｂを設けて、ノイズ成分をカットし、それぞれの蛍光の波長成分のみを検出できるようにしている。
【００５８】
そして、例えば、１波長励起２波長蛍光の試薬には、カルシウムイオン濃度測定用試薬として知られているＩｎｄｏ−１と、ｐＨ測定用試薬として知られているＳＮＡＲＦ−１とがあり、これらによって標本１４が多重染色されている。なお、Ｉｎｄｏ−１が励起される波長の励起極大は３５０ｎｍであり、励起により発せられる蛍光の波長の蛍光極大は、４８０ｎｍ，４０５ｎｍである。ＳＮＡＲＦ−１が励起される波長の励起極大は５３０ｎｍであり、励起により発せられる蛍光の波長の蛍光極大は、６３０ｎｍ，５８０ｎｍである。
【００５９】
以下、ＳＮＡＲＦ−１をＧｒｅｅｎ Ｈｅ：Ｎｅレーザから波長５４３ｎｍのレーザビームを出射させて励起して、発せられた蛍光を共焦点ピンホールを介してフォトマルチプライヤで検出し、Ｉｎｄｏ−１をＴｉ：Ｓａレーザから波長７００ｎｍの超短パルスレーザビームを出射させて２光子励起現象を発生させて、発せられた蛍光をフォトマルチプライヤで検出する場合について記載する。
【００６０】
第１ないし第４の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）７，１１，２４，２５の特性は、それぞれ図６の（ａ）ないし（ｄ）に示すように構成されている。ここで、図６の（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれ縦軸がレーザビームおよび蛍光の透過率、横軸がこれらの波長を表している。このため、まず、第１の波長分離ミラー７は、図６の（ａ）に示すように、それぞれのレーザビーム３，４の波長５４３ｎｍ，７００ｎｍを反射させる（透過させない）特性を有し、これらレーザビーム３，４を反射させる。また、第２の波長分離ミラー１１は、図６の（ｂ）に示すように、それぞれのレーザビーム３，４の波長５４３ｎｍ，７００ｎｍを透過させる特性を有し、これらレーザビーム３，４を透過させる。
【００６１】
多重染色標本１４から発生された蛍光１５ａ，１５ｂ，１６ａ，１６ｂは、それぞれ６３０ｎｍ，５８０ｎｍ，４８０ｎｍ，４０５ｎｍの波長を有する。このため、第２の波長分離ミラーは、図６の（ｂ）に示すように、それぞれ６３０ｎｍ，５８０ｎｍの波長を有する蛍光１５ａ，１５ｂを透過させ、４８０ｎｍ，４０５ｎｍの波長を有する蛍光１６ａ，１６ｂを反射させるような特性を有する。
また、第４の波長分離ミラー２５は、図６の（ｄ）に示すように、４８０ｎｍの波長を有する蛍光１６ａを透過させ、４０５ｎｍの波長を有する蛍光１６ｂを反射させる特性を有する。
また、第１の波長分離ミラー７は、図６の（ａ）に示すように、それぞれ６３０ｎｍ，５８０ｎｍの波長を有する蛍光１５ａ，１５ｂを透過させる特性を有する。そして、第３の波長分離ミラー２４は、図６の（ｃ）に示すように、６３０ｎｍの波長を有する蛍光１５ａを透過させ、５８０ｎｍの波長を有する蛍光１５ｂを反射させる特性を有する。
【００６２】
したがって、それぞれフォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂでＳＮＡＲＦ−１からの蛍光１５ａ，１５ｂを、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂでＩｎｄｏ−１からの蛍光１６ａ，１６ｂを検出することができる。そして、図示しないコンピュータでそれぞれフォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで検出される蛍光量のレシオと、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂで検出される蛍光量のレシオとを求めて、生体組織細胞の標本１４のカルシウム濃度変化とｐＨ変化とを同時に測定することができる。
【００６３】
（第５の実施の形態）
次に、第５の実施の形態について図７を用いて説明する。本実施の形態は、第４の実施の形態の変形例である。
本実施の形態では、カメレオン（商標）というプローブを用いてカルシウムイオン濃度を測定するとともに、ＳＮＡＲＦ−１によりｐＨ測定を同時に行なう場合について説明する。
まず、カメレオンを用いたカルシウムイオン濃度測定法について説明する。これは、２つの蛍光タンパク質であるＣＦＰ蛍光およびＹＦＰ蛍光のエナジートランスファーを利用するものである。例えば、波長４４２ｎｍのビームでＣＦＰ蛍光を励起し、励起されたＣＦＰ蛍光のエネルギでＹＦＰ蛍光を励起させる手法で、ＣＦＰ蛍光の波長４８５ｎｍ、およびＹＦＰ蛍光の波長５３０ｎｍの蛍光量のレシオを測定するものである。
【００６４】
カメレオンを励起させる場合、波長４４２ｎｍのＨｅ：Ｃｄレーザを用い、共焦点ピンホールを用いてフォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで光電変換する。また、ＳＮＡＲＦ−１を励起させる場合、波長１０００ｎｍのＴｉ：Ｓａレーザを用い、２光子励起現象により発せられた蛍光をフォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂで光電変換して行なう。
【００６５】
なお、第１ないし第４の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）７，１１，２４，２５の特性は、それぞれ図７の（ａ）ないし（ｄ）に示すように構成されている。ここで、図７の（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれ縦軸がレーザビームおよび蛍光の透過率、横軸がこれらの波長を表している。このため、まず、第１の波長分離ミラー７は、図７の（ａ）に示すように、それぞれ波長４４２ｎｍ，１０００ｎｍを反射させる（透過させない）特性を有し、これらレーザビーム３，４を反射させる。また、第２の波長分離ミラー１１は、図７の（ｂ）に示すように、それぞれ波長４４２ｎｍ，１０００ｎｍを透過させる特性を有し、これらレーザビーム３，４を透過させる。
【００６６】
多重染色標本１４から発生された蛍光１５ａ，１５ｂ，１６ａ，１６ｂは、それぞれ５３０ｎｍ，４８５ｎｍ，５８０ｎｍ，６３０ｎｍの波長を有する。このため、第２の波長分離ミラーは、図７の（ｂ）に示すように、蛍光１５ａ，１５ｂを透過させ、蛍光１６ａ，１６ｂを反射させる特性を有する。
第４の波長分離ミラー２５は、図７の（ｄ）に示すように、蛍光１６ａを透過させ、蛍光１６ｂを反射させる特性を有する。
また、第１の波長分離ミラー７は、図７の（ａ）に示すように、蛍光１５ａ，１５ｂの波長を透過させる特性を有する。そして、第３の波長分離ミラー２４は、図７の（ｃ）に示すように、蛍光１５ａを透過させ、蛍光１５ｂを反射させる特性を有する。
【００６７】
したがって、フォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで、励起されたＣＦＰ蛍光１５ｂを検出することができるとともに、このＣＦＰ蛍光のエネルギを利用して励起されたＹＦＰ蛍光１５ａを検出することができる。また、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂで、ＳＮＡＲＦ−１による蛍光を検出することができる。そして、図示しないコンピュータでこれら蛍光量のレシオをそれぞれ求めて、生体組織細胞の標本１４のカルシウム濃度変化とｐＨ変化とを同時に測定することができる。
【００６８】
（第６の実施の形態）
次に、第６の実施の形態について図８を用いて説明する。以下、同様な作用および機能を有する部材には、第１ないし第５の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略する。
本実施の形態は、第１ないし第４の実施の形態の変形例である。第３の実施の形態のように、標本１４上で１光子励起現象を発生させる複数（ここでは、３つ）のレーザ光源１ａ，１ｂ，１ｃが配設されている。それぞれのレーザ光源１ａ，１ｂ，１ｃから出射されるレーザビーム３ａ，３ｂ，３ｃを合成し、合成されたレーザビーム３にするために、ミラー２３が設けられている。
【００６９】
また、標本１４上で、２光子励起現象を発生させる複数（ここでは、２つ）の短パルスレーザ光源２ａ，２ｂが配設されている。それぞれの短パルスレーザ光源２ａ，２ｂから出射されるレーザビーム４ａ，４ｂを合成し、合成されたレーザビーム４にするために、ミラー３２が設けられている。
【００７０】
また、第４の波長分離ミラー２５で分離された蛍光１６ｂの光路上には、ダイクロイックミラー２５ａが配設され、蛍光１６をさらに分離させるようになっている。このミラー２５を透過もしくは反射されたビームの光路上には、それぞれバンドパスフィルタとフォトマルチプライヤとが順次配設されている。
【００７１】
また、第３の波長分離ミラー２４のさらに前方に複数（ここでは、３つ）のミラー２４ａ，２４ｂ，２４ｃが配置されている。２つのミラー２４ａ，２４ｂは、ダイクロイックミラーからなり、ミラー２４ｃは、反射ミラーからなる。
【００７２】
そして、これらミラー２４ａ，２４ｂ，２４ｃで反射されたビームの光路上には、共焦点ピンホールと、バンドパスフィルタと、フォトマルチプライヤとがそれぞれ順次配設されている。
【００７３】
本実施の形態では、それぞれ標本上で、１光子励起現象を発生させるレーザ光源１を３つ、２光子励起現象を発生させる短パルスレーザ光源２を２つ設けたが、これらの数に限らず、ダイクロイックミラーの特性を変えれば、組み合わせも自由に変化され得る。
【００７４】
なお、第１ないし第６の実施の形態においては、短パルスレーザ光源から出射されるレーザビームによって標本から発せられるのは、２光子励起現象により発生される蛍光に限らず、例えば、３光子励起現象、４光子励起現象などの多光子励起現象により発生される蛍光、さらには、ラマン光、第２高調波、第３高調波などもあり得、これら蛍光、ラマン光、第２高調波、第３高調波なども同様に検出することができる。このため、標本で非線形現象を生じさせ、この現象により発生される光であれば、同様に、検出することができる。
また、各ダイクロイックミラーの特性において、波長による透過と反射との関係は、互いに反対であっても構わない。また、共焦点検出部分は、ダイクロイックミラーで互いに異なる波長に分離する前にレンズとピンホールとを配置する構成でも構わない。さらに、走査光学系は、ガルバノミラーに限らず、レーザビームを２次元的に走査できるものであれば、他の方式でも構わない。
【００７５】
これまで、いくつかの実施の形態について図面を参照しながら具体的に説明したが、本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。
【００７６】
上記説明によれば、下記の事項の発明が得られる。また、各項の組み合わせも可能である。
【００７７】
［付記］
１．少なくとも１つのレーザ光源と、
前記レーザ光源から出射されたレーザビームを２次元に走査させる走査光学系と、
この走査光学系により走査されたレーザビームを標本上に集光、照射させるとともに、線形現象および非線形現象により、この標本から得られる（発せられる）光を入射させる対物レンズと、
前記標本から得られる光を選択的に分離させる第１のビームスプリッタと、
この第１のビームスプリッタで分離された光を検出する第１の光検出器と、
を具備したレーザ顕微鏡において、
前記対物レンズと第１のビームスプリッタとの間の光軸上に配設され、前記標本から得られる光から、前記標本にレーザビームが照射されて発せられた非線形現象による所定の光を分離させる第２のビームスプリッタと、
この第２のビームスプリッタで分離された光を検出する第２の光検出器とをさらに具備し、
前記第２のビームスプリッタは、前記レーザ光源から出射されたレーザビーム、および前記標本から得られる線形現象による光または反射光と、前記標本から得られる非線形現象による光とを分離させるように設定され、
前記第１のビームスプリッタは、前記レーザ光源から出射されたレーザビームと、前記標本からの線形現象による光または反射光とを分離させるように設定されたことを特徴とするレーザ顕微鏡。
【００７８】
２．少なくとも１つの１光子励起用のレーザ光源から出射されるレーザビームと、少なくとも１つの多光子励起用のパルスレーザ光源から出射されるレーザビームとを合成させるレーザビーム合成光学系と、
前記レーザビーム合成光学系で合成された複数のレーザビームを２次元に走査させる走査光学系と、
この走査光学系により走査されたレーザビームを標本上に集光、照射させるとともに、この標本から得られる光を入射させる対物レンズと、
前記レーザビーム合成光学系と前記走査光学系との間の光軸上に配設され、前記標本から得られる光を選択的に分離させる第１の波長分離ミラーと、
この第１の波長分離ミラーで分離された光を検出する第１の光検出器と、
を具備したレーザ顕微鏡において、
前記対物レンズと第１の波長分離ミラーとの間の光軸上に配設され、前記標本から得られる光から、前記標本にレーザビームが照射されて発せられた所定の光を分離させる第２の波長分離ミラーと、
この第２の波長分離ミラーで分離された光を検出する第２の光検出器とをさらに具備し、
前記第２の波長分離ミラーは、合成された前記レーザビーム、および前記１光子励起用のレーザから出射されたレーザビームによって前記標本から得られる所定の光と、前記多光子励起用のレーザから出射されたレーザビームによって前記標本から得られる所定の光とを分離させるように設定され、
前記第１の波長分離ミラーは、合成された前記レーザビームと、前記１光子励起用のレーザから出射されたレーザビームによって前記標本から得られる所定の光とを分離させるように設定されたことを特徴とするレーザ顕微鏡。
【００７９】
３．前記第１の波長分離ミラーと前記第１の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第１の波長分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長に分離させる少なくとも１つの第３の波長分離ミラーと、
前記第３の波長分離ミラーで分離された光を検出する第３の光検出器とをさらに具備したことを特徴とする付記項２に記載のレーザ顕微鏡。
【００８０】
４．前記第２の波長分離ミラーと前記第２の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第２の波長分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長に分離させる少なくとも１つの第４の波長分離ミラーと、
前記第４の波長分離ミラーで分離された光を検出する第４の光検出器とをさらに具備したことを特徴とする付記項２もしくは３に記載のレーザ顕微鏡。
【００８１】
この付記項４によって、１光子励起および／もしくは２光子励起での２波長蛍光検出が可能となり、複数のレシオ測定を同時に行なうことができる。
【００８２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、生体細胞組織（標本）からの複数の光を同時に検出することが可能で、標本の複数の形態および機能をリアルタイムで観察および測定することが可能となる、特に、多重染色標本から発せられるそれぞれ異なる波長を有する複数の蛍光を同時に効率よく検出することができるレーザ顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図２】第２の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図３】第２の実施の形態に係わり、（ａ）は蛍光の発生状態を説明するための概略図、（ｂ）は多光子励起現象により励起される蛍光の発生状態を説明するための概略図。
【図４】第３の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図５】第４の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図６】第４の実施の形態に係わり、（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれ図５に示す第１ないし第４の波長分離ミラーの波長透過率特性を表すグラフ。
【図７】第５の実施の形態に係わり、（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれ図５に示す第１ないし第４の波長分離ミラーの波長透過率特性を表すグラフ。
【図８】第６の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図９】従来技術に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図１０】従来技術に係わるダイクロイックミラーの特性を表すグラフ。
【符号の説明】
１，２…レーザ光源、３，４…レーザビーム、５…ダイクロイックミラー、６…レーザビーム、７…第１の波長分離ミラー、８…ガルバノミラー、１１…第２の波長分離ミラー、１３…対物レンズ、１４…標本、１５…蛍光、１６…蛍光、１８…第２の光検出器、２１…共焦点ピンホール、２２…第１の光検出器
【発明の属する技術分野】
本発明は、１つの波長を有するレーザビームもしくはそれぞれ波長の異なる複数のレーザビームを２次元的に走査させ、対物レンズを介してレーザビームを標本上で集光させて、この標本から得られる光を検出するレーザ顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
このような顕微鏡を用いて観察するためには、現在では様々な蛍光試薬で標本が染色されて行なわれている。このため、複数の蛍光試薬を用いて同一の生体細胞組織（標本）を多重染色し、波長の異なる複数のレーザビームを標本上に照射して、多重蛍光観察を行なうことによって、生体細胞組織の様々な形態や機能の解析が可能となっている。
【０００３】
また、単一の波長（以下、１波長という）の励起光（レーザビーム）を標本に照射して２つの異なる波長（以下、２波長という）の蛍光を発生させる、１波長励起２波長蛍光を発生させる試薬や、励起された蛍光色素のエネルギで別の蛍光色素を励起させるエナジートランスファー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）など、１波長の励起光に対して２波長の蛍光を測定して、これら蛍光の蛍光量のレシオを求める手法も行なわれている。
【０００４】
一方、近年では、超短パルスレーザにより出射されたレーザビームによる多光子励起現象を利用したレーザ顕微鏡が実用化されている。この多光子励起現象を発生させる超短パルスレーザにより標本を励起するには、近赤外波長で紫外光励起用の蛍光試薬を励起させて蛍光を発生させることができるので、標本への光障害が少なく、標本深部の観察ができるなどの利点がある。しかし、通常の共焦点光学系と同様の光学系を使って蛍光を検出するのは、幾つものレンズやミラーなどを経由させる必要があるために損失が大きく、検出光（蛍光）が非常に弱くなってしまうという欠点がある。
【０００５】
このため、特開２０００−３３００２９号公報による技術は、蛍光を走査光学系および共焦点ピンホールに戻さずに分離して、短い光路で損失を少なくし、効率的に検出する顕微鏡を提案したものである。
【０００６】
この技術による顕微鏡は、共焦点用のレーザ光源および光検出器と、多光子励起現象を発生させるレーザビームを出射させる超短パルスレーザ光源および光検出器とを備えているが、対物レンズと走査光学系との間に配置された波長分離ミラーは、共焦点検出用と多光子励起現象で発せられた蛍光の検出用とがそれぞれ別に用意され、この波長分離ミラーを切り替えて、共焦点を用いる場合と多光子励起現象により発せられた蛍光を検出する場合とで選択して光を検出している。
【０００７】
また、例えば、１波長励起２波長蛍光を発生させる試薬としては、ＳＮＡＲＦ−１として知られているものがあり、これはｐＨ測定用に用いられている。このＳＮＡＲＦ−１を励起させるレーザビームの波長は５３０ｎｍ、発生される蛍光の波長は５８０ｎｍ、６３０ｎｍである。また、近年、カメレオン（商標）というプローブを用いて２つの蛍光タンパク質であるＣＦＰ蛍光およびＹＦＰ蛍光のエナジートランスファーを利用するカルシウムイオン濃度測定が行なわれるようになってきている。これは、波長４４２ｎｍのレーザビームでＣＦＰ蛍光を励起させ、この励起されたＣＦＰ蛍光のエネルギでＹＦＰ蛍光を励起させる手法で、ＣＦＰ蛍光の波長４８５ｎｍ、およびＹＦＰ蛍光の波長５３０ｎｍから得られる蛍光量のレシオを測定するものである。
【０００８】
これらＳＮＡＲＦ−１およびカメレオンで標本を多重染色した場合に、この標本から発せられる複数の蛍光を検出するレーザ顕微鏡の光学系について図９を用いて説明する。
【０００９】
図９に示すように、レーザ光源１０１ａ，１０１ｂからそれぞれ出射されたレーザビーム１０３ａ，１０３ｂは、ダイクロイックミラー１２３によって合成される。この合成されたレーザビーム１０６は、波長分離ミラー１０７によって反射され、ガルバノミラー１０８によって２次元的に走査される。そして、このレーザビーム１０６は、投影レンズ１０９、反射ミラー１１０、結像レンズ１１２、対物レンズ１１３を介して標本１１４上に集光され、標本１１４が励起される。
【００１０】
このレーザビーム１０３ａによって励起された標本１１４からは、それぞれ異なる波長を有する蛍光１１５ａ，１１５ｂが発せられる。また、レーザビーム１０３ｂによって励起された標本１１４からは、同様に蛍光１１５ｃ，１１５ｄが発せられる。そして、これら蛍光１１５ａ，１１５ｂ，１１５ｃ，１１５ｄは、対物レンズ１１３、結像レンズ１１２などを順に遡って波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）１０７に入射される。
【００１１】
これら蛍光１１５ａ，１１５ｂがそれぞれＣＦＰ蛍光およびＹＦＰ蛍光であり、また、蛍光１１５ｃ，１１５ｄがそれぞれＳＮＡＲＦ−１の蛍光であるとすると、検出される蛍光は、図１０の１点鎖線および２点鎖線に示す特性が得られる。このため、図１０には、これらＣＦＰ蛍光１１５ａ、ＹＦＰ蛍光１１５ｂ、およびＳＮＡＲＦ−１の蛍光１１５ｃ，１１５ｄが透過され、レーザビーム１０３ａ，１０３ｂが反射されるのに必要なダイクロイックミラー１０７の特性が示されている。ここで、ＳＮＡＲＦ−１の励起レーザは、波長５４３ｎｍのＧｒｅｅｎ Ｈｅ：Ｎｅレーザとしている。
【００１２】
このため、これらＣＦＰ蛍光１１５ａ、ＹＦＰ蛍光１１５ｂ、およびＳＮＡＲＦ−１の蛍光１１５ｃ，１１５ｄは、このダイクロイックミラー１０７を透過して、ミラー１１９によって反射され、ダイクロイックミラー１２４ａに入射される。ダイクロイックミラー１２４ａはＣＦＰ蛍光１１５ａを反射、分離し、以下同様に、ダイクロイックミラー１２４ｂはＹＦＰ蛍光１１５ｂを、ダイクロイックミラー１２４ｃはＳＮＡＲＦ−１の蛍光１１５ｃを順番に反射、分離し、最後に、ＳＮＡＲＦ−１の蛍光１１５ｄを透過、分離させる特性をそれぞれ有している。そして、これら蛍光１１５ａ，１１５ｂ，１１５ｃ，１１５ｄは、それぞれ共焦点レンズ１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ，１２０ｄ、ピンホール１２１ａ，１２１ｂ，１２１ｃ，１２１ｄを介して、フォトマルチプライヤ１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ，１２２ｄに入射され、光電変換される。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、このような複雑な特性を有するダイクロイックミラー１０７は、非常に製作が困難で、高価になり得る。また、ＹＦＰ蛍光の波長５３０ｎｍ近傍で、蛍光が相当量カットされてしまうという不具合があり、現実的ではない。
【００１４】
したがって、多重染色、特に、１波長励起２波長蛍光および／もしくはエナジートランスファーをいくつか組み合わせて行なおうとすると、複数のレーザ光源を必要とするので、複数のレーザビームと、これらレーザビームの数よりもさらに多くの蛍光とを分離させる必要がある。また、従来の１光子励起現象による共焦点レーザ走査型顕微鏡で行なおうとすると、近接するいくつものレーザビームの波長および蛍光の波長を分離させる波長分離ミラーの設計が困難で高価になる。そして、検出すべき蛍光の多くが波長分離ミラーによってカットされてしまい、明るい観察および精度の高い測定が困難であるという問題があった。
【００１５】
また、特開２０００−３３００２９号公報の技術では、出射されるレーザビームおよび波長分離ミラーなどを切り替えて蛍光を検出しなければならないので、生体細胞組織の複数の形態および機能をリアルタイムで観測および測定することが困難であるという問題があった。
【００１６】
本発明は、このような課題を解決するためになされ、生体細胞組織（標本）からの複数の光を同時に検出することが可能で、標本の複数の形態および機能をリアルタイムで観察および測定することが可能となる、特に、多重染色標本から発せられるそれぞれ異なる波長を有する複数の蛍光を同時に効率よく検出することができるレーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明の、互いに異なる波長の蛍光を発する複数種類の蛍光色素で染色された多重染色標本の蛍光観察を行なうレーザ顕微鏡は、それぞれ標本上で、前記複数の蛍光色素のうちの第１の蛍光色素に線形現象を発生させるのに用いる少なくとも１つのレーザ光源と、前記第１の蛍光色素とは異なる第２の蛍光色素に非線形現象を発生させるのに用いる少なくとも１つの短パルスレーザ光源とから出射されるレーザビームを合成させるレーザビーム合成光学系と、前記レーザビーム合成光学系で合成されたレーザビームを２次元的に走査させる走査光学系と、この走査光学系により走査されたレーザビームを標本上に集光させるとともに、この標本からの光が入射される対物レンズと、前記レーザビーム合成光学系と前記走査光学系との間の光軸上に配設され、合成された前記線形現象用と非線形現象用の各レーザビームから、前記レーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの線形現象による蛍光を波長に基づいて選択的に分離させる第１の波長分離ミラーと、この第１の波長分離ミラーで分離された前記第１の蛍光色素からの蛍光を検出する第１の光検出器と、前記対物レンズと前記走査光学系との間の光軸上に配設され、前記レーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの線形現象による蛍光および合成された前記線形現象用と非線形現象用の各レーザビームから、前記短パルスレーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの非線形現象による蛍光を波長に基づいて選択的に分離させる第２の波長分離ミラーと、この第２の波長分離ミラーで分離された前記第２の蛍光色素からの蛍光を検出する第２の光検出器とを備えていることを特徴とするものである。
【００２０】
このような構成にすることにより、レーザ光源から出射されたレーザビームにより標本から発生した線形現象による蛍光を第１の光検出器で共焦点検出すると同時に、超短パルスレーザ光源から出射されたレーザビームにより標本から発生した非線形現象による蛍光を第２の光検出器で検出することが可能となる。
【００２１】
また、上記課題を解決するために、前記第１の波長分離ミラーと前記第１の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第１の波長分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長の光に分離させる少なくとも１つの第３の波長分離ミラーと、前記第３の波長分離ミラーで分離された光を検出する第３の光検出器とをさらに備えていることが好ましい。
【００２２】
また、上記課題を解決するために、前記第２の波長分離ミラーと前記第２の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第２の波長分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長の光に分離させる少なくとも１つの第４の波長分離ミラーと、前記第４の波長分離ミラーで分離された光を検出する第４の光検出器とをさらに備えていることが好ましい。
【００２３】
このような構成にすることにより、レーザビームにより励起された線形現象と非線形現象により標本から発生した、異なる２つ以上の波長を有する蛍光を検出することが可能となり、複数のレシオ測定を同時に行なうことができる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００２５】
本実施の形態では、非線形現象、例えば２光子励起現象を利用している。この２光子励起現象は、一般に、後述の線形現象と比較して、やや高出力の長波長光で標本を励起して、この標本から前記長波長光よりも波長の短い蛍光が放出されるものである。これに対し、線形現象、例えば、１光子励起現象は、短波長光で標本を励起して、この標本から前記短波長光よりも波長の長い蛍光が放出されるものである。
【００２６】
（第１の実施の形態）
まず、第１の実施の形態について図１を用いて説明する。
本実施の形態によるレーザ顕微鏡は、パルス幅が数十ｆｓないし数百ｆｓ、繰り返し周波数が数十ＭＨｚないし数百ＭＨｚのチタンサファイアレーザーが一般に使用される、標本１４上で２光子励起現象を発生させる、極短パルスレーザ等の短パルスレーザ光源（レーザ出射手段）２を備えている。このレーザ光源２から出射されたレーザビーム４は、予め偏光性を備えていてもよく、出射された後に図示しない光学系によって偏光性が付与されてもよい。この偏光性を有するレーザビーム４の光路上には、偏光ビームスプリッタからなる第１のビームスプリッタ２８がこの光路に対して好ましくは４５°傾けられて配設されている。なお、この第１のビームスプリッタ２８は、レーザ光源２から出射され、所定の偏光性を有するレーザビーム４を所定の方向に反射させる特性を備えている。この反射されたレーザビーム４は、第１のビームスプリッタ２８によって直角に反射される。
【００２７】
このビーム４の光路上には、１／４波長板２９が設けられ、この波長板２９に入射されたビーム４は円偏光とされて、レーザビーム（以下、ビームという）６を出射させる。この出射されたビーム６の光路上には、ガルバノミラー８が設けられている。このガルバノミラー８は、入射されたビーム６を図示しない２次元（Ｘ−Ｙ）的に偏向走査して所定の方向に反射させる。
【００２８】
反射されたビーム６の光路上には、投影レンズ９、ミラー１０、および結像レンズ１２が順次設けられ、ビーム６がこの投影レンズ９に入射されて透過し、ミラー１０で反射され、結像レンズ１２に入射される。この結像レンズ１２を出射されたビーム６の光路上には、ダイクロイックミラーからなる第２のビームスプリッタ１１がこの光路に対して好ましくは４５°傾けられて設けられている。この第２のビームスプリッタ１１に入射されたビーム６は、この第２のビームスプリッタ１１を透過する。なお、この第２のビームスプリッタ１１の特性については後述する。
【００２９】
そして、この第２のビームスプリッタを出射されたビーム６の光路上には、対物レンズ１３が設けられている。この対物レンズ１３の前方には、生体組織（以下、標本という）１４が設けられ、この標本１４上で対物レンズ１３を出射されたビーム６が焦点を結ぶようになっている。
したがって、標本１４上にビーム６が集光、照射されて、この標本１４から反射される反射光３０と、２光子励起現象（非線形現象）が生じることによる蛍光１６とが発生される。
【００３０】
反射光３０と蛍光１６とは、対物レンズ１３を介して第２のビームスプリッタ（ダイクロイックミラー）１１に入射される。なお、このダイクロイックミラー１１は、レーザビーム４およびその反射光３０を透過させ、２光子励起現象により発せられた蛍光１６を反射させる特性を備えている。このため、この蛍光１６のみ、第２のビームスプリッタ１１でほぼ直角に反射されて、反射光３０から分離される。
【００３１】
反射された蛍光１６の光路上には、レンズ１７が設けられている。このレンズ１７の前方には、フォトマルチプライヤからなる第２の光検出器１８が配設されている。このレンズ１７を透過した蛍光１６は、第２の光検出器１８に入射されて、光電変換される。
【００３２】
一方、反射光３０は、第２のビームスプリッタ１１を透過し、結像レンズ１２、ミラー１０、投影レンズ９、ガルバノミラー８を経て、再び１／４波長板２９に入射される。前記標本１４から円偏光の状態で反射された反射光３０は、１／４波長板２９によって前記レーザビーム４に対して偏光方向が９０°ずれた直線偏光にされる。このため、第１のビームスプリッタ（偏光ビームスプリッタ）２８に再び入射され、透過される。
【００３３】
この反射光３０の光路上には、この反射光３０を所定の方向に反射させるミラー１９が設けられ、反射光３０が反射される。この反射光３０の光路上には、反射光３０を集光させるレンズ２０およびピンホール２１が順に配置されている。反射光３０は、レンズ２０によってピンホール２１に集光される。なお、このピンホール２１は、前記対物レンズ１３の焦点位置と共役な位置に配置され、反射光３０は、ピンホール２１面に結像し、焦点位置で反射された光のみがピンホール２１を通過される。
このピンホール２１を通過した反射光３０の光路上には、フォトマルチプライヤからなる第１の光検出器２２が配設されている。反射光３０は、第１の光検出器２２に入射されて、光電変換される。
【００３４】
それぞれ光電変換された２光子励起現象により発生された蛍光１６および反射光３０から得られる電気信号は、図示しないコンピュータで処理され、データとして処理および／もしくは画像として構築される。
【００３５】
したがって、本実施の形態によれば、共焦点反射光像と、２光子励起現象により発生された蛍光像とを同時に得ることができる。
【００３６】
（第２の実施の形態）
次に、第２の実施の形態について図２および図３を用いて説明する。以下、同様な作用および機能を有する部材には、第１の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略する。
レーザ顕微鏡は、それぞれ標本１４上で、１光子励起現象を発生させるレーザ光源１と、２光子励起現象を発生させる、極短パルスレーザ等の短パルスレーザ光源２とを備えている。これらレーザ光源１，２の前方には、それぞれのレーザ光源１，２から出射されるレーザビーム３，４の光路に対して傾けられ、これらレーザビーム３，４を合成する機能を有するダイクロイックミラー５（レーザビーム合成光学系）が配設されている。このダイクロイックミラー５は、１光子励起現象を発生させるレーザ光源１から出射されたレーザビーム３を所定の方向に反射させ、２光子励起現象を発生させる短パルスレーザ光源２から出射されたレーザビーム４を透過させる。このため、このダイクロイックミラー５に入射されたレーザビーム３，４は合成され、１つの合成されたレーザビーム（以下、ビームという）６にされる。
【００３７】
このビーム６の光路上には、ダイクロイックミラーからなる第１の波長分離ミラー７がこのビーム６に対して好ましくは４５°傾けられて配設されている。この第１の波長分離ミラー７の特性については後述する。そして、入射されたビーム６は、直角に偏向される。また、このビーム６は、ガルバノミラー８によって２次元に走査され、投影レンズ９に入射される。また、この投影レンズ９によってミラー１０に入射されて所定の方向に反射される。反射されたビーム６の光路上には、結像レンズ１２、およびダイクロイックミラーからなる第２の波長分離ミラー１１が順次設けられている。この第２の波長分離ミラー１１の特性については後述する。入射されたビーム６は、この第２の波長分離ミラー１１を透過し、対物レンズ１３によって標本１４上で焦点を結ぶようになっている。
【００３８】
標本１４上では、１光子励起現象を発生させるレーザビーム３で発せられた蛍光（以下、１光子励起蛍光と称する）１５（線形現象）と、２光子励起現象を発生させるレーザビーム４で発せられた蛍光（以下、２光子励起蛍光と称する）１６（非線形現象）とが発生される。このとき、図３の（ａ）に示すように、１光子励起蛍光１５は、レーザビーム３が通過（透過）した領域全体から発生されるのに対し、２光子励起蛍光１６は、図３の（ｂ）に示すように、レーザビーム４の対物レンズ１３の焦点位置のみから発生される。したがって、２光子励起蛍光１６は、光軸方向（Ｚ方向）の分解能を備えている。
【００３９】
また、図２に示すように、１光子励起蛍光１５と２光子励起蛍光１６とは、対物レンズ１３を介して第２の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）１１に入射される。
【００４０】
このダイクロイックミラー１１は、前記レーザビーム３，４（ビーム６）、および１光子励起蛍光１５を透過させ、２光子励起蛍光１６を反射させる特性を備えている。このため、２光子励起蛍光１６のみ、第２の波長分離ミラー１１によって反射（偏向）されて、１光子励起蛍光１５から分離される。
偏向された２光子励起蛍光１６は、レンズ１７によって第２の光検出器１８に入射され、光電変換される。なお、２光子励起現象（多光子励起現象）は、対物レンズの焦点位置のみで発生されるので、検出側にピンホールを配置しなくても共焦点と同等の光軸方向の分解能を得ることができる。したがって、２光子励起蛍光１６を検出するには、その発生時点でＺ方向の分解能を備えているので、共焦点ピンホールは不要である。
【００４１】
一方、１光子励起蛍光１５は、第２の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）１１を透過し、結像レンズ１２、ミラー１０、投影レンズ９、ガルバノミラー８を順次介して第１の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）７に入射される。
【００４２】
この第１の波長分離ミラー７は、前記レーザビーム３，４（ビーム６）を反射させ、１光子励起蛍光１５を透過させる特性を備えている。このため、１光子励起蛍光１５は、第１の波長分離ミラー７を透過した後、ミラー１９で偏向され、レンズ２０に入射される。なお、１光子励起蛍光１５は、Ｚ方向の分解能を備えていないため、対物レンズ１３の焦点位置と共役な位置に共焦点ピンホール２１が配置されている。１光子励起蛍光１５は、レンズ２０によってピンホール２１面に結像され、対物レンズ１３の焦点位置から発生した蛍光のみがピンホール２１を通過して、第１の光検出器２２に入射されて光電変換される。
それぞれ光電変換された１光子励起蛍光１５および２光子励起蛍光１６の信号は、図示しないコンピュータで処理されて、データとして処理および／もしくは画像として構築される。
【００４３】
したがって、本実施の形態によれば、１光子励起現象による共焦点蛍光像と、２光子励起現象による２光子励起蛍光像とを同時に得ることができる。
【００４４】
なお、本実施の形態において、線形現象は、１光子励起蛍光１５に限ることはなく、標本からの光が、入射されたレーザビームの出力にほぼ正比例して増加するものであれば、構わない。また、非線形現象は、２光子励起された蛍光１６に限ることはなく、３光子励起された蛍光、ラマン光、第２高調波、第３高調波などでも構わない。
【００４５】
（第３の実施の形態）
次に、第３の実施の形態について図４を用いて説明する。以下、同様な作用および機能を有する部材には、第１および第２の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略する。
レーザ顕微鏡は、それぞれ標本１４上で、１光子励起現象を発生させる２つのレーザ光源１ａ，１ｂと、２光子励起現象を発生させる、極短パルスレーザ等の短パルスレーザ光源２とを備えている。
レーザ光源１ｂから出射されるレーザビーム３ｂの光路上には、ミラー２３ａが設けられている。このミラー２３ａは、入射されたレーザビーム３ｂを所定の方向に反射させる。
【００４６】
そして、これらレーザビーム３ａ，３ｂの光路上には、それぞれレーザビーム３ａ，３ｂの光路に対して傾けられ、これらレーザビーム３ａ，３ｂを合成する機能を有するダイクロイックミラー２３が配設されている。このダイクロイックミラー２３は、レーザビーム３ａを透過させ、レーザビーム３ｂを所定の方向に反射させるようになっている。このため、このダイクロイックミラー２３に入射されたレーザビーム３ａ，３ｂは、１つの合成されたレーザビーム３にされる。
【００４７】
また、短パルスレーザ光源２から出射されたレーザビーム４と、レーザビーム３との光路上には、これらレーザビーム３，４を合成させる機能を有するダイクロイックミラー５が配設されている。このダイクロイックミラー５は、レーザビーム３を所定の方向に反射させ、レーザビーム４を透過させて、これらレーザビーム３，４を合成させる。この合成されたレーザビーム６は、第１の波長分離ミラー７、ガルバノミラー８、投影レンズ９、ミラー１０、結像レンズ１２、第２の波長分離ミラー１１、および対物レンズ１３を順に介して標本１４上に集光、照射される。
【００４８】
この標本１４からは、１光子励起現象を発生させるレーザビーム３ａ，３ｂで発せられた蛍光１５ａ，１５ｂ（以下、１光子励起蛍光と称する）と、２光子励起現象を発生させるレーザビーム４で発せられた蛍光（以下、２光子励起蛍光と称する）１６とが発生される。
これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂおよび２光子励起蛍光１６は、対物レンズ１３を介して第２の波長分離ミラー１１に入射される。
【００４９】
この第２の波長分離ミラー１１により偏向された２光子励起蛍光１６は、第２の実施の形態と同様に、レンズ１７によって第２の光検出器１８で検出される。
【００５０】
一方、１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、第２の波長分離ミラー１１を透過し、さらに、結像レンズ１２、ミラー１０、投影レンズ９、ミラー８を介して第１の波長分離ミラー７に入射される。
【００５１】
この第１の波長分離ミラー７は、前記レーザビーム６を反射させ、これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂを透過させる特性を備えている。このため、１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、第１の波長分離ミラー７を透過した後、ミラー１９で偏向される。これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂの光路上には、ダイクロイックミラーからなる第３の波長分離ミラー２４が所定の角度傾けられて設けられている。この第３の波長分離ミラー２４は、蛍光１５ａの波長と蛍光１５ｂの波長とを互いに分離させる特性を備えている。すなわち、蛍光１５ａを透過し、蛍光１５ｂを反射する特性を備えている。このため、互いに分離された蛍光１５ａ，１５ｂは、それぞれレンズ２０ａ，２０ｂ、共焦点ピンホール２１ａ，２１ｂを介してフォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂに入射され、光電変換される。
【００５２】
（第４の実施の形態）
次に、第４の実施の形態について図５および図６を用いて説明する。以下、同様な作用および機能を有する部材には、第１ないし第３の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略する。
標本１４は、１波長励起２波長蛍光の試薬Ａ，Ｂで２重染色されている。試薬Ａの励起波長に近い発振波長を有するレーザ光源１と、試薬Ｂの励起波長の２倍近くの発振波長を有する短パルスレーザ光源２とから、それぞれレーザビーム３とレーザビーム４とが出射され、第２および第３の実施の形態と同様に合成されたレーザビーム６が標本１４上に集光、照射される。
【００５３】
標本１４からは、１光子励起現象を発生させるレーザビーム３で試薬Ａが発せられた１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂが発生され、２光子励起現象を発生させるレーザビーム４で試薬Ｂが発せられた２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂが発生される。
【００５４】
前記第２の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）１１は、レーザビーム３，４および１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂを透過させ、２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂを反射させる特性を備えている。分離偏向された蛍光１６ａ，１６ｂは、レンズ１７に入射される。このレンズ１７を出射された２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂの前方には、ダイクロイックミラーからなる第４の波長分離ミラー２５が所定の角度傾けられて設けられている。この第４の波長分離ミラー２５は、蛍光１６ａと蛍光１６ｂとを互いに分離させる特性を備えている。すなわち、蛍光１６ａを透過させ、蛍光１６ｂを反射させる特性を備えている。互いに分離された２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂの光路上には、それぞれバンドパスフィルタ２６ａ，２６ｂが配設されている。これら２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂは、それぞれバンドパスフィルタ２６ａ，２６ｂによってこれら蛍光１６ａ，１６ｂの波長成分のみを透過させて、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂで検出され、光電変換される。
【００５５】
一方、第２の波長分離ミラーを透過した１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、第３の実施の形態と同様に、第３の波長分離ミラー２４に入射される。この蛍光１５ａは、このミラー２４を透過し、蛍光１５ｂは、反射される。これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、レンズ２０ａ，２０ｂ、共焦点ピンホール２１ａ，２１ｂに順次入射される。
【００５６】
そして、これら１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂの光路上には、それぞれバンドパスフィルタ２７ａ，２７ｂが配置されている。１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂは、それぞれバンドパスフィルタ２７ａ，２７ｂによって１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂの波長成分のみが透過して、フォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで検出され、光電変換される。
【００５７】
本実施の形態では、測定精度を向上させるため、１光子励起蛍光１５ａ，１５ｂ、および２光子励起蛍光１６ａ，１６ｂがフォトマルチプライヤに入射される直前に前記バンドパスフィルタ２６ａ，２６ｂ，２７ａ，２７ｂを設けて、ノイズ成分をカットし、それぞれの蛍光の波長成分のみを検出できるようにしている。
【００５８】
そして、例えば、１波長励起２波長蛍光の試薬には、カルシウムイオン濃度測定用試薬として知られているＩｎｄｏ−１と、ｐＨ測定用試薬として知られているＳＮＡＲＦ−１とがあり、これらによって標本１４が多重染色されている。なお、Ｉｎｄｏ−１が励起される波長の励起極大は３５０ｎｍであり、励起により発せられる蛍光の波長の蛍光極大は、４８０ｎｍ，４０５ｎｍである。ＳＮＡＲＦ−１が励起される波長の励起極大は５３０ｎｍであり、励起により発せられる蛍光の波長の蛍光極大は、６３０ｎｍ，５８０ｎｍである。
【００５９】
以下、ＳＮＡＲＦ−１をＧｒｅｅｎ Ｈｅ：Ｎｅレーザから波長５４３ｎｍのレーザビームを出射させて励起して、発せられた蛍光を共焦点ピンホールを介してフォトマルチプライヤで検出し、Ｉｎｄｏ−１をＴｉ：Ｓａレーザから波長７００ｎｍの超短パルスレーザビームを出射させて２光子励起現象を発生させて、発せられた蛍光をフォトマルチプライヤで検出する場合について記載する。
【００６０】
第１ないし第４の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）７，１１，２４，２５の特性は、それぞれ図６の（ａ）ないし（ｄ）に示すように構成されている。ここで、図６の（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれ縦軸がレーザビームおよび蛍光の透過率、横軸がこれらの波長を表している。このため、まず、第１の波長分離ミラー７は、図６の（ａ）に示すように、それぞれのレーザビーム３，４の波長５４３ｎｍ，７００ｎｍを反射させる（透過させない）特性を有し、これらレーザビーム３，４を反射させる。また、第２の波長分離ミラー１１は、図６の（ｂ）に示すように、それぞれのレーザビーム３，４の波長５４３ｎｍ，７００ｎｍを透過させる特性を有し、これらレーザビーム３，４を透過させる。
【００６１】
多重染色標本１４から発生された蛍光１５ａ，１５ｂ，１６ａ，１６ｂは、それぞれ６３０ｎｍ，５８０ｎｍ，４８０ｎｍ，４０５ｎｍの波長を有する。このため、第２の波長分離ミラーは、図６の（ｂ）に示すように、それぞれ６３０ｎｍ，５８０ｎｍの波長を有する蛍光１５ａ，１５ｂを透過させ、４８０ｎｍ，４０５ｎｍの波長を有する蛍光１６ａ，１６ｂを反射させるような特性を有する。
また、第４の波長分離ミラー２５は、図６の（ｄ）に示すように、４８０ｎｍの波長を有する蛍光１６ａを透過させ、４０５ｎｍの波長を有する蛍光１６ｂを反射させる特性を有する。
また、第１の波長分離ミラー７は、図６の（ａ）に示すように、それぞれ６３０ｎｍ，５８０ｎｍの波長を有する蛍光１５ａ，１５ｂを透過させる特性を有する。そして、第３の波長分離ミラー２４は、図６の（ｃ）に示すように、６３０ｎｍの波長を有する蛍光１５ａを透過させ、５８０ｎｍの波長を有する蛍光１５ｂを反射させる特性を有する。
【００６２】
したがって、それぞれフォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂでＳＮＡＲＦ−１からの蛍光１５ａ，１５ｂを、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂでＩｎｄｏ−１からの蛍光１６ａ，１６ｂを検出することができる。そして、図示しないコンピュータでそれぞれフォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで検出される蛍光量のレシオと、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂで検出される蛍光量のレシオとを求めて、生体組織細胞の標本１４のカルシウム濃度変化とｐＨ変化とを同時に測定することができる。
【００６３】
（第５の実施の形態）
次に、第５の実施の形態について図７を用いて説明する。本実施の形態は、第４の実施の形態の変形例である。
本実施の形態では、カメレオン（商標）というプローブを用いてカルシウムイオン濃度を測定するとともに、ＳＮＡＲＦ−１によりｐＨ測定を同時に行なう場合について説明する。
まず、カメレオンを用いたカルシウムイオン濃度測定法について説明する。これは、２つの蛍光タンパク質であるＣＦＰ蛍光およびＹＦＰ蛍光のエナジートランスファーを利用するものである。例えば、波長４４２ｎｍのビームでＣＦＰ蛍光を励起し、励起されたＣＦＰ蛍光のエネルギでＹＦＰ蛍光を励起させる手法で、ＣＦＰ蛍光の波長４８５ｎｍ、およびＹＦＰ蛍光の波長５３０ｎｍの蛍光量のレシオを測定するものである。
【００６４】
カメレオンを励起させる場合、波長４４２ｎｍのＨｅ：Ｃｄレーザを用い、共焦点ピンホールを用いてフォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで光電変換する。また、ＳＮＡＲＦ−１を励起させる場合、波長１０００ｎｍのＴｉ：Ｓａレーザを用い、２光子励起現象により発せられた蛍光をフォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂで光電変換して行なう。
【００６５】
なお、第１ないし第４の波長分離ミラー（ダイクロイックミラー）７，１１，２４，２５の特性は、それぞれ図７の（ａ）ないし（ｄ）に示すように構成されている。ここで、図７の（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれ縦軸がレーザビームおよび蛍光の透過率、横軸がこれらの波長を表している。このため、まず、第１の波長分離ミラー７は、図７の（ａ）に示すように、それぞれ波長４４２ｎｍ，１０００ｎｍを反射させる（透過させない）特性を有し、これらレーザビーム３，４を反射させる。また、第２の波長分離ミラー１１は、図７の（ｂ）に示すように、それぞれ波長４４２ｎｍ，１０００ｎｍを透過させる特性を有し、これらレーザビーム３，４を透過させる。
【００６６】
多重染色標本１４から発生された蛍光１５ａ，１５ｂ，１６ａ，１６ｂは、それぞれ５３０ｎｍ，４８５ｎｍ，５８０ｎｍ，６３０ｎｍの波長を有する。このため、第２の波長分離ミラーは、図７の（ｂ）に示すように、蛍光１５ａ，１５ｂを透過させ、蛍光１６ａ，１６ｂを反射させる特性を有する。
第４の波長分離ミラー２５は、図７の（ｄ）に示すように、蛍光１６ａを透過させ、蛍光１６ｂを反射させる特性を有する。
また、第１の波長分離ミラー７は、図７の（ａ）に示すように、蛍光１５ａ，１５ｂの波長を透過させる特性を有する。そして、第３の波長分離ミラー２４は、図７の（ｃ）に示すように、蛍光１５ａを透過させ、蛍光１５ｂを反射させる特性を有する。
【００６７】
したがって、フォトマルチプライヤ２２ａ，２２ｂで、励起されたＣＦＰ蛍光１５ｂを検出することができるとともに、このＣＦＰ蛍光のエネルギを利用して励起されたＹＦＰ蛍光１５ａを検出することができる。また、フォトマルチプライヤ１８ａ，１８ｂで、ＳＮＡＲＦ−１による蛍光を検出することができる。そして、図示しないコンピュータでこれら蛍光量のレシオをそれぞれ求めて、生体組織細胞の標本１４のカルシウム濃度変化とｐＨ変化とを同時に測定することができる。
【００６８】
（第６の実施の形態）
次に、第６の実施の形態について図８を用いて説明する。以下、同様な作用および機能を有する部材には、第１ないし第５の実施の形態で用いた符号と同じ符号を使用して、詳しい説明を省略する。
本実施の形態は、第１ないし第４の実施の形態の変形例である。第３の実施の形態のように、標本１４上で１光子励起現象を発生させる複数（ここでは、３つ）のレーザ光源１ａ，１ｂ，１ｃが配設されている。それぞれのレーザ光源１ａ，１ｂ，１ｃから出射されるレーザビーム３ａ，３ｂ，３ｃを合成し、合成されたレーザビーム３にするために、ミラー２３が設けられている。
【００６９】
また、標本１４上で、２光子励起現象を発生させる複数（ここでは、２つ）の短パルスレーザ光源２ａ，２ｂが配設されている。それぞれの短パルスレーザ光源２ａ，２ｂから出射されるレーザビーム４ａ，４ｂを合成し、合成されたレーザビーム４にするために、ミラー３２が設けられている。
【００７０】
また、第４の波長分離ミラー２５で分離された蛍光１６ｂの光路上には、ダイクロイックミラー２５ａが配設され、蛍光１６をさらに分離させるようになっている。このミラー２５を透過もしくは反射されたビームの光路上には、それぞれバンドパスフィルタとフォトマルチプライヤとが順次配設されている。
【００７１】
また、第３の波長分離ミラー２４のさらに前方に複数（ここでは、３つ）のミラー２４ａ，２４ｂ，２４ｃが配置されている。２つのミラー２４ａ，２４ｂは、ダイクロイックミラーからなり、ミラー２４ｃは、反射ミラーからなる。
【００７２】
そして、これらミラー２４ａ，２４ｂ，２４ｃで反射されたビームの光路上には、共焦点ピンホールと、バンドパスフィルタと、フォトマルチプライヤとがそれぞれ順次配設されている。
【００７３】
本実施の形態では、それぞれ標本上で、１光子励起現象を発生させるレーザ光源１を３つ、２光子励起現象を発生させる短パルスレーザ光源２を２つ設けたが、これらの数に限らず、ダイクロイックミラーの特性を変えれば、組み合わせも自由に変化され得る。
【００７４】
なお、第１ないし第６の実施の形態においては、短パルスレーザ光源から出射されるレーザビームによって標本から発せられるのは、２光子励起現象により発生される蛍光に限らず、例えば、３光子励起現象、４光子励起現象などの多光子励起現象により発生される蛍光、さらには、ラマン光、第２高調波、第３高調波などもあり得、これら蛍光、ラマン光、第２高調波、第３高調波なども同様に検出することができる。このため、標本で非線形現象を生じさせ、この現象により発生される光であれば、同様に、検出することができる。
また、各ダイクロイックミラーの特性において、波長による透過と反射との関係は、互いに反対であっても構わない。また、共焦点検出部分は、ダイクロイックミラーで互いに異なる波長に分離する前にレンズとピンホールとを配置する構成でも構わない。さらに、走査光学系は、ガルバノミラーに限らず、レーザビームを２次元的に走査できるものであれば、他の方式でも構わない。
【００７５】
これまで、いくつかの実施の形態について図面を参照しながら具体的に説明したが、本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で行なわれるすべての実施を含む。
【００７６】
上記説明によれば、下記の事項の発明が得られる。また、各項の組み合わせも可能である。
【００７７】
［付記］
１．少なくとも１つのレーザ光源と、
前記レーザ光源から出射されたレーザビームを２次元に走査させる走査光学系と、
この走査光学系により走査されたレーザビームを標本上に集光、照射させるとともに、線形現象および非線形現象により、この標本から得られる（発せられる）光を入射させる対物レンズと、
前記標本から得られる光を選択的に分離させる第１のビームスプリッタと、
この第１のビームスプリッタで分離された光を検出する第１の光検出器と、
を具備したレーザ顕微鏡において、
前記対物レンズと第１のビームスプリッタとの間の光軸上に配設され、前記標本から得られる光から、前記標本にレーザビームが照射されて発せられた非線形現象による所定の光を分離させる第２のビームスプリッタと、
この第２のビームスプリッタで分離された光を検出する第２の光検出器とをさらに具備し、
前記第２のビームスプリッタは、前記レーザ光源から出射されたレーザビーム、および前記標本から得られる線形現象による光または反射光と、前記標本から得られる非線形現象による光とを分離させるように設定され、
前記第１のビームスプリッタは、前記レーザ光源から出射されたレーザビームと、前記標本からの線形現象による光または反射光とを分離させるように設定されたことを特徴とするレーザ顕微鏡。
【００７８】
２．少なくとも１つの１光子励起用のレーザ光源から出射されるレーザビームと、少なくとも１つの多光子励起用のパルスレーザ光源から出射されるレーザビームとを合成させるレーザビーム合成光学系と、
前記レーザビーム合成光学系で合成された複数のレーザビームを２次元に走査させる走査光学系と、
この走査光学系により走査されたレーザビームを標本上に集光、照射させるとともに、この標本から得られる光を入射させる対物レンズと、
前記レーザビーム合成光学系と前記走査光学系との間の光軸上に配設され、前記標本から得られる光を選択的に分離させる第１の波長分離ミラーと、
この第１の波長分離ミラーで分離された光を検出する第１の光検出器と、
を具備したレーザ顕微鏡において、
前記対物レンズと第１の波長分離ミラーとの間の光軸上に配設され、前記標本から得られる光から、前記標本にレーザビームが照射されて発せられた所定の光を分離させる第２の波長分離ミラーと、
この第２の波長分離ミラーで分離された光を検出する第２の光検出器とをさらに具備し、
前記第２の波長分離ミラーは、合成された前記レーザビーム、および前記１光子励起用のレーザから出射されたレーザビームによって前記標本から得られる所定の光と、前記多光子励起用のレーザから出射されたレーザビームによって前記標本から得られる所定の光とを分離させるように設定され、
前記第１の波長分離ミラーは、合成された前記レーザビームと、前記１光子励起用のレーザから出射されたレーザビームによって前記標本から得られる所定の光とを分離させるように設定されたことを特徴とするレーザ顕微鏡。
【００７９】
３．前記第１の波長分離ミラーと前記第１の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第１の波長分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長に分離させる少なくとも１つの第３の波長分離ミラーと、
前記第３の波長分離ミラーで分離された光を検出する第３の光検出器とをさらに具備したことを特徴とする付記項２に記載のレーザ顕微鏡。
【００８０】
４．前記第２の波長分離ミラーと前記第２の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第２の波長分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長に分離させる少なくとも１つの第４の波長分離ミラーと、
前記第４の波長分離ミラーで分離された光を検出する第４の光検出器とをさらに具備したことを特徴とする付記項２もしくは３に記載のレーザ顕微鏡。
【００８１】
この付記項４によって、１光子励起および／もしくは２光子励起での２波長蛍光検出が可能となり、複数のレシオ測定を同時に行なうことができる。
【００８２】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、生体細胞組織（標本）からの複数の光を同時に検出することが可能で、標本の複数の形態および機能をリアルタイムで観察および測定することが可能となる、特に、多重染色標本から発せられるそれぞれ異なる波長を有する複数の蛍光を同時に効率よく検出することができるレーザ顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図２】第２の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図３】第２の実施の形態に係わり、（ａ）は蛍光の発生状態を説明するための概略図、（ｂ）は多光子励起現象により励起される蛍光の発生状態を説明するための概略図。
【図４】第３の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図５】第４の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図６】第４の実施の形態に係わり、（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれ図５に示す第１ないし第４の波長分離ミラーの波長透過率特性を表すグラフ。
【図７】第５の実施の形態に係わり、（ａ）ないし（ｄ）は、それぞれ図５に示す第１ないし第４の波長分離ミラーの波長透過率特性を表すグラフ。
【図８】第６の実施の形態に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図９】従来技術に係わるレーザ顕微鏡の光学系を説明するための概略図。
【図１０】従来技術に係わるダイクロイックミラーの特性を表すグラフ。
【符号の説明】
１，２…レーザ光源、３，４…レーザビーム、５…ダイクロイックミラー、６…レーザビーム、７…第１の波長分離ミラー、８…ガルバノミラー、１１…第２の波長分離ミラー、１３…対物レンズ、１４…標本、１５…蛍光、１６…蛍光、１８…第２の光検出器、２１…共焦点ピンホール、２２…第１の光検出器
Claims (6)
- 互いに異なる波長の蛍光を発する複数種類の蛍光色素で染色された多重染色標本の蛍光観察を行なうレーザ顕微鏡であって、
それぞれ標本上で、前記複数の蛍光色素のうちの第１の蛍光色素に線形現象を発生させるのに用いる少なくとも１つのレーザ光源と、前記第１の蛍光色素とは異なる第２の蛍光色素に非線形現象を発生させるのに用いる少なくとも１つの短パルスレーザ光源とから出射されるレーザビームを合成させるレーザビーム合成光学系と、
前記レーザビーム合成光学系で合成されたレーザビームを２次元的に走査させる走査光学系と、
この走査光学系により走査されたレーザビームを標本上に集光させるとともに、この標本からの光が入射される対物レンズと、
前記レーザビーム合成光学系と前記走査光学系との間の光軸上に配設され、合成された前記線形現象用と非線形現象用の各レーザビームから、前記レーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの線形現象による蛍光を波長に基づいて選択的に分離させる第１の波長分離ミラーと、
この第１の波長分離ミラーで分離された前記第１の蛍光色素からの蛍光を検出する第１の光検出器と、
前記対物レンズと前記走査光学系との間の光軸上に配設され、前記レーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの線形現象による蛍光および合成された前記線形現象用と非線形現象用の各レーザビームから、前記短パルスレーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの非線形現象による蛍光を波長に基づいて選択的に分離させる第２の波長分離ミラーと、
この第２の波長分離ミラーで分離された前記第２の蛍光色素からの蛍光を検出する第２の光検出器と
を具備することを特徴とするレーザ顕微鏡。 - 前記第１の波長分離ミラーと前記第１の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第１の波長分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長の光に分離させる少なくとも１つの第３の波長分離ミラーと、
前記第３の波長分離ミラーで分離された光を検出する第３の光検出器と
をさらに具備することを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。 - 前記第２の波長分離ミラーと前記第２の光検出器との間の光軸上に配設され、前記第２の波長分離ミラーで分離された光をさらに異なる波長の光に分離させる少なくとも１つの第４の波長分離ミラーと、
前記第４の波長分離ミラーで分離された光を検出する第４の光検出器と
をさらに具備することを特徴とする請求項１もしくは請求項２に記載のレーザ顕微鏡。 - 線形現象に基づく蛍光と、この蛍光とは波長が異なり非線形現象に基づく観察光を発生する標本の観察を行なうレーザ顕微鏡であって、
それぞれ標本上で、前記線形現象を発生させるのに用いる少なくとも１つのレーザ光源と、前記非線形現象を発生させるのに用いる少なくとも１つの短パルスレーザ光源とから出射されるレーザビームを合成させるレーザビーム合成光学系と、
前記レーザビーム合成光学系で合成されたレーザビームを２次元的に走査させる走査光学系と、
この走査光学系により走査されたレーザビームを標本上に集光させるとともに、この標本からの光が入射される対物レンズと、
前記レーザビーム合成光学系と前記走査光学系との間の光軸上に配設され、合成された前記線形現象用と非線形現象用の各レーザビームから、前記レーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの線形現象による蛍光を波長に基づいて選択的に分離させる第１の波長分離ミラーと、
この第１の波長分離ミラーで分離された前記蛍光を検出する第１の光検出器と、
前記対物レンズと前記走査光学系との間の光軸上に配設され、前記レーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの線形現象による蛍光および合成された前記線形現象用と非線形現象用の各レーザビームから、前記短パルスレーザ光源から出射されたレーザビームによる前記標本からの非線形現象による観察光を波長に基づいて選択的に分離させる第２の波長分離ミラーと、
この第２の波長分離ミラーで分離された前記観察光を検出する第２の光検出器と
を具備することを特徴とするレーザ顕微鏡。 - 前記非線形現象に基づく観察光は、ラマン光、第２高調波、第３高調波のうちのいずれかであることを特徴とする請求項４に記載のレーザ顕微鏡。
- 前記短パルスレーザ光源からのレーザビームの波長は近赤外帯域であることを特徴とする請求項１もしくは請求項４に記載のレーザ顕微鏡。
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