JP4769579B2 - 糖化蛋白質の測定方法 - Google Patents

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Description

本発明は、試料中の糖化蛋白質、糖化ペプチド又は糖化アミノ酸の測定方法、及びその測定方法に用いられる測定用試薬に関するものである。
糖化蛋白質は、蛋白質が非酵素的に糖化された蛋白質で、糖側のアルデヒド基と蛋白質側のアミノ基がシッフ塩基を形成した後、アマドリ転移を経て形成されるアマドリ化合物である。糖化蛋白質は生体内に広く存在しており、このうち血液中の糖化蛋白質の濃度は、血清中に溶解しているグルコースなどの単糖の濃度に依存している。糖化蛋白質としては、蛋白質のアミノ末端のα−アミノ基が糖化されたもの（例えば、糖化ヘモグロビン）、蛋白質の内部リジン残基のε−アミノ基が糖化されたもの（例えば、糖化アルブミン）を挙げることができ、血清中の糖化アルブミンの濃度や赤血球中の糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンとの存在比は、過去の一定期間の平均血糖値を反映することから、糖尿病の診断、病状の管理、治療効果の判定など臨床診断の指標として使用されている。
糖化蛋白質の測定方法としては、手技が簡単で、臨床検査室で繁用される自動分析装置にも適応可能な酵素法が知られている（例えば、特許文献１参照）。酵素法は、試料中の糖化蛋白質に蛋白質分解酵素を作用させて次工程の基質となる糖化ペプチド又は糖化アミノ酸を遊離させる前処理工程、次いで、遊離した基質に糖化ペプチド特異酵素又は糖化アミノ酸特異酵素（例えば、オキシダーゼ）を作用させて検出可能な生成物（例えば、過酸化水素）を生成させ、該検出可能な生成物を測定する測定工程からなる方法である。
しかしながら、報告されている酵素法は、前処理工程における蛋白質分解酵素及び測定工程における特異酵素が糖化蛋白質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸（以下、総称して糖化蛋白質等ということがある）個々の分子の違いを厳密に認識することができないため、測定対象の糖化蛋白質等と測定対象外の糖化蛋白質等が共存する場合、前記特異酵素が該測定対象外の糖化蛋白質等とも反応してしまい、測定方法としての特異性が低下するという問題がある。
前記測定工程に用いられる糖化ペプチド特異酵素又は糖化アミノ酸特異酵素としては、従来、コリネバクテリウム属菌の生産するオキシダーゼ（例えば、特許文献２参照）、アスペルギルス属菌の生産するオキシダーゼ（例えば、特許文献３参照）等が知られているが、これらの酵素は糖化アミノ酸にはよく作用するが、糖化ペプチドには作用しにくい。最近、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを改変した酵素（特許文献４）、あるいは糸状菌由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（特許文献５）が報告され、これらのオキシダーゼは、ｐＨ８．０の条件下で糖化ペプチド、特にフルクトシルバリルヒスチジンに対して特異的に作用するとされている。
前記の様なフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いた糖化ヘモグロビンの測定では、ヘモグロビンβ−サブユニットのアミノ末端のバリンが糖化されたフルクトシルバリンや、フルクトシルバリンに更に一アミノ酸が付加しているフルクトシルバリルヒスチジンと、蛋白質中のリジン残基が糖化されたε−フルクトシルリジンに対する反応性の違いが、オキシダーゼの特異性を決定する。しかし、ヘモグロビン分子には４４個のリジン残基が存在しており、ε−フルクトシルリジンに対する反応性が低くとも、その影響を無視できない。また、ヘモグロビンや他の血漿蛋白質由来（例えば、糖化アルブミンなど）又は食品、薬剤由来のフルクトシルリジンを含む化合物（以下「フルクトシルリジン類」という場合がある）による正誤差を従来の方法では回避できない。
特開平１１−１２７８９５号公報 特公平５−３３９９７号公報 特開平３−１５５７８０号公報 特開２００１−９５５９８号公報 特開２００３−２３５５８５号公報
従って、本発明は、フルクトシルリジン類の影響を軽減して種々の自動分析装置に適用できる簡便で効率の良い、糖化蛋白質、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を測定する方法及びその測定用試薬を提供することにある。
本発明者らは、かかる実情に鑑み鋭意研究を行った結果、ｐＨ４．０〜７．０でフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させることにより、糖化蛋白質、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定において、反応液中に存在するフルクトシルリジン類の影響を軽減できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、ｐＨ４．０〜７．０でフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させ、得られる生成物をｐＨ４．０〜７．０にて測定することを特徴とする、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減方法を提供するものである。
本発明はまた、糖化蛋白質含有試料を蛋白質分解酵素で処理し、遊離するフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、ｐＨ４．０〜７．０でフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を特異的に作用させ、得られる生成物をｐＨ４．０〜７．０にて測定することを特徴とする、試料中の糖化蛋白質の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減方法を提供するものである。
本発明はまた、少なくとも、（Ａ）蛋白質分解酵素、（Ｂ）ｐＨ４．０〜７．０でフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に特異的に作用して過酸化水素を生成するオキシダーゼ及び（Ｃ）過酸化水素を測定するための試薬を含むフルクトシルリジン類の影響を軽減した糖化蛋白質測定用試薬を提供するものである。
本発明はまた、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、ｐＨ４．０〜７．０で、少なくとも（Ａ）フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素、（Ｂ）過酸化水素を測定するための試薬及び（Ｃ）糖酸化分解酵素を作用させることを特徴とする、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減方法を提供するものである。
本発明は更に、糖化蛋白質含有試料を蛋白質分解酵素で処理して得られるフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に、ｐＨ４．０〜７．０で、少なくとも（Ａ）フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素、（Ｂ）過酸化水素を測定するための試薬及び（Ｃ）糖酸化分解酵素を作用させることを特徴とする、糖化蛋白質の測定におけるフルクトシルリジン類の影響の軽減方法を提供するものである。
本発明によれば、フルクトシルリジン類の影響を軽減して正確に糖化蛋白質、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を測定することができる。本発明の測定方法は、簡便な操作で測定が可能であるため、種々の分析方法に適用でき、臨床検査の領域においても極めて有用である。
本発明の方法によるヘモグロビンＡ１ｃ値（％）（実施例５）及び比較例５によるヘモグロビンＡ１ｃ値（％）と参照例との相関関係を示す図である。
糖化蛋白質は、蛋白質がグルコース等のアルドースと非酵素的に結合し、生成したものであれば如何なるものでもよい。例えば、糖化ヘモグロビン、糖化アルブミン等が挙げられ、このうち糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が測定対象として好適に用いられる。
糖化蛋白質を含有する試料としては、生体試料として、全血、血球、血清、血漿、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪が挙げられる。また、糖化蛋白質は、ジュース、調味料等の食品一般にも含有されている。これらのうち試料としては、全血、血球、血清、血漿が好ましい。これらの試料は、そのまま測定に供することはもちろん、ろ過や透析処理の後に測定に供してもよく、また測定すべき糖化蛋白質を適宜、濃縮、抽出、更には水もしくは後記する緩衝液で希釈してもよい。
本発明においては、先ず、蛋白質分解酵素を用い、糖化蛋白質よりフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を遊離させる。蛋白質分解酵素は、蛋白質分解活性、ペプチド分解活性を有していれば特に制限されないが、短時間で効率よくフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸、好ましくはフルクトシルバリルペプチド又はフルクトシルバリンを遊離させるものが良い。該蛋白質分解酵素の起源は、微生物由来、動物由来、植物由来など何れでもよく、特に限定はされない。具体的には、プロテイナーゼＫ、トリプシン、ブロメライン、カルボキシペプチダーゼ、パパイン、ペプシン、アミノペプチダーゼなど研究用途の市販品として容易に入手できるもの、ニュートラルプロテイナーゼ、トヨチームＮＥＰ（以上、東洋紡社製）、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、モルシン、ＡＯプロテアーゼ、ペプチダーゼ（以上、キッコーマン社製）、スミチームＣＰ、スミチームＴＰ、スミチームＬＰ５０Ｄ（以上、新日本化学工業社製）、サモアーゼＰＣ１０Ｆ、プロチンＰＣ、プロチンＰＣ１０Ｆ、プロチンＰＳ１０、プロチンＮＹ１０、プロチンＮＬ１０、プロチンＮＣ２５（以上、大和化成社製）、アクチナーゼＡＳ（科研製薬社製）、プロナーゼＥ（ロシュ社製）、ウマミザイム、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ（以上、アマノエンザイム社製）など工業用として市販されているものが挙げられる。これら蛋白質分解酵素は、フルクトシルペプチド等に作用させ、作用の前後の試料をキャピラリー電気泳動を用いて分析、比較することにより効果を確認できる。上記蛋白質分解酵素は、単独で用いても、また二種以上を組み合わせて用いてもよい。これらのなかで、バチルス属、アスペルギルス属もしくはストレプトマイシス属の微生物由来、あるいはその遺伝子により産生されるもの、又はメタロプロテイナーゼ、中性プロテアーゼ、酸性プロテアーゼもしくは塩基性プロテアーゼに属するものが好ましい。バチルス属由来の酵素としては、プロチンＰＣ１０Ｆ、プロチンＮＣ２５（大和化成社製）、トヨチームＮＥＰ（東洋紡社製）など、アスペルギルス属由来の酵素としては、モルシン（キッコーマン社製）、ストレプトマシシス属由来の酵素としては、アクチナーゼＡＳ、アクチナーゼＡＦ、アクチナーゼＥ（科研製薬）、プロテアーゼＴｙｐｅ−ＸＩＶ（シグマ社製）などが挙げられる。これらは単独で使用できるほか、トヨチームＮＥＰなどはプロテイナーゼＫと混合して併用することもできる。
蛋白質分解酵素の使用濃度は、目的とするフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を効率よく遊離できる濃度であれば特に制限はない。使用する酵素の比活性などを考慮し、実験的に使用濃度を適宜設定することができる。例えば、アスペルギルス属菌由来の蛋白質分解酵素（例えば、モルシン、キッコーマン社製）を０．０００１〜５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．００１〜２０ｍｇ／ｍＬ加える。蛋白質分解酵素で処理するときのｐＨは、特に調整しなくてもよいが、使用する酵素の作用に至適なｐＨとなるように、適当なｐＨ調整剤、例えば後記の緩衝液によってｐＨ３．０〜１１．０に調整してもよい。処理温度は、１０〜４０℃が好ましい。
緩衝液としては特に制限はなく、リン酸、フタル酸、クエン酸、トリス、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、酒石酸、酢酸、グッド（ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＤＡなど）の緩衝液等が使用できる。緩衝液の濃度も特に制限はないが、０．００００１〜２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００１〜１ｍｏｌ／Ｌである。
試料を蛋白質分解酵素で処理して得られる遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸としては、フルクトシルバリルヒスチジン、フルクトシルバリン等が挙げられる。また、生体試料や食品中には、蛋白質分解酵素を作用させる前に既に、糖化蛋白質が分解されて遊離したペプチドやアミノ酸にグルコースが結合した後、アマドリ転移を経て生成したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸も含まれており、これらも遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に含まれる。
遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸は、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素を作用させ、その作用による生成物を測定することにより測定できる。
当該フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素としては、遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を代謝できるものであれば特に制限されず、例えば、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（特開２００３−７９３８６号公報及び国際公開第９７／２００３９号パンフレット）、ケトアミンオキシダーゼ（特開平５−１９２１９号公報）、フルクトシルペプチドオキシダーゼ（特開２００１−９５５９８号公報及び特開２００３−２３５５８５号公報）等が挙げられる。これらのうちで、フルクトシルペプチドオキシダーゼが好ましい。これらの酵素は、微生物由来、動物由来、植物由来等のいずれでもよく、また遺伝子操作により作られたものでもよい。更に、化学修飾の有無も問わない。これらの酵素は、溶液状態でも乾燥状態でもよく、不溶性担体に保持又は結合されていてもよく、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
これらの酵素の使用量は、酵素の種類によっても異なるが、好ましくは０．００１〜１０００単位／ｍＬ、特に好ましくは０．１〜５００単位／ｍＬである。使用する酵素の比活性などを考慮し、実験的に使用濃度を適宜設定することができる。作用させるときのｐＨは、使用する酵素の至適ｐＨを考慮しながら、本発明の効果が得られるｐＨ４．０〜７．０、好ましくは４．０〜６．７となるように緩衝液を用いて調整する。作用温度は、例えば、１０〜４０℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。この場合の緩衝液は、前記同様、特に制限なく、リン酸、フタル酸、クエン酸、トリス、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、酒石酸、酢酸、グッドの緩衝液等が使用できる。これらのうち、リン酸、クエン酸、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）がフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素の保存安定性にもすぐれており好ましい。緩衝液の濃度も特に制限はないが、０．００００１〜２ｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．００１〜１ｍｏｌ／Ｌである。
上記測定用酵素は、必要に応じて、他の酵素、補酵素、被酸化性呈色試薬等と組み合わせて使用することができる。他の酵素としては、パーオキシダーゼ、ジアホラーゼ又はフルクトシルバリンを基質としないアミノ酸代謝酵素などが挙げられる。また、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ等の血液中の夾雑成分を処理するための酵素も使用できる。補酵素としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型リン酸（ＮＡＤＰＨ）、チオＮＡＤ、チオＮＡＤＰ等が挙げられる。
被酸化性呈色試薬としては、過酸化水素と反応して呈色するものであれば如何なるものでもよい。例えば、４−アミノアンチピリンと、フェノール系、ナフトール系又はアニリン系化合物との組み合わせ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンとアニリン系化合物との組み合わせなどが挙げられる。４−アミノアンチピリンと組み合わせることができるフェノール系化合物としては、フェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，４，６−トリクロロフェノールなどが挙げられ、アニリン系化合物としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（ヒドロキシエチル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）などが挙げられる。その他、Ｎ−（カルボシキメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン・ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジン・ナトリウム塩（ＤＡ−６７）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ−３−スルホプロピル−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ−ＰＳ）、ジアミノベンチジン、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、テトラメチルベンチジン、オルトフェニレンジアミンなどが挙げられる。
前記測定用酵素を作用させて得られる生成物としては、例えば、ペプチド、過酸化水素、糖オソン等が挙げられる。遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定は、これらの生成物を測定することによって行われるが、短時間で簡単に測定できるため、過酸化水素を測定することが好ましい。過酸化水素の測定方法としては、例えば、酸素電極を用いる電気的方法、パーオキシダーゼ又はジアホラーゼと上記の発色剤を用いる酵素的方法が挙げられるが、後者の酵素的方法が好ましい。
過酸化水素の測定は、通常、前記測定用酵素を作用させて過酸化水素を発生させる工程に連続して行われるが、過酸化水素の測定溶液は、緩衝液を用いてｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ４．０〜６．７に調整する。発色の程度（吸光度変化量）は、分光光度計により測定し、標準とする濃度既知のフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸等の吸光度と比較して、試料中に含まれる糖化蛋白質、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を測定することができる。
本発明の測定方法では、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を遊離させる工程と遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を測定する工程とを別々に行って糖化蛋白質を測定することもできるし、これらの工程を連続的に一段階で行って測定することもできる。
また、本発明の測定方法では、反応液又は測定液をｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ４．０〜６．７に調整することにより、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素のフルクトシルリジン類に対する影響を軽減することができる。従って、遊離したフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸を測定する工程では、上記ｐＨに調整することが必須である。
本発明のフルクトシルリジン類の影響を軽減した糖化蛋白質測定用試薬は、少なくとも（Ａ）蛋白質分解酵素、（Ｂ）ｐＨ４．０〜７．０でフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に特異的に作用して過酸化水素を生成するオキシダーゼ、及び（Ｃ）過酸化水素を測定するための試薬、を含む。更に、前記（Ｂ）記載のオキシダーゼをフルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸に作用させた結果生じるグルコソンにさらに糖酸化分解酵素を作用させ、過酸化水素を生成させて感度増加を図ることができる（特開２０００−３３３６９６号公報）。前記糖酸化分解酵素としては、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びピラノースオキシダーゼからなる群から選択された少なくとも一つの酸化酵素であることが好ましい。それぞれの酵素及び試薬の具体的な説明は前記の通りである。この他に、糖化ヘモグロビン、特にヘモグロビンＡ１ｃを測定する際には赤血球からヘモグロビンを取り出して反応に供するための前処理剤などが使用でき、血液中の夾雑成分を処理する酵素、反応調整剤、試薬の安定化剤、また塩化ナトリウム、塩化カリウム、フェロシアン化カリウムなどの塩、還元性物質の影響回避のためのテトラゾリウム塩、防腐剤としての抗生物質、アジ化ナトリウムなども添加できる。
上記の赤血球からヘモグロビンを取り出して反応に供するための前処理剤としては、ポリオキシエチレン誘導体から選ばれる非イオン系界面活性剤（例えばトリトンＸ−１００など）、陰イオン系界面活性剤等を用いることができる。これら界面活性剤の使用量は、必要に応じて濾過、透析処理等を行った試料中、０．０００１〜１０％、好ましくは０．００１〜１％である。
本発明の糖化蛋白質測定用試薬は、溶液状態だけでなく、乾燥状態やゲル状態でも提供できる。また、ガラスビン、プラスチック容器等への充填の他、不溶性担体への塗布、含浸などの形態で提供できる。不溶性担体としては、例えば、ラテックス、ガラス、コロイドなどの粒子・球状担体、半導体やガラスなどの平板状担体、紙やニトロセルロースなどの膜状担体、繊維状担体が挙げられる。
以下実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］ フルクトシルアミノ酸の測定
（１）試料の調製
フルクトシルバリン（ｆＶ）、フルクトシルバリルヒスチジン（ｆＶＨ）（以上、バイオクエスト社製）、ε−フルクトシルリジン（ｆＫ）（キッコーマン社製）を量り、それぞれ２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かして０．３ｍｍｏｌ／Ｌ濃度の試料とした。
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液
実施例１；ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０
比較例１；ｐＨ７．５、ｐＨ８．０
＜第二試薬＞
５単位／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＣＥ、キッコーマン社製）
２０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）
１ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン
０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液
実施例１；ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０
比較例１；ｐＨ７．５、ｐＨ８．０
（第一試薬と第二試薬は同一のｐＨの組み合わせで使用した。）
試料２０μＬに第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度Ｉ）。次いで第二試薬８０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＩ）。吸光度の測定は主波長５４６ｎｍ（副波長８００ｎｍ）で行い、試料の代わりに生理食塩水を用いて同様に操作したもの（試薬ブランク）を対照とした。
各試料の吸光度Ｉ及び吸光度ＩＩから式Ａを用いて各試料の吸光度変化量（測定値）を算出した。
式Ａ：吸光度変化量（測定値）＝吸光度ＩＩ−（吸光度Ｉ×（２０＋２４０）／（２０＋２４０＋８０））
得られた各測定値を用いて、フルクトシルバリンの測定値に対するε−フルクトシルリジンの測定値の比（ｆＫ／ｆＶ）、及びフルクトシルバリルヒスチジンの測定値に対するε−フルクトシルリジンの測定値の比（ｆＫ／ｆＶＨ）を算出した。また、ｐＨ８．０条件におけるｆＫ／ｆＶ及びｆＫ／ｆＶＨそれぞれの測定値の比を１００％として、各ｐＨ条件の測定値の比も比較した。結果を表１に示した。
Figure 0004769579
表１から明らかなように、ｆＫ／ｆＶ、ｆＫ／ｆＶＨのいずれの場合でも、実施例の測定値の比は比較例と比べて、大幅に低値であった。本発明の方法は、ｆＶ、ｆＶＨに対する特異性が高く、フルクトシルリジン類との反応性は低いことがわかった。
［実施例２］ フルクトシルアミノ酸の測定
（１）試料の調製
実施例１と同様、フルクトシルバリルヒスチジン（ｆＶＨ）（バイオクエスト社製）、ε−フルクトシルリジン（ｆＫ）（キッコーマン社製）を０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かして０．３ｍｍｏｌ／Ｌ濃度の試料とした。
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
実施例１の第一試薬を使用した。
＜第二試薬＞
５単位／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＣＥ）を５単位／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＥＥ）に代える以外は実施例１と同組成の第二試薬を使用した。
（第一試薬と第二試薬は同一のｐＨの組み合わせで使用した。）
実施例１と同一の操作を行った。結果を表２に示した。
Figure 0004769579
表２から明らかなように、実施例１とは異なるフルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＥＥ）を用いた場合においても、比較例と比べて、ｆＫ／ｆＶＨが大幅に減少しており、フルクトシルバリルヒスチジンに対する特異性が高く、フルクトシルリジン類との反応性が低いことがわかった。
［実施例３］ フルクトシルアミノ酸及びフルクトシルペプチドの測定
（１）試料の調製
フルクトシルバリン、フルクトシルバリルヒスチジン（以上、バイオクエスト社製）、ε−フルクトシルリジン（キッコーマン社製）をそれぞれ量り、０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かして０．６ｍｍｏｌ／Ｌ濃度の溶液とした。０．６ｍｍｏｌ／Ｌフルクトシルバリン溶液及び０．６ｍｍｏｌ／Ｌフルクトシルバリルヒスチジン溶液に等量の０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）あるいは０．６ｍｍｏｌ／Ｌε−フルクトシルリジン溶液を混合して、０．３ｍｍｏｌ／Ｌフルクトシルバリン試料、０．３ｍｍｏｌ／Ｌフルクトシルバリルヒスチジン試料、あるいはε−フルクトシルリジンとの混合試料（各基質の濃度は０．３ｍｍｏｌ／Ｌ）とした。
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
実施例１の第一試薬のうち、ｐＨ５．５とｐＨ６．５のもの、及び比較例１のうちｐＨ８．０のものを使用した。
＜第二試薬＞
実施例１の第二試薬のうち、ｐＨ５．５とｐＨ６．５のもの、及び比較例１のうちｐＨ８．０のものを使用した。
（第一試薬と第二試薬は共通のｐＨの組み合わせで使用した。）
実施例１と同様に操作を行い、フルクトシルバリン試料の測定値に対するフルクトシルバリンとε−フルクトシルリジンとの混合試料の測定値の比（（ｆＶ＋ｆＫ）／ｆＶ）、及びフルクトシルバリルヒスチジン試料の測定値に対するフルクトシルバリルヒスチジンとε−フルクトシルリジンとの混合試料の測定値の比（（ｆＶＨ＋ｆＫ）／ｆＶＨ）を算出し評価した。結果を表３に示す。
Figure 0004769579
表３から明らかなように、実施例３では、比較例３と比べてε−フルクトシルリジンの影響が大きく軽減できていることがわかった。
［実施例４］ ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）％の測定
（１）試料の調製
ＥＤＴＡを抗凝固剤として含む採血管を用いて被検者１５人から常法により採血した全血を、冷室に一晩静置して赤血球を沈降させた。沈降した赤血球層より１０μＬを採取し、これに、０．１％トリトンＸ−１００水溶液３００μＬを加え混合し、血球溶血液試料を調製した。
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
１単位／ｍＬ プロテイナーゼＫ
２ｍｍｏｌ／Ｌ ＷＳＴ−３（同仁化学社製）
０．０２ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
＜第二試薬＞
４単位／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＣＥ、キッコーマン社製）
２０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
８０μｍｏｌ／Ｌ ＤＡ−６４（和光純薬工業社製）
７５００単位／ｍＬ トヨチームＮＥＰ（東洋紡社製）＊
３７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．２ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（実施例４：ｐＨ６．０、比較例４：ｐＨ８．０）
＊それぞれのトヨチームＮＥＰは、１０万単位／ｍＬを５００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（実施例４：ｐＨ６．０、比較例４：ｐＨ８．０）に対し、４℃で４時間透析した後用いた。
＊＊本発明及び比較例の反応液の最終ｐＨは、それぞれ６．７及び８．０である。
各試料２０μＬに第一試薬２４０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＩＩ）、次いで第二試薬８０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の吸光度を測定した（吸光度ＩＶ）。尚、各々の試料の吸光度ＩＩＩ及び吸光度ＩＶから、式Ｂを用いて各試料中のフルクトシルペプチド量に基づく吸光度変化量（吸光度Ｖ）を算出した。
式Ｂ：吸光度Ｖ＝吸光度ＩＶ−（吸光度ＩＩＩ×（２０＋２４０）／（２０＋２４０＋８０））
上記の吸光度ＩＩＩは、総ヘモグロビン濃度に比例するので、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）既知の血球溶血液（ヘモグロビンＡ１ｃ値８．６％）を上記と同様に操作した場合の吸光度ＩＩＩ及びＶと比較し、各試料のヘモグロビンＡ１ｃ値（％）を算出した。実施例４、比較例４により求めたヘモグロビンＡ１ｃ値を、ラテックス法を原理とする市販キット「ラピディアＡ１ｃ」（富士レビオ社製）により測定した各試料中のヘモグロビンＡ１ｃ値（％）（参照例）と比較した。結果を表４に示した。
Figure 0004769579
表４より明らかなように、比較例４では本来起こりえない負の値となってしまう場合があるのに対し、本発明の測定方法は、比較例に比べて参照例との相関性が良いことが判明した。よって、本発明の測定方法では、ヘモグロビン由来のε−フルクトシルリジン又はフルクシルリジルペプチドの影響を受けることなく試料中のヘモグロビンＡ１ｃ値（％）を測定できる。
［実施例５］ ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）の測定（１）試料の調製
実施例４と同様にヒト血球試料３５例より、血球溶血液試料を調製した。
（２）試料の測定
日立７１５０形自動分析装置を用いて、以下の操作により各試料の測定を行った。
＜第一試薬＞
１単位／ｍＬ プロテイナーゼＫ
０．２％ プライサーフＡ２０８Ｂ（第一工業製薬社製）
０．０２ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
＜第二試薬＞
４単位／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＣＥ、キッコーマン社製）
２０単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
８０μｍｏｌ／Ｌ ＴＰＭ−ＰＳ（同仁化学社製）
７５００単位／ｍＬ トヨチームＮＥＰ（東洋紡社製）＊
３７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ
０．２ｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ５．５、６．０、７．０、８．０）
＊それぞれのトヨチームＮＥＰは、１０万単位／ｍＬを５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５、６．０、７．０、８．０）に対し、４℃で４時間透析した後用いた。
試料２０μＬに、第一試薬２４０μＬを加え、波長６００ｎｍにおける吸光度（吸光度ＶＩ）を、試料の代わりに生理食塩水を用い同様に操作したもの（試薬ブランク）を対照に測定した。次いで３７℃で５分間加温した後、第二試薬８０μＬを加え、３７℃で５分間加温後の波長６００ｎｍの吸光度（吸光度ＶＩＩ）を試薬ブランクを対照に測定した。これら４種の反応液の最終ｐＨは、それぞれ６．４、６．７、７．２、８．０であり、ヘモグロビンＡ１ｃ値（％）は、実施例４と同様にして算出した。参照例として市販キット「ラピディアＡ１ｃ」（富士レビオ社製）を用い、製造元指定の方法にて測定した。実施例５ならびに比較例５によるヘモグロビンＡ１ｃ値（％）と参照例によるヘモグロビンＡ１ｃ値（％）との相関関係を図１に示した。また、本発明法および比較例のそれぞれについて、参照例に対する相関係数、及び参照例の測定値との差の参照例の測定値に対するパーセント（％バイアス）の平均値を表５に示した。
Figure 0004769579
本発明の測定方法は、参照例とよく一致していることが判明した。本発明の測定方法では、ヘモグロビン由来のε−フルクトシルリジン又はフルクシルリジルペプチドの影響を受けることなく試料中のヘモグロビンＡ１ｃ値（％）を測定できる。
［実施例６］ フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素の保存安定性の確認
（１）酵素液の調製
下記の処方で酵素液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ 緩衝液（ｐＨ６．０）＊
＊緩衝剤の種類はリン酸カリウム、クエン酸ナトリウム及びＮ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）の３種類
５単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
１単位／ｍＬ フルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ−ＣＥ，キッコーマン社製）
（２）酵素液の保存
前記の３種類の酵素液それぞれを４℃、３７℃に１晩放置した。
（３）酵素液中の酵素活性の測定
日立７１７０形自動分析装置を用いて、以下の操作により酵素液中の酵素活性を測定した。
＜希釈酵素液＞
前記の３種類の酵素液それぞれを、１００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）により２倍に希釈して測定に使用した。
＜酵素活性測定用第一試薬＞
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン
１単位／ｍＬ パーオキシダーゼ（ＩＩＩ）（東洋紡社製）
１００ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）
＜酵素活性測定用第二試薬＞
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ フルクトシルグリシン水溶液
希釈酵素液６．５μＬに、酵素活性測定第一試薬１８２μＬを加え、３７℃で５分間加温した。次いで酵素活性測定用第二試薬２６μＬを加え、酵素活性測定用第二試薬添加後２分〜３分の５４６ｎｍにおける吸光度の変化量を測定した。４℃保存した酵素液の吸光度変化量を１００％とし、３７℃保存した酵素液の吸光度変化量を相対値で表わし、安定性を評価した。
リン酸カリウム緩衝液では９５％、クエン酸ナトリウム緩衝液では９８％、ＡＤＡ緩衝液では８９％の相対活性が測定され、これらの緩衝剤が、フルクトシルペプチド又はフルクトシルアミノ酸の測定用酵素の保存安定性に優れていることが確認された。

Claims (7)

  1. 糖化ヘモグロビン含有試料を蛋白質分解酵素で処理し、遊離するフルクトシルバリルヒスチジンに、ｐＨ５．５〜６．５でフルクトシルペプチドオキシダーゼを特異的に作用させ、得られる過酸化水素をｐＨ５．５〜６．５にて測定することによりフルクトシルリジンの影響を軽減することを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定におけるフルクトシルリジンの影響の軽減方法。
  2. 蛋白質分解酵素が、バチルス属、アスペルギルス属又はストレプトマイシス属の微生物由来、あるいは該微生物の遺伝子を組換え操作して得られるものである請求項１記載のフルクトシルリジンの影響の軽減方法。
  3. 糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンＡｌｃである請求項１又は２記載のフルクトシルリジン類の影響の軽減方法。
  4. 少なくとも、（Ａ）糖化ヘモグロビンからフルクトシルバリルヒスチジンを遊離させることのできる蛋白質分解酵素、（Ｂ）ｐＨ５．５〜６．５でフルクトシルバリルヒスチジンに特異的に作用して過酸化水素を生成するフルクトシルペプチドオキシダーゼ及び（Ｃ）過酸化水素を測定するための試薬を含むフルクトシルリジンの影響を軽減した糖化ヘモグロビン測定用であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法に使用するための試薬。
  5. 糖化ヘモグロビン含有試料を蛋白質分解酵素で処理して得られるフルクトシルバリルヒスチジンに、ｐＨ５．５〜６．５で、少なくとも（Ａ）フルクトシルペプチドオキシダーゼ、（Ｂ）過酸化水素を測定するための試薬及び（Ｃ）糖酸化分解酵素を作用させることによりフルクトシルリジンの影響を軽減することを特徴とする、糖化ヘモグロビンの測定におけるフルクトシルリジンの影響の軽減方法。
  6. 糖化ヘモグロビンがヘモグロビンＡｌｃである請求項５記載のフルクトシルリジンの影響の軽減方法。
  7. 蛋白質分解酵素が、バチルス属、アスペルギルス属又はストレプトマイシス属の微生物由来、あるいは該微生物の遺伝子を組換え操作して得られるものである請求項５又は６記載のフルクトシルリジンの影響の軽減方法。
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