JP4769868B2 - 植物細胞懸濁培養によるコロソール酸の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明ではコロソール酸を生産すると知られている植物の枇杷、バナバなどの植物体からカルスを誘導することによって懸濁培養細胞株を確立し、これを懸濁培養してコロソール酸を量産する方法を提供する。
前記植物細胞懸濁培養において二次代謝産物の生産性を増加させるために誘導剤を処理することができる。誘導剤処理は一般に培養初期または培養中盤に処理することができ、二次代謝産物は種類に応じてその合成に関与する生化学的経路も多様であるので、量産の対象となる特定二次代謝産物の生産性を増加させるためには適切な誘導剤を選別し、その処理条件を最適化しなければならない。本発明で使用される誘導剤には生物的誘導剤または非生物的誘導剤を使用することができ、前記生物的誘導剤の例としてはカビ、細菌及び酵母の選択群からの細胞壁抽出物またはろ過物とこれらから由来した多糖体及び糖蛋白質、不活性化した酵素または精製された形態のカードラン、ザンサン、キトサン、グルカンなどを含む精製分画がある。また、前記非生物的誘導剤としては化学的刺激剤または生物起源化合物がある。このような誘導剤として用いることができる種類を下記表1に記載する。
実施例1-1:Eriobotrya japonicaカルスの誘導
露地及び温室で培養したEriobotrya japonicaの葉と幹を採取して5cm程度に切断した後、台所用洗剤を利用して表面を清潔に洗浄し、水道水で十分に洗った。
実施例1-1の方法でLS培地で4週間培養したEriobotrya japonicaのカルス組織を利用して液体懸濁培養を誘導した。
実施例2-1:Eriobotrya japonicaの懸濁培養
植物成長調節剤NAA10μM及びBA1μMが処理された液体培養培地で実施例1-2の方法に従ってEriobotrya japonicaの懸濁培養細胞株を24℃で7日間培養した。
実施例2-2:コロソール酸の分離及び分析
7日目の実施例2-1の懸濁物から細胞を集め、次のようにコロソール酸を抽出した。
実施例2-1で培養した細胞培養液から5mlの試料を取った後、遠心分離して培養液を除去し、細胞を40℃の乾燥オーブンで24時間以上十分に乾燥した後、乳鉢を利用して粉砕した細胞乾燥粉末10mgにメタノール1mlを添加して5時間以上振って1次抽出を実施した。1次抽出が終わった試料は遠心分離してメタノール層のみ回収し、残った細胞粉末層にメタノール1mlを添加して1時間振りながら2次抽出を実施した後、遠心分離してメタノール層を回収した。
前記1次抽出物と2次抽出物を混合物2mlにメタノール濃度が60乃至70%になるように蒸溜水1mlを添加した後、ODS-カラム精製過程を実施した。
まず、ODSカラムを70%メタノール5mlに安定化させた後、試料を注入して再び70%メタノール5mlを加えて洗浄した。
その後、100%のメタノール5mlを加えてカラムに残った物質を溶離し、減圧濃縮して分析用試料を製造した。
コロソール酸の分析は高速液体クロマトグラフィーを利用して実施し、分析条件はクロモリスRP18e(Merck社、100x4.6mm)カラムを利用して移動相として0.05%のトリフルオロアセト酸を含有する75%のメタノールを使用して分当り1mlの流速で流し、、210nmの波長で吸光度を分析してその結果を図4に示した。
図4は標準時料であるコロソール酸とEriobotrya japonica懸濁培養細胞のコロソール酸分析チャートを示したもので、a)は0.1mg/ml濃度のコロソール酸標準試料で、b)はEriobotrya japonica懸濁培養細胞のメタノール抽出物である。
実施例2-3:コロソール酸生産培地の選定
実施例2-1で得た細胞株を実施例1-2に従って4種の液体培養培地で細胞株を培養し、培養後7日目に培養細胞を回収して実施例2-1の方法に従ってコロソール酸を抽出し、コロソール酸の生産性を測定した。
コロソール酸の生産量は次のような方法で定量した。
前記高速液体クロマトグラフィー分析を通じて得られたコロソール酸ピークの面積から0.05〜1mg/Lコロソール酸標準物質のピーク面積から得たスタンダードカーブを利用してコロソール酸の濃度を求めた後、これから%DW(乾燥質量)含量を計算する。
%DW含量は細胞乾燥質量1gに含まれたコロソール酸の%比率を意味する。
計算された%DW含量に細胞培養液の細胞濃度(g/L、DW)をかけて最終容積生産性(mg/L)を計算する。
前記方法によってコロソール酸の生産量を測定して、その結果を図5に示した。
図5に示したように、懸濁培養におけるEriobotrya japonica細胞株の生産性は培地に著しく依存している。コロソール酸生産に好ましい培地はB5培地及びmB5培地であり、LS培地及びMS培地はコロソール酸の低調な生産示した。
これは実施例1-2における細胞成長の結果とは対照的なもので、細胞成長のためとコロソール酸生産のためでは、適切な培地の条件は互いに異なることが分かった。
実施例1-2で得られた細胞株50mlは、NAA10μM及びBA1μMを追加したLS培地で培養し7日後に収穫して、2倍濃度のmB5培地50mlと250mlフラスコで混合して培養した。実施例2-3の方法でコロソール酸の生産性を測定した。
表6に示したように、LS培地に25%(v/v)接種比で接種されて7日間培養したEriobotrya japonica懸濁培養細胞のコロソール酸生産性は2.69%DWであり、LS培地で培養された後、再び変形B5培地で7日間培養したEriobotrya japonica懸濁培養細胞のコロソール酸含量は3.61%DWに34.2%増加した。これは容積生産性で509.61mg/Lに相当する値である。
実施例4の高濃度培養を含む二段階培養において、生産段階のmB5培地に6%の蔗糖を添加し、細胞の接種比を6g/L細胞乾燥質量にして接種し、培養初期0日または3日目に硝酸銀、酪酸ナトリウム及びジャスモン酸メチルを下記表8のような比率で培養培地に添加して14日間培養した後、細胞の乾燥質量及びコロソール酸の生産を調査してその結果を表8に示した。
表8に示したように、2〜6μMの硝酸銀を細胞培養液に処理する場合、懸濁培養細胞のコロソール酸含量は大きく増加し、4μMの硝酸銀を処理した場合には最大含量は45%増加した。
また、酪酸ナトリウムを1mMと400μMのジャスモン酸メチルをそれぞれ処理した場合、コロソール酸含量は約100%増加し、特に酪酸ナトリウム1.0mMとジャスモン酸メチル400μMを同時に処理した場合にはコロソール酸の含量はさらに増加して128%増加し、容積生産性は2151.38mg/Lであった。
実施例6-1:Lagerstroemia speciosaカルスの誘導
露地及び温室で培養したLagerstroemia speciosaの葉と幹を採取して実施例1-1の方法ni従ってLagerstroemia speciosaカルスを誘導及び増殖して表9に示した。
表9に示したように、B5培地でLagerstroemia speciosaカルスの誘導率が最も高かったが、その後、連続した継代培養で最もカルスの成長が速かったのはLS培地であった。
実施例6-2:Lagerstroemia speciosaの細胞懸濁培養
実施例6-1のLagerstroemia speciosaカルス組織を利用したことと第2段階にB5培地を使用したことを除いては、実施例1-2の方法に従って液体懸濁培養を誘導した。
Lagerstroemia speciosa懸濁培養細胞の細胞特性を下記表10に記載した。
前記過程を経て誘導された本発明の枇杷懸濁培養細胞株の中で最も生長が良くて生産性の高いLagerstroemia speciosa懸濁培養細胞株を選別してSYG-3(Lagerstroemia speciosa SYG-3)と命名し、2005年6月22日大田広域市魚隠洞52番地に位置した韓国生命工学研究院生物資源センター(KCTC)に受託番号KCTC10823BPで受託された。
実施例6-3:バナバ懸濁培養細胞のコロソール酸生産
実施例6-2の方法に従ってLagerstroemia speciosaを培養し、培養後14日目に培養細胞を回収した。次いで、実施例2-3の方法に従ってコロソール酸生産を測定した。mB5培地で培養されたLagerstroemia speciosaによるコロソール酸生産性を表11に記載する。実施例2-2の方法に従ってLagerstroemia speciosa懸濁培養細胞のメタノール抽出物のコロソール酸を分析して図6に示した(図6のa:1mg/ml濃度のコロソール酸標準試料、b:Lagerstroemia speciosa懸濁培養細胞のメタノール抽出物)。
表11に示したように、mB5でのLagerstroemia speciosa懸濁培養細胞のコロソール酸の含量は0.56%DWであった。これはLagerstroemia speciosa葉に存在するコロソール酸の含量である0.01%(非特許文献1:Chem Pharm. Bull. 41(12):2129-2131、1993)と比較した時、56倍高い含量であることが分かった。
本発明は植物細胞の懸濁培養によってコロソール酸を量産する方法で、天然の葉で存在するコロソール酸含量より25倍乃至56倍ほど高い水準にコロソール酸を生産することができ、植物細胞懸濁培養の産業化において重要な容積生産性を極大化するので、健康機能食品素材及び医薬品素材として活用が可能で産業的生産に大きく寄与する。
本発明が実際的な実施例に関係づけて述べられていても、本発明が開示された実施例に限定されず、広範な変形および等価な組合せも請求範囲の精神に含まれる。
Claims (11)
- (a)エリオボトリヤ・ヤポニカ(Eriobotrya japonica)の組織からカルスを誘導する段階;
(b)前記カルスから液体培地で培養可能な懸濁培養細胞株を作る段階;
(c)前記懸濁培養細胞株を懸濁培養する段階;
(c−1)前記細胞株を、誘導剤を含む培地に移して培養する段階;および
(d)前記培養段階(c−1)の培養液からコロソール酸を抽出する段階;
を含み、前記誘導剤が、0.5μM〜100μMの量の硝酸銀、1mM〜200mMの量の酪酸ナトリウムおよび0.1μM〜50mMの量のジャスモン酸メチルからなる群より選択される非生物的誘導剤の群より選択されることを特徴とする植物細胞懸濁培養によるコロソール酸製造方法。 - 前記懸濁培養細胞株がエリオボトリヤ・ヤポニカ・リンドル(Eriobotrya japonica Lindl.)SYG-2(受託番号KCTC10822BP)細胞株であることを特徴とする、請求項1に記載のコロソール酸製造方法。
- 前記(a)段階で植物組織をリンスマイエル-スクーグ(Linsmaier & Skoog)培地またはムラシゲ−スクーグ(Murashige & Skoog)培地に置いて培養してカルスを誘導することを特徴とする、請求項1に記載のコロソール酸製造方法。
- 前記培地がα-ナフタレン酢酸または6-ベンジルアミノプリンをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載のコロソール酸製造方法。
- 前記(c)でリンスマイエル-スクーグ培地またはガンボーグ(Gamborg)B5培地で懸濁培養細胞株を培養することを特徴とする、請求項1に記載のコロソール酸製造方法。
- 前記段階(c−1)における培地がガンボーグB5培地または変形ガンボーグB5培地であることを特徴とする、請求項1に記載のコロソール酸製造方法。
- 前記培養時に誘導剤を1回以上処理することを特徴とする、請求項1に記載のコロソール酸製造方法。
- 接種細胞の初期濃度が1乃至20g/LDWであることを特徴とする、請求項1に記載のコロソール酸製造方法。
- 前記培地が炭素源を1乃至20%(w/v)含むことを特徴とする、請求項1に記載のコロソール酸製造方法。
- (a)エリオボトリヤ・ヤポニカ(Eriobotrya japonica)の組織からカルスを誘導する段階;
(b)前記カルスから液体培地で培養可能な懸濁培養細胞株を作る段階;
(c)前記懸濁培養細胞株を懸濁培養する段階;および
(c−1)前記細胞株を、誘導剤を含む培地に移して培養する段階
を含み、前記誘導剤が、0.5μM〜100μMの量の硝酸銀、1mM〜200mMの量の酪酸ナトリウムおよび0.1μM〜50mMの量のジャスモン酸メチルからなる群より選択される非生物的誘導剤の群より選択されるものである、エリオボトリヤ・ヤポニカ(Eriobotrya japonica)の植物細胞株を懸濁培養する方法。 - 前記(b)段階の植物細胞株がエリオボトリヤ・ヤポニカ・リンドル(Eriobotrya japonica Lindl.)SYG-2(受託番号KCTC10822BP)細胞株であることを特徴とする、請求項10に記載の懸濁培養方法。
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