JP4603684B2 - １３−デオキシアントラサイクリン誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
関連する出願の相互参照用記入事項
この出願は、Ｘｉｎｉ Ｚｈａｎｇにより１９９８年８月１３日に出願されたＵＳ特許出願連続番号０８／９１０２１８号の一部継続出願であり、それの開示する全内容をここに参照により取り入れる。
【０００２】
技術分野
本発明は、心臓毒性の副作用を示さない誘導体としての１３−デオキシアントラサイクリン誘導体、及び、このような１３−デオキシアントラサイクリン誘導体を製造する方法に関する。
【０００３】
背景技術
アントラサイクリンは他の全ての癌化学療法と比較してヒトの癌に最も広範な活性スペクトルを持つ。最も良く知られたアントラサイクリン抗癌剤は、１３−ケト基を含むドキソルビシンとダウノルビシンである。なかでも、米国特許３５９００２８号に開示されているドキソルビシンは広範な抗癌スペクトル作用を持ち、白血病、リンパ腫及び充実性腫瘍のほか、肉腫及び癌腫に最も有効な薬剤の１つである。
近似の構造類縁体であり米国特許３６１６２４２号に開示されているダウノルビシンは肉腫及び癌腫に有効でないが、この違いはダウノルビシンにおける１４−ＯＨの欠如に起因するものと思われる。しかし、ダウノルビシンは急性白血病の治療に有用である。
【０００４】
しかしながら、蓄積する心臓毒性はこれら薬剤の有用性を制限している。それらの性質に習い、例えば心臓毒性のためドキソルビシン治療の期間は通常の服用で最大約９ヵ月に制限されている。ドキソルビシン又はダウノルビシンの総累積服用量は通常５５０ｍｇ／ｍ² を越すことができない（Ｅ．Ａ．Ｌｅｆｒａｋら、Ｃａｎｃｅｒ，３２：３０２，１９７３）。推奨される最大総累積服用量（４３０〜６５０ｍｇ／ｍ² ）かその付近でも、６０％の患者に重大かつ持続性の心臓機能不全が生じ、１４％の患者が鬱血性心臓機能不全が生じる（Ａ．Ｄｒｅｓｄａｌｅら、Ｃａｎｃｅｒ，５２：５１，１９８３）。このように、これらの薬品が癌腫瘍の成長阻害に有用である一方で、患者は薬品の痛烈な心臓毒性の副作用による鬱血性心臓機能不全で死ぬ可能性がある。
上記化合物自体の心臓毒性作用に加えて、アントラサイクリン化合物の既知の製造方法は、約３０％台で比較的低収率である（参照、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２１：２８０−２８３，１９７８）。
【０００５】
腫瘍の除去におけるドキソルビシンの効能及びその治療上の使用における制限は、より良いドキソルビシンを開発しようとする世界中の研究者の共通基盤であった。これらの性質に従い、蓄積する不可逆的な心臓毒性による制限のないドキソルビシン類似体が永年待ち望まれている。過去２５年以上にわたり２０００以上の類似体が合成されたが、ドキソルビシンに対する有意な進歩となるものはなかった（Ｒ．Ｂ．Ｗｅｉｓｓ，アントラサイクリン：我々は今までより良いドキソルビシンを発見したか，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１９：６７０−６８６，１９９２）。
【０００６】
アントラサイクリンの心臓毒性の機構を理解するため、過去２５年以上にわたって鋭意研究がなされてきた。発展した評判の良い理論は、フリーラジカル理論であった。この理論によると、アントラサイクリンの心臓毒性はアントラサイクリン分子のキノン部分によるラジカル発生の結果起こる（Ｊ．Ｄｏｒｏｗｓｈｏｗら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６８：１０５３，１９８１；Ｄ．Ｖ．Ｕｎｖｅｒｆｅｒｔｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．，９：１４９，１９８２；Ｊ．Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，７７：７９７，１９７７；Ｊ．Ｌ．Ｚｗｅｉｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：６０５６，１９８４）。
【０００７】
しかしながら、フリーラジカル捕捉剤及び抗酸化剤は蓄積する心臓毒性を防止できなかったので、この理論は不十分であった（Ｄ．Ｐｒｏｐｐｅｒ及びＥ．Ｍａｓｅｒ，ウサギ肝臓及び心臓におけるダウノルビシンのカルボニル還元、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，８０：２４０−２４５，１９９７；Ｊ．Ｆ．ＶａｎＶｌｅｅｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，９９：１３，１９８０；Ｄ．Ｖ．Ｕｎｖｅｒｆｅｒｔｈら、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，５６：１５７，１９８５；Ｃ．Ｍｙｅｒｓら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１０：５３，１９８３；Ｒ．Ｈ．Ｍ．Ｊｕｌｉｃｈｅｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３８：２７７，１９８６；及び Ｅ．Ａ．Ｐｏｒｔａら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．Ｃｈｅｍ．Ｐａｔｈｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４１：１２５，１９８３）。
【０００８】
言い換えれば、フリーラジカル発生阻害は、これらのアントラサイクリンの心臓毒性を除去しないことが分かっている（Ｐ．Ｓ．Ｍｕｓｈｌｉｎら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，４５：８０９，１９８６）。Ｒｉｃｈａｒｄ Ｄ．Ｏｌｓｏｎ博士とＰｈｉｌｌｉｐ Ｓ．Ｍｕｓｈｌｉｎ博士は心臓毒性を誘発させるアントラサイクリンの機構を過去１５年間にわたり研究し、有力な理論になると現在期待される「代謝産物理論」を発展させた。（Ｒ．Ｄ．Ｏｌｓｏｎ及びＰ．Ｓ．Ｍｕｓｈｌｉｎ、ドキソルビシンの心臓毒性：有力仮説の分析、ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ、４：３０７６−３３０８６，１９９０）。この理論によると、親化合物の１３−ＯＨ基代謝産物がアントラサイクリンの心臓毒性に介在している。
【０００９】
この研究は、ドキソルビシン及びダウノルビシンの心臓毒性は、心筋収縮性が減少することで明らかなように、１３−ケト基の１３−ジヒドロ代謝産物への代謝還元に依存していることを示している。ドキソルビシンが１３−ジヒドロ化合物に代謝しないことが明らかな実験系では、心臓毒性の作用は非常に高い濃度（２００〜４００μｇ／ｍＬ）でしか観察されない（Ｐ．Ｓ．Ｍｕｓｈｌｉｎら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，４４：１２７４，１９８５；Ｒ．Ｄ．Ｏｌｓｏｎら、Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，４５：８０９，１９８６）。
【００１０】
ドキソルビシンは短期間だけでも試験系に置いておくと、ある代謝変換が生じ、１３−ジヒドロ代謝産物が充分量形成され、心臓毒性が発現しはじめる（Ｌ．Ｒｏｓｓｉｎｉら、Ａｒｃｈ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．ｓｕｐｐｌ．，９：４７４，１９８６；Ｍ．Ｄｅｌ Ｔｏｃｃａら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７：１０７３，１９８５）。このように、ドキソルビシン及びダウノルビシン等の薬剤の心臓毒性はそれらの１３−ジヒドロ代謝産物によって生じる強力な心臓毒性作用の結果であるという実質的な証拠が集積されている。（Ｐ．Ｍｕｓｈｌｉｎら、Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２：１，１９８８；Ｓ．Ｋｕｙｐｅｒら、ＦＡＳＥＰ Ｊｏｕｒｎａｌ，２：Ａｌ１３３，１９８８；Ｒ．Ｂｏｕｃｅｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１５８５１，１９８７；及びＤ．Ｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：３５８５，１９８８）。
【００１１】
上記と対比して、１３−ジヒドロ代謝産物であるドキソルビシノール及びダウノルビシノールは、比較的低い濃度にある同じ試験系で心臓毒性を発生させる（１〜２μｇ／ｍｌ、Ｒ．Ｄ．Ｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２６：２２７，１９８５；Ｒ．Ｄ．Ｏｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２８：４４１，１９８７）。
【００１２】
上記を検討すると、ドキソルビシンは細胞内カルボニルリダクターゼによって、以下のように１３−ケト基がアルコール基に還元されたドキソルビシノールに変換される。
【００１３】
【化３】

【００１４】
この理論はアントラサイクリン心臓毒性の時間遅延特性に対する説明となる。Ｏｌｓｏｎ及びＭｕｓｈｌｉｎの研究は最近再検討され、いくつかの点が証明されている（Ｄ．Ｐｒｏｐｐｅｒ及びＥ．Ｍａｓｅｒ，ウサギ肝臓及び心臓におけるダウノルビシンのカルボニル還元、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，８０：２４０−２４５，１９９７）。
【００１５】
例えば、研究により心臓内Ｃ１３−アルコール代謝産物の蓄積と心筋の収縮及び弛緩障害との直接的な関係が立証された。また、長期にわたるドキソルビシンの投与の間、その１３−アルコール代謝産物であるドキソルビシノールがラット及びウサギの心臓組織に選択的に蓄積する。加えて、研究によりダウノルビシノールの試験管内心臓毒性作用は親薬剤のそれよりかなり大きいことが立証されている。
【００１６】
その上、ドキソルビシノールがウサギ乳頭筋での心筋収縮性を阻害する点でドキソルビシンの３０倍強力であることが研究により立証された。さらにまた、実験により、ドキソルビシンではなくドキソルビシノールが筋繊維質Ｃａ⁺²−Ｍｇ⁺²−ＡＴＰアーゼ、ミトコンドリアＭｇ⁺²−ＡＴＰアーゼ及び筋繊維質のＮａ⁺ −Ｋ⁺ −ＡＴＰアーゼ活性の強力な阻害剤となることから、心臓機能不全の機構はＡＴＰアーゼ阻害と関連することが立証された。加えて、ドキソルビシンではなくダウノルビシノールが、動物試験においてダウノルビシン治療２日後の心臓組織で発見された。
【００１７】
最近、アントラサイクリンアルコール代謝産物誘因の心臓毒性の基調となす機構は、Ｍｉｎｏｔｔｉらによる「ドキソルビシンの二次アルコール代謝産物がヒト心筋層由来サイトゾル画分中のアコニターゼ／鉄調節タンパク質−１を不可逆的に不活性化する」で解明された。Ｍｉｎｏｔｔｉらは、ドキソルビシンではなくドキソルビシノールが鉄代謝を阻害し、鉄調節タンパク質−Ｉ（ＩＲＰ−Ｉ）を不可逆的に不活性化することを実証した。その結果、鉄は鉄要求性の酵素に利用できなくなる。これらの酵素阻害が心臓毒性を誘導する。
【００１８】
キレーターデキストラゾキサンはドキソルビシンの心臓毒性を減少させるのに利用できるという事実は（Ｇ．Ｗｅｉｓｓら、「鉄調節タンパク質の活性化を介したデキストラゾキサン（ＩＣＲＦ−１８７）によるトランスフェリン受容体発現の調節」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、５３：１４１９−１４２４、１９９７）、これらの発見と一致する。デキストラゾキサンはドキソルビシノールの作用を妨げるＩＲＰ−Ｉの活性を刺激することが分かっている。
【００１９】
Ｏｌｓｏｎ及びＭｕｓｈｌｉｎは、アルコール代謝産物を形成できない１３−ケトアントラサイクリンの類似体は心臓毒性でないであろうと考えた。１３−ケト基をメチレン基に還元することが可能性としてもっとも有望である。この基をアルコールに代謝する酵素は知られていない。アントラサイクリンアクラルビシンで得られた結果はこの考えに一致する。
【００２０】
【化４】

【００２１】
アクラルビシンは、ドキソルビシンと比べて、１４−ＯＨ基の欠損の他、数多くの修飾がなされている。この薬剤は１４−ＯＨ基の欠損に一致して、肉腫や癌腫に対して作用しない。しかしながら、急性白血病に対する作用がある。アクラルビシンは１３−ケト基も有しないが、１３−メチレン基は含有する。
【００２２】
この薬剤はフランスと日本で商業上使用されている。アクラルビシンでは、不可逆的に蓄積する心臓毒性が明らかに見受けられない。患者は心臓機能不全又は心筋症を生じることなく３０００ｍｇ／ｍ² までを受容することができる（Ｄ．Ｃ．Ｃａｓｅら、「急性骨髄芽球性白血病におけるアクラルビシンのフェーズＩＩの研究」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１０：５２３−５２６、１９８７）。当該分野の専門家はアクラルビシンにおける心臓毒性の払底が理解できず、これはその分散と薬物動態によるものであると不正確に予想していた。しかしながら、Ｏｌｓｏｎ及びＭｕｓｈｌｉｎは心臓毒性において１３−ケト基の欠損が重要であると確信していた。図１は、心臓毒性が生じる過程を記したフローチャートである。
【００２３】
発明の要約
本発明のひとつの目的は、１３−デオキシアントラサイクリン誘導体が心臓毒性を示さないことの証拠を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、そのような１３−デオキシアントラサイクリン誘導体の改良された製造方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、ある１３−デオキシアントラサイクリン誘導体の前駆体、及び、その前駆体の製造方法を提供することである。
これらの及びその他の目的並びに利点に対応して、本発明は、式１：
【００２４】
【化５】

【００２５】
（式中、Ｒ₁ はＨ又はＯＨである；Ｒ₂ はＨ、ＯＨ又はＯＭｅである；Ｒ₃ はＨ又はＯＨである；Ｒ₄ はＨ又はＯＨであり；そして、Ｒ₅ は炭水化物又は置換された炭水化物である）
を有する１３−デオキシアントラサイクリン誘導体を提供する。
【００２６】
本発明は、式１の化合物の製薬上許容される塩をも提供する。製薬上許容される塩としては、製薬上許容される無機及び有機の酸並びに塩基から誘導される塩が挙げられる。適当な酸の例としては、塩酸、臭化水素、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、トリフルオロ酢酸及びベンゼンスルホン酸が挙げられる。適当な塩基由来の塩としては、ナトリウム及びアンモニア等のアルカリが挙げられる。
【００２７】
本発明は、抗癌治療を必要とする哺乳類ホストの治療方法をも提供する。以下の式１：
【００２８】
【化６】

【００２９】
（式中、Ｒ₁ はＨ又はＯＨであり；Ｒ₂ はＨ、ＯＨ又はＯＭｅである；Ｒ₃ は、Ｈ又はＯＨである；Ｒ₄ はＨ又はＯＨであり；そして、Ｒ₅ は炭水化物又は置換された炭水化物である）
で表される少なくとも１つの化合物の抗癌有効量を、抗癌有効量で上記ホストに投与する。
【００３０】
本発明は、その外、１３−デオキシアントラサイクリン誘導体の製造方法をも提供する。その方法は還元剤であるシアノボロハイドライド入りのアントラサイクリン１３−トシルヒドラゾン酸性溶液を調製することからなる。溶液を穏やかに還流する。反応混合液を冷却する。溶液に飽和ＮａＨＣＯ₃ 水溶液を加え、続いて含ハロゲン炭素化合物溶媒を加える。混合液を濾過する。濾液を酸性化する。濾液を分取クロマトグラフィーにかけ、１３−デオキシアントラサイクリン誘導体を単離する。
【００３１】
加えて、本発明は上記１３−デオキシアントラサイクリン誘導体の既知の調製法の上記欠点を解決することを目的とする。
従って、本発明のもう一つの目的は、既知の方法に比べて高収率を与える１３−デオキシアントラサイクリン誘導体の改良された製造方法を提供することである。
従って、さらに本発明は１３−デオキシアントラサイクリン誘導体の製造方法を提供する。
一般に、アントラサイクリンは式Ｉで表される。
【００３２】
【化７】

【００３３】
（式中、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ は上記で定義したものである。）
【００３４】
アントラサイクリンは、既知の方法により１３−トシルヒドラゾンに容易に変換する。アントラサイクリン１３−トシルヒドラゾンを、酸性条件下において水素化シアノホウ素ナトリウムで１３−デオキシアントラサイクリン誘導体に還元する。生成物は抽出操作せず、分取クロマトグラフィーで精製する。上記方法は約７０％〜約８０％の収率であることが分かった。
【００３５】
加えて本発明は１３−デオキシアントラサイクリン誘導体の製造方法を提供する。その方法はシアノボロハイドライドとアントラサイクリン１３−トシルヒドラゾンの酸性溶液を調製することからなる。上記溶液を緩やかに還流する。上記反応混合液を冷却する。上記溶液に飽和ＮａＨＣＯ₃ 水溶液を加え、続いて含ハロゲン炭素化合物溶媒を加える。混合液を濾過する。濾液を酸性化する。濾液は分取クロマトグラフィーに供し、１３−デオキシアントラサイクリン誘導体を単離する。
【００３６】
さらに本発明は、１３−デオキシアントラサイクリン誘導体の製造方法を提供する。上記方法は、約１ｇのドキソルビシン１３−トシルヒドラゾン塩酸塩及び約２．４ｇのｐ−トルエンスルホン酸を約５０ｍＬ無水メタノール中に溶解した溶液を調製することからなる。約０．８ｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを溶液に加える。溶液を約６８℃〜約７２℃の温度で加熱する。溶液を約１時間窒素雰囲気下で緩やかに還流する。反応混合液を約２０ｍＬに濃縮する。反応混合液をフリーザーで約０℃〜約４℃の温度に冷却する。約２ｍｌの重炭酸ナトリウム飽和水溶液を反応混合物に加える。約２００ｍｌのクロロホルムを反応混合液に加える。無水硫酸ナトリウムを反応混合液に加える。塩を濾過する。濾液をジエチルエーテル中塩化水素で酸性化する。その溶液をシリカゲルカラムに通す。さらに、溶出液が無色になるまでクロロホルム／メタノールでカラムを洗浄する。生成物を含有する分画はメタノールで溶出する。メタノール溶出液を蒸発させる。蒸発の結果得られた残渣を３０％アセトニトリル−蟻酸アンモニウム緩衝液に溶解させる。生成物をフェニルカラムを用いて分取ＨＰＬＣで単離する。生成物をアセトニトリル／蟻酸アンモニウムの傾斜溶出液を用いて他の不純物から分離する。そしてＨＰＬＣの精製分画を凍結乾燥して、６００ｍｇの１３−デオキシドキソルビシン塩酸塩を得る。
【００３７】
本発明を実施するための最良の各種形態の記述
本発明は、ドキソルビシン、ダウノルビシン又はその他類似のアントラサイクリンの１３−デオキシ型は心臓毒性の１３−ジヒドロ型に代謝変換されないという事実を利用することにより、総累積服用量に対する制限なしに心臓毒性の生じない量で本発明の化合物を投与する手段を提供するものである。
本発明は、式Ａ：
【００３８】
【化８】

【００３９】
（以後、化合物Ａという）
で表される改良したドキソルビシンを含む。
【００４０】
改良した化合物Ａは、ドキソルビシンから１３−ケト基をメチレン基に還元することによって合成する。試験管内の実験により、改良した化合物Ａが、ドキソルビシンがドキソルビシノールに変換される条件下で、心臓組織により上記代謝産物に代謝されないことが示された。
【００４１】
以下に示す試験管内の実験では、本発明の改良したドキソルビシンの生体内変換を試験している。試験の目的は、本発明の化合物Ａが単離したウサギ心筋組織標本中でＣ−１３ヒドロキシ代謝産物に代謝されないかを確定することである。ドキソルビシン、ドキソルビノール及び化合物Ａは、ニュージーランド白ウサギから得られる右心房及び右心室遊離壁層中、蛍光ＨＰＬＣ法で測定した。細心房及び心室層を、酸化クレブス重炭酸緩衝液を入れた筋浴（３０℃）中でインキュベートした。ドキソルビシン（１７５μＭ）又は化合物Ａ（１７５μＭ）をその槽に加えて、２１０分間に３０分間隔で心筋層を取り出した。各々の層を素早く普通食塩水で洗浄し、ブロット乾燥させ、半分に切り重量を計った。ドキソルビシン、ドキソルビシノール及び化合物Ａの組織濃度を確定するため、その組織を−７０℃でガラス瓶に置いた。ドキソルビシン、ドキソルビシノール及び化合物Ａの組織濃度は、３つの別個の実験での標準曲線から確定し、平均±ＳＥＭとして表した。化合物Ａ及びドキソルビシンの心房及び心室濃度が時間依存的に増加していることが観察された。インキュベーション２１０分後の化合物Ａ及びドキソルビシンの心房組織濃度（ｎｇ／ｍｇ湿重量）は、有意に異ならなかった（化合物Ａ：７４３±８９；ドキソルビシン：６１７±３５）。心房中の化合物Ａの濃度は、２１０分のインキュベーション後のドキソルビシンの心房濃度より有意に高かった（化合物Ａ：６２６±３１；ドキソルビシン：４０７±３０；Ｐ＜０．０５）。しかしながら、ドキソルビシンだけがＣ−１３ヒドロキシ代謝産物であるドキソルビシノールに代謝された。化合物Ａの代謝産物は検出されなかった。これらの実験により、化合物Ａは単離した心臓組織標本中でＣ−１３ヒドロキシ代謝産物を形成しないことが分かった。
【００４２】
研究の目的は、単離されたウサギ心筋組織標本中で化合物ＡがＣ−１３ヒドロキシ代謝産物に代謝されないかを確定することであった。
試験は本発明の化合物Ａ及びドキソルビシンを用いて行った。
ウサギ心室全体、右及び左心房組織、右心室遊離壁、クレブス重炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）、普通（０．９％）食塩水、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 、イソプロピルアルコール、クロロホルム、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドキソルビシノール及びメタノールを使用して測定を行った。
【００４３】
試験手順は：ニュージーランド白ウサギから得られる右心室遊離壁及び心房の細膜（各８０〜１００ｍｇ）を、かつて報告された以下の組成：１２７ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、２．３ｍＭ ＫＣｌ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ₃ 、１．３ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、０．６ｍＭ ＭｇＳＯ₄ 及び５．６ｍＭグルコースからなる酸化クレブス重炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）を含む分離筋浴（３０℃）中でインキュベートした（Ｐ．Ｓ．Ｍｕｓｈｌｉｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１０：９７５−９８２、１９９３）。
【００４４】
ドキソルビシノール合成に関しては、ドキソルビシノールはＴａｋａｎａｓｈｉ及びＢａｃｈｕｒの方法（Ｓ．Ｔａｋａｎａｓｈｉ及びＮ．Ｒ．Ｂａｃｈｕｒ、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．、４：１７−８７、１９７６）を少し改変して（Ｐ．Ｓ．Ｍｕｓｈｌｉｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１０：９７５−９８２、１９９３）合成した。
【００４５】
試験の結果の統計分析に関しては、ドキソルビシン、ドキソルビシノール及び化合物Ａの組織濃度（ｎｇ／ｍｇ湿重量）を３つの異なる実験で確定し、平均±ＳＥＭで表した。Ｐｒｉｚｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）プログラムを用い様々な時間間隔で治療効果を分析するのに二因子分析（分散分析）を採用した。
【００４６】
観察及び試験結果より、ウサギ心房（表１）及び右心室遊離壁（表２）組織（図１）双方での化合物Ａ及びドキソルビシンの濃度が時間依存的に増加することが分かった。化合物Ａの心房及び心室両方の濃度はドキソルビシンの心房及び心室濃度以上であった。しかしながら、ドキソルビシンだけがＣ−１３ヒドロキシ代謝産物であるドキソルビシノールに代謝され、ドキソルビシノールの時間依存的な蓄積がウサギ心房（表１）及び心室（表２）組織（図２）で観察された。化合物Ａの代謝産物は検出されなかった（図２）。
【００４７】
【表１】

【００４８】
ＮＤは、化合物Ａ Ｃ−１３ヒドロキシ代謝産物の濃度が検出されなかったことを示す。３つの別々の実験から得られる組織濃度は平均±ＳＥＭとして表す。ＮＤ及び平均値は３つの別々の実験から得られた。
【００４９】
【表２】

【００５０】
¹ Ｐ＞０．０５、化合物Ａ対ドキソルビシン。ＮＤは、化合物Ａ Ｃ−１３ヒドロキシ代謝産物の濃度が検出されなかったことを示す。３つの別々の実験から得られる組織濃度は平均±ＳＥＭとして表す。ＮＤ及び平均値は３つの別々の実験から得られた。
【００５１】
実験からのディスカッション及び結果より、実験の結果により化合物Ａが分離ウサギ心臓調製物中でＣ−１３ヒドロキシ代謝産物を形成しないことが示唆される。しかしながら、構造的に関連した化合物であるドキソルビシンは、Ｃ−１３ヒドロキシ代謝産物であるドキソルビシノールに代謝された。さらに、実験の結果より、ドキソルビシンのドキソルビシノールへの代謝が心室より心房組織中で多く生じていることが示唆される。
【００５２】
図２は、時間に対する、１７５μＭの本発明の化合物Ａ又はドキソルビシン中でインキュベーションされた右心房（Ａ）及び心室（Ｖ）調製物中のドキソルビシノール濃度を表す。図２に見られるように、本発明の化合物は既知のドキソルビシンと比べてかなり低い濃度で存在する。
【００５３】
他の試験管内の実験より、本発明の化合物Ａはヒト癌細胞の成長阻害においてドキソルビシンと同様に効果的であることが示された。
試験管内細胞増殖に与える本発明の化合物Ａとドキソルビシンの作用を比較して、ヒト癌細胞の成長阻害における本発明の化合物の有効性を示す実験を行った。
【００５４】
本発明の化合物の有効性を示す実験に関しては、白血病のヒト及びマウス由来（ＨＬ６０及びＰ３８８）並びにヒト胸筋癌由来（ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ ２３１）の培養細胞系中で、化合物Ａの抗増殖作用をドキソルビシンと比較した。癌細胞増殖阻害は、細胞の［³ Ｈ］チミジンの取込みを測定することにより試験された。化合物Ａの抗増殖作用は同じ培養条件下でドキソルビシンと比較した。５０％最大阻害（ＩＣ₅₀）となる濃度を曲線の当てはめ分析で得た。平均ＩＣ₅₀値（ｎＭ単位）及び９５％信頼区間を以下に示す。平均は３度繰り返した３又は４回の別個の測定によって得られた。
【００５５】
【表３】

【００５６】
化合物Ａ及びドキソルビシンの両方で、試験した各々４つの細胞系中で細胞への［³ Ｈ］チミジンの取込みが完全に無かった。これらの試験は、ＩＣ₅₀値の割合（効力比）で示されるように、ドキソルビシンが４つの細胞系の全てにおいて［³ Ｈ］チミジンの取込みを阻害するため化合物Ａよりある程度強力であるが（Ｐ＜０．０５）、化合物Ａ及びドキソルビシンの双方が試験管内の癌細胞増殖の強力な阻害剤であることを示す。
【００５７】
試験の目的は、充分に確立されたチミジン取込み法（Ｅ．Ｓｅｖｅｒｉｓｏｎ及びＥ．Ｌ．Ｌａｒｓｓｏｎ、「ポリクローナルＢ及びＴ細胞アクティベーターに対するリンパ球の応答」、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（Ｅｄ．）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ ２、第４版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、６３１頁、１９８６）を用いて、各々４つの細胞系で試験化合物の５０％最大応答（ＩＣ₅₀）有効濃度を計算し、その値をドキソルビシンで得られた値と比較して、白血病ヒト及びマウス由来（ＨＬ６０及びＰ３８８）並びにヒト胸筋癌由来（ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ２３１）の悪性培養細胞系中で細胞成長（増殖）を阻害する化合物Ａの効能を確定することからなる。
試験化合物の希釈は、以下の範囲において、細胞に特異な媒体で行った。
【００５８】
【表４】

【００５９】
希釈液を５０μｌずつ３度ウェル全てに加え、細胞を試験化合物の存在下２４時間成長させた。
統計分析は、推奨される不対ｔ−検定からなる。有意のレベルはＰ＜０．０５として選択した。
【００６０】
観察及び実験の結果を以下に示す。試験した４つの癌細胞系中、化合物Ａ及びドキソルビシンは（³ Ｈ）チミジン取込みの濃度依存性阻害を起こす。５０％最大応答となる濃度（ＩＣ₅₀）値を曲線の当てはめ分析（ｃｕｒｖｅ ｆｉｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）から得た。ＩＣ₅₀値（ｎＭ単位）を以下に示し、３度繰り返した３〜４回の分析の平均値（カッコ内は９５％信頼限界）を求めた。
【００６１】
【表５】

【００６２】
化合物Ａは、試験管内の４つの細胞系全てにおいて、ドキソルビシンほど強く細胞増殖を阻害しないことを、結果は示唆している。しかしながら、両化合物は等しく効果的である。
【００６３】
試験管内の試験の結果のディスカッション及び結論は、化合物Ａ及びドキソルビシンの双方が試験した各々４つの細胞系中で細胞への［³ Ｈ］チミジンの取込みを完全に止めていたことを示唆する。ＩＣ₅₀値の割合（効力比）で示されるように、ドキソルビシンは、４つの細胞系の全てにおいて、化合物Ａより強力に［³ Ｈ］チミジンの取込みを阻害する（Ｐ＜０．０５）。図３〜６参照。これらの研究は、化合物Ａ及びドキソルビシンの双方が試験管内癌細胞の成長の強力な阻害剤であることを示す。図８ａ−ｃは、既知のドキソルビシン化合物及びコントロールサンプルと比較した本発明の化合物の心臓組織に対する影響を図示する光学顕微鏡写真を表す。
【００６４】
生体内試験より、化合物Ａでは、以下に示すようにドキソルビシンより全身性毒性が減少し、白血病マウスモデルでの延命に効果的であることが分かった。
白血病オスマウスＰ３８８に対する化合物Ａの作用を以下に示す。
０日でＣＤＦ１オスのマウスに１０⁶ 個の白血病マウス細胞Ｐ３３８を腹腔内に接種する。１〜９日でマウスをドキソルビシン又は化合物Ａで腹腔内投与で治療する。体重を毎日測定し、生存を記録する。ある試験では、０．８ｍｇ／ｋｇ／日でドキソルビシン又は化合物Ａを投与した。２２日目で、賦形剤のグループでは０／８の生存で、ドキソルビシンのグループでは７／８の生存で、化合物Ａのグループでは５／８の生存であった。ドキソルビシン及び化合物Ａでの値は賦形剤の値とは有意に異なるが、互いにはそう異ならない。
【００６５】
同じ白血病マウスモデルを用いた別の試験では、ドキソルビシンは０．８ｍｇ／ｋｇ／日で注入し、化合物Ａは１．６、２．４又は３．２ｍｇ／ｋｇ／日で注入した。
【００６６】
【表６】

【００６７】
上記値は、平均値±ＳＥである； ^*ｐ＞０．０５対賦形剤； ^#ｐ＜０．０５対ドキソルビシン
【００６８】
１９日目で、１．６ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａは、腹水に加えて白血病進行の結果である体重増加を抑制する点でドキソルビシンと同様に効果的であった。２．４及び３．２ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａの服用は体重増加を抑制する点で両方ともドキソルビシン以上に効果的であった。２５日目で、化合物Ａの全服用量が、生存を維持する点でドキソルビシンと同様に効果的であった。３．２ｍｇ／ｋｇ／日の化合物Ａの服用のみが、３２日目まで賦形剤及びドキソルビシンと比較して延命に効果的であった。この試験で使用したドキソルビシンの服用量は、このモデルにおいて最大限に効果的な服用量である。ドキソルビシンの服用量がより多くなると、生き残りが確実に減少する。このように、化合物Ａはドキソルビシンほど強力ではないが、延命に関してはドキソルビシンより多い服用量でもより効果的である。
【００６９】
ダウノルビシンの１３−デオキシ類似体である化合物Ｂも、Ｍｕｓｈｌｉｎらが上記文献で記述したウサギ心臓モデルを用いた試験管内収縮性心臓機能においてダウノルビシンの心臓毒性の性質を示さなかった。このことは図７に表されている。
【００７０】
化合物Ｂは、以下に示すように、生体ラットモデルにおいてダウノルビシンの心臓毒性の性質がないことも示された。以下のディスカッションは、静脈内投与したラットにおいて本発明の化合物Ｂに心臓毒性がないことを示す。
【００７１】
水に溶かしたダウノルビシン塩酸塩又は化合物Ｂ塩酸塩を、オススプレーグ−ドリーラット中に、１日置きに３日間、５ｍｇ／ｋｇ／日で静脈注射で投与した（全服用量１５ｍｇ／ｋｇ）。別の賦形剤のグループを各々の化合物とともに試験した。最初の投与から７日後に、各々のラットにペントバルビタールナトリウム５０ｍｇ／ｋｇ分を腹腔内麻酔した。気管を挿管して、１００％酸素を呼吸させた。熱ランプ及び温度調節計で３７℃に体温を維持させた。カテーテルを右頸動脈に設置し、動脈中に進行させて、平均動脈圧（ＭＡＰ）及び心拍度数（ＨＲ）をＳｔａｔｈａｍ圧力変換器及びＧｏｕｌｄ記録計を用いて記録した。カテーテルを左心室に進行させて、左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）、最大左心室ｄＰ／ｄｔ（ｄＰ／ｄｔ）及び左心室末端拡張期圧（ＬＶＥＤＰ）を記録した。
【００７２】
ダウノルビシンで治療されたラットでは、賦形剤コントロールと比べて、ＭＡＰ、ＬＶＳＰ及びｄＰ／ｄｔが、有意に且つ実質的に抑制された（表４）。ダウノルビシンで治療したラットでは、体重も有意に減少した。それとは逆に、ＭＡＰ、ＬＶＳＰ、ｄＰ／ｄｔ及び体重が、賦形剤及び化合物Ｂで治療したラットの間で類似している（表５）。ダウノルビシンが心臓の収縮性及び機能を有意に減少させる服用量の化合物Ｂが心臓毒性を欠くことを、データは示している。化合物Ｂは心臓毒性を生じることなく治療上の服用量で投与できるが、ダウノルビシンは同じ治療上の服用量で心臓機能を害することを、結果は示している。
【００７３】
【表７】

【００７４】
表４の値は、平均値±標準誤差を示す；化合物を、１日置きに３日間、５ｍｇ／ｋｇ／日でマウスに静脈内注入した；測定は最初の注入から７日後に行った。ＢＷ１＝０日の体重、ＢＷ２＝７日の体重。 ^*＝ｐ＜０．０５、対賦形剤
【００７５】
【表８】

【００７６】
化合物を、１日置きに３日間、５ｍｇ／ｋｇ／日でマウスに静脈内注入した；測定は最初の注入から７日後に行った。ＢＷ１＝０日の体重、ＢＷ２＝７日の体重。
【００７７】
化合物Ａは、ウサギでの慢性ドキソルビシン心臓毒性モデルにおいても評価した。このモデルでは、ドキソルビシンにより心臓機能が害され、ドキソルビシンで長期的に治療されたヒトに見られるものと類似した組織病理学的な変化がある。ウサギ心臓の組織病理学的及び／又は機能的な障害は、ドキソルビシンで治療したウサギの５／６に見られた。同じ条件下で、化合物Ａは臨床上問題となる心臓毒性を生じなかった。
【００７８】
本発明の化合物が非心臓毒性であることは、慢性ウサギモデルでドキソルビシン及び化合物Ａの心臓毒性を評価した以下の試験でも示持される。
【００７９】
上記試験では、２４匹のオスのニュージーランド白ウサギを４つのグループに無作為に分けた。６匹のウサギに１ｍｇ／ｋｇ分のドキソルビシンを耳の端の静脈へ、１週間に２度、８週間投与した。別の６匹のウサギに１ｍｇ／ｋｇ分の化合物Ａを耳の端の静脈に、１週間に２度、８週間投与した。ドキソルビシン治療及び化合物Ａ治療されたグループのウサギの餌の消費は毎日監視して、賦形剤（０．９％ＮａＣｌ）を１週間に２度、８週間、耳の端の静脈に投与した性及び年齢の合う対で餌づけしたコントロールのウサギに同じ量の餌を与えた。大動脈根加速化現象を試験の期間、ドップラー超音波法で毎週監視した。収縮率を、試験１０週間目より２週間に１回、試験の期間中、Ｍ−モード心臓エコー図で測定した。ウサギは試験開始後２０週間となるか、又は、収縮率が２５％未満になるか若しくは少なくとも３週間２５〜２９％にとどまった時に安楽死させた。犠牲にした各々のウサギより左心室乳頭筋、左心室遊離壁及び頂端サンプルを組織病理学的分析のため調製して、処置を知らせていない組織病理学者によって階級付けした。障害を、空胞形成、筋繊維変成、単核炎症及び壊死という程度に基づいて、軽度、中度又は重度と階級分けした。ドキソルビシン治療、化合物Ａ、ドキソルビシンコントロール、化合物Ａコントロールのグループで、それぞれ４／６、０／６、１／６、０／６のウサギに異常な縮小化のものがあった。異常大動脈根加速化現象（９ｍ／ｓ／ｓ未満の値）は、ドキソルビシン治療、化合物Ａ、ドキソルビシンコントロール、化合物Ａコントロールのグループで、それぞれ３／６、０／６、０／６、０／６のウサギに生じた。ドキソルビシン治療したグループのウサギ６匹全てに軽度から重度の異常組織変化があった；化合物Ａでは２／６のウサギに軽度の異常組織変化があった。両グループのコントロールウサギ由来の心臓組織に、組織病理学的障害は見られなかった。３つの心臓毒性試験中少なくとも２つが異常であれば、全体的な心臓状態が異常であると定義した。これらの基準を用いると、ドキソルビシン治療したグループのウサギの５／６は全体的に異常な心臓状態であった；他の３つのグループで全体的に異常な心臓状態なものは、０／６であった（Ｐ＜０．０５、フィッシャー抽出試験）。ドキソルビシンと比較して、化合物Ａは試験した服用量においては心臓毒性を本質的に有しない。さらに、ドキソルビシンは有意に血液の構成を変化させ体重増加を抑制するのに対し、化合物Ａは血液の構成変化及び体重増加に対し明らかな影響を持たない。本服用計画では、化合物Ａはウサギにおける心臓毒性及び組織毒性がドキソルビシンに比較して少ない。
【００８０】
心臓毒性試験の評価の目的は、慢性ウサギモデルでのドキソルビシンと化合物Ａの心臓毒性を比較することからなる。
【００８１】
ドキソルビシン治療した６７％（４／６）のウサギに異常な左心室収縮率が生じた。６匹のドキソルビシン治療ウサギ中３匹のウサギ（５０％）に、異常大動脈根加速化現象が生じた。対照的に、化合物Ａで治療したウサギには機能的な心臓毒性の証拠はなかった。組織病理学はもっとも鋭敏に心臓毒性を表示する。ドキソルビシンで治療した全てのウサギで、主として筋細胞空胞形成及び筋原繊維欠損を特徴とする組織病理学的障害が顕著化した。６匹のウサギ中４匹が軽度の心臓毒性を示し、１匹のウサギが中度の障害を示し、１匹のウサギが重度の障害を示した。６匹の化合物Ａで治療したウサギ中２匹が、軽度の組織病理学的障害を示した（図８参照）。３つの心臓毒性試験すべての結果を集めると、異常な心臓状態は、ドキソルビシン治療したグループの６匹中５匹のウサギで観察されたが、化合物Ａで治療したウサギでは６匹中０匹であった（Ｐ＜０．０２、フィッシャー抽出試験）。３つの心臓毒性試験中少なくとも２つが異常であれば、全体的な心臓状態が異常であると定義した。試験８週間の間、血液サンプルを耳の端の動脈から集め、細胞血球計算値を得た。ドキソルビシン治療では、白血球、赤血球、血小板、ヘモグロビン、平均血球ヘモグロビン濃度及び赤血球分布幅が、賦形剤又は化合物Ａで治療した個体と比較して有意に減少した（Ｐ＞０．０５）。化合物Ａでは、赤血球分布幅に僅かな増加があった以外は、これら各種の値は賦形剤と比較して変わらなかった。さらに、ドキソルビシン治療では、化合物Ａの治療と比較して重量増加が阻害された。化合物Ａで治療したウサギは、試験開始時３．１７±０．０６ｋｇ、試験終了時４．１０±０．１０ｋｇであったのに対し、ドキソルビシンで治療したウサギは、試験開始時３．１９±０．１０ｋｇ、試験終了時３．５４±０．０６ｋｇであった（Ｐ＞０．０５、１方向分散分析（１ ｗａｙ ａｎｏｖａ）、ダンカン新複合範囲試験（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ Ｎｅｗ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ））。
【００８２】
異常大動脈根加速化現象は０．９以下の値と定義する。加速単位はｍ／ｓ／ｓである。Ｎ＝普通の心臓機能；Ａ＝異常心臓機能である。
【００８３】
ウサギは１ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン（ＤＯＸ）又は化合物Ａ（ＤＯＸＡ）を８週間の間、２回／１週間で静脈内投与した（総累積服用量、１６ｍｇ／ｋｇ）。ドキソルビシンのグループ（Ｃ）又は化合物Ａのグループ（ＣＸ）に対し、年齢の合う対で餌づけしたコントロールには賦形剤のみ投与した。
【００８４】
ドキソルビシンのグループは化合物Ａ、ＣＸやＣグループと有意に違っていた（Ｐ＜０．０５；２×２ 相関性カイ２乗分析（ｃｏｎｔｉｎｇｕｅｎｃｙ Ｃｈｉ ｓｑｕａｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）、２テール（ｔｗｏ ｔａｉｌ））。
【００８５】
ウサギは、１ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン（ＤＯＸ）又は化合物Ａ（ＤＯＸＡ）を８週間の間、２回／１週間で静脈内投与した（総累積服用量、１６ｍｇ／ｋｇ）。ドキソルビシンのグループ（Ｃ）又は化合物Ａのグループ（ＣＸ）に対し、年齢の合う対で餌をやったコントロールには賦形剤のみ投与した。
【００８６】
Ｎ＝普通の心臓機能又は組織変化；Ａ＝異常心臓機能又は組織変化である。３つの心臓毒性試験中少なくとも２つが異常であれば、全体的な心臓状態が異常であると定義した。異常収縮率を１００分位数の２０半ば以下での傾向又は持続した値として定義する。９．０ミスト（ｍｉｓｔ）以下の値を異常大動脈根加速化現象と定義した。異常組織変化を、空胞形成、筋原繊維障害及び単核炎症が生じることと定義した（上記方法のディスカッショッンを参照）。組織変化は、普通、軽度、中度又は重度と上述したように評価した。ドキソルビシン治療したグループは、化合物Ａ、ＣＸやＣグループより異常な全体的心臓状態である個体が有意に多かった（Ｐ＜０．０２；フィッシャー抽出試験、２テール）。
【００８７】
【表９】

．
【００８８】
¹ 服用：１ｍｇ／ｋｇドキソルビシン、１週間あたり２度、８週間
² 異常組織変化：空胞形成、筋原繊維障害
³ Ｐ＜０．０２、ドキソルビシンに対するもの
【００８９】
心臓毒性試験の結果、化合物Ａでは存在する心臓機能に変化はなく、軽度の組織病理学的な影響は２／６のウサギに見られただけであった。一方、ドキソルビシンでは５／６のウサギで心臓機能が変化し、この心臓毒性の慢性ウサギモデルにおける全てのウサギに異常組織変化が生じた。化合物Ａは、ドキソルビシンと比較して、試験した服用量において心臓毒性を本質的に有さない。また、化合物Ａは、血液の構成及び体重増加に対し明らかな影響を与えない。本投与手順において、化合物Ａは、ドキソルビシンと比較して、ウサギにおける心臓毒性及び全身毒性が低い。
【００９０】
マウスでの亜急性毒性試験では、以下に示すように化合物Ａがドキソルビシンより骨髄毒性が低いことも示された。
【００９１】
【表１０】

【００９２】
薬剤は１、５及び９日目に静脈注射で投与した。測定は１５日目に行った。値は平均±ＳＥである。＋＝賦形剤との差、Ｐ＜０．０５、＃＝化合物Ａとの差、Ｐ＜０．０５。両服用量は最大致死服用量である。
【００９３】
上述した試験の結果は化合物Ａがドキソルビシンの非心臓毒性の形態であることを明らかに示す。化合物Ａは１４−ＯＨ基が存在しているので、化合物Ａは白血病に加えて肉腫及び癌腫に有用である可能性がある。化合物Ａは毒性１３−アルコール代謝産物を形成しないことから、服用を制限する心臓毒性が生じないと期待される。結果的に、化合物Ａは、ドキソルビシンと異なり、鎮静するか再発及び転移を防止するために必要な限り服用してよい。この点で、化合物Ａ及び他の１３−デオキシアントラサイクリンは、癌のアントラサイクリン化学療法の重大な突破口に相当する。
【００９４】
全身毒性がより少なく服用量を制限する蓄積する心臓毒性がないので、より効果的な服用をより長時間行うことができることから、化合物Ａのようなアントラサイクリン誘導体は非１３−デオキシアントラサイクリン対応物より治療上効果的であることが、結果によって示される。ドキソルビシン及びダウノルビシンで治療できる癌に罹った患者を治療する際に本発明で使用する１３−デオキシアントラサイクリンは、１３−ケト対応化合物と比較して、少なくとも有効又は等能累積服用量の少なくとも約１．５倍の服用量で投与することができることを示している。
【００９５】
本発明は１３−デオキシアントラサイクリン誘導体を形成する改良した方法をも提供する。表８は、本発明に従い合成可能な１３−デオキシアントラサイクリン誘導体の例を示している。上記で論じたように、表８で示したような化合物は抗腫瘍性であることが知られている。
【００９６】
既知の方法とは異なり、本発明の方法は温度感受性がより低い。例えば、本発明の方法は約０℃〜約７５℃の温度で行ってもよい。好ましくは、約６５℃〜約７５℃で行う。さらに好ましくは、約６８℃〜約７２℃で行う。約７２℃を越えると、反応物と生成物の分解が概して生じる。
【００９７】
本発明の方法は、いくつかの一般的な条件からなる。例えば、上記方法は酸性条件下で行うことが好ましい。言い換えれば、ｐＨは約６．５以下であるべきである。上記化合物の既知の製造方法は反応混合物内で塩基性条件下とするが、反応物及び生成物の分解を生じることが知られていた。その反応、又は、還流等のその一部分のいずれかは、約７５℃以下の温度で、無酸素、無水及び／又は窒素下で行ってもよい。
さらに、酸素及び水の両方が反応から除外されなければいけない。好ましくは、上記反応は無水溶媒を用いて窒素又は不活性ガス雰囲気下で行われる。
【００９８】
本発明の方法は、上記化合物の既知の製造方法より高収率である。例えば、既知の方法は収率が約３０％であることが分かっている。一方、本発明の方法は約７０％〜約８０％の収率であることが分かった。
上記に対応して、本発明は上記一般式Ｉの化合物の製造方法を提供する。
以下に反応が進行する際の分子の変換例を示す。
【００９９】
【化９】

【０１００】
（式中、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 及びＲ₅ は上述したものである）。
以下のフローチャートは、１３−デオキシアントラサイクリン誘導体である１３−デオキシドキソルビシンを調製する本発明の方法のある実施形態の例である。
【０１０１】
【表１１】

【０１０２】
以下にアントラサイクリン誘導体の例を示すが、その合成はここで開示する。
【０１０３】
【化１０】

【０１０４】
【表１２】

【０１０５】
化合物中、Ｒ₅ は別のアントラサイクリン類似体の修飾体であってもよい。また、Ｄ環はフッ素化されてもよい。
【０１０６】
一般に、本発明の方法は還元剤と１３−デオキシアントラサイクリンの溶液を調製することからなる。溶液は穏やかに還流する。そして、反応混合液は冷却してもよい。一例では、反応混合物を約０℃〜約４℃の温度に冷却する。そして、塩基を反応混合液に加える。塩基は冷却してもよい。例えば、塩基を約０℃〜約４℃の温度にする。塩基の一例として、飽和ＮａＨＣＯ₃ 水溶液が挙げられる。含ハロゲン炭素化合物溶媒を反応混合液に加えもよい。上記含ハロゲン炭素化合物溶媒を、塩基と同時に反応混合液に加えてもよい。含ハロゲン炭素化合物溶媒を冷却してもよい。例えば、含ハロゲン炭素化合物溶媒は約０℃〜約４℃の温度に冷却してもよい。使用しうる含ハロゲン炭素化合物溶媒の一例として、ＣＨＣｌ₃ が挙げられる。そして反応混合液を濾過できる。上記濾過は低温で行ってもよい。例えば、濾過は約４℃〜約１５℃の温度で行える。
【０１０７】
上記の塩基及び含ハロゲン炭素化合物溶媒の添加は加水分解沈殿を開始するのに好ましい。反応混合液から濾別されうるのは無機塩の沈殿物である。濾過後、濾液を酸性化してもよい。濾液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけてもよい。疎水性の不純物をより極性の低い溶媒で溶出することによって分離できる。そして、１３−デオキシアントラサイクリン産物を溶出して、その溶出物をさらに精製できる。
【０１０８】
本発明の方法は、好ましくは、ｐ−トルエンスルホン酸及び水素化シアノホウ素ナトリウムとアントラサイクリン１３−トシルヒドラゾンの無水メタノール溶液を調製することからなる。溶液は窒素下穏やかに還流し、冷却する。そして、重炭酸ナトリウム飽和水溶液及びクロロホルムを加える。塩沈殿物を濾過し、濾液をジエチルエーテル中塩酸で酸性化して、シリカゲルカラムで単離する。分解の結果生じた疎水性不純物をクロロホルムとメタノールの混合液で溶出する。生成物である１３−デオキシアントラサイクリンはメタノールで溶出する。メタノール溶出物は、分取ＨＰＬＣでさらに精製する。
【０１０９】
上記方法いずれでも、１３−デオキシアントラサイクリンの分離前又は後に、１３−ケト基をメチレン基に還元可能な１つ又は複数の還元剤及び／又はその他の薬剤で１３−デオキシアントラサイクリンを処理できる。
【０１１０】
以下に本発明の方法の例を示す。
【０１１１】
【実施例】
１３−デオキシドキソルビシン塩酸塩の調製
１ｇのドキソルビシン１３−トシルヒドラゾン塩酸塩及び２．４ｇのｐ−トルエンスルホン酸を５０ｍｌの無水メタノールに溶解する。この溶液に０．８ｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを加える。その溶液を６８℃−７２℃に加熱して、１時間窒素雰囲気下で穏やかに還流する。
【０１１２】
そして、反応混合液を約２０ｍｌに濃縮して、フリーザーで０−４℃に冷却する。２ｍｌの重炭酸ナトリウム飽和水溶液を加え、２００ｍｌクロロホルムを加える。無水硫酸ナトリウムを加え、振とう後塩を濾過する。濾液をジエチルエーテル中塩酸で酸性化する。
【０１１３】
その後、溶液をシリカゲルカラム（２．５×５ｃｍ）にかける。カラムは溶出液が無色になるまでクロロホルム／メタノール（１０／１）で洗浄する。生成物を含有する結合分画は、メタノールで溶出する。メタノール溶出液を蒸発させ、残渣を３０％アセトニトリルの蟻酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ＝４．０、０．５％）に溶解させ、分取ＨＰＬＣで単離する。フェニルカラムを用い、アセトニトリル／蟻酸アンモニウムの傾斜溶出液（２７％〜３０％のアセトニトリル、３０分）を用いて、他の不純物から生成物の分離を行う。そしてＨＰＬＣの精製分画を凍結乾燥して、１３−デオキシドキソルビシン蟻酸塩を得、これを塩酸含有メタノールに溶解させる。溶媒を蒸発させ、生成物をメタノール／エチルエーテルで沈殿し、６００ｍｇの１３−デオキシドキソルビシン塩酸塩を得る。収率は８０％であった。
【０１１４】
ＴＣＬ：Ｒ_f ＝０．３８ ＣＨＣｌ₃ （３０）：ＭｅＯＨ（１０）：Ｈ₂ Ｏ（１）
Ｕ．Ｖ．：λ_max ＝２３３，２５２，２９３，４８５ ｎｍ
ＭＳ： ５３０（Ｍ＋Ｈ）
【０１１５】
【化１１】

【０１１６】
¹ＨＮＭＲ（メタノール ｄ₄ ）： （以下参照）
σ １．３０（ｄ，３Ｈ，６’−Ｈ₃ ），
１．８５（ｍ，２Ｈ，１３−Ｈ₂ ），
２．０５（ｍ，２Ｈ，１０−Ｈ₂ ），
２．６０（ｄ，１Ｈ，１２−Ｈ），
３．０５（ｄ，１Ｈ，１２−Ｈ），
３．５５（ｍ，１Ｈ，５’−Ｈ），
３．９０（ｍ，２Ｈ，１４−Ｈ₂ ），
４．０５（ｍ，３Ｈ，Ｏ−ＣＨ₃ ），
４．２５（ｍ，１Ｈ，４’−Ｈ），
４．９５（ｍ，１Ｈ，３’−Ｈ），
５．４０（ｍ，１Ｈ，１’−Ｈ），
７．５０（ｄｄ，１Ｈ，３−Ｈ），及び
７．８０（ｍ，２Ｈ，１−及び ２−Ｈ）
【０１１７】
本発明は、抗癌治療を必要とする哺乳類ホストの治療法でもある。その方法は、抗癌有効量で少なくとも１つの式１の化合物の抗癌有効量をホストに投与することからなる。
【０１１８】
【化１２】

【０１１９】
本発明の化合物の抗癌有効量は、投与の形態、哺乳類の種類、体重、年齢及び個別の状態に依存して投与してもよい。本発明の化合物は、単独の治療薬として又は治療薬の組み合わせで、調合薬に関する使用において利用可能な従来の方法で投与できる。それらは単独で投与することもできるが、一般には選択した投与経路及び標準の調剤の手法に基づいて選択した製薬用の賦形剤と共に投与される。
【０１２０】
投与される服用量は、もちろん、特定の薬物の薬力学的性質及び投与形態及び経路；受容者の年齢、健康及び重量；症状の性質及び拡大、同時に行う治療の種類；治療の頻度；及び、望みの効果等既知の要素に依存して変動する。活性成分の１日の服用量は、体重１キログラム（ｋｇ）あたり約０．００１〜１０００ミリグラム（ｍｇ）であり、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの投与であると考えられる。
【０１２１】
服用形態（服用に適した組成物）は、ユニットあたり約１ｍｇ〜約１００ｍｇの活性成分を含有する。これらの医薬組成物には、通常活性成分が組成物の全体量に対し約０．５％〜９５重量％存在する。
【０１２２】
活性成分は、カプセル、錠剤、粉末等の固形服用形態、又は、エリキシル、シロップ及び懸濁液等の液体調剤形態で経口投与できる。それは滅菌液体調剤形態で非経口投与することもできる。活性成分は鼻孔内に（点鼻薬）又は吸入法で投与することもできる。貼薬や軟膏を介して経皮投与等の他の調剤形態も可能である。
【０１２３】
ゼラチンカプセルは、活性成分、及び、ラクトース、スターチ、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等の粉末化担体を含有する。同種の希釈液を圧縮錠剤を製造するために使用できる。錠剤及びカプセルの両方とも、数時間にわたって薬物の継続的放出を供する持続性放出製品として製造することができる。圧縮錠剤は、不快な風味を隠し周囲から錠剤を保護するために糖被覆又は膜被覆をするか、又は、胃腸管で選択的に消化され腸溶性の被覆をすることができる。
【０１２４】
経口投与のための液体調剤形態は、着色及び香付けをして患者の受容度を大きくすることができる。
一般に、水、適当な油、食塩水、水溶性デキストロース（グルコース）及び関連した糖溶液、並びに、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコールは、非経口用溶液に適当な担体である。非経口投与用の溶液は、活性成分の水溶性塩、適当な安定化剤、及び、必要に応じて緩衝液物質を含有することが好ましい。二硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、又は、アスコルビン酸等の抗酸化剤は、単独又は組み合わせで好ましい安定化剤である。クエン酸、その塩、及び、ＥＤＴＡナトリウムも使用できる。
【０１２５】
加えて、静脈内又は腹腔内投与のための投与形態は、注入のための滅菌水又は滅菌食塩水で還元するための凍結乾燥粉末を含有することもできる。それらの溶液は、ベンズアルコニウムクロライド、メチル又はプロピルパラベン、並びに、クロロブタノール等の保存料を含むこともできる。
【０１２６】
好ましい医薬担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ社、当該分野の標準参考テキストに述べられている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、心臓毒性に至る経路を表したフローチャートである。
【図２】図２は、本発明の化合物の一実施形態又はドキソルビシン１７５μＭ中でインキュベートした右心房及び心室中のドキソルビシノール時間に対する濃度を表したグラフである。
【図３】図３は、本発明の化合物の一実施形態又はドキソルビシンのＨＬ−６０細胞での［³ Ｈ］−チミジン取込みを表したグラフであり、細胞の成長阻害を示したものである。
【図４】図４は、本発明の化合物の一実施形態又はドキソルビシンのＰ３８８細胞での［³ Ｈ］−チミジン取込みを表したグラフであり、細胞の成長阻害を示したものである。
【図５】図５は、本発明の化合物の一実施形態又はドキソルビシンのＭＣＦ７細胞での［³ Ｈ］−チミジン取込みを表したグラフであり、細胞の成長阻害を示したものである。
【図６】図６は、本発明の化合物の一実施形態又はドキソルビシンのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞での［³ Ｈ］−チミジン取込みを表したグラフであり、細胞の成長阻害を示したものである。
【図７】図７は、本発明の化合物Ｂ及びダウノルビシンの収縮性機能に与える作用を表したグラフである。
【図８】
【図９】
【図１０】図８ａ−ｃは、それぞれ本発明の化合物の一実施形態、ドキソルビシン又はコントロールサンプルを使用して２０〜２３週間治療したウサギから得られる左心室組織の組織変化を表わす２００倍拡大光学顕微鏡写真であり、本発明の化合物Ａ又はコントロールサンプルでは見られないが、ドキソルビシンのサンプルでは筋細胞の空胞形成及び筋原繊維の欠損が示されている。

Claims (7)

1. １３−デオキシドキソルビシンの製造方法であって、
   ドキソルビシン１３−トシルヒドラゾンのｐ−トルエンスルホン酸及び水素化シアノホウ素ナトリウム入り無水メタノール溶液を調製し；
   溶液を７５℃以下の温度で、無酸素、無水及び窒素下で穏やかに還流し；
   その溶液を冷却し；
   重炭酸ナトリウム飽和水溶液及びクロロホルムを溶液に加え、沈殿物を形成させ；
   沈殿物を濾過し；
   濾液をジエチルエーテル中塩酸で酸性化して；
   濾液中に含有された塩をシリカゲルカラムで単離し；
   塩の分解の結果生じた疎水性不純物をクロロホルムとメタノールの混合液で溶出し；
   生成物１３−デオキシドキソルビシンをメタノールで溶出し；
   そして
   メタノール溶出物を分取ＨＰＬＣでさらに精製することからなる方法。
2. 前記溶液のｐＨが６．５以下である請求項１記載の方法。
3. 前記還流を６８℃〜７２℃の温度で行う請求項１記載の方法。
4. 前記還流を６５℃〜７５℃の温度で行う請求項１記載の方法。
5. 前記還流を不活性ガス雰囲気下で行う請求項１記載の方法。
6. 前記方法は７０％〜８０％という収率を与える請求項１記載の方法。
7. １３−デオキシドキソルビシンを製造する請求項１記載の方法であって、
   １ｇのドキソルビシン１３−トシルヒドラゾン塩酸塩及び２．４ｇのｐ−トルエンスルホン酸を５０ｍＬの無水メタノール中に溶解して溶液を調製し；
   ０．８ｇの水素化シアノホウ素ナトリウムを前記溶液に加え；
   前記溶液を６８℃〜７２℃の温度に加熱し；
   前記溶液を１時間窒素雰囲気下で緩やかに還流し；
   反応混合液を２０ｍＬに濃縮し；
   反応混合液をフリーザーで０℃〜４℃の温度に冷却し；
   ２ｍｌの飽和重炭素ナトリウム水溶液を反応混合液に加え；
   ２００ｍｌのクロロホルムを反応混合液に加え；
   無水硫酸ナトリウムを加え；
   攪拌後、無水硫酸ナトリウムの添加により生じた塩を濾過し；
   濾液をジエチルエーテル中塩化水素で酸性化し；
   前記溶液をシリカゲルカラムに通し；
   さらに、溶出液が無色になるまでクロロホルム／メタノールでカラムを洗浄し；
   生成物を含有する分画をメタノールで溶出し；
   メタノール溶出液を蒸発させ；
   蒸発の結果得られた残渣を３０％アセトニトリル−蟻酸アンモニウム緩衝液に溶解させ；
   生成物をフェニルカラムを用いて分取ＨＰＬＣで単離し；
   生成物をアセトニトリル／蟻酸アンモニウムの傾斜溶出液を用いて他の不純物から分離し；そして、
   ＨＰＬＣの精製分画を凍結乾燥して、６００ｍｇの１３−デオキシドキソルビシン塩酸塩を得ることからなる方法。

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