JP4793781B2 - White-rot fungi having lignocellulose-degrading action and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、リグノセルロースに対して優れた分解作用を有し、リグノセルロースを酵素糖化・発酵処理の多糖原料として有効利用できるように変換可能な白色腐朽菌に関する。更に、本発明は、当該白色腐朽菌を使用したリグノセルロースの分解方法、リグノセルロースの糖化方法、リグノセルロースから発酵産物を製造する方法に関する。 The present invention relates to a white rot fungus that has an excellent decomposing action on lignocellulose and can be converted so that lignocellulose can be effectively used as a polysaccharide raw material for enzymatic saccharification / fermentation treatment. Furthermore, the present invention relates to a method for decomposing lignocellulose using the white rot fungus, a method for saccharification of lignocellulose, and a method for producing a fermentation product from lignocellulose.
近年の急激な人口増加と化石資源の消費に伴うCO2濃度の増加に対処するため、再生産可能な資源であるバイオマスから多糖の糖化・発酵により有用なエネルギー・化学原料を生産することが求められている。しかしながら、木材細胞壁多糖はリグニンに被覆されリグノセルロースとして存在しているため、木材細胞壁多糖を酵素糖化・発酵するには、リグノセルロースを分解してリグニンにより被覆された多糖を露出させる前処理が必要である。リグノセルロースを分解して木材細胞壁多糖を酵素と接触できるように露出させる前処理としては、粉砕、爆砕、蒸煮、マイクロ波照射、ガンマ線照射、電子線照射、希硫酸処理、アルカリ処理、ソルボリシス処理、等の前処理が知られている（非特許文献１及び２参照）。これらの方法は、エネルギーの投入量が大きい、前処理による糖の損失が大きい、有害物質による環境負荷が大きい、などの欠点があり、木材の酵素糖化法によるエタノールへの変換は未だに工業化されていない。これらの前処理法の中で、爆砕、マイクロ波加熱などの熱化学的処理は、実用化に近い方法として研究例が多いが、いずれの方法も、触媒を添加しない条件では、針葉樹材に対する処理効果が小さいという欠点を有していた。例えば、ブナ材をマイクロ波加熱前処理した場合の最大酵素糖化率は100％になるが、スギ材をマイクロ波加熱前処理した場合の最大酵素糖化率は、36％にとどまることが知られている（非特許文献２参照）。こうした欠点を補うため、熱化学的処理に硫酸やSO2を触媒として利用する方法も試されているが（非特許文献３参照）、これらの有害物質の使用は、酵素糖化法の利点である低環境負荷を損なうことになる。
To cope with the increase in CO 2 concentration due to consumption of the recent rapid population growth and fossil resources, required to produce useful energy and chemical materials by saccharification and fermentation of polysaccharides from biomass is renewable resources It has been. However, since wood cell wall polysaccharides are coated with lignin and exist as lignocellulose, enzymatic saccharification / fermentation of wood cell wall polysaccharides requires pretreatment that decomposes lignocellulose and exposes the lignin-coated polysaccharide. It is. As pretreatment to decompose lignocellulose and expose the wood cell wall polysaccharide so that it can come into contact with the enzyme, crushing, explosion, steaming, microwave irradiation, gamma ray irradiation, electron beam irradiation, dilute sulfuric acid treatment, alkali treatment, solvolysis treatment, Are known (see Non-Patent
一方、リグノセルロース中のリグニンを分解できる微生物である白色腐朽菌に注目して、白色腐朽菌を他の木材酵素糖化前処理法と組み合わせて利用する方法が報告されている（非特許文献４参照）。しかしながら、従来の白色腐朽菌を使用してリグノセルロースを分解する方法では、環境に対する負荷が少ないという利点があるものの、木材の酵素糖化・発酵に対する前処理の効果が小さく、未だ満足できるものではなかった。例えば、広葉樹ブナ材を、白色腐朽菌Phanerochaete chrysosporiumで28日間培養した後210℃で爆砕処理すると、酵素糖化率は腐朽木材当たり76％に達するが、28日間のPhanerochaete chrysosporium培養でブナ材の重量は30％以上減少しているため、元の材の重量あたりの糖化率は、55％以下にとどまる（非特許文献３参照）。このため、腐朽に伴う木材の重量減少率が小さく、なおかつ広葉樹材や非木材リグノセルロースのみでなく、スギなどの針葉樹材に対しても高い前処理効果を示す白色腐朽菌の開発が求められてきた。
そこで本発明は、広葉樹リグノセルロースや非木材系リグノセルロースのみならず針葉樹リグノセルロースに対して優れた分解作用を有し、リグノセルロースを酵素糖化・発酵処理の多糖原料として有効利用できるように変換可能な菌株を提供することを目的とする。更に、本発明は、上記菌株を使用して、効率的にリグノセルロースを分解する方法、リグノセルロースを効率的に糖化する方法、及びリグノセルロースを原料として有用物質を製造する方法を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention has an excellent decomposing action on softwood lignocellulose as well as hardwood lignocellulose and non-wood lignocellulose, and can be converted so that lignocellulose can be effectively used as a polysaccharide raw material for enzymatic saccharification / fermentation treatment. It aims at providing a new strain. Furthermore, the present invention provides a method for efficiently degrading lignocellulose, a method for efficiently saccharifying lignocellulose, and a method for producing useful substances from lignocellulose as a raw material using the above strain. Objective.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、生育樹木、倒木、落葉、材木等から採取された多種の菌株の中から、リグノセルロースに対して優れた分解作用を有し、リグノセルロースを酵素糖化・発酵処理の多糖原料として有効利用できるように変換可能な白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）を見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。 The present inventors diligently studied to solve the above problems, and from various strains collected from growing trees, fallen trees, fallen leaves, timber, etc., have an excellent decomposing action on lignocellulose, A white-rot fungus ( FERM P-20591 ) that can be converted so that lignocellulose can be effectively used as a polysaccharide raw material for enzymatic saccharification and fermentation treatment has been found. The present invention has been completed by making further improvements based on such findings.
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明である：
項１． リグノセルロース分解作用を有する白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）又はリグノセルロース分解作用を有するその変異株。
項２． リグノセルロース分解作用を有する白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）又はリグノセルロース分解作用を有するその変異株をリグノセルロースの存在下で培養する工程を含む、リグノセルロースの分解方法。
項３． リグノセルロースが針葉樹材、広葉樹材、又は非木材リグノセルロースである、項２に記載の分解方法。
項４． リグノセルロース分解作用を有する白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）又はリグノセルロース分解作用を有するその変異株をリグノセルロースの存在下で培養する工程、及び
前記工程で得られた培養物中の多糖を酵素糖化処理する工程を含む、リグノセルロースの糖化方法。
項５． リグノセルロース分解作用を有する白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）又はリグノセルロース分解作用を有するその変異株をリグノセルロースの存在下で培養する工程、及び
前記工程で得られた培養物中の多糖を用いて糖化及び発酵処理する工程を含む、リグノセルロースから発酵産物を製造する方法。
That is, this invention is invention of the aspect hung up below:
Item 2. A method for degrading lignocellulose, comprising a step of culturing a white rot fungus ( FERM P-20591 ) having a lignocellulose-degrading action or a mutant thereof having a lignocellulose-degrading action in the presence of lignocellulose.
Item 4. A step of culturing a white rot fungus ( FERM P-20591 ) having a lignocellulose-degrading action or a mutant thereof having a lignocellulose-degrading action in the presence of lignocellulose, and a polysaccharide in the culture obtained in the above-mentioned step; A method for saccharification of lignocellulose, comprising a step of saccharification treatment.
以下、本発明を詳細に説明する。
１．白色腐朽菌
本発明の白色腐朽菌は、リグノセルロース分解作用を有するものであり、ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１（識別のための表示：SK M2102）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている菌株である。本発明の白色腐朽菌は、優れたリグノセルロース分解作用を有し、リグノセルロースを酵素糖化・発酵処理の多糖原料として有効利用できるように変換することができる。従って、本発明の白色腐朽菌は、リグノセルロースを酵素糖化・発酵処理する際の前処理において有用である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. White rot fungus The white rot fungus of the present invention has a lignocellulose-degrading action and has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center as FERM P-20591 (indication for identification: SK M2102). It is a strain that has been. The white rot fungus of the present invention has an excellent lignocellulose decomposition action and can be converted so that lignocellulose can be effectively used as a polysaccharide raw material for enzymatic saccharification / fermentation treatment. Therefore, the white rot fungus of the present invention is useful in pretreatment when lignocellulose is subjected to enzymatic saccharification / fermentation treatment.
本発明の白色腐朽菌は、リグニンペルオキシダーゼ、べラトリアルアルコールオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、マンガン非依存性ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等のリグニン分解に寄与する酵素を産生すると共に、エキソ-1,4-β-グルカナーゼ、エンド-1,4-β-グルカナーゼ、β-グルコシダーゼ等の多糖分解酵素を産生するという特徴を備えている。 The white rot fungus of the present invention produces enzymes contributing to lignin degradation such as lignin peroxidase, veratrial alcohol oxidase, manganese peroxidase, manganese-independent peroxidase, laccase, and exo-1,4-β-glucanase, It is characterized by producing polysaccharide degrading enzymes such as endo-1,4-β-glucanase and β-glucosidase.
本発明の白色腐朽菌は、その18SrRNAの塩基配列は配列番号１に示す通りであり、当該18SrRNAの塩基配列から推定した担子菌の分子系統樹上では、Ceriporiopsis subvermisporaを含む従来公知の白色腐朽菌とは遺伝的に異なる菌である。 The white rot fungus of the present invention has the base sequence of 18SrRNA as shown in SEQ ID NO: 1. On the molecular phylogenetic tree of basidiomycete deduced from the base sequence of the 18SrRNA , a conventionally known white rot fungus containing Ceriporiopsis subvermispora is known. Is a genetically different fungus.
本発明の白色腐朽菌は、従来公知の白色腐朽菌の場合と同様の培地及び培養条件で生育することができる。例えば、本発明の白色腐朽菌は、ポテトデキストロース寒天（PDA）培地上で、１５〜３３℃で好気的条件下で良好に生育することができる。 The white rot fungus of the present invention can grow on the same medium and culture conditions as those of conventionally known white rot fungi. For example, the white rot fungus of the present invention can grow well on a potato dextrose agar (PDA) medium at 15 to 33 ° C. under aerobic conditions.
本発明の白色腐朽菌の生育特性を以下に示す：
(i)PDA培地上での生育は良好であるが、菌糸の成長速度はCeriporiopsis subvermisporaより遅い。
(ii)１５〜３５℃程度で菌糸の生育が見られるが、もっとも生育が良好な温度は２８〜３０℃前後である。
(iii)培養した際の生育形状は、菌糸状であり、周縁部は波打った様な形となり、菌糸増殖による厚みが見られ、さらに培地が黄色〜褐色に変化することもある。
The growth characteristics of the white rot fungus of the present invention are shown below:
(i) Growth on PDA medium is good, but mycelium growth rate is slower than Ceriporiopsis subvermispora .
(ii) Mycelia grow at about 15 to 35 ° C, but the best temperature is about 28 to 30 ° C.
(iii) The growth shape when cultivated is a mycelium, the peripheral portion has a wavy shape, a thickness due to mycelial growth is seen, and the medium may change from yellow to brown.
また、本発明には、白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）の変異株も包含する。当該変異株は、例えば、白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）を公知の変異処理に供すること、又は経代培養による適応や自然変異により作成できる。 The present invention also includes a mutant strain of white rot fungus ( FERM P-20591 ). The mutant strain can be prepared, for example, by subjecting white-rot fungi ( FERM P-20591 ) to a known mutation treatment, or by adaptation or natural mutation through subculture.
２．白色腐朽菌の利用法
上記白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）又はその変異株を利用して、リグノセルロースを分解することができる。
2. Utilization Method of White Rot Fungus Lignocellulose can be decomposed using the above white rot fungus ( FERM P-20591 ) or its mutant strain.
ここで分解対象となるリグノセルロースとしては、例えば、針葉樹材、広葉樹材、非木材系リグノセルロース等が挙げられる。具体的には、針葉樹材としては、スギ、エゾマツ、カラマツ、クロマツ、トドマツ、ヒメコマツ、イチイ、ネズコ、ハリモミ、イラモミ、イヌマキ、モミ、サワラ、トガサワラ、アスナロ、ヒバ、ツガ、コメツガ、ヒノキ、イチイ、イヌガヤ、トウヒ、イエローシーダー（ベイヒバ）、ロウソンヒノキ（ベイヒ）、ダグラスファー（ベイマツ）、シトカスプルース（ベイトウヒ）、ラジアータマツ、イースタンスプルース、イースタンホワイトパイン、ウェスタンラーチ、ウェスタンファー、ウェスタンヘムロック、タマラック及びこれらの関連樹種等が例示される。また、広葉樹材としては、具体的には、アスベン、アメリカンブラックチェリー、イエローポプラ、ウォールナット、カバザクラ、ケヤキ、シカモア、シルバーチェリー、タモ、チーク、チャイニーズエルム、チャイニーズメープル、ナラ、ハードメイプル、ヒッコリー、ピーカン、ホワイトアッシュ、ホワイトオーク、ホワイトバーチ、レッドオーク及びこれらの関連樹種等が例示される。更に、非木材系リグノセルロースとしては、具体的には、イネ、サトウキビ、ムギ、トウモロコシ、パイナップル、オイルパーム等の農産物及びその廃棄物；ケナフ、綿等の工業植物及びその廃棄物；アルファルファ、チモシー等の飼料作物；タケ、ササ等が例示される。これらのリグノセルロースの内、針葉樹木材は、リグニン含量が多く本発明において好適な分解対象である。 Here, examples of lignocellulose to be decomposed include softwood, hardwood, non-wood lignocellulose, and the like. Specifically, as conifers, cedar, spruce, larch, black pine, todomatsu, Japanese pine, yew, nezuko, spruce, liromi, hinoki, fir, sawara, togasawara, asunaro, hiba, tsuga, kotsutsuga, hinoki, yew, Inugaya, Spruce, Yellow Cedar (Beihiba), Lawson Cypress (Beihi), Douglas Fir (Bay Pine), Sitka Spruce (Beisuhi), Radiata Pine, Eastern Spruce, Eastern White Pine, Western Larch, Western Fur, Western Hemlock, Tamarack and these Related tree species and the like. Specific examples of hardwoods include asben, American black cherry, yellow poplar, walnut, cabbage cherry, zelkova, sycamore, silver cherry, tamo, teak, chinese elm, chinese maple, oak, hard maple, hickory, pecan , White ash, white oak, white birch, red oak and related tree species thereof. Furthermore, as non-wood type lignocellulose, specifically, agricultural products such as rice, sugarcane, wheat, corn, pineapple, oil palm and their wastes; industrial plants such as kenaf, cotton and their wastes; alfalfa, timothy For example, forage crops such as bamboo and bamboo grass. Among these lignocelluloses, coniferous wood has a high lignin content and is a suitable degradation target in the present invention.
分解対象のリグノセルロースは、その形状については、粉末状、チップ状、角材状、丸太状、フレーク状、繊維状（例えば、長さ０．５−３ｃｍ、直径０．０１−２ｍｍ程度のもの）等の如何なる形状のものであってもよい。効率的に白色腐朽菌による分解を行うという観点から、好ましくは粉末状、チップ状、フレーク状、繊維状である。 The lignocellulose to be decomposed is in the form of powder, chip, square, log, flake, or fiber (for example, having a length of about 0.5-3 cm and a diameter of about 0.01-2 mm). Or any other shape. From the viewpoint of efficiently decomposing with white rot fungi, it is preferably in the form of powder, chip, flake or fiber.
リグノセルロースの形状がチップ状である場合、その大きさとしては、例えば、長さ１００ｍｍ以下、縦２０ｍｍ以下及び横５０ｍｍ以下程度、好ましくは５０ｍｍ以下、縦１０ｍｍ以下及び横３０ｍｍ以下程度のものが例示される。 When the shape of lignocellulose is a chip, the size is, for example, 100 mm or less in length, 20 mm or less in length and 50 mm or less in width, preferably 50 mm or less, 10 mm in length or less and 30 mm or less in width. Is done.
リグノセルロースの分解は、上記白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）又はその変異株をリグノセルロースの存在下で培養することによって行われる。 Lignocellulose is decomposed by culturing the above white rot fungus ( FERM P-20591 ) or its mutant strain in the presence of lignocellulose.
当該リグノセルロースの分解において、リグノセルロースが存在する環境下で、上記白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）又はその変異株が生育可能な環境にするためには、通常、リグノセルロース１００重量部に対して水分をを５〜５００重量部、好ましくは５０〜４００重量部、更に好ましくは５０〜３００重量部程度添加することにより、水分含量を調整することが望ましい。また、更に、該リグノセルロースには、必要に応じて、白色腐朽菌の生育に必要とされる塩や栄養素（例えば、ふすま、ペプトン、コーンスティープリカー、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ポテトエキス、米ぬか、合成無機塩類(Kirk塩)等）を添加してもよい。このように調製したリグノセルロースは、上記白色腐朽菌（ＦＥＲＭＰ−２０５９１）又はその変異株の植菌に先だって、加熱殺菌等の殺菌処理に供して、雑菌の繁殖を防止しておくことが望ましい。 In the decomposition of the lignocellulose, in order to make an environment in which the white rot fungus ( FERM P-20591 ) or a mutant thereof can grow in an environment where the lignocellulose is present, it is usually based on 100 parts by weight of the lignocellulose. It is desirable to adjust the water content by adding about 5 to 500 parts by weight, preferably 50 to 400 parts by weight, and more preferably about 50 to 300 parts by weight. Furthermore, the lignocellulose may contain salts and nutrients necessary for the growth of white rot fungi (for example, bran, peptone, corn steep liquor, yeast extract, meat extract, malt extract, potato extract). Rice bran, synthetic inorganic salts (Kirk salt, etc.) may be added. The lignocellulose thus prepared is preferably subjected to a sterilization treatment such as heat sterilization before inoculation of the white rot fungus ( FERMP-20591 ) or its mutant strain to prevent the propagation of miscellaneous bacteria.
リグノセルロースに上記白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）又はその変異株を植菌する方法は、特に制限されず、通常の植菌方法に従って行うことができる。例えば、リグノセルロースが粉末状又はチップ状の場合であれば、これらの針葉樹材の表面に種菌を降りかける方法や、これらのリグノセルロースと種菌を混合する方法が例示できる。また、例えば、リグノセルロースが角材状や丸太状の場合であれば、針葉樹材に適宜穴を開けて、その穴に種菌を詰める方法が例示される。 The method for inoculating the white rot fungus ( FERM P-20591 ) or a mutant thereof into lignocellulose is not particularly limited, and can be performed according to a normal inoculation method. For example, when lignocellulose is in the form of powder or chip, a method of inoculating inoculum on the surface of these softwood materials and a method of mixing these lignocellulose and inoculum can be exemplified. Moreover, for example, when lignocellulose is in the shape of a square or a log, a method of appropriately making a hole in a softwood and filling the hole with an inoculum is exemplified.
植菌に使用する種菌としては、例えば液体種菌、穀粒種菌、おがくず種菌、寒天種菌などを使用することができる。 As the inoculum used for inoculation, for example, liquid inoculum, grain inoculum, sawdust inoculum, agar inoculum and the like can be used.
リグノセルロースの分解の為の培養は、通常４〜４５℃、好ましくは１５〜３７℃、更に好ましくは２０〜３３℃の温度条件下で、相対湿度を３０％以上に保持して好気的に行われる。 Cultivation for the degradation of lignocellulose is usually aerobic at a temperature of 4 to 45 ° C., preferably 15 to 37 ° C., more preferably 20 to 33 ° C. and a relative humidity of 30% or more. Done.
また、培養時間は、使用するリグノセルロースの種類や培養条件等によって異なるが、通常３日以上、好ましくは７〜１８０日、更に好ましくは１０〜６０日が例示される。 Moreover, although culture | cultivation time changes with the kind of lignocellulose to be used, culture | cultivation conditions, etc., it is normally 3 days or more, Preferably it is 7 to 180 days, More preferably, it is 10 to 60 days.
斯くしてリグノセルロースを処理することにより得られる分解産物（培養物）は、更に必要に応じて、粉砕処理、マイクロ波照射、爆砕処理、蒸煮処理、放射線照射処理、化学処理（ソルボリシス処理、オゾン処理、アルカリ処理、酸処理、酸化剤処理、還元剤処理等）、菌処理、酸化酵素処理、及びこれらの複合処理等の各種前処理に供してもよい。 Thus, the degradation product (culture) obtained by treating lignocellulose is further subjected to grinding treatment, microwave irradiation, explosion treatment, steaming treatment, radiation treatment, chemical treatment (solvolysis treatment, ozone) as necessary. Treatment, alkali treatment, acid treatment, oxidant treatment, reducing agent treatment, etc.), fungus treatment, oxidase treatment, and a combination of these treatments.
このようにリグノセルロースを処理することにより、リグノセルロースが分解され、その細胞壁多糖が酵素の作用を受け易い構造に変換される。即ち、リグノセルロース分解作用を有する白色腐朽菌（ＦＥＲＭ Ｐ−２０５９１）又はその変異株をリグノセルロースの存在下で培養することにより得られる培養物中には、細胞壁多糖が酵素糖化や発酵処理の原料として利用することができる状態で存在している。従って、当該培養物中の多糖に対して、セルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ペクチナーゼ等の酵素で糖化処理することにより、該多糖を糖化（単糖化又はオリゴ糖化）することができる。ここで、培養物中の多糖は、単離又は精製されて本糖化処理に供されても良く、また該培養物に含有された状態で（即ち、培養物をそのまま）本糖化処理に供されてもよい。 By treating lignocellulose in this way, lignocellulose is decomposed and its cell wall polysaccharide is converted into a structure that is susceptible to the action of enzymes. That is, in a culture obtained by culturing a white rot fungus ( FERM P-20591 ) having a lignocellulose-degrading action or a mutant thereof in the presence of lignocellulose, the cell wall polysaccharide is a raw material for enzymatic saccharification and fermentation treatment. It exists in a state where it can be used as. Therefore, the polysaccharide in the culture can be saccharified (monosaccharide or oligosaccharide) by subjecting the polysaccharide to saccharification with an enzyme such as cellulase, xylanase, mannanase, galactanase, or pectinase. Here, the polysaccharide in the culture may be isolated or purified and subjected to the main saccharification treatment, or may be subjected to the main saccharification treatment in a state contained in the culture (that is, the culture as it is). May be.
また、当該糖化処理において、酵素の反応条件については、使用する酵素の種類や目的とする糖化の程度等に基づいて適宜設定される。 In the saccharification treatment, the reaction conditions of the enzyme are appropriately set based on the type of enzyme used, the target degree of saccharification, and the like.
このように糖化処理することにより細胞壁多糖が低分子化されて単糖又はオリゴ糖が生成する。この低分子化された糖を炭素源として利用して各種の発酵処理に供することにより、各種発酵産物を製造することができる。 By performing the saccharification treatment in this manner, the cell wall polysaccharide is reduced in molecular weight to produce a monosaccharide or oligosaccharide. Various fermentation products can be produced by using this low molecular weight sugar as a carbon source for various fermentation treatments.
ここで、発酵処理としては、有用物質を含む発酵産物が得られる発酵処理であることが望ましく、例えば、エタノール発酵、メタン発酵、水素発酵、アセトン・ブタノール発酵、乳酸発酵、コハク酸発酵、イタコン酸発酵、アミノ酸発酵等の発酵処理が好適に例示される。これらの発酵処理に使用される微生物や発酵処理条件は公知である。 Here, the fermentation treatment is preferably a fermentation treatment from which a fermentation product containing a useful substance can be obtained. For example, ethanol fermentation, methane fermentation, hydrogen fermentation, acetone / butanol fermentation, lactic acid fermentation, succinic acid fermentation, itaconic acid A fermentation process such as fermentation and amino acid fermentation is preferably exemplified. The microorganisms and fermentation treatment conditions used for these fermentation treatments are known.
また、当該発酵処理は、上記糖化処理の後に実施してもよく、また上記糖化処理と同時に実施してもよい。後者の発酵処理と糖化処理を同時に実施する方法については、糖化処理に要する酵素と、発酵処理に要する微生物を共存させて、該酵素と微生物の双方が有効に作用若しくは生育できる条件に設定してインキュベートすることにより実施される。 Moreover, the said fermentation process may be implemented after the said saccharification process, and may be implemented simultaneously with the said saccharification process. Regarding the method of performing the latter fermentation treatment and saccharification treatment at the same time, the enzyme required for the saccharification treatment and the microorganism required for the fermentation treatment are allowed to coexist, and the conditions are set so that both the enzyme and the microorganism can effectively act or grow. This is done by incubating.
本発明の白色腐朽菌を用いてリグノセルロースを分解することによって、リグノセルロース中の多糖が高い糖化率で酵素糖化されるようになるので、リグノセルロースを有用物質の生産のための原料として有効利用することができる。従って、本発明の白色腐朽菌を使用することによって、リグノセルロース中の多糖の糖化や発酵処理を効率的に実施することが可能になる。 By decomposing lignocellulose using the white rot fungus of the present invention, polysaccharides in lignocellulose are enzymatically saccharified at a high saccharification rate, so that lignocellulose can be effectively used as a raw material for the production of useful substances. can do. Therefore, by using the white rot fungus of the present invention, it becomes possible to efficiently carry out the saccharification and fermentation treatment of the polysaccharide in lignocellulose.
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ SK M2102株のスクリーニングとリグノセルロースの分解処理効果の検証
日本国内の生育樹木、倒木、落葉又は材木等が多く存在する環境から採取した子実体、及び木、枝又は葉に付着した糸状菌を候補菌株として、まず第１次スクリーニングを行って、リグニン分解作用が比較的強い２５菌株を選択した。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, this invention is not limited to these Examples.
Example 1 Screening of SK M2102 strain and verification of lignocellulose decomposition treatment Fruit bodies collected from an environment where there are many growing trees, fallen trees, fallen leaves, timbers, etc. in Japan, and filaments attached to trees, branches or leaves First, a primary screening was performed using 25 bacteria as candidate strains, and 25 strains having a relatively strong lignin degradation action were selected.
なお、選択された２５菌株にブナ木材中のリグニンを分解する作用があることの確認は、木材中リグニン含量を調べ、その減少によって評価した。測定方法はセルロースが硫酸により加水分解されて溶解しリグニンが残ることを利用し測定するKlasonリグニン法であり、その操作は以下の通りとした。 In addition, confirmation that 25 selected strains have the effect | action which decomposes | disassembles the lignin in beech wood examined the lignin content in wood, and evaluated it by the reduction | decrease. The measuring method is a Klason lignin method in which cellulose is hydrolyzed and dissolved by sulfuric acid and lignin is left, and the operation is as follows.
木材０．３５ｇ程度を正確に秤量し、これに７２％濃度の硫酸を４．５ｍｌ加え、ガラス棒で十分になじませた後、２．５時間撹拌しながら反応させ、更に蒸留水１７１ｍｌを加えて希硫酸中に懸濁状態としてオートクレーブで熱反応（121℃, 30 min）を行った。放冷後に、溶液に残る褐色の浮遊物がリグニン（Klasonリグニンあるいは硫酸リグニン）であり、ガラスフィルター（GA-100, φ45 mm）上に吸引ろ過と熱水での洗い込みを行ってリグニンを回収した。次いで、リグニンを含むフィルターを乾燥し（105℃、16 hr）正確な重量を測定した。木材に微生物を成育させなかった試料を対照として、スクリーニングによって得られた菌株のリグニン分解が確認された。 About 0.35 g of wood is accurately weighed, 4.5 ml of 72% sulfuric acid is added to this, and after thoroughly blending with a glass rod, the mixture is allowed to react with stirring for 2.5 hours, and further 171 ml of distilled water is added. The mixture was suspended in dilute sulfuric acid and subjected to a thermal reaction (121 ° C, 30 min) in an autoclave. After standing to cool, the brown floating substance remaining in the solution is lignin (Klason lignin or sulfate lignin), and the lignin is recovered by suction filtration and washing with hot water on a glass filter (GA-100, φ45 mm). did. The filter containing lignin was then dried (105 ° C., 16 hr) and the exact weight was measured. The lignin degradation of the strain obtained by screening was confirmed using a sample in which microorganisms were not grown on wood as a control.
次に、１次選抜した２５菌株を用いてスギ材チップ（長さ１０〜３０ｍｍ、縦２〜８ｍｍ、横５〜２０ｍｍ）を４又は８週間腐朽させ、腐朽材を小型ミルで2分間粉砕して、粉砕物のセルラーゼによる酵素糖化率を測定した。具体的には、まず、C. subvermispora ATCC90467及び１次選抜した２５菌株をポテトデキストロース寒天(PDA)培地上で、25℃で1週間前培養した。これとは別に、スギ材チップ5.5gに小麦フスマ0.5gと蒸留水16.5mlを、300ml容三角フラスコに入れ、よく混合した後シリコ栓をし、120℃で20分間オートクレーブしてスギ材チップ培地を調製した。C. subvermispora ATCC90467及び１次選抜した２５菌株の前培養物からコルクボーラーでペレットをそれぞれ４個打ち抜き、それをスギ材チップ培地に植菌し、28℃、湿度70％で４〜８週間培養して、スギ材チップを腐朽させて腐朽木材サンプルを得た。 Next, cedar chips (length: 10-30 mm, length: 2-8 mm, width: 5-20 mm) are decayed for 4 or 8 weeks using the 25 selected strains, and the decayed material is pulverized for 2 minutes in a small mill. Then, the enzymatic saccharification rate by cellulase of the pulverized product was measured. Specifically, first, C. subvermispora ATCC90467 and the first 25 selected strains were pre-cultured on potato dextrose agar (PDA) medium at 25 ° C. for 1 week. Separately, add 5.5 g of wheat bran and 16.5 ml of distilled water to 5.5 g of cedar wood chips, put them in a 300 ml Erlenmeyer flask, mix well, then plug them into silico stoppers and autoclave them at 120 ° C. for 20 minutes. Was prepared. C. subvermispora ATCC90467 and the primary selection of 25 strains, 4 pellets were punched with a cork borer, inoculated into cedar chip medium, and cultured at 28 ° C and 70% humidity for 4-8 weeks. The cedar wood chips were decayed to obtain a decayed wood sample.
次いで得られた腐朽木材サンプルを酵素糖化処理して、各腐朽木材サンプルの酵素糖化率を測定した。なお、酵素糖化率の測定は、100 mlメディウム瓶に、50 mM酢酸ナトリウムバッファー(pH 5)、乾燥重量0.4 gの腐朽木材サンプル、及び40 FPU(濾紙崩壊活性；Filter Paper Unit)/g-腐朽木材サンプルの濃度メイセラーゼ（明治製菓株式会社製）を含む反応液中で実施した。なお、腐朽木材サンプル中の含水量も考慮にいれて添加する酢酸ナトリウムバッファーの量を調整し、反応液を20 mlとし、更に抗菌剤として200 μlの2%アジ化ナトリウムを加えた。反応はシェーカーを用い、170 rpm、45℃で96時間行った。96時間後、10分間の煮沸で反応を停止させ、遠心分離して得た上清中の還元糖をソモギネルソン法で定量した。 Subsequently, the obtained decayed wood sample was subjected to enzymatic saccharification treatment, and the enzymatic saccharification rate of each decayed wood sample was measured. The enzyme saccharification rate was measured in a 100 ml medium bottle, 50 mM sodium acetate buffer (pH 5), decayed wood sample with a dry weight of 0.4 g, and 40 FPU (Filter Paper Unit) / g-decay. It carried out in the reaction liquid containing the density | concentration mecellase (made by Meiji Seika Co., Ltd.) of the wood sample. The amount of sodium acetate buffer to be added was adjusted in consideration of the water content in the rotten wood sample, the reaction solution was adjusted to 20 ml, and 200 μl of 2% sodium azide was added as an antibacterial agent. The reaction was carried out using a shaker at 170 rpm and 45 ° C. for 96 hours. After 96 hours, the reaction was stopped by boiling for 10 minutes, and the reducing sugar in the supernatant obtained by centrifugation was quantified by the Somoginelson method.
このように酵素糖化率を測定して、各腐朽木材サンプルの中で、最も高い酵素糖化率を示す腐朽木材サンプルの菌株として、SK M2102株を選択した。このSK M2102株の腐朽木材サンプルは、従来知られている最も優秀なバイオパルピング菌C. subvermisporaの腐朽木材サンプルを凌駕する酵素糖化率を示した。図1には、SK M2102株の腐朽木材サンプルと、C. subvermisporaの腐朽木材サンプルの酵素糖化率を測定した結果を示す。 The enzyme saccharification rate was measured as described above, and SK M2102 strain was selected as a strain of the decayed wood sample exhibiting the highest enzyme saccharification rate among the respective decayed wood samples. The SK M2102 strain of decayed wood samples showed an enzymatic saccharification rate that surpassed that of the best known biopulping fungus C. subvermispora . FIG. 1 shows the results of measuring the enzymatic saccharification rate of a decayed wood sample of SK M2102 strain and a decayed wood sample of C. subvermispora .
実施例２ 白色腐朽菌の培養によるスギ材の成分変化の検証
C. subvermispora ATCC90467および新規株（SK M2102株）をポテトデキストロース寒天(PDA)プレート上に、25℃で1週間前培養した。これとは別に、スギ材チップ55gに小麦フスマ5.5gと蒸留水165mlをオートクレーブ可能な滅菌フィルター付き菌床椎茸栽培用の袋NTキノバック(日昌(株))に入れ、よく混合した後、120℃で20分間オートクレーブしてスギ材チップ培地を調製した。冷却後、C. subvermispora ATCC90467及び新規株（SK M2102株）の前培養物からコルクボーラーでペレットをそれぞれ10個打ち抜き、それをスギ材チップ培地に植菌し、28℃、湿度70％で４〜８週間培養した。
Example 2 Verification of component changes in cedar wood by culturing white rot fungi
C. subvermispora ATCC90467 and a new strain (SK M2102 strain) were pre-cultured on potato dextrose agar (PDA) plates at 25 ° C. for 1 week. Separately, 55 g of cedar wood chips and 5.5 g of wheat bran and 165 ml of distilled water are placed in a bag NT kinobac (Nissho Co., Ltd.) with a sterile filter that can be autoclaved and mixed well. A cedar chip medium was prepared by autoclaving at 20 ° C. for 20 minutes. After cooling, 10 pellets were punched out with a cork borer from the pre-culture of C. subvermispora ATCC90467 and a new strain (SK M2102 strain), inoculated into cedar chip medium, and 4 ~ at 28 ° C and 70% humidity. Cultured for 8 weeks.
図２に白色腐朽菌によりスギ材を４週間腐朽させた際の重量減少率を示す。新規単離株（SK M2102株）は、C. subvermisporaに比較し、腐朽に伴う木材の重量減少率が小さいため、バイオマス変換に適していることが分かった。また、培養後のスギ材チップのホロセルロース、α-セルロース含量を測定した結果、図３及び４に示すように新規株（SK M2102株）は、C. subvermisporaに比較して、ホロセルロース及びα-セルロースの残存量が高いことが明らかとなった。これは白色腐朽菌処理後に発酵に利用できる糖が多く残存していることを示し、新規株（SK M2102株）は、木材（リグノセルロース）の糖化の前処理に好適な性質を備えていると結論された。リグニン含量の残存率に関しては、4週間の培養では新規株（SK M2102株）は、C. subvermisporaと同等、8週間では、新規株（SK M2102株）の方が残存率がやや高い結果となった（図５参照）。リグニンの利用を考えた時、酵素糖化率が同じであれば、リグニン残存率は高いことは好ましいと考えられ、新規株（SK M2102株）はリグニンの利用にも適する株と結論される。 FIG. 2 shows the weight reduction rate when the cedar wood was rotted for 4 weeks with white rot fungi. The new isolate (SK M2102 strain) was found to be suitable for biomass conversion because the weight reduction rate of wood due to decay was small compared to C. subvermispora . Moreover, as a result of measuring the holocellulose and α-cellulose contents of the cedar wood chips after the culture, as shown in FIGS. 3 and 4, the new strain (SK M2102 strain) was found to have holocellulose and α as compared with C. subvermispora . -It became clear that the residual amount of cellulose was high. This indicates that a lot of sugar that can be used for fermentation remains after the treatment with white rot fungus, and that the new strain (SK M2102 strain) has suitable properties for pretreatment of saccharification of wood (lignocellulose). It was concluded. For the residual ratio of lignin content, the novel strain (SK M2102 strain) at 4 weeks of culture, C. Subvermispora equivalent, in 8 weeks, a slightly higher results residual ratio newer strain (SK M2102 strain) (See FIG. 5). When the use of lignin is considered, if the enzyme saccharification rate is the same, it is considered that a high lignin residual rate is preferable, and it is concluded that the new strain (SK M2102 strain) is also suitable for the use of lignin.
実施例３ 新規株による木材前処理が及ぼす酵素糖化率への影響−１
C. subvermispora ATCC90467及び新規株（SK M2102株）をポテトデキストロース寒天(PDA)プレート上で、25℃で10〜14日間前培養した。これとは別に、スギ材チップ55gに小麦フスマ5.5gと蒸留水165mlをオートクレーブ可能な滅菌フィルター付き菌床椎茸栽培用の袋NTキノバック(日昌(株))に入れ、よく混合した後、120℃で20分間オートクレーブして、スギ材チップ培地を調製した。C. subvermispora ATCC90467及び新規株（SK M2102株）の前培養物からコルクボーラーでペレットをそれぞれ10個打ち抜き、それをスギ材チップ培地に植菌し、28℃、湿度70％で4〜8週間培養して、腐朽チップ（培養物）を得た。
Example 3 Influence of Enzyme Saccharification Rate by Wood Pretreatment with New Strains-1
C. subvermispora ATCC90467 and a new strain (SK M2102 strain) were pre-cultured on potato dextrose agar (PDA) plates at 25 ° C. for 10-14 days. Separately, 55 g of cedar wood chips and 5.5 g of wheat bran and 165 ml of distilled water are placed in a bag NT kinobac (Nissho Co., Ltd.) with a sterile filter that can be autoclaved and mixed well. A cedar wood chip medium was prepared by autoclaving at 20 ° C. for 20 minutes. C. subvermispora ATCC90467 and a new strain (SK M2102 strain) pre-cultured 10 pellets each with a cork borer, inoculated into cedar chip medium, and cultured at 28 ° C and 70% humidity for 4-8 weeks Thus, a decayed chip (culture) was obtained.
ステンレス製オートクレーブに、培養により得られた腐朽チップ(乾燥重量15 g)と60% (v/v) エタノール水(90 g)を加え、200℃、1時間加熱し、エタノリシス反応を行った。エタノール水の濃度は、腐朽チップに元々含有している水分も考慮にいれて計算した。反応後、オートクレーブを氷水中で直ちに冷却した。次いで、エタノリシス反応後に残存する不溶性画分（以下、パルプと表記する）を、ろ紙(Whatmann No.4)で分離した。分離したパルプをジューサーに入れ、250 mlの50%エタノール水中で4分間解繊した。この繊維は150 mlの50%エタノール水で3回、その後、300 mlの蒸留水で2回洗浄し、パルプ画分として酵素糖化試験に供した。パルプ画分の酵素糖化試験は、100 mlメディウム瓶に、50 mM酢酸ナトリウムバッファー(pH 5)、乾燥重量0.4 gのパルプ及び40 FPU/g−pulpの濃度のメイセラーゼ（明治製菓株式会社製）を含む反応液中で実施した。なお、腐朽木材サンプル中の含水量も考慮にいれて添加する酢酸ナトリウムバッファーの量を調整し、反応液を20 mlとし、更に抗菌剤として200 μlの2%アジ化ナトリウムを加えた。反応はシェーカーにおいて、170 rpm、45℃で96時間行った。96時間後、10分間の煮沸で反応を停止させ、遠心分離して得た上清中の還元糖をソモギネルソン法で定量した。その結果を図６に示す。その結果、新規株（SK M2102株）を培養したスギ材チップは、C. subvermisporaで培養した場合に比して優れた酵素糖化率を示すことが明らかとなった。 To a stainless steel autoclave, decayed chips (dry weight 15 g) obtained by culture and 60% (v / v) ethanol water (90 g) were added and heated at 200 ° C. for 1 hour to perform an ethanolysis reaction. The ethanol water concentration was calculated taking into account the water originally contained in the decayed chips. After the reaction, the autoclave was immediately cooled in ice water. Next, the insoluble fraction (hereinafter referred to as pulp) remaining after the ethanolysis reaction was separated with a filter paper (Whatmann No. 4). The separated pulp was put into a juicer and defibrated for 4 minutes in 250 ml of 50% ethanol water. This fiber was washed three times with 150 ml of 50% ethanol water and then twice with 300 ml of distilled water, and subjected to an enzymatic saccharification test as a pulp fraction. The enzymatic saccharification test of the pulp fraction was carried out with 100 mM medium bottle, 50 mM sodium acetate buffer (pH 5), pulp with a dry weight of 0.4 g, and Meicelase (Meiji Seika Co., Ltd.) with a concentration of 40 FPU / g-pulp. It carried out in the reaction liquid containing. The amount of sodium acetate buffer to be added was adjusted in consideration of the water content in the rotten wood sample, the reaction solution was adjusted to 20 ml, and 200 μl of 2% sodium azide was added as an antibacterial agent. The reaction was carried out on a shaker at 170 rpm and 45 ° C. for 96 hours. After 96 hours, the reaction was stopped by boiling for 10 minutes, and the reducing sugar in the supernatant obtained by centrifugation was quantified by the Somoginelson method. The result is shown in FIG. As a result, it was clarified that the cedar wood chip in which the new strain (SK M2102 strain) was cultured showed an enzyme saccharification rate superior to that in the case of C. subvermispora .
実施例４ 新規株による木材前処理が及ぼす酵素糖化率への影響−２
C. subvermispora ATCC90467及び新規株（SK M2102株）をポテトデキストロース寒天(PDA)プレート上で、25℃で10〜14日間前培養した。これとは別に、スギ材チップ55gに小麦フスマ5.5gと蒸留水165mlをオートクレーブ可能な滅菌フィルター付き菌床椎茸栽培用の袋NTキノバック(日昌(株))に入れ、よく混合した後、120℃で20分間オートクレーブして、スギ材チップ培地を調製した。C. subvermispora ATCC90467及び新規株（SK M2102株）の前培養物からコルクボーラーでペレットをそれぞれ10個打ち抜き、それをスギ材チップ培地に植菌し、28℃、湿度70％で4〜8週間培養して、腐朽チップ（培養物）を得た。
Example 4 Effect of Enzyme Saccharification Rate on Wood Pretreatment with New Strains-2
C. subvermispora ATCC90467 and a new strain (SK M2102 strain) were pre-cultured on potato dextrose agar (PDA) plates at 25 ° C. for 10-14 days. Separately, 55 g of cedar wood chips and 5.5 g of wheat bran and 165 ml of distilled water are placed in a bag NT kinobac (Nissho Co., Ltd.) with a sterile filter that can be autoclaved and mixed well. A cedar wood chip medium was prepared by autoclaving at 20 ° C. for 20 minutes. C. subvermispora ATCC90467 and a new strain (SK M2102 strain) pre-cultured 10 pellets each with a cork borer, inoculated into cedar chip medium, and cultured at 28 ° C and 70% humidity for 4-8 weeks Thus, a decayed chip (culture) was obtained.
培養後の腐朽チップ（乾燥重量3 g）を試験管に入れ、これに36 gの溶媒（エチレングリコール／酢酸／水＝72/14/14）を加えた。これをマイクロ波照射装置の照射フード内に静置し、2.45 GHzのマイクロ波を入射電力0.6 kWで照射し、試料温度220℃まで昇温後、入射電力を0.3から0.4 kWの間で調節しながら5分間220℃に保持した。5分保持後直ちに照射を止め、照射フード外側の防爆容器内に常温空気をポンプで通気し、空冷した。試料温度が80℃以下になった時点で照射フード内の圧力を徐々に下げ、常圧にし、試料を取り出した。溶媒とチップをろ過で分離した。腐朽チップは100 mlの50%エタノールを加えてミルにかけ、4分間の解繊処理を行った。ろ過で繊維分を取り出してパルプ画分とし、これを酵素糖化試験に供した。パルプ画分の酵素糖化試験は、100 mlメディウム瓶に、10 mlの50 mM酢酸ナトリウムバッファー(pH 5)に、乾燥重量0.2gのパルプを分散させ、更に40 FPU/g−pulpのメイセラーゼ添加して、45℃で96時間、170 rpmの振盪をしながら行った。96時間後、10分間煮沸して反応を停止させ、遠心分離した上清中の還元糖量をソモギネルソン法で定量した。 The decayed chips after culture (dry weight 3 g) were placed in a test tube, and 36 g of solvent (ethylene glycol / acetic acid / water = 72/14/14) was added thereto. Place this in the irradiation hood of the microwave irradiation device, irradiate a 2.45 GHz microwave with an incident power of 0.6 kW, raise the sample temperature to 220 ° C, and then adjust the incident power between 0.3 and 0.4 kW. While maintaining at 220 ° C. for 5 minutes. Immediately after holding for 5 minutes, the irradiation was stopped, and air at room temperature was blown into the explosion-proof container outside the irradiation hood with a pump to cool it down. When the sample temperature became 80 ° C. or lower, the pressure in the irradiation hood was gradually lowered to normal pressure, and the sample was taken out. Solvent and chip were separated by filtration. The decayed chips were milled after adding 100 ml of 50% ethanol and defibrated for 4 minutes. The fiber was removed by filtration to obtain a pulp fraction, which was subjected to an enzymatic saccharification test. The enzymatic saccharification test of the pulp fraction was carried out by dispersing 0.2 g of dry weight pulp in 10 ml of 50 mM sodium acetate buffer (pH 5) in a 100 ml medium bottle, and adding 40 FPU / g-pulp of Mecelase. At 45 ° C. for 96 hours with 170 rpm shaking. After 96 hours, the reaction was stopped by boiling for 10 minutes, and the amount of reducing sugar in the centrifuged supernatant was quantified by the Somoginelson method.
得られた結果を図７に示す。この結果、新規株（SK M2102株）は、酵素糖化を促進し、その酵素糖化率は、93.5%に達した。これに対し、C. subvermisporaでは、大きな糖化促進効果は認められなかった。 The obtained results are shown in FIG. As a result, the new strain (SK M2102 strain) promoted enzymatic saccharification, and the enzymatic saccharification rate reached 93.5%. In contrast, C. subvermispora did not show a significant saccharification promoting effect.
実施例５ 新規株による木材前処理が及ぼすエタノール発酵への影響
C. subvermispora ATCC90467及び新規株（SK M2102株）をポテトデキストロース寒天(PDA)プレート上で、25℃で10〜14日間前培養した。これとは別に、スギ材チップ55gに小麦フスマ5.5gと蒸留水165mlをオートクレーブ可能な滅菌フィルター付き菌床椎茸栽培用の袋NTキノバック(日昌(株))に入れ、よく混合した後、120℃で20分間オートクレーブして、スギ材チップ培地を調製した。C. subvermispora ATCC90467及び新規株（SK M2102株）の前培養物からコルクボーラーでペレットをそれぞれ10個打ち抜き、それをスギ材チップ培地に植菌し、28℃、湿度70％で4〜8週間培養して、腐朽チップ（培養物）を得た。
Example 5 Effect of wood pretreatment with new strain on ethanol fermentation
C. subvermispora ATCC90467 and a new strain (SK M2102 strain) were pre-cultured on potato dextrose agar (PDA) plates at 25 ° C. for 10-14 days. Separately, 55 g of cedar wood chips and 5.5 g of wheat bran and 165 ml of distilled water are placed in a bag NT kinobac (Nissho Co., Ltd.) with a sterile filter that can be autoclaved and mixed well. A cedar wood chip medium was prepared by autoclaving at 20 ° C. for 20 minutes. C. subvermispora ATCC90467 and a new strain (SK M2102 strain) pre-cultured 10 pellets each with a cork borer, inoculated into cedar chip medium, and cultured at 28 ° C and 70% humidity for 4-8 weeks Thus, a decayed chip (culture) was obtained.
ステンレス製オートクレーブに、培養後の腐朽チップ(乾燥重量15 g)と60% (v/v) エタノール水(90 g)を加え、200℃、1時間加熱し、エタノリシス反応を行った。エタノール水の濃度は、腐朽材に元々含有している水分も考慮にいれて計算した。反応後、オートクレーブを氷水中で直ちに冷却した。次いで、エタノリシス反応後に残存する不溶性画分（以下、パルプと表記する）を、ろ紙(Whatmann No.4)で分離した。分離したパルプをジューサーに入れ、250 mlの50%エタノール水中で4分間解繊した。この繊維は150 mlの50%エタノール水で3回、その後300 mlの蒸留水で2回洗浄し、パルプ画分としてエタノール発酵試験に供した。 To the stainless steel autoclave, the decayed chips after cultivation (dry weight 15 g) and 60% (v / v) ethanol water (90 g) were added and heated at 200 ° C. for 1 hour to perform an ethanolysis reaction. The concentration of ethanol water was calculated taking into account the water originally contained in the decayed wood. After the reaction, the autoclave was immediately cooled in ice water. Next, the insoluble fraction (hereinafter referred to as pulp) remaining after the ethanolysis reaction was separated with a filter paper (Whatmann No. 4). The separated pulp was put into a juicer and defibrated for 4 minutes in 250 ml of 50% ethanol water. This fiber was washed three times with 150 ml of 50% ethanol water and then twice with 300 ml of distilled water, and subjected to an ethanol fermentation test as a pulp fraction.
パルプ画分のエタノール発酵は併行複発酵法で、メイセラーゼ(40 FPU/g-pulp)と酵母Saccharomyces cerevisiae AM12を用い、微嫌気条件下クエン酸緩衝液(pH 5.0)中、35℃でパルプ画分（基質）濃度50g/lで72時間培養した。エタノールの定量は、ガスクロマトグラフィーを用いた。 The ethanol fermentation of the pulp fraction is a parallel double fermentation method, using mecelase (40 FPU / g-pulp) and yeast Saccharomyces cerevisiae AM12, and the pulp fraction at 35 ° C in citrate buffer (pH 5.0) under slightly anaerobic conditions. (Substrate) The cells were cultured at a concentration of 50 g / l for 72 hours. Ethanol was quantified using gas chromatography.
得られた結果を図８に示す。この結果、新規株（SK M2102株）は、木材の酵素糖化率の上昇のみでなく、酵素糖化後のエタノール発酵に対しても高い促進効果を示すことが明らかとなった。 The obtained result is shown in FIG. As a result, it has been clarified that the new strain (SK M2102 strain) shows not only an increase in the enzymatic saccharification rate of wood but also a high promoting effect on ethanol fermentation after enzymatic saccharification.
実施例６ 新規株（SK M2102株）のリボソーム配列シーケンス
実施例１で得られた新規株（SK M2102株）のリボソーム配列を以下のようにシーケンスし、データベースに登録された配列との相同性検索を行った。
Example 6 Ribosome Sequence Sequence of New Strain (SK M2102 Strain) The ribosome sequence of the new strain (SK M2102 strain) obtained in Example 1 is sequenced as follows, and homology search with sequences registered in the database is performed. Went.
菌株はＰＤＡ培地で静置条件２８℃にて生育させ、その糸状の生育部分の一部を先細ピンセットにより１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、−２０℃での凍結および融解処理を行った後、ＤＮＡ抽出キット（Dneasy Plant Mini、QIAGEN社製）を用いてＰＣＲ用鋳型DNAの抽出を行った。抽出したＤＮＡを鋳型として１８Ｓ ｒＤＮＡのＰＣＲを行った。プライマーは１８Ｓ ｒＤＮＡを増幅させるためのプライマーのE21f（5'-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'）及びE1778r（5'-AATGATCCTTCCGCAGGTTC-3'）を用い、RoboCycler Gradient 96 with Hot Top（Stratagene社）を使用して以下のＰＣＲ反応サイクルを行った。反応条件は、プレヒート：９８℃、２分、反応サイクル：変性９８℃、３０秒、アニーリング６３／５８℃、３０秒、伸張７４℃、４０秒、３５サイクル反応後、７４℃の伸長反応を１２０秒行った。 The strain was grown on a PDA medium at 28 ° C. under static conditions, and a part of the filamentous growth portion was transferred to a 1.5 mL Eppendorf tube with a tapered tweezers and subjected to freezing and thawing at −20 ° C. The template DNA for PCR was extracted using a DNA extraction kit (Dneasy Plant Mini, manufactured by QIAGEN). PCR of 18S rDNA was performed using the extracted DNA as a template. Primers used were E21f (5'-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3 ') and E1778r (5'-AATGATCCTTCCGCAGGTTC-3') for amplifying 18S rDNA, and using RoboCycler Gradient 96 with Hot Top (Stratagene) The PCR reaction cycle was performed. The reaction conditions are preheat: 98 ° C., 2 minutes, reaction cycle: denaturation 98 ° C., 30 seconds, annealing 63/58 ° C., 30 seconds, extension 74 ° C., 40 seconds, 35 cycles, and then 74 ° C. extension reaction is 120 Went for a second.
ＰＣＲにより増幅した予想サイズ約１８００ｂｐのＤＮＡ断片は、スピンカラム法（QIAquick PCR Purification Kit、ＱIAGEN社）を用いて精製し、精製ＤＮＡを鋳型としてＡＢＩ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法によりＰＣＲを行い、ＰＣＲ生成物をABI PRISM 3100 16キャピラリーシステム（Applied Biosystems社）を用いてシーケンスをおこなった。この結果、配列番号１に示す塩基配列が新規株（SK M210２株）の18SrRNAの配列として同定された。 A DNA fragment having an expected size of about 1800 bp amplified by PCR is purified using a spin column method (QIAquick PCR Purification Kit, QIAGEN), and PCR is performed using the purified DNA as a template by the ABI Big Dye Terminator method. Sequencing was performed using an ABI PRISM 3100 16 capillary system (Applied Biosystems). As a result, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 was identified as the 18S rRNA sequence of the new strain (SK M2102 strain).
得られた配列について、DDBJ（DNA Data Bank of Japan）がWWW上で提供する相同性検索システムＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行った。相同性検索の結果、新規株（SK M210２株）の１８Ｓ ｒＤＮＡの配列に最も相同性の高いものは、Fomitiporia mediterranea（９８．３％）、Inonotuslinteus（９８．２％）、Fibricium rude（９８．２％）、Inonotus baumii（９８．１％）であったことから、担子菌類の一種であることが明らかとなった。 The obtained sequences were subjected to homology search using a homology search system BLAST provided by DDBJ (DNA Data Bank of Japan) on the WWW. As a result of the homology search, those having the highest homology to the 18S rDNA sequence of the new strain (SK M2102 strain) are Fomitiporia mediterranea (98.3%) , Inonotuslinteus (98.2%), Fibricium rude (98.2). %) And Inonotus baumii (98.1%), it became clear that it is a kind of basidiomycete.
実施例７ 新規株（SK M2102株）の性質：バーベンダム反応
新規株（SK M2102株）が白色腐朽菌であることを検証するために、以下の方法に従ってバーベンダム反応を実施した。
Example 7 Properties of New Strain (SK M2102 Strain): Barben Dam Reaction In order to verify that the new strain (SK M2102 strain) is a white rot fungus, a Barben dam reaction was performed according to the following method.
ポリデキストロース寒天 (PDA)0.78g、グアイアコール20μl、蒸留水20mlを混合・加熱後冷却して、グアイアコールを含むPDAプレートを作成した。同様に、ポリデキストロース寒天(PDA)0.78g、没食子酸25μg、蒸留水20mlを混合・加熱後冷却して、没食子酸を含むPDAプレートを作成した。PDAプレート上で6日間前培養した新規株（SK M2102株）とC. subvermispora ATCC90467からコルクボーラーでペレットを打ち抜き、それをグアイアコール又は没食子酸を含むPDAプレートに植菌し、25℃で菌の生育とプレートの色の変化を観察した。
Polydextrose agar (PDA) 0.78 g,
その結果、新規株（SK M2102株）では、培養が進につれてグアイアコールの酸化によりプレートが紫色に変化した、また、没食子酸でも、酸化による茶色の呈色が次第に強くなり、どちらの培地でも、10日目には強い色素の着色帯が観察された。一方、C. subvermispora ATCC90467では、没食子酸による茶色の呈色は観察されたが、グアイアコールを含む培地では、生育阻害のために、菌糸がほとんど生育せず、色素の酸化帯は観察されなかった。以上の結果から、新規株（SK M2102株）は、バーベンダム反応に陽性であり、白色腐朽菌としての特徴を備えていることが明らかとなった。 As a result, in the new strain (SK M2102 strain), the plate turned purple due to the oxidation of guaiacol as the culture progressed, and the brown coloration due to oxidation gradually increased with gallic acid. A strong pigmented band was observed on the day. On the other hand, in C. subvermispora ATCC90467, brown coloration due to gallic acid was observed, but in the medium containing guaiacol, mycelia hardly grew and no oxidation band of pigment was observed due to growth inhibition. From the above results, it was revealed that the new strain (SK M2102 strain) is positive for the Babendam reaction and has characteristics as a white-rot fungus.
実施例８ 新規株（SK M2102株）の性質：リグニン分解酵素とセルラーゼの生産
新規株（SK M2102株）によるリグニン分解酵素とセルラーゼの生産プロファイルを以下の方法に従って調べた。
Example 8 Properties of New Strain (SK M2102 Strain): Production of Lignin-Degrading Enzyme and Cellulase Production profiles of lignin-degrading enzyme and cellulase by the new strain (SK M2102 strain) were examined according to the following method.
新規株（SK M2102株）をポテトデキストロース寒天(PDA)プレート上で、25℃で1週間前培養した。また、300 ml三角フラスコにスギ材チップ5gに小麦フスマ0.5gと蒸留水15mlを入れ、よく混合した後、120℃で20分間オートクレーブして、スギ材チップ培地を調製した。新規株（SK M2102株）の前培養物からコルクボーラーでペレットをそれぞれ4個打ち抜き、それをスギ材チップ培地に植菌し、28℃、湿度75％で培養した。培養開始後経時的にサンプリングを行い、培地中の菌体外酵素を80分間減圧下で抽出濾過し、リグニン分解酵素とセルラーゼの活性を測定した。具体的には、リグニンペルオキシダーゼ、べラトリアルコールオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、マンガン非依存性ペルオキシダーゼ、ラッカーゼは3日毎に、エキソ-1,4-β-グルカナーゼ、エンド-1,4-β-グルカナーゼ、β-グルコシダーゼは６日毎に活性を測定した。 A new strain (SK M2102 strain) was pre-cultured on a potato dextrose agar (PDA) plate at 25 ° C. for 1 week. Further, 0.5 g of wheat bran and 15 ml of distilled water were added to 5 g of cedar chips in a 300 ml Erlenmeyer flask and mixed well, and then autoclaved at 120 ° C. for 20 minutes to prepare a cedar chip medium. Four pellets were punched from a preculture of a new strain (SK M2102 strain) with a cork borer, inoculated into a cedar chip medium, and cultured at 28 ° C. and 75% humidity. Sampling was performed over time after the start of culture, and extracellular enzymes in the medium were extracted and filtered under reduced pressure for 80 minutes, and the activities of lignin-degrading enzyme and cellulase were measured. Specifically, lignin peroxidase, beratrialcohol oxidase, manganese peroxidase, manganese-independent peroxidase, laccase every 3 days, exo-1,4-β-glucanase, endo-1,4-β-glucanase, β- The activity of glucosidase was measured every 6 days.
リグニンペルオキシダーゼ(LiP)活性は、ベラトリルアルコールを基質とし、過酸化水素に依存して生成するベラトルムアルデヒドを310nmで定量した。べラトリアルコールオキシダーゼ(VAO)活性は、同様にベラトリルアルコールを基質とし、過酸化水素非存在下で生成するベラトルムアルデヒドを310nmで定量した。マンガンペルオキシダーゼ(MnP)活性、マンガン非依存性ペルオキシダーゼ(MiP)活性、ラッカーゼ活性は、2,6-ジメトキシフェノールを基質として測定した。ラッカーゼ(Lac)活性は、過酸化水素及びマンガンを含まない条件で菌体外酵素によって直接基質が酸化される活性とした。マンガン非依存性ペルオキシダーゼ(MiP)活性は、マンガン非存在下過酸化水素存在下で基質が酸化される活性からラッカーゼ(Lac)活性を差し引いた活性とした。マンガンペルオキシダーゼ(MnP)活性は、マンガンおよび過酸化水素存在下で基質が酸化される活性からマンガン非依存性ペルオキシダーゼ(MiP)活性とラッカーゼ(Lac)活性を差し引いた活性とした。これらの活性は、25mMの酒石酸緩衝液(pH3.0とpH5.0)中で測定した。 The lignin peroxidase (LiP) activity was determined at 310 nm by using veratryl alcohol as a substrate and veratraldehyde produced depending on hydrogen peroxide at 310 nm. As for the beratrialcohol oxidase (VAO) activity, veratraldehyde produced in the absence of hydrogen peroxide was quantified at 310 nm, similarly using veratryl alcohol as a substrate. Manganese peroxidase (MnP) activity, manganese-independent peroxidase (MiP) activity, and laccase activity were measured using 2,6-dimethoxyphenol as a substrate. The laccase (Lac) activity was defined as an activity in which a substrate was directly oxidized by an extracellular enzyme under conditions that did not contain hydrogen peroxide and manganese. Manganese-independent peroxidase (MiP) activity was defined as activity obtained by subtracting laccase (Lac) activity from the activity of oxidizing a substrate in the presence of hydrogen peroxide in the absence of manganese. Manganese peroxidase (MnP) activity was defined as activity obtained by subtracting manganese-independent peroxidase (MiP) activity and laccase (Lac) activity from the activity of oxidizing a substrate in the presence of manganese and hydrogen peroxide. These activities were measured in 25 mM tartrate buffer (pH 3.0 and pH 5.0).
エキソ-1,4-β-グルカナーゼ活性とβ-グルコシダーゼ活性は、p-Nitrophenyl β-D-cellobioside(PNPC)とp-Nitrophenyl β-D-glucosideをそれぞれ基質とし、酵素反応により生成するp-ニトロフェノールを定量することにより測定した。これらの活性は、20mMの酢酸緩衝液(pH3.0とpH5.0)中で測定した。エンド1,4-β-グルカナーゼ活性は、0.5％CM-セルロースを基質とし、37℃10分間の反応で生成する還元糖量をソモギネルソン法により測定した。
Exo-1,4-β-glucanase activity and β-glucosidase activity are p-nitrogen produced by enzymatic reaction using p-Nitrophenyl β-D-cellobioside (PNPC) and p-Nitrophenyl β-D-glucoside as substrates, respectively. Measured by quantifying phenol. These activities were measured in 20 mM acetate buffer (pH 3.0 and pH 5.0). For
得られた結果を図９〜１６に示す。これらの結果から分かるように、新規株（SK M2102株）はリグニン分解酵素であるマンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼを主要な菌体外酸化酵素として生産することが確認された。また、新規株（SK M2102株）は、リグニンペルオキシダーゼ、ベラトリルオキシダーゼ、マンガン非依存性ペルオキシダーゼも生産することが分かった。更に、新規株（SK M2102株）は、セルラーゼであるセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼも生産することが明らかとなった。こうした菌体外酵素の生産プロファイルと18S rDNAの分析から、新規株（SK M2102株）は、リグニンを分解する白色腐朽菌であると結論される。 The obtained results are shown in FIGS. As can be seen from these results, it was confirmed that the new strain (SK M2102 strain) produces manganese peroxidase and laccase, which are lignin degrading enzymes, as main extracellular oxidases. The new strain (SK M2102 strain) was also found to produce lignin peroxidase, veratryl oxidase, and manganese-independent peroxidase. Furthermore, it was revealed that the new strain (SK M2102 strain) also produced cellulase cellobiohydrolase, endoglucanase, and β-glucosidase. From these extracellular enzyme production profiles and 18S rDNA analysis, it is concluded that the new strain (SK M2102 strain) is a white rot fungus that degrades lignin.
Claims (5)
前記工程で得られた培養物中の多糖を酵素糖化処理する工程を含む、リグノセルロースの糖化方法。 A step of culturing a white rot fungus ( FERM P-20591 ) having a lignocellulose-degrading action or a mutant thereof having a lignocellulose-degrading action in the presence of lignocellulose, and a polysaccharide in the culture obtained in the above-mentioned step; A method for saccharification of lignocellulose, comprising a step of saccharification treatment.
前記工程で得られた培養物中の多糖を用いて糖化及び発酵処理する工程を含む、リグノセルロースから発酵産物を製造する方法。 A step of culturing a white rot fungus ( FERM P-20591 ) having a lignocellulose-degrading action or a mutant thereof having a lignocellulose-degrading action in the presence of lignocellulose, and a polysaccharide in the culture obtained in the step A method for producing a fermentation product from lignocellulose, comprising the steps of saccharification and fermentation.
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