JP2001204494A - 糖化ヘモグロビンの測定キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＨＡ
ｌｃ；ＨｂＡｌｃ）やその分解産物であるフルクトシル
トシルバリンの新規な測定方法を提供する。 【解決手段】本発明はフルクトシルアミン酸化酵素の反
応条件を鋭意検討した結果、フルクトシルアミン酸化酵
素を用いてフルクトシルバリンを選択的に反応させる以
下のａ）〜ｃ）のいずれかの反応条件 ｄ）反応溶液のｐＨを６以下であること。 ｅ）反応溶液の電解質濃度が２００ｍＭ以上であること ｆ）ａ）からｂ）の組み合わせによる反応条件。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規な糖化ヘモグロ
ビン（ヘモグロビンＡｌｃ；ＨｂＡｌｃ）の測定方法に
関する。より詳細には本発明は臨床検査などの分野で利
用され、ＨｂＡｌｃやその分解産物であるフルクトシル
バリンの測定方法ならびにその方法に基づき構築される
酵素センサーシステムに関する。

【０００２】

【従来の技術】蛋白質主鎖および側鎖のアミノ基はグル
コースなどの還元糖の還元末端と非酵素的に結合して、
アマドリ化合物すなわち糖化蛋白質を生ずる。血中にお
いては、ヘモグロビンが糖化されて糖化ヘモグロビン
（グリコヘモグロビン；ＨｂＡｌｃ）を生ずることが知
られている。糖尿病患者では健常人に比べてヘモグロビ
ンに対するＨｂＡｌｃの存在比率が高いこと、およびＨ
ｂＡｌｃの血中濃度は過去数週間の血糖値を反映するこ
とから、ＨｂＡｌｃ血中濃度は糖尿病の診断および糖尿
病患者の血糖コントロールの指標として、臨床試験にお
いて極めて重要である。

【０００３】ＨｂＡｌｃにおいては、ヘモグロビンβ鎖
のＮ末端のバリンにグルコースが結合していることか
ら、フルクトシルバリンをＨｂＡｌｃの低分子モデル化
合物として用いることができる。すなわち、フルクトシ
ルバリンを基質とする酵素を用いて、ＨｂＡｌｃをアッ
セイすることが可能である。

【０００４】これまでに、種々の菌株からアマドリ化合
物に対して作用する酵素が単離されており、これらの酵
素を用いてグリコアルブミン、ＨｂＡｌｃおよびフルク
トサミン等の糖化蛋白質を分析しうることが示唆されて
いる（特開昭６１−２６８１７８、特開昭６１−２８０
２９７、特開平３−１５５７８０、特開平５−１９２１
９３、特開平７−２８９２５３、特開平８−１５４６７
２、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（１），
１０３−１１０，１９８９、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５５（２），３３３−３３８，１９９１、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（４４），２７２９
７−２７３０２，１９９４、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（１２），４４８７−
４４８９，１９９５、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９（３），４８７−４９１，１９
９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０（１），２１
８−２２４，１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
７１（５１），３２８０３−３２８０９，１９９６、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（６），３４３７−
３４４３，１９９７）。

【０００５】しかし、これまでに報告されているフルク
トシルアミン酸化酵素を用いて、糖化ヘモグロビンに存
在し、糖化ヘモグロビン含量の指標となるフルクトシル
アミン化合物である’フルクトシルバリンと、糖化アル
ブミンの主な分解産物として知られるフルクトシルアミ
ン化合物であるフルクトシルリジンとを区別することは
困難であった。

【０００６】これはこれまでに報告されているフルクト
シルアミン酸化酵素の基質特異性に起因するものであ
る。したがって、フルクトシルアミン酸化酵素をフルク
トシルバリンに選択的に反応させることが期待されてい
た。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は糖化ヘモグロ
ビン（ヘモグロビンＨＡｌｃ；ＨｂＡｌｃ）やその分解
産物であるフルクトシルトシルバリンの新規な測定方法
ならびにその方法に基づき構築される分析キットおよび
酵素センサーシステムを提供する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明はフルクトシルア
ミン酸化酵素の反応条件を鋭意検討した結果、フルクト
シルアミン酸化酵素を用いてフルクトシルバリンを選択
的に反応させる条件を見出した。

【０００９】すなわち、フルクトシルバリンとフルクト
シルリジンを同等、あるいはフルクトシルリジンをより
選択的に基質とするフルクトシルアミン酸化酵素の基質
特異性をフルクトシルバリンに選択的に反応させるため
の以下のａ）〜ｃ）のいずれかの反応条件 ａ）反応溶液のｐＨを６以下であること。 ｂ）反応溶液の電解質濃度が２００ｍＭ以上であること ｃ）ａ）からｂ）の組み合わせによる反応条件 を提供する。本発明はまた、ＨｂＡｌｃ分解して得られ
るフルクトシルバリンあるいはフルクトシルバリンを上
記反応条件のもとでフルクトシルアミン酸化酵素と反応
させることにより測定することを特徴とする測定方法を
提供する。

【００１０】本発明はまた、上記記載の方法を実施する
ためのフルクトシルバリン測定キットを提供する。

【００１１】本発明はまた、上記記載の方法でフルクト
シルバリンを測定することを実施するための糖化ヘモグ
ロビンの測定キットを提供する。

【００１２】本発明はさらに本発明の測定方法に基づき
構築されるＨｂＡｌｃあるいはフルクトシルバリン計測
用の酵素センサーシステムを提供する。

【００１３】本発明はさらに本発明のＨｂＡｌｃあるい
はフルクトシルバリンの測定方法ならびに分析キットに
おいてそのフルクトシルアミン酸化酵素がＰｉｃｈｉａ
ｓｐ．Ｎ１−１株由来のフルクトシルアミン酸化酵素
であるものを提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明の方法において用いるフル
クトシルアミン酸化酵素は本発明を達成できるものであ
れば特に限定されるものではない。例えば、フルクトシ
ルアミン酸化酵素を産生する微生物を用いて製造するこ
とができる。その様な微生物の例としては、Ｐｉｃｈｉ
ａ ｓｐ．Ｎ１−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２６）が
挙げられる。微生物をフルクトシルバリンを含む適当な
天然または合成培地で培養する。フルクトシルバリンを
唯一の窒素源とする培地を用いて、フルクトシルバリン
酸化酵素を誘導することにより、酵素の収率を高めるこ
とが好ましい。フルクトシルバリンを唯一の窒素源とす
る培地としては、最少培地（例えばＭ９Ｓ）にフルクト
シルバリンを添加したものが挙げられる。培養液から遠
心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレス
などで破砕する。これを超遠心分離し、フルクトシルバ
リン酸化酵素を含む水溶性画分を得ることができる。得
られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどによ
り精製することにより、フルクトシルアミン酸化酵素を
調製する。本発明におけるフルクトシルバリンあるい
は、ＨｂＡｌｃを酵素的あるいは化学的に分解し生成し
たフルクトシルバリンを測定する方法は、以下に示す
ａ）〜ｃ）の条件のもとでフルクトシルアミン酸化酵素
をこれらの基質に作用させる。フルクトシルバリンを同
条件下で特異的に酸化するフルクトシルアミン酸化酵素
としては上記で調製したＰｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１
由来フルクトシルアミン酸化酵素などを使用することが
できる。 ａ）反応溶液のｐＨを６以下であること。 ｂ）反応溶液の電解質の濃度が２００ｍＭ以上であるこ
と ｃ）ａ）からｂ）の組み合わせによる反応条件

【００１５】フルクトシルアミン酵素の基質選択性は、
反応溶液のｐＨが７近辺では、図１に示されるように、
フルクトシルリジンを基質とした時の酵素活性に対する
フルクトシルバリンを基質とした時の酵素活性の比は２
以下であり、この２基質を区別する観点において実用上
問題がある。しかしｐＨの低下とともにフルクトシルバ
リンに対する反応比が向上し、ｐＨ６以下、好ましくは
ｐＨ５．５以下、より好ましくはｐＨ５．０以下では比
活性は２以上となり、実用上十分に利用でき、フルクト
シルバリンに対する選択性が高くなる。

【００１６】さらにフルクトシルアミン酸化酵素の基質
選択性は、反応溶液中の電解質濃度が図２および３に示
すように、２００ｍＭ以下では、フルクトシルリジンを
基質とした時の酵素活性に対するフルクトシルバリンを
基質とした時の酵素活性の比は２以下であり、この２基
質を区別する観点において実用上問題がある。しかし、
反応溶液中の電解質濃度の増加とともに反応比が向上
し、反応溶液の電解質濃度が２００ｍＭ以上、好ましく
は３００ｍＭ以上、より好ましくは４００ｍＭ以上では
比活性は２以上となり、実用上十分に利用でき、フルク
トシルバリンに対する選択性が高くなる。

【００１７】酵素活性の測定 フルクトシルアミン酸化酵素活性は、酵素反応により消
費される酸素の量または発生する過酸化水素の量を定量
することにより測定することができる。当該技術分野に
おいては、酸素および過酸化水素を定量する種々の方法
が知られている。例えば、恒温セルにフルクトシルバリ
ン酸化酵素およびメディエーターを含む緩衝液を入れて
一定温度に維持し、ここにフルクトシルバリンを含む試
料を加え、酸化還元色素の呈色反応をモニターすること
により、フルクトシルアミン酸化酵素の活性を測定する
ことができる。あるいは、ペルオキシダーゼを用いて発
生する過酸化水素を定量することができる。このような
測定系としては、ペルオキシダーゼ〜４−アミノアンチ
ピリン系が知られており、種々の実験書（例えば生物工
学実験書 社団法人生物工学会編、培風館平成４年）に
記載されている。

【００１８】さらに同様にしてフルクトシルアミン酸化
酵素の電子受容体として酸素ではなく、種々の人工電子
メディエーターを利用することができる。メディエータ
ーとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オ
スミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートなどを用
いることができる。

【００１９】アッセイキット 別の観点においては、本発明は、上記方法を実施するた
めのフルクトシルバリンアッセイキットを特徴とする。
本発明のフルクトシルバリンアッセイキットは、本発明
に従うフルクトシルバリン酸化酵素の測定条件を備えた
反応液を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。
典型的には、キットは、フルクトシルアミン酸化酵素と
本発明の条件にしたがったアッセイに必要な緩衝液、適
当なメディエーター、および必要な場合にはペルオキシ
ダーゼ等の酵素、キャリブレーションカーブ作製のため
のフルクトシルバリンもしくはその誘導体の標準溶液、
ならびに使用の指針を含む。本発明に従うフルクトシル
バリン分析キットは種々の形態で、例えば、凍結乾燥さ
れた試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として
提供することができる。

【００２０】さらに別の観点においては、本発明はＨｂ
Ａｌｃアッセイキットを特徴とする。ＨｂＡｌｃを酵素
的または化学的に分解することによりフルクトシルバリ
ンが生成し、これを本発明のフルクトシルバリン分析キ
ットを用いて定量することによりＨｂＡｌｃをアッセイ
することができる。したがって、本発明のＨｂＡｌｃア
ッセイキットは、上述のフルクトシルバリンアッセイキ
ットにさらに加水分解試薬または蛋白質分解酵素を含
む。

【００２１】酵素センサーシステム 別の観点においては、本発明は、フルクトシルバリン計
測用センサーシステムおよびＨｂＡｌｃ計測用センサー
システムを特徴とする。本発明のセンサーシステムを用
いて、本発明の反応条件下でフルクトシルアミン酸化酵
素の作用により消費される酸素または発生する過酸化水
素を計測することにより、基質であるフルクトシルバリ
ンの濃度を決定することができる。酸素または過酸化水
素を測定する種々のセンサー系が当該技術分野において
知られている。電極としては、酸素電極、カーボン電
極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明
の酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を
用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透
析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマ
ー、酸化還元ポリマーなどがあり、これらを組み合わせ
て用いてもよい。

【００２２】酸素電極を用いる場合には、電極表面に酵
素を固定化して、緩衝液中に挿入して一定温度に保持す
る。ここに試料を加えて電流の減少値を測定する。

【００２３】カーボン電極、金電極、白金電極などを用
いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電
極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極
（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／Ａｇ
Ｃｌ電極）とともに、メディエーターを含む緩衝液中に
挿入して一定温度に保持する。作用電極に一定の電圧を
印加し、試料を加えて電流の増加値を測定する。メディ
エーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセ
ン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサルフェートな
どを用いることができる。

【００２４】あるいは同様の酵素電極を本発明の反応条
件のもとで酵素反応の結果生成する過酸化水素を測定す
ることによっても分析に用いることができる。すなわ
ち、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用
い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡ
ｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、本発明の条件下の緩衝液
中に挿入して一定温度に保持する。作用電極に一定の電
圧を印加し、試料を加えて酵素反応の結果生じる過酸化
水素に起因する電流の増加値を測定する。図５に、フル
クトシルアミン酸化酵素と白金電極を組み合わせた酵素
センサーシステムの概略図を示す。

【００２５】さらにカーボン電極、金電極、白金電極な
どを用いてアンペロメトリック系で測定する方法とし
て、固定化電子メディエータを用いる系がある。すなわ
ち、作用電極として酵素およびフェリシアン化カリウ
ム、フェロセン、オスミウム誘導体、フェナジンメトサ
ルフェートなどの電子メディエータを吸着あるいは共有
結合法により高分子マトリックスに固定化したこれらの
電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極
（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）とともに、緩衝液中に挿
入して一定温度に保持する。作用電極に一定の電圧を印
加し、試料を加えて電流の増加値を測定する。

【００２６】いずれの電極を用いる場合にも、標準濃度
のフルクトシルバリン溶液により作製したキャリブレー
ションカーブに従い、試料中のフルクトシルバリン濃度
を求めることができる。ＨｂＡｌｃ計測用センサーシス
テムとして用いる場合は、上述のフルクトシルバリン計
測用センサーシステムに、さらに蛋白質分解酵素（例え
ばプロテアーゼ）を固定化した膜などを組み合わせて、
複合センサーシステムを構築する。このような、複数の
酵素の組み合わせによる連続的反応を用いる複合センサ
ーシステムの構造は、当該技術分野においてよく知られ
ており、例えばＢｉｏｓｅｎｓｏｒｓ−Ｆｕｎｄａｍｅ
ｎｔａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−Ａｎｔ
ｈｏｎｙ Ｐ．Ｆ．Ｔｕｎｅｒ，Ｉｓａｏ Ｋａｒｕｂ
ｅ ａｎｄ ＧｅｒｏｇｅＳ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８７に
記載されている。

【００２７】以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。実施例１ 最少培地（Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ６％，ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．
３ ％，ＮａＣｌ ３％，ＭｇＳＯ_４ ０．０１％，Ｃ
ａＣｌ_２ ０．０１％，Ｄ−グルコース１％）１５０ｍ
ｌに、窒素源として終濃度０．５２％のフルクトシルバ
リンを添加した培地で培養した。この培地を用いて、Ｐ
ｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１を培養し、得られた菌体を
１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）を用いて洗浄す
る。この菌体を酵素Ｚｙｍｏｌｙａｓｅによって消化し
細胞を破砕する。この破砕液を超遠心分離（４０００ｒ
ｐｍ、２０ｍｉｎ）の後、その上清を凍結乾燥し、濃縮
する。この酵素濃縮液を酵素試料として用いる。あるい
はさらに陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製し
た酵素標品を用いることもできる。このようにして得ら
れたフルクトシルアミン酸化酵素（ＦＡＯ）を用いて、
フルクトシルバリンの選択性のｐＨ依存性を以下のよう
に検討した。緩衝溶液としてはｐＨ４．９〜８．２に調
整した０．５ＭのＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝溶液を用い
た。活性測定はフルクトシルアミン類の酸化に基づき発
生する過酸化水素をペルオキシダーゼ〜４−アミノアン
チピリン系で測定した。基質としてフルクトシルバリン
とフルクトシルリジンを用いたときの酵素活性のｐＨ依
存性を図１に示す。本緩衝液中においてはｐＨ７．０以
上ではフルクトシルリジンに対する酵素活性のフルクト
シルバリンに対する酵素活性の比は１．５以下であっ
た。しかしｐＨの低下とともにフルクトシルバリンに対
する反応比が向上し、ｐＨ４．９においてはフルクトシ
ルリジンに対する酵素活性のフルクトシルバリンに対す
る酵素活性の比は５となり、フルクトシルバリンに対し
て選択性が高くなった。実施例２ 実施例１と同様にＰｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１由来Ｆ
ＡＯを用いてＦＡＯの選択性の緩衝溶液濃度の依存性を
検討した。緩衝溶液としてはｐＨ７．０に調整した５ｍ
Ｍ〜５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝溶液を用いた。活
性測定はフルクトシルアミン類の酸化に基づき発生する
過酸化水素をペルオキシダーゼ〜４−アミノアンチピリ
ン系で測定した。基質としてフルクトシルバリンとフル
クトシルリジンを用いたときの酵素活性の緩衝溶液濃度
依存性を図２に示す。本緩衝液中においては５ｍＭ〜１
００ｍＭ付近では、フルクトシルリジンを基質とした時
の酵素活性に対するフルクトシルバリンを基質とした時
の酵素活性の比は１．５以下であった。しかし緩衝溶液
の濃度の増加とともににフルクトシルバリンに対する反
応比が向上し、５００ｍＭにおいてはフルクトシルリジ
ンに対する酵素活性のフルクトシルバリンに対する酵素
活性の比は８．５となり、フルクトシルバリンに対して
選択性が高くなった。実施例３ 実施例１と同様にＰｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１由来Ｆ
ＡＯを用いてＦＡＯの選択性の緩衝溶液中のＮａＣｌ濃
度の依存性を検討した。緩衝溶液としてはｐＨ７．０に
調整した１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝溶液を用い、Ｎ
ａＣｌ濃度は０〜１０００ｍＭの間で検討した。活性測
定はフルクトシルアミン類の酸化に基づき発生する過酸
化水素をペルオキシダーゼ〜４−アミノアンチピリン系
で測定した。基質としてフルクトシルバリンとフルクト
シルリジンを用いたときの酵素活性の緩衝溶液中のＮａ
Ｃｌ濃度依存性を図３に示す。本緩衝液中においてはＮ
ａＣｌ濃度０ｍＭ〜５０ｍＭ付近ではフルクトシルリジ
ンを基質とした時の酵素活性に対するフルクトシルバリ
ンを基質とした時の酵素活性の比１．５以下であった。
しかし緩衝溶液中のＮａＣｌの濃度の増加とともににフ
ルクトシルバリンに対する反応比が向上し、ＮａＣｌ濃
度５００ｍＭにおいてはフルクトシルリジンに対する酵
素活性のフルクトシルバリンに対する酵素活性の比は３
となり、フルクトシルバリンに対して選択性が高くなっ
た。実施例４ 実施例２と同様にＦｕｓａｌｌｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒ
ｕｍ ｆ．ｓｐ．ｆｒａｇａｒｉａｅ（ＩＦＯ ３１１
８０）由来ＦＡＯを用いてＦＡＯの選択性の緩衝溶液濃
度の依存性を検討した。ＩＦＯ３１１８０は最少培地
（Ｎａ_２ＨＰＯ_４６％，ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．３ ％，Ｎ
ａＣｌ ３％，ＭｇＳＯ_４ ０．０１％，ＣａＣｌ_２
０．０１％，Ｄ−グルコース１％）１５０ｍｌに、窒素
源として終濃度０．５２％のフルクトシルリジンを添加
した培地で培養した。えられた菌体を洗浄後、ガラスビ
ーズで破砕した。この破砕液を遠心分離（５０００ｇ、
２０ｍｉｎ）によって調製した上清を１０ｍＭリン酸緩
衝溶液（ｐＨ７．０）で一晩透析の後、凍結乾燥により
濃縮した。このようにして調製した酵素濃縮液を酵素試
料として用いた。緩衝溶液としてはｐＨ７．０に調整し
た５ｍＭ〜５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝溶液を用い
た。活性測定はフルクトシルアミン類の酸化に基づき発
生する過酸化水素をペルオキシダーゼ〜４−アミノアン
チピリン系で測定した。基質としてフルクトシルバリン
とフルクトシルリジンを用いたときの酵素活性の緩衝溶
液濃度依存性を図４に示す。本緩衝液中においては５ｍ
Ｍ〜５０ｍＭ付近ではフルクトシルリジンを基質とした
時の酵素活性に対するフルクトシルバリンを基質とした
時の酵素活性の比は１．５以下であった。しかし緩衝溶
液の濃度の増加とともににフルクトシルバリンに対する
反応比が向上し、５００ｍＭにおいてはフルクトシルリ
ジンに対する酵素活性のフルクトシルバリンに対する酵
素活性の比は８．５となり、フルクトシルバリンに対し
て選択性が高くなった。実施例５ 実施例１と同様にＰｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１由来Ｆ
ＡＯを調製して、同酵素を用いたフルクトシルアミン類
計測用の酵素センサーシステムを構築した。センサーシ
ステムの構成図を図５に示す。同酵素を０．０３Ｕ含む
５０μリットルのリン酸緩衝液をろ紙に含浸させ、これ
を直径３ミリメートルのＢＡＳ社製の白金電極上に装着
し、これを透析膜で覆った。本酵素センサーを５００ｍ
Ｍリン酸緩衝溶液ｐＨ７．０あるいは１０ｍＭリン酸緩
衝溶液ｐＨ７．０に浸漬した。測定は、フルクトシルバ
リンあるいはフルクトシルリジン１ｍＭ添加時の酵素セ
ンサーの信号を２５℃で、印加電位６００ｍＶ ｖｓ
Ａｇ／ＡｇＣｌとしてフルクトシルアミン類の酸化によ
り生じた過酸化水素を測定した。ＦＡＯの選択性の緩衝
溶液濃度の依存性を検討した。緩衝溶液としてはｐＨ
７．０に調整した１０ｍリン酸カリウム緩衝溶液を用い
たときにはフルクトシルリジンを基質とした時の酵素活
性に対するフルクトシルバリンを基質とした時の酵素活
性の比は１．０であった。しかし５００ｍＭにおいては
フルクトシルリジンに対する酵素活性のフルクトシルバ
リンに対する酵素活性の比は４．５となり、フルクトシ
ルバリンに対して選択性が高くなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】は酵素としてＰｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１由
来フルクトシルアミン酸化酵素を用いたときの、フルク
トシルバリンへの酵素反応の選択性のｐＨ依存性

【図２】は酵素としてＰｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１由
来フルクトシルアミン酸化酵素を用いたときの、フルク
トシルバリンへの酵素反応の選択性のリン酸緩衝溶液濃
度依存性

【図３】は酵素としてＰｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１由
来フルクトシルアミン酸化酵素を用いたときの、フルク
トシルバリンへの酵素反応の選択性のＮａＣｌ濃度依存
性

【図４】は酵素としてＦｕｓａｌｌｉｕｍ ＩＦＯ３１
１８０ フルクトシルアミン酸化酵素を用いたときの、
フルクトシルバリンへの酵素反応の選択性ののリン酸緩
衝液濃度依存性

【図５】は酵素としてＰｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１由
来フルクトシルアミン酸化酵素を用いて構築した酵素セ
ンサーシステム構成図

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フルクトシルバリンの測定方法であり、フ
   ルクトシルバリンを以下のａ）〜ｃ）のいずれかの条件
   のもとでフルクトシルアミン酸化酵素を作用させること
   を特徴とするフルクトシルバリンの測定方法。 ａ）反応溶液のｐＨを６以下であること。 ｂ）反応溶液の電解質濃度が２００ｍＭ以上であること ｃ）ａ）からｂ）の組み合わせによる反応条件
2. 【請求項２】糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡｌｃ；
   ＨｂＡｌｃ）の測定方法であり、試料中のＨｂＡｌｃを
   分解して生成させたフルクトシルバリンを請求項１記載
   の方法で定量することを含む方法。
3. 【請求項３】請求項１記載の方法を実施するためフルク
   トシルバリン測定キット。
4. 【請求項４】請求項１記載の方法を実施するための糖化
   ヘモグロビンの測定キット。
5. 【請求項５】ｐＨ６以下で電解質濃度２００ｍＭ以上で
   あり、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．Ｎ１−１由来のフルクトシ
   ルアミン酸化酵素を含むフルクトシルバリン測定キッ
   ト。
6. 【請求項６】請求項１記載の方法を含むフルクトシルバ
   リン測定用酵素センサーシステム。
7. 【請求項７】請求項１記載の方法を含む糖化ヘモグロビ
   ンの測定用酵素センサーシステム。
8. 【請求項８】請求項１から７において酵素がＰｉｃｈｉ
   ａ ｓｐ．Ｎ１−１由来のフルクトシルバリン酸化酵素
   であるもの。