JP4742491B2 - Cell implantation method and cell tissue preparation method - Google Patents
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Description
本発明は細胞着床方法及び細胞組織作製方法に関する。更に詳しくは、本発明は、細胞又は細胞群の培養、形態観察、スクリーニング、同種又は異種の細胞間相互作用（例えばシグナル伝達等の細胞レベルの生体現象）の研究等に好適であり、これらの観察や研究等を in vitro でありながら in vivoに近い状態で行い得る細胞着床方法に関する。この発明は、医薬品開発等におけるハイスループットスクリーニング等にも応用可能である。本発明は、更に、上記のようにして着床させたヒト等の生物細胞（各種の幹細胞を含む）を増殖させて自家利用又は他家利用のための一定の細胞組織を再生させ、これを採取する細胞組織作製方法にも関する。この発明は、いわゆる移植医療のための臓器組織再生等に有効に応用可能である。 The present invention relates to a cell implantation method and a cell tissue preparation method. More specifically, the present invention is suitable for culturing a cell or a group of cells, morphological observation, screening, studying the interaction between the same or different types of cells (for example, cell level biological phenomena such as signal transduction), etc. The present invention relates to a cell implantation method in which observation and research can be performed in a state close to in vivo while being in vitro. The present invention can also be applied to high-throughput screening and the like in drug development. The present invention further regenerates certain cell tissues for self-use or other-use use by proliferating living cells such as humans (including various stem cells) implanted as described above. The present invention also relates to a method for preparing a cell tissue to be collected. The present invention can be effectively applied to organ tissue regeneration for so-called transplantation medicine.
近年、細胞の観察や細胞レベルの生体現象の研究、細胞のスクリーニング等のために細胞を担体上に固定化し、より好ましくは複数種類の細胞を固定化し、更に好ましくはこれらの細胞を特定の微細なパターニングに従って固定化する技術、とりわけ細胞アレイや細胞チップと呼ばれるような選択的細胞パターニングの技術が注目されている。又、移植医療等のための細胞培養技術や幹細胞を利用する細胞組織再生技術も注目されている。 In recent years, cells have been immobilized on a carrier for cell observation, cell-level biological phenomenon research, cell screening, etc., more preferably multiple types of cells have been immobilized, and even more preferably these cells have a specific fineness. Attention has been focused on a technique for immobilization according to such patterning, particularly a technique for selective cell patterning called a cell array or a cell chip. In addition, cell culture technology for transplantation medical treatment and cell tissue regeneration technology using stem cells have attracted attention.
上記の特許文献１、特許文献２に見られるように、基材上の任意の部位に細胞等の微細な対象物をパターニングするに当たり、一般的には、半導体における微細加工技術を応用して、ステンシルやフォトマスクを利用したり、余分な部分をエッチングしたりする場合が多い。このような技術をうまく応用すれば、基材上における選択的細胞パターニングの目的は、ある程度は達成することが可能であると考えられる。 As seen in Patent Document 1 and Patent Document 2 described above, in patterning a fine object such as a cell on an arbitrary part on a base material, generally, by applying a fine processing technique in a semiconductor, In many cases, a stencil or a photomask is used, or excess portions are etched. If such a technique is successfully applied, the purpose of selective cell patterning on the substrate can be achieved to some extent.
しかしながら、これらの技術においては工程が煩雑であり、極めて微細かつ複雑なパターニングを行い難いと言う問題もある。エッチング工程では一般的に強い腐食性の酸等を使用するので、細胞の固定化後にエッチング工程を行うことは、細胞やタンパク質に対する重大な悪影響のために、不可能である。更に、レーザーアブレーションには高価なレーザー照射装置が必要であるし、一般的に半導体微細加工技術を行う装置は同様に高価である。 However, in these techniques, the process is complicated, and there is a problem that it is difficult to perform extremely fine and complicated patterning. Since the etching process generally uses a strong corrosive acid or the like, it is impossible to perform the etching process after immobilization of cells due to a serious adverse effect on cells and proteins. Furthermore, an expensive laser irradiation apparatus is necessary for laser ablation, and an apparatus for performing a semiconductor micromachining technique is generally expensive as well.
そこで本発明は、安価な装置により簡易に実行することができ、しかも固定化対象たる細胞やこれに含まれるタンパク質の性質を損なわない細胞固定化技術、より好ましくは極めて微細なスケールでの選択的細胞パターニング技術を提供することを、解決すべき技術的課題とする。 Therefore, the present invention is a cell immobilization technique that can be easily carried out with an inexpensive apparatus and that does not impair the properties of cells to be immobilized and the proteins contained therein, more preferably selective on a very fine scale. Providing cell patterning technology is a technical problem to be solved.
（第１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、光変形を起こし得る材料であって、表面に配置された微小物体に対して光照射時に固定化能力を示す光固定化材料を少なくとも表層部に用いた着床基材を構成し、（Ａ）該着床基材の表面に、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程と、（Ｂ）光固定化した前記細胞着床要素に対して不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程とを行う、細胞着床方法である。
(Configuration of the first invention)
The structure of the first invention of the present application for solving the above-described problem is a material capable of causing optical deformation, and at least a light-immobilizing material that exhibits immobilization ability at the time of light irradiation on a minute object disposed on the surface is at least a surface layer. (A) Light that immobilizes, on the surface of the implantation substrate, a cell implantation element that exhibits adhesion or binding to unspecified or specific cells by light irradiation. A cell implantation method comprising: an immobilization step; and (B) an implantation step of bringing an unspecified or specific cell or cell group into contact with the light-immobilized cell implantation element.
（第２発明の構成）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明に係る光固定化材料が光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む材料である、細胞着床方法である。
(Configuration of the second invention)
The structure of the second invention of the present application for solving the above problem is a cell implantation method, wherein the photofixation material according to the first invention is a material having a chemical structure capable of causing cis-trans photoisomerization by light irradiation. It is.
（第３発明の構成）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第２発明に係る化学構造がアゾ基を有する色素構造である、細胞着床方法である。
(Configuration of the third invention)
The configuration of the third invention of the present application for solving the above problem is a cell implantation method in which the chemical structure according to the second invention is a dye structure having an azo group.
（第４発明の構成）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかに係る細胞着床要素が、細胞外基質タンパク質、細胞表面に露出した特定の抗原に対して特異的に結合する抗体又はこれを備えた物質、細胞表面に露出した特定の抗体に対して特異的に結合する抗原又はこれを備えた物質、特定の細胞膜レセプタータンパク質に対して特異的に結合するリガンド又はこれを備えた物質、多糖類（糖鎖等を包含する概念である）と結合するタンパク質又はこれを備えた物質、の内の１種以上である、細胞着床方法である。
(Configuration of the fourth invention)
The structure of the fourth invention of the present application for solving the above-described problem is that the cell implantation element according to any one of the first to third inventions is an extracellular matrix protein, a specific antigen exposed on the cell surface. An antibody that specifically binds or a substance provided with the same, an antigen that specifically binds to a specific antibody exposed on the cell surface or a substance provided with the same, or a specific cell membrane receptor protein It is a cell implantation method that is at least one of a ligand or a substance provided with the same, a protein that binds to a polysaccharide (concept including a sugar chain) or a substance provided with the same.
（第５発明の構成）
上記課題を解決するための本願第５発明の構成は、前記第１発明〜第４発明のいずれかに係る光固定化工程において、細胞着床要素として特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す１種類又は２種類以上の細胞着床要素を固定化することにより、前記着床工程において細胞着床要素に対して接触させる複数種類の細胞又は細胞群の内から１種類又は２種類以上の特定された細胞又は細胞群を選択的に着床させる、細胞着床方法である。
(Structure of the fifth invention)
The structure of the fifth invention of the present application for solving the above-mentioned problems shows adhesiveness or binding property to a specific cell as a cell implantation element in the light immobilization step according to any of the first to fourth inventions. By immobilizing one type or two or more types of cell implantation elements, one type or two or more types are specified from a plurality of types of cells or cell groups to be brought into contact with the cell implantation elements in the implantation step. This is a cell implantation method for selectively implanting a cell or a group of cells.
（第６発明の構成）
上記課題を解決するための本願第６発明の構成は、前記第１発明〜第５発明のいずれかに係る光固定化工程における細胞着床要素の光固定化を特定のパターニングに従って行うことにより、細胞又は細胞群を当該パターニングに従って着床させる、細胞着床方法である。
(Structure of the sixth invention)
The configuration of the sixth invention of the present application for solving the above-described problem is that by performing light immobilization of the cell implantation element in the light immobilization step according to any one of the first invention to the fifth invention according to a specific patterning, This is a cell implantation method in which cells or groups of cells are implanted according to the patterning.
（第７発明の構成）
上記課題を解決するための本願第７発明の構成は、前記第６発明に係る細胞着床要素の光固定化のパターニングを細胞レベルのサイズで区画して設定する、細胞着床方法である。
(Structure of the seventh invention)
The configuration of the seventh invention of the present application for solving the above-described problem is a cell implantation method in which patterning for light immobilization of the cell implantation element according to the sixth invention is set by partitioning at a cell level size.
（第８発明の構成）
上記課題を解決するための本願第８発明の構成は、前記第６発明又は第７発明に係る光固定化工程と着床工程とを２サイクル以上繰り返して行い、かつ、各サイクルにおいて、光固定化工程における細胞着床要素の光固定化のパターニングの設定と、着床工程で用いる細胞又は細胞群の種類とを互いに異ならせることにより、２種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させる、細胞着床方法である。
(Configuration of the eighth invention)
The configuration of the eighth invention of the present application for solving the above-described problem is that the light immobilization step and the landing step according to the sixth invention or the seventh invention are repeated two or more cycles, and the light fixation is performed in each cycle. By setting the patterning for light immobilization of cell implantation elements in the conversion step and the types of cells or cell groups used in the implantation step, two or more types of cells or cell groups are attached according to different patterns. This is a cell implantation method for making a bed.
（第９発明の構成）
上記課題を解決するための本願第９発明の構成は、前記第６発明又は第７発明に係る光固定化工程を２サイクル以上繰り返して行い、かつ、各サイクルの光固定化工程において互いに異なる光固定化のパターニングに従って互いに異なる特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す２種類以上の細胞着床要素を順次固定化した後、着床工程においてはそれぞれ前記細胞着床要素に特異的に接着又は結合する細胞又は細胞群を着床させることにより、２種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させる、細胞着床方法である。
(Structure of the ninth invention)
The structure of the ninth invention of the present application for solving the above-described problem is that the light immobilization process according to the sixth invention or the seventh invention is repeated two or more cycles, and different light is used in the light immobilization process of each cycle. After sequentially immobilizing two or more types of cell implantation elements exhibiting adhesiveness or binding properties to different specific cells according to the immobilization patterning, in the implantation step, each cell adheres specifically to the cell implantation element. This is a cell implantation method in which two or more types of cells or cell groups are implanted according to different patterning by implanting cells or cell groups to be combined.
（第１０発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１０発明の構成は、前記第６発明又は第７発明に係る光固定化工程と着床工程とを２サイクル以上繰り返して行い、かつ、各サイクルの光固定化工程において互いに異なる光固定化のパターニングに従って互いに異なる特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す２種類以上の細胞着床要素をそれぞれ固定化すると共に、各サイクルの着床工程においてはそれぞれ前記細胞着床要素に特異的に接着又は結合する細胞又は細胞群を着床させることにより、２種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させる、細胞着床方法である。
(Configuration of the tenth invention)
The structure of the tenth invention of the present application for solving the above-described problem is that the light immobilization process and the landing process according to the sixth invention or the seventh invention are repeated two or more cycles, and the light immobilization of each cycle is performed. In the process, two or more kinds of cell implantation elements exhibiting adhesion or binding properties to different specific cells are respectively immobilized according to different light immobilization patterns, and each cell implantation is performed in the implantation process of each cycle. It is a cell implantation method in which two or more types of cells or cell groups are implanted according to different patterns by implanting cells or cell groups that specifically adhere to or bind to a floor element.
（第１１発明の構成）
上記課題を解決するための本願第１１発明の構成は、光変形を起こし得る材料であって、表面に配置された微小物体に対して光照射時に固定化能力を示す光固定化材料を少なくとも表層部に用いた着床基材を構成し、
（Ａ）該着床基材の表面に、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程と、
（Ｂ）光固定化した前記細胞着床要素に対して一定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程と、
（Ｃ）着床させた前記細胞又は細胞群を増殖させ、あるいは増殖及び分化させることにより、一定の細胞シートあるいは細胞組織を作製し、これを採取する回収工程とを行う、細胞組織作製方法である。
(Structure of 11th invention)
The structure of the eleventh invention of the present application for solving the above-described problem is a material capable of causing optical deformation, and at least a light-immobilizing material that exhibits immobilization ability upon light irradiation with respect to a minute object disposed on the surface is at least a surface layer. The flooring base material used for the
(A) a light immobilization step of immobilizing a cell implantation element exhibiting adhesion or binding to unspecified or specific cells on the surface of the implantation substrate by light irradiation;
(B) an implantation step in which certain cells or groups of cells are brought into contact with the light-immobilized cell implantation element, and implantation is performed.
(C) A cell tissue preparation method in which a fixed cell sheet or cell tissue is prepared by growing or proliferating and differentiating the implanted cells or cell groups, and a collecting step of collecting the cell sheet or cell tissue. is there.
（第１発明の効果）
第１発明の細胞着床方法においては、着床基材の少なくとも表層部に光固定化材料を用いて細胞着床要素を光固定化し、この細胞着床要素に対して不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる。従って、光固定化工程で用いる光照射装置以外の特段の装置を要しないし、光照射以外の特別な操作を要しないので、安価な装置により簡易に実行することができる。しかも、プロセスとしては光固定化工程と細胞又は細胞群の着床工程が分離しており、かつ光固定化工程では光照射と言うマイルドな手段を用いるので、着床対象たる細胞やこれに含まれるタンパク質の性質を損なう恐れがない。
(Effect of the first invention)
In the cell implantation method of the first invention, the cell implantation element is light-immobilized using a light-immobilizing material on at least the surface layer portion of the implantation substrate, and an unspecified or specific cell is specified for the cell implantation element. Alternatively, the cells are brought into contact with each other for implantation. Therefore, no special device other than the light irradiation device used in the light fixing step is required, and no special operation other than the light irradiation is required, so that it can be easily executed by an inexpensive device. Moreover, as the process, the light immobilization step and the cell or cell group implantation step are separated, and the light immobilization step uses a mild means called light irradiation. There is no risk of damaging the properties of the protein.
更に、第１発明のような光固定化は、極めて微細な細胞着床要素の十分な固定化に対しても有効であることが確認されている。又、細胞着床要素の固定化におけるパターニングは、フォトマスク等の簡易な手段により容易に行うことができる。更に、特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を選択的にあるいは組み合わせて使用することもできる。従って、極めて微細なスケールでの選択的細胞パターニングを行うことも容易である。 Furthermore, it has been confirmed that the light immobilization as in the first invention is effective for sufficient immobilization of extremely fine cell implantation elements. Further, patterning in immobilizing the cell implantation element can be easily performed by a simple means such as a photomask. Furthermore, cell implantation elements exhibiting adhesion or binding properties to specific cells can be used selectively or in combination. Therefore, it is easy to perform selective cell patterning on a very fine scale.
第１発明において、着床工程で着床させる細胞又は細胞群としては、同一種類のものでも良いし、不特定又は特定の２種類以上の細胞又は細胞群を着床させても良い。そしてこれらの生存状態にある細胞又は細胞群を至近距離に着床させることにより、一般的な細胞間の相互作用や、特定細胞間の特殊な相互作用（例えば、神経細胞間の神経情報伝達、ガン細胞が隣接する健常細胞に及ぼす作用）等をin vivoに近い状態で研究することができる。 In the first invention, the cells or cell groups to be implanted in the implantation step may be the same type, or two or more types of specific cells or cell groups may be implanted. And by implanting these living cells or cell groups at a close distance, general cell-to-cell interactions and special interactions between specific cells (for example, nerve information transmission between neurons, The effect of cancer cells on adjacent healthy cells can be studied in a state close to in vivo.
後述の第７発明のように、光固定化工程と着床工程とを同一の前記着床基材に対して２サイクル以上繰り返して行い、結果的に互いに異なる２種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させることができるが、この方法による場合、第２サイクル目以降の光固定化工程においては、既に一部の細胞又は細胞群が着床基材に固定化されている。しかし、前記のように、光固定化工程では光照射と言うマイルドな手段を用いるので、既に固定化されている細胞又は細胞群、あるいはこれらに含まれているタンパク質の性質を損なう恐れがない。 As in the seventh invention described later, the light immobilization step and the landing step are repeated for two or more cycles on the same landing base material, and as a result, two or more types of cells or cell groups different from each other are obtained. Although implantation can be performed according to different patterning, in this method, some cells or cell groups are already immobilized on the implantation substrate in the light immobilization step after the second cycle. However, as described above, since a mild means called light irradiation is used in the light immobilization step, there is no possibility of damaging the properties of cells or cell groups already immobilized, or proteins contained therein.
（第２発明の効果）
光固定化材料としては、基本的には、光変形を起こし得る材料であれば良いが、第２発明のように、光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む材料を用いることが、より好ましい。
(Effect of the second invention)
Basically, any material capable of causing photodeformation may be used as the photofixation material. However, as in the second invention, a material having a chemical structure capable of causing cis-trans photoisomerization by light irradiation is used. It is more preferable.
この材料は、光照射を受けた時にシス−トランス光異性化によってある程度の可塑化を起こし、光固定化の対象である細胞着床要素の形状に依存した変形（典型的には、鋳物と鋳型の関係のように、細胞着床要素の形状に対応した凹状の変形）を起こし、細胞着床要素が仮固定化状態となる。そして光照射の終了後に、光固定化材料が固化状態に戻ることにより、前記の変形した形状による支持効果や、接触面積の増加によるファンデルワールス力の増大等により、細胞着床要素を十分に固定化することができる。 This material undergoes some plasticization by cis-trans photoisomerization when irradiated with light, and deforms (typically castings and molds) depending on the shape of the cell implantation element that is the subject of light immobilization. As shown in the relationship, a concave deformation corresponding to the shape of the cell implantation element) occurs, and the cell implantation element is temporarily fixed. After the light irradiation, the light-immobilized material returns to the solidified state, so that the cell implantation element can be sufficiently removed due to the support effect due to the deformed shape and the increase in van der Waals force due to the increase in the contact area. Can be immobilized.
以上の固定化メカニズムからして、細胞着床要素を光固定化し、あるいは更にこの細胞着床要素に更に細胞を接着又は結合させた状態にある光固定化材料に対して、再度光照射を行って光固定化材料を可塑化状態に保ちながら、ある程度の機械的外力（水流、振動等）を付加すると、細胞着床要素を着床基材から脱離させることも可能である。この際にも細胞着床要素に接着又は結合した細胞が損なわれる恐れはない。 Based on the above-described immobilization mechanism, the cell implantation element is light-immobilized, or light irradiation is performed again on the light-immobilization material in a state where cells are further adhered or bonded to the cell implantation element. By applying a certain amount of mechanical external force (water flow, vibration, etc.) while keeping the light immobilization material in a plasticized state, the cell implantation element can be detached from the implantation substrate. At this time, there is no possibility that cells adhered or bound to the cell implantation element are damaged.
（第３発明の効果）
光固定化材料としては、第２発明に言う化学構造としてアゾ基を有する色素構造を含む材料が、細胞着床要素に対する固定化力が特に大きく、好ましい。
(Effect of the third invention)
As the light-immobilizing material, a material containing a dye structure having an azo group as the chemical structure described in the second invention is preferable because it has a particularly large immobilizing force for the cell implantation element.
（第４発明の効果）
細胞着床要素としては、最も一般的なものが、コラーゲンＩ、コラーゲンIV、フィブロネクチン、ポリリシン等のいわゆる細胞外基質タンパク質又はこれを備えた物質である。これらのタンパク質の細胞一般に対する接着作用は良く知られている。
(Effect of the fourth invention)
The most common cell implantation elements are so-called extracellular matrix proteins such as collagen I, collagen IV, fibronectin, and polylysine, or substances having the same. The adhesion of these proteins to cells in general is well known.
又、細胞膜表面に露出したタンパク質に着目した場合、このタンパク質と結合する性質を持つタンパク質等や、これを備えた物質も、細胞着床要素として好適に使用できる。例えば、細胞膜表面に露出した抗体／抗原に対して特異的に結合する抗原／抗体、細胞膜レセプタータンパク質に対するリガンド等や、これらを備えた物質である。これらの物質は、特定の細胞膜タンパク質と特異的に結合するので、多種のあるいは多様な状態にある細胞群の中から特定の種類あるいは特定の状態にある細胞を選択的に着床させたい場合等に、特に有効に利用することができる。 Further, when attention is paid to a protein exposed on the cell membrane surface, a protein having a property of binding to the protein or a substance provided with the protein can be suitably used as a cell implantation element. For example, an antigen / antibody that specifically binds to an antibody / antigen exposed on the cell membrane surface, a ligand for a cell membrane receptor protein, or a substance provided with these. Since these substances bind specifically to specific cell membrane proteins, it is necessary to selectively implant cells in a specific type or a specific state from a group of cells in various or various states. In particular, it can be used effectively.
着目する細胞膜タンパク質としては、細胞膜表面に豊富に存在するような種類のタンパク質が特に好ましい。なぜなら、個体細胞における多数の細胞膜タンパク質を着床基材の細胞着床要素に多点で結合させることにより、細胞に対する十分な着床強度を持たせることができるからである。 The cell membrane protein of interest is particularly preferably a type of protein that is abundant on the cell membrane surface. This is because a sufficient implantation strength for cells can be obtained by binding a large number of cell membrane proteins in individual cells to the cell implantation elements of the implantation substrate at multiple points.
（第５発明の効果）
第５発明の細胞着床方法においては、不特定の多数種類の細胞又は細胞群を含む試料液から特定の１種類又は２種類以上の細胞又は細胞群を選択的に着床させることを以て、これらのスクリーニングと、更に解析等を行うことができる。
(Effect of the fifth invention)
In the cell implantation method according to the fifth aspect of the present invention, the specific one type or two or more types of cells or cell groups are selectively implanted from a sample solution containing many unspecified types of cells or cell groups. Screening and further analysis.
（第６発明の効果）
第６発明のように、細胞又は細胞群を一定のパターニングに従って着床させることにより、一般的に細胞アレイや細胞チップと呼ばれる、細胞又は細胞群を決まった位置に集積した検査ツールを構成することができ、例えば医薬品開発におけるいわゆるハイスループットスクリーニング等への有効利用を期待することができる。
(Effect of the sixth invention)
As in the sixth aspect of the invention, by constructing a cell or a group of cells according to a certain patterning, a test tool that is generally called a cell array or a cell chip and that accumulates cells or a group of cells at a fixed position is constructed. For example, it can be expected to be effectively used for so-called high-throughput screening in drug development.
又、前記した第５発明の方法で２種類以上の細胞又は細胞群を着床させる場合には、細胞着床要素の固定位置のパターニング等によって２種類以上の細胞又は細胞群の着床位置を極めて近接した相互位置に指定することにより、これらの細胞間の相互作用を解析することもできる。 Further, when two or more types of cells or cell groups are implanted by the method of the fifth invention, the implantation positions of two or more types of cells or cell groups are determined by patterning the fixed positions of the cell implantation elements. The interaction between these cells can also be analyzed by designating very close mutual positions.
（第７発明の効果）
第７発明のように、細胞着床要素の光固定化のパターニングを細胞レベルのサイズで区画して設定することにより、細胞の解析等や細胞間相互作用の解析等を極めて精密に行うことができる。
(Effect of the seventh invention)
As in the seventh aspect of the invention, by patterning the light immobilization of the cell implantation element by setting it at a cell level size, it is possible to carry out analysis of cells, analysis of cell-to-cell interactions, etc. very precisely. it can.
細胞着床要素を細胞レベルのサイズで区画してパターニングすることについては、第１に、細胞着床要素が細胞外基質タンパク質、抗体、抗原、細胞膜レプタータンパク質に対するリガンド等の非常に微細な物質である点、第２に、光固定化によればこのような微細な物質を十分に固定化できる点、第３に、後述するフォトマスクの利用やレーザートラッピング法の利用等により細胞レベルのサイズでの光固定化のパターニングが別段に困難ではない点から、細胞又は細胞群を単細胞レベルのサイズで区画してパターニングすることは十分に可能である。 Regarding the patterning by dividing the cell implantation element at a cell level size, first, the cell implantation element is a very fine substance such as an extracellular matrix protein, an antibody, an antigen, a ligand for a cell membrane leptor protein, etc. Secondly, according to light immobilization, such a fine substance can be sufficiently immobilized, and thirdly, a cell-level size can be obtained by using a photomask or a laser trapping method described later. From the point that patterning of light immobilization in is not particularly difficult, it is sufficiently possible to partition and pattern a cell or a group of cells at a single cell level size.
（第８発明の効果）
第８発明によって、同一の着床基材上で２種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させると言う選択的細胞パターニングの第１の技法が提供される。
(Effect of the eighth invention)
According to the eighth invention, there is provided a first technique of selective cell patterning in which two or more types of cells or groups of cells are implanted according to different patterning on the same implantation substrate.
第８発明の細胞又は細胞群の着床パターニングを、第６発明のように２種類以上の細胞又は細胞群が極めて近接した相互位置に着床するように設計して行うこと、又は第７発明のように細胞レベルのサイズで区画して行うことは、もちろん可能である。 The implantation patterning of the cells or cell groups of the eighth invention is performed by designing so that two or more types of cells or cell groups are implanted at extremely close positions as in the sixth invention, or the seventh invention Of course, it is possible to partition the cells at the cell size as shown in FIG.
（第９発明の効果）
第９発明によって、同一の着床基材上で２種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させると言う選択的細胞パターニングの第２の技法が提供される。
(Effect of the ninth invention)
According to the ninth invention, there is provided a second technique of selective cell patterning in which two or more types of cells or groups of cells are implanted according to different patterning on the same implantation substrate.
第９発明の細胞又は細胞群の着床パターニングを、第６発明のように２種類以上の細胞又は細胞群が極めて近接した相互位置に着床するように設計して行うこと、又は第７発明のように細胞レベルのサイズで区画して行うことは、もちろん可能である。 The implantation patterning of the cell or cell group of the ninth invention is performed by designing so that two or more types of cells or cell groups are implanted at extremely close positions as in the sixth invention, or the seventh invention Of course, it is possible to partition the cells at the cell size as shown in FIG.
更に第９発明による細胞又は細胞群の着床工程において、第５発明のように、不特定の多数種類の細胞又は細胞群を含む試料液から特定の２種類以上の細胞又は細胞群を選択的に着床させることも、もちろん可能である。 Further, in the implantation step of cells or cell groups according to the ninth invention, as in the fifth invention, two or more specific cells or cell groups are selectively selected from a sample solution containing a large number of unspecified cells or cell groups. Of course, it is also possible to make it landed.
（第１０発明の効果）
第１０発明によって、同一の着床基材上で２種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させると言う選択的細胞パターニングの第３の技法が提供される。この第３の技法によれば、とりわけ高い精度で選択的細胞パターニングを行うことができる。
(Effect of the tenth invention)
According to the tenth invention, a third technique of selective cell patterning is provided, in which two or more types of cells or cell groups are implanted according to different patterning on the same implantation substrate. According to this third technique, selective cell patterning can be performed with particularly high accuracy.
第１０発明の細胞又は細胞群の着床パターニングを、第６発明のように２種類以上の細胞又は細胞群が極めて近接した相互位置に着床するように設計して行うこと、又は第７発明のように細胞レベルのサイズで区画して行うことは、もちろん可能である。 The implantation patterning of the cells or cell groups of the tenth invention is performed by designing so that two or more types of cells or cell groups are implanted at extremely close positions as in the sixth invention, or the seventh invention Of course, it is possible to partition the cells at the cell size as shown in FIG.
更に第１０発明による細胞又は細胞群の着床工程において、第５発明のように、不特定の多数種類の細胞又は細胞群を含む試料液から特定の２種類以上の細胞又は細胞群を選択的に着床させることも、もちろん可能である。 Further, in the implantation step of cells or cell groups according to the tenth invention, as in the fifth invention, two or more specific cells or cell groups are selectively selected from a sample solution containing a large number of unspecified cells or cell groups. Of course, it is also possible to make it landed.
（第１１発明の効果）
第１１発明においては、細胞がパターニングされたり多種の細胞が着床したりすることにより、１種又は多種の細胞が多層又は多重に積層又は集積された細胞シートや細胞組織を作製することができる。細胞が積層又は集積するための初期の段階で、必要な細胞種（例えば、幹細胞）とそのパターニングとの選択により、生物体内の組織に近い細胞塊を作製することもできる。
(Effect of the 11th invention)
In the eleventh invention, a cell sheet or a cell tissue in which one kind or many kinds of cells are laminated or accumulated in multiple layers or multiple layers can be produced by patterning cells or implanting various cells. . A cell mass close to a tissue in an organism can be produced by selecting a necessary cell type (for example, stem cell) and its patterning at an initial stage for stacking or accumulating cells.
従って、第１１発明の細胞組織作製方法によって、いわゆる移植医療のための細胞シート（ヒト等の表皮細胞シートや角膜細胞シート等）や再生された臓器組織（ヒト等の各種幹細胞の増殖及び分化に基づく膵臓ランゲルハンス島組織や腎臓糸球体組織等）等を in vitro で取得することができる。 Therefore, according to the cell tissue preparation method of the eleventh invention, so-called cell sheets for transplantation medicine (such as human epidermis cell sheets and corneal cell sheets) and regenerated organ tissues (human and other stem cells proliferate and differentiate). Pancreatic islet tissue, kidney glomerular tissue, etc.) can be obtained in vitro.
次に、本願の第１発明〜第１１発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。以下において、単に「本発明」と言う時は、本願の各発明を一括して指している。 Next, modes for carrying out the first to eleventh inventions of the present application will be described including the best mode. In the following, the term “present invention” refers to each invention of the present application collectively.
〔細胞着床方法〕
本発明に係る細胞着床方法においては、まず光固定化材料を少なくとも表層部に用いた着床基材を構成し、次に該着床基材の表面に細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程を行い、更に光固定化したこの細胞着床要素に対して不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程を行う。
[Cell implantation method]
In the cell implantation method according to the present invention, an implantation substrate using at least a surface immobilization material is first configured, and then a cell implantation element is fixed to the surface of the implantation substrate by light irradiation. Then, an immobilization step is performed, and an unspecified or specific cell or cell group is brought into contact with the cell-immobilized cell-immobilized element for implantation.
単一の着床基材に対する光固定化工程と着床工程との実施回数は限定されず、例えば、光固定化工程と着床工程を一回ずつ行ったり、後述するように、単一の着床基材に対して光固定化工程と着床工程とを２サイクル以上繰り返して行ったり、光固定化工程を２サイクル以上繰り返して行った後に一回の着床工程を行ったりすることができる。 The number of executions of the light immobilization step and the landing step for a single landing base material is not limited. For example, the light immobilization step and the landing step are performed once or as described later, The light immobilization process and the landing process may be repeated for two or more cycles on the flooring base material, or the light immobilization process may be repeated for two cycles or more and then performed once. it can.
細胞着床方法の実施目的あるいは実施形態は限定されない。例えば、ヒト又はその他の動植物の各種の細胞を単に培養・保管する目的であっても良く、各種の分化細胞や幹細胞等を増殖又は組織再生等の目的のために培養する目的であっても良い。 The implementation purpose or embodiment of the cell implantation method is not limited. For example, it may be for the purpose of simply culturing and storing various cells of humans or other animals and plants, and may be for the purpose of culturing various differentiated cells, stem cells, etc. for the purpose of proliferation or tissue regeneration. .
あるいは観察や研究のために細胞又は細胞群を固定化する目的であっても良い。この目的には、細胞個体の観察や研究の他、極めて近接した位置に固定化された同種又は異種の細胞間の相互作用の研究等も含まれる。「細胞間の相互作用」として、遺伝子の発現制御に関与する細胞間のシグナル伝達、神経細胞間の神経情報伝達、ガン細胞が健常細胞に及ぼす作用、等を例示できる。又、各種の手段による有用細胞のスクリーニングのために細胞又は細胞群を固定化する場合もあり得る。 Alternatively, the purpose may be to immobilize cells or cell groups for observation or research. This purpose includes not only the observation and research of individual cells but also the study of the interaction between the same or different cells immobilized at very close positions. Examples of the “cell-cell interaction” include signal transmission between cells involved in gene expression control, nerve information transmission between nerve cells, action of cancer cells on healthy cells, and the like. In addition, a cell or a group of cells may be immobilized for screening useful cells by various means.
又、一定の実用目的のために細胞又は細胞群を担体又はチップとしての着床基材に固定化する場合がある。例えば、整列した細胞の各々に薬物を作用させ、細胞の形態変化等の反応から有用な薬物のスクリーニングを行うことができる。 In some cases, a cell or a group of cells is immobilized on an implantation base material as a carrier or a chip for a certain practical purpose. For example, a drug is allowed to act on each of the aligned cells, and a useful drug can be screened based on a reaction such as cell shape change.
〔着床基材〕
着床基材は、細胞着床要素を光固定化するためのベース材であって、後述する光固定化材料からなり、あるいは少なくとも表層部に光固定化材料を用いたものである限りにおいて、その形態、材質、用途等を限定されない。例えば、比較的小さなチップの形態、カラム等の充填するための粒体等の形態、いわゆる細胞培養床の形態、簡便なアッセイ等に用いる小サイズの試験紙等の形態、顕微鏡観察等に用いられるスライドガラスの如き形態、等が挙げられる。
[Fixing substrate]
The implantation substrate is a base material for light-immobilizing the cell implantation element, and is composed of a light-immobilization material described later, or at least as long as the light-immobilization material is used for the surface layer portion, The form, material, use, etc. are not limited. For example, it is used in the form of relatively small chips, in the form of granules for filling columns, etc., in the form of so-called cell culture beds, in the form of small test papers used for simple assays, etc., for microscopic observation, etc. Examples thereof include a slide glass.
〔光固定化材料）
着床基材の少なくとも表層を構成する光固定化材料とは、光変形（光照射によって誘起される変形）を起こし得る材料であって、表面に配置された微小物体に対して光照射時に固定化能力を示す材料である。光固定化材料の好ましい例示として、光照射によってアブレーション、フォトクロミズム、分子の光誘起配向等を起こす成分（光反応性成分）を材料中に含み、結果的に材料の体積、密度、自由体積等が変化して光変形が誘起されるような誘起又は無機の材料を挙げることができる。
[Light immobilization material]
The light-fixing material that constitutes at least the surface layer of the flooring base material is a material that can undergo light deformation (deformation induced by light irradiation), and is fixed to a micro object placed on the surface during light irradiation. It is a material that shows the ability to convert. As a preferable example of the light-fixing material, a component (photoreactive component) that causes ablation, photochromism, photo-induced orientation of molecules, etc. by light irradiation is included in the material. As a result, the volume, density, free volume, etc. of the material Examples thereof include an induced or inorganic material that changes and induces optical deformation.
光反応性成分の種類は限定されないが、材料の光変形を伴う異方的光反応を起こし得る成分である光異性化成分や光重合性成分を、好ましく例示することができる。細胞着床要素が、化学反応等によって損なわれ易い活性の維持を必要とするものである場合（例えば抗体である場合）には、光反応性成分として光異性化成分が特に好ましい。光異性化成分としては、光照射によりシス−トランス光異性化を起こし得る化学構造を含む成分、特に好ましくはアゾ基（−Ｎ＝Ｎ−）を有する色素構造（例えば、アゾベンゼンやその誘導体の化学構造）を含む成分を挙げることができる。 Although the kind of photoreactive component is not limited, The photoisomerization component and photopolymerizable component which are components which can raise | generate anisotropic photoreaction accompanying the photodeformation of material can be illustrated preferably. A photoisomerization component is particularly preferred as the photoreactive component when the cell implantation element requires maintenance of activity that is easily impaired by a chemical reaction or the like (for example, when it is an antibody). As the photoisomerization component, a component having a chemical structure capable of causing cis-trans photoisomerization by light irradiation, particularly preferably a dye structure having an azo group (—N═N—) (for example, chemistry of azobenzene or a derivative thereof) The component containing a structure) can be mentioned.
光固定化材料のマトリクス中において、光反応性成分は単に分散していても良いし、マトリクスの構成分子と化学結合等の結合をしていても良いが、光反応性成分の均一な分布密度を制御し易い点や、材料の光固定化機能の耐熱性や経時的安定性等の見地からは、後者がより好ましい。マトリクス材料としては、有機材料、特に有機高分子材料が好ましいが、ガラス等の無機材料を用いることも可能である。 In the matrix of the photo-fixing material, the photoreactive component may be simply dispersed or may be bonded to the constituent molecules of the matrix, such as a chemical bond, but the uniform distribution density of the photoreactive component The latter is more preferable from the standpoints of easy control, heat resistance of the light fixing function of the material, stability over time, and the like. As the matrix material, an organic material, particularly an organic polymer material is preferable, but an inorganic material such as glass can also be used.
上記高分子材料の種類は限定されないが、高分子の繰返し単位の中にウレタン基，ウレア基，又はアミド基を含んだものが、更には高分子の主鎖中にフェニレン基のような環構造を備えたものが、耐熱性の点では好ましい。高分子材料は必要な形状に成形可能である限りにおいて分子量や重合度を問わず、重合形態も直鎖状，分岐状，はしご状，星形等の任意の形態で良く、又、ホモポリマーでも共重合体であっても良い。光変形の経時的な安定性（細胞着床要素に対する経時的な固定力の維持）のためには、高分子材料のガラス転移温度が例えば１００°Ｃ以上と言った高いものの方が好ましいが、ガラス転移温度が室温程度やそれ以下のものでも使用可能である。 The type of the polymer material is not limited, but the polymer repeating unit containing a urethane group, urea group, or amide group, and a ring structure such as a phenylene group in the polymer main chain It is preferable in terms of heat resistance. As long as the polymer material can be molded into the required shape, the polymerization form may be any form such as linear, branched, ladder or star shape, regardless of molecular weight or degree of polymerization. A copolymer may also be used. For the stability over time of light deformation (maintenance of fixing force with respect to the cell implantation element), it is preferable that the glass transition temperature of the polymer material is as high as, for example, 100 ° C or higher. A glass transition temperature of about room temperature or lower can also be used.
以上の点から、光反応性成分を含む高分子材料として特に好ましいものの２，３の具体例として、実施例で述べるものの他、次の「化１」〜「化４」に示すものが挙げられる。これらの例において、−Ｘはニトロ基，シアノ基，トリフルオロメチル基，アルデヒド基又はカルボキシル基を、−Ｙ−は−Ｎ＝Ｎ−，−ＣＨ＝Ｎ−又は−ＣＨ＝ＣＨ−を、−Ｒ−はフェニレン基，オリゴメチレン基，ポリメチレン基又はシクロヘキサン基を、それぞれ示す。 In view of the above points, a few specific examples of the polymer material containing the photoreactive component include those shown in the following “Chemical Formula 1” to “Chemical Formula 4” in addition to those described in the Examples. . In these examples, -X represents a nitro group, a cyano group, a trifluoromethyl group, an aldehyde group or a carboxyl group, -Y- represents -N = N-, -CH = N- or -CH = CH-, R- represents a phenylene group, an oligomethylene group, a polymethylene group or a cyclohexane group, respectively.
光固定化工程においては、前記した着床基材の表面に不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を配置し、これを光照射によって着床基材の表面に固定化する。
In the light immobilization step, a cell implantation element exhibiting adhesion or binding to unspecified or specific cells is arranged on the surface of the above-described implantation substrate, and this is applied to the surface of the implantation substrate by light irradiation. Immobilize.
着床基材の表面に細胞着床要素を配置する方法は任意である。例えば、細胞着床要素を静電気力によって着床基材の表面に付着させても良い。しかし、細胞着床要素がタンパク質等であることを考慮した場合、細胞着床要素を水等の液状媒体中に含有させた状態で着床基材の表面に接触させることが好ましい。液状媒体は適正なｐＨやイオン強度等を備えた緩衝液とすることが特に好ましい。そして着床基材の表面をこのような液状媒体中に浸漬させたり、着床基材の表面に少量の液状媒体を接触させた状態において、光照射を行うことができる。 The method for arranging the cell implantation element on the surface of the implantation substrate is arbitrary. For example, the cell implantation element may be attached to the surface of the implantation substrate by electrostatic force. However, considering that the cell implantation element is a protein or the like, it is preferable that the cell implantation element is brought into contact with the surface of the implantation substrate in a state where the cell implantation element is contained in a liquid medium such as water. The liquid medium is particularly preferably a buffer solution having an appropriate pH and ionic strength. Light irradiation can be performed in a state where the surface of the landing base material is immersed in such a liquid medium or a small amount of the liquid medium is brought into contact with the surface of the landing base material.
〔細胞着床要素〕
本発明に係る細胞着床要素とは、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す物質を言う。以下の各種の細胞着床要素の内、特定の条件を満たす細胞又は細胞群に対して特異的に接着性又は結合性を示すものが、とりわけ利用価値が大きい。
[Cell implantation element]
The cell implantation element according to the present invention refers to a substance exhibiting adhesion or binding to unspecified or specific cells. Of the following various types of cell implantation elements, those that exhibit specific adhesion or binding properties to cells or cell groups that satisfy specific conditions are particularly valuable.
細胞着床要素の第１のカテゴリーは、細胞外基質タンパク質又はこれを備えた物質である。細胞外基質タンパク質としてはコラーゲンＩ、コラーゲンIV、フィブロネクチン、ポリリシン等を例示することができる。又、細胞外基質タンパク質を備えた物質としては、例えば、細胞外基質タンパク質を化学結合等の手段で結合させた有機材料又は無機材料の微小球等を例示することができる。この場合、実際には微小球が着床基材に光固定化される。 The first category of cell implantation elements are extracellular matrix proteins or materials with them. Examples of extracellular matrix proteins include collagen I, collagen IV, fibronectin, polylysine and the like. Moreover, as a substance provided with extracellular matrix protein, the microsphere etc. of the organic material or inorganic material which couple | bonded extracellular matrix protein by means, such as a chemical bond, can be illustrated, for example. In this case, actually, the microsphere is light-immobilized on the landing base material.
細胞着床要素の第２のカテゴリーは、細胞表面に露出した特定の膜タンパク質に対して結合性を示す抗原、抗体、細胞膜レセプタータンパク質のリガンド、等である。あるいは、これらの一種を備えた物質、例えば、これらの一種を化学結合等の手段で結合させた有機材料又は無機材料の微小球も用いることができる。 細胞着床要素の第３のカテゴリーは、多糖類（糖鎖等を包含する概念である）と結合するタンパク質である。あるいは、これらの一種を備えた物質、例えば、これらの一種を化学結合等の手段で結合させた有機材料又は無機材料の微小球等である。 The second category of cell implantation elements are antigens, antibodies, ligands for cell membrane receptor proteins, etc. that bind to specific membrane proteins exposed on the cell surface. Alternatively, a substance provided with one of these, for example, a microsphere of an organic material or an inorganic material in which one of these is combined by a chemical bond or the like can also be used. The third category of cell implantation elements is proteins that bind to polysaccharides (a concept that includes sugar chains and the like). Or it is the substance provided with these 1 type, for example, the microsphere etc. of the organic material or the inorganic material which combined these 1 types by means, such as a chemical bond.
〔光照射〕
光照射を行う照射光としては、光固定化材料との組み合わせにおいてミスマッチングがない限り、伝搬光、近接場光又はエバネッセント光等の任意の照射光を利用できる。伝搬光としては、自然光、レーザー光等を利用できる。伝搬光、近接場光又はエバネッセント光として、その偏光特性を利用できる。照射光の波長や光源は限定されないが、波長に関しては、光固定化材料の吸収効率の高い波長が好ましい。細胞着床要素が例えば紫外光（波長３００〜４００ｎｍ）により不活性化、劣化等の影響を受ける恐れがある場合には、照射光として可視光（波長４００〜６００ｎｍ）を用い、かつ可視光の照射により細胞着床要素の光固定化が可能な光固定化材料を用いることが好ましい。照射光の照射時間は必要に応じて任意に設定すれば良い。尖頭出力の高いパルス光を使用することもできる。
[Light irradiation]
As the irradiation light for performing the light irradiation, any irradiation light such as propagating light, near-field light, or evanescent light can be used as long as there is no mismatch in combination with the light fixing material. Natural light, laser light, or the like can be used as the propagating light. The polarization characteristics can be used as propagating light, near-field light, or evanescent light. The wavelength of the irradiation light and the light source are not limited, but with regard to the wavelength, a wavelength with high absorption efficiency of the light fixing material is preferable. When the cell implantation element is likely to be inactivated or deteriorated by, for example, ultraviolet light (wavelength 300 to 400 nm), visible light (wavelength 400 to 600 nm) is used as irradiation light, and visible light It is preferable to use a light immobilization material capable of light immobilization of the cell implantation element by irradiation. What is necessary is just to set the irradiation time of irradiation light arbitrarily as needed. Pulse light with a high peak output can also be used.
光照射の方法として、その照射領域あるいは照射強度に一定の分布を与えることも好ましい。その場合、多数の細胞着床要素を一定の分布パターンに従って着床基材の表面に固定化することができる。 As a light irradiation method, it is also preferable to give a certain distribution to the irradiation region or irradiation intensity. In that case, a large number of cell implantation elements can be immobilized on the surface of the implantation substrate according to a certain distribution pattern.
このような照射光の照射領域あるいは照射強度の分布を与える手段として、例えばフォトマスクを利用することができる。フォトマスクの利用方法は限定されないが、例えば、プロキシミティー露光法や投影露光法を好ましく例示できる。あるいは、照射光の照射領域あるいは照射強度の分布を与える手段として、細く絞った集光ビームを特定のパターンに従って照射することもできる。更には、干渉光における光の強度分布を利用することもできる。 For example, a photomask can be used as a means for providing such irradiation light irradiation region or irradiation intensity distribution. Although the usage method of a photomask is not limited, For example, a proximity exposure method and a projection exposure method can be illustrated preferably. Alternatively, as a means for providing an irradiation region of irradiation light or a distribution of irradiation intensity, a narrow focused beam can be irradiated according to a specific pattern. Furthermore, the light intensity distribution in the interference light can be used.
又、細胞着床要素を着床基材表面の特定部位に配置したり、多数の細胞着床要素を一定の分布パターンに従って着床基材の表面に配置したりする手段として、細胞着床要素を公知のレーザートラッピングによって所定位置へ移動させる手法も利用できる。 In addition, as a means for arranging a cell implantation element at a specific site on the surface of the implantation substrate or arranging a large number of cell implantation elements on the surface of the implantation substrate according to a certain distribution pattern, the cell implantation element A method of moving the lens to a predetermined position by known laser trapping can also be used.
〔着床工程：細胞〕
着床工程においては、着床基材の表面に光固定化した前記細胞着床要素に対して、不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる。
[Implantation process: cells]
In the implantation step, nonspecific or specific cells or groups of cells are brought into contact with the cell implantation element that is light-immobilized on the surface of the implantation substrate.
この場合、細胞着床要素として、特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す１種類又は２種類以上の細胞着床要素を固定化することにより、着床工程において、細胞着床要素に対して接触させる複数種類の細胞又は細胞群の内から、１種類又は２種類以上の特定された細胞又は細胞群を選択的に着床させることが可能となる。 In this case, by immobilizing one or two or more types of cell implantation elements exhibiting adhesiveness or binding to specific cells as the cell implantation elements, in the implantation process, One or two or more types of specified cells or cell groups can be selectively implanted from a plurality of types of cells or cell groups to be contacted.
なお、「細胞」には、多細胞生物に由来する細胞の他、単細胞生物の細胞も包含される。又、「細胞群」には、同種細胞の集合体の他、異種細胞の混成に係る細胞群も包含される。 The “cell” includes cells derived from multicellular organisms as well as cells of unicellular organisms. In addition, the “cell group” includes a group of allogeneic cells as well as a group of allogeneic cells.
細胞着床要素に細胞又は細胞群を接触させる形態は限定されないが、好ましくは、細胞を含有する液状媒体を着床基材の表面に接触させると言う形態（例えば着床基材の表面を液状媒体中に浸漬させ、又は着床基材の表面に少量の液状媒体を接触させると言う形態）が挙げられる。この場合の液状媒体は、適正なｐＨやイオン強度等を備えた緩衝液とすることが好ましい。 The form in which the cell or the cell group is brought into contact with the cell implantation element is not limited, but preferably, the form in which the liquid medium containing the cell is brought into contact with the surface of the implantation base (for example, the surface of the implantation base is liquid. A mode in which a small amount of liquid medium is brought into contact with the surface of the flooring base material). In this case, the liquid medium is preferably a buffer solution having an appropriate pH, ionic strength, and the like.
〔パターニング〕
光固定化工程における細胞着床要素の光固定化を特定のパターニングに従って行うことにより、細胞又は細胞群を当該パターニングに従って着床基材に着床させることが、とりわけ好ましい。このような光固定化のパターニングは、細胞レベルのサイズで区画して設定することができるし、又、そうすることが特に好ましい場合がある。「細胞レベルのサイズ」とは、例えば、光固定化のパターニングが０．１μｍ〜１０００μｍ程度のオーダーで設定されていることを言う。
[Patterning]
It is particularly preferable that the cell or cell group is implanted on the implantation substrate according to the patterning by performing the light immobilization of the cell implantation element in the light immobilization step according to the specific patterning. Such light immobilization patterning can be partitioned and set at a cell level size, and it may be particularly preferred to do so. “Cell-level size” means, for example, that the pattern of light immobilization is set on the order of about 0.1 μm to 1000 μm.
光固定化のパターニングのための有効な一手段として、光固定化工程での光照射の照射領域あるいは照射強度に一定の分布を与えることができる。照射光の照射領域あるいは照射強度の分布を与える手段として、例えばフォトマスクを利用できる。フォトマスクの利用方法は限定されないが、例えば、プロキシミティー露光法や投影露光法を好ましく例示できる。又、他の有効な一手段として、細く絞った集光ビームを特定のパターンに従って照射することもできる。更には、干渉光における光の強度分布を利用することもできる。 As an effective means for patterning of light fixation, it is possible to give a certain distribution to the irradiation region or irradiation intensity of light irradiation in the light fixation process. For example, a photomask can be used as means for providing an irradiation region of irradiation light or a distribution of irradiation intensity. Although the usage method of a photomask is not limited, For example, a proximity exposure method and a projection exposure method can be illustrated preferably. Further, as another effective means, it is possible to irradiate a narrow focused beam according to a specific pattern. Furthermore, the light intensity distribution in the interference light can be used.
このような細胞着床パターニングは多様な実施形態において行うことが可能であるが、好ましい第１の実施形態として、光固定化工程と着床工程とを２サイクル以上繰り返して行い、各サイクルにおいて、光固定化工程における細胞着床要素の光固定化のパターニングの設定と、着床工程で用いる細胞又は細胞群の種類とを互いに異ならせることにより、２種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させること、を例示できる。 Such cell implantation patterning can be performed in various embodiments, but as a preferred first embodiment, the light immobilization step and the implantation step are repeated two or more cycles, and in each cycle, Two or more types of cells or cell groups are patterned differently by setting the pattern of light immobilization patterning of cell implantation elements in the light immobilization step and the type of cells or cell groups used in the implantation step different from each other. Can be exemplified.
細胞着床パターニングの好ましい第２の実施形態として、光固定化工程を２サイクル以上繰り返して行い、各サイクルの光固定化工程において互いに異なる光固定化のパターニングに従って互いに異なる特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す２種類以上の細胞着床要素を順次固定化した後、着床工程においてはそれぞれ前記細胞着床要素に特異的に接着又は結合する細胞又は細胞群を着床させることにより、２種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させること、を例示できる。 As a preferred second embodiment of cell implantation patterning, the light immobilization step is repeated two or more cycles, and the adhesion to specific cells different from each other according to the different light immobilization patterns in the light immobilization step of each cycle or After two or more types of cell implantation elements exhibiting binding properties are sequentially immobilized, in the implantation step, cells or groups of cells that specifically adhere to or bind to the cell implantation elements are implanted, respectively. Implanting cells or groups of cells of different types according to different patterning can be exemplified.
細胞着床パターニングの好ましい第３の実施形態として、光固定化工程と着床工程とを２サイクル以上繰り返して行い、各サイクルの光固定化工程において互いに異なる光固定化のパターニングに従って互いに異なる特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す２種類以上の細胞着床要素をそれぞれ固定化すると共に、各サイクルの着床工程においてはそれぞれ前記細胞着床要素に特異的に接着又は結合する細胞又は細胞群を着床させることにより、２種類以上の細胞又は細胞群を互いに異なるパターニングに従って着床させること、を例示できる。 As a preferred third embodiment of cell implantation patterning, the light immobilization process and the implantation process are repeated two or more cycles, and different specific immobilization patterns are provided according to different light immobilization patterns in each light immobilization process. A cell or a group of cells that immobilize two or more types of cell implantation elements that exhibit adhesion or binding properties to cells, and that specifically adhere to or bind to the cell implantation elements in the implantation step of each cycle. By implanting, it can be exemplified that two or more types of cells or cell groups are implanted according to different patterning.
〔細胞組織作製方法〕
細胞組織作製方法の発明においては、前記した光固定化工程と着床工程に加えて、「回収工程」、即ち、着床させた細胞又は細胞群を増殖させ、あるいは増殖及び分化させることにより、一定の細胞シートあるいは細胞組織を作製し、これを採取する工程が付加される。光固定化工程と着床工程との実施形態は、前記と同様である。
[Cell tissue preparation method]
In the invention of the cell tissue preparation method, in addition to the light immobilization step and the implantation step described above, a “recovery step”, that is, by proliferating, or proliferating and differentiating the implanted cells or cell groups, A step of producing a certain cell sheet or cell tissue and collecting it is added. Embodiments of the light immobilization step and the landing step are the same as described above.
利用する細胞又は細胞群としては、生物（特に動物、とりわけヒト）の増殖性のある細胞又は細胞群が好ましい。ヒト等の動物の各種の幹細胞も好ましく例示される。回収工程においては、着床工程で着床させた細胞又は細胞群を増殖させ、あるいは増殖及び分化させることにより、一定の細胞シートあるいは細胞組織を作成し、これを採取する。細胞シートあるいは細胞組織の種類及び内容は限定されないが、例えば、ヒトの表皮組織、角膜組織、膵臓や腎臓等の臓器又はその一部の組織を例示することができる。 As a cell or a group of cells to be used, a cell or a group of cells capable of proliferating an organism (particularly an animal, particularly a human) is preferable. Various stem cells of animals such as humans are also preferably exemplified. In the collection step, a cell or a group of cells implanted in the implantation step is proliferated or proliferated and differentiated to produce a certain cell sheet or cell tissue, which is collected. The type and content of the cell sheet or cell tissue are not limited, and examples thereof include human epidermal tissue, corneal tissue, organs such as pancreas and kidney, or a part of the tissue.
回収工程においては、細胞又は細胞群を増殖や分化に有利な栄養状態及び培養条件に維持することが好ましい。 In the recovery step, it is preferable to maintain the cells or cell groups in a nutritional state and culture conditions that are advantageous for proliferation and differentiation.
作製した細胞シートや細胞組織を採取する（着床基材から剥離させる）方法は限定されない。着床基材を構成する光固定化材料は、光照射中は細胞又は細胞群に対する固定力がやや弱まる傾向がある。従って、光照射を行いながら、細胞シートや細胞組織を着床させた着床基材に対して液体培地の攪拌、流動、加振等のマイルドな物理的外力を付加させることにより、細胞シートや細胞組織を、その損傷を伴うことなく、着床基材から剥離させ採取することができる。 The method of collecting the produced cell sheet or cell tissue (peeling from the implantation base material) is not limited. The light-immobilizing material constituting the implantation base material tends to have a slightly weaker fixing force to cells or cell groups during light irradiation. Therefore, by applying a mild physical external force such as stirring, flow, and vibration of the liquid medium to the implantation base material on which the cell sheet or cell tissue is implanted while performing light irradiation, The cellular tissue can be detached from the implantation base material without being damaged.
（実施例１：光固定化材料の合成）
高分子光固定化材料の合成を常法に従い行った。まず、公知のジアゾカップリング法を用いて下記の「化５」に示す化合物を合成した。次に、公知の酸クロリド反応により、下記の「化６」に示す化合物を合成した。これらの化合物においては、アゾベンゼン構造部分が光反応性成分を構成している。
(Example 1: Synthesis of light immobilization material)
The synthesis of the polymer photo-fixing material was performed according to a conventional method. First, a compound represented by the following “Chemical Formula 5” was synthesized using a known diazo coupling method. Next, a compound represented by the following “Chemical Formula 6” was synthesized by a known acid chloride reaction. In these compounds, the azobenzene structure portion constitutes a photoreactive component.
１００ｍＬ容のなすフラスコに上記の各モノマーを上記の割合で投入・混合した後、ジメチルホルムアミド５０ｍＬと２，２−アゾイソブチロニトリル８２ｍｇを加えた。なすフラスコにゴム栓をした後、窒素を１時間バブリングして系内の酸素を取り除いた。次に窒素をバブリングしたままでなすフラスコを６０°Ｃで２時間加熱した。その後、なすフラスコから反応溶液を取り出し、メタノールを用いて再沈殿させた。このような再沈殿を３回繰り返した後に減圧蒸留させ、実施例１に係る２元共重合の高分子光固定化材料を得た。 Each of the above monomers was charged and mixed in a 100 mL volumetric flask at the above ratio, and then 50 mL of dimethylformamide and 82 mg of 2,2-azoisobutyronitrile were added. A rubber stopper was put on the eggplant flask, and nitrogen was bubbled for 1 hour to remove oxygen in the system. The flask, which was bubbled with nitrogen, was then heated at 60 ° C. for 2 hours. Thereafter, the reaction solution was taken out from the eggplant flask and reprecipitated using methanol. Such reprecipitation was repeated three times, followed by distillation under reduced pressure to obtain a binary copolymeric polymer light immobilization material according to Example 1.
（実施例２：着床基材の作製）
実施例１に係る高分子光固定化材料１２．５ｍｇをピリジン２ｍＬに溶解し、ポア径０．２μｍのフィルターでろ過した。ろ液をＭＡＳコートスライドガラス（松浪ガラス社製）の表面に滴下し、このスライドガラスを回転数４０００ｒ．ｐ．ｍ．でスピンキャストして、スライドガラスの表面に高分子光固定化材料のフィルムを形成することにより、着床基材を作製した。高分子光固定化材料フィルムは約２０ｎｍの均一な膜厚であることを吸光度測定により確認した。
(Example 2: Preparation of a flooring substrate)
12.5 mg of the polymer light immobilization material according to Example 1 was dissolved in 2 mL of pyridine and filtered through a filter having a pore diameter of 0.2 μm. The filtrate was dropped on the surface of a MAS-coated slide glass (manufactured by Matsunami Glass Co., Ltd.). p. m. The landing substrate was prepared by spin-casting to form a film of a polymer light-fixing material on the surface of the slide glass. It was confirmed by absorbance measurement that the polymer light-fixing material film had a uniform film thickness of about 20 nm.
（実施例３：細胞着床−１）
実施例２で得た着床基材の表面の特定の部分に対し、コラーゲンＩの０．１％ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩液： Phosphate Buffered Saline）溶液１μＬを滴下して乾燥させ、青色ＬＥＤ光を３０分間照射した。その後、０．１％ Tween／ＰＢＳ溶液にて着床基材上の未固定のコラーゲンＩを洗浄・除去し、コラーゲンＩを光固定化した着床基材を得た。
(Example 3: Cell implantation-1)
1 μL of 0.1% PBS (Phosphate Buffered Saline) solution of collagen I is added dropwise to a specific portion of the surface of the landing base material obtained in Example 2, and dried with blue LED light. Was irradiated for 30 minutes. Thereafter, unimmobilized collagen I on the implantation base material was washed and removed with a 0.1% Tween / PBS solution to obtain an implantation base material on which collagen I was photofixed.
この着床基材をシャーレに収容した RPMI 1640培地中に浸漬し、併せてこの培地中でマウスハイブリドーマ細胞を３日間培養した。培養の終了後、この着床基材をRPMI 1640 培地で洗浄し、ついで着床基材の表面を光学顕微鏡にて観察したところ、着床基材表面において上記のようにコラーゲンＩの溶液を滴下した部分のみに、マウスハイブリドーマ細胞が観察された。 This implantation base material was immersed in RPMI 1640 medium contained in a petri dish, and mouse hybridoma cells were cultured in this medium for 3 days. After completion of the culture, this implantation base material was washed with RPMI 1640 medium, and then the surface of the implantation base material was observed with an optical microscope. The collagen I solution was dropped on the surface of the implantation base material as described above. Mouse hybridoma cells were observed only in the portions that were observed.
（実施例４：細胞着床−２）
実施例２で得た着床基材をコラーゲンＩの０．１％ＰＢＳ溶液中に浸漬させ、その着床基材表面の特定の部分に青色ＬＥＤ光を６０分間照射した。その後上記のＰＢＳ溶液中から着床基材を取り出して０．１％ Tween／ＰＢＳ溶液にて着床基材上の未固定のコラーゲンＩを洗浄・除去することにより、コラーゲンＩを光固定化した着床基材を得た。
(Example 4: Cell implantation-2)
The implantation base material obtained in Example 2 was immersed in a 0.1% PBS solution of collagen I, and a specific portion of the surface of the implantation base material was irradiated with blue LED light for 60 minutes. Thereafter, the implantation base material was taken out from the above PBS solution, and the collagen I was photo-immobilized by washing and removing the unfixed collagen I on the implantation base material with a 0.1% Tween / PBS solution. An imbedded substrate was obtained.
この着床基材をシャーレに収容した RPMI 1640培地中に浸漬し、併せてこの培地中でマウスハイブリドーマ細胞を３日間培養した。培養の終了後、この着床基材をRPMI 1640 培地で洗浄し、ついで着床基材の表面を光学顕微鏡にて観察したところ、着床基材表面において上記のように青色ＬＥＤ光を照射した部分のみに、マウスハイブリドーマ細胞が観察された。 This implantation base material was immersed in RPMI 1640 medium contained in a petri dish, and mouse hybridoma cells were cultured in this medium for 3 days. After completion of the culture, this landing base was washed with RPMI 1640 medium, and then the surface of the landing base was observed with an optical microscope. As a result, the surface of the landing base was irradiated with blue LED light as described above. Mouse hybridoma cells were observed only in the part.
（実施例５：細胞着床−３）
実施例２で得た着床基材の表面のそれぞれ特定の部分に対し、コラーゲンＩの０．１％ＰＢＳ溶液１μＬと、ＩｇＥ１０μｇ／ｍＬ ＰＢＳ溶液とを滴下して乾燥させ、青色ＬＥＤ光を３０分間照射した。その後、０．１％ Tween／ＰＢＳ溶液にて着床基材上の未固定のコラーゲンＩ及びＩｇＥを洗浄・除去し、コラーゲンＩ及びＩｇＥを光固定化した着床基材を得た。
(Example 5: Cell implantation-3)
1 μL of a collagen I 0.1% PBS solution and an IgE 10 μg / mL PBS solution are added dropwise to each specific portion of the surface of the flooring base material obtained in Example 2 to dry the blue LED light. Irradiated for 1 minute. Thereafter, unfixed collagen I and IgE on the implantation base material were washed and removed with a 0.1% Tween / PBS solution to obtain an implantation base material on which collagen I and IgE were immobilized.
この着床基材をシャーレに収容した RPMI 1640培地中に浸漬し、併せてこの培地中でヒトマスト細胞及びヒト上皮細胞を３日間共培養した。培養の終了後、この着床基材をRPMI 1640 培地で洗浄し、ついで着床基材の表面を光学顕微鏡にて観察したところ、着床基材表面において上記のようにコラーゲンＩの溶液を滴下した部分のみにヒト上皮細胞が、ＩｇＥの溶液を滴下した部分のみにヒトマスト細胞が、それぞれ観察された。 This implantation base was immersed in RPMI 1640 medium contained in a petri dish, and human mast cells and human epithelial cells were co-cultured in this medium for 3 days. After completion of the culture, this implantation base material was washed with RPMI 1640 medium, and then the surface of the implantation base material was observed with an optical microscope. The collagen I solution was dropped on the surface of the implantation base material as described above. Human epithelial cells were observed only in the areas where the cells were removed, and human mast cells were observed only in the areas where the IgE solution was dropped.
（実施例６：細胞着床−４）
実施例２で得た着床基材をコラーゲンＩの０．１％ＰＢＳ溶液中に浸漬させ、その着床基材表面のそれぞれ特定の部分に直径１０μｍ及び３０μｍの青色レーザー光を３０分間照射した。その後上記のＰＢＳ溶液中から着床基材を取り出して０．１％ Tween／ＰＢＳ溶液にて未固定のコラーゲンＩを洗浄・除去することにより、コラーゲンＩを上記２点のスポットで光固定化した着床基材を得た。
(Example 6: Cell implantation-4)
The implantation base material obtained in Example 2 was immersed in a 0.1% PBS solution of collagen I, and each specific part of the surface of the implantation base material was irradiated with blue laser light having a diameter of 10 μm and 30 μm for 30 minutes. . Thereafter, the implantation base material was taken out of the above PBS solution, and unfixed collagen I was washed and removed with a 0.1% Tween / PBS solution, so that collagen I was photofixed at the two spots. An imbedded substrate was obtained.
この着床基材をシャーレに収容した RPMI 1640培地中に浸漬し、併せてこの培地中でマウスハイブリドーマ細胞を３日間培養した。培養の終了後、着床基材をRPMI 1640 培地で洗浄し、ついで着床基材の表面を光学顕微鏡にて観察したところ、着床基材表面における上記の直径１０μｍのスポットには１個のマウスハイブリドーマ細胞が、直径３０μｍのスポットには平均３．２個のマウスハイブリドーマ細胞が、それぞれ観察された。 This implantation base material was immersed in RPMI 1640 medium contained in a petri dish, and mouse hybridoma cells were cultured in this medium for 3 days. After completion of the culture, the implantation substrate was washed with RPMI 1640 medium, and then the surface of the implantation substrate was observed with an optical microscope. As a result, one spot was found in the spot having a diameter of 10 μm on the implantation substrate surface. An average of 3.2 mouse hybridoma cells were observed in spots having a diameter of 30 μm.
本発明の細胞着床方法により、細胞やこれに含まれるタンパク質の性質を損なわない細胞固定化技術、選択的細胞パターニング技術が安価に提供される。
By the cell implantation method of the present invention, a cell immobilization technique and a selective cell patterning technique that do not impair the properties of cells and proteins contained therein are provided at low cost.
Claims (11)
（Ａ）該着床基材の表面に、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程と、
（Ｂ）光固定化した前記細胞着床要素に対して不特定又は特定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程と、
を行うことを特徴とする細胞着床方法。 A dye structure having an azobenzene skeleton, and the benzene ring on one side of the azobenzene skeleton has an amino group chemically bonded to a constituent molecule of the matrix, and the benzene ring on the other side has a nitro group, a cyano group, trifluoro A material having a functional group selected from a methyl group, an aldehyde group, or a carboxyl group, and having a chemical structure capable of causing cis-trans photoisomerization to cause photodeformation, and is capable of emitting light to a micro object disposed on a surface. Constructing a flooring base material using at least the surface immobilization material showing the immobilization ability at the time of irradiation,
(A) a light immobilization step of immobilizing a cell implantation element exhibiting adhesion or binding to unspecified or specific cells on the surface of the implantation substrate by light irradiation;
(B) an implantation step of bringing an unspecified or specific cell or cell group into contact with the light-immobilized cell implantation element,
A cell implantation method characterized by comprising:
（Ａ）該着床基材の表面に、不特定又は特定の細胞に対する接着性あるいは結合性を示す細胞着床要素を光照射によって固定化する光固定化工程と、
（Ｂ）光固定化した前記細胞着床要素に対して一定の細胞又は細胞群を接触させて着床させる着床工程と、
（Ｃ）着床させた前記細胞又は細胞群を増殖させ、あるいは増殖及び分化させることにより、一定の細胞シートあるいは細胞組織を作製し、これを採取する回収工程と、
を行うことを特徴とする細胞組織作製方法。 A dye structure having an azobenzene skeleton, and the benzene ring on one side of the azobenzene skeleton has an amino group chemically bonded to a constituent molecule of the matrix, and the benzene ring on the other side has a nitro group, a cyano group, trifluoro A material having a functional group selected from a methyl group, an aldehyde group, or a carboxyl group, and having a chemical structure capable of causing cis-trans photoisomerization to cause photodeformation, and is capable of emitting light to a micro object disposed on a surface. Constructing a flooring base material using at least the surface immobilization material showing the immobilization ability at the time of irradiation,
(A) a light immobilization step of immobilizing a cell implantation element exhibiting adhesion or binding to unspecified or specific cells on the surface of the implantation substrate by light irradiation;
(B) an implantation step in which certain cells or groups of cells are brought into contact with the light-immobilized cell implantation element, and implantation is performed.
(C) A recovery step of producing a certain cell sheet or cell tissue by proliferating or proliferating and differentiating the implanted cells or cell groups,
A method for preparing a cell tissue, comprising:
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