JP4770987B2 - 糖液の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法に関する。

糖を原料とした化学品の発酵生産プロセスは、種々の工業原料生産に利用されている。この発酵原料となる糖として、現在、さとうきび、澱粉、テンサイなどの食用原料に由来するものが工業的に使用されているが、今後の世界人口の増加による食用原料価格の高騰、あるいは食用と競合するという倫理的な側面から、再生可能な非食用資源、すなわちセルロース含有バイオマスより効率的に糖液を製造するプロセス、あるいは得られた糖液を発酵原料として、効率的に工業原料に変換するプロセスの構築が今後の課題となっている。

セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法として、硫酸を使用する糖液の製造方法として、濃硫酸を使用してセルロースおよびヘミセルロースを酸加水分解して糖液を製造する方法（特許文献１または２）、セルロース含有バイオマスを希硫酸で加水分解処理した後に、さらにセルラーゼなどの酵素処理することより糖液を製造する方法が開示されている（非特許文献１）。

また、酸を使用しない方法として、２５０〜５００℃程度の亜臨界水を使用してセルロース含有バイオマスを加水分解して糖液を製造する方法（特許文献３）、またセルロース含有バイオマスを亜臨界水処理したあとに、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献４）、またセルロース含有バイオマスを２４０℃〜２８０℃の加圧熱水で加水分解処理した後に、さらに酵素処理することにより糖液を製造する方法（特許文献５）が開示されている。

しかしながら、セルロース含有バイオマスの加水分解においてセルロースあるいはヘミセルロース成分などの分解と同時に、生成したグルコース、キシロースとした糖の分解物反応も進み、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラールなどのフラン化合物、あるいはギ酸、酢酸、レブリン酸など有機酸といった副産物も生成するという課題があった。また、セルロース含有バイオマスは、芳香族ポリマーであるリグニン成分を含むため、酸処理工程において、リグニン成分が分解され、低分子量のフェノール類などの芳香族化合物を同時に副産物として生成する。これらの化合物は、微生物を利用した発酵工程で阻害的に作用し、微生物の増殖阻害を引き起こし、発酵産物の収率を低下させるため、発酵阻害物質と呼ばれ、セルロース含有バイオマス糖液を発酵原料として利用する際に大きな課題であった。

このような発酵阻害物質を糖液製造過程で除去する方法として、オーバーライミングといった方法が開示されている（非特許文献２）。この方法では、酸処理後のセルロースあるいは糖化液に対し、石灰を添加し中和する工程において、６０℃付近まで加温しながら一定時間保持することで、フルフラール、ＨＭＦといった発酵阻害物質を石膏成分とともに除去する方法である。しかしながら、オーバーライミングでは、ギ酸、酢酸、レブリン酸といった有機酸の除去効果が少ないといった課題があった。

また、発酵阻害物質を除去する別の方法として、セルロース含有バイオマスからの糖液に水蒸気を吹き込むことで、発酵阻害物質を蒸発除去する方法が開示されている（特許文献６）。しかしながらこうした蒸発除去する方法では、発酵阻害物質の沸点に依存しており、特に沸点の低い有機酸などの発酵阻害物質の除去効率は低く、十分な除去効率を得るためには、多大のエネルギーを投入しなければならないといった課題があった。

また、発酵阻害物質をイオン交換で除去する方法もあるが（特許文献７）、コスト的に課題があった。また木質系炭化物、すなわち活性炭などを使用して吸着除去する方法もあるが、除去対象が疎水性化合物に限定されるという課題があった（特許文献８）。

特表平１１−５０６９３４号公報 特開２００５−２２９８２１号公報 特開２００３−２１２８８８号公報 特開２００１−９５５９７号公報 特許３０４１３８０号公報 特開２００４−１８７６５０号公報 特表２００１−５１１４１８号公報 特開２００５−２７００５６号公報

A. Adenら、"Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover"NREL Technical Report (2002) M. Alfred ら、"Effect of pH, time and temperature of overliming on detoxification of dilute-acid hydrolyzates for fermentation by Saccaromyces cerevisiase"Process Biochemistry, 38,515-522 (2002)

本発明では、上述したような課題、すなわちセルロース含有バイオマスから糖を製造する工程で生成する発酵阻害物質を、糖液製造の工程において除去する方法を提供し、また発酵阻害物質量が極めて少ない精製糖液を製造する方法を提供するものである。

本発明者らは、上記課題を鋭意検討した結果、セルロース含有バイオマスから糖を製造する工程において、糖液をナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じることにより、発酵原料となる糖と発酵阻害物質を分離除去可能であることを見出した。すなわち、本発明は以下の［１］〜［１４］の構成を有する。

［１］セルロース含有バイオマスを原料として糖液を製造する方法であって、
（１）セルロース含有バイオマスを加水分解し、糖水溶液を製造する工程
（２）得られた糖水溶液をナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過して、非透過側から精製糖液を回収し、透過側から発酵阻害物質を除去する工程
を含む、糖液の製造方法。

［２］前記工程（２）の糖水溶液のｐＨを１〜５に調整する、［１］に記載の糖液の製造方法。

［３］前記発酵阻害物質が有機酸、フラン系化合物およびフェノール系化合物からなる群から選択される１種または２種以上を含む、［１］または［２］に記載の糖液の製造方法。

［４］前記有機酸がギ酸または酢酸である、［３］に記載の糖液の製造方法。

［５］前記フラン系化合物がヒドロキシメチルフルフラールまたはフルフラールである、［３］に記載の糖液の製造方法。

［６］前記フェノール系化合物がバニリン、アセトバニリンまたはシリンガ酸である、［３］に記載の糖液の製造方法。

［７］前記工程（２）の精製糖液が単糖を主成分とする糖液である、［１］から［６］のいずれかに記載の糖液の製造方法。

［８］前記工程（１）で得られた糖水溶液を、前記工程（２）の処理の前に精密濾過膜および／または限外濾過膜に通じて微粒子および高分子成分を除去する、［１］から［７］のいずれかに記載の糖液の製造方法。

［９］前記工程（２）の糖水溶液の温度を１〜１５℃に調整してナノ濾過膜で濾過する、［１］から［８］のいずれかに記載の糖液の製造方法。

［１０］前記工程（２）の糖水溶液の温度を４０℃〜８０℃に調整して逆浸透膜で濾過する、［１］から［８］のいずれかに記載の糖液の製造方法。

［１１］前記工程（２）が、糖水溶液をナノ濾過膜に通じて濾過し、得られた濾過液を逆浸透膜に通じて濾過する工程である、［１］から［１０］のいずれかに記載の糖液の製造方法。

［１２］前記工程（２）のナノ濾過膜および／または逆浸透膜の機能層がポリアミドである、［１］から［１１］のいずれかに記載の糖液の製造方法。

［１３］前記工程（２）のナノ濾過膜の機能層が架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする、［１］から［１２］のいずれかに記載の糖液の製造方法。

（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ_３、ｎは０から３までの整数を表す。）。

［１４］［１］から［１３］のいずれかに記載の糖液の製造方法によって得られた糖液を発酵原料として使用する、化学品の製造方法。

本発明によって、セルロース含有バイオマスに由来する糖水溶液から、発酵阻害物質であるフルフラール、ＨＭＦなどのフラン化合物、酢酸、ギ酸、レブリン酸などの有機酸、バニリンなどのフェノール系化合物を網羅的に除去することが可能であり、一方でグルコース、キシロースなどの糖を高純度・高収率で製造することができる。その結果、本発明で得られた精製糖液を発酵原料として使用することで、種々の化学品の発酵生産の効率を向上させることができる。

図１は、ナノ濾過膜／逆浸透膜のろ過装置の概略を示す。 図２は、平膜試験に使用したステンレス製のセルの模式図を示す。 図３は、ナノ濾過膜で糖液を濾過した時のｐＨの違いによってフラックス量を比較したグラフである。 図４は、ナノ濾過膜で糖液を濾過する前に精密濾過膜または処理する方法によりフラックス量を比較したグラフである。 図５は、水熱処理液を精密濾過膜で濾過した時に濾過前後の膜表面の走査型電子顕微鏡の撮影写真である。 図６は、図５の走査電子顕微鏡写真を観察中に付随のエネルギー分散型X線分析装置で元素の分布を測定した結果である。 図７は、酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明の糖液の製造方法に用いられるセルロース含有バイオマスとは、バガス、スイッチグラス、コーンストーバー、稲わら、麦わら、などの草本系バイオマス、また樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。これらセルロース含有バイオマスは、糖が脱水縮合した多糖であるセルロースあるいはヘミセルロースを含有しており、こうした多糖を加水分解することにより発酵原料として利用可能な糖液を製造することが可能である。

本発明の糖液とは、セルロース含有バイオマスの加水分解によって得られる糖水溶液のことを指す。一般的に糖とは、単糖の重合度によって分類され、グルコース、キシロースなどの単糖類、そして単糖が２〜９個脱水縮合したオリゴ糖類、さらには単糖が１０個以上脱水縮合した多糖類に分類される。本発明の糖液とは、主成分として単糖を含む糖液を指し、具体的には、グルコースあるいはキシロースを主成分として含む。また、少量ではあるが、セロビオースなどのオリゴ糖、およびアラビノース、マンノースなどの単糖も含んでいる。ここで主成分が単糖であるとは、水に溶解している単糖、オリゴ糖、多糖の糖類の中の総重量の８０重量％以上が単糖であることを指す。具体的な水に溶解した単糖、オリゴ糖、多糖の分析方法としては、ＨＰＬＣにより、標品との比較により定量することができる。具体的なＨＰＬＣ条件は、反応液はなしで、カラムにＬｕｎａ ＮＨ_２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用いて、移動相が超純水：アセトニトリル＝２５：７５とし、流速を０．６ｍＬ／ｍｉｎ、測定時間が４５ｍｉｎ、検出方法がＲＩ（示差屈折率）、温度が３０℃である。

次に、本発明の糖液の製造方法における工程（１）セルロース含有バイオマスを加水分解する工程に関して説明する。

セルロース含有バイオマスを加水分解に供するに際しては、セルロース含有バイオマスをそのまま使用してもよいが、蒸煮、微粉砕、爆砕などの公知の処理を施すことが可能であり、こうした処理によって加水分解の効率を向上させることが可能である。

セルロース含有バイオマスの加水分解工程については特に制限はないが、具体的には処理法Ａ：酸のみを用いる方法、処理法Ｂ：酸処理後、酵素を利用する方法、処理法Ｃ：水熱処理のみを用いる方法、処理法Ｄ：水熱処理後、酵素を利用する方法、処理法Ｅ：アルカリ処理後、酵素を利用する方法、処理法Ｆ：アンモニア処理後、酵素を利用する方法の６つが主に挙げられる。

処理法Ａでは、セルロース含有バイオマスの加水分解に酸を使用する。使用する酸に関して硫酸、硝酸、塩酸などが挙げられるが、硫酸を使用することが好ましい。

酸の濃度に関しては特に限定されないが、０．１〜９９重量％の酸を使用することができる。酸の濃度が０．１〜１５重量％、好ましくは０．５〜５重量％である場合、反応温度は１００〜３００℃、好ましくは１２０〜２５０℃の範囲で設定され、反応時間は１秒〜６０分の範囲で設定される。処理回数は特に限定されず上記処理を１以上行えばよい。特に上記処理を２以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。

また、酸の濃度が１５〜９５重量％、好ましくは６０〜９０重量％である場合、反応温度は１０〜１００℃の範囲で設定され、反応時間は１秒〜６０分の範囲で設定される。

前記酸処理の回数は特に限定されず上記処理を１回以上行えばよい。特に前記処理を２以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。

酸処理によって得られた加水分解物は、硫酸などの酸を含むため発酵原料として使用するためには中和を行う必要がある。中和は、加水分解物より固形分を固液分離により除去した酸水溶液に対し行ってもよいし、固形分を含んだままの状態で行ってもよい。中和に使用するアルカリ試薬は特に限定されないが、好ましくは１価のアルカリ試薬である。工程（２）の最中に酸・アルカリ成分がともに２価以上の塩であると、ナノ濾過膜では透過されず、また液が濃縮される過程で液中に塩が析出し膜のファウリング要因となることがある。

１価のアルカリを使用する場合、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられるが特に限定はされない。

２価以上のアルカリ試薬を用いる場合は工程（２）中に塩の析出が起こらないよう酸、アルカリ量を減らすか、または工程（２）中に析出物を除外する機構が必要となる。２価以上のアルカリを使用する場合、コストの面から水酸化カルシウムであることが好ましい。水酸化カルシウムを使用した場合、中和によって石膏成分が生成することから、固液分離により石膏を除去する必要がある。固液分離の方法としては、遠心分離法、膜分離法があるが特に限定されるものではなく、複数種の分離工程を設けて除去してもよい。

酸を使用する加水分解では一般的に結晶性の低いヘミセルロース成分より加水分解が起き、次いで結晶性の高いセルロース成分が分解されるという特徴を有する。したがって、酸を使用してヘミセルロース由来のキシロースを多く含有する液を得ることが可能である。また酸処理においては、さらに前記処理後のバイオマス固形分を、前記処理よりも高圧、高温での反応を行うことでさらに結晶性の高いセルロース成分を分解しセルロース由来のグルコースを多く含有する液を得ることが可能である。加水分解を行う２段階の工程を設定することで、ヘミセルロース、セルロースに適した加水分解条件が設定でき、分解効率、および糖収率を向上させることが可能になる。また、第１の分解条件で得られる糖液、と第２の分解条件で得られる糖液を分離しておくことで、加水分解物に含まれる単糖成分比率が異なる２種の糖液を製造することが可能になる。すなわち、第１の分解条件で得られる糖液はキシロースを主成分とし、第２の分解条件で得られる糖液はグルコースを主成分として分離することも可能である。このように糖液に含まれる単糖成分を分離することにより、糖液中のキシロースを発酵原料として使用する発酵と、グルコースを発酵原料として使用する発酵に分けて行うことも可能になり、それぞれの発酵に使用する最適な微生物種を選定し使用することが可能になる。但し酸での高圧高温処理を長時間行うことでヘミセルロース成分・セルロース成分を分離することなく一度に両成分由来の糖を得ても良い。

処理法Ｂでは、処理法Ａで得られた処理液をさらに酵素によりセルロース含有バイオマスを加水分解する。処理法Ｂにおける使用する酸の濃度は０．１〜１５重量％であることが好ましく、より好ましくは、０．５〜５重量％である。反応温度は１００〜３００℃の範囲で設定することができ、好ましくは１２０〜２５０℃で設定することができる。反応時間は１秒〜６０分の範囲で設定することができる。処理回数は特に限定されず前記処理を１回以上行えばよい。特に上記処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。

酸処理によって得られた加水分解物は、硫酸などの酸を含んでおり、さらに酵素による加水分解反応を行うため、あるいは発酵原料として使用するために、中和を行う必要がある。中和は、処理法Ａでの中和と同様に実施することができる。

前記酵素としては、セルロース分解活性を有する酵素であればよく、一般的なセルラーゼを使用することが可能であるが、好ましくは、結晶性セルロースの分解活性を有するエキソ型セルラーゼ、あるいはエンド型セルラーゼを含んでなるセルラーゼであることが好ましい。こうしたセルラーゼとして、トリコデルマ属細菌が産生するセルラーゼが好適である。トリコデルマ属細菌とは糸状菌に分類される微生物であり、細胞外に、多種のセルラーゼを大量に分泌する微生物である。本発明で使用するセルラーゼは、好ましくは、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼである。また、加水分解に使用する酵素として、グルコースの生成効率を向上させるために、セロビオース分解酵素であるβグルコシダーゼを添加してもよく、上述のセルラーゼと併せて加水分解に使用してもよい。βグルコシダーゼとしては、特に限定されないがアスペルギルス由来のものであることが好ましい。こうした酵素を使用した加水分解反応は、ｐＨが３〜７の付近で行うことが好ましく、より好ましくはｐＨ５付近である。反応温度は、４０〜７０℃であることが好ましい。また酵素による加水分解終了時に固液分離を行い、未分解の固形分を除去することが好ましい。固形分除去の方法としては、遠心分離法、膜分離法などがあるが特に限定されない。またこうした固液分離を複数種組み合わせて使用してもよい。

酸処理後、酵素を利用してセルロース含有バイオマスを加水分解する場合、第１の加水分解において酸処理により結晶性の低いヘミセルロースの加水分解を行い、次いで第２の加水分解として酵素を使用することで結晶性の高いセルロースの加水分解を行うことが好ましい。第２の加水分解において酵素を使用することで、より効率よくセルロース含有バイオマスの加水分解工程を進めることができる。具体的には、酸による第１の加水分解において、主としてセルロース含有バイオマスに含まれるヘミセルロース成分の加水分解とリグニンの部分分解が起き、その加水分解物を酸溶液とセルロースを含む固形分に分離し、セルロースを含む固形分成分に対しては、酵素を添加することによって加水分解を行う。分離・回収された希硫酸溶液にはペントースであるキシロースを主成分として含んでいるため、酸溶液を中和して糖水溶液を単離することができる。また、セルロースを含む固形分の加水分解反応物からグルコースを主成分とする単糖成分を得ることができる。なお、中和によって得られた糖水溶液を、固形分に混合し、ここに酵素を添加して加水分解を行ってもよい。

処理法Ｃでは特段の酸の添加は行わず、セルロース含有バイオマスが、０．１〜５０重量％となるよう水を添加後、１００〜４００℃の温度で、１秒〜６０分処理する。こうした温度条件において処理することにより、セルロースおよびへミセルロースの加水分解が起こる。処理回数は特に限定されず該処理を１回以上行えばよい。特に該処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。

水熱処理を使用する加水分解では一般的に結晶性の低いヘミセルロース成分より加水分解が起き、次いで結晶性の高いセルロース成分が分解されるという特徴を有する。したがって、水熱処理を使用してヘミセルロース由来のキシロースを多く含有する液を得ることが可能である。また水熱処理においては、さらに前記処理後のバイオマス固形分を前記処理よりも高圧、高温での反応を行うことでさらに結晶性の高いセルロース成分を分解しセルロース由来のグルコースを多く含有する液を得ることが可能である。加水分解を行う２段階の工程を設定することで、ヘミセルロース、セルロースに適した加水分解条件が設定でき、分解効率、および糖収率を向上させることが可能になる。また、第１の分解条件で得られる糖液、と第２の分解条件で得られる糖液を分離しておくことで、加水分解物に含まれる単糖成分比率が異なる２種の糖液を製造することが可能になる。すなわち、第１の分解条件で得られる糖液はキシロースを主成分とし、第２の分解条件で得られる糖液はグルコースを主成分として分離することも可能である。このように糖液に含まれる単糖成分を分離することにより、糖液中のキシロースを発酵原料として使用する発酵と、グルコースを発酵原料として使用する発酵に分けて行うことも可能になり、それぞれの発酵に使用する最適な微生物種を選定し使用することが可能になる。

処理法Ｄでは、処理法Ｃで得られた処理液をさらに酵素によりセルロース含有バイオマスを加水分解する。

前記酵素は、処理法Ｂと同様の酵素が用いられる。また、酵素処理条件についても処理法Ｂと同様の条件が採用されうる。

水熱処理後、酵素を使用してセルロース含有バイオマスを加水分解する場合、第１の加水分解において水熱処理により結晶性の低いヘミセルロースの加水分解を行い、次いで第２の加水分解として酵素を使用することで結晶性の高いセルロースの加水分解を行う。第２の加水分解において酵素を使用することで、より効率よくセルロース含有バイオマスの加水分解工程を進めることができる。具体的には、水熱処理による第１の加水分解において、主としてセルロース含有バイオマスに含まれるヘミセルロース成分の加水分解とリグニンの部分分解が起き、その加水分解物を水溶液とセルロースを含む固形分に分離し、セルロースを含む固形分に対しては、酵素を添加することによって加水分解を行う。分離・回収された水溶液にはペントースであるキシロースを主成分として含んでいる。また、セルロースを含む固形分の加水分解反応物からグルコースを主成分とする単糖成分を得ることができる。なお、水熱処理によって得られる水溶液を、固形分に混合し、ここに酵素を添加して加水分解を行ってもよい。

処理法Ｅでは、使用するアルカリは水酸化ナトリウムまたは水酸化カルシウムがより好ましい。これらアルカリの濃度は、０．１〜６０重量％の範囲でセルロース含有バイオマスに添加し、１００〜２００℃、好ましく、１１０〜１８０℃の温度範囲で処理すればよい。処理回数は特に限定されず上記処理を１以上行えばよい。特に上記処理を２以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。

アルカリ処理によって得られた処理物は、水酸化ナトリウムなどのアルカリを含むため、さらに酵素による加水分解反応を行うために、中和を行う必要がある。中和は、加水分解物より固形分を固液分離により除去したアルカリ水溶液に対し行ってもよいし、固形分を含んだままの状態で行ってもよい。中和に使用する酸試薬は特に限定されないが、より好ましくは１価の酸試薬である。工程（２）の最中に酸・アルカリ成分がともに２価以上の塩であると、ナノ濾過膜では透過されず、また液が濃縮される過程で液中に塩が析出し膜のファウリング要因となるからである。

１価の酸を使用する場合、硝酸、塩酸等が挙げられるが特に限定はされない。

２価以上の酸試薬を用いる場合は、工程（２）中に塩の析出が起こらないように酸、アルカリ量を減らすか、または工程（２）中に析出物を除外する機構が必要となる。２価以上の酸を使用する場合、硫酸、リン酸であることが好ましい。水酸化カルシウムを使用した場合、中和によって石膏成分が生成することから、固液分離により石膏を除去する必要がある。固液分離の方法としては、遠心分離法、膜分離法があるが特に限定されるものではなく、複数種の分離工程を設けて除去してもよい。

前記酵素は、処理法Ｂと同様の酵素が用いられる。また、酵素処理条件についても処理法Ｂと同様の条件が採用されうる。

アルカリ処理後、酵素を利用してセルロース含有バイオマスを加水分解する場合、アルカリを含んだ水溶液に混合して加熱することでヘミセルロースおよびセルロース成分周辺のリグニン成分を除去し、ヘミセルロース成分およびセルロース成分を反応しやすい状態にした後、酵素によってアルカリ処理中の水熱により分解されなかった分の結晶性の低いヘミセルロース、結晶性の高いセルロースの加水分解を行う。具体的には、アルカリによる処理において、主としてセルロース含有バイオマスに含まれる一部のヘミセルロース成分の加水分解とリグニンの部分分解が起き、その加水分解物をアルカリ溶液とセルロースを含む固形分に分離し、セルロースを含む固形分成分に対しては、ｐＨを調製して酵素を添加することによって加水分解を行う。また、アルカリ溶液濃度が希薄な場合は、固形分を分離することなく、そのまま中和後酵素添加して加水分解してもよい。セルロースを含む固形分の加水分解反応物からはグルコース、キシロースを主成分とする単糖成分を得ることができる。また、分離・回収されたアルカリ溶液にはリグニン以外にペントースであるキシロースを主成分として含んでいるため、アルカリ溶液を中和して糖水溶液を単離することも可能である。また、中和によって得られた糖水溶液を、固形分に混合し、ここに酵素を添加して加水分解を行ってもよい。

処理法Ｆのアンモニア処理条件については特開２００８−１６１１２５および特開２００８−５３５６６４に準拠する。例えば、使用するアンモニア濃度はセルロース含有バイオマスに対して０．１〜１５重量％の範囲でセルロース含有バイオマスに添加し、４〜２００℃、好ましくは９０〜１５０℃で処理する。添加するアンモニアは液体状態、あるいは気体状態のどちらであってもよい。さらに添加する形態は純アンモニアでもアンモニア水溶液の形態でもよい。処理回数は特に限定されず前記処理を１回以上行えばよい。特に前記処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。

アンモニア処理によって得られた処理物は、さらに酵素による加水分解反応を行うため、アンモニアの中和あるいはアンモニアの除去を行う必要がある。中和は、加水分解物より固形分を固液分離により除去したアンモニアに対し行ってもよいし、固形分を含んだままの状態で行ってもよい。中和に使用する酸試薬は特に限定されない。例えば塩酸、硝酸、硫酸などがあげられるが、プロセス配管の腐食性および発酵阻害因子とならない事を考慮して硫酸がより好ましい。アンモニアの除去は、アンモニア処理物を減圧状態に保つことでアンモニアを気体状態に揮発させて除去することができる。また除去したアンモニアは、回収再利用してもよい。

アンモニア処理後に酵素を使用する加水分解では、一般的にアンモニア処理によりセルロースの結晶構造が変化し、酵素反応を受けやすい結晶構造に変化することが知られている。したがって、こうしたアンモニア処理後の固形分に対し、酵素を作用させることで、効率的に加水分解を行うことができる。前記酵素は、処理法Ｂと同様の酵素が用いられる。また、酵素処理条件についても処理法Ｂと同様の条件が採用されうる。

またアンモニア水溶液を用いる場合は、アンモニア処理時にアンモニア以外に水成分が処理法Ｃ（水熱処理）と同様の効果も得ることがあり、ヘミセルロースの加水分解やリグニンの分解が起こることもある。アンモニア水溶液で処理後、酵素を利用してセルロース含有バイオマスを加水分解する場合、アンモニアを含んだ水溶液に混合して加熱することでヘミセルロースおよびセルロース成分周辺のリグニン成分を除去し、ヘミセルロース成分およびセルロース成分を反応しやすい状態にした後、酵素によってアンモニア処理中の水熱により分解されなかった分の結晶性の低いヘミセルロース、結晶性の高いセルロースの加水分解を行う。具体的には、アンモニア水溶液による処理において、主としてセルロース含有バイオマスに含まれる一部のヘミセルロース成分の加水分解とリグニンの部分分解が起き、その加水分解物をアンモニア水溶液とセルロースを含む固形分に分離し、セルロースを含む固形分成分に対しては、ｐＨを調製して酵素を添加することによって加水分解を行う。また、アンモニア濃度が１００％に近い濃い濃度の場合は、アンモニアを脱気により多くを除外後、固形分を分離することなく、そのまま中和後酵素添加して加水分解してもよい。セルロースを含む固形分の加水分解反応物からはグルコース、キシロースを主成分とする単糖成分を得ることができる。また、分離・回収されたアンモニア水溶液にはリグニン以外にペントースであるキシロースを主成分として含んでいるため、アルカリ溶液を中和して糖水溶液を単離することも可能である。また、中和によって得られた糖水溶液を、固形分に混合し、ここに酵素を添加して加水分解を行ってもよい。

工程（１）で得られる糖水溶液は、前述の通り遠心分離法、あるいは膜分離法で固形分を除去することによって得られる。その際、その分離条件、特に使用する分離膜によっては、固形分の除去が十分でなく、微粒子を含むことがある。このような微粒子の構成成分としては、リグニン、タンニン、シリカ、カルシウム、未分解のセルロース、などが例示できるが、特にこれらに限定されるものではない。また、微粒子の粒径も特に限定されるものではない。また、微粒子に加えて水溶性高分子成分も含まれる。糖水溶液に含まれる水溶性高分子としては、オリゴ糖、多糖、タンニン、あるいは酵素を利用した糖水溶液の場合、酵素が多く含まれる。

糖水溶液中に含まれる微粒子または水溶性高分子の存在は、後述のナノ濾過膜および／または逆浸透膜処理を連続運転する際に、運転可能ではあるもののファウリングの要因となるため、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜の交換頻度が高くなる場合がある。その場合、工程（１）の後処理において、こうした微粒子および水溶性高分子を確実に除去可能な精密濾過膜および／または限外濾過膜に、糖水溶液を通じて微粒子を除去することが好ましい。濾過の方法としては、圧濾過、真空濾過、遠心濾過などがあるが特に限定されるものではない。また濾過操作として、定圧濾過、定流量濾過、非定圧非定流量濾過に大別されるが特に限定されない。また濾過操作としては、固形分を効率的に除去するために、精密濾過膜あるいは限外濾過膜を２回以上使用する多段的なろ過でもよく、またその際使用する膜の素材および性状に関しても特に限定されるものではない。

本発明に使用する精密濾過膜とは、平均細孔径が０．０１μｍ〜５ｍｍである膜のことであり、マイクロフィルトレーション、ＭＦ膜などと略称されるものである。また、本発明に使用する限外濾過膜とは、分画分子量が１，０００〜２００，０００となる膜のことであり、ウルトラフィルトレーション、ＵＦ膜などと略称されるものである。ここで、限外濾過膜は、孔径が小さすぎて膜表面の細孔径を電子顕微鏡等で計測することが困難であり、平均細孔径の代わりに分画分子量という値を孔径の大きさの指標とすることになっている。分画分子量とは、日本膜学会編 膜学実験シリーズ 第ＩＩＩ巻 人工膜編 編集委員／木村尚史・中尾真一・大矢晴彦・仲川勤 （１９９３ 共立出版） Ｐ９２に、『溶質の分子量を横軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットしたものを分画分子量曲線とよんでいる。そして阻止率が９０％となる分子量を膜の分画分子量とよんでいる。』とあるように、限外濾過膜の膜性能を表す指標として当業者には周知のものである。

これら精密濾過膜または限外濾過膜の材質としては、上述した微粒子の除去という本発明の目的を達成できるものであれば、特に限定されるものではないが、セルロース、セルロースエステル、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、塩素化ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリフッ化ビニリデン、ポリ４フッ化エチレン等の有機材料、あるいはステンレス等の金属、あるいはセラミック等無機材料が挙げられる。精密濾過膜または限外濾過膜の材質は、加水分解物の性状、あるいはランニングコストを鑑みて適宜選択すればよいが、有機材料であることが好ましく、塩素化ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンであることが好ましい。

また、工程（１）で得られる糖水溶液を特に限外濾過膜で濾過することによって、非透過側から糖化に使用した酵素を回収することができる。酵素を回収する工程について説明する。本発明の工程（１）で得られる糖液を限外濾過膜に通じることにより加水分解に使用した酵素は、分子量が１０，０００〜１００，０００の範囲にあり、これらを阻止することができる分画分子量を有する限外濾過膜を使用することで、酵素を非透過側画分より回収することができる。好ましくは、分画分子量１０，０００〜３０，０００の範囲の限外ろ過膜を使用することで加水分解に使用する酵素を効率的に回収することができる。使用する限外濾過膜の形態は特に限定されるものではなく、平膜、中空糸いずれであってもよい。回収されたセルラーゼは、工程（１）の加水分解に再利用することで、酵素使用量を削減することができる。こうした糖水溶液の限外濾過膜による濾過を行う際には、その前に糖水溶液を予め精密濾過膜に通じて処理し、微粒子を除去しておくことが好ましい。

以上のような工程（１）の後に、精密濾過膜および／または限外濾過膜で処理する工程としては、例えば処理法α：精密濾過膜で濾過する方法、処理法β：遠心分離処理後、精密濾過膜で濾過する方法、処理法γ：遠心分離処理後、精密濾過膜で濾過しさらに限外濾過膜で濾過する方法、処理法δ：フィルタープレスで固液分離後、濾液を限外濾過膜で濾過する方法、処理法ε：フィルタープレスで固液分離後、精密濾過処理を行い、その濾液をさらに限外濾過膜で濾過する方法、などが挙げられる。

処理法αは、工程（１）で得られた糖液に、例えば未分解物のセルロースに代表される固体成分、高分子由来のゲル成分に代表される精密濾過膜表面を特に閉塞させやすい物質が少ない場合は精密濾過膜のみで固液分離を行うものであり、未分解のセルロースやバイオマスに付着している数十ｎｍ以上の粒径を有するシリカ等の無機成分を除くことが可能である。これらの固形分を除去しないと工程（２）のナノ濾過膜および／または逆浸透膜の表面を通過するときに膜表面を傷つけて膜を破壊したり、短時間で表面に堆積してフラックスを低下させる要因となる。

また、例えば未分解セルロースなどの固形物が多く、精密濾過膜だけでは経時的なフラックスが大幅に低下して全量濾過できない場合は、処理法βによって事前に遠心分離処理を行ってから精密濾過膜処理を行うことにより未分解のセルロースやバイオマスに付着している数十ｎｍ以上の粒径を有するシリカ等の無機成分を除くことが可能になる。処理法βでは、処理法αで示した固体成分、ゲル成分が少ない場合においても遠心分離処理によって事前に質量の比較的大きい成分を除外できるため精密濾過膜のメンテナンスが小さくて済みプロセスコストを低減させる効果を有する。

また、処理法βに加えてさらに後段に限外濾過膜を据える処理法γにより、精密濾過膜では除くことが出来ない数十ｎｍ以下の無機粒子成分や、リグニン由来の水溶性の高分子成分（タンニン）や、加水分解で分解したが単糖までにはならずオリゴ糖から多糖レベルで分解が途中である糖類、そして糖を加水分解する際に用いた酵素などを除くことが可能となる。無機粒子成分については後述の工程（２）で膜を傷つけ破壊したり、膜上に体積してフラックスを低下させたりする原因となる。また通常凝集して数十ｎｍサイズで存在している数ｎｍサイズ以下の極微粒子・クラスターに至っては膜内に入り閉塞させる可能性がある。同様にタンニン、オリゴ糖、多糖、酵素は膜上にゲル化して堆積したり、膜内で閉塞する因子になる。以上から限外濾過膜をさらに加えることで、工程（２）での膜ファウリングを抑制して膜のメンテナンスコストを大幅に低下することが可能になる効果がある。さらに加水分解時に酵素を利用する工程の場合は、限外濾過膜で酵素を回収することが可能であり、限外濾過膜で阻止された酵素を工程（１）の加水分解工程に戻して再利用することが可能となる利点も有する。

さらに、固液分離工程をフィルタープレス、遠心濾過、高速の遠心分離などさらに固液分離時の液の清澄度を高めることが可能な方法である処理法δを選択した場合は、処理法γから精密濾過工程を省き限外濾過膜工程を直接行うことも可能である。

また、液の清澄度が低い、つまり濁度が高い場合は限外濾過膜工程の膜ファウリングが多くなり限外濾過膜のメンテナンスコストが増大する原因となるため、限外濾過膜のランニングコストと照合して限外濾過膜のファウリング防止のため、精密濾過膜処理を限外濾過膜処理の前段に入れた清澄度の高い固液分離法である処理法εを選択することで、精密濾過膜および限外濾過膜の合計のランニングコストが限外濾過膜のみを使用する処理法δより下回る設計になることも考えられる。

次に、本発明の糖液の製造方法における工程（２）である、糖水溶液をナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過して、非透過側から精製糖液を回収し、透過側から発酵阻害物質を除去する工程に関して説明する。

本発明のいう発酵阻害とは、発酵阻害物質を含むセルロース含有バイオマスを原料とする糖液を発酵原料として使用して化学品を製造する際に、試薬単糖を発酵原料として使用する場合と比較した際に、化学品の生産量、蓄積量、あるいは生産速度の低下現象のことをいう。こうした発酵阻害の程度は、糖化液中に存在する発酵阻害物質の種類、およびこれらの量により微生物の受ける阻害の程度も異なり、また使用する微生物種、あるいはその生産物である化学品の種類によってもその阻害の程度は異なっているため、本発明においては特段限定されるものではない。

前記セルロース含有バイオマスの加水分解処理方法によって得られる糖水溶液には、処理方法あるいはセルロース含有バイオマス原料の種類により量あるいは成分に差があるものの、いずれも発酵阻害物質を含んでおり、該糖水溶液を工程（２）の処理方法により、発酵阻害物質を除去することができる。発酵阻害物質とは、セルロース含有バイオマスの加水分解で生成する化合物であり、かつ本発明の製造方法によって得られる糖液を原料とする発酵工程において前述の通り阻害的に作用する物質のことを指し、特にセルロース含有バイオマスの酸処理の工程で生成される、有機酸、フラン系化合物、フェノール系化合物に大きく分類される。

有機酸としては、酢酸、ギ酸、レブリン酸などが具体例として挙げられる。フラン系化合物としては、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）などが挙げられる。こうした有機酸あるいはフラン系化合物は、単糖であるグルコースあるいはキシロースの分解による産物である。

また、フェノール系化合物としては、バニリン、アセトバニリン、バニリン酸、シリンガ酸、没食子酸、コニフェリルアルデヒド、ジヒドロコニフェニルアルコール、ハイドロキノン、カテコール、アセトグアイコン、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル誘導体（Ｈｉｂｂｅｒｔ’ｓ ｋｅｔｏｎｅｓ）などが具体例として挙げられ、これらの化合物はリグニンまたはリグニン前駆体に由来する。

その他、セルロース含有バイオマスとして廃建材あるいは合板などを使用する際は、製材工程で使用された接着剤、塗料などの成分が発酵阻害物質として含まれる場合がある。接着剤としては、ユリア樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、ユリアメラミン共重合樹脂などが挙げられる。こうした接着剤に由来する発酵阻害物質として、酢酸、ギ酸、ホルムアルデヒドなどが挙げられる。

前記工程（１）により得られる糖水溶液には、発酵阻害物質として前記物質のうち少なくとも１種が含まれており、実際には複数種含まれている。なお、これらの発酵阻害物質は、薄相クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなど、一般的な分析手法により検出および定量することが可能である。

本発明で使用するナノ濾過膜とは、ナノフィルター（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。

本発明で使用する逆浸透膜とはＲＯ膜とも呼ばれるものであり、「１価のイオンを含めて脱塩機能を有する膜」と一般的に定義される膜であり、数オングストロームから数ナノメートル程度の超微小空隙を有していると考えられる膜で、主として海水淡水化や超純水製造などイオン成分除去に用いられる。

また、本発明における「ナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過する」とは、セルロース含有バイオマスの加水分解により得られた糖液を、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過し、溶解している糖、特にグルコースやキシロースといった単糖の糖液を非透過側に阻止または濾別し、発酵阻害物質を透過液、あるいは濾液として透過させることを意味する。

本発明で使用するナノ濾過膜および／または逆浸透膜の性能を評価する方法として、糖水溶液に含まれる対象化合物（発酵阻害物質、あるいは単糖など）の透過率（％）を算出することで評価できる。透過率（％）の算出方法を式１に示す。

透過率（％）＝（透過側の対象化合物濃度／非透過液の対象化合物濃度）×１００・・・（式１）。

式１における対象化合物濃度は、高い精度と再現性を持って測定可能な分析手法であれば限定されないが、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーなどが好ましく使用できる。本発明で使用するナノ濾過膜および／または逆浸透膜は、対象化合物が単糖である場合、その透過率が低い方が好ましく、その一方で対象化合物が発酵阻害物質である場合、その透過率が高いものが好ましい。

また、ナノ濾過膜の透過性能としては、０．３ＭＰａの濾過圧において、膜単位面積当たりの塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の透過流量（ｍ^３／ｍ^２／ｄａｙ）が０．５〜０．８のナノ濾過膜が好ましく用いられる。膜単位面積当たりの透過流量（膜透過流束またはフラックス）の評価方法としては、透過液量および透過液量を採水した時間および膜面積を測定することで、式２によって算出することができる。

膜透過流束（ｍ^３／ｍ^２／ｄａｙ）＝透過液量／膜面積／採水時間・・・（式２）。

ナノ濾過膜および／または逆浸透膜に供する糖水溶液のｐＨは特に限定されないが、ｐＨ１〜５であることが好ましい。ｐＨが１未満であると長期間使用した際に膜が変性してフラックス、透過率といった膜性能が著しく低下し、ｐＨが５より大きいと酢酸、ギ酸、レブリン酸といった有機酸の除去率が著しく低下する場合があるためである。ナノ濾過膜および／または逆浸透膜は膜表面が電荷を帯びているため溶液中にイオン化している物質の方が、イオン化していない物質に比べて除去または阻止しやすいことから、糖水溶液中に含まれる有機酸の含量が高い場合、あるいは高い除去効果が必要な場合、前記の範囲のｐＨに糖水溶液を調整することで、その除去効率を飛躍的に向上させることができる。また、糖水溶液のｐＨを１〜５に調整してナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過する効果として、膜のファウリング抑制効果がある。一般的にｐＨが低下するにつれて初期フラックス値は低下するが、特にセルロース含有バイオマス由来の糖水溶液に限っては、ｐＨが１〜５である方が膜の長期安定性が保つことができる。

また、特に逆浸透膜においては、糖水溶液のｐＨを１〜３に調製することがより好ましい。ナノ濾過膜同様、ｐＨが１未満であると長期間使用時に膜が変性してフラックス、透過率といった膜性能が著しく低下することは同様であるが、ｐＨが３より大きいと有機酸の除去率が十分得られないことがあるためである。これは、逆浸透膜はナノ濾過膜に対し孔径等が小さい等の理由により溶出成分のイオン性由来の電荷をより一層抑制しないと有機酸の有効半径であるイオン半径が大きくなり、ナノ濾過膜と同等の除去性能が保てないものと推察される。

なお、逆浸透膜の中でも操作圧力を低減できる低圧・超低圧タイプの逆浸透膜を使用すれば、原水の調整ｐＨが３より大きい値であっても、低圧・超低圧タイプでないＲＯ膜と同等の有機酸除去率となり、ｐＨ調整に使用する酸使用量、および後工程の発酵工程におけるｐＨ調整に使用するアルカリ使用量を低減させる効果が得られ、また、有機酸の除去率が低圧・超低圧タイプではない逆浸透膜に比べて有機酸の除去率が向上するため、本発明において好ましく使用される。ここで低圧・超低圧タイプの逆浸透膜とは、０．７５ＭＰａの濾過圧、ｐＨ６．５において、膜単位面積当たりの塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の透過流量（ｍ^３／ｍ^２／ｄａｙ）が０．４以上の逆浸透膜を指す。

糖水溶液のｐＨ調整に使用する酸もしくはアルカリは特に限定されるものではない。酸として好ましくは塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、より好ましくは発酵時の阻害が起こりにくい観点から硫酸、硝酸、リン酸、さらに好ましくは経済性の観点から硫酸である。アルカリとして好ましくは経済性の観点からアンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウムとそれらを含む水溶液、より好ましくは膜ファウリングの観点から１価イオンであるアンモニア、ナトリウム、さらに好ましくは発酵時の阻害が起こりにくい観点からアンモニアである。

糖水溶液のｐＨ調整を行う段階は、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜処理の前であればよい。またセルロース含有バイオマスの加水分解に酵素を利用する場合は、加水分解反応時にｐＨを５以下に調整しておいてもよい。また、限外濾過膜を利用して酵素を再利用するプロセスを利用する場合はｐＨを４以下まで低下させると酵素の失活が起こりやすいため限外濾過膜処理後の濾液をｐＨ調整することが好ましい。

本発明におけるナノ濾過膜および／または逆浸透膜に供する糖水溶液の温度は特に限定されないが、使用する膜の濾過時の発酵阻害物除去能を高める目的で適宜設定することができる。

具体的には、ナノ濾過膜で濾過する場合、糖水溶液の温度が４０〜８０℃であれば、ナノ濾過膜の発酵阻害物質除去能が高まるため、好ましく設定される。ナノ濾過膜で濾過する場合の糖水溶液の温度が４０℃以上の範囲から除去能が大きくなるものの、８０℃より高いとナノ濾過膜が変性してしまうことによって膜特性が失われることがあるからである。

また、逆浸透膜で濾過する場合、糖水溶液の温度が１〜１５℃であれば、逆浸透膜の発酵阻害物質除去能が高まるため、好ましく設定される。逆浸透膜で濾過する場合の糖水溶液の温度が１℃より低いと配管中の凍結により装置不良の原因となり、１５℃より高い場合は、損失低下に効果が大きく現れない。前記の温度制御は温度の高いと膜の膨張が起きてより分子量の大きいものが除去され、除去量も向上する傾向が得られ、温度が低いと膜の収縮が起きて膜の孔径が小さくなり糖の濾液側への損失が低減されることがあるからである。

一般的にナノ濾過膜は逆浸透膜に比べて孔径が大きい部類に峻別されるため、工程（２）においてナノ濾過膜を用いた場合は発酵阻害物質を透過させ除外する物質重量が逆浸透膜に比べて大きい反面、目的産物である単糖についても透過側に損失する重量も逆浸透膜に比べて大きくなると考えられる。特に糖濃度が高い場合には本傾向が強く現れる。一方、工程（２）において逆浸透膜を用いた場合は、孔径が小さいことからナノ濾過膜に比べて分子量の大きい阻害物を除去できる重量が減少してしまうと考えられる。従って、上記で示してきた処理により得られた糖液の発酵阻害物の重量の大小、および主要な発酵阻害物の分子量に応じて、ナノ濾過膜および逆浸透膜の中から適切な膜を選択して利用することが好ましい。選択する膜の種類は１種に限らず糖液の組成に応じてナノ濾過膜および逆浸透膜の中から組み合わせて多種類の膜を利用して濾過しても良い。

なお、ナノ濾過膜で精製糖液を得る場合、ナノ濾過膜の濃縮側に捕捉されていた単糖の精製が進んで濃度が高まるにつれて、単糖が濾液側に損失する傾向が急激に強くなることが見出された。一方、逆浸透膜で精製する場合、濃縮側の単糖濃度が高まっても単糖の損失傾向は殆どゼロに近いまま一定であったものの、発酵阻害物質除去の観点からはナノ濾過膜の方が逆浸透膜よりも性能が優れていた。そこで、逆浸透膜に比べて発酵阻害物質をより多く除去できるナノ濾過膜で濾液への糖損失が大きいと判断する濃度まで精製工程を行い、さらにナノ濾過膜よりは発酵阻害物質の除去効率が少し劣るが単糖を損失無く濃縮することが可能な逆浸透膜で精製工程を続けて行うことで、単糖の濾液側への損失を抑制しながら発酵阻害物質も多く除去できることが可能であることが見出された。したがって、本発明においてナノ濾過膜と逆浸透膜を組み合わせて精製糖液を得る場合、その組み合わせには特に限定はないが、工程（１）で得られる糖水溶液をまずナノ濾過膜で濾過し、得られる濾過液をさらに逆浸透膜で濾過することが好ましい。

本発明で使用されるナノ濾過膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載の、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。

これらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが適している。また、ポリアミド半透膜としては、多官能アミンと多官能酸ハロゲン化物との重縮合反応により得られる架橋ポリアミドの機能層を支持体に有してなる複合半透膜が適している。

ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜において、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、およびこれらの混合物がより好ましい。

前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、メチレンビスジアニリン、４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、ジアニシジン、３，３’，４−トリアミノビフェニルエーテル、３，３’，４，４’−テトラアミノビフェニルエーテル、３，３’−ジオキシベンジジン、１，８−ナフタレンジアミン、ｍ（ｐ）−モノメチルフェニレンジアミン、３，３’−モノメチルアミノ−４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、４，Ｎ，Ｎ’−（４−アミノベンゾイル）−ｐ（ｍ）−フェニレンジアミン−２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾイミダゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾオキサゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾチアゾール）等の芳香環を有する一級ジアミン、ピペラジン、ピペリジンまたはこれらの誘導体等の二級ジアミンが挙げられ、中でもピペラジンまたはピペリジンを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜は耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられる。より好ましくは前記架橋ピペラジンポリアミドまたは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドであり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドである。また、前記化学式１中、ｎ＝３のものが好ましく用いられる。架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とするナノ濾過膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のものが挙げられ、具体例として、架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式１中、ｎ＝３のものを構成成分として含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製の架橋ピペラジンポリアミド系ナノ濾過膜のＵＴＣ６０が挙げられる。

ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜モジュールとして使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜も、スパイラル型の膜モジュールとして好ましく使用される。好ましいナノ濾過膜モジュールの具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノ濾過膜であるＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜のＧＥｓｅｐａ、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００、ＮＦ−２７０またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０が挙げられ、より好ましくはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０であり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式１で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０である。

工程（２）におけるナノ濾過膜による濾過は、圧力をかけてもよく、その濾過圧は、０．１〜８ＭＰａの範囲であることが好ましい。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、濾過圧が０．５〜７ＭＰａの範囲であれば、膜透過流束が高いことから、糖溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１〜６ＭＰａの範囲であることが特に好ましい。

本発明で使用される逆浸透膜の素材としては、酢酸セルロール系のポリマーを機能層とした複合膜（以下、酢酸セルロース系の逆浸透膜ともいう）またはポリアミドを機能層とした複合膜（以下、ポリアミド系の逆浸透膜ともいう）が挙げられる。ここで、酢酸セルロース系のポリマーとしては、酢酸セルロース、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース等のセルロースの有機酸エステルの単独もしくはこれらの混合物並びに混合エステルを用いたものが挙げられる。ポリアミドとしては、脂肪族および／または芳香族のジアミンをモノマーとする線状ポリマーまたは架橋ポリマーが挙げられる。

本発明で使用される逆浸透膜の具体例としては、例えば、東レ株式会社製ポリアミド系逆浸透膜モジュールである超低圧タイプのＳＵＬ−Ｇ１０、ＳＵＬ−Ｇ２０、低圧タイプのＳＵ−７１０、ＳＵ−７２０、ＳＵ−７２０Ｆ、ＳＵ−７１０Ｌ、ＳＵ−７２０Ｌ、ＳＵ−７２０ＬＦ、ＳＵ−７２０Ｒ、ＳＵ−７１０Ｐ、ＳＵ−７２０Ｐの他、逆浸透膜としてＵＴＣ８０を含む高圧タイプのＳＵ−８１０、ＳＵ−８２０、ＳＵ−８２０Ｌ、ＳＵ−８２０ＦＡ、同社酢酸セルロース系逆浸透膜ＳＣ−Ｌ１００Ｒ、ＳＣ−Ｌ２００Ｒ、ＳＣ−１１００、ＳＣ−１２００、ＳＣ−２１００、ＳＣ−２２００、ＳＣ−３１００、ＳＣ−３２００、ＳＣ−８１００、ＳＣ−８２００、日東電工株式会社製ＮＴＲ−７５９ＨＲ、ＮＴＲ−７２９ＨＦ、ＮＴＲ−７０ＳＷＣ、ＥＳ１０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｄ、ＥＳ２０−Ｕ、ＥＳ１５−Ｄ、ＥＳ１５−Ｕ、ＬＦ１０−Ｄ、アルファラバル製ＲＯ９８ｐＨｔ、ＲＯ９９、ＨＲ９８ＰＰ、ＣＥ４０４０Ｃ−３０Ｄ、ＧＥ製ＧＥ Ｓｅｐａ、Ｆｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ３０−４０４０、ＴＷ３０−４０４０、ＸＬＥ−４０４０、ＬＰ−４０４０、ＬＥ−４０４０、ＳＷ３０−４０４０、ＳＷ３０ＨＲＬＥ−４０４０、ＫＯＣＨ製ＴＦＣ−ＨＲ、ＴＦＣ−ＵＬＰ、ＴＲＩＳＥＰ製ＡＣＭ−１、ＡＣＭ−２、ＡＣＭ−４などが挙げられる。

本発明においては、ポリアミド系の材質を有する逆浸透膜が好ましく使用される。酢酸セルロース系の膜を長時間使用時に前工程で使用する酵素、特にセルラーゼ成分の一部が透過して膜素材であるセルロースを分解することがあるからである。

膜形態としては、平膜型、スパイラル型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。

工程（２）における逆浸透膜による濾過は、圧力をかけてもよく、その濾過圧は、０．１〜８ＭＰａの範囲であることが好ましい。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、濾過圧が０．５〜７ＭＰａの範囲であれば、膜透過流束が高いことから、糖溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１〜６ＭＰａの範囲であることが特に好ましい。

前記工程（２）において、発酵阻害物質はナノ濾過膜および／または逆浸透膜を透過することにより糖水溶液から除去される。前記発酵阻害物質の中でも、ＨＭＦ、フルフラール、酢酸、ギ酸、レブリン酸、バニリン、アセトバニリンまたはシリンガ酸が好ましく透過・除去されうる。一方、糖水溶液に含まれる糖分は、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜の非透過側に阻止または濾別される。糖分としては、グルコース、キシロースといった単糖が主成分であるが、２糖、オリゴ糖など工程（１）の加水分解の工程において、単糖まで完全に分解されなかった糖成分も含まれてなる。

工程（２）においてナノ濾過膜および／または逆浸透膜の非透過側から得られる精製糖液は、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じる前の糖水溶液に対して、特に発酵阻害物含量が初期含量に対して低減している。該精製糖液に含まれる糖成分は、セルロース含有バイオマスに由来する糖であり、本質的には、工程（１）の加水分解で得られる糖成分と大きな変化はない。すなわち、本発明の精製糖液に含まれる単糖としてはグルコースおよび／またはキシロースが主成分として構成される。グルコースとキシロースの比率は、工程（１）の加水分解の工程により変動するものであり本発明で限定されるものではない。すなわち、ヘミセルロースを主として加水分解を行った場合は、キシロースが主要な単糖成分となり、ヘミセルロース分解後、セルロース成分のみを分離して加水分解を行った場合は、グルコースが主要な単糖成分となる。また、ヘミセルロースの分解、およびセルロースの分解を、特段の分離を行わない場合は、グルコース、およびキシロースが主要な単糖成分として含まれる。

なお、前記工程（２）で得られる精製糖液を、一旦エバポレーターに代表される濃縮装置を用いて濃縮してもよく、また、精製糖液を、さらに、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜で濾過して濃度を高めてもよいが、濃縮のためのエネルギー削減という観点から、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜で濾過して精製糖液濃度をさらに高める工程が好ましく採用できる。この濃縮工程で使用する膜とは被処理水の浸透圧以上の圧力差を駆動力にイオンや低分子量分子を除去する濾過膜であり、例えば酢酸セルロースなどのセルロース系や、多官能アミン化合物と多官能酸ハロゲン化物とを重縮合させて微多孔性支持膜上にポリアミド分離機能層を設けた膜などが採用できる。ナノ濾過膜および／または逆浸透膜表面の汚れすなわちファウリングを抑制するために、酸ハライド基と反応する反応性基を少なくとも１個有する化合物の水溶液をポリアミド分離機能層の表面に被覆して、分離機能層表面に残存する酸ハロゲン基と該反応性基との間で共有結合を形成させた主に下水処理用の低ファウリング膜なども好ましく採用できる。本発明で使用するナノ濾過膜および／または逆浸透膜としては、少なくとも、工程（２）で使用するナノ濾過膜および／または逆浸透膜に対して、グルコースあるいはキシロースといった単糖の阻止率がより高いものがより好ましく採用できる。

濃縮に使用するナノ濾過膜または逆浸透膜の具体例は、前記のナノ濾過膜または逆浸透膜の具体例に準ずる。

また、工程（２）により濾液排出される水を、加水分解や糖精製といった糖を製造する工程または後の発酵や化学品精製といった化学品を製造する工程に再利用しても良い。さらに濾液を一度ナノろ過膜および／または逆浸透膜にて再度ろ過した後、該再利用を行っても良い。より好ましくは、ｐＨを１〜５に調整してナノろ過膜及び／または逆浸透膜にて精製した後、その濾液をナノろ過膜および／または逆浸透膜によりろ過した後、該の再利用を行う方法である。さらに好ましくは、ｐＨを１〜５に調整してナノろ過膜および／または逆浸透膜にて精製した後、さらにｐＨを上昇させてナノろ過膜及び／または逆浸透膜で特に有機酸を選択的に除外して該再利用を行う方法である。

次に、本発明の糖液の製造方法で得られた精製糖液を発酵原料として使用する化学品の製造方法に関して説明する。

本発明で得られた精製糖液を発酵原料として使用されることにより、化学品を製造することが可能である。本発明で得られる精製糖液は、微生物あるいは培養細胞の生育のための炭素源であるグルコースおよび／またはキシロースを主成分として含んでおり、一方でフラン化合物、有機酸、芳香族化合物などの発酵阻害物質の含量が極めて少ないために、発酵原料、特に炭素源として有効に使用することが可能である。

本発明の化学品の製造方法で使用される微生物あるいは培養細胞は、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。特に、セルロース含有バイオマスに由来する糖液には、キシロースといったペントースを含むため、ペントースの代謝経路を強化した微生物が好ましく使用できる。

本発明の化学品の製造方法で使用される培地としては、精製糖液の他に、窒素源、無機塩類、さらに必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する液体培地が好ましく使用される。本発明の精製糖液には、炭素源として、グルコース、キシロースなど微生物が利用可能な単糖を含んでいるが、場合によっては、さらに炭素源として、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなどを追加して、発酵原料として使用してもよい。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。

本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加すればよい。また、消泡剤を必要に応じて使用してもよい。

微生物の培養は、通常、ｐＨ４〜８、温度２０〜４０℃の範囲で行われる。培養液のｐＨは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって、通常、ｐＨ４〜８範囲内のあらかじめ定められた値に調節する。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。

本発明の糖液の製造方法で得られた精製糖液を発酵原料として使用する化学品の製造方法としては、当業者に公知の発酵培養方法が採用されうるが、生産性の観点から、ＷＯ２００７／０９７２６０に開示される連続培養方法が好ましく採用される。

本発明の化学品の製造方法で製造される化学品としては、上記微生物や細胞が培養液中に生産する物質であれば制限はない。本発明で製造される化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、アルコールとしては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなど、有機酸としては、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸、核酸であれば、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、またカダベリンなどのジアミン化合物を挙げることができる。また、本発明は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質のような物質の生産に適用することも可能である。

以下、本発明の糖液の製造方法に関し、さらに詳細に説明するために実施例を挙げて説明する。しかしながら、本発明は、これらの実施例に限定されない。

（参考例１）単糖濃度の分析方法
得られた糖水溶液に含まれる単糖濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Ｌｕｎａ ＮＨ_２（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
移動相：超純水：アセトニトリル＝２５：７５（流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：なし
検出方法：ＲＩ（示差屈折率）
温度：３０℃。

（参考例２）発酵阻害物質濃度の分析方法
糖液に含まれるフラン系発酵阻害物質（ＨＭＦ、フルフラール）、およびフェノール系発酵阻害物質（バニリン、アセトバニリン、シリンガ酸、レブリン酸、４−ヒドロキシ安息香酸）は下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Synergi HidroRP ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）
移動相：アセトニトリル−０．１％ Ｈ_３ＰＯ_４（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：ＵＶ（２８３ｎｍ）
温度：４０℃。

糖液に含まれる有機酸系発酵阻害物質（酢酸、ギ酸）は下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
カラム：Shim-Pack SPR-HとShim-Pack SCR１０１H（株式会社島津製作所製）の直列
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ
ビストリス、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。

（参考例３）セルロース含有バイオマスの希硫酸処理・酵素処理による加水分解工程
工程（１）のセルロース含有バイオマスを加水分解する工程に関し、０．１〜１５重量％の希硫酸および酵素を使用するセルロース含有バイオマスの加水分解方法について例を挙げて説明する。

セルロース含有バイオマスとして、稲藁を使用した。前記セルロース含有バイオマスを硫酸１％水溶液に浸し、１５０℃で３０分オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）した。処理後、固液分離を行い、硫酸水溶液（以下、希硫酸処理液）と硫酸処理セルロースに分離した。次に硫酸処理セルロースと固形分濃度が１０重量％となるように希硫酸処理液と攪拌混合した後、水酸化ナトリウムによって、ｐＨを５付近に調整した。この混合液に、セルラーゼとしてトリコデルマセルラーゼ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）およびノボザイム１８８（アスペルギルスニガー由来βグルコシダーゼ製剤、シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を添加し、５０℃で３日間攪拌混同しながら、加水分解反応を行った。その後、遠心分離（３０００Ｇ）を行い、未分解セルロースあるいはリグニンを分離除去し、糖水溶液を得た。糖水溶液の濁度は７００ＮＴＵであった。さらに糖水溶液に含まれる発酵阻害物質および単糖の組成はそれぞれ表１および２の通りであった。

（参考例４）セルロース含有バイオマスの水熱処理・酵素処理による加水分解工程
工程（１）のセルロース含有バイオマスを加水分解する工程に関し、水熱処理および酵素を使用するセルロース含有バイオマスの加水分解方法について例を挙げて説明する。

セルロース含有バイオマスとして、稲藁を使用した。前記セルロース含有バイオマスを水に浸し、撹拌しながら１８０℃で２０分間オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）した。その際の圧力は１０ＭＰａであった。処理後は溶液成分（以下、水熱処理液）と処理バイオマス成分に遠心分離（３０００Ｇ）を用いて固液分離した。水熱処理液のｐＨは４．０、水熱処理液の濁度は８００ＮＴＵであった。

次に処理バイオマス成分の含水率を測定後、前記の絶乾処理バイオマス換算で固形分濃度が１５重量％となるようにＲＯ水を添加し、さらにセルラーゼとしてトリコデルマセルラーゼ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）およびノボザイム１８８（アスペルギルスニガー由来βグルコシダーゼ製剤、シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を添加し、５０℃で３日間攪拌混同しながら、加水分解反応を行った。その後、遠心分離（３０００Ｇ）を行い、未分解セルロースあるいはリグニンを分離除去して糖水溶液を得た。糖水溶液のｐＨは５．２、糖水溶液の濁度は９００ＮＴＵであった。さらに水熱処理液および糖水溶液に含まれる発酵阻害物質および単糖の組成は表３および４の通りであった。

（参考例５）セルロース含有バイオマスのアンモニア処理・酵素処理による加水分解工程
工程（１）のセルロース含有バイオマスを加水分解する工程に関し、５．０〜１００重量％アンモニア水のおよび酵素を使用するセルロース含有バイオマスの加水分解方法について例を挙げて説明する。セルロース含有バイオマスとして、稲藁を使用した。前記セルロース含有バイオマスを小型反応器（耐圧硝子工業株式会社製、ＴＶＳ−Ｎ２ ３０ｍＬ）に投入し、液体窒素で冷却した。この反応器にアンモニアガスを流入し、試料を完全に液体アンモニアに浸漬させた。リアクターの蓋を閉め、室温で１５分ほど放置した。次いで、１５０℃のオイルバス中にて１時間処理した。処理後、反応器をオイルバスから取り出し、ドラフト中で直ちにアンモニアガスをリーク後、さらに真空ポンプで反応器内を１０Ｐａまで真空引きし前記セルロース含有バイオマスを乾燥させた。この処理セルロース含有バイオマスと固形分濃度が１５重量％となるように純水を攪拌混合した後、硫酸によって、ｐＨを５付近に調整した。この混合液に、セルラーゼとしてトリコデルマセルラーゼ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン）およびノボザイム１８８（アスペルギルスニガー由来βグルコシダーゼ製剤、シグマ・アルドリッチ・ジャパン）を添加し、５０℃で３日間攪拌混同しながら、加水分解反応を行った。その後、遠心分離（３０００Ｇ）を行い、未分解セルロースあるいはリグニンを分離除去した糖水溶液を得た。糖水溶液の濁度は６００ＮＴＵであった。さらに糖水溶液に含まれる発酵阻害物質および単糖の組成は表５および６の通りであった。

（実施例１）希硫酸処理・酵素処理糖水溶液をナノ濾過膜または逆浸透膜に通じて濾過する工程
参考例３で得られた糖水溶液をナノ濾過膜（ＮＦ膜）または逆浸透膜（ＲＯ膜）に通じて濾過して、非透過側から精製糖液を回収し、透過側から発酵阻害物質を除去する工程に関し、実施例を挙げて説明する。参考例３で得られた糖水溶液２０Ｌを、さらに細孔径０．０５μｍＰＶＤＦ膜を使用して濾過を行い、ナノ濾過膜または逆浸透膜モジュールに通じて処理を行った。図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に実施例２で得られた糖水溶液２０Ｌを注入した。その後、原水槽１に２００ＬのＲＯ水を添加した。図２の符号７に示されるナノ濾過膜として、架橋ピペラジンポリアミド系ナノ濾過膜ＵＴＣ６０（東レ株式会社製）、ＲＯ膜として架橋全芳香族ポリアミド系逆浸透膜ＵＴＣ８０（東レ株式会社製）をセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプ３の圧力を３ＭＰａに調整し、透過液を除去した。透過液は、計２００Ｌ除去し、原水槽に残った２０Ｌ弱の溶液を、ＲＯ水により２０Ｌにメスアップし、これを精製糖液とした。

参考例３で得られた糖水溶液、および前記精製糖液に含まれる発酵阻害物質（ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、アセトバニリン、シリンガ酸）は参考例１に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。また単糖濃度は参考例１記載のＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。その結果を表７および８にまとめた。発酵阻害物質としては、酢酸、ギ酸、フルフラール、ＨＭＦ、バニリン、アセトバニリン、シリンガ酸、レブリン酸が含まれることが分析より示された。またそれぞれの糖液に含まれる単糖としては、グルコースおよびキシロースが主成分であった。また極少量ではあるが、アラビノース、マンノースに関しても検出された。さらに、精製糖液は参考例３で得られた糖水溶液に比べ、発酵阻害物質の量が大きく減少していることが確認できた。また一方で、糖濃度は大きく減少しておらず、糖水溶液をナノ濾過膜または逆浸透膜に通じて処理することで、透過液として発酵阻害物質を除去でき、非透過側から発酵阻害物質濃度が低減した精製糖液を回収できることが確認できた。

（実施例２）水熱処理・酵素処理糖水溶液をナノ濾過膜または逆浸透膜に通じて濾過する工程
参考例４で得られた糖水溶液をナノ濾過膜または逆浸透膜に通じて濾過して、非透過側から精製糖液を回収し、透過側から発酵阻害物質を除去する工程に関し、実施例１と同様の方法で精製糖液を得て、発酵阻害物質と単糖濃度を定量した。その結果を表９および１０にまとめた。発酵阻害物質としては、酢酸、ギ酸、フルフラール、ＨＭＦ、バニリン、アセトバニリン、シリンガ酸が含まれることが分析より示された。またそれぞれの糖液に含まれる単糖としては、グルコースおよびキシロースが主成分であった。また極少量ではあるが、アラビノース、マンノースに関しても検出された。

各精製糖液は、参考例４で得られた糖水溶液に比べ、発酵阻害物質の量が大きく減少していることが確認できた。また一方で、糖濃度は大きく減少しておらず、糖水溶液をナノ濾過膜または逆浸透膜に通じて処理することで、透過液として発酵阻害物質を除去でき、非透過側から発酵阻害物質濃度が低減した精製糖液を回収できることが確認できた。

（実施例３）アンモニア処理・酵素処理糖水溶液をナノ濾過膜または逆浸透膜に通じて濾過する工程
参考例５で得られた糖水溶液をナノ濾過膜または逆浸透膜に通じて濾過して、非透過側から精製糖液を回収し、透過側から発酵阻害物質を除去する工程に関し、実施例１と同様の方法で精製糖液を得て、発酵阻害物質と単糖を定量した。その結果を表１１および１２にまとめた。発酵阻害物質としては、酢酸、ギ酸、フルフラール、ＨＭＦ、バニリン、アセトバニリン、シリンガ酸が含まれることが分析より示された。またそれぞれの糖液に含まれる単糖としては、グルコースおよびキシロースが主成分であった。また極少量ではあるが、アラビノース、マンノースに関しても検出された。

各精製糖液は、参考例５で得られた糖水溶液に比べ、発酵阻害物質の量が大きく減少していることが確認できた。また一方で、糖濃度は大きく減少しておらず、糖水溶液をＮＦ膜またはＲＯ膜に通じて処理することで、透過液として発酵阻害物質を除去でき、非透過側から発酵阻害物質濃度が低減した精製糖液を回収できることが確認できた。

（実施例５）水熱処理液をナノ濾過膜または逆浸透膜に通じて濾過する工程
参考例４で得られた水熱処理液をナノ濾過膜または逆浸透膜に通じて濾過して、非透過側から精製糖液を回収し、透過側から発酵阻害物質を除去する工程に関し、実施例１と同様の方法で精製糖液を得て、発酵阻害物質と単糖濃度を定量した。その結果を表１３および１４にまとめた。発酵阻害物質としては、酢酸、ギ酸、フルフラール、ＨＭＦ、バニリン、アセトバニリン、シリンガ酸が含まれることが分析より示された。またそれぞれの糖液に含まれる単糖としては、グルコースおよびキシロースが主成分であった。また極少量ではあるが、アラビノース、マンノースに関しても検出された。

各精製糖液は、参考例４で得られた水熱処理液に比べ、発酵阻害物質の量が大きく減少していることが確認できた。また一方で、糖濃度は大きく減少しておらず、糖水溶液をＮＦ膜またはＲＯ膜に通じて処理することで、透過液として発酵阻害物質を除去でき、非透過側から発酵阻害物質濃度が低減した精製糖液を回収できることが確認できた。

（実施例６）モデル糖液を用いてナノ濾過膜または逆浸透膜に通じて濾過する工程
バイオマスを加水分解処理した糖水溶液のモデル糖液として糖濃度の高いもの（モデル糖水溶液Ａ）と糖濃度の低いもの（モデル糖水溶液Ｂ）を用意した。表１５および１６に各々の組成を示す。

硫酸または水酸化ナトリウムを用いてｐＨを０．５、１、２、３、４、５、６、７に調整したモデル糖液ＡおよびＢを実施例１と同様の方法で濾過し、透過液に含まれる発酵阻害物質および糖の濃度を参考例１に記載の方法で定量した。結果を表１７〜２０に示す。単糖の透過率はモデル糖液ＡとＢで差異があったが、ｐＨによる差異は認められなかった。また、発酵阻害物質の透過率についてはｐＨにより差異が見られたが、モデル糖液ＡとＢの間で差異は見られなかった。

以上の結果より、ナノ濾過膜および逆浸透膜ともに発酵阻害物質を濾液側に除去しながら単糖濃度を高めることが可能であることを見出した。また、糖濃度が高い場合にはナノ濾過膜の濾液側に単糖を損失する割合が増加する一方、逆浸透膜では糖損失は変わらず殆どないことが判明した。さらにｐＨによって有機酸の除去率が大幅に変化することを見出した。

（実施例７）水熱処理・酵素処理糖水溶液を逆浸透膜に通じて濾過する工程（ｐＨ調整によるファウリング抑制効果）
参考例４で得られた糖水溶液のｐＨ調整によるファウリング抑制効果を調べた。参考例４で得られた糖水溶液１０Ｌを、精密濾過膜（ミリポア社製、細孔径０．４５μｍＰＶＤＦ膜）で濾過した。この時の濁度は１ＮＴＵ以下であった。さらに限外濾過膜（ＧＥ ＳＥＰＡ ＰWシリーズ、ポリエーテルスルホン、分画分子量１００００）で濾過を行った。その後、この濾液を２Ｌずつに分けてｐＨを１、２、３、５、７となるように硫酸およびアンモニアを用いてそれぞれ調製し、原水槽が０．５Ｌになるまで実施例１と同様の方法で逆浸透膜に通じて濾過（濃縮倍率４倍）し、透過液を回収する際のフラックス量を透過液合計量の経時変化の差分をとって計算した。フラックスの計算結果を図３に示す。その結果、ｐＨが１の時はフラックスが非常に小さく濾過に長時間かかり、ｐＨが７の時は運転途中からのフラックス低下が顕著に現れた。ｐＨが２，３，５の時も約１．５時間後から低下が見られるがこれは糖濃度が高くなり浸透圧が大幅に上昇したためと推察された。また、糖水溶液と精製糖液の単糖および発酵阻害物質濃度は表２１および２２に示す通りであり、単糖は濃縮倍率通り濃縮されるのに比べ、発酵阻害物質の濃縮の程度は低く、糖水溶液から発酵阻害物質が除去されていることが確認できた。

（実施例８）水熱処理液をナノ濾過膜に通じて濾過する工程（精密濾過膜・限外濾過膜のファウリング抑制効果）
参考例４で得られた水熱処理液をナノ濾過膜で濃縮する前に濾過処理した場合のファウリング抑制効果について、容量を減らした加速度試験により調べた。参考例４で得られた水熱処理液をそのまま遠心分離処理のみ行った液、精密濾過膜（ミリポア社製、細孔径０．４５μｍＰＶＤＦ膜）処理を行った液、限外濾過膜（ＧＥ ＳＥＰＡ ＰWシリーズ、ポリエーテルスルホン、分画分子量１００００）処理を行った液の３種類用意してｐＨを３に調整した。この時の濁度は遠心分離処理液が８００ＮＴＵ、残り２種は共に１ＮＴＵ以下であった。各液２Ｌを原水槽が０．５Ｌになるまで実施例１と同様の方法でナノ濾過膜に通じて濾過し、透過液を回収する際のフラックス量を透過液合計量の経時変化の差分をとって計算した。フラックスの計算結果を図４に示す。その結果、遠心分離のみの処理では濁度も高く濃縮中にフラックスが急激に低下した。濁度を規定している成分が濃縮中に膜に付着して膜の濾過性を急激に悪化させたと推察された。

（実施例９）ファウリング成分の同定
参考例４で得られた水熱処理液を曝気して洗浄しながら精密濾過した後の膜を、真空乾燥させて走査電子顕微鏡装置（株式会社日立ハイテクノロジーズ製Ｓ−４８００）により観察した。さらに該走査電子顕微鏡装置に付随のエネルギー分散型X線分析装置（株式会社堀場製作所製ＥＸ−２５０）を用いて成分分析を行った。その結果、精密濾過膜上に図５に示すようなゲル状の体積物と数ｎｍから数ミクロンレベルの粒子が多数見られた。この成分をエネルギー分散型X線分析装置のマッピングモードで成分の分散を調べたところ、Ｓｉ（ケイ素）およびＯ（酸素）が粒子と同様の場所に多く検出された（図６）。この粒子状のものはＳｉＯ_２（シリカ）と推察される。また周りのゲル状の成分としてＣ（炭素）およびＯ（酸素）が観察された。以上からゲル状のものは未分解のセルロース、リグニンなどと考えられた。さらに精密濾過した濾液を限外濾過膜で濾過し、限外濾過膜をＲＯ水で軽く洗浄した後、真空乾燥させて走査電子顕微鏡で２０ｋＶの電圧をかけながら１００倍の倍率にしてエネルギー分散型X線分析装置で元素分析のみを異なる３点でおこなった。結果、Ｃ（炭素）が７２〜７７％、Ｏ（酸素）が２０〜２５％検出された。以上から除去成分は水溶性の多糖、タンニン、ポリフェノールなどが限外濾過膜上に堆積し除去されると推察された。

（実施例１０）酵素の回収
上記参考例１で得られた糖水溶液より酵素を回収した例を説明する。酵素の回収には、分画分子量１０，０００のポリエーテルスルホン製限外濾過膜（直径４４．５ｍｍ、ミリポア）を攪拌式セル８０００シリーズ（ミリポア）に設置し、窒素ボンベを使用して加圧ろ過を行った。加圧ろ過は、実施例１で得られた糖液５０ｍＬを非透過側に投入し、透過液として４５ｍＬを除去した。非透過側に残った糖液５ｍＬの酵素濃度（タンパク質濃度）を測定した。酵素濃度は、ＢＣＡ測定キット（BCA Protein Assay Regent kit、ピアス社）を使用して行い、牛アルブミン（２ｍｇ／ｍＬ）を標品として、５６２ｎｍの吸光度を測定し、比色定量を行った。その結果、初期投入時の酵素濃度１００％として、参考例１で回収された酵素濃度は、相対値として１０〜６０％の範囲回収できることが確認できた。

（実施例１１）糖水溶液温度による発酵阻害物質除去能力の変化
参考例５で得られたアンモニア処理・酵素処理糖水溶液を精密濾過膜、限外濾過膜で濾過後、さらにナノ濾過膜に通じて濾過して、非透過側から精製糖液を回収し、透過側から発酵阻害物質を除去する工程に関し、実施例を挙げて説明する。参考例５で得られた糖水溶液４Ｌを、精密濾過膜（ミリポア社製、細孔径０．４５μｍＰＶＤＦ膜）で濾過した。この時の濁度は１ＮＴＵ以下であった。さらに限外濾過膜（ＧＥ ＳＥＰＡG ＰWシリーズ ポリエーテルスルホン 分画分子量１００００）で濾過を行った。この糖水溶液をｐＨが３になるように硫酸で調製した後、２Ｌずつを糖水溶液温度２５℃または５０℃の条件下で原水槽が０．５Ｌになるまで実施例１と同様の方法で逆浸透膜に通じて濾過し、透過液を回収した。濾過を終えたら共に液が２ＬとなるようにＲＯ水でメスアップし精製糖液とした。糖水溶液温度が２５℃の場合と５０℃の場合の精製糖液の濃度は表２３に示す通りであり、糖水溶液温度上昇によって発酵阻害物質の除去能が改善された。糖水溶液温度上昇によって膜の孔径が大きくなったためと推察された。

（実施例１２）糖水溶液温度による単糖損失抑制レベルの変化
参考例５で得られたアンモニア処理・酵素処理糖水溶液を精密濾過膜、限外濾過膜で濾過後、さらにナノ濾過膜に通じて濾過して、非透過側から精製糖液を回収し、透過側から発酵阻害物質を除去する工程に関し、実施例を挙げて説明する。参考例５で得られた糖水溶液４Ｌを、精密濾過膜（ミリポア社製、細孔径０．４５μｍＰＶＤＦ膜）で濾過した。この時の濁度は１ＮＴＵ以下であった。さらに限外濾過膜（ＧＥ ＳＥＰＡ ＰWシリーズ、ポリエーテルスルホン、分画分子量１０，０００、ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製）で濾過を行った。この糖水溶液をｐＨが３になるように硫酸で調製した後、２Ｌずつを糖水溶液温度２５℃または１０℃の条件下で原水槽が０．５Ｌになるまで実施例１と同様の方法でナノ濾過膜に通じて濾過し、透過液を回収した。濾過を終えたら共に液が２ＬとなるようにＲＯ水でメスアップし精製糖液とした。糖水溶液温度が２５℃の場合と１０℃の場合の精製糖液の濃度は表２４に示す通りであり、温度上昇によって糖の損失量が改善された。糖水溶液温度の低下によって膜の孔径が小さくなったためと推察された。

（実施例１３）各種ナノ濾過膜による精製糖液の製造例
参考例３で得られた糖水溶液を、さらに精密濾過膜（ミリポア社製、細孔径０．０５μｍＰＶＤＦ膜）を使用して濾過を行い、糖水溶液をＲＯ水で２０倍希釈した溶液２０Ｌを実施例１と同様の方法により１Ｌになるまでナノ濾過膜処理した。９０φナノ濾過膜として、架橋ピペラジンポリアミド系ナノ濾過膜ＵＴＣ６０（ナノ濾過膜１；東レ株式会社製）、架橋ピペラジンポリアミド系ナノ濾過膜ＮＦ−４００（ナノ濾過膜２；フィルムテック製）、ポリアミド系ナノ濾過膜ＮＦ９９（ナノ濾過膜３；アルファラバル製）、酢酸セルロース系ナノ濾過膜ＧＥ Ｓｅｐａ ＤＫ（ナノ濾過膜４；ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製）を使用した。透過液に含まれる発酵阻害物質（酢酸、ギ酸、ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、アセトバニリン、シリンガ酸、レブリン酸）の透過率および単糖（グルコース、キシロース）の透過率を計算した。その結果、いずれのナノ濾過膜においても単糖と発酵阻害物質を阻害することができたが、特にナノ濾過膜１〜３、すなわちポリアミド系、架橋ピペラジンポリアミド系のナノ濾過膜が、単糖の透過率が低く、一方で発酵阻害物質の透過率が高いことが示された（表２５および２６）。

（実施例１４）各種逆浸透膜による精製糖液の製造例
参考例５で得られた糖水溶液を精密濾過膜（ミリポア社製、細孔径０．４５μｍＰＶＤＦ膜）で濾過した。この時の濁度は１ＮＴＵ以下であった。さらに限外濾過膜（ＧＥ ＳＥＰＡ ＰWシリーズ、ポリエーテルスルホン、分画分子量１００００）で濾過を行った。この濾液をｐＨが３になるように硫酸で調製した後、２０Ｌを実施例１と同様の方法により逆浸透膜処理した。逆浸透膜として、架橋全芳香族ポリアミド系逆浸透膜ＵＴＣ８０（逆浸透膜１；東レ株式会社製）、架橋全芳香族ポリアミド系逆浸透膜ＵＴＣ８０を５０℃で１日間、セルラーゼ酵素液であるノボザイム１８８（アスペルギルスニガー由来βグルコシダーゼ製剤、シグマ・アルドリッチ・ジャパン）に浸した後ＲＯ水で洗浄した膜（逆浸透膜２）、ポリアミド系逆浸透膜ＤＥＳＡＬ−３Ｂ（逆浸透膜３；ＤＥＳＡＬ製）、酢酸セルロース系逆浸透膜ＧＥ ＳＥＰＡ ＣＥ（逆浸透膜４；ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）（比較例）、酢酸セルロース系逆浸透膜ＧＥ ＳＥＰＡ ＣＥ（ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）を５０℃で１日間、セルラーゼ酵素液であるノボザイム１８８（アスペルギルスニガー由来βグルコシダーゼ製剤、シグマ・アルドリッチ・ジャパン）に浸した後ＲＯ水で洗浄した膜（逆浸透膜５）を使用し、原水の液量が投入時の４分の１に濃縮されるまで透過液を回収した。

透過液と等量のＲＯ水を原水槽内の濃縮液に投入した後、原水槽および透過液に含まれる、発酵阻害物質の濃度をＨＰＬＣ（島津製）により分析し、発酵阻害物質（酢酸、ギ酸、ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、アセトバニリン、シリンガ酸）の透過率および単糖（グルコース、キシロース）の透過率を計算した。その結果、いずれの逆浸透膜においても単糖と発酵阻害物質を阻害することができたが、特に逆浸透膜１〜２、すなわちポリアミド系、架橋全芳香族ポリアミド系の逆浸透膜が、単糖の透過率が低く、一方で発酵阻害物質の透過率が高いことが示された。また、酢酸セルロース系の膜はセルラーゼ耐性も弱いことが明らかになった（表２７および２８）。

（実施例１５）単糖および発酵阻害物質の濃縮効果の比較
単糖および発酵阻害物質の濃縮効果を比較するため、糖水溶液をナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過した場合の単糖と発酵阻害物質の濃縮度を比較した。参考例５で得られたアンモニア処理・酵素処理糖水溶液６０Ｌをアンモニア水および硫酸でｐＨ３に調製した後、精密濾過膜で濾過した。さらに限外濾過膜を通して濾過した。この時の濁度は０．５ＮＴＵ以下であった。この濾液を３種類（２０Ｌずつ）に分けて、実施例７と同様の方法でナノ濾過膜のみで原液側の量が５Ｌになるまで処理（４倍濃縮）、ナノ濾過膜で原液側の量が１０Ｌになるまで処理（２倍濃縮）後に逆浸透膜で原液側の量が１０Ｌになるまで処理（さらに２倍濃縮、合わせて４倍濃縮）、逆浸透膜のみで原液側の量が５Ｌになるまで処理（４倍濃縮）を行った。ナノ濾過膜として、架橋ピペラジンポリアミド系ナノ濾過膜ＵＴＣ６０（ナノ濾過膜１；東レ株式会社製）を、逆浸透膜として、架橋全芳香族ポリアミド系逆浸透膜ＵＴＣ８０（逆浸透膜１；東レ株式会社製）用いた。

精製糖液に含まれる単糖および発酵阻害物質の濃度を参考例１に示した条件でＨＰＬＣにより分析した結果を表２９に示す。なお、表中の濃度の下段には括弧内にグルコースを５０ｇ／Ｌに後から薄めた場合の濃度をそれぞれ示した。その結果、単糖の濃縮度に比べて発酵阻害物質の濃縮度は低く、ナノ濾過膜処理、ナノ濾過膜処理後逆浸透膜処理、逆浸透膜処理の順にグルコース濃度あたりの発酵阻害物質除去性能がよいことが判明した。一方で、ナノ濾過膜と逆浸透膜を併用することで、糖濃度が１００ｇ／Ｌ以上の高い場合に顕著に現れるナノ濾過膜の濾液側への損失を抑えることが可能であり、発酵阻害物質の除去性能も逆浸透膜のみで処理する場合に比べて大幅に改善された。

（実施例１６）低圧・超低圧タイプ逆浸透膜による精製糖液の製造例
逆浸透膜の種類に応じた単糖および発酵阻害物質の濃縮効果を比較するため、実施例６と同様の方法でモデル糖液を用いて透過流量の異なる逆浸透膜に通じて濾過を行った。バイオマスを加水分解処理した糖水溶液のモデル糖液各々の組成を表３０に示す。

逆浸透膜として、低圧タイプの例としてＦｉｌｍｔｅｃ製ＢＷ−３０（逆浸透膜６）、東レ株式会社製ＳＵ−７００（逆浸透膜７）、超低圧タイプの例としてＫＯＣＨ製ＴＦＣ−ＵＬＰ（逆浸透膜８）、東レ株式会社製ＳＵＬ−Ｇ１０（逆浸透膜９）、また参考として中圧タイプのＤＥＳＡＬ社製ＤＥＳＡＬ−３Ｂ（逆浸透膜１０）を使用した。各膜の０．７５ＭＰａの濾過圧、ｐＨ６．５において、膜単位面積当たりの塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の透過流量（ｍ^３／ｍ^２／ｄａｙ）を表３１に示す。

硫酸または水酸化ナトリウムを用いてｐＨを２、３、４、５、６、７に調整したモデル糖液ＡおよびＢを実施例１と同様の方法で濾過し、透過液に含まれる発酵阻害物質である酢酸、および糖の濃度を参考例１に記載の方法で定量した。結果を表３２および３３に示す。酢酸の透過率についてはｐＨにより差異が見られ、糖損失は低圧タイプの方が超低圧タイプより極わずかであるが少ない傾向が見られた。以上の結果より、超低圧・低圧逆浸透膜が有機酸の除去性能に優れており、原水のｐＨが３よりも大きい値でも、発酵阻害物質を効果的に除去できることが判明した。

次に、本発明により得られる精製糖液を発酵原料として使用した化学品の製造方法に関し、さらに詳細に説明するために化学品としてＬ−乳酸、Ｄ−乳酸、エタノール、カダベリン、コハク酸について実施例を挙げて説明する。しかしながら、本発明により製造されうる化学品は、以下の実施例に限定されない。

（参考例６）化学品の濃度測定方法
［Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸］
Ｌ−乳酸またはＤ−乳酸蓄積濃度測定にはＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。
カラム：Shim-Pack SPR-H（株式会社島津製作所製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０ｍＭ ビストリス、０．１ｍＭ EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。

また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー株式会社製）
移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ
温度 ：３０℃。

また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算した。

光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。なお、Ｄ−乳酸の光学純度も同様に計算した。

［エタノール］
エタノール蓄積濃度の測定には、ガスクロマトグラフ法により定量した。Shimadzu GC-2010キャピラリーGC TC-1(GL science) 15 meter L.＊0.53 mm I.D., df1.5 μmを用いて、水素炎イオン化検出器により検出・算出して評価した。

［カダベリン］
カダベリンは以下に示すＨＰＬＣ法によって評価した。
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（株式会社資生堂製）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μＬに内標として、１，４−ジアミノブタン（０．０３Ｍ）を２５μＬ、炭酸水素ナトリウム（０．０７５Ｍ）を１５０μＬおよび２，４−ジニトロフルオロベンゼン（０．２Ｍ）のエタノール溶液を添加混合し、３７℃の温度で１時間保温する。
上記の反応溶液５０μＬを１ｍＬアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の上清１０μＬをＨＰＬＣ分析した。

［コハク酸］
コハク酸蓄積濃度の測定については、ＨＰＬＣ（株式会社島津製作所 ＬＣ１０Ａ、ＲＩモニター：ＲＩＤ-１０Ａ、カラム：アミネックスＨＰＸ-８７Ｈ）で分析した。カラム温度は５０℃、０.０１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４でカラムを平衡化した後、サンプルをインジェクションし、０.０１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４で溶出して分析を行った。

（参考例７）Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を下記のように造成した。ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することでＬ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、La-Taq（タカラバイオ株式会社）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡株式会社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。

ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（インビトロジェン社製）を用いてＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（インビトロジェン社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。

上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymerase（東洋紡株式会社製）によるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ株式会社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ株式会社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図７）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにしてヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５（Ｌ−ｌｄｈ遺伝子）を得た。なお、ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。

ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。

得られた形質転換細胞がヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることをＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。

ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことを確認した。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続くＬ−乳酸発酵に用いた。

（参考例８）Ｌ−乳酸発酵（酵母）
参考例７で得られた酵母株（ＳＷ−１）によるＬ−乳酸発酵を行った。培地は、炭素源としてグルコース、他成分としてＹｅａｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン、表３４ドロップアウトＭＸ）、Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ、Ｙｅａｓｔ ＮＴｂａｓｅ）および硫酸アンモニウム（硫安）を表３４に示す比率で混合した。培地はフィルター滅菌（ミリポア、ステリカップ０．２２μｍ）を行い発酵に用いた。グルコース濃度の定量は、グルコーステスト和光（和光純薬工業株式会社製）を使用した。また、各培養液中に産生された乳酸量は、参考例６と同様の条件でＨＰＬＣにより測定した。

ＳＷ−１株を試験管で５ｍＬの発酵用培地（前培養培地）（で一晩振とう培養した（前培養）。前培養液より酵母を遠心分離により回収し、滅菌水１５ｍＬでよく洗浄した。洗浄した酵母を、表３４記載組成の各培地１００ｍＬに植菌し５００ｍＬ容坂口フラスコで４０時間振とう培養した（本培養）。

（参考例９）Ｌ−乳酸発酵方法（乳酸菌）
培地には表３５に示すＬ−乳酸菌発酵培地を用い、高圧蒸気滅菌処理（１２１℃、１５分）して用いた。乳酸菌としては、原核微生物であるラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ７６３８株を用い、培地として表３５に示す組成の乳酸菌乳酸発酵培地を用いた。発酵液に含まれるＬ−乳酸は、参考例１と同様の方法で評価した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬工業株式会社製）を用いた。

ラクトコッカス・ラクティスＪＣＭ７６３８株を、試験管で表３５に示す５ｍＬの窒素ガスでパージした乳酸発酵培地で２４時間、３７℃の温度で静置培養した（前培養）。得られた培養液を窒素ガスでパージした新鮮な乳酸発酵培地５０ｍＬに植菌し、４８時間、３７℃の温度で静置培養した（本培養）。

（参考例１０）エタノール発酵（酵母）
酵母株（ＯＣ２、サッカロマイセス・セレビシエ、ワイン酵母）によるエタノール発酵を検討した。培地は、参考例８の組成の培地をフィルター滅菌（ミリポア、ステリカップ０．２２μｍ）したものを発酵に用いた。グルコース濃度の定量は、グルコーステスト和光（和光純薬工業株式会社製）を使用した。また、各培養液中に産生されたエタノール量は参考例７と同様の条件でＧＣにより測定した。

ＯＣ２株を試験管で５ｍＬの発酵用培地（前培養培地）で一晩振とう培養した（前培養）。前培養液より酵母を遠心分離により回収し、滅菌水１５ｍＬでよく洗浄した。洗浄した酵母を、表３４記載組成の各培地１００ｍＬに植菌し５００ｍＬ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（本培養）。

（参考例１１）カダベリン発酵（コリネバクテリウム・グルタミカム）
カダベリンを生産させる微生物として、特開２００４−２２２５６９号公報に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＴＲ−ＣＡＤ１株用い、グルコースを資化するカダベリンの発酵を検討した。培地は、炭素源として表３６に示すグルコース組成になりかつ３Ｍのアンモニア水でｐＨを７．０になるように糖液を調製し、カダベリン発酵培地を調整した。生産物であるカダベリンの濃度の評価はＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬工業株式会社製）を用いた。

コリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を、試験管で５ｍＬのカナマイシン（２５μｇ／ｍＬ）を添加したカダベリン発酵培地添加で一晩振とう培養した（前培養）。前培養液よりコリネバクテリウム・グルタミカムＴＲ−ＣＡＤ１株を遠心分離により回収し、滅菌水１５ｍＬでよく洗浄した。洗浄した菌体を、上記培地１００ｍＬに植菌し５００ｍＬ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（本培養）。

（参考例１２）Ｄ−乳酸発酵
微生物として、特開２００７−０７４９３９記載の酵母ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を用い、培地として表３７に示す組成のＤ−乳酸生産培地を用い、生産物であるＤ−乳酸の濃度の評価は参考例１と同様のＨＰＬＣ法により測定した。また、グルコース濃度の測定には、グルコーステストワコーＣ（和光純薬工業株式会社製）を用いた。

ＮＢＲＣ１０５０５／ｐＴＭ６３株を、試験管で５ｍＬのＤ−乳酸生産培地で一晩振とう培養した（前培養）。得られた培養液を、新鮮なＤ−乳酸生産培地５０ｍＬに植菌し、５００ｍＬ容坂口フラスコで２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（本培養）。

（参考例１３）コハク酸発酵方法
コハク酸の生産能力のある微生物として、アナエロビオスピリラム・サクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ５３４８８株によるコハク酸の発酵を行った。表３８の組成からなる種培養用培地１００ｍＬを、１２５ｍＬ容三角フラスコに入れ加熱滅菌した。

嫌気グローブボックス内で、３０ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３ １ｍＬと１８０ｍＭ Ｈ_２ＳＯ_４０.１５ｍＬを加え、さらに、０.２５ｇ／Ｌ システイン・ＨＣｌ、０.２５ｇ／Ｌ Ｎａ_２Ｓからなる還元溶液０.５ｍＬを加えた後、ＡＴＣＣ５３４８８株を接種し、３９℃で２４時間静置培養した（本培養）。

（実施例１７）希硫酸処理・酵素処理糖水溶液の精製糖液を使用した化学品発酵
実施例１の糖水溶液または精製糖液（ナノ濾過膜処理、逆浸透膜処理）各１Ｌをロータリーエバポレーター（東京理化器械株式会社製）を用いて、減圧下（２００ｈＰａ）で水を蒸発させて約３倍程度に濃縮したものならびに比較として試薬グルコースを使用して、参考例８から１３の発酵条件で各培地成分の濃度条件下で各発酵に適した培地成分を調製して本培養で使用した。なお、前培養では試薬単糖を用い、本培養時のみ各糖液を用いた。その結果、表３９に見られる通り、膜処理をすることにより未処理のものに比べて発酵阻害が抑制され化学品の蓄積濃度が改善した。

さらに酵母を用いたＬ−乳酸の発酵試験（参考例８）については発酵時の糖液のグルコース消費量および対糖（グルコース）収率について表４０に示す。糖水溶液をナノ濾過膜または逆浸透膜処理することにより糖の消費についても処理しない場合に比べて改善傾向が見られた。

（実施例１８）水熱処理・酵素処理糖水溶液の精製糖液を使用した化学品発酵
実施例２の糖水溶液または精製糖液（ナノ濾過膜処理、逆浸透膜処理）各約１Ｌをロータリーエバポレーター（東京理化器械株式会社製）を用いて、減圧下（２００ｈＰａ）で水を蒸発させて約１．２倍程度に濃縮したものならびに比較として試薬グルコースを使用して、参考例８から１３に示した発酵条件で各培地成分の濃度条件下で各発酵に適した培地成分を調製して本培養で使用した。なお、前培養では試薬単糖を用い、本培養時のみ各糖液を用いた。その結果、表４１に見られる通り、膜処理をすることにより未処理のものに比べて発酵阻害が抑制され化学品の蓄積濃度が改善した。

（実施例１９）アンモニア処理・酵素処理糖水溶液の精製糖液を使用した化学品発酵
実施例３の糖水溶液または精製糖液（ナノ濾過膜処理、逆浸透膜処理）各約１Ｌをロータリーエバポレーター（東京理化器械株式会社製）を用いて、減圧下（２００ｈＰａ）で水を蒸発させて約１．２倍程度に濃縮したものおよび比較として試薬グルコースを使用して、参考例８から１３に示した発酵条件で各培地成分の濃度条件下で各発酵に適した培地成分を調製して本培養で使用した。なお、前培養では試薬単糖を用い、本培養時のみ各糖液を用いた。その結果、表４２に見られる通り膜処理をすることにより未処理のものに比べて発酵阻害が抑制され化学品の蓄積濃度が改善した。

（実施例２０）水熱処理糖水溶液の精製糖液を使用した化学品発酵
実施例４の糖水溶液または精製糖液（ＮＦ膜処理、ＲＯ膜処理）各１Ｌをロータリーエバポレーター（東京理化器械株式会社製）を用いて、減圧下（２００ｈＰａ）で水を蒸発させて約２０倍程度に濃縮したものおよび比較として試薬グルコースを使用して、参考例８から１３に示した発酵条件で各培地成分の濃度条件下で各発酵に適した培地成分を調製して本培養で使用した。なお、前培養では試薬単糖を用い、本培養時のみ各糖液を用いた。その結果、表４３に見られる通り膜処理をすることにより未処理のものに比べて発酵阻害が抑制され化学品の蓄積濃度が改善した。

（実施例２１）糖水溶液のｐＨの化学品製造への影響
糖水溶液のｐＨが精製糖液を使用した化学品の製造に及ぼす影響を調べるため、糖水溶液のｐＨが異なる場合のＬ−乳酸発酵を比較・検討した。発酵培地の炭素源として、実施例７の２種の精製糖液（糖水溶液ｐＨ３またはｐＨ７で逆浸透膜処理）、そして対照として試薬グルコースを使用した。実施例７の各精製糖液０．５Ｌを硫酸およびアンモニア水でｐＨ５に調製し、さらにグルコース濃度を５５ｇ／Ｌまで希釈した糖液ＡおよびＢ（Ａ：ｐＨ３で逆浸透膜処理、Ｂ：ｐＨ７で逆浸透膜処理）に対し、Ｙｅａｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン、表３４ドロップアウトＭＸ）、Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ、Ｙｅａｓｔ ＮＴｂａｓｅ）および硫酸アンモニウム（硫安）を、参考例８の表３４に示すＬ−乳酸発酵用培地に示す比率になるように混合し、それぞれ精製糖液Ａ、Ｂ培地とした。同様に試薬単糖培地は、試薬グルコースを表３４に示す比率で混合して調整した。

各培地はフィルター滅菌（ミリポア、ステリカップ０．２２μｍ）を行い発酵に用いた。グルコース濃度の定量は、グルコーステスト和光（和光純薬工業株式会社製）を使用した。また、各培養液中に産生された乳酸量は、参考例２の有機酸のＨＰＬＣ測定と同様の条件でＨＰＬＣにより測定した。

参考例８に従い、酵母ＳＷ−１株を試験管で５ｍＬの試薬単糖培地で前培養後、本培養を精製糖液Ａ、Ｂ培地、試薬単糖培地で実施した結果、表４４に見られる通り、糖水溶液（ｐＨ７）を逆浸透膜処理した精製糖液に対し、糖水溶液（ｐＨ３）で逆浸透膜処理した精製糖液は、試薬単糖培地と同等に微生物のグルコース消費量が増大しており、発酵阻害が低減していることが確認できた。また、乳酸蓄積濃度も、糖水溶液（ｐＨ３）で逆浸透膜に通じて濾過処理した精製糖液培地では、試薬単糖培地と同等の乳酸蓄積濃度となることが示された。

（実施例２２）化学品の製造におけるナノ濾過膜と逆浸透膜の性能比較
化学品の製造におけるナノ濾過膜と逆浸透膜の性能を比較するため、ナノ濾過膜による精製糖液、逆浸透膜による精製糖液、ナノ濾過膜および逆浸透膜による精製糖液によるエタノール発酵を比較・検討した。炭素源として、実施例１５の３種の精製糖液（ナノ濾過膜処理、逆浸透膜処理、ナノ濾過膜処理後に逆浸透膜処理）、そして対照として試薬グルコースを使用した使用した。実施例１５で得られた濃縮糖液各約０．５Ｌをアンモニア水でｐＨ５に調製して、さらにグルコース濃度を５５ｇ／Ｌまで希釈した糖液Ｅ、Ｆ、およびＧ（Ｅ：ナノ濾過膜処理、Ｆ：ナノ濾過膜処理後に逆浸透膜処理、Ｇ：逆浸透膜処理）に対し、Ｙｅａｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｒｏｐ−ｏｕｔ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（シグマ・アルドリッチ・ジャパン、表３４ドロップアウトＭＸ）、Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ ｗ／ｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ、Ｙｅａｓｔ ＮＴｂａｓｅ）および硫酸アンモニウム（硫安）を参考例８の表３４に示す比率で混合し、それぞれ精製糖液Ｃ〜Ｅ培地とした。同様に試薬単糖培地は、試薬グルコースを表３４に示す比率で混合して調整した。

各培地はフィルター滅菌（ミリポア、ステリカップ０．２２μｍ）を行い発酵に用いた。グルコース濃度の定量は、グルコーステスト和光（和光純薬工業株式会社製）を使用した。また、各培養液中に産生されたエタノール量は、参考例１の条件でＧＣにより測定した。

参考例９に従い、ＯＣ２株を試験管で５ｍＬの試薬単糖培地で前培養後、本培養を精製糖液Ｃ〜Ｅ培地、試薬単糖培地で実施した結果、表４５に見られる通り、ナノ濾過膜による精製糖液を使用したＥおよびＦでは微生物のグルコース消費量およびエタノール蓄積濃度が試薬単糖培地と同等であり、発酵阻害が低減していることが確認できた。また、逆浸透膜による精製糖液を使用したＥにおいても、ＣおよびＤに少し劣るものの試薬単糖培地とほぼ同等の発酵が確認できた。

（参考例１４）カダベリン発酵大腸菌の作製
大腸菌染色体中に存在するリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現量を増強させてカダベリン発酵能を高めるために、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターを大腸菌のｇａｐＡ遺伝子（グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子）プロモーターと置換した株の作製を試みた。プロモーターの置換は、ＦＬＰレコンビナーゼを用いた相同組換えによる遺伝子破壊方法を改変して行った。以下に、作製方法を示す。

＜１＞ｇａｐＡ遺伝子プロモーターのクローニング
大腸菌Ｗ３１１０株を培養し遠心回収後、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit（ＭＯ ＢＩＯ社製）を用いてゲノムＤＮＡの抽出を行った。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。

上記のようにして得られたゲノムＤＮＡを鋳型、オリゴヌクレオチド（配列番号１０（ＫＳ０２９）、配列番号１１（ＫＳ０３０））をプライマーセットとして、ＰＣＲによりｇａｐＡ遺伝子プロモーター（ｇａｐＡ遺伝子の上流５００ｂｐ、以下、ｇａｐＡプロモーターと略す。）の増幅を行った。ＰＣＲ増幅反応には、KOD-Plus polymerase（東洋紡株式会社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したゲノムＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymerase（東洋紡株式会社製）を１ユニット／サンプルになるように５０μＬの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：３０秒を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号１０（ＫＳ０２９）、配列番号１１（ＫＳ０３０））には、５’末端側及び３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列が付加されるようにして作製した。

各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（タカラバイオ株式会社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（タカラバイオ株式会社製）を用いて行った。ライゲーション溶液で大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ株式会社製）を形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｇａｐＡプロモーターが挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。

＜２＞リジンデカルボキシラーゼ遺伝子のクローニング
次に、＜１＞で得られた大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号１２（ＣａｄＡＦ２）、配列番号１３（ＣａｄＡＲ２））をプライマーセットとしてＰＣＲを行い、リジンデカルボキシラーゼをコードしているｃａｄＡ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲ増幅反応は、伸張反応のみ２分に変えた以外は＜１＞と同様な条件で行った。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号１２（ＣａｄＡＦ２）、配列番号１３（ＣａｄＡＲ２））には、５’末端側にＨｉｎｄＩＩＩ、３’末端側にＸｂａＩ認識配列が付加されるようにして作製した。得られたＤＮＡ断片を＜１＞と同様な方法でｐＵＣ１１８ベクターにライゲーションし、ｃａｄＡ遺伝子が挿入されているｐＵＣ１１８ベクターを得た。得られたベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断して、ｃａｄＡ遺伝子が挿入されているプラスミドを確認した。

次に、このｃａｄＡ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断し、得られたｃａｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断部位にライゲーションし、得られたプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断することにより、ｃａｄＡ遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。得られたプラスミドをｐＨＳ７とした。

＜３＞クロラムフェニコール耐性遺伝子のクローニング
次に、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ遺伝子）およびその上下流にＦＬＰ認識サイト（ＦＲＴ）を有するベクターｐＫＤ３を鋳型、オリゴヌクレオチド（配列番号１４、配列番号１５）をプライマーセットとして、ＰＣＲによりｃａｔ遺伝子のクローニングを行った。ＰＣＲ増幅反応は、伸張反応のみ１分に変えた以外は＜１＞と同様な条件で行った。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号１４、配列番号１５）には、５’末端側にＢａｍＨＩ、３’末端側にＳａｃＩ認識配列が付加されるようにして作製した。得られたＤＮＡ断片を＜１＞と同様な方法でｐＵＣ１１８ベクターにライゲーションし、ｃａｔ遺伝子が挿入されているｐＵＣ１１８ベクターを得た。得られたベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断して、ｃａｔ遺伝子が挿入されているプラスミドを確認した。

＜４＞ｃａｔ遺伝子およびｇａｐＡプロモーターのｐＨＳ７への挿入
次に、ｃａｔ遺伝子が挿入されているｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、得られたＤＮＡ断片を上記ｐＨＳ７のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ切断部位に導入したプラスミドを作製した。得られたベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで切断して、ｃａｔ遺伝子が挿入されていることを確認した。このようにして得られたプラスミドをｐＫＳ５とした。

＜５＞ｇａｐＡプロモーター−ｃａｄＡ遺伝子カセットの染色体への導入
次に、ｇａｐＡプロモーターが挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、得られたDNA断片を上記ｐＫＳ５のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に導入したプラスミドを作製した。このプラスミドＤＮＡを鋳型、オリゴヌクレオチド（配列番号１６（Ｍ１３ ＲＶ）、配列番号１１（ＫＳ０３０））をプライマーセットとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはPremixTaq ExTaq Ver（タカラバイオ株式会社製）を用いた。このＰＣＲにより、約５００ｂｐの増幅断片が得られるプラスミドを目的のプラスミドとして選抜した。このようにして得られたプラスミドをｐＫＳ８とした。

＜４＞のようにして得られたｐＫＳ８を鋳型、オリゴヌクレオチド（配列番号１７（ＫＳ０３２）、配列番号１８（ＫＳ０３３））をプライマーセットとして、ＰＣＲによりｇａｐＡプロモーター、ｃａｄＡ遺伝子、ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ増幅反応にはKOD-Plus polymerase（東洋紡株式会社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。プラスミドＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びKOD-Plus polymerase（東洋紡株式会社製）を１ユニット／サンプルになるように５０μＬの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、６５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：３分３０秒を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。得られた約３．５ｋｂの増幅断片を定法に従って電気泳動後のアガロースゲルから抽出し、５００ｎｇ／μＬとなるように調整した。

Ｗ３１１０株にＦＬＰレコンビナーゼを有するプラスミドｐＫＤ４６を導入した株（Ｗ３１１０／ｐＫＤ４６と表記する。）を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、一晩３０℃で培養した（前培養）。得られた前培養液を５ｍＬのＳＯＢ培地（１ｍＭ アラビノース含有）に１％植菌し、ＯＤ６００が０．６になるまで３０℃で培養した（本培養）。本培養液を遠心して集菌した後、氷冷した１０％グリセロールで３回洗浄し、最終的に５０μＬの１０％グリセロールに菌体を懸濁した。この菌体懸濁液に上記のように精製したＰＣＲ増幅断片を２μＬ添加し、３０分氷冷した。この懸濁液をエレクトロポレーション用キュベット（０．２ｃｍ）に移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてエレクトロポレーションを行った（２５００Ｖ、２５μＦ、２００Ω）。電気パルスを与えた後、キュベットに１ｍＬのＳＯＣ培地を投入し菌体懸濁液を回収して、３７℃で２．５時間培養した。培養液を２５μｇ／Ｌのクロラムフェニコールを添加したＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。

得られたコロニーがアンピシリンを添加したＬＢ培地で生育しないことを確認した後、目的とするｃａｄＡ遺伝子のプロモーターがｇａｐＡプロモーターと置換されている株であることを、抽出したゲノムを鋳型、オリゴヌクレオチド（配列番号１９（ＫＳ００７）、配列番号２０（ＫＳ００８））をプライマーとしたＰＣＲにより行った。目的とする相同組換え株では約３．８ｋｂの増幅断片が得られるのに対し、目的の位置に相同組換えで挿入されていない株では約２．３ｋｂの増幅断片が得られる。その結果、約３．８ｋｂの増幅断片が確認できた。このｃａｄＡ遺伝子のプロモーターがｇａｐＡプロモーターと置換されている株をＷ３１１０（ｇａｐＡ−ｃａｄＡ）株とした。

（実施例２３）キシロース成分を含む精製糖液の製造
キシロース成分を多く含む糖液として、参考例３の希硫酸処理液（キシロース濃度１５ｇ／Ｌ）、および参考例４の水熱処理液（キシロース濃度１４ｇ／Ｌ）を水酸化カルシウム水溶液および硫酸でそれぞれｐＨ３および７に調整した後、精密濾過膜で濾過した。この時の濁度はそれぞれ１．０ＮＴＵ以下であった。この計４種類の糖水溶液を実施例１と同様の方法によりナノ濾過膜処理することで精製糖液を得た。ナノ濾過膜として、架橋ピペラジンポリアミド系ナノ濾過膜ＵＴＣ６０（ナノ濾過膜１；東レ株式会社製）を用いて、それぞれ原水の液量が投入時の４分の１になるまで濾過した。この時原水槽の濃縮液に含まれる、発酵阻害物質および単糖の濃度をＨＰＬＣ（株式会社島津製作所製）により分析したところ、発酵阻害物質（酢酸、ギ酸、ＨＭＦ、フルフラール、バニリン、アセトバニリン、シリンガ酸）および単糖（グルコース、キシロース）、表４６および４７の通りであった。

（実施例２４）キシロース糖液を用いた大腸菌によるカダベリン発酵
参考例１４のカダベリン発酵大腸菌株（Ｗ３１１０（ｇａｐＡ−ｃａｄＡ）株）によるカダベリン発酵試験を実施した。培地は、炭素源として実施例２３の精製糖液４種と、比較として試薬グルコースおよびキシロースを使用した試薬単糖、の計５種を使用した。精製糖液各０．５Ｌを硫酸およびアンモニア水でｐＨ５に調製した糖液Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ（Ｆ：水熱処理液をｐＨ３でナノ濾過膜処理、Ｇ：水熱処理液をｐＨ７でナノ濾過膜処理、Ｈ：希硫酸処理液をｐＨ３でナノ濾過膜処理、Ｉ：希硫酸処理液をｐＨ７でナノ濾過膜処理）に対し、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、リン酸二水素カリウム、ポリペプトンＳを表４８に示す比率で混合し、それぞれ精製糖液Ｆ〜Ｉ培地とした。試薬単糖培地は、試薬キシロースが５０ｇ／Ｌとなるように表４８に示す比率で混合して調整した。各培地はフィルター滅菌（ミリポア、ステリカップ０．２２μｍ）を行い発酵に用いた。キシロース濃度の定量はキシロース濃度測定キット（メガザイム社）を使用した。

Ｗ３１１０（ｇａｐＡ−ｃａｄＡ）株を試験管で５ｍＬの試薬単糖培地で一晩振とう培養した（前培養）。前培養液より菌体を遠心分離により回収し、滅菌水１５ｍＬでよく洗浄した。洗浄した菌体を、表５６記載の各培地１００ｍＬに植菌し５００ｍＬ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した。その結果、表４９に見られる通り、ｐＨ７でナノ濾過膜処理した精製糖液Ｇ、Ｉに対し、ｐＨ３でナノ濾過膜処理した精製糖液Ｆ、Ｈでは、キシロース消費量が増大しており、発酵阻害が低減していることが確認できた。また、カダベリン蓄積濃度も、試薬単糖を使用した培地と同等のカダベリン蓄積濃度となることが示された。

本発明によって、セルロース含有バイオマスに由来する糖水溶液から発酵阻害物質を除去することが可能であり、一方でグルコース、キシロースなどの単糖を含む精製糖液を高純度・高収率で製造することができるため、該精製糖液を発酵原料とした場合、種々の化学品の発酵生産の効率を向上させることができる。

１ 原水槽
２ ナノ濾過膜または逆浸透膜が装着されたセル
３ 高圧ポンプ
４ 膜透過液の流れ
５ 膜濃縮液の流れ
６ 高圧ポンプにより送液された培養液またはナノ濾過膜透過液の流れ
７ ナノ濾過膜または逆浸透膜
８ 支持板

Claims (14)

1. セルロース含有バイオマスを原料として糖液を製造する方法であって、
   （１）セルロース含有バイオマスを加水分解し、糖水溶液を製造する工程
   （２）得られた糖水溶液をナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過して、非透過側から精製糖液を回収し、透過側から発酵阻害物質を除去する工程
   を含む、糖液の製造方法。
2. 前記工程（２）の糖水溶液のｐＨを１〜５に調整する、請求項１に記載の糖液の製造方法。
3. 前記発酵阻害物質が有機酸、フラン系化合物およびフェノール系化合物からなる群から選択される１種または２種以上を含む、請求項１または２に記載の糖液の製造方法。
4. 前記有機酸がギ酸または酢酸である、請求項３に記載の糖液の製造方法。
5. 前記フラン系化合物がヒドロキシメチルフルフラールまたはフルフラールである、請求項３に記載の糖液の製造方法。
6. 前記フェノール系化合物がバニリン、アセトバニリンまたはシリンガ酸である、請求項３に記載の糖液の製造方法。
7. 前記工程（２）の精製糖液が単糖を主成分とする糖液である、請求項１から６のいずれかに記載の糖液の製造方法。
8. 前記工程（１）で得られた糖水溶液を、前記工程（２）の処理の前に精密濾過膜および／または限外濾過膜に通じて微粒子および高分子成分を除去する、請求項１から７のいずれかに記載の糖液の製造方法。
9. 前記工程（２）の糖水溶液の温度を１〜１５℃に調整してナノ濾過膜で濾過する、請求項１から８のいずれかに記載の糖液の製造方法。
10. 前記工程（２）の糖水溶液の温度を４０℃〜８０℃に調整して逆浸透膜で濾過する、請求項１から８のいずれかに記載の糖液の製造方法。
11. 前記工程（２）が、糖水溶液をナノ濾過膜に通じて濾過し、得られた濾過液を逆浸透膜に通じて濾過する工程である、請求項１から１０のいずれかに記載の糖液の製造方法。
12. 前記工程（２）のナノ濾過膜および／または逆浸透膜の機能層がポリアミドである、請求項１から１１のいずれかに記載の糖液の製造方法。
13. 前記工程（２）のナノ濾過膜の機能層が架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式１で示される構成成分を含有することを特徴とする、請求項１から１２のいずれかに記載の糖液の製造方法。
    

    

    （式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ_３、ｎは０から３までの整数を表す。）
14. 請求項１から１３のいずれかに記載の糖液の製造方法によって得られた糖液を発酵原料として使用する、化学品の製造方法。

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