JP4776153B2 - ストレス関連小胞体タンパク質serp1遺伝子欠損モデル非ヒト動物 - Google Patents
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Description
性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法(請求項9)や、非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項7〜9のいずれか記載のインスリン分泌異常及び/又は小胞体機能異常に起因する2型糖尿病、及び/又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法(請求項10)からなる。
(マウスSERP1遺伝子のクローニング)
マウスSERP1 cDNAの部分配列を、ラットSERP1との相同性によりESTクローンより得た。その配列を基に、センスプライマーとしてms1プライマー(5'-CTGTCCGGTGGTTGGATCCT-3':配列番号3)、アンチセンスプライマーとしてms4プライマー(5'-ACTTTGCCGCGCTGAGTTAT-3':配列番号4)を合成し、マウス129Sv/JゲノムDNAライブラリーをPCRにてスクリーニングした。得られたクローンをサザンブロット法により確認した。さらに、得られたクローンの配列をシークエンスすることにより決定した。同定されたマウスSERP1 ゲノムDNAの配列を、配列番号1に示した。
(細胞培養)
マウスインスリノーマ由来の細胞系であるMIN6細胞(大阪大学の宮崎博士より供与;Endocrinology. 127, 126-132, 1990)を15%のFCS及び25mMのグルコースを含むDMEM培地で培養した。細胞が70%コンフルエント状態に達した時に、培地を高グルコース濃度培地(25mMグルコース)又は低グルコース濃度培地(5.5mMグルコース)と交換した。SERP1及び他の分子の発現解析は培養開始から24時間後に行った。
(ノザンブロット法及びin situハイブリダイゼーション)
MIN6細胞及びマウス膵臓から全RNAを単離し、全RNA10μgを1%アガロースを含むホルムアルデヒドゲルで分子量別に分けた後、Immobilon Nメンブレン(Millipore社製;MA, USA)に固定した。SERP1のプローブとして、マウスSERP1ゲノムDNAの5´側配列(配列表の配列番号1に記載のマウスSERP1ゲノムDNAの428番目から788番目の塩基配列:配列番号5)及び、3´側配列(配列表の配列番号1に記載のマウスSERP1ゲノムDNAの7935番目から8403番目の塩基配列:配列番号6)を用いた。SERP1、Sec61(α及びβサブユニット)、及びGRP78のDNA断片によるハイブリダイゼーションは山口らの方法(J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999)に従って行った。
(免疫沈降、ウエスタンブロット法及び免疫染色)
タンパク質レベルにおけるSERP1の発現と小胞体内分子シャペロンGRP78及びGRP94の発現を比較するため、MIN6細胞及び単離した膵臓ランゲルハンス島を1% TritonX-100、10mM Tris(pH7.6)、150mM 塩化ナトリウム、1mM EDTA、1mM PMSF、1μg/mlアプロチニン、1μg/mlロイペプチン、及び1μg/mlペプスタチンを含む溶液で溶解した。免疫沈降又はウエスタンブロット法は抗SERP1抗体(J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999)、抗KDEL抗体(GRP78及びGRP94を認識する。StressGen Biotechnologies社製;Victoria, BC, Canada)、及び抗インスリン抗体(Biogenesis社製; Poole England, UK)を用いて行った。一次抗体認識部位はアルカリホスファターゼ標識二次抗体によって検出した。なお、免疫染色は、抗インスリン抗体又は抗FLAG抗体(マウスより単離したランゲルハンス島にAdex1 CA SERP1を用いてSERP1を強制発現させる際に、SERP1 cDNAをFLAGでタグしておいて異所性に発現しているSERP1のみFLAGで確認できるようにした。)を用い、厚さ5μmの膵臓切片及び/又は単離した膵臓ランゲルハンス島を用いて行った。また、二次抗体としてFITC標識抗マウスIgG抗体を用いた。なお、山口らの方法(J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999)に従い、Quality Oneソフトウェア(pdi社製;Huntington Station, NY)を用いて、ウエスタン及びノーザンブロット法の結果を標準化するためにレーザー濃度測定を行った。
(SERP1ノックアウトマウスの作製)
マウス129Sv/Jライブラリー(Incyte genomics社製;St. Louis, Mo, USA)由来のマウスSERP1遺伝子のエキソン1をネオマイシン耐性遺伝子(pGK-neo)で置換し、さらに5.2kbp上流にhsv−tK遺伝子を挿入した配列を、pPNT(Dr. Tybulewiczより供与;MRC National Institute for Medical Research, London, UK)に挿入することにより、ターゲッティングベクターを構築した(図3A)。さらに、ヘテロ接合体胚幹細胞クローンを未分化胚芽細胞に注入することにより、SERP1突然変異遺伝子の生殖系列伝達系を構築した。
(血中グルコース濃度及びインスリン濃度の測定)
血中グルコース濃度は、携帯用グルコース測定装置Dexter-Z(Bayer Medical社製)を用いて測定した。腹腔内(IP)グルコース負荷試験及びインスリン負荷試験(ITT)は、マウス体重1gあたり2mgのグルコース又は体重1gあたり1Uのインスリン(1U/kg)を腹腔内投与し、特定時刻に尾静脈から血液を採取する方法で行った。血漿、培養培地、及び細胞抽出液中のインスリン濃度及び成長ホルモン濃度はELISAキット(インスリン濃度:Shibayagi社製、成長ホルモン用キット:Cayman Chemical社製)を用いて測定した。
(組換えアデノウイルスの作製とアデノウイルスによる遺伝子発現)
マウスSERP1のコーディング領域全体とFLAGエピトープ(J. Cell Biol. 147, 1195-1204, 1999)を含むcDNA断片を、pAdx1CAコスミドベクターに挿入し、さらに、アデノウイルス発現キット(TaKaRa社製)を用いた相同組換えにより、組換え型アデノウィルスAdex1CA SERP1を作製した。得られたウイルスの力価は、培地1mlあたり約109プラーク形成単位(plaque-forming units:pfu)であった。対照として、ウイルスAdex1CA GFP(大阪市立大学のKiyama博士より供与)を用いた。単離した膵臓ランゲルハンス島を、11mMのグルコースを含むRPMI 1640培地中にAdex1CA SERP1又はAdex1CA GFPを添加することにより16時間刺激した後、RPMI 1640培地中で24時間培養した。SERP1の発現は、膵臓ランゲルハンス島を抗FLAG抗体を用いて免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡で観察することにより解析した。
(パルスラベリング法による、膵臓ランゲルハンス島におけるインスリン生合成及び分泌量の測定)
SERP1+/+、SERP1+/-及びSERP1-/-マウスから、コラゲナーゼ処理により膵臓ランゲルハンス島を単離した。膵臓ランゲルハンス島細胞をグルコースを含まないRPMI 1640培地(Sigma社製)で1時間培養した後、培地中に異なる濃度のグルコース(0〜22mM)を添加することにより細胞を刺激し、膵臓ランゲルハンス島細胞中のインスリン分泌及びインスリン含有量を特定時刻に測定した。インスリンの生合成及び分泌量の測定には、22mMグルコース及び200μCiの35S−Met/Cys(Amersham Pharmacia Biotech Inc.社製;Piscataway, NJ, USA)を含む100μlのRPMI 1640培地中で30分間培養することにより放射性標識した膵臓ランゲルハンス島細胞を用いた。これらの細胞を抗インスリン抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降したタンパク質を15%トリシン緩衝ポリアクリルアミドゲル上で分離した後、オートラジオグラフィーにより目的のバンドを検出した。
(LIVE/DEAD assay)
SERP1+/+、SERP1+/-及びSERP1-/-マウスより単離したランゲルハンス島をそれぞれ、1)小胞体ストレス誘導剤であるツニカマイシン(tunicamycin 1μg/ml: Sigma社製)入りのRPMI1640培地、2)ツニカマイシン及びタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド(cycloheximide 1μg/ml: Sigma社製)入りのRPMI1640培地、3)RPMI1640培地のみの条件、の計6群に分けて48時間培養した。その後の細胞の状態を、LIVE/DEAD assay(Molecular probe社;Eugene, OR, USA)にて評価した。
[実験結果]
(ヒトの内分泌組織におけるSERP1及びSec61遺伝子の発現分布)
SERP1の機能を研究するためのモデル器官を探すため、ヒトの内分泌組織(膵臓、副腎髄質、甲状腺、副腎皮質、精巣、胸腺、小腸、胃の計8組織)における、SERP1遺伝子及びSec61複合体遺伝子(α,βサブユニット)の組織分布をノザンブロット法により解析した(図1)。その結果、SERP1遺伝子は膵臓で多く発現し、副腎髄質、甲状腺及び副腎皮質でも検出された。Sec61αサブユニットは全体的に広く分布していたが、特に膵臓で高発現し、βサブユニットは膵臓の他、副腎皮質でも検出された。いずれの遺伝子も膵臓において高発現することが明らかになった。
(MIN6細胞及び膵臓ランゲルハンス島におけるSERP1及びSec61複合体の発現分布)
Sec61複合体等のトランスロコンメンバーが、高グルコース濃度条件下のMIN6細胞において発現が上昇することから(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 5773-5778, 2000)、膵臓内におけるSEPR1の発現をさらに詳しく解析するために、マウスインスリノーマ由来の細胞系であるMIN6を用いて検討した。その結果、SERP1及びSec61複合体は、mRNA及びタンパク質共に、インスリン産生が盛んになる高濃度のグルコース条件下で発現が上昇することが明らかになった(図2A、B)。また、膵臓切片を用いてin situハイブリダイゼーションを行ったところ、SERP1はランゲルハンス島のβ細胞において強い発現が認められ、絶食条件下で発現が低下することが明らかになった(図2C)。
(SERP1遺伝子ノックアウトマウスの作製)
インスリンの生合成、及び分泌におけるSERP1の役割を明らかにするために、相同組換え法を用いてSERP1遺伝子ノックアウトマウスを作製した(図3A)。SERP1+/+マウス(野性型)、SERP1+/-マウス、及びSERP1-/-マウス(SERP1ノックアウトマウス)の比較をサザンブロット法により行った(図3B)。さらにSERP1 mRNA及びSec61α mRNAの発現をノザンブロット法で解析したところ、SERP1-/-マウスでは、SERP1遺伝子が発現しないことが確認された(図3C)。
(グルコース及びインスリン負荷試験)
SERP1の発現がインスリンの生合成及び分泌へ与える影響を、in vivoにおけるグルコース負荷試験により検討した。10週齢及び25週齢のマウスに、体重1gあたり2mgのグルコースを腹腔内投与した後、血糖値を測定した結果、SERP1ノックアウトマウスにおいて耐糖能異常が認められた。特に、雄においては、雌と比較してより強い耐糖能異常が見られたが、加齢による影響は認められなかった(図5)。
(グルコース負荷によるインスリン分泌への影響)
SERP1+/+マウス(野性型マウス)、SERP1+/-マウス、及びSERP1-/-マウス(SERP1ノックアウトマウス)よりランゲルハンス島を単離し、グルコース負荷によるインスリン分泌への影響を解析した。(結果を図7に示す。)その結果、グルコース負荷より15分後のインスリンの分泌量においては、3群間で有意な差は認められなかったが、負荷後30分及び60分後では、SERP1ノックアウトマウスにおけるインスリン分泌量が有意に減少し、さらに120分後には、再び3群間で有意な差が認められなくなった(図7A)。従って、SERP1は、グルコース負荷後のインスリンの生合成速度に影響を与えることが示唆された。また、インスリン分泌量は、負荷グルコース濃度依存的に増加することが明らかになった(図7B)。
(SERP1の強制発現によるインスリン分泌への影響)
野性型マウス及びSERP1ノックアウトマウス由来のランゲルハンス島にアデノウイルスを用いてSERP1 cDNAを導入することにより、インスリン分泌量への影響を検討した。はじめに、ランゲルハンス島への遺伝子導入効率を確認するため、作製した組換え型アデノウイルスAdex1CA SERP1を、対照として組換え型アデノウイルスAdex1CA GFPをランゲルハンス島に導入した。GFP及びSERP1の発現は、抗FLAG抗体を用いて免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡で観察した(図8A)。その結果、組換え型アデノウィルスAdex1CA SERP1は70%以上の効率で遺伝子が導入されることが確認された。
(グルコース刺激後のプロインスリン及びインスリン生合成量の変化)
パルスラベリング法により、ランゲルハンス島でのインスリン生合成及び培養液中への分泌量の経時変化を解析した。その結果、野性型マウスではいずれも、グルコース負荷後30〜60分でプロインスリンの合成量が最大となり、その後減少していくのに対し、ノックアウトマウスでは、90〜120分後に合成量が最大となることが認められた(図9A、B)。従って、SERP1は、インスリンの合成そのものに直接関与するのではなく、グルコース負荷後の急速なインスリン生合成に必須であることが示唆された。
(SERP1の発現と膵臓ランゲルハンス島のストレス応答との関係)
SERP1が、小胞体ストレスによりその発現が上昇することから、SERP1の発現とランゲルハンス島のストレス抵抗性との関係を、(LIVE/DEAD assay)を用いて検討した。ランゲルハンス島を、小胞体ストレスを誘導するツニカマイシン(tunicamycin)で処理したところ、48時間後、野性型マウスでは、あまり多くの細胞死は認められなかったが、SERP1ノックアウトマウスでは、細胞死に至る細胞の数が有意に増加した。この細胞死は、小胞体ストレスによる細胞死を防ぐ薬剤であるシクロヘキシミド(cycloheximide)を培地中に添加することにより抑制された。その結果、小胞体ストレスによって引き起こされた細胞死であることが示唆された(図10)。
(下垂体及びホルモン生合成におけるSERP1遺伝子の影響)
出生後のSERP1-/-マウスにおいて一時的に成長発育不全が認められることから、SERP1は、新生児の成長と相関しているホルモンの生合成において重要な役割を果たしていることが示唆された。マウス脳(大脳皮質及び視床下部)及び脳下垂体からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットより、SERP1及びSec61複合体(Sec61β)両者とも下垂体において高発現していることが明らかになった(図11A)。免疫組織学的解析によりSERP1の発現は、成長ホルモンの分布と同様、前葉において観察された(図11B)。C56BL/6系統及び129v/JxC57BL/6系統の各遺伝子型の成熟マウス(12〜16週齢、図11C I、II)及び新生児マウス(6日)を用いて解析したところ、コントロールである野生型と比較して、SERP1-/-マウスにおいて下垂体前葉の大きさが減少していることが明らかになった。下垂体中葉及び後葉においては、このような変化は認められなかった。
Claims (10)
- ストレス関連小胞体タンパク質SERP1遺伝子機能を染色体上で欠損させたことを特徴とするインスリン分泌異常及び/又は小胞体機能異常に起因する2型糖尿病及び/又は成長ホルモン生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
- インスリン分泌異常が、膵臓β細胞におけるインスリン生合成異常に起因することを特徴とする請求項1記載の2型糖尿病、及び/又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
- 小胞体機能異常が、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害であることを特徴とする請求項1又は2記載の2型糖尿病及び/又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
- 下垂体性小人症の発症が、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因することを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の2型糖尿病及び/又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
- ストレス関連小胞体タンパク質SERP1遺伝子機能の欠損が、配列表の配列番号1に示されるSERP1遺伝子の機能の欠損であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の2型糖尿病及び/又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
- 非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の2型糖尿病及び/又は下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物。
- 請求項1〜6のいずれか記載のインスリン分泌異常及び/又は小胞体機能異常に起因する2型糖尿病、及び/又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物、或いは該モデル非ヒト動物の細胞、組織又は器官におけるインスリン生合成/分泌、及び/又は小胞体機能の異常、或いは、下垂体での成長ホルモンの生合成異常を測定・評価することを特徴とするインスリン分泌異常及び/又は小胞体機能異常に起因する2型糖尿病、及び/又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。
- 小胞体機能の異常の測定・評価が、小胞体ストレス下における膵臓ランゲルハンス島細胞の生存に対する障害の測定・評価であることを特徴とする請求項7記載のインスリン分泌異常及び/又は小胞体機能異常に起因する2型糖尿病、及び/又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。
- 請求項1〜6のいずれか記載のインスリン分泌異常及び/又は小胞体機能異常に起因する2型糖尿病、及び/又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物に、被検物質を投与した場合と、野生型非ヒト動物の場合及び/又はインスリン分泌異常及び/又は小胞体機能異常に起因する2型糖尿病、及び/又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症を発症するモデル非ヒト動物の場合とを、比較・評価することを特徴とするインスリン分泌異常及び/又は小胞体機能異常に起因する2型糖尿病、及び/又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。
- 非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項7〜9のいずれか記載のインスリン分泌異常及び/又は小胞体機能異常に起因する2型糖尿病、及び/又は、下垂体での成長ホルモンの生合成異常に起因する下垂体性小人症の予防・治療薬のスクリーニング方法。
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