JP4623604B2

JP4623604B2 - 新規なオキシインドール誘導体

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Publication number: JP4623604B2
Application number: JP2008543069A
Authority: JP
Inventors: 典昭忍; 邵軍; 正孝小林; 孝男盛
Original assignee: THERAVALUES CO.
Current assignee: THERAVALUES CO.
Priority date: 2006-11-06
Filing date: 2007-11-05
Publication date: 2011-02-02
Anticipated expiration: 2027-11-05
Also published as: CN101535302A; EP2130829A1; EP2130829A4; JPWO2008056634A1; US20100076049A1; US8053461B2; WO2008056634A1

Description

本発明は、オキシインドール誘導体、及びその医薬用途に関する。

キナーゼは、ＡＴＰなどの高エネルギーリン酸結合を有する分子からリン酸基を基質あるいはターゲット分子に転移（リン酸化）する酵素であり、中でもタンパク質分子をリン酸化する酵素であるプロテインキナーゼは細胞内における様々なシグナル伝達経路内や代謝経路の調節因子として機能している。しかしながらキナーゼの機能異常は、癌などの疾患の原因になることも多く、特定のキナーゼを阻害する機能を有する薬剤の開発により病気の治療または予防に役立てることが期待されている。

セリン／スレオニンキナーゼであるPim-1は、最初はマウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）によって引き起こされるＴ細胞リンパ腫内において白血病ウイルスの挿入によってしばしば活性化される遺伝子として同定されたセリン／スレオニンキナーゼである（非特許文献１）。また、細胞質内のPim-1が種々の造血細胞内においてアポトーシスを阻害するための因子として機能することが報告されている（非特許文献２）。

Pim-1の発現は、造血細胞内だけではなく、リンパ系から前立腺、精巣、口腔上皮細胞にまで及ぶことが知られており、Pim-1と顕著な配列相同性を有するセリン／スレオニンキナーゼである、Pim-2とPim-3についても大部分の機能がPim-1と重複していることが知られている（非特許文献３）。

また、Pim-3が膵臓、及び肝細胞の悪性病変において発現するが、正常な膵臓組織においては発現しないことが知られており、Pim-3がヒト膵臓癌細胞内、及び、肝細胞癌細胞株においてアポトーシスを阻害するための因子として機能することが報告されている（非特許文献４、非特許文献５）。

Cuypers, H.T., Selten, G., Quint, W., Zijlstra, M., Maandag, E.R., Boelens, W., van Wezenbeek, P., Melief, C., Berns, A. Murine leukemia virus-induced T-cell lymphomagenesis: integration of proviruses in a distinct chromosomal region. Cell, 37:141-150, 1984 Selten, G., Cuypers, H.T. & Berns, A. Proviral activation of the putative oncogene Pim-1 in MuLV induced T-cell lymphomas. EMBO J, 4:1793-1798, 1985 Malte Bachmann, Tarik Moroy, The serine/threonine kinase Pim-1,The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 37 (2005) 726-730 Chifumi Fujii, Yasunari Nakamoto, Peirong lu, Koichi Tsuneyama, Boryana K. Popivanova, Shuichi Kaneko and Naofumi Mukaida, Aberrant expression of serine/threonine kinase Pim-3 in hepatocellular carcinoma development and its role in the proliferation of human hepatoma cell lines, Int. J. Cancer: 114, 209-218 (2005) Ying-Yi Li, Boryana K. Popivanova, Youichiro Nagai, hiroshi Ishiokura, Chifumi Fujii, and Naofumi Mukaida, Pim-3, a Proto-Oncogene with Serine/Threonine Kinase Activity, Is Aberrantly Expressed in Human Pancreatic Cancer and Phosphorylates Bad to Block Bad-Mediated Apoptosis in Human Pancreatic Cancer Cell Line, Cancer Res 2006; 66: (13). July 1, 2006; 6741-7.

本発明は、キナーゼの活性を阻害する薬剤として有用な化合物またはその薬学的に許容される塩、及び癌等のキナーゼに関連する疾患を治療および/または予防する薬剤として有用な化合物またはその薬学的に許容される塩を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、Pimキナーゼなど、ある種のキナーゼを不活性化できる特定の化合物またはその薬学的に許容される塩が、固形癌をはじめとするキナーゼに起因する各種疾患の予防および/または治療に有効に作用することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下を含む。

〔１〕
下記一般式（I）

〔式中、R₁−R₈は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、C1−C6アルキル基、C2−C8アルケニル基、C1-C6アルキルカルボニル基または−COOR₉（式中、R₉は、水素原子、C1−C6アルキル基またはC2−C8アルケニル基を示す。）を置換基に有してもよく；
Ｘは、硫黄原子、酸素原子またはNR₁₀（式中、R₁₀は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、C1−C6アルキル基、C2−C8アルケニル基またはC1−C6アルコキシ基を示す。）を示す。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩。
〔２〕
R₁、R₂、R₄、R₅が、それぞれ独立に水素原子またはCOOR₉（式中、R₉は、水素原子、C1−C6アルキル基またはC2−C8アルケニル基を示す。）である、〔１〕に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
〔３〕
R₃、R₆が、それぞれ独立に水素原子またはC1-C6アルキルカルボニル基である、〔１〕または〔２〕のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
〔４〕
R₇、R₈が、水素原子である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
〔５〕
Ｘが酸素原子である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
〔６〕
下記式（１）〜（７）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩；

〔７〕
〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、キナーゼ阻害剤。
〔８〕
前記キナーゼ阻害剤が、Pimキナーゼ阻害剤である、〔７〕に記載のキナーゼ阻害剤。
〔９〕
前記キナーゼ阻害剤が、アポトーシス誘導剤である、〔７〕または〔８〕に記載のキナーゼ阻害剤。
〔１０〕
〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、キナーゼ関連性疾患の予防および/または治療剤。
〔１１〕
前記キナーゼ関連性疾患が、癌、細胞増殖異常、心臓障害、心筋梗塞、動脈硬化症、閉塞性循環器障害、リウマチ関節炎、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性網膜症、神経変性疾患、自己免疫病、炎症性疾患、糖尿病またはウイルス性疾患である、〔１０〕に記載の予防および/または治療剤。
〔１２〕
前記癌が、固形癌である、〔１１〕に記載の予防および/または治療剤。
〔１３〕
キナーゼ関連性疾患の予防および/または治療剤の製造のための、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。

以下に本明細書において記載する用語、記号等の意義を説明し、本発明を詳細に説明する。

本発明において、「キナーゼ活性」とは、各種キナーゼにより標的タンパク質がリン酸化されることをいう。該「キナーゼ活性」には、セリン／スレオニンキナーゼにより標的タンパク質がリン酸化されること、及びPimキナーゼにより標的タンパク質がリン酸化されることを含む。

本発明における、「Pimキナーゼ」とは、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質であり、具体的には、Pim-1キナーゼ、Pim-2キナーゼ、Pim-3キナーゼなどがあげられる。

本発明において、「Pim-1キナーゼ」とは、マウス白血病ウィルス（MuLV）によって引き起こされたT細胞リンパ腫内でMuLVの挿入によって活性化される遺伝子として同定された、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質である（Cuypers, H.T., Selten, G., Quint, W., Zijlstra, M., Maandag, E.R., Boelens, W., van Wezenbeek, P., Melief, C., Berns, A. Murine leukemia virus-induced T-cell lymphomagenesis: integration of proviruses in a distinct chromosomal region. Cell, 37:141-150, 1984）。

本発明において、「Pim-2キナーゼ」とは、「Pim-1キナーゼ」と同様にマウス白血病ウィルス（MuLV）によって引き起こされたT細胞リンパ腫内でMuLVの挿入によって活性化される遺伝子として同定された、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質である（Andrew Macdonald, David G Campbell, Rachel Toth, Hilary McLauchlan, C James, Hastie, and J Simon C Arthur, BMC Cell Biol. 2006; 7: 1.）。

本発明において、「Pim-3キナーゼ」とは、ラットの褐色細胞種細胞系のPC12細胞の脱分極によって誘発された遺伝子（KID-1）として同定された、セリン／スレオニンキナーゼ活性を有するタンパク質である（Feldman JD, Vician L, Crispino M, Tocco G, Marcheselli VL, Bazan NG, Baudry M, Herschman HR., J Biol Chem. 1998 Jun 26;273(26):16535-43.）。

本発明において、「キナーゼ阻害」とは、標的タンパク質が各種キナーゼによりリン酸化されるのを阻害する機能のことをいう。標的タンパク質のリン酸化のあとに続いて、細胞のアポトーシス阻害反応が引き起こされる場合には、アポトーシス阻害能を阻害すること、即ち、アポトーシス誘導を含む。

本発明において、「セリン／スレオニンキナーゼ阻害」とは、前記キナーゼ阻害の定義において、キナーゼがセリン／スレオニンキナーゼである場合をいう。

本発明において、「Pimキナーゼ阻害」とは、前記キナーゼ阻害の定義において、キナーゼがPimキナーゼである場合をいう。

本発明において、「キナーゼ阻害剤」とは、キナーゼによる標的タンパク質のリン酸化を阻害する機能やアポトーシス誘導能を有する化合物を有効成分として含有する医薬組成物のことをいう。

本発明において、「セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤」とは、セリン／スレオニンキナーゼ阻害能を有する化合物を有効成分として含有する医薬組成物のことをいう。

本発明において、「Pimキナーゼ阻害剤」とは、Pimキナーゼ阻害能を有する化合物を有効成分として含有する医薬組成物のことをいう。

本発明における「キナーゼ阻害剤」として好ましくは、「セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤」であり、より好ましくは「Pimキナーゼ阻害剤」であり、特に好ましくは「Pim-1活性阻害剤」である。

本発明において「キナーゼ関連性疾患」とは、「キナーゼ活性に起因する疾患」を意味し、少なくともキナーゼ活性による標的タンパク質のリン酸化、及びそのあとに続く、細胞のアポトーシス阻害を含む種々の反応が疾患の原因または疾患の進行に関与する疾患を意味する。

本発明において「Pim関連性疾患」とは、「Pimキナーゼ活性に起因する疾患」を意味し、少なくともPimキナーゼ疾患による標的タンパク質のリン酸化、及びそのあとに続く、細胞のアポトーシス阻害を含む種々の反応が疾患の原因または疾患の進行に関与する疾患を意味する。

このような「キナーゼ関連性疾患」、あるいは「Pim関連性疾患」としては、具体的には、癌、細胞増殖異常、心臓障害、心筋梗塞、動脈硬化症、閉塞性循環器障害、リウマチ関節炎、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性網膜症、神経変性疾患、自己免疫病、炎症性疾患、糖尿病、ウイルス性疾患などがあげられる。

本発明において、「固形癌」とは、血液癌を除く、全ての癌のこと言い、例えば、胃癌、肺癌、乳癌、食道癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、子宮癌、皮膚癌、脳腫瘍、前立腺癌などのことをいう。

本発明において「アルキル基」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される一価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和炭素−炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素の部分集合を有する。アルキル基は直鎖状または分枝鎖状の構造を含む。「Ｃ１−Ｃｎアルキル基」とは、炭素原子数が１〜ｎを示す。

具体的には例えば、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、２−メチル−１−プロピル基、２−メチル−２−プロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−１−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基、２，２−ジメチル−１−プロピル基、１−へキシル基、２−へキシル基、３−へキシル基、２−メチル−１−ペンチル基、３−メチル−１−ペンチル基、４−メチル−１−ペンチル基、２−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−２−ペンチル基、４−メチル−２−ペンチル基、２−メチル−３−ペンチル基、３−メチル−３−ペンチル基、２，３−ジメチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−１−ブチル基、２，２−ジメチル−１−ブチル基、２−エチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−２−ブチル基、２，３−ジメチル−２−ブチル基等があげられ、好ましくはメチル基である。

本明細書における「アルケニル基」は、少なくとも1個の二重結合（２個の隣接SP2炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（E）またはツザンメン（Z）、シスまたはトランス配置をとることができる。「Ｃ１−Ｃｎアルケニル基」とは、炭素原子数が１〜ｎを示す。アルケニル基としては、直鎖状または分枝鎖状のものがあげられる。
このようなアルケニル基は、具体的には、たとえば、ビニル基、アリル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基（シス、トランスを含む）、３−ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基などがあげられ、好ましくはビニル基である。

本発明において、Ｃ１−Ｃｎアルキルカルボニル基とは、カルボニル基に前記定義の「Ｃ１−Ｃｎアルキル基」が結合した基であることを意味する。具体的には、例えばメチルカルボニル基、エチルカルボニル基、１−プロピルカルボニル基、２−プロピルカルボニル基、２−メチル−１−プロピルカルボニル基、２−メチル−２−プロピルカルボニル基、１−ブチルカルボニル基、２−ブチルカルボニル基、１−ペンチルカルボニル基、２−ペンチルカルボニル基、３−ペンチルカルボニル基、２−メチル−１−ブチルカルボニル基、３−メチル−１−ブチルカルボニル基、２−メチル−２−ブチルカルボニル基、３−メチル−２−ブチルカルボニル基、２，２−ジメチル−１−プロピルカルボニル基、等があげられ、好ましくは、メチルカルボニル基または1-プロピルカルボニル基である。

本発明において「Ｃ１−Ｃｎアルコキシ基」とは、前記定義の「Ｃ１−Ｃｎアルキル基」が結合したオキシ基であることを意味する。具体的には例えば、メトキシ基、エトキシ基、１−プロピルオキシ基、２−プロピルオキシ基、２−メチル−１−プロピルオキシ基、２−メチル−２−プロピルオキシ基、１−ブチルオキシ基、２−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、２−ペンチルオキシ基、３−ペンチルオキシ基、２−メチル−１−ブチルオキシ基、３−メチル−１−ブチルオキシ基、２−メチル−２−ブチルオキシ基、３−メチル−２−ブチルオキシ基、２，２−ジメチル−１−プロピルオキシ基、１−へキシルオキシ基、２−へキシルオキシ基、３−へキシルオキシ基、２−メチル−１−ペンチルオキシ基、３−メチル−１−ペンチルオキシ基、４−メチル−１−ペンチルオキシ基、２−メチル−２−ペンチルオキシ基、３−メチル−２−ペンチルオキシ基、４−メチル−２−ペンチルオキシ基、２−メチル−３−ペンチルオキシ基、３−メチル−３−ペンチルオキシ基、２，３−ジメチル−１−ブチルオキシ基、３，３−ジメチル−１−ブチルオキシ基、２，２−ジメチル−１−ブチルオキシ基、２−エチル−１−ブチルオキシ基、３，３−ジメチル−２−ブチルオキシ基、２，３−ジメチル−２−ブチルオキシ基等があげられ、好ましくは、メトキシ基である。

本発明において「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味し、好ましくは、臭素原子である。

本明細書における「塩」とは、本発明に係る化合物と塩を形成し、かつ薬理学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば、無機酸塩、有機酸塩、無機塩基塩、有機塩基塩、酸性または塩基性アミノ酸塩などがあげられる。

無機酸塩の好ましい例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などがあげられ、有機酸塩の好ましい例としては、例えば酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ステアリン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などがあげられる。

無機塩基塩の好ましい例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられ、特に好ましくはナトリウム塩である。有機塩基塩の好ましい例としては、例えばジエチルアミン塩、ジエタノールアミン塩、メグルミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩などがあげられる。

酸性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられ、塩基性アミノ酸塩の好ましい例としては、例えばアルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩などがあげられる。

本明細書においては、化合物の構造式が便宜上一定の異性体を表すことがあるが、本発明には化合物の構造上生ずる総ての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体および異性体混合物を含み、便宜上の式の記載に限定されるものではなく、いずれか一方の異性体でも混合物でもよい。従って、本発明の化合物には、分子内に不斉炭素原子を有し光学活性体およびラセミ体が存在することがありうるが、本発明においては限定されず、いずれもが含まれる。また、結晶多形が存在することもあるが同様に限定されず、いずれかの結晶形が単一であっても結晶形混合物であってもよく、そして、本発明にかかる化合物には無水物と水和物とが包含される。さらに、本発明にかかる化合物が生体内で分解されて生じる、いわゆる代謝物も本発明の特許請求の範囲に包含される。

本発明の化合物およびその好ましい態様は下記の通りである。

下記一般式（Ｉ）で表される化合物。

式中、R₁−R₈は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、C1−C6アルキル基、C2−C8アルケニル基、C1-6アルキルカルボニル基または−COOR₉（式中、R₉は、水素原子、C1−C6アルキル基またはC2−C8アルケニル基を示す。）を示す。

R₁、R₂、R₄、R₅は、好ましくは、それぞれ独立に水素原子または−COOR₉（式中、R₉は、水素原子、C1−C6アルキル基またはC2−C8アルケニル基を示す。）であり、より好ましくは、それぞれ独立に水素原子または−COOHである。

R₁またはR₄のいずれかまたは双方がCOOR₉のとき、該置換基の位置は、少なくとも式（Ｉ）中、５位または５’位あるいは６位または６’位に存在することが好ましい。

R₃、R₆は、好ましくは、それぞれ独立に水素原子またはC1-6アルキルカルボニル基であり、より好ましくは、それぞれ独立に水素原子、メチルカルボニル基または、1-プロピルカルボニル基である。

R₇、R₈は、好ましくは、それぞれ独立に水素原子である。

式中、Ｘは、硫黄原子、酸素原子またはNR₁₀（式中、R₁₀は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、C1−C6アルキル基、C2−C8アルケニル基またはC1−C6アルコキシ基を示す。）を示し、好ましくは、酸素原子である。

上記式（Ｉ）において置換基R₁〜R₈の好ましい態様は下記のとおりである。
（１）R₁=R₂=R₄=R₅=水素原子、R₃=R₆=水素原子、R₇=R₈=水素原子。
（２）R₁=R₂=R₄=R₅=水素原子、R₃=R₆= C1-6アルキルカルボニル基、R₇=R₈=水素原子。
（３）R₁=R₂=R₄=R₅=水素原子、R₃=水素原子、R₆= C1-6アルキルカルボニル基、R₇=R₈=水素原子。
（４）R₁=R₄=−COOR₉（式中、R₉は、水素原子、C1−C6アルキル基、C2−C8アルケニル基またはC1−C6アルコキシ基を示す。）、R₂=R₅=水素原子、R₃=R₆=水素原子、R₇=R₈=水素原子。
（５）R₁=R₂=R₅=水素原子、R₄=−COOR₉（式中、R₉は、水素原子、C1−C6アルキル基、C2−C8アルケニル基またはC1−C6アルコキシ基を示す。）、R₃= C1-6アルキルカルボニル基、R₆=水素原子、R₇=R₈=水素原子。

このような式（Ｉ）を表す化合物として具体的にはたとえば下記の化合物（１）〜（７）があげられる。

前記本発明で用いる化合物およびこれらの好ましい化合物は、例えば下記の合成方法により得ることができる。

以下の合成例において、R₁〜R₈、Xは、前記式（I）における置換基R₁〜R₈、Xと同意義を表す。

方法Ａ：

方法Ａにおいて、オキシインドール誘導体（1a）にジホルミルフラン誘導体（2a）と塩基を加え、１０分〜７２時間、-７８〜４０℃で攪拌し、単離・精製を行うことにより目的化合物（3a）を得ることができる。

使用される溶媒は、本反応に関与しないものであれば特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノールのようなアルコール系溶媒、ＴＨＦ、ジオキサンのようなエーテル系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレンのような芳香族系溶媒、アセトニトリルのようなニトリル系溶媒、ジクロロメタンのようなハロゲン系溶媒、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）や、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）であり、好ましくはエタノールである。

使用される塩基としては、例えば、トリエチルアミン、ピリジン、ピペリジン、イミダゾールなどの有機塩基類、水素化リチウム、水素化ナトリウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の水素化物類、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシドなどのアルカリ金属アルコキシド類、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムのようなアルカリ金属炭酸塩類、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムのようなアルカリ金属重炭酸塩類、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムのようなアルカリ金属水酸化物類があげられるが、好ましくは、有機塩基類であり、より好ましくはピペリジンである。

反応温度は、通常−７８〜４０℃であり、好ましくは、０〜３０℃である。

反応時間は、反応温度により異なるが、通常１０分〜２４時間であり、好ましくは２４〜４８時間である。

単離・精製は、抽出、濃縮、留去、結晶化、ろ過、再結晶、各種クロマトグラフィー等の通常の科学操作を適応して行われるが、好ましくは、ろ過である。

方法Ｂ：

方法Ｂにおいて、ジホルミルフラン誘導体（2b）を溶媒に溶かし、これにオキシインドール誘導体（1b）を溶媒に溶かした溶液を徐々に加える。添加終了後、１０分〜２時間、-７８〜３０℃で攪拌し、単離・精製を行うことにより、中間体（3b）を得ることができる。

次いで、溶媒の存在下、前記中間体（3b）にオキシインドール誘導体（4b）と塩基を加え、１０分〜２４時間、０〜３０℃で攪拌し、単離・精製を行うことにより目的化合物（5b）を得ることができる。

反応温度は、通常−７８℃〜４０℃であり、好ましくは、０℃〜３０℃である。

反応時間は、反応温度により異なるが、通常１０分間〜２４時間であり、好ましくは６時間〜１８時間である。

オキシインドール誘導体は、当業者が用いる通常の手法により合成することが可能だが、例えば、N−アセチル体や、カルボキシル基置換体は下記の方法で合成することができる。

Nアセチル体（2c）の合成：

オキシインドール誘導体（1c）を無水酢酸に溶かし、２４〜７２時間、還流した後、単離・精製を行うことにより、N-アセチル体（2c）を合成することができる。

反応時間は、反応温度により異なるが、通常１０分間から２４時間であり、好ましくは６時間〜１８時間である。

カルボキシル基置換体（3d）の合成：

塩化アルミニウム（無水）を塩化メチレンにけん濁させ、攪拌させておき、この溶液にオキシインドール誘導体（1d）を加える。この溶液に塩化クロロアセチルを滴下して攪拌し、単離・精製を行うことにより、クロロアセチル基置換体（2d）を合成することができる。さらに通常の手法に従って、フェニル基に結合しているクロロアセチル基をアルカリで処理することにより、カルボキシル基置換体（3d）を得ることができる。

反応温度は、０〜５０℃であり、好ましくは、４０〜５０℃である。

反応時間は、反応温度により異なるが、通常１〜５時間であり、好ましくは、１〜２時間である。

カルボキシル基置換体（4e）の合成：

水素化ナトリウムにDMSOを加え、マロン酸ジメチルを攪拌しながら徐々に加える。この溶液に（1e）を加え、単離精製することにより、ジメチルエステル体（2e）を得ることができる。ジメチルエステル体（2e）に塩酸溶液を加え、単離・精製することにより、メチルエステル体（3e）を得ることができる。カルボン酸体(3e)をパラジウムカーボンで還元し、単離・精製することにより、オキシインドールエチルエステル体（4e）を得ることができる。（4e）をエタノール性水酸化カリウム溶液に溶かした後、さらに塩酸水溶液を加え単離・精製を行うことにより、カルボキシル基置換対（5e）を得ることができる。

反応温度は、０〜１００℃であり、好ましくは、２０〜５０℃である。

単離・精製は、抽出、濃縮、留去、結晶化、ろ過、再結晶、各種クロマトグラフィー等の通常の科学操作を適応して行うことができる。

本発明で用いる化合物の製造における原料化合物・各種試薬は、塩や水和物あるいは溶媒和物を形成していてもよく、いずれも出発原料、使用する溶媒等により異なり、また反応を阻害しない限りにおいて特に限定されない。用いる溶媒についても、出発原料、試薬等により異なり、また反応を阻害せず出発物質をある程度溶解するものであれば特に限定されないことはいうまでもない。本発明で用いる化合物がフリー体として得られる場合、前記化合物が形成していてもよい塩またはそれらの水和物の状態に常法に従って変換することができる。

本発明で用いる化合物が化合物の塩または水和物として得られる場合、前記の化合物のフリー体に常法に従って変換することができる。

また、本発明で用いる化合物について得られる種々の異性体（例えば幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、回転異性体、立体異性体、互変異性体、等）は、通常の分離手段、例えば再結晶、ジアステレオマー塩法、酵素分割法、種々のクロマトグラフィー（例えば薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、等）を用いることにより精製し、単離することができる。

本発明で用いる化合物は、キナーゼ阻害活性を有する。該化合物は、特にセリン／スレオニンキナーゼ阻害活性を有し、その中でも特にPimキナーゼ阻害活性を有する。Pimキナーゼ阻害活性としては、例えば、Pim-1キナーゼ阻害活性、Pim-2キナーゼ阻害活性、Pim-3キナーゼ阻害活性などがあげられる。

本発明で用いる化合物は、キナーゼ阻害活性を有するため、該化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するキナーゼ阻害剤、特にPimキナーゼ阻害剤として有用である。

本発明で用いる化合物は、キナーゼ阻害活性を有するため、キナーゼ関連性疾患、特にPimキナーゼ関連性疾患の予防および/または治療剤として有効である。具体的な疾患としては、例えば、癌、アポトーシス誘導、抗癌剤増強、抗癌剤耐性解除、あるいは、細胞増殖異常、心臓障害、心筋梗塞、動脈硬化症、閉塞性循環器障害、リウマチ関節炎、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性網膜症、神経変性疾患、自己免疫病、炎症性疾患、糖尿病、ウイルス性疾患などが挙げられ、特に癌の予防および/または治療剤として有効に作用する。

本発明で用いる化合物は、アポトーシスを誘導する薬剤となり得るので、アポトーシス阻害により引き起こされる疾患、具体的には、例えば閉塞性循環器障害、動脈硬化、心筋梗塞などの予防および/または治療剤としても有用である。

本発明のキナーゼ活性を阻害する方法としては、前記本発明で用いる化合物の医薬的に有効な量を、キナーゼ関連性疾患の患者に投与する方法があげられる。また、本発明のキナーゼ関連性疾患の予防および/または治療方法は、前記本発明で用いる化合物の医薬的に有効な量を、キナーゼ関連性疾患の患者に投与することを含む。なお、化合物についての好ましい態様は前記のとおりである。

本発明の使用は、キナーゼ阻害剤の製造のための、前記本発明で用いる化合物の使用を含む。また、キナーゼ関連性疾患の予防および/または治療剤の製造のための、前記本発明で用いる化合物の使用を含む。

本発明で用いる化合物を既存の抗癌効果を有する化合物、たとえばシスプラチン、５-フルオロウラシル、ゲムシタビン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）などと併用するととりわけ制癌効果が著明に増強される。

したがって、本発明の別の態様としては、本発明で用いる化合物と、化学療法治療剤とを組み合わせてなる、併用癌治療剤があげられる。

このような併用癌治療剤は、前記式のいずれかで表される化合物またはその好ましい態様のいずれかで表される化合物と公知の抗癌効果を有する化合（抗癌化合物）との配合剤であっても、前記式のいずれかで表される化合物またはその好ましい態様を含む薬剤と、公知の抗癌効果を有する化合物を含む薬剤（化学療法治療剤）とからなるキットであってもよい。

本発明で用いる化合物は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、投与できる。上記化合物をキナーゼ関連性疾患の予防および/または治療に使用する場合は、好ましくは９０％、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上に精製された化合物を使用することが好ましい。

上記化合物は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、あるいはエアロゾル化して吸入剤の形で、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液または懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。

例えば、本発明の化合物を生理学的に許容し得る担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリー等の香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂等の液状担体を含有することができる。注射剤は、本発明のポリペプチドを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。

このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等）に対して投与することができ、癌の予防および/または治療剤、アポトーシス誘導剤または抗癌剤増強剤あるいは、細胞増殖異常、心臓障害、循環器障害、心筋梗塞、動脈硬化症、閉塞性循環器障害、リウマチ関節炎、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性網膜症、神経変性疾患、自己免疫病、炎症性疾患、糖尿病、ウイルス性疾患患者の予防および/または治療にとして用いることができる。

投与量は患者の、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性差、薬剤に対する感受性差などにより著しく異なるが、通常成人として１日あたり、約０．０３−１０００ｍｇ、好ましくは０．１−５００ｍｇ、さらに好ましくは０．１−１００ｍｇを１日１−数回に分けて投与する。注射剤の場合は、通常約１μｇ／ｋｇ−３０００μｇ／ｋｇであり、好ましくは約３μｇ／ｋｇ−１０００μｇ／ｋｇである。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

化合物（１）のPim-1キナーゼ阻害活性を示した図である。棒グラフは、化合物（１）のPim-1キナーゼ阻害活性の濃度依存性を示したものであり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長450nmの吸光度を示し、Pim-1キナーゼ活性を意味する。線グラフは、化合物（１）のPim-1キナーゼ阻害活性のＩＣ５０を検量するための図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、DMSO溶媒コントロールを100%としたPim-1キナーゼ活性阻害率（％）を示す。化合物（２）のPim-1キナーゼ阻害活性を示した図である。棒グラフは、化合物（２）のPim-1キナーゼ阻害活性の濃度依存性を示したものであり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長450nmの吸光度を示し、Pim-1キナーゼ活性を意味する。線グラフは、化合物（２）のPim-1キナーゼ阻害活性のＩＣ５０を検量するための図であり、縦軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、DMSO溶媒コントロールを100%としたPim-1キナーゼ活性阻害率（％）を示す。化合物（３）のPim-1キナーゼ阻害活性を示した図である。棒グラフは、化合物（３）のPim-1キナーゼ阻害活性の濃度依存性を示したものであり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長450nmの吸光度を示し、Pim-1キナーゼ活性を意味する。線グラフは、化合物（３）のPim-1キナーゼ阻害活性のＩＣ５０を検量するための図であり、縦軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、DMSO溶媒コントロールを100%としたPim-1キナーゼ活性阻害率（％）を示す。化合物（９）のPim-1キナーゼ阻害活性を示した図である。棒グラフは、化合物（９）のPim-1キナーゼ阻害活性の濃度依存性を示したものであり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長450nmの吸光度を示し、Pim-1キナーゼ活性を意味する。線グラフは、化合物（９）のPim-1キナーゼ阻害活性のＩＣ５０を検量するための図であり、縦軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、DMSO溶媒コントロールを100%としたPim-1キナーゼ活性阻害率（％）を示す。化合物（１０）のPim-1キナーゼ阻害活性を示した図である。棒グラフは、化合物（１０）のPim-1キナーゼ阻害活性の濃度依存性を示したものであり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長450nmの吸光度を示し、Pim-1キナーゼ活性を意味する。線グラフは、化合物（１０）のPim-1キナーゼ阻害活性のＩＣ５０を検量するための図であり、縦軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、DMSO溶媒コントロールを100%としたPim-1キナーゼ活性阻害率（％）を示す。化合物（７）のPim-1キナーゼ阻害活性を示した図である。棒グラフは、化合物（７）のPim-1キナーゼ阻害活性の濃度依存性を示したものであり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長450nmの吸光度を示し、Pim-1キナーゼ活性を意味する。線グラフは、化合物（７）のPim-1キナーゼ阻害活性のＩＣ５０を検量するための図であり、縦軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、DMSO溶媒コントロールを100%としたPim-1キナーゼ活性阻害率（％）を示す。化合物（１）の膵癌細胞株（ＭｉａＰａＣａ−２）に対する細胞障害性を示した図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、障害活性を意味する。なお、図中のＣＤＤＰは、比較対象のシスプラチンを意味する。化合物（１）の肺癌細胞株（Ａ５４９）に対する細胞障害性を示した図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、障害活性を意味する。なお、図中のＣＤＤＰは、比較対象のシスプラチンを意味する。化合物（１）の口腔扁平上皮癌細胞株（ＨＳＣ−３）に対する細胞障害性を示した図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、障害活性を意味する。なお、図中のＣＤＤＰは、比較対象のシスプラチンを意味する。化合物（１）の食道扁平上皮癌細胞株（Ｔ．Ｔｎ）に対する細胞障害性を示した図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、障害活性を意味する。なお、図中のＣＤＤＰは、比較対象のシスプラチンを意味する。化合物（１）の子宮癌細胞株（ＨｅＬａ）に対する細胞障害性を示した図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、障害活性を意味する。化合物（１）の正常腎細胞株（２９３）に対する細胞障害性を示した図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、障害活性を意味する。棒グラフは、化合物（１）の前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）に対する細胞障害性を示した図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、障害活性を意味する。線グラフは、生細胞数の経時変化を観察したものであり、横軸は時間（hr）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、細胞致死効果を意味する。棒グラフは、化合物（２）の膵癌細胞株（ＢｘＰＣ−３）における細胞障害性を示した図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、障害活性を意味する。線グラフは、生細胞数の経時変化を観察したものであり、横軸は時間（hr）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、細胞増殖抑制、および細胞致死効果を意味する。棒グラフは、化合物（２）の肺癌細胞株（Ａ５４９）における細胞障害性を示した図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、障害活性を意味する。線グラフは、生細胞数の経時変化を観察したものであり、横軸は時間（hr）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、細胞増殖抑制、および細胞致死効果を意味する。棒グラフは、化合物（２）の食道扁平上皮癌細胞株（Ｔ．Ｔｎ）における細胞障害性を示した図であり、横軸は、化合物の濃度（μM）を、縦軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、障害活性効果を意味する。線グラフは、生細胞数の経時変化を観察したものであり、横軸は、波長490nmの吸光度の値であり、生細胞数を示し、細胞増殖抑制、および細胞致死効果を意味する。

〔発明を実施するための形態〕
以下に、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

以下で使用されるオキシインドール、ジホルミルフラン等の原料化合物は公知であり、例えば、オキシインドール（東京化成、O02721）、ジホルミルフラン（東京化成、D2408）を市販品として容易に入手することができる。

[実施例1]
(3E)-3-[(5-((E)-(2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene]indoline-2-one（１）
オキシインドール（1当量）、ジホルミルフラン（0.5当量）およびピペリジン（0.2当量）を1μmolあたり1ｍLのエタノールに溶かし、室温で12時間攪拌した。反応終了後、析出物を濾取し、冷却したエタノールで数回洗い乾燥し目的化合物を45%の収率で得た。
¹H-NMR(d₆-DMSO,400Mz): 13.20 (s, 1H), 13.18 (s, 1H), 11.01 (d, J= 7.84 Hz, 1H), 10.98 (d, J= 3.92 Hz), 10.43 (d, J= 7.84 Hz, 1H), 10.10 (d, J= 7.35 Hz, 1H), 10.08 (s, 1H), 9.96 (d, J= 3.92 Hz, 1H), 9.82 (s, 1H), 9.80 -9.65 (m, 2H), 9.52 (t, J= 7.84 Hz, 1H-), 9.37 (t, J= 7.84 Hz, 1H), 9.11 (t, J= 7.84 Hz, 1H)、MS m/z: 355(M)⁺。

[実施例２]
(3E)-1-acetyl-3-[((5E)-((1-acetyl-2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene]indolin-2-one （２）
オキシインドール（1当量）を無水酢酸に溶かし3日間加熱還流した。冷却後、反応液を氷水中に注ぎ、析出物をろ取し、水洗後乾燥し、1−アセチルオキシインドールを得た。1−アセチルオキシインドールとジホルミルフランから実施例1と同様の方法で目的物を得た。
¹H-NMR(d₆-DMSO,400Mz): 11.05 (d, J= 7.84 Hz, 1H), 11.00 (d, J= 3.92 Hz), 10.46 (d, J= 7.84 Hz, 1H), 10.13 (d, J= 7.35 Hz, 1H), 10.04 (s, 1H), 9.94 (d, J= 3.92 Hz, 1H), 9.80 (s, 1H), 9.78 -9.63 (m, 2H), 9.43 (t, J= 7.84 Hz, 1H-), 9.30 (t, J= 7.84 Hz, 1H), 9.08 (t, J= 7.84 Hz, 1H), 2.38 (s,3H), 2.36 (s,3H)。MS m/z: 438 (M)⁺。

[実施例３]
(3E)-3-((5-((E)-(1-acetyl-2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene)indolin-2-one （３）
ジホルミルフラン（1当量）をエタノールに溶かし、これにオキシインドール（0.5当量）およびピペリジン（0.1当量）をエタノールに溶かした溶液を徐々に加えた。添加終了後、室温で2時間攪拌した。反応終了後、析出物をろ過して除き、ろ液にアセトンを加え１N-塩酸溶液で酸性とし、減圧下乾固し5-((E)-(indolin-3-ylidene)methyl)furan-2-carbaldehydeを得た（収率31％）。次いで、5-((E)-(indolin-3-ylidene)methyl)furan-2-carbaldehyde（1.2当量）、１−アセチルオキシインドール（1当量）およびピペリジン（0.1当量）をエタノールに溶かし室温にて12時間攪拌した。反応終了後、析出物をろ取し、冷エタノールで洗い乾燥することで目的物を得た。
¹H-NMR(d₆-DMSO,400Mz): 10.68 (d, J=7.84 Hz, 1H), 10.62 (d, J=3.92 Hz, 1H), 10.45 (s, 1H), 8.51 (m, 1H), 8.02 (t, J=8.55 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.52 (s,1H), 7.05 (d, J=3.66 Hz, 1H), 6.88 (d, J=8.55 Hz, 1H), 6.83 (t, J=7.08 Hz), 6.61 (t, J=7.57, 1H), 6.51 (t, J=7.57 Hz, 1H), 2.67 (s, 3H)、MS m/z: 396 (M)⁺。

[実施例４]
(3E)-3-[(5-((E)-(5-carboxy-2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene]-2-oxoindolin-5-caboxylic acid （４）
氷冷下、塩化アルミニウム（無水）（3.5当量）を塩化メチレンにけん濁させ攪拌させておき、この溶液にオキシインドール（1当量）を加えた。この溶液に塩化クロロアセチル（2当量）を徐々に滴下し、塩化水素ガスの発生が収まってから約10分間攪拌した。その後、反応液を40〜50℃に暖め2時間攪拌した。冷却後、反応液を氷水中に注ぎ析出物をろ取し、水洗後乾燥し５−クロロアセチルインドリン−２−オンを得た。５−クロロアセチルインドリンをピリジンに溶解し、80〜90℃で3時間加熱攪拌した。冷後、析出物をろ取し、エタノールで数回洗い、この析出物を2.5N水酸化ナトリウムに溶かし、70−75℃で攪拌した。冷後、反応液を塩酸で酸性とし析出物をろ取し、水洗、乾燥し5-carboxyindolin-2-oneを得た。5-carboxyindolin-2-oneとジホルミルフランから実施例1と同様の方法で目的物を得た。
¹H-NMR(d₆-DMSO,400Mz): 12.30 (s, br, 2H), 11.15 (d, J= 7.84 Hz, 1H), 11.02 (d, J= 3.92 Hz), 10.46 (d, J= 7.84 Hz, 1H), 10.13 (d, J= 7.35 Hz, 1H), 10.04 (s, 1H), 9.98 (d, J= 3.92 Hz, 1H), 9.80 (s, 1H), 9.88 -9.73 (m, 2H), 9.53 (t, J= 7.84 Hz, 1H), MS m/z: 442 (M)⁺。

[実施例５]
(3E)-3-[(5-((E)-(5-carboxy-2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene]-2-oxoindolin-5-caboxylic acid di sodium salt （８）
化合物（４）（1当量）に水酸化ナトリウム（2当量）をエタノールに溶かし、析出物をろ取し、エタノールで数回洗い乾燥することで前記化合物（４）のナトリウム塩を得た。

[実施例６]
(3E)-3-((5-((E)-(1-acetyl-2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene)-2-oxoindoline-5-carboxylic acid （５）
5-carboxyindolin-2-one（1当量）および3-((5-formylfuran-2-yl)methylene)-
N-acetyl-2-oxoindoline（1.2当量）およびピペリジン（0.2当量）を1μmolあたり1ｍLのエタノールに溶かし、室温で2時間攪拌した。反応終了後、析出物を濾取し、冷却したエタノールで数回洗い乾燥し目的化合物を得た。
¹H-NMR(d₆-DMSO,400Mz): 9.41 (s, 1H), 9.39 (s, 1H), 8.42 (d, J= 3.91Hz, 1H), 8.32 (d, J=3.91 Hz, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.98 (s, 1H) , 7.92 (d, J=8.05 Hz, 1H), 7.82 (d, J=8.05 Hz, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.55 (dd, J= 8.21 Hz, 1.72 Hz, 1H), 7.36 (d, J= 7.22 Hz, 1H), 7.26 (d, J= 7.22 Hz, 1H), 6.87 (m, 1H), 2.66 (s, 3H)、MS m/z: 440 (M)⁺。

[実施例７]
(3E)-3-((5-((E)-(1-acetyl-2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene)-2-oxoindoline-5-carboxylic acid sodium salt（９）
化合物（５）（1当量）に水酸化ナトリウム（1当量）をエタノールに溶かし、析出物をろ取し、エタノールで数回洗い乾燥することで前記化合物（５）のナトリウム塩（９）を得た。

[実施例８]
(3E)-3-((5-((E)-(1-acetyl-2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene)-2-oxoindoline-6-carboxylic acid （６）
１．４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸１当量をエタノール5.3当量に溶解し濃硫酸0.25当量を加え5時間加熱還流した。反応液を冷却後、反応液が約半量になるまで減圧下濃縮し、これに炭酸ナトリウムを加え中和した後、これをエーテルで3回抽出した。抽出液は飽和食塩水、ついで水で洗い、エーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧下乾固し４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸エチルエステルを得た。

２．ヘキサンにて脱脂した水素化ナトリウム0.98gに無水ジメチルスルホキシド30ｍLを加え、室温にてこの溶液にマロン酸ジメチル2.98ｇを攪拌しながら徐々に加えた。滴下終了後、100℃にて1時間攪拌した。この溶液を室温まで冷却し、これに４−フルオロ−３−ニトロ安息香酸エチルエステル 3ｇ（14mmol）を加え、室温にて30分攪拌後100℃にて1時間攪拌した。反応液を冷却後反応液に飽和塩化アンモニウムを加え酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層は飽和食塩水、水で順次洗浄し無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧下乾固しethyl 4-(di(methoxycarbonyl)methyl)-3-nitrobenzoateを得た。

３．ethyl 4-(di(methoxycarbonyl)methyl)-3-nitrobenzoate 5.58ｇに6N塩酸溶液9ｍLを加え12時間加熱還流した。反応液を冷却後反応液に水を加え析出物をろ取して除き、ろ液はエーテルで抽出した。エーテル層は水洗後無水硫酸ナトリウムで乾燥後減圧下乾固しethyl 4-(carboxylmetheyl)-3-nitorobenzoateを得た。

４．ethyl 4-(carboxylmetheyl)-3-nitorobenzoate 4ｇ（15.8 mmol）および10%パラジウムカーボン0.45gを酢酸15ｍLに懸濁させ水素ガス雰囲気下23時間室温にて攪拌した。反応終了後、反応液に水を加えろ過して不溶物を除きクロロホルムで抽出した。クロロホルム層は減圧下乾固し、これに水を加え析出したethyl 2-oxoindoline-6-carboxylateをろ取して得た。

５．ethyl 2-oxoindoline-6-carboxylate 300mgをエタノール性水酸化カリウム溶液4ｍLに溶かし、100℃で6時間攪拌した。反応液を室温まで冷却し、6N塩酸水溶液1ｍLを加え酸性とした後再び100℃で10分間加熱した。反応液を冷却し、析出した2-oxoindoline-6-carboxylic acidをろ取した。

６．N-アセチルオキシインドール（1当量）、５−ヒドロキシメチル−２−フルアルデヒド（0.5当量）およびピペリジン（0.2当量）を1μmolあたり1ｍLのエタノールに溶かし、室温で12時間攪拌した。反応終了後、析出物を濾取し、冷却したエタノールで数回洗い乾燥し、3-((5-(hydroxymethyl)furan-2-yl)methylene)-N-acetyl-2-oxoindolineを得た。

７．3-((5-(hydroxymethyl)furan-2-yl)methylene)-N-acetyl-2-oxoindoline 1当量およびピリジニウムクロロクロメート1.5当量を塩化メチレンに溶解し室温にて2時間攪拌した。反応終了後、反応液を減圧下乾固し残留物に酢酸エチルを加え不溶物をセライトろ過しろ液を減圧下乾固し目的物を得た。

８．2-oxoindoline-6-carboxylic acid（1当量）および3-((5-formylfuran-2-yl)methylene)-N-acetyl-2-oxoindoline（1.2当量）およびピペリジン（0.2当量）を1μmolあたり1ｍLのエタノールに溶かし、室温で2時間攪拌した。反応終了後、析出物を濾取し、冷却したエタノールで数回洗い乾燥し(3E)-3-((5-((E)-(1-acetyl-2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene)-2-oxoindoline-6-carboxylic acid（６）を得た。
¹H-NMR(d₆-DMSO,400Mz): 10.72(s, br, 1H), 8.77 (s, 1H), 8.40 (d, J= 3.91Hz, 1H), 8.25 (m, 1H), 8.03 (s, 1H), 8.17 (t, J= 7.81Hz, 1H) , 7.90 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.65 (d, J= 3.91Hz, 1H), 7.63 (d, J= 7.80Hz, 1H), 7.60 (d, J= 7.80 Hz, 1H), 7.11 (d, J= 7.80 Hz, 1H), 6.88 (t, J= 7.81 Hz, 1H), 2.66 (s, 3H)、MS m/z: 440 (M)⁺。

[実施例９]
(3E)-3-((5-((E)-(1-acetyl-2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene)-2-oxoindoline-6-carboxylic acid sodium salt（１０）
化合物（６）（1当量）に水酸化ナトリウム（1当量）をエタノールに溶かし、析出物をろ取し、エタノールで数回洗い乾燥することで前記化合物（６）のナトリウム塩を得た（１０）。

[実施例１０]
(3E)-1-butyryl-3-[((5E)-((1-butyryl-2-oxoindolin-3-ylidene)methyl)furan-2-yl)methylene]indolin-2-one （７）
オキシインドール（7.56 mmol）を無水酪酸 (11.39 mmol)に溶かし120℃で24時間加熱攪拌した。冷却後、反応液を氷水中に注ぎ、析出物をろ取し、水洗後乾燥し、1-butyrylindolin-2-one を得た。
1-butyrylindolin-2-one（1当量）、ジホルミルフラン（0.5当量）およびピペリジン（0.2当量）を1μmolあたり1ｍLのエタノールに溶かし、室温で12時間攪拌した。反応終了後、析出物を濾取し、冷却したエタノールで数回洗い乾燥し目的化合物を得た。
¹H-NMR(d₆-DMSO,400Mz): 11.02 (d, J= 7.84 Hz, 1H), 10.98 (d, J= 3.92 Hz), 10.36 (d, J= 7.84 Hz, 1H), 10.23 (d, J= 7.35 Hz, 1H), 9.98 (s, 1H), 9.90 (d, J= 3.92 Hz, 1H), 9.76 (s, 1H), 9.76 -9.62 (m, 2H), 9.41 (t, J= 7.84 Hz, 1H-), 9.27 (t, J= 7.84 Hz, 1H), 9.07 (t, J= 7.84 Hz, 1H), 2.23 (m,4H), 1.82 (m,4H), 1.02 (m,6H)、MS m/z: 494 (M)⁺。

[実施例１１]
新規のPim-1キナーゼ阻害剤の同定を目的として、in vitroのPim-1キナーゼ測定システム（下記参照）を利用して、セリン／スレオニンキナーゼ阻害化合物ライブラリー（ChemDiv社製）より阻害剤候補化合物を探索した。得られた候補化合物の構造活性相関の情報をもとに、55種を越える化合物合成を施行し、表１に示す６つの新規化合物（１）, （２）, （３）、（９）、（１０）、（７）を獲得した。

これら新規化合物のPim-1活性阻害に対する感度（IC50: 50%活性阻害濃度）と濃度依存性を（下記のシステムを用いて）検討した。図１に示すように、新規化合物（１）と（２）は、1nM〜100nMの範囲で、（３）は0.1μM〜10μMの範囲で、（９）と（１０）は、0.15μM〜5μMの範囲で、また（７）は、0.0078μM〜1μMの範囲で濃度依存性の阻害効果を示した。50%阻害濃度（IC50）は、（１）, （２）, （３）, （９）、（１０）、（７）それぞれ 50nM, 10nM, 0.8μM, 1.4μM, 0.58μM, 0.026μMであり、低濃度でPim-1キナーゼ活性を阻害することが明らかとなった。

In vitroのPim-1キナーゼ活性測定システム：
（１）ビオチン化したPim-1のリン酸化基質p21ペプチド（1mM）とリコンビナントGST-Pim-1キナーゼ（18μg/ml）をキナーゼバッファーに添加。
（２）被検化合物（2%DMSOに溶解）、あるいは2%DMSO（溶媒コントロール）を加える。
（３）ATP（10μM）を添加し、25℃で30分間インキュベーション（キナーゼ反応開始）。
（４）EDTA（10mM）加えて反応を停止する。
（５）キナーゼ反応液10μlを、アビジンでコートした96ウエルプレート（ブロッキング済み）に加えて、60分間室温でインキュベーションする。
（６）洗浄用のバッファーで3回ウエルを洗う。
（７）リン酸化p21（Thr145）認識抗体希釈液（1:500）を100μl/ウエル加えて、90分間インキュベーション。
（８）洗浄用のバッファーで3回ウエルを洗う。
（９）ペルオキシダーゼ（HRP）認識二次抗体希釈液（1:2000）を100μl/ウエル加えて、60分間インキュベーション。
（１０）洗浄用のバッファーで5回ウエルを洗う。
（１１）ペルオキシダーゼの基質（TMB）を加えて、8分間インキュベーションし、反応を2M H₂SO₄で止めて、マイクロプレートリーダーで比色定量（OD450）する。

新規Pim-1キナーゼ阻害化合物

[実施例１２]
化合物（１）、（２）、（３）、（９）、（１０）、（７）の各種培養癌細胞に対する細胞障害性（細胞増殖抑制、細胞致死）を検討した。
96ウエルプレートに各種癌細胞株を3〜5000細胞個／ウエルの濃度で播き、翌日新規化合物濃度が0〜100μM(溶媒DMSOは0.5%)になるように添加し、24〜72時間培養する。培養後、生細胞数をMTS法（CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega社）にて算出することで、癌細胞に対する細胞障害性を調査することができる。

ここでMTS法とは、テトラゾリウム化合物（MTS）が生細胞の酸化還元酵素により発色性のホルマザン産物に変換されることを利用した生細胞数算定法である。
測定法は、100μlの培養培地中にサンプルの細胞を含む96ウェルプレートの各ウェルに20μlのCellTiter 96 Aqueous One Solution Reagentを加えて、 37℃インキュベーターで90〜120分インキュベートし、96ウェルプレートリーダーを使って490nmの吸光度を測定する。

図２に示すように、膵癌細胞株(MiaPaCa-2)、肺癌細胞株(A549)、口腔扁平上皮癌細胞株(HSC-3)、食道扁平上皮癌細胞株(T.Tn) 、子宮癌細胞株(HeLa)、正常腎細胞株(293)に対して化合物（１）は100μM, 10μM、細胞株によっては1μMでも顕著に細胞障害性を示した。

また、図３に示すように、前立腺癌細胞株(PC-3)に対する経時的観察より、化合物（１）に細胞致死効果を確認した。

化合物（２）もまた、図４に示すように、膵癌細胞株(BxPC-3)、肺癌細胞株、食道扁平上皮癌細胞株に対して、細胞増殖抑制および細胞致死効果が認められた。

本発明の前記一般式（I）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩は、優れた抗癌作用、キナーゼ阻害作用、アポトーシス誘導能を有することから、医薬、例えば癌、心臓障害、心筋梗塞、動脈硬化症、閉塞性循環器障害、リウマチ関節炎、糖尿病性網膜症、華麗性黄斑性網膜症、神経性変性疾患、自己免疫病、炎症性疾患、糖尿病またはウイルス性疾患の治療薬、予防薬として有用である。また、前記一般式（I）を有する化合物を有効成分として含有するキナーゼ阻害剤も、これらの各種疾患の治療または予防剤として有用である。

Claims

下記一般式（I）

〔式中、R₁−R₈は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、C1−C6アルキル基、C2−C8アルケニル基、C1-C6アルキルカルボニル基または−COOR₉（式中、R₉は、水素原子、C1−C6アルキル基またはC2−C8アルケニル基を示す。）を置換基に有してもよく；
Ｘは、硫黄原子、酸素原子またはNR₁₀（式中、R₁₀は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、C1−C6アルキル基、C2−C8アルケニル基またはC1−C6アルコキシ基を示す。）を示す。〕で表される化合物またはその薬学的に許容される塩。
R₁、R₂、R₄、R₅が、それぞれ独立に水素原子またはCOOR₉（式中、R₉は、水素原子、C1−C6アルキル基またはC2−C8アルケニル基を示す。）である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
R₃、R₆が、それぞれ独立に水素原子またはC1-C6アルキルカルボニル基である、請求項１または２のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
R₇、R₈が、水素原子である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
Ｘが酸素原子である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
下記式（１）〜（７）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩；
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、キナーゼ阻害剤。
前記キナーゼ阻害剤が、Pimキナーゼ阻害剤である、請求項７に記載のキナーゼ阻害剤。
前記キナーゼ阻害剤が、アポトーシス誘導剤である、請求項７または８に記載のキナーゼ阻害剤。
請求項１〜６のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、キナーゼ関連性疾患の予防および/または治療剤。
前記キナーゼ関連性疾患が、癌、細胞増殖異常、心臓障害、心筋梗塞、動脈硬化症、閉塞性循環器障害、リウマチ関節炎、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性網膜症、神経変性疾患、自己免疫病、炎症性疾患、糖尿病またはウイルス性疾患である、請求項１０に記載の予防および/または治療剤。
前記癌が、固形癌である、請求項１１に記載の予防および/または治療剤。
キナーゼ関連性疾患の予防および/または治療剤の製造のための、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。