TWI384993B

TWI384993B - 可用於保護肝臟及／或降脂肪之枇杷葉細胞之萃取物及其製備方法與用途

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Publication number: TWI384993B
Application number: TW98136479A
Authority: TW
Inventors: Wen Chuan Lin; jin bin Wu; Hui Ya Ho
Original assignee: Jen Li Biotech Co Ltd
Priority date: 2009-10-28
Filing date: 2009-10-28
Publication date: 2013-02-11
Also published as: TW201114433A

Description

可用於保護肝臟及/或降脂肪之枇杷葉細胞之萃取物及其製備方法與用途

本發明係關於枇杷葉細胞之萃取物於保護肝臟及/或降脂肪之應用，以及該萃取物之製備方法。

枇杷之學名為Eriobotrya japonica ，中文古名為蘆橘，又名金丸或蘆枝，其係薔薇料中之蘋果亞科的一個屬，為常綠小喬木。目前研究顯示枇杷葉具有降低體脂肪、抗發炎、抗腫瘤、降血糖及改善異常代謝之療效，相關說明可參考日本專利公開第2006104182號，其內容併於此處以供參考。

此外，業經文獻確認，枇杷葉中之三萜酸(triterpene acid)成分具有抗發炎及抗腫瘤之活性(請參考Bio1. Pharm. Bu11. 28(10)，1995-1999(2005))；於美國專利US 6,908,632 B1中，揭露枇杷萃取物中之科羅索酸(corosolic acid，為一種三萜酸)具有調控血糖之功能。由上述文獻可知，枇杷中之三萜酸成分對於許多疾病皆具有療效。

經發現，除枇杷之外，三萜酸(例如委陵菜酸(tormentic acid)、山香二烯酸(hyptadienic acid)、山楂酸(maslinic acid)及科羅索酸等)亦可自其他植物中獲得，且具其他生物活性。舉例言之，於美國專利US 6,784,206 B2中，教示大花紫薇(Lagerstroemia speciosa )或巴拿巴(Banaba)葉中之科羅索酸可應用於減肥及調控血糖；倭客木科(Vochysia divergens )中之委陵菜酸成分可用以減緩神經性或發炎性疼痛(請參考European Journal of Pharmacology ，453(2002)，203-208)；此外，山楂酸則具有降血糖之效用(請參考Biol. Pharm. Bull. 30(11)2075-2078(2007))。

儘管三萜酸可自不同植物中萃取而得，惟其於天然植物中之含量極低，若欲自天然植物中製得三萜酸，以因應市場需求，則必須種植大量之植物，且需要繁複之純化步驟及使用大量之溶劑、活性碳與純化樹脂，從而增加製造成本。

業界已積極研發製備三萜酸之方法，例如利用組織培養枇杷葉細胞之方式(請參考Phytochemistry ，59，315-323(2002))，但其提升三萜酸含量之效果有限。於WO 2007/004827 A1中，則教示一種製備科羅索酸之方法，其係以二階段培養枇杷葉或大花紫薇葉細胞之方式，獲得高含量之科羅索酸。然而，該方法須先篩選具有高產能之細胞株，並於培養液中添加誘導劑，且須經二階段之培養步驟，不但製程相當複雜且製造成本高，而且僅能提升科羅索酸之含量，而無益於其他三萜酸含量之提升。因此，一種可方便且大量地生產三萜酸的方法係迫切需要的。

本發明係針對上述需求所為之研究，本案發明人藉由於枇杷葉細胞之培養液中，添加枇杷葉細胞萃餘物之方式，可大幅提升培養所得枇杷葉細胞之三萜酸之含量。此外，本案發明人另發現，枇杷葉細胞之萃取物具有保護肝臟之效果，且萃取物中之委陵菜酸與山香二烯酸活性成分亦可用於降脂肪。

本發明之第一目的在於提供一種用於保護肝臟之枇杷葉細胞之萃取物，其包含下式(1)化合物：

其中，R₁ 及R₂ 係各自獨立為氫或甲基；R₃ 及R₄ 係各自獨立為氫、甲基或羥基；R₅ 係與1號及2號所標示位置之碳原子連接且形成具下式(2)之六元環或下式(3)之五元環之結構：

本發明之第二目的在於提供一種製備上述枇杷葉細胞之萃取物之方法。

本發明之第三目的在於提供一種醫藥組合物，包含有效量之上述萃取物。

本發明之第四目的在於提供一種使用上述枇杷葉細胞之萃取物於製造保護肝臟之藥劑之應用。

本發明之第五目的在於提供一種用於降脂肪及/或保護肝臟之醫藥組合物，其包含有效量之具下式(4)及/或式(5)之化合物：

本發明之第六目的在於提供一種用於降脂肪之枇杷葉細胞之萃取物，其包含具上述式(4)及/或式(5)之化合物。

本發明之第七目的在於提供一種製備具上述式(4)及/或式(5)之化合物之方法。

本發明之第八目的在於提供一種使用具上述式(4)及/或式(5)之化合物或其醫藥可接受鹽或酯於製造降脂肪及/或保護肝臟之藥劑之應用。

本發明之第九目的在於提供一種使用枇杷葉細胞之萃取物於製造降脂肪之藥劑之應用，其中該萃取物包含具上述式(4)及/或式(5)之化合物。

本發明之詳細技術及較佳實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。

本案發明人在進行無數次活體外之細胞實驗及活體內之動物實驗後發現，枇杷葉細胞之萃取物具有保護肝臟之效果，且其活性成分為下式(1)化合物：

特定言之，本發明之枇杷葉細胞之萃取物係包含一或多種下列三萜酸化合物：

其中，式(4)至式(7)之化合物分別為山香二烯酸、委陵菜酸、山楂酸及科羅索酸。

更特定言之，本發明之枇杷葉細胞之萃取物係包含式(4)及/或式(5)之化合物。

於本文中，『保護肝臟』乙詞係涵蓋保護由化學物質所引起之肝損傷。舉例言之，本發明之萃取物可用於保護由如四氯化碳、乙醇及硫乙醯胺(thioacetamide)等化學物質所引起之肝損傷或抑制由肝損傷所引起之肝纖維化。

本發明亦提供一種製備枇杷葉細胞之萃取物之方法，其包含：a)於一培養液中培養一枇杷葉細胞，其中該培養液包含一枇杷葉細胞萃餘物及該枇杷葉細胞；以及b)萃取步驟a)所培養之枇杷葉細胞。

其中，步驟a)中之枇杷葉細胞係經以下步驟得到：1)取一具有傷口之枇杷種子苗之葉片，並待傷口長出癒傷組織(callus tissue)細胞；以及2)取出該癒傷組織細胞並加以培育。於前述步驟1)中，可以任意方式使枇杷種子苗之葉片產生傷口，舉例言之，可以割劃、撕裂或剪切之方式，獲得帶有傷口之枇杷種子苗葉片，較佳則係利用割劃之方式；之後，可利用任何技藝人士所熟知的誘導方式，使枇杷種子苗之葉片的傷口處長出癒傷組織，例如利用一固態培養基，並添加適當的氮源、碳源、植物生長調節劑、細胞***調節激素(例如6-芐基腺嘌呤(BA)、裂殖素(kinetin)、或玉米素(zeatin)等)或細胞生長調節激素(例如α-萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)或哚吲乙酸(IAA))等，培養約1個月的時間，此可參見Avanzadoset al. ,Plant Cell Culture Protocols,Methods in Molecular Biology,vol. 318,p. 59-70，該文獻內容倂於此處以供參考。

咸知，癒傷組織細胞係由植物組織分化之細胞團塊，具有再生為與原來植株具有相同性狀與遺傳特性之新植株的潛力。若將癒傷組織細胞培養於合適之培養基上，則可經由器官發生途徑而形成根或芽，再經進一步之培育，終可長成新的枇杷幼苗；若利用細胞懸浮培養方式來培育癒傷組織細胞，則其可***更多新的枇杷葉細胞，此可參見Maet al. ,Leaf callus induction and suspension culture establishment in lychee(Litchi chinensis Sonn.)cv. Huaizhi,Acta Physiologiae Plantarum,vol. 31,p. 401-405，該文獻內容併於此處以供參考。於本發明方法之部分實施態樣中，即係利用細胞懸浮培養方式製得枇杷葉細胞。

用於本發明方法之步驟a)中之枇杷葉細胞萃餘物，係經以下步驟製得：I)取一枇杷葉細胞，並使用濃度為約80體積%至約100體積%之乙醇萃取該枇杷葉細胞；II)濃縮步驟I)之經萃取之產物，以獲得一第一濃縮物；III)使用濃度為約40體積%至約60體積%之甲醇溶解該第一濃縮物，收集一第一未溶解部分；以及IV)使用濃度為約70體積%至約95體積%之甲醇溶解該第一未溶解部分，收集一第二未溶解部分，以製得枇杷葉細胞萃餘物。

其中，上述步驟I)中之枇杷葉細胞亦可經由以下步驟製得：1)取一具有傷口之枇杷種子苗之葉片，並待傷口長出癒傷組織細胞；以及2)取出該癒傷組織細胞並加以培育。相關細節如上文中關於步驟a)中之枇杷葉細胞之培育步驟中所述。

再者，步驟I)之乙醇濃度較佳為約90體積%至約98體積%；步驟III)之甲醇濃度較佳為約45體積%至約55體積%；且步驟IV)之甲醇濃度較佳為約80體積%至約90體積%。於本發明方法之部分實施態樣中，當於步驟III)與步驟IV)中分別使用濃度約50體積%與約85體積%之甲醇時，可獲得特別令人滿意濃度之枇杷葉細胞萃餘物；換言之，經此特定部分態樣之步驟所製得之枇杷葉細胞萃餘物，係實質上不包含約50體積%甲醇可溶解部分與約85體積%甲醇可溶解部分。

以培養液之總量計，步驟a)中之枇杷葉細胞萃餘物之含量為約0.5ppm至約20ppm，較佳為約1ppm至約5ppm，最佳為約1ppm。若枇杷葉細胞萃餘物之含量低於0.5ppm，則刺激/誘導三萜酸產生之效果有限；而若枇杷葉細胞萃餘物之含量高於20ppm，則會抑制枇杷葉細胞之生長，從而影響三萜酸之產率。

根據本發明之製備枇杷葉細胞萃取物之方法，於完成步驟a)之培養程序後，接著進行步驟b)之萃取程序。進一步言之，步驟b)實質上包含以下步驟：b1)使用濃度為約80體積%至約100體積%之乙醇萃取步驟a)所培養之枇杷葉細胞；b2)濃縮步驟b1)之經萃取之產物，以獲得一第二濃縮物；b3)使用濃度為約40體積%至約60體積%之甲醇溶解該第二濃縮物，收集一第三未溶解部分；b4)使用濃度為約70體積%至約95體積%之甲醇溶解該第三未溶解部分並加以過濾，收集濾液；以及b5)視需要濃縮該濾液。

於本發明方法之部分實施態樣中，上述步驟b1)之乙醇濃度較佳為約90體積%至約98體積%；步驟b3)之甲醇濃度較佳為約45體積%至約55體積%；且步驟b4)之甲醇濃度較佳為約80體積%至約90體積%。此外，可視需要重複進行多次步驟b)中之萃取及/或溶解步驟，儘可能使枇杷葉細胞中之有效成分與無效成分分離，以及儘可能將全部有效成分萃取而出。

一般而言，依據枇杷葉細胞之萃取物之應用形式，可視需要進一步將步驟b)所獲得之枇杷葉細胞之萃取物完全乾燥，以方便運送、儲存或利用。舉例言之，可利用一乾燥步驟(例如減壓濃縮及/或通入氣體)以移除製程中殘留於萃取物中之有機溶劑。於本發明之一實施態樣中，係利用減壓濃縮進行乾燥，以獲得白色粉末狀之枇杷葉細胞之萃取物。

於本發明之一實施態樣中，係以包含如下程序之步驟b)以得到本發明之枇杷葉細胞之萃取物：使用約95體積%乙醇萃取經培養之枇杷葉細胞，以濾紙過濾，收集濾液並減壓濃縮，以獲得一濃縮物→使用約50體積%甲醇溶解該濃縮物，以濾紙過濾，收集未溶解部分→使用約85體積%甲醇溶解未溶解部分，以濾紙過濾，收集濾液→使濾液進行減壓濃縮，獲得枇杷葉細胞之萃取物。上述操作係如第1圖所示。經由此實施態樣所製得之枇杷葉細胞之萃取物，係實質上不包含約50體積%甲醇可溶解成分與約85體積%甲醇不可溶解成分，且含有特別令人滿意含量的三萜酸活性成分。

詳言之，本發明之方法係經由添加枇杷葉細胞萃餘物至培養液中，刺激/誘導枇杷葉細胞以產生高含量之三萜酸，毋須經由二階段培養或篩選具有高產能之細胞株。相較於先前技術，本發明之方法可經濟且方便地大量製得三萜酸。一般而言，以枇杷葉細胞之萃取物的乾重計，三萜酸成分之含量至少約60重量%，較佳至少約75重量%，更佳至少約80重量%，最佳至少約85重量%。

本發明亦關於一種用於保護肝臟之醫藥組合物，其包含有效量之枇杷葉細胞之萃取物，該萃取物可由本發明方法所製得。於本發明之用於保護肝臟之醫藥組合物中，枇杷葉細胞之萃取物之含量並非絕對關鍵所在，只要可提供所欲保護肝臟之效益即可。

可以任何合宜之方式施用根據本發明之醫藥組合物，舉例言之，但不以此為限，可以口服、皮下或靜脈內等投藥方式施用之。此外，本發明之醫藥組合物可單獨或與醫藥佐劑一起使用，且實際上可使用於獸醫與人類醫藥上。

此外，本發明又關於一種使用枇杷葉細胞之萃取物或由本發明方法所製得之枇杷葉細胞之萃取物於製造藥劑之應用，其可用以製備具任何合宜形式之用於保護肝臟之藥劑。舉例言之，當使用枇杷葉細胞之萃取物於製造用於保護肝臟之藥劑時，通常每人每天之用量為每公斤體重約25至約90毫克之式(4)及/或式(5)之化合物，較佳為每公斤體重約30至約75毫克之式(4)及/或式(5)之化合物。

其中，於製備具適於口服投藥之藥劑而言，可經由將本發明之枇杷葉細胞之萃取物與適合此項目且不會不利影響萃取物活性之佐劑混合，例如：溶劑、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。舉例而言，溶劑可選自水及蔗糖溶液，稀釋劑可選自乳糖、澱粉及微晶纖維素，吸收延遲劑可選自幾丁聚醣及葡萄胺基聚醣，潤滑劑可選自碳酸鎂，油性溶劑可選自植物或動物油類，如橄欖油、葵花油及魚肝油等。於此，可利用習知方法製成合宜的口服投藥形式，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等等。

至於具適於皮下或靜脈內投藥形式之藥劑而言，係將枇杷葉細胞萃取物與視需要之習用於此項目的材料，如增溶劑、乳化劑、或其他佐劑等加以混合，以製成如靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、注射劑、乾粉注射劑、懸液注射劑、及乾粉懸液注射劑等等。可能採用之溶劑例如：水、生理食鹽溶液、醇類(例如：乙醇、丙醇、或甘油等)、糖溶液(例如：葡萄糖或甘露醇溶液)、或前述之組合。

視需要地，除上述可用的醫藥製劑的佐劑成分外，另可加入調味劑、調色劑、著色劑等添加劑，以提高所得藥劑服用時的口適感及視覺感受；另可添加合理用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等，以改善所得藥劑的儲存性。

再者，可視需要於本發明之醫藥組合物(或藥劑)中併含一或多種其他活性成分，進一步加強本發明醫藥組合物(或藥劑)之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對枇杷葉細胞之萃取物之效益沒有不利的影響即可。

另一方面，如下文中實施例所示，本案發明人意外發現，枇杷葉細胞之萃取物中具下式(4)之山香二烯酸及式(5)之委陵菜酸化合物具有降脂肪及/或保護肝臟之功效，例如減少體脂肪堆積或減少血中三酸甘油脂含量，故可特別有用於治療高三酸甘油脂血症或減肥，包含降低體重、控制體重、避免肥胖等。於不受理論之限制下，咸信山香二烯酸或委陵菜酸可藉由抑制脂肪細胞形成之機制，達成降脂肪之效果。於本文中，『降脂肪』乙詞係涵蓋降低組織中之體脂肪及/或血液中之血脂肪。

因此，本發明亦關於一種用於降脂肪及/或保護肝臟之醫藥組合物，其包含有效量之具下式(4)及/或式(5)之化合物：

或其醫藥可接受鹽或酯；以及一種用於降脂肪之枇杷葉細胞之萃取物，其亦包含具式(4)及/或式(5)之化合物。

於天然枇杷葉中，山香二烯酸(即具式(4)之化合物)之含量極低，甚至無法測得，且於先前技術中所能提升之含量亦有限。然而，根據本發明之製備枇杷葉細胞之萃取物之方法，可製得高含量山香二烯酸之萃取物，如下文實施例中所證實。根據本發明，枇杷葉細胞之萃取物通常含有至少約3重量%，較佳至少約4重量%，更佳至少約5重量%之山香二烯酸，以萃取物之乾重計。此外，本發明之枇杷葉細胞之萃取物通常含有至少約20重量%，較佳至少約30重量%，更佳至少約40重量%之委陵菜酸，以萃取物之乾重計。

其中，於製得枇杷葉細胞之萃取物後，可利用一純化步驟以獲得山香二烯酸或委陵菜酸，例如透過液相分配或管柱層析法等手段。於本發明之一實施態樣中，係利用高效能液相層析方式來進行純化，以得到標的化合物山香二烯酸與委陵菜酸。

於本發明之用於降脂肪及/或保護肝臟之醫藥組合物中，具式(4)及/或式(5)之化合物之含量並非絕對關鍵所在，只要可提供所欲之降脂肪及/或保護肝臟的效益即可。

此外，本發明亦關於一種使用具式(4)及/或式(5)之化合物或其醫藥可接受鹽或酯或使用包含具式(4)及/或式(5)之化合物之枇杷葉細胞之萃取物於製造藥劑之應用，其中該藥劑係用於降脂肪及/或保護肝臟。

與上述用於保護肝臟之藥劑(或醫藥組合物)相似，用於降脂肪之藥劑亦可製備成任何合宜之形式，且可與不會不利影響具式(4)(即山香二烯酸)及/或式(5)(即委陵菜酸)之化合物之活性的佐劑或其他活性成分混合，以增加藥劑之應用性。

一般而言，當使用包含具式(4)及/或式(5)之化合物的枇杷葉細胞之萃取物於製造用於降脂肪之藥劑時，通常每人每天之用量為每公斤體重約75至約180毫克之式(4)及/或式(5)之化合物，較佳為每公斤體重約90至約150毫克之式(4)及/或式(5)之化合物。

茲以下列具體實施態樣以進一步例示說明本發明。其中該些實施態樣僅提供作為說明，而非用以限制本發明之範疇。

[實施例] [實施例1]製備枇杷葉細胞之萃取物

(1)建立無菌苗

自台中縣頭汴坑之果園中，採集成熟之枇杷(Eriobotrya japonica Lindl. )種子，並以水沖洗30分鐘。以70%乙醇浸泡種子達約1分鐘，再改浸泡於含有0.01% Tween 20之1%次氯酸鈉溶液，並置於超音波震盪器中，進行表面消毒約15分鐘後，再移至無菌操作台。以滅菌水清洗種子三至四次，於含有30公克/公升蔗糖之MS培養基(Murashige-Skoog medium)中培養種子。二至三週後，種子開始發芽，收集發芽後二個月之種子苗的葉片，以作為試驗材料。

(2)誘導癒傷組織(callus tissue)

割劃種子苗之葉片約0.3公分，並將其移入固態培養基(MS基本配方中包含2.5ppm之6-苄基腺嘌呤(BA，6-benzyladenine)、1ppm之α-萘乙酸(NAA，α-naphthaleneacetic acid)、3%(30公克/公升)蔗糖及0.3%(3公克/公升)水晶洋菜(gelrite))中培養。一個月後，自經割劃之傷口處長出淺黃色癒傷組織。

(3)培養枇杷葉細胞

取約60公克之上述淺黃色癒傷組織(可分化成新生之枇杷葉細胞)，並利用590微米之篩網過篩，使癒傷組織細胞分散成一定大小後，將其移入含4,000毫升培養液(MS基本配方中包含2.5ppm之BA、1ppm之NAA及3%(30公克/公升)蔗糖)之生物反應器(BioFlo110 Bioreactor，New Brunswick Scientific，美國)中培養(培養條件：通氣量為0.3v.v.m.(每分鐘每單位液體體積之氣體體積流量，gas volume flow per unit of liquid volume per minute)，攪拌速度為40轉/分鐘，溫度為24至26℃)。每十天繼代新的培養液，並於每次繼代時，留下500毫升舊的懸浮細胞液(即培養液)，再加入4,500毫升新的培養液。將另外4,500毫升舊的懸浮細胞液(含細胞鮮重約320公克)移入含25.5公升培養液(MS基本配方中包含2.5ppm之BA、1ppm之NAA及3%(30公克/公升)蔗糖)之生物反應器(體積為30公升之不鏽鋼瓶)中，並添加1ppm之枇杷葉細胞萃餘物至培養液中，以繼續培養經分化之枇杷葉細胞。於18天後，終止培養。

(4)製備枇杷葉細胞萃餘物

於一獨立之培養批次中，獲得經培養之枇杷葉細胞，將其乾燥(乾燥前約5,400公克，乾燥後約320公克)，並以95體積%之乙醇進行回流萃取三次後，以濾紙過濾，收集濾液並進行減壓濃縮。以50體積%甲醇溶解濃縮物，溶解二次後，以濾紙過濾，取未溶解部分。之後，再用85體積%甲醇溶解該未溶解部分，溶解三次，以濾紙過濾，收集未溶解部分，即獲得枇杷葉細胞萃餘物。

(5)製備枇杷葉細胞萃取物

於一獨立之培養批次中，獲得經培養之枇杷葉細胞，於60℃下將其乾燥(乾燥前約5,400公克，乾燥後約320公克)，並以10公升之95體積%乙醇進行回流萃取三次後，以濾紙過濾，收集濾液並進行減壓濃縮。以5公升之50體積%甲醇溶解濃縮物，溶解二次後，以濾紙過濾，取未溶解部分。之後，再用10公升之85體積%甲醇溶解該未溶解部分，溶解三次，以濾紙過濾，收集濾液，並進行減壓濃縮，即可獲得約53公克白色粉狀之枇杷葉細胞萃取物。經上述步驟製得之枇杷葉細胞萃取物實質上不包含50體積%甲醇可溶解成分與85體積%甲醇不可溶解成分。

(6)純化三萜酸化合物

將約1公克之白色粉狀枇杷葉細胞之萃取物置於矽膠(LiChroprep RP-18，E. Merck，40至63微米)上，以甲醇對水之比例為8：2至10:0之濃度分配，再利用製備型高效能液相層析儀(HPLC，幫浦：Shimadzu LC-8A(日本，京都)；移動相：85體積%甲醇；流速：3毫升/分鐘；管柱：YMC，J’Sphere series ODS-H80管柱(內徑為10毫米，長為250毫米，顆粒尺寸為5微米)純化，可以分別得到兩種三萜酸化合物。

利用質譜(Jeol GCmate，日本，東京)與NMR(¹ H，¹³ C，DEPT，COSY，HMQC，HMBC，Jeol 500MHz，日本，東京)分析經純化之化合物，其中，主要成分經確認為山香二烯酸(hyptadienic acid，具式(4)之化合物)及委陵菜酸(tormentic acid，具式(5)之化合物)。

山香二烯酸(7.2毫克)：¹ H-NMR(吡啶-d₅ ):δ0.98,1.08,1.15,1.17,1.42,1.70(each 3H,s,H-23 to H-29),1.10(3H,d ,J =6.6Hz,H-30),3.04(1H,s ,H-18),4.44,4.56(each 1H,d ,J =14.9Hz,H-1),5.60(1H,t ,J =3.4Hz,H-12).¹³ C-NMR(吡啶-d₅ ):δ16.7(C-30),17.6(C-6),18.8(C-26),18.9(C-25),21.7(C-24),25.3(C-27),26.9(C-21),27.0(C-11),27.1(C-16),27.1(C-29),29.6(C-15),30.1(C-23),34.5(C-7),38.4(C-22),41.9(C-4),42.3(2C,C-8,C-14),42.4(C-9),43.6(C-20),48.2(C-17),50.9(C-10),54.7(C-18),60.8(C-1),63.6(C-5),72.6(C-19),128.1(C-12),133.6(C-3),140.2(C-13),156.7(C-2),180.6(C-28)。

委陵菜酸(25.3毫克)：¹ H-NMR(吡啶-d₅ ):δ0.92(3H,s,H-24),δ1.00(3H,s,H-25),δ1.12(3H,s,H-26),δ1.12(3H,s,H-30),δ1.28(3H,s,H-23),δ1.43(3H,s,H-29),δ1.65(3H,s,H-27),1.74(1H,t,J =12.7Hz,H-1),1.90(1H,dd,J =12.0、3.8Hz,H-1),δ2.34(1H,td,J =13.2、4.1Hz,H-15),δ3.05(3H,s,H-18),δ3.14(1H,td,J =13.1、4.1Hz,H-16),δ3.77(3H,s,H-3),δ4.31(1H,dt,J =10、2.6Hz,H-2),δ5.59(1H,s,H-12).¹³ C-NMR(吡啶-d₅ )：δ17.1(C-30),17.2(C-25),19.1(C-6),22.8(C-24),17.7(C-26),24.5(C-11),25.1(C-27),26.9(C-16),27.4(C-21),27.6(C-29),29.7(2C,C-15,C-23),34.0(C-7),39.0(C-22),39.1(C-10),39.3(C-4),41.1(C-8),42.6(C-1),42.8(C-20),43.3(C-14),48.1(C-9),48.7(C-17),49.2(C-5),55.1(C-18),66.6(C-2),73.2(C-19),79.8(C-3),128.5(C-12),140.4(C-13),181.2(C-28)。

(7)測定枇杷葉細胞之萃取物之三萜酸含量

以HPLC測定枇杷葉細胞萃取物之三萜酸含量。HPLC所用條件如下：幫浦係Shimadzu LC-10ATvp；折射率偵測器係Shimadzu RID-10A；管柱係HyPURITY C-18管柱(內徑為4.6毫米，長為250毫米，顆粒尺寸為5微米)；溶劑系統為甲醇/0.15體積%含水醋酸，甲醇：0.15體積%含水醋酸=85：15體積比，流速為0.5毫升/分鐘，溫度為35℃。如表1所示，以枇杷葉細胞之萃取物之乾重計，山香二烯酸之含量為約5重量%，而委陵菜酸之含量為約39重量%。

如表2所示，三萜酸成分於原植物中之含量不高，而利用組織培養方法所提升之含量亦有限，故以枇杷葉作為三萜酸之來源係不經濟的。然而，相較於先前技術，利用本發明之製備枇杷葉細胞之萃取物之方法，可獲得高含量之四種三萜酸成分，其總含量更高達173.9毫克/公克(以細胞乾重計)。

此外，值得注意的是，根據WO2007/004827A1之揭露內容，枇杷葉細胞僅能於250毫升之容器中進行培養，而本發明之製備方法實可運用於150公升以上之規模的容器。

[實施例2]枇杷葉細胞之萃取物保護小鼠之肝臟 實驗A、枇杷葉細胞之萃取物抑制肝臟發炎與肝臟纖維化及減輕肝損傷

將36隻ICR小鼠(購自樂斯科生技公司)分成四組，一組為控制組，另三組則以四氯化碳誘發小鼠之肝損傷及肝臟纖維化。分別投予實驗組之小鼠0.5重量%之羧甲基纖維素(CMC)溶媒、或枇杷葉細胞萃取物(70或200毫克/公斤體重)。

另一方面，進行小鼠肝纖維化之誘導。每週投予ICR小鼠兩次四氯化碳(10體積%，溶於橄欖油中(0.1毫升/10公克體重))，為期八週。誘導期間，每天投予小鼠萃取物。誘導結束，於小鼠經麻醉(以二氧化碳麻醉)之情況下，由小鼠之腹腔靜脈採血，以供血漿生化值之測定。另外，迅速地取下小鼠之肝臟，並以冰生理食鹽水洗淨。之後，將肝臟分成四份，分別將其浸於10體積%中性福馬林中，以供病理切片用。以100℃之溫度烘乾其中一份，以供肝臟纖維化程度之測定，並將另外一份儲存於-80℃下，以供麩胺基硫(glutathione)之測定。

此外，於取得小鼠血液後，以4,700轉/分鐘之轉速將其離心15分鐘，並使用自動生化儀(Cobas Mira，Roche，Rotkreuz，瑞士)及市售試劑(Roche Diagnostics，Mannheim，德國)測定小鼠血漿中麩氨酸丙氨基轉氨酶(alanine transaminase，ALT)及麩氨酸草乙酸轉氨酶(aspartate transaminase，AST)之活性。其中，麩氨酸丙氨基轉氨酶及麩氨酸草乙酸轉氨酶係肝臟發炎的指標，測定結果係如表3所示。

肝組織中蛋白質之測定係依照Lowry的方法進行，並以牛血漿蛋白作為標準品(此可參見Lowryet al . Protein measurement with the folin phenol reagent.J .Biol .Chem . 1951;193:262-275，該文獻內容倂於此處以供參考)，結果係如表4所示。

肝組織中之麩胺基硫之測定係依據Hissin的方法，此可參見Hissinet al . A fluorometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues.Anal .Biochem . 1976;74:214-226，該文獻內容倂於此處以供參考。其中，秤取0.5公克之肝臟組織，並添加5毫升之1.15重量%氯化鉀溶液，以均質機進行均質化後，取1毫升之均漿，再添加1毫升之10重量%三氯乙酸，混合均勻後，以3000g之離心力離心15分鐘。接著，取0.01毫升之上清液，並添加0.18毫升磷酸-伸乙二胺四乙酸(phosphate-EDTA)緩衝液及0.01毫升σ-鄰苯二甲醛(σ-phthaldehyde，1毫克/毫升甲醇)溶液，混合均勻後，以420奈米之波長的螢光、激發光波長350奈米進行偵測。麩胺基硫之含量係以『微莫耳/公克組織』表示，結果係如表4所示。

慢性肝炎或肝損傷會導致肝臟纖維化，而肝臟纖維化主要係細胞外基質膠原蛋白之增生所造成，其中，羥脯胺酸(hydroxyproline)為膠原蛋白中特殊的胺基酸，故測定肝臟中羥脯胺酸之含量可推估肝臟纖維化的程度。肝臟組織中之膠原蛋白(或羥脯胺酸)含量之測定係參照Neuman的方法，此可參見Neumanet al . The determination of hydroxyproline.J. Biol. Chem . 1950;184:299-306，該文獻內容倂於此處以供參考。其中，將肝臟組織水解後，以過氧化氫氧化，再以p -二甲基胺基苯甲醛(p -dimethylaminobenzoaldehyde)呈色，於540奈米之波長下測定吸光值。羥脯胺酸之含量係以『微克/公克組織』表示，結果係如表4所示。

以福馬林固定肝臟組織後，進行石臘包埋及切片製作，並使用兩種染色法進行染色，一種為一般的H.E.染色法(蘇木精及伊紅染色，hematoxylin and eosin stain)，另一種則為膠原蛋白的特殊染色法，即Sirius Red染色。肝臟纖維化之測定則係利用影像分析系統(Image-Pro Plus version 5.1，Media Cybernetics，馬里蘭州，美國)來分析肝纖維化的比例。上述試驗結果係如第2圖、第3圖及表5所示。

由表3可知，枇杷葉細胞之萃取物可抑制由四氯化碳所引起之小鼠血漿ALT和AST活性的上升，此結果顯示枇杷葉細胞之萃取物能減輕四氯化碳引起之肝藏發炎。

此外，自表4可看出，四氯化碳引起小鼠之肝損傷會造成肝臟中蛋白質之含量的減少，蓋因其抑制肝臟合成蛋白質的能力，故造成肝臟中蛋白質含量下降，且四氯化碳所引起之氧化壓力或傷害會消耗及降低肝中麩胺基硫之含量，而表4顯示本發明之枇杷葉細胞之萃取物可提升蛋白質及麩胺基硫之含量，顯示其能減輕肝臟損傷。再者，如第2圖所示，病理切片亦顯示枇杷葉細胞之萃取物能改善四氯化碳所引起之肝細胞嚴重壞死的情形。

表4之結果亦說明，枇杷葉細胞之萃取物可降低四氯化碳所造成之肝臟中羥脯胺酸含量之提升，因此，枇杷葉細胞之萃取物可抑制肝臟纖維化。自第3圖及表5可知，病理切片的結果亦顯示枇杷葉細胞之萃取物可抑制肝臟纖維化。

實驗B、枇杷葉細胞之萃取物抑制庫否細胞表面受體CD14之表現

枇杷葉細胞之萃取物可能經由抑制發炎來減輕肝臟纖維化，此機制可參見Salmineaet al .,Terpenoids:natural inhibitors of NF-κB signaling with anti-inflammatory and anticancer potential.Cell Mol. Life Sci 2008;65:2979-2999，該文獻內容併於此處以供參考。四氯化碳會引起血中的脂多醣(lipopolysaacharide，LPS)增加，脂多醣進入肝臟後可與肝臟巨噬細胞(macrophage，即庫否細胞(Kupffer cell))之表面受體CD14作用，以活化庫否細胞並促進細胞激素產生，引起發炎反應，進而導致肝損傷，此機制可參見Su,2002. Lipopolysaccharides in liver injury:molecular mechanisms of Kupffer cell activation.Am. J. Physiol. 283,G256-G265，該文獻內容倂於此處以供參考。因此，以下進行表面受體CD14之免疫染色，藉由觀察CD14之表現情形來瞭解枇杷葉細胞萃取物是否經由抑制發炎作用來減輕肝纖維化。

首先，將上述實驗A中之病理切片進行脫臘及酒精脫水處理後，以3體積%過氧化氫去除內源性過氧化酶，再添加5重量%牛乳，並反應30分鐘，以阻斷非專一性的結合。接著，添加CD14抗體，於室溫下培養2小時後，再以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)洗淨，添加二級抗體，並於室溫下培養30分鐘。利用免疫偵測套組(購自BioGenex，San Ramon，加拿大)及二胺基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)進行呈色，再以蘇木精染色後，脫水並封片，結果係如第4圖所示。

由第4圖可看出，四氯化碳可促進CD14之表現，而枇杷葉細胞之萃取物則可抑制CD14之表現，因此，枇杷葉細胞之萃取物可抑制庫否細胞之活化或抑制肝臟之發炎反應。

綜合表3至表5、及第2圖、第3圖及第4圖之結果可知，枇杷葉細胞之萃取物可抑制肝臟發炎，進而抑制肝臟纖維化。

[實施例3]枇杷葉細胞之萃取物、委陵菜酸及山香二烯酸抑制肝臟庫否細胞之活化

由於庫否細胞活化後會產生一氧化氮，故可藉由測定一氧化氮之濃度來觀察庫否細胞之活化情形或肝臟發炎之程度。

依據以下方式分離出大鼠(購自樂斯科生技公司)之肝臟庫否細胞：首先，將大鼠麻醉，再使用溶於HBSS(Hanks’ balanced salt solution)中之0.05重量%第四型膠原蛋白分解酶(type IV collagenase)，以每分鐘20毫升之流速進行灌流(共200毫升)。之後，取出大鼠肝臟並加以剪碎，再以0.5公克/公升之第四型膠原蛋白分解酶進行消化達10分鐘。接著，以經滅菌之尼龍網(strile nylon guaze)過濾肝臟樣本，清洗濾液後，以50%/25%體積percoll溶液梯度進行離心。離心結束後，收集25% percoll和50% percoll之細胞液，再次加以離心，並將分離出的細胞培養於含有DMEM培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，Hyclone，美國，含有10體積%胎牛血清、100活性單位/公升之盤尼西林、100微克/毫升之鏈黴素、及2毫莫耳/公升之L-麩醯胺酸)之96孔盤(5×10⁵ 細胞/孔)中。培養15分鐘後，清除培養基上清液，再添加DMEM培養基，培養24小時後，更換培養基，並添加不同濃度之枇杷葉細胞萃取物(10、50或100微克/毫升)、委陵菜酸(5、25或50微克/毫升)、或山香二烯酸(10、25或50微克/毫升)，再培養60分鐘。之後，添加0.1微莫耳濃度之脂多醣至培養基中，經24小時後，收集培養基之上清液，並使用革利士(Griess)試劑(購自Sigma)測定一氧化氮之含量，此外，以MTS(3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，購自Promega，Madison，威斯康辛州，美國)測量細胞存活率。其中，MTS的作用原理為：由於活細胞具脫氫酶之活性，故可將MTS還原成紅紫色水溶性的產物，而其在490奈米之波長下有最高吸光值，因此，由吸光值比率即可判斷細胞之存活率，細胞存活率係由下列公式計算。上述試驗之結果係列於表6。

存活率=實驗組之吸光值/控制組之吸光值×100%

由表6可看出，0.1微莫耳濃度之脂多醣不會使庫否細胞死亡，於此條件下，枇杷葉細胞萃取物、委陵菜酸及山香二烯酸皆可抑制由脂多醣所誘發之一氧化氮的產生，且具有濃度依存性。因此，上述結果證明，枇杷葉細胞之萃取物、委陵菜酸及山香二烯酸皆可經由抑制庫否細胞之活化或肝臟發炎反應，而達成抑制肝臟纖維化之功效。

[實施例4]枇杷葉細胞之萃取物抑制高脂飼料誘發小鼠肥胖 實驗A、枇杷葉細胞之萃取物抑制小鼠體重及脂肪重量

以雄性C57BL/6小鼠(購自台北樂斯科生技公司)進行實驗。將24隻小鼠分成四組，一組餵食正常飼料(控制組)，另三組則餵食高脂飼料58Y1(購自TestDiet)及分別給予0.5重量%之羧甲基纖維素溶媒、200毫克/公斤或400毫克/公斤之枇杷葉細胞之萃取物，並紀錄每隻小鼠之每週平均攝食量及體重變化，為期四週，結果係如以下表7及表8所示。

以二氧化碳麻醉上述進行實驗四週後之小鼠後，採血並取出其副睪兩側之脂肪，進行稱重後，將一部分脂肪浸泡於10體積%中性福馬林中。

如表7所示，餵食高脂飼料之小鼠的食物攝取量低於餵食正常飼料之小鼠，且經投予枇杷葉細胞之萃取物之小鼠中，投藥劑量為400毫克/公斤之小鼠僅第一週的攝食量降低，而第二至四週的攝食量則沒有明顯影響。

如表8所示，四週後，以高脂飼料餵食之小鼠的體重明顯高於控制組，且相較於經投予CMC之小鼠，經投予枇杷葉細胞之萃取物之小鼠的最終體重、副睪脂肪之絕對重量及相對重量(相對於體重的百分比)均較低。

實驗B、枇杷葉細胞之萃取物抑制小鼠血漿中之總膽固醇及三酸甘油脂的濃度

利用自動生化儀(Cobas Mira，Roche，Rotkreuz，瑞士)及市售試劑(Roche Diagnostics，Mannheim，德國)測定小鼠血漿中總膽固醇及三酸甘油脂之濃度，結果係如表9所示。

如表9所示，經投予枇杷葉細胞之萃取物之小鼠之最終血漿總膽固醇及三酸甘油脂的濃度皆低於經投予CMC之小鼠。

實驗C、枇杷葉細胞之萃取物抑制小鼠脂肪細胞之生長

將實驗A中取得之脂肪切片進行H.E.染色，並以影像分析系統分析脂肪細胞的直徑，結果係如表10及第5圖所示。

表10及第5圖之脂肪細胞分析的結果顯示，相較於經投予CMC之小鼠，經投予高劑量之枇杷葉細胞之萃取物之小鼠的脂肪細胞直徑較小。因此，本發明之枇杷葉細胞之萃取物具有抑制脂肪細胞生長之功效。

表7至表10及第5圖明確地顯示，本發明之枇杷葉細胞之萃取物可有效降低體脂肪之形成與含量，同時亦具有降血脂之作用。

[實施例5]枇杷葉細胞之萃取物、委陵菜酸及山香二烯酸抑制脂肪細胞分化

於飽和濕度為含5%之二氧化碳且溫度為37℃之培養箱中，在含10體積%胎牛血清(Hyclone，美國)之DMEM培養液(Hyclone，美國)內，以1×10⁴ 個細胞/平方公分之密度培養3T3-L1前脂肪細胞(preadipocyte)。

於24孔盤中培養3T3-L1細胞兩天，使細胞呈現單層全滿的狀態(monolayer confluents)且具接觸抑制作用後，投予分化劑(包括5微克/毫升胰島素、0.5毫莫耳/公升IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，3-isobutyl-1-methylxanthine)及1微莫耳/公升DEX(dexamethason))，以及二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，DMSO)或不同濃度(0.5、5或50微克/毫升)之枇杷葉細胞之萃取物、委陵菜酸、或山香二烯酸，並加以培養。兩天後，更新培養液(含5微克/毫升胰島素及10%體積FBS之DMEM培養液)，且每兩天更換一次培養液，一直持續到添加分化劑後之第八天。

於培養過程中，在顯微鏡之觀察下，3T3-L1細胞由紡錘狀變成球形並增大，且可發現在細胞質中分佈密集的油滴，此時，3T3-L1細胞已分化為脂肪細胞(adipocyte)。以10體積%中性福馬林固定脂肪細胞一小時，於室溫下，以Oil red O(0.1毫克/毫升)染色兩小時後，油滴會被染成紅色，再以去離子水清洗細胞三次後，以顯微鏡觀察並照相，隨後以定量之異丙醇將油滴溶出。最後，以492奈米之波長測定吸光值，並計算枇杷葉細胞之萃取物、委陵菜酸、或山香二烯酸對脂肪細胞分化之抑制率。細胞分化之抑制率係以下列公式計算。

分化抑制率(%)=[(分化劑+二甲基亞碸)吸光值-控制組吸光值-(分化劑+試驗物質)吸光值]/[(分化劑+二甲基亞碸)吸光值-控制組吸光值]×100%

此外，於分化劑存在下，以MTS觀察試驗物質(即枇杷葉細胞之萃取物、委陵菜酸及山香二烯酸)對3T3-L1細胞存活率之影響，結果係列於表11。

存活率=實驗組之吸光值/控制組之吸光值×100%

由第6圖及表11可清楚地觀察到，枇杷葉細胞之萃取物、委陵菜酸與山香二烯酸皆可抑制脂肪細胞之分化。因此，於此實施例中，首次證明委陵菜酸及山香二烯酸具有降脂肪之功效。

上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列者。

第1圖所示為本發明之一實施例中之製備枇杷葉細胞之萃取物的流程圖；

第2圖所示為將枇杷葉細胞之萃取物投予經四氯化碳誘發肝纖維化之小鼠後之其肝組織細胞的H.E.染色圖；

第3圖所示為將枇杷葉細胞之萃取物投予經四氯化碳誘發肝纖維化之小鼠後之其肝組織細胞的Sirius Red染色圖；

第4圖所示為將枇杷葉細胞之萃取物投予經四氯化碳誘發肝纖維化之小鼠後之其庫否細胞之CD14之免疫染色圖；

第5圖所示為將枇杷葉細胞之萃取物投予小鼠後之其脂肪細胞的顯微鏡圖；以及

第6圖所示為將枇杷葉細胞萃取物、委陵菜酸、或山香二烯酸投予3T3-L1前脂肪細胞後之其分化成脂肪細胞的染色圖。

Claims

一種製備枇杷葉細胞之萃取物之方法，包含：a)於一培養液中培養一枇杷葉細胞，其中該培養液包含一枇杷葉細胞萃餘物及該枇杷葉細胞，該枇杷葉細胞萃餘物係經以下步驟製得：I)取一枇杷葉細胞，並使用濃度為約80體積%至約100體積%之乙醇萃取該枇杷葉細胞；II)濃縮步驟I)之經萃取之產物，以獲得一第一濃縮物；III)使用濃度為約40體積%至約60體積%之甲醇溶解該第一濃縮物，收集一第一未溶解部分；以及IV)使用濃度為約70體積%至約95體積%之甲醇溶解該第一未溶解部分，收集一第二未溶解部分，以製得該枇杷葉細胞萃餘物，且該枇杷葉細胞係經以下步驟得到：1)取一具有傷口之枇杷種子苗之葉片，並待傷口長出癒傷組織細胞；以及2)取出該癒傷組織細胞並加以培育；以及b)萃取步驟a)所培養之枇杷葉細胞。
如請求項1之方法，其中以該培養液之總量計，步驟a)中之枇杷葉細胞萃餘物的用量為約0.5 ppm至約20 ppm。
如請求項1之方法，其中以該培養液之總量計，步驟a)中之枇杷葉細胞萃餘物的用量為約1 ppm至約5 ppm。
如請求項1之方法，其中步驟I)中之枇杷葉細胞係經以下步驟製得：1)取一具有傷口之枇杷種子苗之葉片，並待傷口長出癒傷組織細胞；以及2)取出該癒傷組織細胞並加以培育。
如請求項1之方法，其中該步驟I)之乙醇的濃度為約90體積%至約98體積%，該步驟III)之甲醇的濃度為約45體積%至約55體積%，且該步驟IV)之甲醇的濃度為約80體積%至約90體積%。
如請求項1至3中任一項之方法，其中步驟b)包含以下步驟：b1)使用濃度為約80體積%至約100體積%之乙醇萃取步驟a)所培養之枇杷葉細胞；b2)濃縮步驟b1)之經萃取之產物，以獲得一第二濃縮物；b3)使用濃度為約40體積%至約60體積%之甲醇溶解該第二濃縮物，收集一第三未溶解部分；b4)使用濃度為約70體積%至約95體積%之甲醇溶解該第三未溶解部分並加以過濾，收集濾液；以及b5)視需要濃縮該濾液。
如請求項6之方法，其中該步驟b1)之乙醇的濃度為約 90體積%至約98體積%，該步驟b3)之甲醇的濃度為約45體積%至約55體積%，且該步驟b4)之甲醇的濃度為約80體積%至約90體積%。
一種用於保護肝臟之醫藥組合物，包含一有效量之如請求項1至7中任一項之方法所製得之萃取物。
如請求項8之醫藥組合物，其係用於保護由化學物質所引起之肝損傷或抑制肝纖維化。
如請求項9之醫藥組合物，其中該化學物質係四氯化碳、乙醇或硫乙醯胺。
一種使用如請求項1至7中任一項之方法所製得之萃取物於製造藥劑之應用，其中該藥劑係用於保護肝臟。
如請求項11之應用，其中該藥劑係用於保護由化學物質所引起之肝損傷或抑制肝纖維化。
如請求項12之應用，其中該化學物質係四氯化碳、乙醇或硫乙醯胺。
一種製備具下式(4)及/或式(5)之化合物的方法，其係包含利用如請求項1至7中任一項之方法以製備一枇杷葉細胞之萃取物，以及進行一純化步驟以得到式(4)及/或式(5)之化合物：
如請求項14之方法，其中該純化步驟係包含進行一高效能液相層析。