JP4637835B2 - シュードモナスの非マルトース産生性エキソアミラーゼ改変体を含む食品添加剤 - Google Patents

シュードモナスの非マルトース産生性エキソアミラーゼ改変体を含む食品添加剤 Download PDF

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Description

本発明は、ポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードする核酸、および食品を製造する際の非マルトース産生性エキソアミラーゼとしてのそれらの使用に関する。詳細には、上記ポリペプチドは、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性（特に、グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）活性）を有するポリペプチドに由来する。
（要旨）
本発明の第一の局面に従って、本発明者らは、ＰＳ４改変体ポリペプチドを含む食品添加剤を提供する。上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、非マルトース産生性（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドに由来し、このＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置番号付けに関して１３４位における置換、１４１位における置換、１５７位における置換、２２３位における置換、３０７位における置換、および３３４位における置換を含む。
好ましくは、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、１２１位における置換および２２３位における置換（好ましくはＧ１２１Ｄおよび／もしくはＧ２２３Ａ）の一方または両方を含む。上記２２３位における置換はまた、Ｇ２２３Ｌを含み得る。より好ましくは、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、３３位における置換（好ましくはＮ３３、より好ましくはＮ３３Ｙ）、３４位における置換（好ましくはＤ３４、より好ましくはＤ３４Ｎ）、１７８位における置換、および１７９位における置換のうちの１つ以上を含む。
好ましくは、上記親ポリペプチドは、非マルトース産生性エキソアミラーゼ（好ましくはグルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０））を含む。好ましくは、上記親ポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）であるかまたはこれに由来する。好ましい実施形態において、上記親ポリペプチドは、配列番号１または配列番号５として示される配列を有する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ由来の非マルトース産生性エキソアミラーゼである。非常に好ましい実施形態において、上記親ポリペプチドは、配列番号７または配列番号１１として示される配列を有する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来の非マルトース産生性エキソアミラーゼである。
非常に好ましい実施形態において、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、同じ条件下で試験した場合に上記親ポリペプチドと比較して高い熱安定性を有する。好ましくは、その半減期（ｔ１／２）、好ましくは６０℃における半減期は、上記親ポリペプチドに対して、１５％以上、好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上増加している。
あるいは、またはさらに、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくは、同じ条件下で試験した場合に上記親ポリペプチドと比較して高いエキソ特異性を有する。好ましくは、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、上記親ポリペプチドと比較して、１０％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは５０％以上のエキソ特異性を有する。
さらなる好ましい実施形態において、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、上記１３４位における置換がＧ１３４Ｒを含む、ポリペプチドである。上記１４１位における置換は、好ましくは、Ａ１４１Ｐを含む。さらに、上記３３４位における置換は、好ましくは、Ｓ３３４Ｐを含む。
好ましくは、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、（ａ）上記３３位における置換がＮ３３Ｙを含むポリペプチド；（ｂ）上記３４位における置換がＤ３４Ｎを含むポリペプチド；（ｃ）上記１５７位における置換がＩ１５７Ｌを含むポリペプチド；（ｄ）上記１７８位における置換がＬ１７８Ｆを含むポリペプチド；（ｅ）上記１７９位における置換がＡ１７９Ｔを含むポリペプチド；（ｆ）上記２２３位における置換がＧ２２３Ａを含むポリペプチド；または（ｇ）上記３０７位における置換がＨ３０７Ｌを含むポリペプチドである。
非常に好ましい実施形態において、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、置換Ｇ１３４Ｒ、置換Ａ１４１Ｐ、置換Ｉ１５７Ｌ、置換Ｇ２２３Ａ、置換Ｈ３０７Ｌ、および置換Ｓ３３４Ｐを、１７８位におけるフェニルアラニンもしくは１７９位におけるスレオニンまたはその両方とともに、必要に応じてＮ３３ＹおよびＤ３４Ｎのうちの一方または両方とともに含む。
上記ＰＳ４改変体ポリペプチドはさらに、１２１位における置換を含み得る。上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列ＰＳａｃ−Ｄ３４（配列番号２）または配列ＰＳｔｕ−Ｄ３４（配列番号８）を有し得る。上記ＰＳ４改変体ポリペプチドはさらに好ましくは、上記１２１位における置換がＧ１２１Ｄを含むポリペプチドであり得る。好ましくは、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列ＰＳａｃ−Ｄ２０（配列番号３）または配列ＰＳｔｕ−Ｄ２０（配列番号９）を有し得る。
さらなる置換が、可能である。例えば、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、８７位における置換をさらに含み得る。上記８７位における置換は、好ましくはＧ８７Ｓを含む。好ましくは、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列ＰＳａｃ−Ｄ１４（配列番号４）または配列ＰＳｔｕ−Ｄ１４（配列番号１０）を有する。上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３を有し得る。
本発明の第二の局面に従って、本発明者らは、食品添加剤としての、本発明の第一の局面に記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドの使用を提供する。
本発明の第三の局面に従って、本発明者らは、デンプンを処理するためのプロセスを提供する。このプロセスは、上記デンプンを、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドと接触させる工程；および上記ポリペプチドが上記デンプンから１つ以上の直鎖状生成物を生成するのを許容する工程、を包含する。
本発明の第四の局面に従って、本発明者らは、食品を調製することにおける、本発明の第一の局面に記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドの使用を提供する。
本発明の第五の局面に従って、本発明者らは、食品を調製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、本発明の第一の局面に記載されるポリペプチドを、食品成分と混合する工程、を包含する。
好ましい実施形態において、上記食品は、生地（ｄｏｕｇｈ）または生地製品（好ましくは、加工された生地製品）を含む。好ましくは、上記食品は、パン製品（ｂａｋｅｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）である。
本発明の第六の局面に従って、本発明者らは、パン製品を製造するためのプロセスを提供する。このプロセスは、（ａ）デンプン媒体（ｍｅｄｉｕｍ）を提供する工程；（ｂ）上記デンプン媒体に、本発明の第一の局面に記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドを添加する工程；および（ｃ）工程（ｂ）の間または工程（ｂ）の後に上記デンプン媒体に熱を適用して、パン製品を製造する工程、を包含する。
本発明の第七の局面に従って、本発明者らは、上記のプロセスによって得られる、食品、生地製品、またはパン製品を提供する。
本発明の第八の局面に従って、本発明者らは、生地のための改良剤組成物を提供する。この改良剤組成物は、本発明の第一の局面に記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドと、少なくとも１種のさらなる生地成分または生地添加剤と、を含む。
本発明の第九の局面に従って、本発明者らは、小麦粉と、本発明の第一の局面に記載のＰＳ４改変体ポリペプチドと、を含む、組成物を提供する。
本発明の第十の局面に従って、本発明者らは、生地製品における、その生地製品の老化（好ましくは、有害な老化）を遅延または低減するための、本発明の第一の局面に記載のＰＳ４改変体ポリペプチドの使用を提供する。
本発明の第十一の局面に従って、本発明者らは、上記のＰＳ４改変体ポリペプチドと、ノバミル、またはマルトース産生性α−アミラーゼ活性を有するその改変体、ホモログ、もしくは変異体との組み合わせを提供する。
本発明の第十二の局面に従って、本発明者らは、上記の適用のための、上記ノバミルの組合せの使用を提供する。
本発明の第十三の局面に従って、本発明者らは、上記組合せで処理することにより製造される、食品を提供する。
本発明の第十四の局面に従って、ＰＳ４改変体ポリペプチドを含む食品添加剤が提供される。このＰＳ４改変体ポリペプチドは、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドに由来し、このＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置番号付けに関して置換Ｇ１２１Ｄ、１３４位における置換、１４１位における置換、１５７位における置換、Ｇ２２３Ａ、３０７位における置換、および３３４位における置換を含む。
（配列表）
配列番号１は、ＰＳ４参照配列を示し、これは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列に由来する。
配列番号２は、ＰＳａｃ−Ｄ３４配列を示す。これは、１１個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＰＳａｃ−Ｄ２０配列を示す。これは、１３個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号４は、ＰＳａｃ−Ｄ１４配列を示す。これは、１４個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａのグルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ前駆体（ＥＣ３．２．１．６０）（Ｇ４−アミラーゼ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エキソマルトテトラヒドロラーゼ）（マルトテトラオース形成エキソアミラーゼ）を示す。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ２２９６３。
配列番号６は、マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ番号＝３．２．１．６０）をコードするＰ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ ｍｔａ遺伝子を示す。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１６７３２。
配列番号７は、ＰＳ４参照配列を示し、これは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列に由来する。
配列番号８は、ＰＳｔｕ−Ｄ３４配列を示す。これは、９個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号９は、ＰＳｔｕ−Ｄ２０配列を示す。これは、１１個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である
配列番号１０は、ＰＳｔｕ−Ｄ１４配列を示す。これは、１２個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｆｅｃｔｏｍａｒｉｎａ）のグルカン１，４−α−マルトヒドロラーゼ前駆体（ＥＣ３．２．１．６０）（Ｇ４−アミラーゼ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エキソマルトテトラヒドロラーゼ）（マルトテトラオース形成エキソアミラーゼ）を示す。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ１３５０７。
配列番号１２は、Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉのマルトテトラオース形成アミラーゼ（ａｍｙＰ）遺伝子の完全ｃｄｓを示す。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２４５１６。
配列番号１３は、ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３配列を示す。これは、１０個の置換（Ｎ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ、Ｓ３３４Ｐ）と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１４は、ＰＳａｃ−Ｄ３４（Ｙ３３Ｎ）配列を示す。これは、１０個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ＰＳａｃ−Ｄ２０（Ｙ３３Ｎ）配列を示す。これは、１２個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１６は、ＰＳａｃ−Ｄ１４（Ｙ３３Ｎ）配列を示す。これは、１３個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、ＰＳｔｕ−Ｄ３４（Ｙ３３Ｎ）配列を示す。これは、８個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１８は、ＰＳｔｕ−Ｄ２０（Ｙ３３Ｎ）配列を示す。これは、１０個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１９は、ＰＳｔｕ−Ｄ１４（Ｙ３３Ｎ）配列を示す。これは、１１個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３（Ｙ３３Ｎ）配列を示す。これは、９個の置換（Ｄ３４Ｎ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ、Ｓ３３４Ｐ）と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２１は、ＰＳａｃ−Ｄ３４（Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、１０個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２２は、ＰＳａｃ−Ｄ２０（Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、１２個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２３は、ＰＳａｃ−Ｄ１４（Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、１３個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２４は、ＰＳｔｕ−Ｄ３４（Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、８個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２５は、ＰＳｔｕ−Ｄ２０（Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、１０個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２６は、ＰＳｔｕ−Ｄ１４（Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、１１個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２７は、ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３（Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、９個の置換（Ｎ３３Ｙ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ、Ｓ３３４Ｐ）と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ＰＳａｃ−Ｄ３４（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、９個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号２９は、ＰＳａｃ−Ｄ２０（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、１１個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３０は、ＰＳａｃ−Ｄ１４（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、１２個の置換と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３１は、ＰＳｔｕ−Ｄ３４（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、７個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３２は、ＰＳｔｕ−Ｄ２０（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、９個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ＰＳｔｕ−Ｄ１４（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、１０個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３４は、ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列を示す。これは、８個の置換（Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ、Ｓ３３４Ｐ）と、デンプン結合ドメインの欠失とを含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列である。
他の配列もまた、配列表に示される。これらの他の配列ならびに配列番号１〜３４（但し、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号１１、および配列番号１２を除く）の各々は、本明細書中に記載される方法および組成物に従ってＰＳ４改変体ポリペプチドとして使用され得る。これらの配列の各々は、親配列として使用され得る。
（発明の詳細な説明）
以下の記載および例において、文脈が他に示さなければ、ＰＳ４改変体ポリペプチドの投薬量は、粉末のｐｐｍ（ｍｇ／ｇ）で記載される。例えば、表２に記載されるような「１Ｄ３４」は、重量／重量に基づいたｐＳａｃ−Ｄ３４のｐｐｍを表す。好ましくは、酵素の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）または量（ａｍｏｕｎｔ）は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６、Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４）に記載されるアッセイを用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として用いて測定される純粋な酵素タンパク質の等価物として、活性のアッセイに基づいて決定される。
本発明の実施は、他に示されない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を用いる。これらの従来技術は、当業者の能力の範囲内である。このような技術は、文献中に説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，第１巻〜第３巻，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５および定期補遺；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第９章，第１３章および第１６章，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．ＣｒａｂｔｒｅｅおよびＡ．Ｋａｈｎ，１９９６，ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｅｄ ＨａｒｌｏｗによるＰｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ．Ｉ（１９９９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５４４−７）；Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（編）、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編）によるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３１４−２），１８５５，Ｌａｒｓ−Ｉｎｇｅ Ｌａｒｓｓｏｎ「Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ｉｎｃ．，Ｂａｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８８，ＩＳＢＮ ０−８４９３−６０７８−１，Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｐｏｕｎｄ（編）；「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｖｏｌ ８０」、シリーズで；「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９８，ＩＳＢＮ ０−８９６０３−４９３−３，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓにより編集された、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（２００１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ ０−８２４７−０５６２−９）；ならびにＬａｂ Ｒｅｆ：Ｊａｎｅ ＲｏｓｋａｍｓおよびＬｉｎｄａ Ｒｏｄｇｅｒｓ編集の、Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ，２００２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−６３０−３、を参照のこと。これらの一般的な教科書の各々は、本明細書中に参考として援用される。
（ＰＳ４改変体）
本発明者らは、非マルトース産生性エキソアミアラーゼ活性を有するポリペプチドの改変体であるポリペプチドを含有する組成物、ならびにこのような改変体ポリペプチドおよび上記組成物の使用を提供する。この組成物は、別の成分とともにポリペプチド改変体を含有する。特に、本発明者らは、このポリペプチドを含む食品添加剤を提供する。
このような改変体ポリペプチドは、この文献中で、「ＰＳ４改変体ポリペプチド」と呼ばれる。このような改変体ポリペプチドをコードする核酸は、便宜上、「ＰＳ４改変体核酸」と呼ばれる。ＰＳ４改変体ポリペプチドおよびＰＳ４改変体核酸は、以下にさらに詳細に記載されている。
具体的には、本発明者らは、非マルトース産生性エキソアミラーゼ配列においてアミノ酸置換を含む配列変さらを有するＰＳ４改変体ポリペプチドを提供する。このアミノ酸置換は、配列番号１に示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置番号付けを参照して、１３４位、１４１位、１５７位、２２３位、３０７位および３３４位の任意の一つ以上に存在し得る。３３位および３４位の一方または両方においてさらなる置換が、存在し得る。１７８位および１７９位でのなおさらなる置換でさえもまた、含まれ得る。
３３位での残基は、好ましくは野生型（すなわち、Ｎ）であり；同様に、３４位での残基は、好ましくは野生型（すなわち、Ｄ）である。
１２１位での置換が存在する場合、１２１位での置換は、有利には、Ｇ１２１Ｄを含む。同様に、２２３位での置換が存在する場合、２２３位での置換は、有利には、Ｇ２２３Ａを含む。あるいは、２２３位での置換は、Ｇ２２３Ｌを含み得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明者らは、ＰＳ４改変体ポリペプチドを含有する食品添加剤を開示し、このＰＳ４改変体ポリペプチドは、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドから得ることができ、このＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列番号１に示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置番号付けを参照して、以下の位置：Ｇ１２１Ｄ、１３４、１４１、１５７、Ｇ２２３Ａ、３０７、および３３４に置換を含む。
ＰＳ４改変体ポリペプチドの例が、配列表中に示され、そしてこれらは、以下に詳細に記載される。
このような改変体ポリペプチドは、上記親ポリペプチドの特徴を保持し、そしてさらに好ましくは、追加の有益な特性（例えば、活性もしくは熱安定性の増強、またはｐＨ抵抗性、あるいはこれらの組み合わせ（好ましくは全て））を有する。
本明細書中に記載されるＰＳ４置換変異体は、この親酵素が適切である任意の目的のために使用され得る。特に、これらの変異体は、エキソ−マルトテトラヒドロラーゼが使用される任意の適用において使用され得る。非常に好ましい実施形態において、これらは、より高い熱安定性、またはより高いエキソアミラーゼ活性もしくはより高いｐＨ安定性、あるいは任意の組み合わせという付加的な利点を有する。このＰＳ４改変体ポリペプチドおよびＰＳ４改変体核酸の適切な使用の例としては、食品生産（特に、焼成（ｂａｋｉｎｇ））ならびに食料品の生産が挙げられる；さらなる例は、以下に詳細に記載される。
上記「親」配列（すなわち、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドおよびＰＳ４改変体核酸が基づく配列）は、好ましくは、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドである。用語「親酵素」および「親ポリペプチド」は、上記に従って解釈されるべきであり、ＰＳ４改変体ポリペプチドが基づく酵素およびポリペプチドを意味すると見なされるべきである。
特に好ましい実施形態において、上記親配列は、非マルトース産生性エキソアミラーゼ酵素であり、好ましくは、細菌の非マルトース産生性エキソアミラーゼ酵素である。非常に好ましい実施形態では、この親配列は、グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．６０）を含む。好ましくは、この親配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来である。
好ましい実施形態では、この親ポリペプチドは、配列番号１に示される配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ非マルトース産生性エキソアミラーゼを含むか、またはこれと相同である。配列番号１に示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ非マルトース産生性エキソアミラーゼＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列に関連するタンパク質または核酸、好ましくは、この配列を有するかもしくは機能的相同性を有するタンパク質または核酸は、この文献中で、「ＰＳ４ファミリー」のメンバーと呼ばれる。上記ＰＳ４改変体ポリペプチドまたはＰＳ４改変体核酸を生成する際に用いるのに適切な「ＰＳ４ファミリー」非マルトース産生性エキソアミラーゼ酵素の例は、以下にさらに詳細に開示される。
いくつかの好ましい実施形態において、この親ポリペプチドは、配列番号１に示される配列、またはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ２２９６３を有する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ非マルトース産生性エキソヌクレアーゼ由来の非マルトース産生性エキソヌクレアーゼを含む。他の好ましい実施形態では、この親ポリペプチドは、配列番号１１に示されるような配列を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来の非マルトース産生性エキソアミラーゼ、またはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ１３５０７を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非マルトース産生性エキソアミラーゼを含む。
このＰＳ４改変体ポリペプチドおよびＰＳ４改変体核酸は、多くの変異を含むことにより、親配列とは異なる。換言すれば、このＰＳ４改変体ポリペプチドまたはＰＳ４改変体核酸の配列は、多くの位置または残基が親の配列とは異なる。好ましい実施形態では、この変異は、アミノ酸置換、つまり、一アミノ酸残基の別のアミノ酸残基への変さらを含む。従って、このＰＳ４改変体ポリペプチドは、この親配列の一以上の位置にて、アミノ酸残基の性質における多くの変化を含む。
産生されたかまたはこの文献により包含されることが企図された、種々のＰＳ４改変体ポリペプチド改変体を記載する際、参照の容易性のために、以下の命名法が採用される：［元のアミノ酸／番号付けシステムに従う位置／置換アミノ酸］。従って、例えば、１４１位のアラニンのプロリンへの置換は、Ａ１４１Ｐと表記される。複数の変異は、スラッシュ記号「／」により区切ることにより表記され得る。例えば、Ａ１４１Ｐ／Ｇ２２３Ａは、１４１位および２２３位において、アラニンをプロリンと、そしてグリシンをアラニンとそれぞれ置換する変異を表す。
本文献において、番号付けにより言及される全ての位置は、以下に示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ基準配列（配列番号１）の番号付けをいう。
Figure 0004637835
 この基準配列は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ２２９６３を有するが、シグナル配列ＭＳＨＩＬＲＡＡＶＬＡＡＶＬＬＰＦＰＡＬＡを有さないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａの配列に由来する。
本明細書中に記載されるＰＳ４改変体ポリペプチド改変体は、好ましくは、以下の位置：Ｇ１３４、Ａ１４１、Ｉ１５７、Ｇ２２３、Ｈ３０７、Ｓ３３４、Ｎ３３およびＤ３４に置換を含む。好ましくは、これらのＰＳ４改変体ポリペプチド改変体は、Ｌ１７８およびＡ１７９の一方または両方に、さらなる置換を含み得る。さらに好ましい実施形態では、１３４位のグリシンは、ＰＳ４改変体ポリペプチドにおいて、アルギニンにより置換される。さらに特に好ましい実施形態では、１４１位のアルギニンは、プロリンにより置換される。さらに、このような特に好ましい実施形態において、３３４位のセリンは、プロリンにより置換される。
従って、好ましい実施形態では、このＰＳ４改変体ポリペプチドは、１３４位にて置換アルギニンを、１４１位にて置換プロリンを、そして３３４位にて置換プロリンを含む（例えば、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、およびＳ３３４Ｐ）。１５７位、２２３位、３０７位、３３位、３４位、１７８位および１７９位における残基は、多くの残基により置換され得る（例えば、Ｉ１５７ＶもしくはＩ１５７ＮまたはＧ２２３ＬもしくはＧ２２３ＩもしくはＧ２２３ＳもしくはＧ２２３ＴまたはＨ３０７ＩもしくはＨ３０７ＶまたはＤ３４ＧもしくはＤ３４ＡもしくはＤ３４ＳもしくはＤ３４ＴまたはＡ１７９Ｖ）。
しかし、このＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくは、置換Ｉ１５７Ｌ、置換Ｌ１７８Ｆ、置換Ａ１７９Ｔ、置換Ｇ２２３Ａおよび置換Ｈ３０７Ｌを含む。３３位および／または３４位における置換が存在する場合、これらは、好ましくは、Ｎ３３ＹまたはＤ３４Ｎである。
非常に好ましい実施形態では、このＰＳ４改変体ポリペプチドは、Ｌ１７８ＦおよびＡ１７９Ｔの一方または両方と一緒に、以下の置換：Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ、およびＳ３３４Ｐを含む。必要に応じて、置換Ｎ３３Ｙおよび置換Ｄ３４Ｎもまた、含まれ得る。
一つの実施形態では、このＰＳ４改変体は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非マルトース産生性酵素配列に由来する。従って、そして好ましくは、このＰＳ４改変体ポリペプチド改変体は、配列ＰＳａｃ−Ｄ３４（配列番号２）を含む。
１以上の更なる置換は、親配列（特にＧ１２１もしくはＧ８７、または両位置）へと導入され得る。このＧ１２１置換は、好ましくは、Ｇ１２１Ｄを含み、そしてＧ８７置換は、好ましくは、Ｇ８７Ｓを含む。
従って、本発明者らは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａに基づいたＰＳ４改変体ポリペプチドであって以下の置換：Ｌ１７８ＦおよびＡ１７９Ｔの一方または両方と一緒に、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｇ１２１Ｄ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ、およびＳ３３４Ｐを含み、また必要に応じて、Ｎ３３Ｙおよび／またはＤ３４Ｎを含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａに基づいたＰＳ４改変体ポリペプチド、ならびに、ＰＳ４改変体ポリペプチドであって以下の置換：Ｌ１７８ＦおよびＡ１７９Ｔの一方または両方と一緒に、Ｇ８７Ｓ、Ｇ１２１Ｄ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ、およびＳ３３４Ｐを含み、そして必要に応じて、Ｎ３３Ｙおよび／またはＤ３４Ｎを含むＰＳ４改変体ポリペプチドを開示する。
従って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非マルトース産生性酵素配列に基づくＰＳ４改変体は、Ｇ１２１Ｄを含む配列ＰＳａｃ−Ｄ２０（配列番号３）を有し得るか、または、さらにＧ８７Ｓを含む配列ＰＳａｃ−Ｄ１４（配列番号４）を有し得る。このＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３を有し得る。
別の実施形態では、このＰＳ４改変体は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非マルトース産生性酵素配列、好ましくは以下の配列番号７：
Figure 0004637835
 に示される配列に由来する。
従って、このＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列ＰＳｔｕ−Ｄ３４（配列番号８）を含み得る。本発明者らは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非マルトース産生性酵素配列が元になっていて、かつＧ１２１置換および／またはＧ８７置換を含むＰＳ４改変体ポリペプチドをさらに開示する。これらは、Ｌ１７８ＦおよびＡ１７９Ｔの一方または両方と共に、以下の置換：Ｎ３３Ｙ（３３位での置換が存在する場合）、Ｄ３４Ｎ（３４位での置換が存在する場合）、Ｇ１２１Ｄ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７ＬおよびＳ３３４Ｐを含み得、ならびに、Ｌ１７８ＦおよびＡ１７９Ｔの一方または両方と共に、以下の置換：Ｎ３３Ｙ（３３位での置換が存在する場合）、Ｄ３４Ｎ（３４位での置換が存在する場合）、Ｇ８７Ｓ、Ｇ１２１Ｄ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７ＬおよびＳ３３４Ｐを含むＰＳ４改変体ポリペプチドを含み得る。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非マルトース産生性酵素配列に基づいたＰＳ４改変体は、Ｇ１２１Ｄを含む配列ＰＳｔｕ−Ｄ２０（配列番号９）、またはＧ８７Ｓをさらに含む配列ＰＳｔｕ−Ｄ１４（配列１０）を有し得る。
この番号付けシステムは、特定の配列を塩基基準点として使用し得るとしても、関係する全ての相同配列にもまた適用可能である。例えば、この位置番号付けは、他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種からの相同配列、または他の細菌からの相同配列に適用され得る。好ましくは、このような相同配列は、上記の基準配列（配列番号１）と、またはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ２２９６３もしくはＰ１３５０７を有する配列と、好ましくはこれらの全ての配列と、６０％以上の相同性（例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の相同性）を有する。タンパク質間の配列相同性は、本明細書中に記載の周知のアライメントプログラムおよびハイブリダイゼーション技術を用いて確かめられ得る。このような相同配列は、この明細書の中で「ＰＳ４ファミリー」と呼ばれる。
さらに、上記のように、本明細書において使用される番号付けシステムは、基準配列（配列番号１）へ参照をさせる。基準配列（配列番号１）は、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ２２９６３を有するが、シグナル配列ＭＳＨＩＬＲＡＡＶＬＡＡＶＬＬＰＦＰＡＬＡを有さないＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ配列に由来する。このシグナル配列は、基準配列のＮ末端に存在し、そして２１アミノ酸残基からなる。従って、このシグナル配列を含む対応する配列、または、Ｎ末端もしくはＣ末端の、他の任意の延長もしくは欠失を含む確かに対応する配列において、変異されるかもしくは置換されるべき特定の残基を同定することは平凡なことである。例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ２２９６３を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ非マルトース産生性エキソアミラーゼ配列またはＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ１３５０７を有するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非マルトース産生性エキソアミラーゼを有するエキソアミラーゼの配列。
このＰＳ４改変体ポリペプチドは、上に示される変異に加えて、１個以上の更なる変異を含み得る。すでに示されている変異に加えて、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個またはそれ以上の変異（好ましくは置換）が存在し得る。一つ以上の他の位置における他の変異（例えば、欠失、挿入、置換、トランスバージョン、転移および転位がまた、包含され得る。さらに、このＰＳ４改変体は、列挙された位置における全ての置換を有する必要はない。実際に、これらは、１個、２個、３個、４個、または５個の置換欠失を有し得る（すなわち、野生型アミノ酸残基は、このような位置にて存在する）。
本発明者らはまた、本明細書中に記載される目的のために、このようなポリペプチドを産生する際に使用するためのＰＳ４改変体ポリペプチド配列における変更に対応するかまたはこれをコードする配列を有するＰＳ４核酸を記載する。当業者は、核酸配列とポリペプチド配列との間の関係、特に、遺伝コードとこのコードの縮重を知っており、そして障害なくこのようなＰＳ４核酸を構築し得る。例えば、当業者は、ＰＳ４改変体ポリペプチド配列における各アミノ酸の置換に関して、置換アミノ酸をコードする一種以上のコドンが存在し得ることを知っている。従って、特定のアミン酸残基に関するこの遺伝コードの縮重に依存して、ＰＳ４改変体ポリペプチド配列に対応する１以上のＰＳ４核酸配列が生成され得ることが明らかである。さらに、このＰＳ４改変体ポリペプチドが１以上の置換（例えば、Ａ１４１Ｐ／Ｇ２２３Ａ）を含む場合、対応するＰＳ４核酸は、それぞれ２つのアミノ酸の変更をコードするコドンの対の組み合わせを包含し得る。
従って、例えば、ＰＳ４核酸配列は、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有し、かつ、配列番号１に示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎｏａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の番号付けした位置に関して、Ｌ１７８およびＡ１７９の一方または両方と共に、以下の位置：Ｇ１３４、Ａ１４１、Ｉ１５７、Ｇ２２３、Ｈ３０７、Ｓ３３４、そして必要に応じて、Ｎ３３およびＤ３４の一方または両方にアミノ酸置換をコードするコドンを含むポリペプチドをコードする親配列に由来し得る。本発明者らはまた、親配列、非マルトース産生性エキソアミラーゼをコードし得る親配列に由来する核酸配列を記載し、この非マルトース産生性エキソアミラーゼをコードし得る親配列に由来する核酸配列は、１個以上の残基にて置換基を含み、その結果、この核酸配列は、特定の位置における以下の変異（配列番号１に示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の番号付けした位置に関して、Ｇ１３４、Ａ１４１、Ｉ１５７、Ｇ２２３、Ｈ３０７、Ｓ３３４、そして必要に応じて、Ｌ１７８およびＡ１７９の一方または両方と一緒に、Ｎ３３およびＤ３４の一方または両方、の１個以上をコードする。
特定のＰＳ４改変体核酸配列と同一ではないがこれらに関連する核酸配列（例えば、ＰＳ４改変体核酸配列の改変体、ホモログ、誘導体、もしくは断片、または相補体あるいはこれらをハイブリダイズし得る配列）が、明細書に記載の方法および組成物にとって有用であることが、理解される。文脈が他に示さない限り、用語「ＰＳ４改変体核酸」は、上に列挙されたこれらの存在の各々を包含すると解釈されるべきである。
アミノ酸配列および核酸配列における変異は、当該分野において公知の多くの技術のいずれかにより作製され得る。特に好ましい実施形態では、この変異は、実施例において例示されているように、適切なプライマーを用いたＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の手段によって親配列に導入される。従って、アミノ酸置換（Ｌ１７８およびＡ１７９の一方または両方と一緒に、Ｇ１３４、Ａ１４１、Ｉ１５７、Ｇ２２３、Ｈ３０７、Ｓ３３４、必要に応じてＮ３３および／またはＤ３４を含む）を非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチド中に（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉエキソアミラーゼ配列中に）記載されたように導入することにより、アミノ酸レベルまたは核酸レベルでポリペプチドの配列を変更することは可能である。本発明者らは、非マルトース産生性エキソアミラーゼの配列が、上記非マルトース産生性エキソアミラーゼをコードする核酸配列を変更することにより変更される方法を記載する。
このＰＳ４改変体ポリペプチドおよび核酸は、当該分野において公知の任意の方法により産生され得る。特に、これらは、発現システムから発現され得、この発現システムは、本質的に、インビトロまたはインビボであり得る。特に、本発明者らは、ＰＳ４核酸配列を含むプラスミドおよび発現ベクター、好ましくはＰＳ４改変体ポリペプチドを発現し得るものを記載する。このようなＰＳ４核酸、プラスミド、およびベクターを含み、そして好ましくは、これらを用いて形質転換された、細胞および宿主細胞もまた開示され、そしてこれらはまた、本明細書中に包含されることが明らかにされるべきである。
好ましい実施形態では、上記ＰＳ４改変体ポリペプチド配列は、単離された形態で食品添加剤として使用される。用語「単離された」は、少なくとも実質的に、この配列が本質的に結合し、そして本質的に見出される少なくとも一の他の成分がないことを意味する。一つの局面では、好ましくは、この配列は、精製形態である。用語「精製された」は、この配列が比較的純粋な状態（例えば、少なくとも純度約９０％、または少なくとも純度約９５％、または少なくとも純度約９８％）にあることを意味する。
（親酵素）
上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、「親酵素」、「親ポリペプチド」または「親配列」として公知の別の配列に由来するか、またはこれの改変体である。
本明細書中で用いられる場合、用語「親酵素」は、生じた改変体（すなわち、ＰＳ４改変体のポリペプチドまたは核酸）に対して、近い、好ましくは最も近い化学構造を有する酵素を意味する。この親酵素は、前駆体酵素（すなわち、実際に変異を入れられた酵素）であり得るか、またはデノボで調製され得る。この親酵素は、野生型酵素であり得る。
本明細書中で用いられる場合、用語「前駆体」とは、この酵素に先立つ酵素を意味し、この先立つ酵素が改変されてこの酵素が生じる。従って、この前駆体は、変異誘発により改変された酵素であり得る。同様に、この前駆体は、野生型酵素、改変体野生型酵素またはすでに変異した酵素であり得る。
用語「野生型」は、当業者に理解されている技術用語であり、そして天然に存在して変異体の表現型と対照的である種のメンバーのほとんどに特徴的である表現型を意味する。従って、本文脈では、野生型酵素は、関連する種のほとんどのメンバーにおいて、天然に見出される酵素の一形態である。一般的に、本明細書中に記載される改変体ポリペプチドに対して、関連する野生型酵素は、配列相同性の観点から非常に密接に関連した対応する野生型酵素である。しかし、特定の野生型配列が、本明細書中に記載される通りに改変体ＰＳ４ポリペプチドを産生するための基礎として使用される場合、これは、より密接に関連している別の野生型配列の存在に関わらず、アミノ酸配列相同性の観点から、対応する野生型配列である。
親酵素は、好ましくは、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を示すポリペプチドである。好ましくは、この親酵素は、非マルトース産生性エキソアミラーゼそのものである。例えば、この親酵素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非マルトース産生性エキソアミラーゼ（例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ２２９６３を有するポリペプチド）であり得るか、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非マルトース産生性エキソアミラーゼ（例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ１３５０７を有するポリペプチド）であり得る。このＰＳ４ファミリーの他のメンバーは、親酵素として使用され得る（例えば、ＰＳ４ファミリーメンバーは、一般的に、これら２つのいずれかの酵素と類似しているか、相同性があるか、または機能的に等価であり、そして標準的な方法（例えば、プローブを用いた適切なライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングまたはゲノム配列分析）により、同定され得る。
特に、これらの２種類の酵素のいずれかの機能的等価物および「ＰＳ４ファミリー」の他のメンバーはまた、本明細書に記載されるようなＰＳ４改変体ポリペプチドの生成のための開始点または親ポリペプチドとして使用され得る。
あるタンパク質の「機能的等価物」とは、そのタンパク質の１つ以上、好ましくは、実質的に全ての機能を有する物をいう。好ましくは、このような機能は、生物学的機能、好ましくは酵素学的機能（例えば、アミラーゼ活性、好ましくは非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性）である。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非マルトース産生性エキソアミラーゼ（例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ２２９６３を有するポリペプチド）または、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非マルトース産生性エキソアミラーゼ（例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ１３５０７を有するポリペプチド）である親酵素に関して用語「機能的等価物」とは、機能的等価物が、他の供給源から得られ得ることを意味する。機能的等価物である酵素は、種々のアミノ酸配列を有し得るが、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有する。
非常に好ましい実施形態において、上記機能的等価物は、上記のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非マルトース産生性エキソアミラーゼおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非マルトース産生性エキソアミラーゼのいずれか、好ましくは両方に相同な配列を有する。上記機能的等価物は、配列番号１〜１２、好ましくは配列番号１もしくは配列番号７または両方として示される配列のいずれかと相同な配列を有し得る。このような配列間の配列相同性は、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは６５％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。このような配列相同性は、当該分野で公知の多くのコンピュータプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなど）によって作られ得る。このようなアラインメントを実行するための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）。配列比較を達成し得る他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９９同書第１８章）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０を参照のこと）および比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方は、オフライン検索およびオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９９同書、７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが、好ましい。
他の実施形態において、上記機能的等価物は、上記に示される任意の配列に特異的にハイブリダイズし得る。１つの配列が、別の配列にハイブリダイズし得るか否かを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（前出）に記載される。非常に好ましい実施形態において、上記機能的等価物は、ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ３ ｐＨ ７．０｝）下でハイブリダイズし得る。
例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非マルトース産生性エキソアミラーゼおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非マルトース産生性エキソアミラーゼに対して相同な配列を有する機能的等価物は、親酵素としての使用に適切である。このような配列は、任意の１つ以上の位置でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ配列と異なり得る。さらに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の他の株（例えば、ＡＴＣＣ１７６８６）はまた、親ポリペプチドとして使用され得る。ＰＳ４改変体ポリペプチド残基は、上記改変体ＰＳ４ポリペプチド配列を生じるように、任意のこれらの親配列中に挿入され得る。
親酵素は、アミノ酸レベルまたは核酸レベルで改変されて、本明細書に記載されるＰＳ４改変体配列を生じ得る。従って、本発明者らは、非マルトース産生性エキソアミラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中の１つ以上の対応するコドン変更を導入することによって、ＰＳ４改変体ポリペプチドの生成を提供する。
核酸番号付けは、好ましくは、配列番号６として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼヌクレオチド配列の位置の番号付けを参照するべきである。あるいは、またはさらには、参照は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１６７３２を有する配列に対して作成され得る。好ましい実施形態において、上記核酸の番号付けは、配列番号６として示されるヌクレオチド配列を参照するべきである。しかしながら、アミノ酸残基の番号付けのように、上記配列の残基の番号付けは、参照の目的のためにのみ使用されるべきである。特に、上記コドン変更は、任意のＰＳ４ファミリー核酸配列中に作成され得ることが認識される。例えば、配列変更は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ非マルトース産生性エキソアミラーゼ核酸配列またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ非マルトース産生性エキソアミラーゼ核酸配列（例えば、Ｘ１６７３２，配列番号６またはＭ２４５１６，配列番号１２）に対して作成され得る。
親酵素は、「完全な」酵素（すなわち、親酵素が、天然に存在するような（または、変異されたような）その全長の酵素）を含んでもよいし、またはその切断された形態を含んでもよい。従って、このようなものに由来するＰＳ４改変体は、そのように切断されてもよいし、または「全長」であってもよい。上記切断は、Ｎ末端またはＣ末端、好ましくはＣ末端であり得る。親酵素またはＰＳ４改変体は、１つ以上の部分（例えば、部分配列、シグナル配列、ドメインまたは部分（活性があってもなくても）、など）を欠失し得る。例えば、親酵素またはＰＳ４改変体ポリペプチドは、上記のようなシグナル配列を欠失し得る。あるいは、またはさらには、親酵素またはＰＳ４改変体は、１つ以上の触媒ドメインもしくは結合ドメインを欠失し得る。
非常に好ましい実施形態において、上記親酵素またはＰＳ４改変体は、非マルトース産生性エキソアミラーゼ中に存在するドメインのうちの１つ以上（例えば、デンプン結合ドメイン）を欠失し得る。例えば、上記ＰＳ４ポリペプチドは、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ非マルトース産生性エキソアミラーゼの番号付けと関連して、４２９位までの配列のみを有し得る。これは、ＰＳ４改変体である、ｐＳａｃ−ｄ３４、ｐＳａｃ−Ｄ２０およびｐＳａｃ−Ｄ１４についての場合であることは、注意されるべきである。
（アミラーゼ）
ＰＳ４改変体ポリペプチドは、概して、アミラーゼ活性を有する。
用語「アミラーゼ」は、その通常の意味（例えば、とりわけ、デンプンの分解を触媒し得る酵素）で使用される。特に、これらは、デンプン中のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド結合を切断し得るヒドロラーゼである。
アミラーゼは、デンプン分解性酵素であり、ヒドロラーゼとして分類され、これは、デンプン中のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド結合を切断する。一般的に、α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１，α−Ｄ−（１→４）−グルカングルカノヒドロラーゼ）は、ランダム様式でデンプン分子内のα−Ｄ−（１→４）Ｏ−グリコシド結合を切断するエンド作用性酵素として定義される。対照的に、エキソ作用性デンプン分解酵素（例えば、（β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２，α−Ｄ−（１→４）−グルカンマルトヒドロラーゼ））、およびいくつかの産物特異的アミラーゼ様マルトース産生性α−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３３）は、基質の非還元末端からデンプンを切断する。β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０，α−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ）、グルコアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３，α−Ｄ−（１→４）−グルカングルコヒドロラーゼ）、および産物特異的アミラーゼは、デンプンから特異的長さのマルトオリゴ糖を生成し得る。
（非マルトース産生性エキソアミラーゼ）
本明細書中に記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくは非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を示すポリペプチド（またはこれらの改変体）に由来する。好ましくは、これらの親酵素は、非マルトース産生性エキソアミラーゼ自体である。非常に好ましい実施形態におけるＰＳ４改変体ポリペプチド自体はまた、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を示す。
非常に好ましい実施形態において、本明細書中で使用される場合、用語「非マルトース産生性（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）エキソアミラーゼ酵素」は、この酵素が、デンプンを、本明細書中に記載されるような産物決定手順に従って分析されるような実質的な量のマルトースに最初に分解しないことを意味するように用いられるべきである。
非常に好ましい実施形態において、上記非マルトース産生性エキソアミラーゼは、エキソ−マルトテトラヒドロラーゼを含む。エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．６０）は、より正式には、グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼとして公知である。この酵素は、デンプン様多糖中の１，４−α−Ｄ−グルコシド結合を加水分解して、非還元鎖末端から連続的なマルトテトロース残基を除去する。
非マルトース産生性エキソアミラーゼおよびその使用は、米国特許第６，６６７，０６５号およびＷＯ９９／５０３９９に詳細に記載され、これらは、本明細書中に参考として援用される。
（非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性についてのアッセイ）
以下の系は、本明細書に記載される方法および組成物に従う使用に適切な非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有するポリペプチドを特徴づけるために使用される。このシステムは、例えば、本明細書に記載されるＰＳ４親ポリペプチドまたは改変体ポリペプチドを特徴づけるために使用され得る。
初めの背景情報として、ｗａｘｙトウモロコシアミロペクチン（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ，ＦｒａｎｃｅからＷＡＸＩＬＹＳ ２００として入手可能）は、非常に高いアミロペクチン含有量（９０％超）を有するデンプンである。２０ｍｇ／ｍｌのｗａｘｙトウモロコシデンプンは、５０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、２ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ ６．０の緩衝液中で３分間煮沸され、次いで、５０℃でインキュベートされ、そして半時間以内に使用される。
非マルトース産生性エキソアミラーゼの１単位は、上記のように調製された５０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ ６．０中４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのｗａｘｙトウモロコシデンプンとともに試験管中で５０℃にてインキュベートした場合の、１分あたりに１μｍｏｌの還元糖と等価な加水分解産物を放出する酵素の量として定義される。還元糖は、標準物質としてマルトースを使用し、そしてＢｅｒｎｆｅｌｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，（１９５４），１，１４９−１５８のジニトロサリチル酸法または還元糖を定量するための当該分野で公知の別の方法を使用して測定される。
非マルトース産生性エキソアミラーゼの加水分解産物パターンは、上記のように調製した緩衝液中４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのｗａｘｙトウモロコシデンプンとともに、試験管中で５０℃にて、１５分または３００分間０．７単位の非マルトース産生性エキソアミラーゼをインキュベートすることによって決定される。この反応は、沸騰している水槽で３分間試験管を浸すことによって停止される。
加水分解産物は、溶離剤として酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび水を用い、パルス電流検出を用い、そして標準物質としてグルコースからマルトヘプタオースまでの公知の直線マルトオリゴ糖を用いたＤｉｏｎｅｘ ＰＡ １００カラムを使用したアニオン交換ＨＰＬＣによって分析され、そして定量される。マルトオクタオースからマルトデカオースについて使用された応答因子は、マルトヘプタオースに見出される応答因子である。
好ましくは、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、０．７単位量の上記非マルトース産生性エキソアミラーゼが、５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸および２ｍＭの塩化カルシウムを含む１ｍｌの緩衝溶液あたり１０ｍｇの予め煮沸したｗａｘｙトウモロコシデンプン４ｍｌの水溶液中で５０℃の温度、ｐＨ ６．０にて１５分間インキュベートされる場合に上記酵素が、２〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の１つ以上の直線マルト−オリゴ糖および必要に応じてグルコースからなる加水分解産物を生じるように非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有し；その結果、上記加水分解産物の少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％および最も好ましくは少なくとも８５重量％は、３〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の直線マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８個のＤ−グルコピラノシル単位からなる直線マルトオリゴ糖で構成される。
参照の容易さのための、および本発明の目的のための、上記０．７単位量の非マルトース産生性エキソアミラーゼを、５０ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸および２ｍＭの塩化カルシウムを含む１ｍｌの緩衝溶液あたり１０ｍｇの予め煮沸したｗａｘｙトウモロコシデンプン４ｍｌの水溶液中で５０℃の温度、ｐＨ ６．０にて１５分間インキュベートする特徴は、「Ｗａｘｙトウモロコシデンプンインキュベーション試験（Ｗａｘｙ Ｍａｉｚｅ Ｓｔａｒｃｈ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ）」と呼ばれ得る。
従って、代替的に表現すると、非マルトース産生性エキソアミラーゼである好ましいＰＳ４改変体ポリペプチドは、２〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の１つ以上の直線マルト−オリゴ糖および必要に応じてグルコースからなる加水分解産物を生じるためのｗａｘｙトウモロコシデンプンインキュベーション試験における能力を有すると特徴付けられ；その結果、上記加水分解産物のうちの少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％および最も好ましくは少なくとも８５重量％は、３〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の直線マルトオリゴ糖、好ましくは４〜８個のＤ−グルコピラノシル単位からなる直線マルトオリゴ糖で構成される。
ｗａｘｙトウモロコシデンプンのインキュベーション試験における加水分解生成物は、２〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の１種以上の直鎖状マルト−オリゴ糖、および必要に応じてグルコースを含み得る。ｗａｘｙトウモロコシデンプンのインキュベーション試験における加水分解生成物はまた、他の加水分解生成物を含み得る。それにも拘らず、３〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の直鎖状マルトオリゴサッカライドの重量％は、２〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の１種以上の直鎖状マルトオリゴサッカライド、および必要に応じてグルコースからなる加水分解生成物の量に基づく。換言すると、３〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の直鎖状マルトオリゴサッカライドの重量％は、２〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の１種以上の直鎖状マルト−オリゴ糖およびグルコース以外の加水分解生成物の量に基づかない。
上記加水分解生成物は、任意の適切な手段により分析され得る。例えば、上記加水分解生成物は、Ｄｉｏｎｅｘ ＰＡ １００カラムを使用するアニオン交換ＨＰＬＣにより、パルス化電流測定検出で、および例えば、標準物質として、グルコースからマルトヘプタオースまでの公知の直鎖状マルトオリゴサッカライドを使用して、分析され得る。
参照を簡略化するために、および本発明の目的で、Ｄｉｏｎｅｘ ＰＡ １００カラムを使用するアニオン交換ＨＰＬＣにより、パルス化電流測定検出で、および例えば、標準物質として、グルコースからマルトヘプタオースまでの公知の直鎖状マルトオリゴサッカライドを使用して加水分解生成物を分析する特性は、「アニオン交換によって分析する」と称され得る。もちろん、このように、他の分析技術、および他の特定のアニオン交換技術も十分である。
従って、代替的に発現された、好ましいＰＳ４改変体ポリペプチドは、ｗａｘｙトウモロコシデンプンのインキュベーション試験において、２〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の１種以上の直鎖状マルトオリゴサッカライド、および必要に応じてグルコースからなる加水分解生成物を生じる能力を有するような、非マルトース産生性エキソアミラーゼを有するものであり（上記加水分解生成物は、アニオン交換によって分析され得る）；その結果、上記加水分解生成物の、少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％、および最も好ましくは少なくとも８５重量％は、３〜１０個のＤ−グルコピラノシル単位の直鎖状マルトオリゴサッカライドからなり、好ましくは、４〜８個のＤ−グルコピラノシル単位の直鎖状マルトオリゴサッカライドからなる。
本明細書中で使用される場合、用語「直鎖状マルト−オリゴ糖」は、α−（１→４）結合によって結合した、２〜１０単位のα−Ｄ−グルコピラノースを意味するような通常の意味で使用される。
非常に好ましい実施形態において、本明細書中で記載されるＰＳ４ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較された場合、好ましくは同条件下で試験された場合、向上したエキソアミラーゼ活性を有し、好ましくは非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有する。特に、非常に好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくはｗａｘｙトウモロコシデンプン試験において試験された場合、それらの親と比較して１０％以上の、好ましくは２０％以上の、好ましくは５０％以上の、エキソアミラーゼ活性を有する。
上記加水分解生成物は、任意の適切な手段によって分析され得る。例えば、上記加水分解生成物は、Ｄｉｏｎｅｘ ＰＡ １００カラムを使用するアニオン交換ＨＰＬＣにより、パルス化電流測定検出で、および例えば、標準物質として、グルコースからマルトヘプタオースまでの公知の直鎖状マルトオリゴサッカライドを使用して、分析され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「直鎖状マルト−オリゴ糖」は、α−（１→４）結合によって結合した、２〜２０単位のα−Ｄ−グルコピラノースを意味するような通常の意味で使用される。
（向上した特性）
本明細書中で記載されるＰＳ４改変体は、好ましくは、それらの親酵素と比較される場合、向上した特性（例えば、向上した熱安定性、向上したｐＨ安定性、または向上したエキソ特異性のうちのいずれか１つ以上）を有する。
いずれの特定の理論によっても制約されることを望むことなく、本発明者らは、特定の位置における変異は、そのような変異を含むポリペプチドの特性に対する、個々の効果および累積の効果を有すると考える。従って、例えば、本発明者らは、１３４位、１４１位、１５７位、２２３位、３３４位、および必要に応じて１７８位もしくは１７９位、またはその両方は、そのような変化を含むＰＳ４ポリペプチドの熱安定性に影響を与えると考える。特に、および好ましくは、上向きの効果または有用な効果は、これらの位置、特に存在する場合、１３４Ｒ、１４１Ｐ、１５７Ｌ、２２３Ａ、３０７Ｌ、３３４Ｐ、１７８Ｆおよび１７９Ｔの置換に存在する。
他方、本発明者らは、３０７位および１２１位は、ＰＳ４ポリペプチドのエキソ特異性対して効果（好ましくは上向きの効果）を有すると考える。
（熱安定性およびｐＨ安定性）
好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、熱安定性であり；好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、その親酵素よりも高い熱安定性を有する。
コムギおよび他の穀物において、アミロペクチン中の外部側鎖は、ＤＰ１２〜１９の範囲である。従って、例えば、記載されたような非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４改変体ポリペプチドによるアミロペクチン側鎖の酵素的加水分解は、それらの結晶化傾向を顕著に低下し得る。
パンを焼く目的で使用される小麦および他の穀物中のデンプンは、アミラーゼによる酵素攻撃に対して一般的に耐性である、デンプン顆粒の形態で存在する。従って、デンプンの改変は、主に、損傷されるデンプンに限定され、そして生地の加工および最初のパン焼成の間、糊化が約６０℃で始まるまで、非常にゆっくりと進行する。その結果として、高程度の熱安定性を有するアミラーゼのみが、デンプンをパン焼成の間に効率的に改変し得る。そして一般的に、アミラーゼの効率は、熱安定性が増加するに伴って増加される。これは、酵素がより熱安定であるほど、その酵素はより長時間パン焼成の間に活性であり得るからであり、それによって、より防腐性の効果をその酵素は提供する。
従って、本明細書中で記載されるようなＰＳ４改変体ポリペプチドの使用は、食品への加工の任意の段階（例えば、パンを焼成する前後）でデンプンに加えられる場合、劣化を遅延させるか、または妨害し得るか、または減速させ得る。このような使用は、以下にさらに詳細に記載される。
本明細書中で使用される場合、用語「熱安定性」は、酵素が高温への曝露後に活性を保持する能力に関する。好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、約５５℃〜約８０℃以上の温度においてデンプンを分解し得る。適切には、上記酵素は、約９５℃までの温度への曝露の後に、その活性を保持する。
非マルトース産生性エキソアミラーゼのような酵素の熱安定性は、その半減期によって測定される。従って、本明細書中で記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドは、好ましくは５５℃〜約９５℃以上の高温にて、好ましくは約８０℃にて、親酵素に対して、好ましくは１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％またはそれ以上延長された半減期を有する。
本明細書中で使用される場合、半減期（ｔ１／２）は、酵素活性の半分が規定された熱条件下で不活化される時間（分）である。好ましい実施形態において、半減期は、８０℃でアッセイされる。好ましくは、サンプルは、１〜１０分間、８０℃以上で加熱される。次いで、半減期の値は、本明細書中で記載される任意の方法で、残りのアミラーゼ活性を測定することによって計算される。好ましくは、半減期アッセイは、実施例でより詳細に記載されたように実施される。
好ましくは、本明細書中で記載されたＰＳ４改変体は、パン焼成の間活性であり、そして約５５℃の温度で始まるデンプン顆粒の糊化の間およびその後に、デンプンを加水分解する。非マルトース産生性アミラーゼがより熱安定であるほど、それはより長時間パン焼成の間に活性であり得、従って、より防腐性の効果をその酵素は提供する。しかし、約８５℃の温度以上でのパン焼成の間、酵素不活化が起こり得る。これが起こる場合、非マルトース産生性エキソアミラーゼは、徐々に不活化され得、その結果、最終的なパンのパン焼成加工の後に実質的に不活性となる。従って、好ましくは、記載されたような使用に適切な非マルトース産生性エキソアミラーゼは、５０℃より上〜９８℃より下の最適温度を有する。
本明細書中で記載されたＰＳ４改変体の熱安定性は、タンパク質工学を使用することによって向上されてより熱安定になり得、従って、本明細書中で記載された使用により適切である；従って、本発明者らは、タンパク質工学によってより熱安定となるように改変されたＰＳ４改変体の使用を包含する。
好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、ｐＨ安定である；より好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、その同族の親ポリペプチドよりも高いｐＨ安定性を有する。本明細書中で使用される場合、用語「ｐＨ安定」は、酵素が広範囲のｐＨにわたって活性を保持する能力に関する。好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、約５〜約１０．５のｐＨにおいてデンプンを分解し得る。１つの実施形態において、ｐＨ安定性の程度は、特定のｐＨ条件において、酵素の半減期を測定することによってアッセイされ得る、別の実施形態において、ｐＨ安定性の程度は、特定のｐＨ条件において、酵素の活性または比活性を測定することによってアッセイされ得る。特定のｐＨ条件は、ｐＨ５〜ｐＨ１０．５の任意のｐＨであり得る。
従って、ＰＳ４改変体ポリペプチドは、同一の条件下で親ポリペプチドと比較される場合、（アッセイに依存して）より長い半減期、またはより高い活性を有し得る。ＰＳ４改変体ポリペプチドは、同一のｐＨ条件下でそれらの親ポリペプチドと比較される場合、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％またはそれより長い半減期を有し得る。あるいは、またはさらに、それらは、同一のｐＨ条件下でそれらの親ポリペプチドと比較される場合、そのような高い活性を有し得る。
（エキソ特異性）
いくつかの非マルトース産生性エキソアミラーゼは、ある程度のエンドアミラーゼ活性を有し得ることが公知である。いくつかの場合、この型の活性は、低下されるかまたは排除されることが必要とされ得る。なぜなら、エンドアミラーゼ活性は、分枝デキストリンの蓄積に起因して、粘着性またはゴム質のパンの中身を生成することによって最終的なパン製品の品質に悪影響を与え得る可能性があるからである。
エキソ特異性は、通常、全体的なエンドアミラーゼ活性に対する全体的なアミラーゼ活性の割合を決定することによって、測定され得る。この割合は、本明細書中で、「エキソ特異性指数」と称される。好ましい実施形態において、酵素は、２０以上のエキソ特異性指数を有する場合、すなわち、その全体的なアミラーゼ活性（エキソアミラーゼ活性を含む）がそのエンドアミラーゼ活性よりも２０倍以上大きい場合、エキソアミラーゼであると考えられる。非常に好ましい実施形態において、エキソアミラーゼのエキソ特異性指数は、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、または１００以上である。非常に好ましい実施形態において、エキソ特異性指数は、１５０以上、２００以上、３００以上、または４００以上である。
全体的なアミラーゼ活性およびエンドアミラーゼ活性は、当該分野で公知の任意の手段によって測定され得る。例えば、全体的なアミラーゼ活性は、デンプン基質から遊離した還元末端の合計数をアッセイすることによって測定され得る。あるいは、ベタミル（Ｂｅｔａｍｙｌ）アッセイの使用は、実施例にさらに詳細に記載され、便宜上、実施例でアッセイされたようなアミラーゼ活性は、表および図において「ベタミル単位」の用語で記載される。
エンドアミラーゼ活性は、Ｐｈａｄｅｂａｓ Ｋｉｔ（ＰｈａｒｍａｃｉａおよびＵｐｊｏｈｎ）を使用することによって、アッセイされ得る。これは、青色に標識された架橋デンプン（アゾ色素で標識されている）を利用する；デンプン分子の内部の切断のみが、標識を放出し、他方外部の切断は、標識を放出しない。色素の放出は、分光測光法によって測定され得る。従って、Ｐｈａｄｅｂａｓ Ｋｉｔにより、エンドアミラーゼ活性を測定し、便宜上、（実施例に記載される）そのようなアッセイの結果は、本明細書中で「Ｐｈａｄｅｂａｓ単位」と称される。
従って、非常に好ましい実施形態において、エキソ特異性指数は、ベタミル（Ｂｅｔａｍｙｌ）単位／Ｐｈａｄｅｂａｓ単位の用語で表される。
エキソ特異性はまた、先行技術（例えば、本発明者らの国際特許公開番号ＷＯ９９／５０３９９）に記載される方法に従って、アッセイされ得る。これは、エキソアミラーゼ活性に対するエンドアミラーゼ活性の比率によって、エキソ特異性を測定する。従って、好ましい局面において、本明細書中に記載されるＰＳ４改変体は、エキソアミラーゼ活性１単位あたり、０．５未満のエンドアミラーゼ単位（ＥＡＵ）を有する。好ましくは、本発明に従う使用に適切な非マルトース産生性エキソアミラーゼは、エキソアミラーゼ活性１単位あたり、０．０５未満のＥＡＵを有し、より好ましくは、エキソアミラーゼ活性１単位あたり、０．０１未満のＥＡＵを有する。
本明細書中に記載のＰＳ４改変体は、好ましくはエキソ特異性を有し、本エキソ特異性は、例えば、それらがエキソアミラーゼであることと合わせて、上に記載されるようなエキソ特異性指数によって測定される。さらに、ＰＳ４改変体は、それらが由来する親の酵素またはポリペプチドと比較された場合、好ましくはより高いエキソ特異性かまたはより上昇したエキソ特異性を有する。従って、例えば、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、それらの親のポリペプチドと比較された場合、好ましくは同一の条件下で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、またはより高いエキソ特異性指数を有し得る。上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、それらの親のポリペプチドと比較した場合、好ましくは同一の条件下で、１．５×以上、２×以上、５×以上、１０×以上、５０×以上、１００×以上のエキソ特異性指数を有し得る。
（ＰＳ４改変体のポリペプチドおよび核酸の使用）
上記ＰＳ４改変体のポリペプチド、核酸、宿主細胞、発現ベクターなどは、アミラーゼが使用され得る任意の適用において、使用され得る。特に、これらは、任意の非マルトース産生性エキソアミラーゼを置換するために使用され得る。これらは、単独でも、あるいは他の公知のアミラーゼまたは非マルトース産生性エキソアミラーゼと組み合わせても、アミラーゼ活性または非マルトース産生性エキソヌクレアーゼ活性を補完するために使用され得る。
本明細書中に記載されるＰＳ４改変体配列は、食品産業（例えば、パン製品および飲料製品）における種々の適用において使用され得、これらはまた、例えば薬学的組成物としての他の適用において、または化学工業における適用においてさえも、使用され得る。特に、上記ＰＳ４改変体のポリペプチドおよび核酸は、パン焼成（ｂａｋｉｎｇ）（ＷＯ ９９／５０３９９において開示される）および小麦粉の標準化（体積の増大または体積の改良）を含む、種々の産業的適用に有用である。これらを使用して、デンプンおよび他の基質からマルトテトラオースを生成し得る。
上記ＰＳ４改変体ポリペプチドを使用して、パン製品（例えば、パン）の体積を増大し得る。いかなる特定の理論によっても束縛されることを望まないが、本発明者らは、このことは、エキソアミラーゼがアミロース分子を短縮することの結果として、加熱（例えば、パン焼成）する間に生地の粘度が減少することから生じると考える。このことは、発酵によって生じる二酸化炭素が、ほとんど障害を伴わずにパンの大きさを増大することを可能にする。
従って、ＰＳ４改変体ポリペプチドを含むかまたはＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品は、そのように処理されていない食品または親のポリペプチドで処理された食品と比較した場合、体積が増す。つまり、上記食品は、食品の体積あたり、空気体積が大きい。あるいは、またはさらに、ＰＳ４改変体ポリペプチドで処理された食品は、体積の比あたりの密度または重量（もしくは質量）が低い。特に好ましい実施形態において、上記ＰＳ４改変体ポリペプチドを使用して、パンの体積を増大し得る。体積の増大または拡大は有益である。なぜなら、食品の粘着性またはデンプン質を減少させるからである。軽食は、消費者によって好まれ、消費者の経験は増強される。好ましい実施形態において、ＰＳ４改変体ポリペプチドの使用は、上記体積を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％以上増大する。
食品の体積を増加させるためのＰＳ４改変体ポリペプチドの使用は、実施例において詳細に記載される。
（食品での用途）
本明細書中に記載されるＰＳ４改変体のポリペプチドおよび核酸は、食品として、または食品の調製の際に、使用され得る。特に、これらは食品に（すなわち、食品添加剤として）添加され得る。用語「食品（ｆｏｏｄ）」は、調製食品、および食品の成分（例えば、小麦粉）の両方を含むことが意図される。好ましい局面において、上記食品は、ヒトによる消費のためである。上記食品は、溶液の形態であり得るか、固体であり得、これは、用途および／または適用様式および／または投与様式に依存する。
上記ＰＳ４改変体のポリペプチドおよび核酸は、食品成分として使用され得る。本明細書中で使用される場合、用語「食品成分」は、機能性食品または食料品に添加されるか、あるいは添加され得る処方物を包含する。用語「食品成分」は、例えば、酸化または乳化に必要とされる多種多様な製品中で低いレベルにおいて使用され得る処方物を包含する。上記食品成分は、溶液の形態であり得るか、固体であり得、これは、用途および／または適用様式および／または投与様式に依存する。
本明細書中で開示されるＰＳ４改変体のポリペプチドおよび核酸は、食品サプリメントであり得るか、または食品サプリメントに添加され得る。本明細書中で開示されるＰＳ４改変体のポリペプチドおよび核酸は、機能性食品であり得るか、または機能性食品に添加され得る。本明細書中で使用される場合、用語「機能性食品」は、栄養効果および／または味覚の満足を提供し得るだけでなく、消費者に対してさらなる有益な効果を送達し得る、食品を意味する。機能性食品の法律上の規定はないが、この領域に関心を有する団体の大部分は、機能性食品が、特定の健康効果を有するものとして市販される食品であることに同意する。
上記ＰＳ４改変体ポリペプチドはまた、食品または食料品を製造する際にも、使用され得る。代表的な食料品としては、乳製品、肉製品、鶏肉製品、魚製品、および生地製品が挙げられる。上記生地製品は、任意の処理された生地製品（フライにした（ｆｒｉｅｄ）生地、揚げた（ｄｅｅｐ ｆｒｉｅｄ）生地、あぶった（ｒｏａｓｔｅｄ）生地、焼いた（ｂａｋｅｄ）生地、蒸した（ｓｔｅａｍｅｄ）生地およびゆでた（ｂｏｉｌｅｄ）生地（例えば、蒸しパンおよびライスケーキ）を含む）であり得る。非常に好ましい実施形態において、上記食品は、パン製品である。
好ましくは、上記食料品は、パン製品である。代表的なパン（焼いた）製品は、パン（例えば、パン、ロール、バン、ピザ生地など、ペイストリー、プレッツェル、トルティーヤ、ケーキ、クッキー、ビスケット、クラッカーなど）が挙げられる。
（老化（ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ）／老化（ｓｔａｌｉｎｇ））
本発明者らは、デンプン媒体（例えば、デンプンゲル）の老化を遅延させ得るＰＳ４改変体タンパク質の使用を記載する。上記ＰＳ４改変体ポリペプチドは、特に、デンプンの有害な老化を遅延させ得る。
大部分のデンプン顆粒は、２種のポリマー（実質的に直鎖状のアミロースおよび高度に分岐したアミロペクチン）の混合物から構成される。アミロペクチンは、（１−４）結合によって連結されたα−Ｄ−グルコピラノシル単位の鎖からなる、非常に大きな分岐した分子であって、ここで上記鎖は、α−Ｄ−（１−６）結合によって結合されて分岐を形成する。アミロペクチンは、すべての天然のデンプン中に存在し、もっとも一般的なデンプンの約７５％を構成する。アミロースは、α−Ｄ−（１−６）分岐をほとんど含まない、（１−４）結合型α−Ｄ−グルコピラノシル単位の本質的に直鎖状の鎖である。大部分のデンプンは、約２５％のアミロースを含む。
水の存在下で加熱されたデンプン顆粒は、ゲル化と呼ばれる秩序−無秩序相転移（ｏｒｄｅｒ−ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を受け、ここで液体は、膨張した顆粒によって取り込まれる。ゲル化温度は、異なるデンプンについて異なる。新しく焼成されたパンを冷却すると、アミロース画分が、数時間以内に老化して網目構造を生じる。このプロセスは、低い程度の堅さを有しスライス特性が改良された所望のパン構造を生み出す点において有益である。より徐々にアミロペクチンの結晶化が、パン焼成の後の日の間、ゲル化したデンプン顆粒の中で生じる。このプロセスにおいて、アミロペクチンは、デンプン顆粒が包埋されるアミロース網目構造を強化すると考えられる。この強化は、パン粉の堅さを増加させる。この強化は、パンの老化の主な原因の一つである。
焼成された製品（ｂａｋｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）の質は、保管する間に徐々に悪化することが公知である。デンプンの再結晶化（老化とも呼ばれる）の結果として、パン粉の保水力は、感能特性および食事特性と重要に関連して変化する。パン粉は、柔らかさおよび弾力性を失い、堅くかつもろくなる。パン粉の堅さの増大は、パンの老化プロセスの尺度として使用される場合が多い。
アミロペクチンの有害な老化の速度は、アミロペクチンの側鎖の長さに依存する。従って、例えば、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４改変体ポリペプチドによる、アミロペクチン側鎖の酵素的加水分解は、それらの結晶化傾向を著しく減少させ得る。
従って、本明細書中に記載のＰＳ４改変体ポリペプチドの使用は、デンプンを食品へと加工する任意の段階においてデンプン中に添加される（例えば、パン焼成の間またはパン焼成の後にパンに添加される）場合、老化を遅延し得るか、または妨げ得るか、遅らせ得る。このような使用は、下記にさらに詳細に記載される。
（老化（ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ）（老化（ｓｔａｌｉｎｇ）を含む）の測定のためのアッセイ）
本明細書中に記載される非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４改変体ポリペプチドの老化防止効果を評価するために、パン粉の堅さが、Ｉｎｓｔｒｏｎ ４３０１ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｆｏｏｄ Ｔｅｘｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｚｅｒまたは当該分野で公知の同様の機器によって、パン焼成の１日後、３日後、および７日後に測定され得る。
当該分野で伝統的に使用され、そして非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有するＰＳ４改変体ポリペプチドのデンプン老化に対する効果を評価するために使用される別の方法は、ＤＳＣ（示差走査熱量分析）に基づく。ここで、酵素と一緒にか、または酵素なしで（コントロール）パン焼成されたモデル系生地由来のパンのパン粉またはパン粉における老化したアミロペクチンの融解エンタルピーが、測定される。記載される実施例において使用されるＤＳＣ機器は、２０℃から９５℃まで１分間あたり１０℃の温度勾配で運転するＭｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ ８２０である。サンプルの調製のために、１０〜２０ｍｇのパン粉が測量され、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏアルミニウムパンに移され、次いで、密封してシールされる。
記載される実施例において使用されるモデル系生地は、標準的な小麦粉と、最適な量の水または緩衝液とを、非マントース産生性ＰＳ４改変体エキソアミラーゼを含むか、もしくは含まずに含む。これらは、１０ｇまたは５０ｇのＢｒａｂｅｎｄｅｒ Ｆａｒｉｎｏｇｒａｐｈ中で、それぞれ６分間または７分間混合される。生地のサンプルは、蓋付きのガラスの試験チューブ（１５＊０．８ｃｍ）中に配置される。これらの試験チューブは、水浴中で以下のパン焼成プロセスに供される；３３℃で３０分間のインキュベーションから開始し、続いて、１．１℃／分の勾配で３３℃から９５℃まで加熱し、そして最後に９５℃で５分間のインキュベーションする。続いて、そのチューブは、ＤＳＣ分析の前に、２０℃のサーモスタットに保管される。
好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるＰＳ４改変体は、コントロールと比較して融解エンタルピーが減少している。非常に好ましい実施形態において、上記ＰＳ４改変体は、１０％以上減少した融解エンタルピーを有する。好ましくは、上記ＰＳ４改変体は、コントロールと比較した場合、２０％以上、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上減少した融解エンタルピーを有する。
Figure 0004637835
 （表２）
上記の表２は、７日間の保管の後に異なる用量のＰＳａｃ−Ｄ３４で調製されたモデル生地系のＤＳＣ値を示す。０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、および２ｐｐｍ（またはｍｇ／ｇ）の小麦が、試験される。
（デンプン生成物の調製）
本発明者らは、食品、特にデンプン生成物の調製におけるＰＳ４改変体ポリペプチドの使用を提供する。この方法は、非マルトース産生性エキソアミラーゼ酵素（例えば、ＰＳ４改変体ポリペプチド）をデンプン媒体に添加することによりデンプン生成物を形成する工程を包含する。デンプン媒体が、生地である場合、その生地は、小麦粉、水、非マルトース産生性エキソアミラーゼ（これは、ＰＳ４改変体ポリペプチドである）および必要に応じて他の可能な成分および添加剤を混合することにより調製される。
用語「デンプン」は、デンプン自体またはその成分、特にアミロペクチンを意味するととられるべきである。用語「デンプン媒体」は、デンプンを含有する任意の適切な培地を意味する。用語「デンプン生成物」は、デンプンを含むか、デンプンに基づくか、デンプンに由来する任意の生成物を意味する。好ましくは、このデンプン生成物は、小麦粉から得たデンプンを含むか、それに基づくか、それに由来する。用語「小麦粉」は、本明細書中で使用される場合、細かくすりつぶした、小麦または他の穀類の食物と同義語である。しかし、好ましくは、この用語は、別の穀類ではなく、小麦自体から得られた小麦粉を意味する。従って、他に表現されない場合、「小麦粉」に対する言及は、本明細書中で使用される場合、好ましくは、小麦粉自体に対する言及ならびに培地に存在する小麦粉（例えば、生地）に対する言及を意味する。
好ましい小麦粉は、小麦粉もしくはライ麦粉、または小麦粉とライ麦粉との混合物である。しかし、他の型の穀類（例えば、稲、トウモロコシ、大麦およびアズキモロコシ）に由来する粉末を含む生地もまた、企図される。好ましくは、このデンプン生成物は、パン製品（ｂａｋｅｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）である。より好ましくは、このデンプン生成物は、パン製品（ｂｒｅａｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）である。さらにより好ましくは、このデンプン生成物は、焼いたデンプン質のパン製品である。用語「焼いたデンプン質のパン製品」とは、小麦粉、水および発酵剤を、生地を形成する条件下で混合することにより得られる生地に基づいた任意の焼いた製品である。さらなる成分が、当然のことながらこの生地混合物に添加され得る。
従って、このデンプン生成物が、焼いたデンプン質のパン製品である場合、そのプロセスは、小麦粉、水および発酵剤を、生地を形成する条件下で任意の適切な順序で混合する工程、さらに、必要に応じてプレミックスの形態で、ＰＳ４改変体ポリペプチドを添加する工程を包含する。この発酵剤は、化学的発酵剤（例えば、重炭酸ナトリウム）またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン製造業者の酵母）の任意の株であり得る。
ＰＳ４改変体非マルトース産生性エキソアミラーゼは、水または生地成分混合物を含む任意の生地成分と一緒に、または任意の添加剤もしくは添加剤混合物と一緒に添加され得る。この生地は、パン産業または小麦粉生地に基づいた製品を製造する他の産業で一般的な任意の従来の生地調製方法により調製され得る。
デンプン質のパン製品（例えば、白パン、ふるいにかけたライ麦および小麦粉から製造したパン、ロールパンなど）を焼く工程は代表的に、１８０℃〜２５０℃の範囲のオーブン温度で、約１５分間〜６０分間パン生地を焼く工程により達成される。焼くプロセスの間、急速な温度勾配（２００℃→１２０℃）は、外部生地層に広がり、そこに、焼いた製品の特徴的な堅い皮が形成される。しかし、蒸気発生に起因する熱の消費によって、パンの中身の温度は、焼くプロセスの終了時に、１００℃近くにしかならない。
従って、本発明者らは、以下を包含するパン製品を製造するためのプロセスを記載する：（ａ）デンプン媒体を提供する工程；（ｂ）このデンプン媒体に、本明細書中に記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドを添加する工程；および（ｃ）パン製品を製造するために、工程（ｂ）の間および後にこのデンプン媒体を加熱する工程。本発明者らはまた、デンプン媒体に、記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドを添加する工程を包含するパン製品を製造するためのプロセスを記載する。
非マルトース産生性エキソアミラーゼＰＳ４改変体ポリペプチドは、単独の活性成分として酵素を含有するか、または一種以上のさらなる生地成分または生地添加剤との混合物中に酵素を含有する液体調製物として、または乾燥微粉組成物として添加され得る。
（改良組成物）
本発明者らは、パン改良組成物および生地改良組成物を含む改良組成物を記載する。これらは、必要に応じて、さらなる成分もしくはさらなる酵素またはその両者を一緒にＰＳ４改変体ポリペプチドに含む。
本発明者らはまた、パン焼成におけるパン改良組成物および生地改良組成物の使用を提供する。さらなる局面において、本発明者らは、パン改良組成物または生地改良組成物から得たパン製品または生地を提供する。別の局面において、本発明者らは、パン改良組成物または生地改良組成物の使用から得たパン製品または生地を記載する。
（生地調製）
生地は、小麦粉、水、（上記の）ＰＳ４改変体ポリペプチドならびに必要に応じて他の成分および添加剤を含有する生地改良組成物を混合することにより調製され得る。
この練粉改良組成物は、小麦粉、水または必要に応じて他の成分もしくは添加剤を含む任意の生地成分と一緒に添加され得る。この練粉改良組成物は、小麦粉、水または必要に応じて他の成分および添加剤の前に、添加され得る。この生地改良組成物は、小麦粉または水、または必要に応じて他の成分および添加剤の後に、添加され得る。この生地は、パン産業または小麦粉生地ベースの製品を製造する任意の他の産業で一般的な任意の従来の生地調製方法により調製され得る。
この生地改良組成物は、単独の活性成分として、または一種以上の他の生地成分または添加剤との混合物中に上記組成物を含む液体調製物としてまたは乾燥粉末組成物の形態で添加され得る。
添加されるＰＳ４改変体ポリペプチド非マルトース産生性エキソアミラーゼの量は、通常、小麦粉１ｋｇあたり５０〜１００，０００単位、好ましくは小麦粉１ｋｇあたり１００〜５０，０００単位の、完成した生地中の存在を生じる量である。好ましくは、その量は、小麦粉１ｋｇあたり２００〜２０，０００単位の範囲である。
本発明の文脈において、１単位の非マルトース産生性エキソアミラーゼは、５０℃で、後述する５０ｍＭ ＭＥＳ、２ｍＭ 塩化カルシウム、ｐＨ６．０中４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのｗａｘｙトウモロコシデンプンとともに試験管でインキュベートされる場合の１分間あたり１μｍｏｌの還元糖に相当する加水分解産物を放出する酵素の量として定義される。
本明細書中で記載される生地は概して、小麦全粒または小麦粉および／または他の型のミール、小麦粉、デンプン（例えば、トウモロコシ粉（ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ）、トウモロコシデンプン、トウモロコシ粉（ｍａｉｚｅ ｆｌｏｕｒ）、米粉、ライ麦ミール、ライ麦粉、オート麦粉、オートミール、大豆粉、サトウモロコシミール、サトウモロコシ粉、ジャガイモミール、ジャガイモ粉またはジャガイモデンプン）を含む。この生地は、新鮮なもの、凍結したものまたは一部焼いたものであり得る。
この生地は、発酵した生地または発酵に供されるべき生地であり得る。この生地は、種々の方法（例えば、化学発酵剤（例えば、重炭酸ナトリウム）を添加することにより、または発酵したもの（発酵した生地）を添加することにより）で発酵され得るが、適切な酵母培養物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン製造業者の酵母）（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの市販される株））を添加することにより生地を発酵することが好ましい。
この生地は、脂肪（例えば、顆粒状脂肪またはショートニング）を含み得る。この生地は、乳化剤（例えば、モノグリセリドまたはジグリセリド、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のポリグリセロールエステル、モノグリセリドの脂肪酸エステル、モノグリセリドの酢酸エステル、ポリオキシエチレンステアレートまたはリソレシチン）をさらに含み得る。
本発明者らはまた、小麦粉を、本明細書中に記載される組合せと一緒に含むプレミックスを記載する。このプレミックスは、他の生地改良添加剤および／またはパン改良添加剤（例えば、本明細書中で述べた、酵素を含む任意の添加剤）を含み得る。
（さらなる生地添加剤または成分）
焼いた製品の特性をさらに改良し、焼いた製品に特有の品質を与えるために、さらなる生地成分および／または生地添加剤が、生地中に組み込まれ得る。代表的に、このようなさらなる添加された成分は、生地成分（例えば、塩、穀物、脂肪および油、糖またはスイートバー（ｓｗｅｅｔｂｅｒ）、食餌繊維、タンパク質供給源（例えば、粉乳）、グルテン、大豆または卵）および生地添加剤（例えば、乳化剤、他の酵素、親水コロイド、矯味矯臭剤、酸化剤、ミネラルおよびビタミン））を含み得る。
乳化剤は、生地強化剤およびパンの軟化剤として有用である。生地強化剤として、乳化剤は、静止時間に関して許容性および加工の間の衝撃に対する許容性を提供し得る。さらに、生地強化剤は、所定の生地の許容性を発酵時間中、改変物に改良する。ほとんどの生地強化剤はまた、オーブンスプリングを改良し、これは、プルーフした商品から焼いた商品への体積の増加を意味する。最後に、生地増強剤は、レシピ混合物に存在する任意の脂肪を乳化する。
適した乳化剤としては、レシチン、ポリオキシエチレンステアレート、食用脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリド、食用脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの酢酸エステル、食用脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドの乳酸エステル、食用脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのクエン酸エステル、食用脂肪酸のモノグリセリドおよびジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、食用脂肪酸のショ糖エステル、ステアロイル−２−ラクチレートナトリウムおよびステアロイル−２−ラクチレートカルシウムが挙げられる。
さらなる生地添加剤または成分は、小麦粉、水または任意の他の成分もしくは添加剤、または生地改良組成物を含む任意の生地成分と一緒に添加され得る。さらなる生地添加剤または成分は、小麦粉、水、任意の他の成分もしくは添加剤または生地改良組成物の前に添加され得る。さらなる生地添加剤または成分は、小麦粉、水、任意の他の成分もしくは添加剤または生地改良組成物の後に添加され得る。
さらなる生地添加剤または成分は、好都合なことに、液体調製物であり得る。しかし、さらなる生地添加剤または成分は、好都合なことに、乾燥組成物の形態であり得る。
好ましくは、さらなる生地添加剤または成分は、生地の小麦粉成分の少なくとも１重量％である。より好ましくは、さらなる生地添加剤または成分は、少なくとも２％、好ましくは少なくとも３％、好ましくは少なくとも４％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも６％である。添加剤が脂肪である場合、代表的に、脂肪は、１〜５％、代表的に１〜３％、より代表的には、約２％の量で存在し得る。
（さらなる酵素）
ＰＳ４改変体ポリペプチドに加えて、一種以上のさらなる酵素が使用され得、例えば、食品、生地調製物、食品原料またはデンプン組成物に添加され得る。
生地に添加され得るさらなる酵素としては、酸化還元酵素、ヒドロラーゼ（例えば、リパーゼ、エステラーゼ）およびグリコシダーゼ様α−アミラーゼ、プルラナーゼ、ならびにキシラナーゼが挙げられる。酸化還元酵素（例えば、グルコース酸化酵素およびヘキソース酸化酵素）は、生地強化および焼いた製品の体積の制御のために使用され得、キシラナーゼおよび他のヘミセルラーゼは、生地取り扱い特性、パンの柔らかさおよびパンの体積を改良するために添加され得る。リパーゼは、生地の強化剤およびパンの軟化剤として有用であり、α−アミラーゼおよび他のデンプン分解酵素は、パンの体積を制御するためおよびパンの固さを減少するために生地に組み入れられ得る。
使用され得るさらなる酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、デンプン分解酵素、プロテアーゼ、リポキシゲナーゼからなる群より選択され得る。
有用な酸化還元酵素の例としては、マルトース酸化酵素、グルコース酸化酵素（ＥＣ １．１．３．４）、炭水化物酸化酵素、グリセロール酸化酵素、ピラノース酸化酵素、ガラクトース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．１０）およびヘキソース酸化酵素（ＥＣ１．１．３．５）が挙げられる。
デンプン分解酵素のうち、アミラーゼは、生地改良添加剤として特に有用である。α−アミラーゼは、デンプンをデキストリンに分解し、これはさらに、β−アミラーゼによってマルトースに分解される。生地組成物に添加され得る他の有用なデンプン分解酵素としては、グルコアミラーゼおよびプルラナーゼが挙げられる。
好ましくは、さらなる酵素は、少なくともキシラナーゼおよび／または少なくともアミラーゼである。用語「キシラナーゼ」とは、本明細書中で使用される場合、キシロース（ｘｙｌｏｓｉｄｉｃ）連結を加水分解するキシラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．３２）をいう。
用語「アミラーゼ」とは、本明細書中で使用される場合、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）、β−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）およびγ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）のようなアミラーゼをいう。
さらなる酵素は、小麦粉、水もしくは任意の他の成分または添加剤、あるいは生地改良組成物を含む任意の生地成分と一緒に添加され得る。さらなる酵素は、小麦粉、水および必要に応じて他の成分および添加剤または生地改良組成物の前に添加され得る。さらなる酵素は、小麦粉、水および必要に応じて他の成分および添加剤または生地改良組成物の後に添加され得る。さらなる酵素は、便利には、液体調製物であり得る。しかし、この組成物は、便利には、乾燥組成物の形態であり得る。
生地改良組成物のいくつかの酵素は、小麦粉生地のレオロジー特性および／または処理可能特性ならびに／あるいはこの酵素により生地から作製された生成物の品質の改良に対する効果が、相加的であるだけでなく、この効果が相乗的である程度まで、生地条件下で、互いと相互作用し得る。
生地から作製される生成物（最終生成物）の改良に関連して、この組み合わせは、パン粉構造（ｃｒｕｍｂ ｓｔｒｕｃｔｏｒｅ）に関して実質的な相乗効果を生じることが見出され得る。また、特定容量の焼成された生成物に関して、相乗的効果が見出され得る。
さらなる酵素は、カルボン酸エステル結合を加水分解してカルボキシレートを放出し得るリパーゼ（ＥＣ ３．１．１）であり得る。リパーゼの例としては、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ ３．１．１．３）、ガラクトリパーゼ（ＥＣ ３．１．１．２６）、ホスホリパーゼ Ａ１（ＥＣ ３．１．１．３２）、ホスホリパーゼ Ａ２（ＥＣ ３．１．１．４）およびリポタンパク質リパーゼＡ２（ＥＣ ３．１．１．３４）が挙げられるが、これらに限定されない。
（アミラーゼの組み合わせ）
本発明者らは、ＰＳ４改変体ポリペプチドとアミラーゼ（特に、マルトース産生性アミラーゼ）との特定の組み合わせを開示する。マルトース産生性α−アミラーゼ（グルカン １，４−ａ−マルトヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３３）は、アミロースおよびアミロペクチンをマルトースに、α−構成で加水分解することが可能である。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ（ＥＰ １２０ ６９３）からのマルトース産生性α−アミラーゼは、商品名ノバミル（Ｎｏｖａｍｙｌ）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）で市販され、デンプンの劣化を減少させるその能力に起因して、老化防止（ａｎｔｉ−ｓｔａｌｉｎｇ）剤としてパン焼成工業において幅広く使用されている。ノバミル（Ｎｏｖａｍｙｌ）は、国際特許公報ＷＯ９１／０４６６９に詳細に記載される。マルトース産生性α−アミラーゼであるノバミル（Ｎｏｖａｍｙｌ）は、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）といくつかの特性を共有し、配列相同性（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ，Ｂａｉｒｏｃｈ Ａ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１６，６９５−６９６（１９９６））およびトランスグリコシル化生成物の形成（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ，Ｃ．，ら，１９９７，Ｓｔａｒｃｈ，５０巻、Ｎｏ．１，３９−４５）を含む。
非常に好ましい実施形態において、本発明者らは、ノバミル（Ｎｏｖａｍｙｌ）または任意のその改変体と一緒にＰＳ４改変体ポリペプチドを含む組み合わせを開示する。このような組み合わせは、ベーキングのような食品生産に有用である。ノバミル（Ｎｏｖａｍｙｌ）は、特に、ノバミル（Ｎｏｖａｍｙｌ） １５００ ＭＧを含む。
ノバミル（Ｎｏｖａｍｙｌ）およびその使用を記載する他の文献としては、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎ，Ｃ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．，ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｔ．，（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｔｏｓｅ ａｎ ａ ｌｉｍｉｔ ｄｅｘｔｒｉｎ，ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｄｅｘｔｒｉｎ，ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｄｅｘｔｒｉｎ．Ｄｅｎｍａｒｋ、ならびにＷＯ ９５／ｌ０６２７が挙げられる。これはさらに、米国特許第４，５９８，０４８号および米国特許第４，６０４，３５５号に記載される。これらの文献のそれぞれは、本明細書によって参考として援用され、そこに記載されるノバミル（Ｎｏｖａｍｙｌ）ポリペプチドのいずれかが、本明細書中に記載される任意のＰＳ４改変体ポリペプチドと組み合わされて使用され得る。
ノバミル（Ｎｏｖａｍｙｌ）の改変体、ホモログ、および変異体は、αアミラーゼ活性を保持する組み合わせのために使用され得る。例えば、米国特許第６，１６２，６２８号（この開示全体が、本明細書中で参考として援用される）に開示される任意のノバミル（Ｎｏｖａｍｙｌ）改変体は、本明細書中に記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドとともに使用され得る。特に、その文献に記載される任意のポリペプチド、特に、Ｑ１３、Ｉ１６、Ｄ１７、Ｎ２６、Ｎ２８、Ｐ２９、Ａ３０、Ｓ３２、Ｙ３３、Ｇ３４、Ｌ３５、Ｋ４０、Ｍ４５、Ｐ７３、Ｖ７４、Ｄ７６、Ｎ７７、Ｄ７９、Ｎ８６、Ｒ９５、Ｎ９９、Ｉ１００、Ｈ１０３、Ｑ１１９、Ｎｌ２０、Ｎ１３１、Ｓ１４１、Ｔ１４２、Ａ１４８、Ｎ１５２、Ａ１６３、Ｈ１６９、Ｎｌ７１、Ｇ１７２、Ｉ１７４、Ｎ１７６、Ｎ１８７、Ｆ１８８、Ａ１９２、Ｑ２０１、Ｎ２０３、Ｈ２２０、Ｎ２３４、Ｇ２３６、Ｑ２４７、Ｋ２４９、Ｄ２６１、Ｎ２６６、Ｌ２６８、Ｒ２７２、Ｎ２７５、Ｎ２７６、Ｖ２７９、Ｎ２８０、Ｖ２８１、Ｄ２８５、Ｎ２８７、Ｆ２９７、Ｑ２９９、Ｎ３０５、Ｋ３１６、Ｎ３２０、Ｌ３２１、Ｎ３２７、Ａ３４１、Ｎ３４２、Ａ３４８、Ｑ３６５、Ｎ３７１、Ｎ３７５、Ｍ３７８、Ｇ３９７、Ａ３８１、Ｆ３８９、Ｎ４０１、Ａ４０３、Ｋ４２５、Ｎ４３６、Ｓ４４２、Ｎ４５４、Ｎ４６８、Ｎ４７４、Ｓ４７９、Ａ４８３、Ａ４８６、Ｖ４８７、Ｓ４９３、Ｔ４９４、Ｓ４９５、Ａ４９６、Ｓ４９７、Ａ４９８、Ｑ５００、Ｎ５０７、Ｉ５１０、Ｎ５１３、Ｋ５２０、Ｑ５２６、Ａ５５５、Ａ５６４、Ｓ５７３、Ｎ５７５、Ｑ５８１、Ｓ５８３、Ｆ５８６、Ｋ５８９、Ｎ５９５、Ｇ６１８、Ｎ６２１、Ｑ６２４、Ａ６２９、Ｆ６３６、Ｋ６４５、Ｎ６６４および／またはＴ６８１に対応する任意の１つ以上の位置での、米国特許第６，１６２，６２８号の配列番号１の改変体が使用され得る。
（アミノ酸配列）
本発明は、ＰＳ４改変体核酸を利用し、そしてこのようなＰＳ４改変体核酸のアミノ酸配列は、本明細書中に記載される方法および組成物によって包含される。
本明細書中で使用される場合、「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および／または用語「タンパク質」と同義語である。いくつかの場合において、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義語である。いくつかの場合において、用語「アミノ酸配列」は、用語「酵素」と同義語である。
アミノ酸配列は、適切な供給源から調製／単離され得るか、または合成的に作製され得るか、または組換えＤＮＡ技術の使用によって調製され得る。
本明細書中に記載されるＰＳ４改変体酵素は、他の酵素とともに使用され得る。従って、本発明者らは、酵素の組み合わせをさらに開示し、ここで、この組み合わせは、本明細書中に記載されるＰＳ４改変体ペプチド酵素および別の酵素を含み、この別の酵素自体が、別のＰＳ４改変体ポリペプチド酵素であり得る。
（ＰＳ４改変体ヌクレオチド配列）
上記のように、本発明者らは、記載される特定の特性を有するＰＳ４改変体酵素をコードするヌクレオチド配列を開示する。
用語「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、ならびにその改変体、ホモログ、フラグメント、および誘導体（例えば、その一部）をいう。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源、合成起源または組換え起源であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを表す二本鎖または一本鎖であり得る。
用語「ヌクレオチド配列」は、本明細書で使用される場合、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。好ましくは、この用語は、ＤＮＡ配列、より好ましくは、ＰＳ４改変体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を意味する。
代表的には、ＰＳ４改変体ヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術を使用して調製される（すなわち、組換えＤＮＡ）。しかし、代替の実施形態において、ヌクレオチド配列は、当該分野で周知の化学方法を使用して、全体的にまたは一部、合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨら、（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２１５−２３およびＨｏｒｎ Ｔら、（１９８０）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ ２２５−２３２を参照のこと）。
（核酸配列の調製）
本明細書中に規定される特定の特性を有する酵素（例えば、ＰＳ４改変体ポリペプチド）または改変に適切な酵素（例えば、親酵素）のいずれかをコードするヌクレオチド配列は、この酵素を産生する任意の細胞または生物から同定および／または単離および／または精製され得る。ヌクレオチド配列の同定および／または単離および／または精製のための種々の方法が当該分野において周知である。例として、一旦適切な配列が同定および／または単離および／または精製されると、１つより多くの配列を調製するためのＰＣＲ増幅技術が、使用され得る。
さらなる例として、ゲノムＤＮＡライブラリーおよび／またはｃＤＮＡライブラリーは、酵素を産生する生物から、染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを使用して構築され得る。この酵素のアミノ酸配列またはこの酵素のアミノ酸配列の一部が公知である場合、標識されたオリゴヌクレオチドプローブが合成され得、その生物から調製されたゲノムライブラリーから酵素をコードするクローンを同定するために使用され得る。あるいは、別の公知の酵素遺伝子に相同な配列を含む標識化オリゴヌクレオチドプローブが、酵素コードクローンを同定するため使用され得る。後者の場合、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が使用される。
あるいは、酵素をコードするクローンは、ゲノムＤＮＡのフラグメントを、プラスミドのような発現ベクター内に挿入し、酵素ネガティブな細菌を、得られるゲノムＤＮＡライブラリーで形質転換し、次いで、形質転換された細菌を、酵素の基質（すなわち、マルトース）を含む寒天プレート上にプレートし、それによって、酵素を発現するクローンが同定され得ることによって、同定され得る。
なおさらなる代替法において、上記酵素をコードするヌクレオチド配列は、確立された標準的方法（例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌ．ら、（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２、ｐ１８５９〜１８６９によって記載されるホスホロアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３、ｐ８０１−８０５によって記載される方法）によって合成的に調製され得る。ホスホロアミダイト法において、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクター中にクローニングされる。
ヌクレオチド配列は、標準的な技術に従って、合成起源、ゲノム起源またはｃＤＮＡ起源のフラグメントを適切に連結することによって調製される、混合ゲノムおよび合成起源、混合合成およびｃＤＮＡ起源、または混合ゲノムおよびｃＤＮＡ起源であり得る。各連結されたフラグメントは、ヌクレオチド配列全体の種々の部分に対応する。ＤＮＡ配列はまた、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、またはＳａｉｋｉ ＲＫら、（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐｐ４８７−４９１）に記載されるように、特異的プライマーを使用した、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製され得る。
（改変体／ホモログ／誘導体）
本発明者らは、酵素の任意のアミノ酸配列またはこのような酵素をコードする任意のヌクレオチド配列の改変体、ホモログおよび誘導体（例えば、ＰＳ４改変体ポリペプチドもしくはＰＳ４改変体核酸）の使用をさらに記載する。内容が他を示さない限り、用語「ＰＳ４改変体核酸」は、以下に記載される核酸の実態の各々を含むようにとられるべきであり、そして用語「ＰＳ４改変体ポリペプチド」は、同様に、以下に記載されるポリペプチドまたはアミノ酸の実態の各々を含むようにとられるべきである。
ここで、用語「ホモログ」は、目的のアミノ酸配列および目的のヌクレオチド配列と特定の相同性を有する実態を意味する。ここで、用語「相同性」は、「同一性」と等価であり得る。
本文脈において、相同配列は、目的の配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、または９０％同一であり得、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むようにとられる。
好ましくは、従って、本明細書中に記載される方法および組成物における使用のためのＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列表に記載される配列と、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同なまたは同一の配列を有するポリペプチドを含む。
代表的に、ホモログは、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的特性／化学的機能を有するアミノ酸残基）の点でも考慮され得るが、本明細書の文脈においては、配列同一性の点で相同性を表現することが好ましい。
本明細書の文脈において、ホモログ配列は、ＰＳ４改変体ポリペプチド酵素をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＰＳ４改変体核酸）に対して、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、もしくは少なくとも９０％同一であり得る（好ましくは少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、もしくは少なくとも９９％同一であり得る）ヌクレオチド配列を包含すると解釈される。代表的に、上記ホモログは、活性部位などについてコードする、対象配列と同じ配列を包含する。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的特性／化学的機能を有するアミノ酸残基）の点でも考慮され得るが、本明細書の文脈においては、配列同一性の点で相同性を表現することが好ましい。
相同性比較は、眼で見ることによって行われ得るか、より通常には、容易に入手可能な配列比較プログラムを用いて行われ得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列の間での相同性％を計算し得る。
相同性％は、連続配列上で計算され得る。すなわち、１つの配列は、他の配列にアラインメントされ、１つの配列中の各アミノ酸は、他の配列の対応するアミノ酸と、一度に１残基、直接比較される。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。代表的に、このようなギャップなしアラインメントは、比較的少数の残基上でのみ行われる。
これは、非常に簡単かつ一貫性のある方法であるが、これは、例えば、全体的アラインメントが行われる場合、他の同一な配列の対において、１つの挿入もしくは欠失が、その後のアミノ酸残基をアラインメントから締め出し、相同性％における大幅な低下を生じる可能性があることを考慮に入れていない。結果的に、ほとんどの配列比較法は、全体的相同性スコアに過度に不利益を科すことなく、可能性のある挿入および欠失を考慮に入れた、最適なアラインメントを作製するように設計されている。これは、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入して、局所的相同性を最大化するようにすることによって達成される。
しかし、これらのより複雑な方法は、アラインメントに生じた各ギャップに「ギャップペナルティー」を割当てる。これによって、同じ数の同一なアミノ酸について、可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメント（２つの比較される配列間でのより高い関連性を反映する）は、多くのギャップを有するアラインメントより高いスコアを達成する。「アフィン（Ａｆｆｉｎｅ）ギャップコスト」が、代表的に使用される。これは、ギャップの存在に対して相対的に高いコストを負わせ、そしてそのギャップ中の後に続く残基の各々に対してより低いペナルティーを負わせる。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、当然、より少ないギャップを有する最適化されたアラインメントを作製する。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを修正することを許容する。しかし、このようなソフトウェアが配列比較に対して使用される場合、デフォルト値が使用されることが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティーは、１つのギャップに対して−１２であり、各伸長に対して−４である。
最大相同性％の計算は、したがって、最初に、ギャップペナルティーを考慮に入れた最適なアラインメントを作製することを必要とする。このようなアラインメントを実行するために適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら １９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列比較を実行し得る他のソフトウェアの例としては、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版−第１８章を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳの比較ツール一式が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方は、オフライン検索およびオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，７−５８〜７−６０頁を参照のこと）。
しかし、いくつかの用途については、上記ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールもまた、タンパク質配列およびヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ １９９９ １７７（１）：１８７−８、およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと）。
最終的な相同性％は、同一性の点で測定され得るが、アラインメントプロセスそのものは、代表的に、対があるか否か（ａｌｌ−ｏｒ−ｎｏｔｈｉｎｇ ｐａｉｒ）の比較に基づいている。代わりに、規模を合わせた類似性スコアマトリクス（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ）が一般的に使用される。これは、化学的類似もしくは進化距離に基づいて対での比較の各々に対してスコアを割当てる。一般的に使用されるこのようなマトリクスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス（ＢＬＡＳＴプログラム一式に対するデフォルトマトリクス）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、公共のデフォルト値か、もしくは、供給される場合、特別記号比較表（ｃｕｓｔｏｍ ｓｙｍｂｏｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔａｂｌｅ）のいずれかを一般的に使用する（さらなる詳細は利用者マニュアル参照）。いくつかの用途に関して、ＧＣＧパッケージについての公共のデフォルト値を使用することが好ましく、または、他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリクスを使用することが好ましい。
あるいは、相同性％は、ＤＮＡＳＩＳＴＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における複数アラインメント機能を用いて計算され得る。これは、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）に類似するアルゴリズムに基づいている。
一旦ソフトウェアが最適なアラインメントを作製すれば、相同性％（好ましくは配列同一性％）を計算することが可能である。このソフトウェアは、代表的に、配列比較の一部としてそれを行い、多くの結果を算出する。
上記配列はまた、サイレント変化を生じて機能的に等価の物質を生む、アミノ酸残基の欠失、挿入もしくは置換を有し得る。計画的なアミノ酸置換は、アミノ酸特性（例えば、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性および／もしくは両親媒性性質）の類似性に基づいてなされ得、したがって、アミノ酸を官能基でまとめることは、有用である。アミノ酸は、それらの側鎖の特性のみに基づいてまとめられ得る。しかし、変異データも含むと、より有用である。したがって、このようにして誘導されたアミノ酸のセットは、構造的理由のために保存されている可能性がある。これらのセットは、ベン図の形態で記載され得る（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．およびＢａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ」Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）「Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ」Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的置換は、例えば、一般的に受け入れられているアミノ酸のベン図分類を記載する以下の表に従って、行われ得る。
Figure 0004637835
 本発明者らは、ホモログ置換（すなわち、類似するもの同士の（ｌｉｋｅ−ｆｏｒ−ｌｉｋｅ）置換（例えば、塩基性に対して塩基性の置換、酸性に対して酸性の置換、極性に対して極性の置換など）を生じ得る）を含む配列をさらに開示する（置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）および置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）の両方は、本明細書において、存在するアミノ酸残基の代替的残基との交換を意味するために使用される）。非ホモログ置換もまた生じ得る（すなわち、１つの残基の分類から別の分類への置換、あるいは、オルニチン（本明細書において今後、Ｚと称される）、ジアミノブチル酸オルニチン（本明細書において今後、Ｂと称される）、ノルロイシンオルニチン（本明細書において今後、Ｏと称される）、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンのような非天然アミノ酸を含有することを含む）。
改変体アミノ酸配列は、配列の任意の２アミノ酸残基の間に挿入され得る適切なスペーサー基を含み得る。これらのスペーサー基としては、例えば、メチル基、エチル基もしくはプロピル基のようなアルキル基が挙げられ、さらにグリシン残基もしくはβ−アラニン残基のようなアミノ酸スペーサー基が挙げられる。変異のさらなる形態（ペプトイド形態における一以上のアミノ酸残基の存在に関する）は、当業者によく理解されている。疑いを避けるため、「ペプトイド形態」は、改変体アミノ酸残基を指すために使用される。ここで、α炭素置換基は、α炭素よりもむしろ、その残基の窒素原子上にある。ペプトイド形態でのペプチドを調製するためのプロセスは、当該分野で公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪら，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１およびＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４）。
本明細書において記載されるヌクレオチド配列、および本明細書において記載される方法および組成物においての使用に適切なヌクレオチド配列（例えば、ＰＳ４改変体核酸）は、それらの中に、合成ヌクレオチドもしくは改変ヌクレオチドを包含し得る。オリゴヌクレオチドへの、多くの異なる型の改変は、当該分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネート骨格およびホスホロチオエート骨格ならびに／またはこの分子の３’末端および／もしくは５’末端におけるアクリジン鎖もしくはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本明細書の目的のため、本明細書において記載されるヌクレオチド配列が、当該分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ることを理解すべきである。このような改変は、ヌクレオチド配列のインビボでの活性もしくは寿命を増強するために行われ得る。
本発明者らは、本明細書において提示される配列に相補的なヌクレオチド配列の使用、または任意の誘導体、フラグメントもしくはそれらの誘導体の使用をさらに記載する。配列が、そのフラグメントに相補的である場合、その配列は、他の生体などにおいて同様なコード配列を同定するためのプローブとして使用され得る。
ＰＳ４改変体配列と１００相同性％ではないポリヌクレオチドは、多くの方法で得ることができる。本明細書において記載される配列の他の改変体は、例えば、種々の個体群（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）（例えば、異なる集団由来の個体群）から作製されたＤＮＡライブラリをプローブすることによって得ることができる。さらに、他のホモログを得ることができ、このようなホモログおよびそれらのフラグメントは、一般的に、本明細書の配列表に示される配列と選択的にハイブリダイズし得る。このような配列は、他種から作製されたｃＤＮＡライブラリまたは他種由来のゲノムＤＮＡライブラリをプローブすること、および添付の配列表中の配列のいずれか１つの全部もしくは一部を含むプローブでこのようなライブラリを、中〜高ストリンジェント条件下でプローブすることによって、得ることができる。同様の考慮が、本明細書において記載されるポリペプチド配列もしくはヌクレオチド配列の種ホモログおよび対立遺伝子改変体を得ることに適用される。
改変体および株／種ホモログもまた、保存的アミノ酸配列をコードする改変体およびホモログ内の標的配列に対して設計されたプライマーを使用する縮重ＰＣＲを用いて得ることができる。 保存的配列は、例えば、いくつかの改変体／ホモログ由来のアミノ酸配列をアラインメントすることによって予測され得る。配列アラインメントは、当該分野で公知のコンピュータソフトウェアを用いて行われ得る。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＰｉｌｅＵｐプログラムが広く使用されている。
縮重ＰＣＲに使用されるプライマーは、１つ以上の縮重位置を含み、そして既知の配列に対する単一配列プライマーを用いて配列をクローニングするために使用される条件よりは、低いストリンジェント条件で使用される。
あるいは、このようなポリヌクレオチドは、特徴的配列の部位特異的変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、サイレントコドン配列変化が上記ポリヌクレオチド配列が発現されるべき特定の宿主細胞にとって好ましいコドンを最適化するために必要とされる場合に、有用であり得る。他の配列変化は、制限酵素認識部位を導入するため、または上記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの特性もしくは機能を変化させるために所望され得る。
本明細書に記載される、ＰＳ４改変体核酸のようなポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー、代替的増幅反応のためのプライマー）、プローブ（例えば、放射性もしくは非放射性標識を用いた従来の手段によって顕示する標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｌａｂｅｌ）で標識されたもの）を作製するために使用され得るか、または上記ポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングされ得る。このようなプライマー、プローブ、および他のフラグメントは、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長（例えば、少なくとも２５ヌクレオチド長、少なくとも３０ヌクレオチド長、もしくは少なくとも４０ヌクレオチド長）であり、やはり用語「ポリヌクレオチド」に包含される。
ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡプローブ）は、組み換えによって、合成によって、または当業者が利用可能な任意の手段によって作製され得る。これらはまた、標準的技術によってクローニングされ得る。一般的に、プライマーは、合成法によって作製される。この方法は、所望の核酸配列の、一度に１ヌクレオチドでの段階的な製造を包含する。これを達成するため、自動化技術を用いた技術は、当該分野において容易に利用可能である。
より長いポリヌクレオチドは、一般的に、組み換え手段を用いて（例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて）作製される。プライマーは、適切な制限酵素認識部位を含み、したがって増幅されたＤＮＡが適切なクローニングベクター内にクローニングされ得るように、設計され得る。好ましくは、この改変体配列などは、少なくとも本明細書中で提示される配列と同程度に、生物学的に活性である。
本明細書中で使用される場合、「生物学的に活性」とは、天然に存在する配列と類似の構造的機能（しかし、必ずしも同程度ではない）、および／または類似の調節機能（しかし、必ずしも同程度ではない）、および／または類似の生化学的機能（しかし、必ずしも同程度ではない）を有する配列を指す。
（ハイブリダイゼーション）
本発明者らは、ＰＳ４改変体の核酸配列に相補的な配列、またはこのＰＳ４改変体配列にハイブリダイズし得る配列もしくはこの配列に相補的な配列にハイブリダイズし得る配列を記載する。
用語「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用される場合、「核酸の１つの鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合するプロセス」ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において行われる場合の増幅プロセスを含むものとする。従って、本発明者らは、本明細書で示される配列に相補的な配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、またはその任意の誘導体、フラグメントもしくは誘導体の使用を開示する。
用語「改変体」とはまた、本明細書に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。
好ましくは、用語「改変体」は、本明細書に示されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。より好ましくは、用語「改変体」は、本明細書に示されるヌクレオチド配列に高ストリンジェントな条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸Ｎａ３、ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズし得る配列に相補的な配列を包含する。
本発明者らはさらに、ＰＳ４改変体のヌクレオチド配列（本明細書に示される配列に対する相補配列を含む）にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、ならびにＰＳ４改変体のヌクレオチド配列（本明細書に示される配列に対する相補配列を含む）にハイブリダイズし得る配列に相補的なヌクレオチド配列を開示する。本発明者らはさらに、中間から最大のストリンジェンシーの条件下で本明細書に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列を記載する。
好ましい局面において、本発明者らは、ストリンジェントな条件下（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ）でＰＳ４改変体核酸のヌクレオチド配列、またはその相補鎖にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を開示する。より好ましくは、そのヌクレオチド配列は、ＰＳ４改変体のヌクレオチド配列、またはその相補鎖に高ストリンジェントな条件下（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ）でハイブリダイズし得る。
（部位特異的変異誘発）
一旦、酵素をコードするヌクレオチドが配列が単離されると、または推定の酵素をコードするヌクレオチド配列が同定されると、酵素を調製するためにその配列を変異させることが望ましくあり得る。従って、ＰＳ４改変体配列は、親配列から調製され得る。変異は、合成オリゴヌクレオチドを使用して導入され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、望ましい変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
適切な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２、ｐ６４６−６４９）に開示される。酵素をコードするヌクレオチド配列に変異を導入する別の方法は、ＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９）、１８０、ｐ１４７−１５１）に記載される。さらなる方法は、ＳａｒｋａｒおよびＳｏｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９０），８，ｐ４０４−４０７「Ｔｈｅ ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」）に記載される。
一局面において、本明細書に記載される方法および組成物において使用するための配列は、組換え配列（すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して調製された配列）である。これらの組換えＤＮＡ技術は、当業者の能力の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓにおいて説明されている。
一局面において、本明細書に記載される方法および組成物において使用するための配列は、合成配列（すなわち、インビトロでの化学合成または酵素的合成により調製された配列）である。これらの配列としては、宿主生物（例えば、メチル資化性酵母であるＰｉｃｈａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ）の最適なコドン使用法で行われた配列が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で記載される方法および組成物において使用するためのヌクレオチド配列は、組換え複製ベクターに組み込まれ得る。このベクターは、酵素形態で、適合性の宿主細胞中でおよび／またはこの宿主から、ヌクレオチド配列を複製および発現するために使用され得る。発現は、制御配列（例えば、調節配列）を使用して制御され得る。ヌクレオチド配列の発現によって宿主組換え細胞により生成される酵素は、使用される配列および／またはベクターに依存して、分泌されてもよいし、細胞内に含まれてもよい。このコード配列は、特定の原核生物細胞膜または真核生物細胞膜を介して物質のコード配列の分泌を指向するシグナル配列とともに設計され得る。
（ＰＳ４核酸およびＰＳ４ポリペプチドの発現）
ＰＳ４ポリヌクレオチドおよびＰＳ４核酸は、合成起源および天然起源両方のＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。これらのＤＮＡまたはＲＮＡは、改変または非改変のデオキシヌクレオチドもしくはジデオキシヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドもしくはジデオキシリボヌクレオチドまたはこれらのアナログを含み得る。このＰＳ４核酸は、一本鎖または二本鎖のＮＤＡまたはＲＮＡとして、あるいはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖としてまたはＲＮＡ／ＤＮＡコポリマーとして存在し得る。ここで用語「コポリマー」とは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を含む単一の核酸鎖をいう。ＰＳ４核酸は、さらに、発現をさらに増加させるために最適化されたコドンであり得る。
用語「合成」とは、本明細書で使用される場合、インビトロでの化学合成または酵素的合成によって生成されるものとして規定される。この合成のものとしては、宿主生物（例えば、メチル資化性酵母ＰｉｃｈａおよびＨａｎｓｅｎｕｌａ）にとって最適なコドン使用法で作製されたＰＳ４核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書で記載される改変体ＰＳ４ポリヌクレオチド）は、組換え複製可能ベクターに組み込まれ得る。このベクターは、適合性の宿主細胞において核酸を複製するために使用され得る。このポリヌクレオチド配列を含むベクターは、適切な宿主細胞に形質転換され得る。適切な宿主としては、細菌、酵母、昆虫、真菌の細胞が挙げられ得る。
用語「形質転換細胞」は、組換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換された細胞を包含する。この形質転換は、代表的には、１以上のヌクレオチド配列を形質転換されるべき細胞に挿入することによって起こる。この挿入されるヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換されるべき細胞に対して天然でない配列）であり得る。さらに、または代わりに、この挿入されるヌクレオチド配列は、同種ヌクレオチド配列（すなわち、形質転換されるべき細胞に対して天然である配列である）であってもよい。その結果、細胞は、そこに既に存在しているヌクレオチド配列の１以上の余分なコピーを受ける。
従って、さらなる実施形態において、本発明者らは、複製可能ベクターにポリヌクレオチドを導入し、このベクターを適合性の宿主細胞に導入し、そしてこの宿主細胞を、このベクターの複製をもたらす条件下で増殖させることによって、ＰＳ４改変体ポリペプチドおよびＰＳ４改変体ポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。このベクターは、宿主細胞から回収され得る。
（発現構築物）
ＰＳ４核酸は、目的の宿主細胞において活性な転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントに作動可能に連結され得る。このＰＳ４核酸はまた、シグナル配列（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓのグルコアミラーゼ遺伝子由来のもの）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα因子接合型遺伝子およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡ−アミラーゼを含む融合タンパク質をコードし得る。あるいは、このＰＳ４核酸は、膜結合ドメインを含む融合タンパク質をコードし得る。
（発現ベクター）
ＰＳ４核酸は、発現ベクターを使用して、宿主生物において望ましいレベルで発現され得る。
ＰＳ４核酸を含む発現ベクターは、選択された宿主生物においてＰＳ４核酸をコードする遺伝子を発現し得る任意のベクターであり得、ベクターの選択は、導入される宿主細胞に依存する。従って、このベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち、エピソーム実体として存在するベクター）（このベクターの複製は、染色体複製とは独立している）であり得、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたはエピソームエレメント、ミニ染色体または人工染色体が挙げられる。あるいは、このベクターは、宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、染色体と一緒に複製され得る。
（発現ベクターの構成要素）
発現ベクターは、代表的には、クローニングベクターの構成要素（例えば、選択された宿主生物におけるベクターの自律的複製を可能にする要素および選択目的で表現型的に検出可能な１つ以上のマーカー）を含む。この発現ベクターは、通常、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナルおよび必要に応じてリプレッサー遺伝子または１以上のアクチベーター遺伝子をコードする制御ヌクレオチド配列を含む。さらに、発現ベクターは、宿主細胞オルガネラ（例えば、ペルオキシソーム）にまたは特定の宿主細胞構成要素にＰＳ４改変体ポリペプチドを標的化し得るアミノ酸配列をコードする配列を含み得る。このような標的化配列としては、ＳＫＬ配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の文脈において、用語「発現シグナル」とは、上記の制御配列、リプレッサーまたはアクチベーター配列のいずれかを含む。制御配列の指向の下での発現に関して、ＰＳ４改変体ポリペプチドの核酸配列は、発現に関して適切な様式で制御配列に作動可能に連結される。
好ましくは、ベクター中のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供し得る制御配列に作動可能に連結される。すなわち、このベクターは、発現ベクターである。用語「作動可能に連結される」とは、記載される構成要素が、それらの意図される様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。コード配列に「作動可能に連結される」調節配列は、そのコード配列の発現が、制御配列と適合性の条件下で達成される様式で、連結される。
その制御配列は、例えば、さらなる転写調節要素の付加によって改変されて、制御配列によって指向される転写のレベルを、転写モジュレーターに対してより応答性であるようにし得る。この制御配列は、特に、プロモーターを含み得る。
（プロモーター）
ベクターにおいて、改変体ＰＳ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーター配列と作動可能に組み合わせられる。このプロモーターは、選択された宿主生物において転写活性を有する任意のＤＮＡ配列であり得、この宿主生物に対して同種または異種である遺伝子に由来し得る。
（細菌プロモーター）
細菌宿主において改変ヌクレオチド配列（例えば、ＰＳ４核酸）の転写を指向するために適したプロモーターの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロンのプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ（ａｇａｒａｓｅ）遺伝子ｄａｇＡプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース産生性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｘｙｌＡ遺伝子およびｘｙｌＢ遺伝子プロモーター、ならびにＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来プロモーター（ｐ１７０プロモーターを含む）が挙げられる。ＰＳ４改変体ポリペプチドをコードする遺伝子が細菌種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現される場合、例えば、バクテリオファージプロモーター（Ｔ７プロモーターおよびファージλプロモーターが挙げられる）から、適切なプロモーターが選択され得る。
（真菌プロモーター）
真菌種における転写に関して、有用なプロモーターの例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースホスフェートイソメラーゼまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーターである。
（酵母プロモーター）
酵母種における発現に適したプロモーターの例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ １プロモーターおよびＧａｌ １０プロモーター、ならびにＰｉｃｈａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ１プロモーターまたはＡＯＸ２プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
（宿主生物）
（（Ｉ）細菌宿主生物）
適切な細菌宿主生物の例は、グラム陽性細菌種（例えば、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓが挙げられる）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）、乳酸細菌種（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉが挙げられる）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｓｐｐ．、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．が挙げられる）である。あるいは、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅに属する（Ｅ．ｃｏｌｉが挙げられる）かまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅに属するグラム陰性細菌種の株は、宿主生物として選択され得る。
（（ＩＩ）酵母宿主生物）
適切な酵母宿主生物は、生物工学的に関連する酵母種から選択され得、これらは、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ種またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられる）またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅに属する種（例えば、Ｓ．Ｐｏｍｂｅ種）のような酵母種であるが、これらに限定されない。
好ましくは、メチロトローフ酵母種Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの株が、宿主生物として使用される。好ましくは、この宿主生物は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種である。
（（ＩＩＩ）真菌宿主生物）
繊維状真菌のうちで適切な宿主生物としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）が挙げられる。あるいは、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種の株（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）またはＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ種（例えば、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）が、宿主生物として使用され得る。他の適切な株としては、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ種およびＭｕｃｏｒ種が挙げられる。
（タンパク質の発現および精製）
ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、ポリペプチド（例えば、改変体ＰＳ４ポリペプチド、そのフラグメント、ホモログ、改変体または誘導体）を発現するために使用され得る。宿主細胞は、これらのタンパク質の発現を可能にする、適切な条件下で培養され得る。ポリペプチドの発現は、これらのポリペプチドが連続的に生成され得るように、構成的であり得るか、または発現を開始するための刺激を必要として、誘導的であり得る。誘導的発現の場合、タンパク質の生成は、必要とされる場合に、例えば、誘導物質（例えば、デキサメタゾンまたはＩＰＴＧ）を培養培地に添加することによって開始され得る。
ポリペプチドは、当該分野において公知である種々の技術（酵素溶解、化学的溶解および／または浸透圧溶解、ならびに物理的破壊が挙げられる）によって、宿主細胞から抽出され得る。ポリペプチドはまた、インビトロ無細胞系（例えば、ＴｎＴＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウサギ網状赤血球系）において、組換え的に生成され得る。
（実施例１．ＰＳ４のクローニング）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｈａｒｏｐｈｉａを、ＬＢ培地で一晩増殖させ、そして染色体ＤＮＡを、標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）によって単離する。ＰＳ４のオープンリーディングフレームを含む２１９０ｂｐのフラグメント（Ｚｈｏｕら、１９８９）を、Ｐ．ｓａｃｈａｒｏｐｈｉｌａ染色体ＤＮＡから、プライマーＰ１およびＰ２（表３を参照のこと）を使用するＰＣＲによって増幅する。得られたフラグメントを、Ｐ３およびＰ４を用いるネステッドＰＣＲにおいて、テンプレートとして使用し、ＰＳ４のオープンリーディングフレームを、そのシグナル配列なしで増幅し、そしてこの遺伝子の５’末端におけるＮｃｏＩ部位および３’末端におけるＢａｍＨＩ部位を導入する。ＮｃｏＩ部位と一緒に、Ｎ末端メチオニンに対するコドンを導入し、ＰＳ４の細胞内発現を可能にする。１６０５ｂｐのフラグメントを、ｐＣＲＢＬＵＮＴ ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そしてその構築物の一体性を、配列決定によって分析する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢａｃｉｌｌｕｓシャトルベクターｐＤＰ６６Ｋ（Ｐｅｎｎｉｎｇａら、１９９６）を修飾して、Ｐ３２プロモーターおよびｃｔｇａｓｅシグナル配列の制御下でのＰＳ４の発現を可能にする。得られたプラスミドｐＣＳｍｔａ用いて、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを形質転換する。
ＰＳ４のデンプン結合ドメインが除去された、第二の発現構築物を作製する。プライマーＰ３およびＰ６（表３）を用いる、ｐＣＳｍｔａに対するＰＣＲにおいて、ｍｔａ遺伝子の短縮バージョンが発生する。ｐＣＳｍｔａの全長ｍｔａ遺伝子を、この短縮バージョンで置き換え、これにより、プラスミドｐＳＣｍｔａ−ＳＢＤを生じる。
（実施例２．ＰＳ４の部位特異的変異誘発）
変異を、２つの方法によって、ｍｔａ遺伝子に導入する。２段階ＰＣＲベースの方法またはＱｕｉｃｋ Ｅｘｃｈａｎｇｅ方法（ＱＥ）のいずれかによる。簡便なために、ｍｔａ遺伝子を、３つの部分（ＰｖｕＩ−ＦｓｐＩフラグメント、ＦｓｐＩ−ＰｓｔＩフラグメントおよびＰｓｔＩ−ＡｓｐＩフラグメント）に分離し、さらに、それぞれフラグメント１、フラグメント２、およびフラグメント３と称する。
２段階ＰＣＲベースの方法において、変異を、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して導入する。第一のＰＣＲを、コード鎖に対する変異誘発プライマー（表４）および低次鎖（表３の２Ｒまたは３Ｒのいずれか）に対する下流のプライマーを用いて実施する。その反応生成物を、第二のＰＣＲにおけるプライマーとして、コード鎖の上流のプライマーと一緒に使用する。最後の反応の生成物を、ｐＣＲＢＬＵＮＴｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そして配列決定後、そのフラグメントを、ｐＣＳｍｔａにおける対応するフラグメントと置き換える。
Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｃｈａｎｇｅ方法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、変異を、ＰＣＲにおいて２つの相補的プライマーを使用して、ｍｔａ遺伝子またはｍｔａ遺伝子の一部分を含むプラスミドに導入する。
この目的で、好都合なプラスミドのセット（３ＳＤＭプラスミドおよび３ｐＣＳΔプラスミドを含む）を構築する。ＳＤＭプラスミドは、上述のように、それぞれ、ｍｔａ遺伝子のフラグメントのうちの１つを保有し、ここに、所望の変異が、ＱＥによって導入される。配列決定による評価後、これらのフラグメントを、対応するレシピエントｐＣＳΔプラスミドにクローニングする。ｐＣＳΔプラスミドは、ｐＣＳｍｔａ由来の不活性誘導体である。活性は、ＳＤＭプラスミド由来の対応するフラグメントをクローニングすることによって回復され、容易なスクリーニングを可能にする。
（表３．ｍｔａ遺伝子のクローニングにおいて使用されるプライマー、および２段階ＰＣＲ方法を用いる部位特異的変異体の構築物において使用される標準的なプライマー）
Figure 0004637835
 （表４：部位特異的変異をｍｔａに導入するために使用されるプライマー）
Figure 0004637835
 （表５．ＳＤＭプラスミドおよびｐＣＳΔプラスミドの特徴）
Figure 0004637835
 （実施例３．多重ＳＤＭ）
記載されるようないくらかの改変を伴うＰＳ４改変体を、製造業者のプロトコルに従ってＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、生成した。
（工程１：変異体鎖合成反応（ＰＣＲ））
− ３ｍｌのＬＢ（２２ｇ／ｌ Ｌｅｎｎｏｘ Ｌ Ｂｒｏｔｈ Ｂａｓｅ，Ｓｉｇｍａ）および抗生物質（０．０５μｇ／ｍｌカナマイシン、Ｓｉｇｍａ）を、１０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに接種する
− 一晩３７℃、約２００ｒｐｍでインキュベートする
− 遠心分離（５０００ｒｐｍ／５分）によって、細胞を沈殿させる
− 培地を大まかに（ｐｏｏｒ ｏｆｆ）除去する
− ｄｓ−ＤＮＡテンプレートを、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用して調製する。
１．サーマルサイクリングのための変異体鎖合成反応を、以下のように準備した：
ＰＣＲ混合物：
２．５μｌ １０×ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ反応緩衝液
０．７５μｌ ＱｕｉｃｋＳｏｌｕｔｉｏｎ
Ｘμｌ プライマー
Figure 0004637835
 １μｌ ｄＮＴＰ混合物
Ｘμｌ ｄｓ−ＤＮＡテンプレート（２００ｎｇ）
１μｌ ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ酵素ブレンド（２．５Ｕ／μｌ）（ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ）
Ｘμｌ ｄＨ２Ｏ（２５μｌの最終体積まで）
ピペッティングによって全ての成分を混合し、そしてその反応混合物を、穏やかに遠心分離により沈殿させる。
２．以下のパラメータを使用して、反応をサイクルさせる：
３５サイクルの変性（９６℃／１分）
プライマーアニーリング（６２．８℃／１分）
伸長（６５℃／１５分）
次いで、４℃で保持。
ＰＣＲ機の蓋を１０５℃まで予熱し、そしてプレートを９５℃まで予熱し、その後、ＰＣＲチューブを、その機械（エッペンドルフサーマルサイクラー）に静置する。
（工程２：Ｄｐｎ Ｉ消化）
１． ２μｌのＤｐｎ Ｉ制限酵素（１０Ｕ／μｌ）を、各増幅反応物に添加し、ピペッティングによって混合し、そして混合物を遠心分離により沈殿させる
２． ３７℃で約３時間インキュベートする。
（工程３：ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（登録商標）超コンピテント細胞の形質転換）
１． ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞を、氷上で融解する。１回の変異誘発反応あたり４５μｌの細胞を、予冷したＦａｌｃｏｎチューブにアリコートとして取る
２． 水浴（４２℃）をオンにし、そしてＮＺＹ＋ブロスを含むチューブを、この浴に入れて予熱する
３． ２μｌのβ−メルカプトエタノール混合物を、各チューブに添加する。穏やかにかきまぜ、そして叩いて、氷上で１０分間インキュベートし、２分おきにかきまぜる
４． １．５μｌのＤｐｎ Ｉ処理したＤＮＡを、細胞の各アリコートに添加し、かきまぜて混合し、そして氷上で３０分間インキュベートする
５． ４２℃の水浴中で３０秒間、このチューブを熱パルスし、そして氷上に２分間置く
６． ０．５ｍｌの予熱したＮＺＹ＋ブロスを各チューブに添加し、そして３７℃で１時間、２２５〜２５０ｒｐｍで震盪しながらインキュベートする
７． ２００μｌの各形質転換反応物を、１％デンプンおよび０．０５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレート（３３．６ｇ／ｌ Ｌｅｎｎｏｘ Ｌ Ａｇａｒ，Ｓｉｇｍａ）上にプレートする
８． この形質転換プレートを、３７℃で一晩インキュベートする。
（表６．ｐＰＤ７７ｄ１４に対するプライマー表）
Figure 0004637835
 （表７．ｐＰＤ７７ｄ２０に対するプライマー表）
Figure 0004637835
 （表８．ｐＰＤ７７ｄ３４（ｐＳａｃ−Ｄ３４）に対するプライマー表）
Figure 0004637835
 （ｐＰＤ７７に基づくベクター系）
ｐＰＤ７７のために使用するベクター系は、ｐＣＲｂｌｕｎｔＴＯＰＯＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づく。ゼオシン耐性カセットを、ｐｍＩＩによって除去し、３９３ｂｐのフラグメントを除去した。次いで、ｐＣＣベクター由来の発現カセット（Ｐ３２−ｓｓＣＧＴａｓｅ−ＰＳ４−ｔｔ）を、このベクターに挿入した。
（ＰＳ４改変体のｐＣＣＭｉｎｉへのライゲーション）
関連する変異体を含むプラスミド（ＭＳＤＭによって作製した）を、制限酵素Ｎｃｏ １およびＨｉｎｄ ＩＩＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断する：
３μｇのプラスミドＤＮＡ、Ｘμｌの１０×緩衝液２、１０単位のＮｃｏ１，２０単位のＨｉｎｄＩＩＩ、３７℃で２時間のインキュベーション。
消化産物を１％アガロースゲルで泳動。１２９３ｂｐの大きさのフラグメント（ＰＳ４）を、このゲルから切り出し、そしてＱｉａｇｅｎゲル精製キットを使用して精製する。
次いで、ベクターｐＣＣＭｉｎｉを、制限酵素Ｎｃｏ １およびＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、そしてその消化産物を、次いで、１％アガロースゲルで泳動する。３５６９ｂｐの大きさのフラグメントを、このゲルから切り出し、そしてＱｉａｇｅｎゲル精製キットを使用して精製する。
ライゲーション：Ｒａｐｉｄ ＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用。
ベクターに対して２倍の量のインサートを使用
例えば、２μｌのインサート（ＰＳ４遺伝子）
１μｌのベクター
５μｌのＴ４ ＤＮＡライゲーション緩衝液（２倍濃度）
１μｌのｄＨ２Ｏ
１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ。
５分／室温でライゲーション。
このライゲーション産物を用いて、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰＯコンピテント細胞を、製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って形質転換。５μｌのライゲーション産物を形質転換に使用。
５０μｌの形質転換混合物を、１％デンプンおよび０．０５μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレート（３３．６ｇ／ｌ Ｌｅｎｎｏｘ Ｌ Ａｇａｒ，Ｓｉｇｍａ）上にプレート。インサートを含むベクター（ＰＳ４改変体）が、デンプンプレート上でのハロ形成によって、認識され得る。
（実施例４．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓへの形質転換（プロトプラスト形質転換））
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（株ＤＢ１０４Ａ；Ｓｍｉｔｈら、１９８８；Ｇｅｎｅ ７０，３５１−３６１）を、変異したｐＣＳ−プラスミドで、以下のプロトコルに従って形質転換する：
（Ａ．プロトプラストおよび形質転換のための培地）
２×ＳＭＭ
１リットル当たり：３４２ｇスクロース（１Ｍ）；４．７２ｇマレイン酸ナトリウム（０．０４Ｍ）；８．１２ｇ ＭｇＣｌ２，６Ｈ２Ｏ（０．０４Ｍ）；濃ＮａＯＨでｐＨ６．５にする。５０ｍｌの部分に分け、そして１０分間オートクレーブ処理する
４×ＹＴ（１／２ ＮａＣｌ）
１００ｍｌあたり２ｇ酵母抽出物＋３．２ｇ トリプトン＋０．５ｇ ＮａＣｌ
ＳＭＭＰ
等体積の２×ＳＭＭと４×ＹＴとを混合する
ＰＥＧ
２５ｍｌの１×ＳＭＭ中１０ｇのポリエチレングリコール６０００（ＢＤＨ）またはポリエチレングリコール８０００（Ｓｉｇｍａ）（１０分間オートクレーブ処理）。
（Ｂ．プレーティング／再生のための培地）
寒天
４％ Ｄｉｆｃｏ最小寒天。１５分間オートクレーブ処理
コハク酸ナトリウム
２７０ｇ／ｌ（１Ｍ）、ＨＣｌでｐＨ７．３にする。１５分間オートクレーブ処理
リン酸緩衝液
１００ｍｌあたり３．５ｇ Ｋ２ＨＰＯ４＋１．５ｇ ＫＨ２ＰＯ４。１５分間オートクレーブ処理
ＭｇＣｌ２
１００ｍｌあたり２０．３ｇ ＭｇＣｌ２，６Ｈ２Ｏ（１Ｍ）
カスアミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏａｃｉｄ）
５％（ｗ／ｖ）溶液。１５分間オートクレーブ処理
酵母抽出物
１００ｍｌあたり１０ｇ、１５分間オートクレーブ処理
グルコース
２０％（ｗ／ｖ）溶液。１０分間オートクレーブ処理。
ＤＭ３再生培地：６０℃で混合（水浴：５００ｍｌ瓶）：
２５０ｍｌコハク酸ナトリウム
５０ｍｌカスアミノ酸
２５ｍｌ酵母抽出物
５０ｍｌリン酸緩衝液
１５ｍｌグルコース
１０ｍｌ ＭｇＣｌ２
１００ｍｌ溶融寒天。
適切な抗生物質（クロラムフェニコールおよびテトラサイクリン、５ｕｇ／ｍｌ；エリスロマイシン、１ｕｇ／ｍｌ）を添加。カナマイシンでの選択は、ＤＭ３培地中において問題がある：２５０ｕｇ／ｍｌの濃度が必要とされ得る。
（Ｃ．プロトプラストの調製）
１．全体を通して洗剤のないプラスチックまたはガラス器具を使用する。
２．単一のコロニーから１００ｍｌフラスコ中の１０ｍｌの２×ＹＴ培地に接種する。振盪器（２００ｒｅｖ／分）で、２５〜３０℃にて一晩培養物を増殖する。
３．一晩培養物を１００ｍｌの新しい２×ＹＴ培地（２５０ｍｌフラスコ）に２０倍希釈し、そしてＯＤ６００＝０．４〜０．５になるまで（約２時間）、振盪器（２００〜２５０ｒｅｖ／分）で３７℃にて増殖する。
４．遠心分離（９０００ｇ、２０分、４℃）により、細胞を回収する。
５．ピペットで上清を取り除き、その細胞を５ｍｌのＳＭＭＰ＋５ｍｇリゾチームで再懸濁し、滅菌濾過する。
６．水浴振盪器（１００ｒｅｖ／分）で３７℃にてインキュベートする。
３０分後、その後１５分の間隔で、２５μｌのサンプルを顕微鏡により検査する。９９％の細胞がプロトプラスト化（球状の外観）するまでインキュベーションを継続する。遠心分離（４０００ｇ、２０分、ＲＴ）により、プロトプラストを回収し、そして、上清を除去する。１〜２ｍｌのＳＭＭＰ中でペレットを静かに再懸濁する。
ここで、プロトプラストは、使用準備が整っている。（一部（例えば、０．１５ｍｌ）は、後の使用のために−８０℃にて凍結しても良い（グリセロールの添加は、必要ない）。これは、形質転換能のいくばくかの減少を生じ得るが、ＤＮＡ １μｇあたり１０６の形質転換体を、凍結したプロトプラストで得ることが出来る）。
（Ｄ．形質転換）
１．４５０μｌのＰＥＧをマイクロチューブに移す。
２．１〜１０μｌのＤＮＡ（０．２ｇ）を１５０μｌのプロトプラストと混合し、その混合物をＰＥＧを含むマイクロチューブに添加する。すぐに、ただし静かに混合する。
３．２分間室温で静置し、次いで、１．５ｍｌのＳＭＭＰを添加し、混合する。
４．微量遠心（１０分間、１３，０００ｒｅｖ／分（１０〜１２，０００ｇ））によりプロトプラストを回収し、上清を取り除く。ティッシュで残った小滴を除去する。
３００μｌのＳＭＭＰを添加し（ボルテックスしない）、水浴振盪器（１００ｒｅｖ／分）で３７℃にて６０〜９０分間インキュベートして抗生物質抵抗性マーカーの発現を可能にする。（プロトプラストは、水浴の振盪動作を通して十分に再懸濁される）。１×ＳＳＭで適切に希釈し、そしてＤＭ３プレート上に０．１ｍｌをプレートする。
（実施例５．振盪フラスコにおけるＰＳ４改変体の発酵）
振盪フラスコの基質を、以下のとおりに調製する。
Figure 0004637835
 その基質を、オートクレーブする前に、４Ｎ硫酸または水酸化ナトリウムでｐＨ６．８に調節する。１００ｍｌの基質を、１つのバッフルを備えた５００ｍｌフラスコに置き、３０分間オートクレーブする。その後、６ｍｌの滅菌デキストロースシロップを添加する。そのデキストロースシロップを、１容量の５０％（ｗ／ｖ）デキストロースを１容量の水と混合し、続いて、２０分間オートクレーブすることにより調製する。
振盪フラスコに、改変体を接種し、インキュベーター中で、２４時間３５℃／１８０ｒｐｍにてインキュベートする。インキュベーション後、遠心分離（１０分間、１０，０００×ｇ）により培地から細胞を分離し、最終的にその上清を、０．２μｍでの精密濾過により、無菌にする。無菌上清を、アッセイ検定および適用検定に使用する。
（実施例６．アミラーゼアッセイ）
（Ｂｅｔａｍｙｌアッセイ）
Ｂｅｔａｍｙｌの１単位を、１分間あたり０．０３５１ｍｍｏｌのＰＮＰが、アッセイ混合物中の過剰α−グルコシダーゼにより遊離し得るように、１分間あたり０．０３５１ｍｍｏｌのＰＮＰ結合マルトペンタオースを分解する活性として定義する。そのアッセイ混合物は、２５μｌの酵素試料およびＭｅｇａｚｙｍｅ，ＩｒｅｌａｎｄからのＢｅｔａｍｌｙ基材（Ｇｌｃ５−ＰＮＰおよびα−グルコース）（１瓶を１０ｍｌの水に溶解）２５μｌと共に５０μｌの５０ｍＭクエン酸Ｎａ、５ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ６．５）を含む。そのアッセイ混合物を３０分間４０℃にてインキュベートし、次いで、１５０μｌの４％トリスを添加することにより停止する。４２０ｎｍにおける吸光を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して測定し、Ｂｅｔａｍｙｌ活性を、アッセイした酵素試料のＢｅｔａｍｙｌ単位／ｍｌで、活性＝Ａ４２０＊ｄに基づいて計算する。
（エンドアミラーゼアッセイ）
エンドアミラーゼアッセイは、製造者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ）による Ｐｈａｄｅｂａｓアッセイの実施と同じである。
（エキソ特異性）
Ｐｈａｄｅｂａｓ活性に対するエキソアミラーゼ活性の比を、エキソ特異性を評価するのに使用した。
（比活性）
ＰＳａｃ−Ｄ１４改変体、ＰＳａｃ−Ｄ２０改変体およびＰＳａｃ−Ｄ３４改変体について、本発明者らは、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２，２４８）に従って計測された、精製タンパク質１μｇあたり１０Ｂｅｔａｍｙｌ単位の平均比活性を見出している。この比活性は、適用検定において使用される用量を計算するための活性に基づいて使用する。
（実施例７．半減期の決定）
ｔ１／２を、酵素活性の半分が、規定された熱条件下で不活性化する時間（分）として定義する。上記酵素の半減期を決定するために、試料を、６０〜９０℃の一定温度にて１〜１０分間加熱する。その半減期を、残ったＢｅｔａｍｙｌアッセイに基づいて計算する。
（手順）
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ容器中で、１０００μｌの緩衝液を、少なくとも１０分間、６０℃以上に前もって加熱する。加熱インキュベーター（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆからのＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ｃｏｍｆｏｒｔ）中のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ容器を連続して混合（８００ｒｐｍ）する条件下で、１００μｌの試料を、前もって加熱した緩衝液に添加して、その試料の熱処理を開始する。インキュベーションの０分後、２分後、４分後、６分後、８分後、そして９分後に、４５μｌの試料を２０℃に平衡化した１０００μｌの緩衝液に移し、２０℃にて１５００ｒｐｍで１分間インキュベートすることにより、反応を停止する。残った活性を、Ｂｅｔａｍｙｌアッセイで測定する。
（計算）
ｔ１／２の計算を、残ったＢｅｔａｍｙｌ活性対インキュベーション時間のｌｏｇ１０（底が１０の対数）の傾きに基づいて計算する。ｔ１／２を、傾き／０．３０１＝ｔ１／２として計算する。
（実施例８．結果）
（表９．野生型ＰＳａｃ−ｃｃ１と比較したＰＳａｃ改変体の生物化学的特性）
Figure 0004637835
 実験を、上記表に列挙される改変体の各々の変形を使用するが、３３位の変異は使用せずに（すなわち、この位置において野生型の残基Ｎを有する）行う。同様の結果は、変異Ｎ３３Ｙを有するような変形について得られる。
また、実験を、上記表に列挙される改変体の各々の変形を使用するが、３４位の変異は使用せずに（すなわち、この位置において野生型の残基Ｄを有する）行う。同様の結果は、変異Ｄ３４Ｎを有するような変形について得られる。
（実施例９．モデル系のパン焼成試験）
ファリノグラフ（Ｆａｒｉｎｏｇｒａｐｈ）中で３０℃にて、生地を製造する。１０．００ｇの改良小麦粉を計量し、ファリノグラフに添加する；１分後、基準／試料を混合したもの（基準＝緩衝液または水、試料＝酵素＋緩衝液または水）を、捏ね桶（ｋｎｅａｄｉｎｇ ｖａｔ）の穴を通して、滅菌ピペットで添加する。３０秒後、その小麦粉を、（また捏ね桶の穴を通して）その端をこそげ取る。その試料を、７分間捏ねる。
緩衝液または水を使用した検定を、最後に基準を実施する前に、ファリノグラフで実施する。ＦＵは、基準に対して４００であるべきであり、もしそうでない場合、これは、例えば、液体の量で調節するべきである。その基準／試料を、スパーテルで取り出し、（使い捨て手袋を着けた）手の中に置き、その後、（約４．５ｃｍ長の）小さなガラスチューブに充填し、これをＮＭＲチューブに入れ、栓をする。１つの生地あたり７つのチューブを作製する。
全てのサンプルを調製したとき、そのチューブを、３３℃にて（栓をせず）、２５分間水浴（変更可能）中に置き、その後、水浴を、３３℃にて５分間維持するように設定し、次いで、５６分間にわたって９８℃に加熱し（１分間あたり１．１℃）、最終的に、９６℃にて５分間維持する。
そのチューブを、温熱器（ｔｈｅｒｍｏ ｃｕｐｂｏａｒｄ）中で、２０．０℃にて貯蔵する。そのパン粉の固形分を、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＳ １２０ Ｍｉｎｉｓｐｅｃ ＮＭＲ分析器を使用して、１日目、３日目、および７日目に、プロトンＮＭＲにより測定した（図２において、０ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、および２ｐｐｍのＰＳａｃＤ３４を使用して調製されたパン粉試料について示される）。固形分の増加が、経時的に低くなることで、アミロペクチンのもどり（ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ）の減少が示される。温熱器中で２０．０℃での７日間の貯蔵後、パン粉の１０〜２０ｍｇの試料を計量し、４０μｌのアルミニウム標準のＤＳＣカプセル中に入れ、２０℃に維持した。
そのカプセルを、Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ ＤＳＣ８２０器具の示差走査熱量計に使用する。パラメーターとして、１分間あたり１０℃加熱する２０〜９５℃の加熱サイクル、およびガス／流量：Ｎ２／８０ｍｌ／分を使用する。結果を分析し、そして、もどったアミロペクチンの融解エンタルピーを、Ｊ／ｇで計算する。
（実施例１０．老化防止（ａｎｔｉｓｔａｌｉｎｇ）効果）
実施例８に従って、モデルパン粉を調製し、計測する。表２に示されるように、ＰＳ４改変体は、示差走査熱量計により計測されるように、コントロールと比較してパン焼成後のアミロペクチンのもどりの強力な減少を示す。ＰＳ４改変体は、明白な添加効果を示す。
（実施例１１．焼成検定における堅さの効果）
焼成検定を、標準的な白パンスポンジおよびアメリカのトーストについての生地製法を使用して実行した。スポンジ生地を、１６００ｇのＳｉｓｃｏ Ｍｉｌｌｓ ＵＳＡからの「Ａｌｌ Ｐｕｒｐｏｓｅ Ｃｌａｓｓｉｃ」小麦粉、９５０ｇの水、４０ｇのダイズ油、および３２ｇの乾燥酵母から調製する。そのスポンジを、Ｈｏｂａｒｔ回転ミキサーで、１分間低速で混合し、次に３分間スピード２で混合する。その後、そのスポンジを、２．５時間、３５℃にて、８５％ ＲＨで発酵させ、その後、５℃にて０．５時間発酵させる。
その後、４００ｇの小麦粉、４ｇの乾燥酵母、４０ｇの塩、２．４ｇのプロピオン酸カルシウム、２４０ｇの高濃度フルクトーストウモロコシシロップ（Ｉｓｏｓｗｅｅｔ）、５ｇのＰＡＮＯＤＡＮ２０５乳化剤、５ｇの酵素活性なダイズ粉、３０ｇの不活性なダイズ粉、２２０ｇの水、および３０ｇのアスコルビン酸溶液（５００ｇの水中に溶解した４ｇのアルコルビン酸から調製）を、そのスポンジに添加する。得られた生地を、Ｄｉｏｓｎａミキサーで、１分間低速で混合し、次いで６分間スピード２で混合する。その後、生地を、周囲温度にて５分間休ませ、次いで、５５０ｇの生地片を量り、５分間休ませ、次いで、各辺を１：４、２：４、３：１５、４：１２および１０の設定で、Ｇｌｉｍｅｋシート状にし、焼成形態に変形させる。４３℃にて９０％ ＲＨで６０分間盛り上がらせた後、その生地を、２９分間、２１８℃にて焼く。
堅さおよび弾性を、ＴＡ−ＸＴ２テクスチャー分析器を使用して測定した。柔らかさ、凝集性、および弾性を、Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ．からのテクスチャー分析器を使用して、テクスチャープロフィール分析によりパン切れを分析することにより決定する。以下の設定を使用した：
検定前の速度：２ｍｍ／ｓ
検定速度：２ｍｍ／ｓ
検定後の速度：１０ｍｍ／ｓ
破裂検定差（ｒｕｐｔｕｒｅ ｔｅｓｔ ｄｉｓｔａｎｃｅ）：１％
差（ｄｉｓｔａｎｃｅ）：４０％
力：０．０９８Ｎ
時間：５．００秒
回数：５回
ロードセル（ｌｏａｄ ｃｅｌｌ）：５ｋｇ
トリガー型：自動−０．０１Ｎ。
結果を、図３および図４に示す。
（実施例１２．デニッシュロール（Ｄａｎｉｓｈ Ｒｏｌｌ）の体積の制御）
デニッシュロールを、２０００ｇのデンマーク改良小麦（Ｃｅｒｅａｌｉａより）、１２０ｇの圧縮酵母、３２ｇの塩、および３２ｇのスクロースを元にして生地から調製した。事前の水分最適化を優先して、生地に水を添加する。
その生地を、Ｄｉｏｓｎａミキサーで混合する（低速で２分間、そして高速で５分間）。混合後のその生地の温度を２６℃に維持する。１３５０ｇの生地を量り、加熱キャビネット中で３０℃にて１０分間休ませる。そのロールを、Ｆｏｒｔｕｎａ型に流し込み、３４℃、相対湿度８５％にて４５分間盛り上がらせる。その後、そのロールを、最初の１３秒間蒸して、Ｂａｇｏ２オーブン中で、１８分間２５０℃にて焼く。焼き上がり後、計量および体積の測定前に、そのロールを、２５分間冷却する。
そのロールを、パン皮の外観、パン粉の均質性、表面の堅さ、アオスブント（ａｕｓｂｕｎｄ）、および比容積（菜種置換法でその体積を計測する）に関して評価する。
これらの判定に基づいて、ＰＳ４改変体は、比容積を増やし、デニッシュロールの品質パラメータを改良することが見出されている。従って、ＰＳ４改変体は、パン製品の体積を制御可能である。
（実施例１３．化学的に発酵させたバニラケーキドーナッツ）
バニラケーキドーナッツを、以下のような標準的なレシピを使用して調製する。
Figure 0004637835
 （混合物の調製手順）
１．へらおよび２０クォートのボウルを備えたＨｏｂａｒｔ Ａ−２００ミキサーを使用する。工程１の成分を合わせ、１０分間スピード１にてブレンドする。２．２分間にわたりスピード１にて工程２の成分を添加し、次いで、さらに１８分間ブレンドする。３．ケーキの仕上げ機械を介して混合物を滑らかにし、そして塊を取り除く。
（バターの調製手順）
１．へらおよび１２クォートのボウルを備えたＨｏｂａｒｔ Ａ−２００ミキサーを使用する。混合物：２０００グラム；水：９００グラム。水をボウルの底部に添加する。２．頂部に混合物を添加する。１分間、スピード１で混合し、それらを２分間スピード２で混合する。３．標的のバターの温度は、開口なべ型揚げ鍋（ｏｐｅｎ ｋｅｔｔｌｅ ｆｒｙｅｒ）中で調理されるドーナツのために７２°Ｆであるはずである。
（揚げ物の手順）
揚げ鍋の温度を、ドーナッツを揚げるために十分に調整されたドーナッツショートニングを使用して３７５°Ｆに設定する（油も汎用ショートニング（ａｌｌ−ｐｕｒｐｏｓｅ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）も使用しない）。
（開口やかん型揚げ鍋について）
直径１．７５インチのカッターを使用してドーナッツ１個あたり４３グラムの重量を標的とする。第１の面を５０秒間揚げ、ひっくり返し、次いで５０〜６０秒間以上揚げる。揚げ鍋から取り出し、そして油分を切って、ドーナッツを冷却する。
（実施例１４．バニラケーキドーナッツにおける新鮮さの維持効果）
ＰＳａｃ−Ｄ３４をバニラケーキドーナッツ（実施例１３）に添加し、焼成後８日目に評価するとおりに新鮮さの維持を改良する。
Figure 0004637835
 （表１０．ＰＳａｃ−Ｄ３４を含まないドーナッツおよび含むドーナッツにおいて評価された新鮮さのパラメータ）
堅さ、凝集性、および弾性を、実施例１１に記載されるとおりにＴＰＡに対して測定する。
新鮮さと、粘着性と、全体的嗜好（ｏｖｅｒａｌｌ ｌｉｋｉｎｇ）を、１が下位であり、９が最良である１〜９のスケールの官能評価によって、評点付けする。
全ての質的パラメータは、ＰＳａｃ−Ｄ３４の添加に起因して改良されている；堅さが、減少し、粘着性および弾性が増加し、そして官能評価に基づく新鮮さ、ガム性、および全体嗜好が、改良されていることが観察される。
（参考文献）
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Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｆ．Ｅ．Ｍ．Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ。
Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｈ．，Ｂａｂａ，Ｔ．，Ｔａｋａｎｏ，Ｔ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｓ．，Ａｒａｉ，Ｙ．（１９８９）．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｌｔｏｔｅｔｒａｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２５５，３７−４１。
本文書において言及される出願および特許の各々、ならびに上記出願および特許の各々において引用または参照される各々の文書（上記出願及び特許の各々の実施（「文書に引用された出願」）、ならびに上記出願および特許の各々において、ならびに文書に引用される任意の出願において引用または言及される任意の製造物についての任意の製造者の指示書またはカタログを包含する）は、本明細書により、本明細書中で参照として援用される。さらに、本文書において引用される全ての文書、および本文書において引用される文書中で引用、または参照される全ての文書、ならびに本文書において引用、または言及される任意の製造物についての任意の製造者の指示書またはカタログは、本明細書により、本明細書中で参照として援用される。
本発明の記載された方法およびシステムの種々の変更および改変は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態において関して記載されているが、特許請求の範囲としての本発明が、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが、理解されるべきである。実際に、分子生物学または関連分野における当業者に明らかである本発明を実施するために、記載された態様の種々の変更は、特許請求の範囲内であることが意図される。
（配列表）
（配列番号１）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列由来の、ＰＳ４参照配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２）
ＰＳａｃ−Ｄ３４配列；１１個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号３）
ＰＳａｃ−Ｄ２０配列；１３個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号４）
ＰＳａｃ−Ｄ１４配列；１４個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号５）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ グルカン、１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ前駆体（ＥＣ３．２．１．６０）（Ｇ４−アミラーゼ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ）（マルトテトラオース形成エキソ−アミラーゼ）。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ２２９６３。
Figure 0004637835
 （配列番号６）
マルトテトラヒドロラーゼをコードするＰ．ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ ｍｔａ遺伝子（ＥＣ番号＝３．２．１．６０）。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１６７３２。
Figure 0004637835
 （配列番号７）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列由来のＰＳ４参照配列。
Figure 0004637835
 （配列番号８）
ＰＳｔｕ−Ｄ３４配列；９個の置換を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号９）
ＰＳｔｕ−Ｄ２０配列；１１個の置換を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号１０）
ＰＳｔｕ−Ｄ１４配列；１２個の置換を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号１１）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｆｅｃｔｏｍａｒｉｎａ）。グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ前駆体（ＥＣ３．２．１．６０）（Ｇ４−アミラーゼ）（マルトテトラオース形成アミラーゼ）（エキソ−マルトテトラヒドロラーゼ）（マルトテトラオース形成エキソ−アミラーゼ）。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ登録番号Ｐ１３５０７。
Figure 0004637835
 （配列番号１２）
Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラオース形成アミラーゼ（ａｍｙＰ）遺伝子、ｃｄｓ。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２４５１６。
Figure 0004637835
 （配列番号１３）
ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３配列；１０個の置換（Ｎ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ，Ｓ３３４Ｐ）、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号１４）
ＰＳａｃ−Ｄ３４（Ｙ３３Ｎ）配列；１０個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号１５）
ＰＳａｃ−Ｄ２０（Ｙ３３Ｎ）配列；１２個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号１６）
ＰＳａｃ−Ｄ１４（Ｙ３３Ｎ）配列；１３個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号１７）
ＰＳｔｕ−Ｄ３４（Ｙ３３Ｎ）配列；８個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号１８）
ＰＳｔｕ−Ｄ２０（Ｙ３３Ｎ）配列；１０個の置換を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号１９）
ＰＳｔｕ−Ｄ１４（Ｙ３３Ｎ）配列；１１個の置換を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２０）
ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３（Ｙ３３Ｎ）配列；９個の置換（Ｄ３４Ｎ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ，Ｓ３３４Ｐ）、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２１）
ＰＳａｃ−Ｄ３４（Ｎ３４Ｄ）配列；１０個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２２）
ＰＳａｃ−Ｄ２０（Ｎ３４Ｄ）配列；１２個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２３）
ＰＳａｃ−Ｄ１４（Ｎ３４Ｄ）配列；１３個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２４）
ＰＳｔｕ−Ｄ３４（Ｎ３４Ｄ）配列；８個の置換、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２５）
ＰＳｔｕ−Ｄ２０（Ｎ３４Ｄ）配列；１０個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２６）
ＰＳｔｕ−Ｄ１４（Ｎ３４Ｄ）配列；１１個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２７）
ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３（Ｎ３４Ｄ）配列；９個の置換（Ｎ３３Ｙ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ，Ｓ３３４Ｐ）、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２８）
ＰＳａｃ−Ｄ３４（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列；９個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号２９）
ＰＳａｃ−Ｄ２０（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列；１１個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号３０）
ＰＳａｃ−Ｄ１４（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列；１２個の置換、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号３１）
ＰＳｔｕ−Ｄ３４（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列；７個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号３２）
ＰＳｔｕ−Ｄ２０（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列；９個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号３３）
ＰＳｔｕ−Ｄ１４（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列；１０個の置換を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （配列番号３４）
ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３（Ｙ３３Ｎ−Ｎ３４Ｄ）配列；８個の置換（Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ａ、Ｈ３０７Ｌ，Ｓ３３４Ｐ）、およびデンプン結合ドメインの欠失を含む、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａマルトテトラヒドロラーゼのアミノ酸配列。
Figure 0004637835
 （他の配列）
親ポリペプチドとしての使用にさらに適切である他のＰＳ４改変体ポリペプチドを、以下に示す。
Figure 0004637835
図１は、上記ＰＳ４改変体の熱安定性改良を示すグラフである。ＰＳ４ｃｃ１は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａ由来の発現制御酵素であり、シグナル配列を含まず、デンプン結合ドメインを欠く。半減期（分間）が、ＰＳ４ｃｃ１、ＰＳａｃ−Ｄ３、ＰＳａｃ−Ｄ２０、およびＰＳａｃ−Ｄ１４に関して、温度（℃）に対してプロットされている。 図２は、モデルパン焼成系試験におけるＰＳａｃ−Ｄ３４の用量効果を示すグラフである。パン粉の固体含量が、ＮＭＲにより測定された。そのパン粉の固体含量として測定された老化に対する影響が、コントロール、０．５ｐｐｍのＤ３４、１ｐｐｍのＤ３４、２ｐｐｍのＤ３４についてのパン焼成後の日数に対してプロットされている。 図３は、パン焼成試験の結果を示すグラフであり、これは、１ｋｇの小麦粉当たり１ｍｇの用量でＰＳａｃ−Ｄ３およびＰｓａｃ−Ｄ１４を添加した際の減少した堅さおよび硬化率を示す。ｈＰａにより測定した堅さが、コントロールについてパン焼成後の日数に対してプロットされている。 図４は、Ｎ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｋ７１Ｒ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔを含まないＰｓａｃ−Ｄ３と比較した、ＰＳａｃ−Ｄ３（Ｎ３３Ｙ、Ｄ３４Ｎ、Ｋ７１Ｒ、Ｇ１３４Ｒ、Ａ１４１Ｐ、Ｉ１５７Ｌ、Ｌ１７８Ｆ、Ａ１７９Ｔ、Ｇ２２３Ａ、Ａ３０７Ｌ、Ｄ３４３Ｅ、Ｓ３３４Ｐ）の増加した軟化効果を示す、パン焼成試験を示す。前者は、７５℃において９．３分間であるＰＳａｃ−Ｄ３のｔ１／２−７５とは対照的に、ｔ１／２−７５ ３．６分間を有する。同様の結果が、Ｎ３３Ｙ，Ｄ３４Ｎにおける変異を欠くＰＳａｃ−Ｄ３改変体を用いて得られる。

Claims (41)

  1. ＰＳ４改変体ポリペプチドを含む食品添加剤であって、
    該ＰＳ４改変体ポリペプチドは、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドに由来し、
    該ＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置番号付けに関して、以下：
    （ｉ）１３４位におけるＲまたはＲの保存的置換体への置換、
    （ｉｉ）１４１位におけるＰまたはＰの保存的置換体への置換、
    （ｉｉｉ）１５７位におけるＬまたはＬの保存的置換体への置換、
    （ｉｖ）２２３位におけるＡまたはＡの保存的置換体への置換、
    （ｖ）３０７位におけるＬまたはＬの保存的置換体への置換、および
    （ｖｉ）３３４位におけるＰまたはＰの保存的置換体への置換
    を含み、ここで、
    該親ポリペプチドは、グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）非マルトース産生性エキソアミラーゼを含み、かつ
    ６０℃における該ＰＳ４改変体ポリペプチドの半減期（ｔ １／２ ）が、該親ポリペプチドに対して１５％以上増加している、
    食品添加剤。
  2. ＰＳ４改変体ポリペプチドを含む食品添加剤であって、
    該ＰＳ４改変体ポリペプチドは、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドに由来し、
    該ＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置番号付けに関して、以下：
    （ｉ）Ｇ１３４のＲ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＱのいずれかへの置換、
    （ｉｉ）Ａ１４１のＰ、Ｖ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＤのいずれかへの置換、
    （ｉｉｉ）Ｉ１５７のＬ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ａ、ＧまたはＣのいずれかへの置換、
    （ｉｖ）Ｇ２２３のＡ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ｌ、ＧまたはＣのいずれかへの置換、
    （ｖ）Ｈ３０７のＬ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、Ａ、ＧまたはＣのいずれかへの置換、および
    （ｖｉ）Ｓ３３４のＰ、Ｖ、Ｃ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、ＮまたはＤのいずれかへの置換
    を含み、ここで、
    該親ポリペプチドは、グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）非マルトース産生性エキソアミラーゼを含み、かつ
    ６０℃における該ＰＳ４改変体ポリペプチドの半減期（ｔ １／２ ）が、該親ポリペプチドに対して１５％以上増加している、
    食品添加剤。
  3. ＰＳ４改変体ポリペプチドを含む食品添加剤であって、
    該ＰＳ４改変体ポリペプチドは、非マルトース産生性エキソアミラーゼ活性を有する親ポリペプチドに由来し、
    該ＰＳ４改変体ポリペプチドは、配列番号１として示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼ配列の位置番号付けに関して、以下：
    （ｉ）Ｇ１３４位のＲへの置換、
    （ｉｉ）Ａ１４１のＰへの置換、
    （ｉｉｉ）Ｉ１５７のＬへの置換、
    （ｉｖ）Ｇ２２３のＡへの置換、
    （ｖ）Ｈ３０７のＬへの置換、および
    （ｖｉ）Ｓ３３４のＰへの置換
    を含み、ここで、
    該親ポリペプチドは、グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）非マルトース産生性エキソアミラーゼを含み、かつ
    ６０℃における該ＰＳ４改変体ポリペプチドの半減期（ｔ １／２ ）が、該親ポリペプチドに対して１５％以上増加している、
    食品添加剤。
  4. 請求項１、請求項２または請求項３のいずれか１項に記載の食品添加剤であって、１２１位における置換をさらに含む、食品添加剤。
  5. 前記１２１位における置換がＧ１２１のＤまたはＤの保存的置換体への置換である、請求項４に記載の食品添加剤。
  6. 請求項１、２、３、４または５のいずれか１項に記載の食品添加剤であって、３３位における置換、３４位における置換、１７８位における置換、および１７９位における置換のうちの、１つ以上をさらに含む、食品添加剤。
  7. 前記３３位における置換がＮ３３の置換である、請求項６に記載の食品添加剤。
  8. 前記３３位における置換がＮ３３のＹまたはＹの保存的置換体への置換である、請求項６に記載の食品添加剤。
  9. 前記３４位における置換がＤ３４の置換である、請求項６、７または８に記載の食品添加剤。
  10. 前記３４位における置換がＤ３４のＮまたはＮの保存的置換体への置換である、請求項６、７または８に記載の食品添加剤。
  11. 請求項１、２、３、４または５のいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    前記親ポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種に由来する、
    食品添加剤。
  12. 前記親ポリペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａまたはＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉに由来する、請求項１１に記載の食品添加剤。
  13. 請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    前記親ポリペプチドは、配列番号１または配列番号５として示される配列を有する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌｉａエキソアミラーゼからの非マルトース産生性エキソアミラーゼである、
    食品添加剤。
  14. 請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    前記親ポリペプチドは、配列番号７または配列番号１１として示される配列を有する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来の非マルトース産生性エキソアミラーゼである、
    食品添加剤。
  15. 請求項１〜１４のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    ６０℃における半減期（ｔ １／２ ）が、前記親ポリペプチドに対して、５０％以上増加している、
    食品添加剤。
  16. 前記６０℃における半減期（ｔ １／２ ）が、前記親ポリペプチドに対して、１００％以上増加している、請求項１５に記載の食品添加剤。
  17. 請求項１〜１６のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    同じ条件下で試験した場合に前記親ポリペプチドと比較して高いエキソ特異性を有する、
    食品添加剤。
  18. 請求項１〜１７のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    前記親ポリペプチドと比較して、１０％以上のエキソ特異性を有する、
    食品添加剤。
  19. 前記親ポリペプチドと比較して２０％以上のエキソ特異性を有する、請求項１８に記載の食品添加剤。
  20. 前記親ポリペプチドと比較して５０％以上のエキソ特異性を有する、請求項１８に記載の食品添加剤。
  21. 請求項１〜２０のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    （ａ）前記３３位における置換は、Ｎ３３のＹまたはＹの保存的置換体への置換を含み；
    （ｂ）前記３４位における置換は、Ｄ３４のＮまたはＮの保存的置換体への置換を含み；
    （ｃ）前記１７８位における置換は、Ｌ１７８のＦまたはＦの保存的置換体への置換を含み；または
    （ｄ）前記１７９位における置換は、Ａ１７９のＴまたはＴの保存的置換体への置換を含む、
    食品添加剤。
  22. 請求項１〜２１のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    置換Ｇ１３４Ｒ、置換Ａ１４１Ｐ、置換Ｉ１５７Ｌ、置換Ｇ２２３Ａ、置換Ｈ３０７Ｌ、および置換Ｓ３３４Ｐを、１７８位におけるフェニルアラニンもしくは１７９位におけるスレオニンまたはその両方とともに含む、
    食品添加剤。
  23. 請求項１〜２２のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    配列ＰＳａｃ−Ｄ３４（配列番号２）または配列ＰＳｔｕ−Ｄ３４（配列番号８）を有する、
    食品添加剤。
  24. 請求項１〜２３のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    １２１位における置換をさらに含む、
    食品添加剤。
  25. 前記１２１位における置換がＧ１２１のＤまたはＤの保存的置換体への置換である、請求項２４に記載の食品添加剤。
  26. 請求項２４または２５に記載の食品添加剤であって、
    配列ＰＳａｃ−Ｄ２０（配列番号３）または配列ＰＳｔｕ−Ｄ２０（配列番号９）を有する、
    食品添加剤。
  27. 請求項１〜２６のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    ８７位における置換をさらに含む、
    食品添加剤。
  28. 前記８７位における置換がＧ８７のＳまたはＳの保存的置換体への置換である、請求項２７に記載の食品添加剤。
  29. 請求項２７または２８に記載の食品添加剤であって、
    配列ＰＳａｃ−Ｄ１４（配列番号４）を有する、
    食品添加剤。
  30. 請求項２７または２８に記載の食品添加剤であって、
    配列ＰＳｔｕ−Ｄ１４（配列番号１０）を有する、
    食品添加剤。
  31. 請求項１〜３０のうちのいずれか１項に記載の食品添加剤であって、
    配列ＰＳａｃ−ｐＰＤ７７ｄ３３（配列番号１３）を有する、
    食品添加剤。
  32. デンプン結合ドメインを欠失する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の食品添加剤。
  33. 請求項１〜３２のいずれか１項に記載のＰＳ４改変体ポリペプチドをコードし得る核酸。
  34. デンプンを処理するためのプロセスであって、該プロセスは、
    該デンプンを、請求項１〜３２のうちのいずれか１項に記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドと接触させる工程；および
    該ポリペプチドが該デンプンから１つ以上の直鎖状生成物を生成するのを許容する工程、
    を包含する、プロセス。
  35. 食品を調製するためのプロセスであって、
    請求項１〜３２のうちのいずれか１項に記載されるポリペプチドを、食品成分と混合する工程、
    を包含する、プロセス。
  36. パン製品を製造するためのプロセスであって、該プロセスは、
    （ａ）デンプン媒体を提供する工程；
    （ｂ）該デンプン媒体に、請求項１〜３２のうちのいずれか１項に記載されるＰＳ４改変体ポリペプチドを添加する工程；および
    （ｃ）工程（ｂ）の間または工程（ｂ）の後に該デンプン媒体に熱を適用して、パン製品を製造する工程、
    を包含する、プロセス。
  37. 食品において使用するため、または、食品の調製のための組成物であって、
    小麦粉と、
    請求項１〜３２のうちのいずれか１項に記載のＰＳ４改変体ポリペプチドと、
    を含む、組成物。
  38. 生地製品における、該生地製品の老化を遅延または低減するための、請求項１〜３２のうちのいずれか１項に記載のＰＳ４改変体ポリペプチドの使用。
  39. 生地製品における、該生地製品の有害な老化を遅延または低減するための、請求項１〜３２のうちのいずれか１項に記載のＰＳ４改変体ポリペプチドの使用。
  40. 請求項１〜３２のうちのいずれか１項に記載のＰＳ４改変体ポリペプチドと、ノバミル、またはマルトース産生性α−アミラーゼ活性を有するその改変体、ホモログ、もしくは変異体との組み合わせ。
  41. 請求項４０に記載の組合せで処理することにより製造される、食品。
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