JP4595279B2 - Anti-adhesion membrane - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コラーゲン含有癒着防止膜に関する。本発明の癒着防止膜は、生体適合性が良好であり、生体内で長期間安定に癒着防止効果を発揮し、縫合可能であるため、例えば胸膜、心膜、脳硬膜、漿膜などの生体内膜状組織および各種臓器などの欠損部または切断面への補填、補綴用膜として用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
各種の外科手術においては、患部の切除、および損傷部位の修復等を行うことが多く、特に肺、心臓、肝臓、脳、消化器官、胆嚢などの各種臓器を対象とする場合には、その切断面や欠損部などに、該臓器の組織を覆っている膜状物を補填または補綴しなければ、その臓器の根本的な機能を損なう場合が多い。これらの処置を不完全に行うと、臓器の機能不全により死亡するか、もしくは生命の危機を逃れても、予後が大変悪くなる傾向が良く見受けられる。またこれらの補綴、補填部位での縫合固定が不良であると、該処置を行った臓器自身の機能はかろうじて維持できたとしても、これらの臓器から滲出または漏出した体液、消化液、内容物などにより感染したり、他臓器への攻撃、浸食を引き起こして生命の危機を招くこともある。
【０００３】
さらに、これら補綴または補填した膜状物と臓器との癒着が高頻度に発生するケースがあり、その結果として、経時的に臓器の機能不全を誘発する事もある。このような各種の問題点を解決する目的で、臓器または該臓器の組織を覆う膜状物または癒着防止膜が、様々な材料により開発されている。
【０００４】
癒着を防止する機構として、最も単純かつ効果的である方法は、損傷または欠損等により傷ついた組織と、この組織に物理的に接触が可能である別の組織とを隔壁により接触させないことである。しかし、これを合成繊維等で行う場合、生体適合性の不足から、過度の石灰化、異物反応、炎症反応などの様々な不都合が生じてくる。また、隔壁として生体適合性材料を用いた場合であっても、材料自身が、損傷または欠損した組織と、それに対応する別組織との癒着を媒介してしまってはならない。これらの条件を満足するものとしては、ヒアルロン酸やゼラチンなどが挙げられる。両者は共に粘性のある水溶性の液体として取り扱うことが可能であり、様々な加工方法により、ゲルとして利用することが可能である。
【０００５】
これらの材料は主に動物等の生体より抽出・精製されるものであるから、生体適合性が良好であり、既に医薬品をはじめ、様々な医療分野で実用化が成されている。
例えば、ヒアルロン酸を利用する癒着防止膜、医用材料等は特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０などに記載されている。
【０００６】
【先行技術文献】
【特許文献１】
特開平６−７３１０３号公報
【特許文献２】
特公平７−３０１２４号公報
【特許文献３】
登録特許第２６７０９９６号公報
【特許文献４】
特開平８−３３３４０２号公報
【特許文献５】
特開昭６１−２３４８６４号公報
【特許文献６】
登録特許第２６４８３０８号公報
【特許文献７】
特開平８−１５７３７８号公報
【特許文献８】
特開平９−２９６００５号公報
【特許文献９】
特開平７−１０２００２号公報
【特許文献１０】
特表平７−５０９３８６号公報
【０００７】
特許文献１１には、動物由来コラーゲンのみを利用した医療用膜を改良した膜として、架橋したコラーゲン繊維からなる不織布層の少なくとも一面が、コラーゲン被膜で覆われた医療用コラーゲン膜が記載されている。特許文献１２には、コラーゲン繊維の不織布上にゼラチンまたはヒアルロン酸を単独で癒着防止膜に利用した技術が記載されている。
【０００８】
【特許文献１１】
特開２０００−９３４９７号公報
【特許文献１２】
特開２０００−２７１２０７号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら上記した技術は生体適合性、生体内分解・吸収性、物理的・機械的強度、取り扱いの容易さ、長期間の癒着防止効果などの点において十分満足できるものではない。長期間にわたって十分な癒着防止効果を発揮し、副作用もほとんどなく、しかも生体適合性、生体内分解・吸収性が良く、縫合固定が可能な機械的強度を同時に満足する改良された医用材料が求められている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、種々鋭意検討を行った結果、本発明者らはコラーゲン繊維からなる不織布層の表面に、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層を設けることにより、有意に耐分解性が向上した癒着防止層を構築することを可能とし、癒着防止効果が長期間維持される癒着防止膜が得られることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち、本発明は、
（１） コラーゲン繊維からなる不織布層の表面に、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層を有してなる癒着防止膜、
（２） コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層がスポンジ状もしくはフィルム状である上記１記載の癒着防止膜、
（３） コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層がコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を架橋反応に付してなる層である上記１記載の癒着防止膜、
（４） コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層の厚さが約５０μｍ〜２０ｍｍである上記１記載の癒着防止膜、
（５） 癒着防止膜を構成するコラーゲンが酵素可溶化コラーゲン、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲンまたは中性可溶化コラーゲンである上記１記載の癒着防止膜、
（６） 癒着防止膜を構成するコラーゲンの一部もしくは全部が架橋されたコラーゲンである上記１記載の癒着防止膜、
（７） コラーゲン繊維からなる不織布層が▲１▼コラーゲンまたは▲２▼コラーゲンとヒアルロン酸との混合物でコラーゲン繊維が互いに接合された不織布の層である上記１記載の癒着防止膜、
（８） コラーゲン繊維からなる不織布層の厚さが約５０μｍ〜１０ｍｍ、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層の厚さが約５０μｍ〜２０ｍｍである上記１記載の癒着防止膜、
（９） コラーゲン繊維からなる不織布層が、コラーゲン繊維からなる不織布を１〜６枚積層してなる上記１記載の癒着防止膜、
（１０） コラーゲン繊維の直径が約１０〜１，０００μｍ、コラーゲン繊維からなる不織布層の嵩密度が約５×１０−４〜５０ｇ/ｃｍ３である上記１記載の癒着防止膜、
（１１） 膜全体の厚さが約１００μｍ〜３０ｍｍである上記１記載の癒着防止膜
に関する。
【００１２】
【発明の実施の態様】
本発明において、コラーゲン繊維からなる不織布層とは、コラーゲン繊維からなる２次あるいは３次構造を有する構造物であり、コラーゲン繊維空隙の一部または全部が気体、液体、固体などで満たされていてもよく、コラーゲン繊維の外周面の一部または全部が固体または液体で覆われていてもよい。コラーゲン繊維は▲１▼コラーゲンまたは▲２▼コラーゲンとヒアルロン酸との混合物等のバインダーで互いに接合されていてもよい。
またコラーゲン繊維を構成するコラーゲンは、その一部もしくは全部が架橋されていてもよい。また、コラーゲン繊維を構成するコラーゲンやコラーゲンとヒアルロン酸との混合物におけるコラーゲンは、酸可溶化コラーゲンを用いた場合、アルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（例、マグネシウム、カルシウム等）等の塩として用いてもよく、アルカリ可溶化コラーゲンを用いた場合、無機酸（例、塩酸、硫酸、硝酸、等）、有機酸（例、酢酸、クエン酸等）との塩として用いてもよい。ヒアルロン酸は、アルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（例、マグネシウム、カルシウム等）等の塩として用いてもよい。
【００１３】
コラーゲン繊維の直径は通常、約１０〜１，０００μｍ、好ましくは約２０〜２５０μｍである。コラーゲン繊維からなる不織布層は通常、１〜６枚、好ましくは２〜４枚のコラーゲン不織布が積層されたものである。
コラーゲン繊維からなる不織布層の嵩密度は、通常、約５×１０−４〜５０ｇ/ｃｍ３、好ましくは約０．０５〜５０ｇ/ｃｍ３である。厚さは通常、約５０μｍ〜１０ｍｍ、好ましくは、約０.２〜２ｍｍである。
【００１４】
コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層とは、コラーゲンとヒアルロン酸とを含有し、通常、スポンジ状もしくはフィルム状などの形態を有する層状物である。コラーゲンとヒアルロン酸との混合物は、酸可溶化コラーゲンを用いる場合、アルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（例、マグネシウム、カルシウム等）等の塩として用いてもよく、アルカリ可溶化コラーゲンを用いた場合、無機酸（例、塩酸、硝酸等）、有機酸（例、酢酸、クエン酸等）との塩として用いてもよい。
コラーゲンとヒアルロン酸の混合比率（重量比）は約１：１００から約１００：１の範囲が用いられ、好ましくは約３：７から約７：３の範囲であり、さらに好ましくは約１：１である。コラーゲンとヒアルロン酸との混合物は架橋反応処理されていてもよい。コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層とコラーゲン繊維からなる不織布層とを接着させるため、コラーゲン、ヒアルロン酸、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む水溶液などを被覆層と不織布層との接着面に塗布してもよい。コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層の厚さは、通常、約５０μｍ〜２０ｍｍであり、好ましくは、約０．１〜１ｍｍである。該被覆層はコラーゲン繊維からなる不織布層の片面または両面のいずれに積層されていてもよい。
【００１５】
本発明の癒着防止膜は、コラーゲン繊維からなる不織布層と、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層を積層させた、積層構造を有する。本発明の癒着防止膜の全体の厚さは、通常、約１００μｍ〜３０ｍｍであり、好ましくは約０．５〜８ｍｍである。
本発明の癒着防止膜は十分に縫合可能な膜強度を主にコラーゲン繊維からなる不織布層が担当し、生体適合性と周囲組織との癒着防止効果をコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層が発揮する。
【００１６】
本発明の癒着防止膜は、コラーゲンおよびヒアルロン酸が生体由来材料であり、生体適合性が非常に優れているだけでなく、移植された生体内では徐々に分解・吸収され、最終的には全て分解・吸収されることとなる。特にコラーゲン繊維からなる不織布層は、生体内欠損部位等の組織再生が完了するまでの間、補填、補綴、シールする足場として存在し、縫合固定の一定期間、その膜強度を維持した後に、全て分解・吸収される。また、最外層のコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層は、その粘性と徐放作用により、損傷または欠損部位の組織と周囲組織との癒着を防止する。なお、この癒着を防止する期間は、損傷または欠損部位の組織が、自然状態で周囲組織との癒着が起こらない程度まで再生・治癒するまでの期間持続する。これらの癒着防止効果を発揮しつつ、徐々に体内で分解・吸収され、最終的にはこれらコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層も消失する。
【００１７】
本発明の癒着防止膜の製造方法を以下に記載する。
本発明において使用される代表的なコラーゲンの原料としては、例えば酵素可溶化コラーゲン、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲンまたは中性可溶化コラーゲンなどが挙げられる。これらの可溶化コラーゲンとは、溶媒に溶解できるよう処理が施されたコラーゲンである。例えば、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン、中性可溶化コラーゲン等の可溶化コラーゲンが挙げられる。特に可溶化処理と同時にコラーゲンの抗原決定基であるテロペプタイドの除去処理が施されている、アテロコラーゲンが好適である。これらコラーゲンの可溶化方法については、特公昭４６−１５００３号公報、特公昭４３−２５９８３９号公報、特公昭４３−２７５１３号公報等に記載されている。またコラーゲンの由来については、ウシ、ブタ、鳥類、魚類、ウサギ、ヒツジ、ネズミ、ヒト等の動物種の皮膚、腱、骨、軟骨、臓器等から抽出されるものである。コラーゲンのタイプとしてはＩ型、III型等の分類可能なタイプのうちいずれかに限定されるものではないが、取り扱い上の観点から、Ｉ型が特に好適である。
【００１８】
酸可溶化コラーゲンを用いる場合、コラーゲンは凝固後、水中で炭酸アルカリ金属（例、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、炭酸水素アルカリ金属（例、炭酸水素ナトリウム等）、水酸化アルカリ金属（例、水酸化ナトリウム等）などにより中和した塩として用いてもよい。また、アルカリ可溶化コラーゲンを用いる場合、コラーゲンは凝固後、水中で無機酸（例、塩酸、硫酸、硝酸等）、有機酸（例、酢酸、クエン酸等）などにより中和した塩として用いてもよい（以下の場合も同様）。
【００１９】
ヒアルロン酸は動物由来、微生物由来のどちらでも良いが、医療用グレードの物が特に好適である。ヒアルロン酸はアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウム等）等の塩として用いてもよい。
また、コラーゲンを可溶化させる溶媒については、コラーゲンを可溶化できる溶媒であれば、特に限定されないが、好ましくは、水、中性塩（例、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等）の水溶液、希鉱酸（例、希塩酸、希硝酸等）、親水性有機溶媒（例、エチルアルコール、エチレングリコールなどの１価ないし多価アルコール類）を含んでいてもよい。取り扱い上、水が好適である。
【００２０】
コラーゲン繊維からなる不織布は、常法（例えば、特開２０００−９３４９７に記載の方法）に従ってコラーゲン水溶液から連続紡糸してコラーゲン糸を得、不織布状に加工することにより好適に製造される。
本発明に用いられるコラーゲン水溶液の濃度は、使用するコラーゲンの種類により任意であり、紡糸可能であればどの様な濃度でも構わないが、通常は約０．１重量％〜２０重量％、このうち湿式紡糸では約１重量％〜１０重量％程度が特に好適である。また、紡糸時のコラーゲンの吐出速度は、紡糸可能である範囲であれば任意である。
【００２１】
紡糸の際、コラーゲン溶液の吐出に用いる装置は、汎用のギアポンプ、ディスペンサー、各種押し出し装置等、何を用いても良いが、均一な紡糸を行うためには脈動が少なく安定してコラーゲン溶液を定量吐出できる装置が良い。
また、紡糸を行う際の口金の孔径サイズは紡糸さえ可能であれば、特に限定はされないが、あまりに大きな孔径ではバインダー処理による繊維状物から膜状物にする操作が困難となり、また極度に細径であると膜強度の向上が難しくなるので、通常、約１０μｍ〜１０００μｍ、好ましくは約５０μｍ〜７００μｍの範囲が用いられる。さらに口金の孔数は単数でも複数でも良い。口金の形状も特に限定はされず、紡糸可能であれば、例えばスリット状、各種形状などの物を用いても良い。さらに口金の孔長に関しては、これも紡糸可能であれば特に限定はされないが、可溶化コラーゲン分子中のコラーゲン分子を、少しでも多く配向させる目的において、可能な限り長い方が好ましい。
【００２２】
湿式紡糸で用いられる凝固浴としては、一般的にコラーゲンを凝固させうる溶媒、懸濁液、乳濁液もしくは溶液であれが特に限定はされないが、無機塩類水溶液、無機塩類含有有機溶媒、アルコール類、ケトン類またはこれらの任意の組み合わせが用いられる。無機塩類水溶液としては、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどの水溶液、特に塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの水溶液が好ましい。これらの無機塩類をアルコール、アセトンに溶解／分散させた無機塩類含有有機溶媒等を用いてもよく、この場合特に塩化ナトリウムのエタノール溶解／分散溶液が好ましい。アルコール類としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アミルアルコール、ペンタノール、ヘキサノールなどの炭素数１から６のアルコール類やエチレングリコールなどのグリコール類、好ましくはエタノールが挙げられる。ケトン類としてはアセトン、メチルエチルケトンなどが挙げられる。
【００２３】
上記凝固浴はコラーゲンの凝固のためだけではなく、後述する各種架橋剤との組み合わせにより、コラーゲンの凝固と架橋処理を同時に実施できる加工方法も有効である。たとえば、エタノールとグルタルアルデヒドを混和した溶液を、凝固処理と架橋処理を兼ね備えた凝固浴として使用した場合、両者の工程を一度に行うことができ、紡糸されたコラーゲン糸はそのまま架橋処理される。これらの同時処理は、工程の合理化だけではなく、希薄なコラーゲン溶液による紡糸や細径の糸を紡糸する際に非常に有効である。
【００２４】
上記の不織布層の形成方法において、特に好適な具体例を以下に記す。コラーゲン吐出用口金の孔径がφ２００μｍ程度で、孔長１５〜２０ｍｍ程度のものを使用し、脈動なくコラーゲン溶液をディスペンサー等で吐出させ、約９９．５容量％エタノール凝固浴中へ湿式紡糸すことが望ましい。約９９．５容量％エタノール凝固浴中にコラーゲンを押し出す際には、吐出口金を随時移動させ、紡糸された糸が任意の方向より交差し得る状態で連続的に押し出し、糸を多重多層状態にした後に凝固液を除去して再度エタノールで洗浄し、減圧乾燥する事により、非常に良好な綿状の繊維状物を簡便に得ることができる。この方法は、紡糸と不織布化が同時に実施できるので、工程の簡素化、短縮化、経済性の面で特に有効である。
【００２５】
この例は代表的なものであり、繊維状物が得られさえすれば 、これに限定されるものではなく、例えば前述のコラーゲン繊維ステープルを利用しても良いし、凝固浴の種類、凝固浴と架橋剤の混合浴の利用、また乾燥方法等を変更し、さらにそれらの組み合わせを変更してもよい。
【００２６】
一方、コラーゲン水溶液から間欠吐出による非連続紡糸、又は通常の連続紡糸を行った後に得られる糸を切断処置することにより、連続、非連続紡糸のいずれの場合においても短いステープル状の繊維状物が得られる。これらを適当な大きさの容器に均一に分散させた状態で、減圧乾燥、自然乾燥などの方法により乾燥させた不織布（繊維状物）を製造することも可能である。
【００２７】
上記方法で得られた不織布は十分な縫合強度を獲得するために、必要によりさらに架橋処理を施してもよい。この架橋処理により、特に湿潤時における物理的な強度が向上し、縫合に必要な強度が十分に確保できる。また、生体内に移植された際に分解・吸収される時間を、未架橋の場合に比較して飛躍的に遅延させる為でもある。この架橋処理により、生体の欠損部を補填または補綴し、欠損による臓器・組織等の機能不全を防止し、しかも創傷面の修復および組織の再生を完了するまでの期間、体内で必要な膜強度を維持したまま残存することが可能となる。
【００２８】
この架橋方法には、大別して物理的架橋方法と化学的架橋方法が存在する。物理的架橋処理法としては、γ線照射、紫外線照射、電子線照射、プラズマ照射、熱脱水架橋処理などがあげられる。このうち熱脱水架橋処理が好ましい。熱脱水架橋処理では、コラーゲン単糸が巻き取られた状態で減圧下加熱処理することにより物理的に架橋処理される。この架橋処理では、架橋温度と架橋時間により生体適合性と分解吸収性をコントロールすることが可能である。物理的架橋と化学的架橋はそれぞれ単独で行ってもよいし、併用してもよく、また併用する場合にはその順番は問わない。
化学的架橋反応に用いる架橋剤としては、コラーゲンとの架橋反応が可能であれば如何なる架橋剤でも使用可能であり、例えばアルデヒド類、エポキシ類、カルボジイミド類、イソシアネート類などが挙げられる。アルデヒド類としてはホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサル、ジアルデヒドデンプン等、エポキシ類としてはグリセロールジグリシジルエーテル等、カルボジイミド類としては水溶性カルボジイミド等、イソシアネート類としてはヘキサメチレンジイソシアネート等が挙げられる。好ましくはグルタルアルデヒドである。コラーゲン単糸の架橋は、通常、架橋剤の溶液中にコラーゲン単糸を浸漬することにより行われる。架橋剤溶液の溶媒は特に限定されないが、水やエタノール等が好適であり、特にエタノールが最適である。架橋剤溶液の濃度と浸漬時間により、分解吸収性と生体適合性をコントロールすることが可能である。架橋剤がグルタルアルデヒドである場合、溶液の濃度は、通常約０.００１容量％〜２５容量％、好ましくは、約０．０１容量％〜１．０容量％である。
【００２９】
上記の方法により得られるコラーゲン繊維からなる不織布層はその物理的強度を向上させる目的で、バインダー処理を施してもよい。バインダー処理とは、不織布層に、（１）コラーゲンまたは（２）コラーゲンとヒアルロン酸との混合物の水溶液などを含浸させた後、自然乾燥、送風下乾燥、減圧乾燥、低温下乾燥などの適当な乾燥方法で乾燥を行い、不織布層の繊維同士を結合させる処理である。
このバインダー処理により得られる不織布層は、未処理の不織布層よりもはるかに物理的強度が向上し、従って縫合強度も格段に向上する。要求される物理的強度の程度により、この含浸・乾燥の工程を１回〜数１０回以上繰り返しても差し支えない。
【００３０】
ただし、バインダー処理を行う際には、コラーゲン繊維のみからなる、不織布層に架橋処理が施されていない場合、（１）コラーゲンまたは（２）コラーゲンとヒアルロン酸との混合物の水溶液等に含浸した時点で不織布層自身が溶解してしまう場合がある。従って、前述の方法等で、前もって架橋処理を施しておくのが望ましい。
なお、バインダー処理法としては、（１）コラーゲン水溶液または（２）コラーゲンとヒアルロン酸との混合物の水溶液に不織布層を含浸する方法の他に、適当な容器または型中に不織布層とともにコラーゲンまたはコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を流延または充填する方法や、不織布層にコラーゲン溶液またはコラーゲンとヒアルロン酸との混合物の溶液を直接塗布する方法もある。
【００３１】
本発明では、スポンジ層を利用したバインダー処理方法を用いてもよい。例えば、あらかじめスポンジ状に乾燥しておいたコラーゲン層で不織布層を挟んで得た膜状物、もしくは該スポンジ層と不織布層を同時に圧縮し、不織布層を該スポンジ層に埋入させた膜状物を、希薄なコラーゲンまたはその上記した塩基塩又は酸付加塩の溶液または水の存在下で、常圧もしくは減圧下に置くことにより、スポンジ層のコラーゲンを溶解させ、不織布層に溶液を十分に浸透させてから、各種乾燥法で乾燥させる方法等が用いられる。
このスポンジ層を利用したバインダー処理方法は、不織布層の繊維同士を結合させるために、実際に使用されるコラーゲン量に対して、水分などの溶媒成分が非常に少量で済む。従って後工程で乾燥を行う際に短時間で終了する上、乾燥時における収縮、変形などが非常に少ないという大きなメリットがある。また、通常の含浸工程では、含浸用コラーゲン溶液中の実質コラーゲン量は、実用的溶液粘度の関係から、数％程度が限界であり、残り９０％以上は水分等の溶媒成分となる。したがって、含浸・乾燥の操作に時間を要し、この操作自体を反復する必要があるが、操作が非常に簡便であるというメリットがある。無論、これらの方法は代表的な例示であり、不織布層または圧縮された不織布層の繊維同士をコラーゲンを用いて接合させる方法であれば、どのような方法でも良く、上記代表例には特に限定されない。また、バインダー処理には、上記コラーゲン水溶液の他、ヒアルロン酸溶液、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物の水溶液なども使用できる。
【００３２】
ついで上記方法により得られるコラーゲン繊維からなる不織布層に、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層を形成させる。該形成方法は常法に従い、凍結乾燥などの方法により容易に実施可能である。形成する製造工程上の順序・方法等については特に限定されない。具体的な製法としては、例えば、コラーゲン繊維からなる不織布層とコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状もしくはフィルム状の被覆層を積層するか、またはコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状の被覆層を独自に作製して、その後に、該被覆層およびコラーゲン繊維からなる不織布層とを、コラーゲン、ヒアルロン酸またはコラーゲンとヒアルロン酸との混合物の水溶液などを用いて接着する方法がある。また、コラーゲン繊維からなる不織布層を、コラーゲンの水溶液に浸漬させた後に一度凍結し、再度、同様にコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む水溶液に浸漬させ、これらを凍結して一体化した後に凍結乾燥することにより、同時にコラーゲン繊維からなる不織布層とコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層の２種の層を有する癒着防止膜を得る方法などがある。
【００３３】
また、容器中に充填したコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む溶液中にコラーゲン繊維からなる不織布層を浸漬させた後に、フリーザーで凍結し、さらに凍結乾燥してコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状の被覆層中にコラーゲン不織布が含有されている状態に成型することも可能である。しかし、これらは本発明の加工方法の一例を示したに過ぎず、これらの加工の目的はコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状の被覆層もしくはフィルム層とコラーゲン繊維からなる不織布層が生体内移植時に簡単に剥離・分離すること無く、一体化されることが目的であり、これが達成されるのであれば、どのような加工順序、方法を用いても構わない。
【００３４】
コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状の被覆層の作製については、コラーゲン溶液またはコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む水溶液を容器に流延、または所望の厚さとなるまで充填し、汎用フリーザー等で十分に凍結した後、凍結乾燥機で乾燥することにより、均一なスポンジ層が得られる。この時、コラーゲンとヒアルロン酸の混合物からなるスポンジ層に形成される微細な多孔の孔径は、コラーゲン溶液またはコラーゲンとヒアルロン酸の混合物からなる溶液の濃度とその溶媒、凍結時の温度と凍結時間などにより変化する。
【００３５】
コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状の被覆層における各種原料の総量およびスポンジ状の被覆層の厚さについては、対象となる部位の癒着防止効果、損傷・切断部位の修復、組織再生の誘導などにおける支障を来さないように、約１〜４週間程度、スポンジ層が体内で残存している程度が望ましい。このコラーゲンとヒアルロン酸の混合物からなるスポンジ状の被覆層の厚さ、およびスポンジ層の形成に使用される総原料量は、生体内に移植された場合の分解・吸収時間、組織再生の誘導への影響を考慮して、任意にコントロールすることが可能である。スポンジ層の厚さは各々、具体的には約５０μｍ〜２０ｍｍ、好ましくは１００〜１０００μｍであり、特に乾燥終了時の厚さが１〜１０ｍｍであり、これらを圧縮して使用する場合において、１００μｍ〜１ｍｍの厚さとなることが好ましい。これらの状況を考慮して、コラーゲン水溶液およびコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む溶液の濃度範囲は、０.１〜６０重量％、好ましくは０.５〜１０重量％であることが望ましい。また凍結温度は−２００〜−１０℃、好ましくは汎用のフリーザーまたはディープフリーザーで設定可能である−８０〜−１０℃であることが好ましい。また、凍結乾燥機は安定して乾燥が可能であれば特に限定はされない。
【００３６】
さらに、コラーゲン水溶液およびコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む水溶液の容器への充填量は、仕上がりスポンジの厚さが、約５０μｍ〜２０ｍｍ、好ましくは１０〜１０００μｍ程度になるように充填すれば良い。これらの値は、使用する目的に応じて随時変更が可能であり、これらの例示に限定されない。
【００３７】
癒着防止効果を発揮するコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層は、スポンジの形状のみには限定されず、例えば、通常の流延方式などにより得られるフィルム状などの形状に加工されていても良い。また、癒着防止効果を付与するためにコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層を形成する場合には、目的に応じて膜の片面または両面、あるいは一部分または全面被覆など様々な形態が選択可能であり、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層の形成方法、または、その部位については特に限定されるものでは無く、任意の組み合わせが可能である。
【００３８】
上記の各種架橋方法により、架橋処理を施される対象としては、膜を構成する不織布層、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層、およびこれらが一体化され積層化された癒着防止膜の一部または全部が対象となる。また、架橋の順序、架橋方法の組み合わせは任意であり、特に限定されない。しかし、最も好ましくは、コラーゲン繊維からなる不織布層においてグルタルアルデヒドなどのアルデヒト類を用いて架橋を施し、しかる後にコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層を形成し、これと一体化させ、最後に熱脱水架橋を施す。これらの方法においては、コラーゲンの紡糸、不織布化の工程において、エタノール等の凝固剤と、グルタルアルデヒドに代表される架橋剤類を混合し、紡糸と架橋の工程を一度に行う方法なども含まれる。
酸可溶化コラーゲンは、そのまま癒着防止膜の材料として生体に使用すれば、周囲の体液等を酸性化してしまう場合がある。これを避けるため、水溶液中で炭酸アルカリ金属（例、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、炭酸水素アルカリ金属（例、炭酸水素ナトリウム等）、水酸化アルカリ金属（例、水酸化ナトリウム等）などにより中和した塩として用いてもよい。また、アルカリ可溶化コラーゲンは、無機酸（例、希塩酸、希硝酸等）、有機酸（例、酢酸、クエン酸等）などにより中和した塩として用いてもよい（以下の場合も同様）。酸（希塩酸、希硝酸、酢酸等）で中和して用いてもよい。中性可溶化コラーゲンはそのまま用いてもよい。
【００３９】
本発明の癒着防止膜は、縫合強度、生体適合性、生体内分解・吸収性、組織再生の促進・誘導の点において優れた癒着防止膜である。コラーゲン繊維からなる不織布層において、バインダー処理を行う場合には、これにより形成される層をも熱脱水架橋することが良い。しかし、これはあくまでも一例であって、例えば、全ての層を熱脱水架橋により処理しても、何ら問題は無く、また、滅菌と架橋を兼ねて、例えばγ線を照射しても良い。
【００４０】
上記方法により得られる不織布層とコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層を有する癒着防止膜は、さらに圧縮成形することが可能である。コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層を単独で圧縮した後に、圧縮されていない不織布層と組み合わせて一体化しても良い。特に好ましくは、製膜の最終工程において不織布層とコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状の被覆層が一体化されているものを同時に圧縮することである。これは圧縮することにより膜厚が減少し、薄膜化されることで、手術現場において実際に癒着防止膜を使用する際に、縫合における縫合針の貫通性、任意の形状への切断等の取り扱いが特に向上し、移植手術等がより円滑に行える。圧縮の方法は汎用のプレス機で行うことが可能であるが、医療用途を目的とすることから、十分に丈夫な滅菌済みの包装材、例えばアルミパック、高強度樹脂包装材等により無菌的に包装された状態で圧縮されることが望ましい。また、癒着防止膜を圧縮する圧力に関しては、膜本体を破壊しない範囲において特に制限はされないが、通常、１０〜１０００ｋｇｆ/ｃｍ２程度であることが望ましい。
【００４１】
本発明の癒着防止膜は、生体適合性が良好であり、副作用がほとんどなく生体内で長期間安定に癒着防止効果を発揮し、しかも縫合可能であるため、例えば胸膜、心膜、脳硬膜、漿膜などの生体内膜状組織および各種臓器などの欠損部または切断面への補填、補綴用膜として用いられる。本発明の癒着防止膜は自体公知の方法により、人間や動物に安全に使用できる。
【００４２】
【実施例】
以下に実施例、実験例を示して本発明を詳細に説明する。
以下、本発明を実施例を用いて詳細に説明する。
本発明の実施例で使用するコラーゲンはアテロ化した酸可溶化コラーゲンであるブタ由来Ｉ型混合コラーゲン粉末（日本ハム株式会社製、SOFDタイプ、Lot No.0102226）を用い、ヒアルロン酸はヒルネート注キット（菱山製薬株式会社製）を用いた。
【００４３】
（実施例１） 癒着防止膜（２層状）の作製
（１）コラーゲン繊維からなる不織布層の作製
酸可溶化コラーゲン７重量％水溶液１５０ｍＬを９９.５容量％エタノール（和光純薬製、特級）３Ｌ凝固浴中に押し出し脱水凝固後、得られたコラーゲン糸を、特開２０００−９３４９７に記載の方法に従って積層させコラーゲン不織布を得た。次に、得られたコラーゲン不織布をクリーンベンチ内で風乾させた後に、そのままバキュームドライオーブン（EYELA社製：VOS-300VD型）中にて高真空下（１torr以下）、１２０℃、２４時間の条件で、熱脱水架橋反応を施した。
架橋反応終了後、架橋されたコラーゲン不織布の糸間の隙間を埋めるために、バインダー処理として、コラーゲン１重量％水溶液をコラーゲン不織布に塗り込んだあと、乾燥を行った。塗り込み操作と乾燥操作を３回繰り返すことによって、コラーゲン繊維からなる不織布層を得た。その後、バキュームドライオーブン（EYELA社製：VOS-300VD型）中にて高真空下（１torr以下）、１２０℃で１２時間加熱し、塗り込んだコラーゲンに熱脱水架橋反応を施した。架橋反応後、コラーゲン膜状物を０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に３０分間浸して中和処理を行った後、水酸化ナトリウム水溶液中から取出した。コラーゲン繊維からなる不織布層表面に残存した水酸化ナトリウムを蒸留水により洗浄し、クリーンベンチ内で風乾した。
【００４４】
（２）コラーゲンとヒアルロン酸の混合物を含むスポンジ状の被覆層
ヒアルロン酸１重量％水溶液と等量のコラーゲン１重量％水溶液を混合し、コラーゲンとヒアルロン酸との等量混合物２５０ｍＬを得た。酸性状態にある該混合物を０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、直方体状に空間を有する金属製の器（縦１１ｃｍ、横１１ｃｍ）の中に充填し、-２０℃で一夜凍結した。該凍結物を凍結乾燥機（EYELA社製：FDU-830型）にて減圧下（１torr以下）で約２４時間凍結乾燥して、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状の被覆層を得た。
【００４５】
（３） 上記（２）で得られたスポンジ状の被覆層を、圧縮機（井内盛栄堂社製：１５ｔプレス機）にて１００ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で圧縮した後、上記（１）で得られたコラーゲン繊維からなる不織布層の上に、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む溶液で接着した。このようにして、コラーゲン繊維からなる不織布層の一方の面にコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状の被覆層の２種類の層からなる積層構造を有する癒着防止膜を得た。その後、癒着防止膜のコラーゲンおよびヒアルロン酸を前述の架橋反応処理と同様にバキュームドライオーブン（EYELA社製：VOS-300VD型）中にて高真空下（１torr以下）、１１０℃で２４時間加熱し、熱脱水架橋反応を行った。このようにして、癒着防止層として外層にコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状の被覆層、内層に縫合固定に耐えうる強度を維持するためのコラーゲン繊維からなる不織布層の２種類の層を有する厚さ約２ｍｍの癒着防止膜を得た。
【００４６】
（実施例２） 癒着防止膜の作製
コラーゲン７重量％水溶液１５０ｍＬを９９.５容量％エタノール（和光純薬製、特級）凝固浴中に押し出して得られたコラーゲン糸を常法に従い、積層させてコラーゲン繊維からなる不織布層を得た。次に、この得られたコラーゲン繊維からなる不織布層をクリーンベンチ内で風乾させた後に、そのままバキュームドライオーブン（EYELA社製：VOS-300VD型）中にて高真空下（１torr以下）、１２０℃、２４時間の条件で熱脱水架橋反応を施した。架橋反応後、コラーゲン繊維からなる不織布層を０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に浸し中和処理を行った後、蒸留水により洗浄し、クリーンベンチ内で風乾した。洗浄後、乾燥した不織布層に対して、以下に示す溶液を塗り込んだ。
【００４７】
コラーゲン１重量％水溶液と等量のヒアルロン酸１重量％を混合し、コラーゲンとヒアルロン酸との等量混合物１５０ｍＬを得た。酸性状態にある該混合水溶液を０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、コラーゲン繊維からなる不織布層に塗り込んだ。その後乾燥させ、塗り込み・乾燥を３回繰り返すことによって、コラーゲン繊維からなる不織布層および外層にコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層を有する、癒着防止膜を得た。得られた癒着防止膜をコラーゲン繊維からなる不織布層と同様に熱脱水架橋処理を、バキュームドライオーブン（EYELA社製：VOS-300VD型）中にて高真空下（１torr以下）、１１０℃、１２時間の条件で施すことで、厚さ約１．５ｍｍの癒着防止膜を得た。
【００４８】
（実施例３） 癒着防止膜（２層状）の作製
実施例１と同様の手法を用いてコラーゲン繊維からなる不織布層および圧縮されたコラーゲンとヒアルロン酸の混合物を含むスポンジ状の被覆層１枚を各々作製した。コラーゲン繊維からなる不織布層の一方の面にコラーゲンとヒアルロン酸の混合物を含むスポンジ状の被覆層を実施例１と同様に接着し、熱脱水架橋処理をバキュームドライオーブン（EYELA社製：VOS-300VD型）中にて高真空下（１torr以下）、１１０℃、２４時間の条件で施した。このようにして、中心に縫合に耐えうる強度を担うコラーゲン繊維からなる不織布層、その一方の面に、癒着防止能を発揮するコラーゲンとヒアルロン酸の混合物を含むスポンジ状の被覆層を有した、合計２層構造からなる厚さ約２ｍｍの癒着防止膜を得た。
【００４９】
（実施例４） スポンジ作製と不織布への貼付
実施例１と同様にコラーゲン繊維からなる不織布層を作製した後、コラーゲン１重量％溶液とヒアルロン酸１重量％水溶液との等量混合物からなる水溶液２５０ｍＬ（溶液１）を調製し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中和処理した。次に、金属製の平板１１の上にコラーゲン繊維からなる不織布層１２を置き、その上に液漏れ防止用のポリフッ化エチレン系繊維ゴム製パッキン１３をのせて、上部に開口部１４１を有する形状の金属製の充填容器１４を被せ、しっかりと固定した（図１）。続いて充填容器１４（縦１５ｃｍ、横１５ｃｍ）の最上部の開口部１４１から充填容器１４中に溶液１を充填し、-２０℃で１２時間凍結した。該凍結物を凍結乾燥機（EYELA社製：FDU-830型）にて減圧下（１torr以下）で約２４時間凍結乾燥して、コラーゲン繊維からなる不織布層の上にコラーゲンとヒアルロン酸の混合物を含むスポンジ状の被覆層を有した２層構造物が得られた。
【００５０】
（実施例５） 癒着防止膜（３層状）の作製
（１）架橋反応後、コラーゲン繊維からなる不織布層を7.5%炭酸水素ナトリウム水溶液中に３０分浸して中和処理を行った後、炭酸水素ナトリウム水溶液中から取出し、コラーゲン繊維からなる不織布層表面に残存した炭酸水素ナトリウムを蒸留水により洗浄し、クリーンベンチ内で風乾する操作以外は、実施例１と同様にしてコラーゲン繊維からなる不織布層を得た。
（２）別途、実施例1と同様にしてコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むスポンジ状の被覆層を２枚作製した。
（３）次にコラーゲン繊維からなる不織布層の両面に該スポンジ状の被覆層を実施例１と同様の手法を用いて接着し、熱脱水架橋を施すことで、中心に縫合に耐えうる強度を担うコラーゲン繊維からなる不織布層、その両表面にに癒着防止能を発揮するコラーゲンとヒアルロン酸の混合物を含むスポンジ状の被覆層を有する合計３層構造からなる厚さ約３ｍｍの癒着防止膜を得た。
【００５１】
（実施例６） 癒着防止膜（３層状）の作製
（１）実施例５と同様にして、コラーゲン繊維からなる不織布層を作製した。
（２）別途、以下の手順でコラーゲンとヒアルロン酸の混合物を含むスポンジ状の被覆層を２枚作製した。
コラーゲン１重量％水溶液１２５ｍＬとヒアルロン酸１重量％水溶液１２５ｍＬを調製し、混合した後に１Ｎ ＨＮＯ３を用いてｐＨ１．５に調整した。混合物を−２０℃にて２４時間凍結し、室温にて融解することで、コラーゲンとヒアルロン酸の混合物からなるゲル状物を得た。得られたゲル状物をリン酸緩衝液中に３０分間浸して中和し、次に滅菌蒸留水中で洗浄を３０分間行い、洗浄を合計３回行った。中和されたゲル状物を実施例１と同様の手順にて凍結乾燥をすることで、コラーゲンとヒアルロン酸の混合物を含むスポンジ状の被覆層を得た。
【００５２】
（３）その他の操作は実施例１と同様にして行い、中心に縫合に耐えうる強度を担うコラーゲン繊維からなる不織布層、その両表面にに癒着防止能を発揮するコラーゲンとヒアルロン酸の混合物を含むスポンジ状の被覆層を有する合計３層構造からなる厚さ約３ｍｍの癒着防止膜を得た。
【００５３】
（実施例７） 癒着防止膜（３層状）の作製
（１）実施例５と同様にして、コラーゲン繊維からなる不織布層を作製した。
【００５４】
（２）別途、以下の手順でコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むフィルム状の被覆層を作製した。
ヒアルロン酸１重量％水溶液と等量のコラーゲン１重量％水溶液を混合し、ヒアルロン酸とコラーゲンとの等量混合物約１２５ｍＬを得た。酸性状態にある該混合物を０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で中和した後、上部に開口部を有する充填容器中に充填しクリーンベンチ内で風乾することで、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むフィルム状の被覆層を２枚作製した。
【００５５】
（３）上記（２）で得られたコラーゲンとヒアルロン酸の混合物を含むフィルム状の被覆層を上記（１）で得られたコラーゲン線維からなる不織布層の両面に、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む溶液で接着した。その後、癒着防止膜のコラーゲンとヒアルロン酸を前述の架橋反応処理と同様にバキュームドライオーブン（EYELA社製：VOS-300VD型）中にて高真空下（１torr以下）、１１０℃で２４時間加熱し、熱脱水架橋反応を行った。このようにして、癒着防止層として外層にコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含むフィルム状の被覆層、中心層に縫合固定に耐えうる強度を維持するためのコラーゲン繊維からなる不織布層の２種類の層を有する厚さ約３ｍｍの３層積層構造からなる癒着防止膜を得た。
【００５６】
（実験例１） 耐分解性試験
試料１〜３としてコラーゲンとヒアルロン酸の混合比を変えた（３：７、５：５、７：３）スポンジ状の被覆層を有する癒着防止膜を実施例１と同様に作製した。試料は１ｃｍ×１ｃｍ平方に切断して試験に使用した。比較試料としてヒアルロン酸からなるスポンジ状の被覆層を有する癒着防止膜を作製し、試料１〜３同様に切断して試験に使用した。各々の試料にはバキュームドライオーブン（EYELA社製：VOS-300VD型）中にて高真空下（１torr以下）、１１０℃、２４時間の条件で、熱脱水架橋を施した。各試料を注射用蒸留水１０ｍＬ中で３７℃恒温漕にて定温保存し、経時的変化を３０分、２４時間、３日後の３点で被覆層の面積を測定し、その減少率により分解の度合いを観察し、耐分解性を表１に示す評価基準によって評価した。評価結果を表２に示す。
【００５７】
【表１】
耐分解性スコアリング
【表２】
耐分解性試験
表２から明らかなように、比較試料（ヒアルロン酸単独）は１日後には完全溶解していた。実際には３０分〜１時間以内に完全溶解してしまった。また、ヒアルロン酸の比率が高い試料３は、３日後には完全分解していた。試料１、２は３日後にもその形状を維持しつつ残存している事が観察された。また、３日後の試料２については用手的に調べたところ、ヒアルロン酸特有の粘性が保持されていることが確認できた。このことから、ヒアルロン酸とコラーゲンを混合することで、飛躍的に耐分解性が向上することが確認された。
【００６０】
（実験例２） 埋植試験
実施例１で得られた癒着防止膜を、ウサギ（ｎ＝8）の背部筋肉内に埋植して、その組織反応を肉眼と光学顕微鏡により観察し、生体適合性を評価した。埋植試料は、実施例１で得られた癒着防止膜を１.５ｍｍ×１０ｍｍの大きさに切断して使用した。また、比較試料としては、高密度ポリエチレンプレートを試料と同じ大きさに切断して使用した。なお、比較試料はEOG滅菌を行って使用した。試料膜は２５ｋＧｙのγ線を照射して滅菌した後に埋植試験に使用した。埋植はまず、ウサギ（体重約２.５ｋｇ〜３.０ｋｇ）に通常の吸入麻酔を行い、次に無菌的にウサギ背部脊髄を挟んで左に比較試料、右に間隔を置いて、試料二種類を各々埋植した。埋植方法は、滅菌した１５ゲージの注射針を用いて皮膚表面に対して約３０゜の角度より刺入して、注射針内に充填しておいた試料膜および比較試料を押し出して、ウサギ筋肉内に埋植した。この後、埋植１週間後の４羽、さらに４週間後に４羽を観察対象として使用した。各観察時間において、ウサギ４羽のうち２羽については、麻酔下で試料埋植部位を切開し、埋植部分と周辺組織の観察を炎症反応等を中心に目視による観察を行った。
【００６１】
これらの観察結果より、いずれの観察時間において、また、全てのウサギにおいて、試料膜は比較試料に対して顕著な炎症反応等を示さず、本発明により得られる癒着防止膜の生体適合性が良好であることが分かった。なお、埋植後４週間経過した場合においては、試料膜の一部が分解・吸収されていることが見受けられた。
【００６２】
（実験例３） 癒着防止作用試験
実施例１により得られた、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物からなるスポンジ状の被覆層を有する癒着防止膜（以下試料１）を、ウサギ（ｎ＝８）の腹壁欠損部（１ｃｍ角）および腸漿膜をメスで剥離した部分に埋植・縫合固定した。埋植後１週間後、６週間後に開腹して癒着防止膜の残存量から耐分解性、癒着の程度から癒着防止効果を観察した。この時、欠損部のみの箇所（以下比較１）、ヒアルロン酸スポンジからなる被覆層を有する癒着防止膜（以下比較２）を比較試料として比較評価を行った。
【００６３】
試料１と比較１，２を比較した結果、１週間後における残存量に関しては、試料１では被覆層が残存していたが、比較２ではヒアルロン酸からなる被覆層は全て分解・吸収されてしまっていた。６週間後では、試料１に関しても被覆層だけでなく癒着防止膜自体が分解・吸収されていた。このことからも、コラーゲンとヒアルロン酸を混合することで耐分解性が向上したことが判明した。すなわち、癒着防止効果の持続性が向上することは明らかである。
【００６４】
また癒着防止効果については、表３に示す判断基準に基づき評価を行った。評価基準を表４に示す。
【００６５】
【表３】
癒着の程度判別基準
【表４】
癒着防止効果の評価結果
表４から明らかなように、６週間後において試料１では癒着を認めた例が無かったのに対して、比較１は等級４以上、比較２では等級３以上の癒着を認めた。以上より、本発明の癒着防止膜が有効な癒着防止効果を有し、かつ高い耐分解性を有することが明らかとなった。
以上のことから、本発明の癒着防止膜はその表面にコラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む被覆層を有することにより、癒着防止効果、耐分解性において優れることは明白である。
【００６８】
【本発明の効果】
本発明の癒着防止膜は、縫合強度、生体適合性、癒着防止性能を合わせ持つ。特に、コラーゲンとヒアルロン酸との混合物を含む癒着防止層は高い耐分解性を有し、癒着防止効果の継続時間を飛躍的に延ばすものである。よって、手術などにおける生体内の損傷部位もしくは出血部位、またはそれらと正常部位との癒着を防止することができる縫合可能な人工生体膜として非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例４の説明図である。
【符号の説明】
１． 平板
２． コラーゲン繊維からなる不織布層
３． パッキン
４． 充填容器
４１．開口部[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a collagen-containing adhesion-preventing membrane. The adhesion-preventing membrane of the present invention has good biocompatibility, exhibits an anti-adhesion effect stably in the living body for a long period of time, and can be sutured. For example, living bodies such as the pleura, pericardium, brain dura mater, and serosa It is used as a membrane for prosthesis or filling of a defect or cut surface of an intima-like tissue and various organs.
[0002]
[Prior art]
In various types of surgery, the affected area is often removed and the damaged area is repaired, especially when the various organs such as the lung, heart, liver, brain, digestive organs, and gallbladder are targeted. If a surface or a defect is not supplemented or prosthetic with a membrane covering the organ tissue, the fundamental function of the organ is often impaired. If these treatments are incomplete, the prognosis tends to be very poor, even if they die due to organ dysfunction or escape a life crisis. Moreover, if the prosthesis and the suture fixation at the filling site are inferior, even if the function of the treated organ itself can be barely maintained, body fluid, digestive fluid, contents, etc. exuded or leaked from these organs, etc. May cause infection, attack other organs, and cause erosion.
[0003]
Furthermore, there are cases in which adhesion between these prosthetic or filled membranes and organs occurs frequently, and as a result, organ dysfunction may be induced over time. For the purpose of solving such various problems, membranes or adhesion-preventing membranes covering an organ or a tissue of the organ have been developed using various materials.
[0004]
The simplest and most effective method for preventing adhesions is to prevent the tissue damaged by damage or defect from contacting another tissue that can physically contact this tissue with a septum. . However, when this is performed with synthetic fibers or the like, various inconveniences such as excessive calcification, foreign body reaction, and inflammatory reaction occur due to insufficient biocompatibility. Further, even when a biocompatible material is used as the partition wall, the material itself must not mediate adhesion between a damaged or missing tissue and a corresponding other tissue. Examples of satisfying these conditions include hyaluronic acid and gelatin. Both can be handled as viscous water-soluble liquids and can be used as gels by various processing methods.
[0005]
Since these materials are mainly extracted and purified from living organisms such as animals, they have good biocompatibility and have already been put into practical use in various medical fields including pharmaceuticals.
For example, anti-adhesion membranes and medical materials using hyaluronic acid are disclosed in Patent Document 1,
[0006]
[Prior art documents]
[Patent Document 1]
JP-A-6-73103
[Patent Document 2]
Japanese Patent Publication No. 7-30124
[Patent Document 3]
Japanese Patent No. 2670996
[Patent Document 4]
JP-A-8-333402
[Patent Document 5]
JP 61-234864 A
[Patent Document 6]
Japanese Patent No. 2648308
[Patent Document 7]
JP-A-8-157378
[Patent Document 8]
Japanese Patent Laid-Open No. 9-296005
[Patent Document 9]
Japanese Patent Laid-Open No. 7-102002
[Patent Document 10]
JP 7-509386
[0007]
Patent Document 11 describes a medical collagen membrane in which at least one surface of a non-woven fabric layer made of cross-linked collagen fibers is covered with a collagen film as a membrane improved from a medical membrane using only animal-derived collagen. . Patent Document 12 describes a technique in which gelatin or hyaluronic acid alone is used as an anti-adhesion film on a non-woven fabric of collagen fibers.
[0008]
[Patent Document 11]
JP 2000-93497 A
[Patent Document 12]
JP 2000-271207 A
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, the above-described techniques are not fully satisfactory in terms of biocompatibility, biodegradability / absorbability, physical / mechanical strength, ease of handling, long-term adhesion prevention effect, and the like. There is a need for an improved medical material that exhibits sufficient anti-adhesion effects over a long period of time, has few side effects, has good biocompatibility, biodegradability and absorbability, and simultaneously satisfies the mechanical strength that allows suture fixation. It has been.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various earnest studies to solve the above problems, the present inventors have significantly improved resistance by providing a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid on the surface of the nonwoven fabric layer made of collagen fibers. The present inventors have found that an anti-adhesion layer having improved degradability can be constructed, and that an anti-adhesion film that maintains the anti-adhesion effect for a long period of time can be obtained, and the present invention has been achieved.
[0011]
That is, the present invention
(1) an anti-adhesion membrane having a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid on the surface of a nonwoven fabric layer made of collagen fibers;
(2) The adhesion-preventing membrane according to 1 above, wherein the coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid is in the form of a sponge or a film,
(3) The adhesion-preventing membrane according to 1 above, wherein the coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid is a layer formed by subjecting a mixture of collagen and hyaluronic acid to a crosslinking reaction,
(4) The adhesion-preventing membrane according to 1 above, wherein the coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid has a thickness of about 50 μm to 20 mm,
(5) The adhesion-preventing membrane according to 1 above, wherein the collagen constituting the adhesion-preventing membrane is enzyme-solubilized collagen, acid-solubilized collagen, alkali-solubilized collagen or neutral-solubilized collagen.
(6) The adhesion-preventing membrane according to the above 1, which is a collagen in which part or all of the collagen constituting the adhesion-preventing membrane is crosslinked.
(7) The anti-adhesion membrane according to 1 above, wherein the non-woven fabric layer comprising collagen fibers is a non-woven fabric layer in which collagen fibers are joined to each other by (1) collagen or (2) a mixture of collagen and hyaluronic acid.
(8) The adhesion-preventing membrane according to 1 above, wherein the nonwoven fabric layer comprising collagen fibers has a thickness of about 50 μm to 10 mm, and the coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid has a thickness of about 50 μm to 20 mm.
(9) The anti-adhesion film according to 1 above, wherein the nonwoven fabric layer made of collagen fibers is formed by laminating 1 to 6 nonwoven fabrics made of collagen fibers.
(10) The diameter of the collagen fibers is about 10 to 1,000 μm, and the bulk density of the nonwoven fabric layer made of collagen fibers is about 5 × 10. -4 ~ 50g / cm 3 The adhesion-preventing film according to 1 above,
(11) The adhesion-preventing membrane according to 1 above, wherein the entire membrane has a thickness of about 100 μm to 30 mm.
About.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, the non-woven fabric layer made of collagen fibers is a structure having a secondary or tertiary structure made of collagen fibers, and part or all of the collagen fiber voids are filled with gas, liquid, solid or the like. Alternatively, part or all of the outer peripheral surface of the collagen fiber may be covered with a solid or liquid. The collagen fibers may be joined to each other with a binder such as (1) collagen or (2) a mixture of collagen and hyaluronic acid.
Moreover, the collagen which comprises a collagen fiber may be partially or wholly crosslinked. Collagen in collagen fibers or a mixture of collagen and hyaluronic acid, when using acid-solubilized collagen, alkali metals (eg, sodium, potassium, etc.), alkaline earth metals (eg, magnesium, calcium) Etc.), and when alkali-solubilized collagen is used, it is used as a salt with an inorganic acid (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, etc.) or an organic acid (eg, acetic acid, citric acid, etc.). May be. Hyaluronic acid may be used as a salt of an alkali metal (eg, sodium, potassium, etc.), an alkaline earth metal (eg, magnesium, calcium, etc.), etc.
[0013]
The diameter of the collagen fiber is usually about 10 to 1,000 μm, preferably about 20 to 250 μm. The nonwoven fabric layer made of collagen fibers is usually a laminate of 1 to 6, preferably 2 to 4 collagen nonwoven fabrics.
The bulk density of the nonwoven fabric layer made of collagen fibers is usually about 5 × 10 -4 ~ 50g / cm 3 , Preferably about 0.05 to 50 g / cm 3 It is. The thickness is usually about 50 μm to 10 mm, preferably about 0.2 to 2 mm.
[0014]
The coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid is a layered product containing collagen and hyaluronic acid and usually having a sponge-like or film-like form. The mixture of collagen and hyaluronic acid may be used as a salt of an alkali metal (eg, sodium, potassium, etc.), an alkaline earth metal (eg, magnesium, calcium, etc.) or the like when an acid-solubilized collagen is used. When solubilized collagen is used, it may be used as a salt with an inorganic acid (eg, hydrochloric acid, nitric acid, etc.) or an organic acid (eg, acetic acid, citric acid, etc.).
The mixing ratio (weight ratio) of collagen and hyaluronic acid is in the range of about 1: 100 to about 100: 1, preferably in the range of about 3: 7 to about 7: 3, more preferably about 1: 1. It is. A mixture of collagen and hyaluronic acid may be subjected to a crosslinking reaction treatment. In order to bond a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid and a nonwoven fabric layer made of collagen fibers, an adhesive surface of the coating layer and the nonwoven fabric layer is coated with collagen, hyaluronic acid, an aqueous solution containing a mixture of collagen and hyaluronic acid, or the like. You may apply to. The thickness of the coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid is usually about 50 μm to 20 mm, preferably about 0.1 to 1 mm. This coating layer may be laminated | stacked on either the single side | surface or both surfaces of the nonwoven fabric layer which consists of collagen fibers.
[0015]
The anti-adhesion membrane of the present invention has a laminated structure in which a nonwoven fabric layer made of collagen fibers and a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid are laminated. The total thickness of the adhesion-preventing membrane of the present invention is usually about 100 μm to 30 mm, preferably about 0.5 to 8 mm.
The anti-adhesion membrane of the present invention is a non-woven fabric layer mainly composed of collagen fibers with sufficient suturable membrane strength, and is a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid for biocompatibility and anti-adhesion effects with surrounding tissues Is demonstrated.
[0016]
The anti-adhesion membrane of the present invention is not only excellent in biocompatibility because collagen and hyaluronic acid are bio-derived materials, but gradually decomposed and absorbed in the transplanted living body, and finally all It will be decomposed and absorbed. In particular, a non-woven fabric layer made of collagen fibers exists as a scaffold for filling, prosthesis, and sealing until tissue regeneration of a defect site in a living body is completed, and after maintaining its membrane strength for a certain period of time for suture fixation, Decomposed and absorbed. Moreover, the coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid in the outermost layer prevents adhesion between the tissue at the site of damage or defect and the surrounding tissue due to its viscosity and sustained release action. Note that this adhesion prevention period lasts until the tissue at the damaged or defective site is regenerated and healed to such an extent that adhesion with surrounding tissues does not occur in the natural state. While exhibiting these anti-adhesion effects, it is gradually decomposed and absorbed in the body, and eventually the coating layer containing a mixture of these collagen and hyaluronic acid also disappears.
[0017]
The method for producing the adhesion-preventing membrane of the present invention will be described below.
Typical collagen raw materials used in the present invention include, for example, enzyme-solubilized collagen, acid-solubilized collagen, alkali-solubilized collagen, or neutral-solubilized collagen. These solubilized collagens are collagens that have been treated so that they can be dissolved in a solvent. Examples thereof include solubilized collagen such as acid-solubilized collagen, alkali-solubilized collagen, enzyme-solubilized collagen, and neutral-solubilized collagen. In particular, atelocollagen, which has been subjected to the removal treatment of telopeptide, which is an antigenic determinant of collagen, at the same time as the solubilization treatment, is preferred. Methods for solubilizing these collagens are described in Japanese Patent Publication No. 46-15003, Japanese Patent Publication No. 43-259839, Japanese Patent Publication No. 43-27513, and the like. The origin of collagen is extracted from the skin, tendon, bone, cartilage, organ, etc. of animal species such as cattle, pigs, birds, fish, rabbits, sheep, mice and humans. The type of collagen is not limited to any type that can be classified, such as type I and type III, but type I is particularly preferred from the viewpoint of handling.
[0018]
When acid-solubilized collagen is used, the collagen is solidified and then alkali metal carbonate (eg, sodium carbonate, potassium carbonate, etc.), alkali metal hydrogen carbonate (eg, sodium bicarbonate), alkali metal hydroxide (eg, water) It may be used as a salt neutralized with sodium oxide or the like. In addition, when using alkali-solubilized collagen, the collagen is solidified and then used as a salt neutralized with an inorganic acid (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, etc.) or an organic acid (eg, acetic acid, citric acid, etc.) in water. (Also in the following cases).
[0019]
Hyaluronic acid may be of animal origin or microorganism origin, but medical grade is particularly preferred. Hyaluronic acid may be used as a salt of an alkali metal (eg, sodium, potassium, etc.).
The solvent for solubilizing collagen is not particularly limited as long as it is a solvent that can solubilize collagen. Preferably, water, an aqueous solution of a neutral salt (eg, sodium chloride, sodium hydrogenphosphate, etc.), dilute Mineral acids (eg, dilute hydrochloric acid, dilute nitric acid, etc.) and hydrophilic organic solvents (eg, monovalent or polyhydric alcohols such as ethyl alcohol and ethylene glycol) may be included. Water is suitable for handling.
[0020]
A non-woven fabric made of collagen fibers is suitably produced by continuously spinning from a collagen aqueous solution according to a conventional method (for example, the method described in JP-A-2000-93497) to obtain a collagen yarn and processing it into a non-woven fabric.
The concentration of the aqueous collagen solution used in the present invention is arbitrary depending on the type of collagen used, and may be any concentration as long as it can be spun. Usually, about 0.1 wt% to 20 wt%, In wet spinning, about 1 to 10% by weight is particularly suitable. Moreover, the discharge speed of the collagen at the time of spinning is arbitrary as long as it can be spun.
[0021]
Any device such as a general-purpose gear pump, dispenser, or various extrusion devices can be used for spinning the collagen solution during spinning. However, to perform uniform spinning, the collagen solution is quantified stably with little pulsation. A device capable of discharging is good.
Also, the diameter of the hole diameter of the die at the time of spinning is not particularly limited as long as spinning is possible. However, if the hole diameter is too large, it becomes difficult to change the fibrous material into a film-like material by the binder treatment, and it is extremely fine. Since it is difficult to improve the film strength when the diameter is used, a range of about 10 μm to 1000 μm, preferably about 50 μm to 700 μm is usually used. Furthermore, the number of holes in the die may be single or plural. The shape of the die is not particularly limited, and for example, a slit shape or various shapes may be used as long as spinning is possible. Furthermore, the hole length of the die is not particularly limited as long as it can be spun, but it is preferably as long as possible for the purpose of orienting as many collagen molecules as possible in the solubilized collagen molecule.
[0022]
The coagulation bath used in wet spinning is not particularly limited as long as it is a solvent, suspension, emulsion or solution capable of coagulating collagen, but inorganic salt aqueous solution, inorganic salt-containing organic solvent, alcohols , Ketones or any combination thereof. As the inorganic salt aqueous solution, an aqueous solution such as sodium sulfate, sodium chloride, ammonium sulfate, calcium chloride, and magnesium chloride, particularly an aqueous solution such as sodium chloride, sodium sulfate, and ammonium sulfate is preferable. An inorganic salt-containing organic solvent in which these inorganic salts are dissolved / dispersed in alcohol or acetone may be used. In this case, an ethanol-dissolved / dispersed solution of sodium chloride is particularly preferable. Examples of the alcohols include alcohols having 1 to 6 carbon atoms such as methanol, ethanol, isopropanol, amyl alcohol, pentanol and hexanol, and glycols such as ethylene glycol, preferably ethanol. Examples of ketones include acetone and methyl ethyl ketone.
[0023]
The coagulation bath is effective not only for the coagulation of collagen, but also a processing method capable of simultaneously coagulating and cross-linking collagen by combining with various cross-linking agents described later. For example, when a solution in which ethanol and glutaraldehyde are mixed is used as a coagulation bath having both a coagulation treatment and a cross-linking treatment, both steps can be performed at once, and the spun collagen yarn is cross-linked as it is. These simultaneous treatments are not only rationalized in the process, but are very effective when spinning with dilute collagen solution or spinning thin yarns.
[0024]
In the above method for forming a nonwoven fabric layer, a particularly preferred specific example will be described below. Collagen discharge nozzle has a hole diameter of about φ200μm and a hole length of about 15-20mm. Collagen solution can be discharged without pulsation with a dispenser, etc. and wet-spun into about 99.5% by volume ethanol coagulation bath. desirable. When extruding collagen into an ethanol coagulation bath of about 99.5% by volume, the discharge nozzle is moved as needed to continuously extrude the spun yarn in a state where it can cross from any direction, and the yarn is in a multi-layer state. Then, the coagulating liquid is removed, washed again with ethanol, and dried under reduced pressure, whereby a very good cotton-like fibrous material can be easily obtained. This method is particularly effective in terms of simplification, shortening, and economical efficiency of the process because spinning and non-woven fabric can be carried out simultaneously.
[0025]
This example is representative and is not limited to this as long as a fibrous material can be obtained. For example, the above-described collagen fiber staple may be used, and the type of coagulation bath, coagulation bath The use of a mixed bath of a crosslinking agent and a drying method may be changed, and the combination thereof may be changed.
[0026]
On the other hand, by cutting discontinuous spinning by intermittent discharge from a collagen aqueous solution, or by cutting the yarn obtained after normal continuous spinning, a short staple-like fibrous material can be obtained in both continuous and discontinuous spinning. can get. It is also possible to produce a non-woven fabric (fibrous material) that is dried by a method such as reduced pressure drying or natural drying in a state where these are uniformly dispersed in a container of an appropriate size.
[0027]
The nonwoven fabric obtained by the above method may be further subjected to a crosslinking treatment as necessary in order to obtain a sufficient stitching strength. This cross-linking treatment improves the physical strength, particularly when wet, and can sufficiently secure the strength necessary for suturing. Moreover, it is also for delaying the time decomposed | disassembled and absorbed when transplanted in the living body drastically compared with the case of non-bridge | crosslinking. This cross-linking treatment compensates or prosthetics the defective part of the living body, prevents organ / tissue dysfunction due to the defect, and the membrane strength required in the body until the wound surface repair and tissue regeneration are completed It is possible to remain while maintaining.
[0028]
This crosslinking method is roughly classified into a physical crosslinking method and a chemical crosslinking method. Examples of the physical crosslinking treatment include γ-ray irradiation, ultraviolet irradiation, electron beam irradiation, plasma irradiation, and thermal dehydration crosslinking treatment. Of these, thermal dehydration crosslinking is preferred. In the thermal dehydration cross-linking treatment, the cross-linking treatment is physically performed by heat treatment under reduced pressure in a state where the collagen single yarn is wound. In this crosslinking treatment, biocompatibility and decomposition absorbability can be controlled by the crosslinking temperature and crosslinking time. Physical cross-linking and chemical cross-linking may be performed independently or in combination, and the order of the cross-linking is not particularly limited.
As the crosslinking agent used for the chemical crosslinking reaction, any crosslinking agent can be used as long as the crosslinking reaction with collagen is possible, and examples thereof include aldehydes, epoxies, carbodiimides, isocyanates and the like. Examples of aldehydes include formaldehyde, glutaraldehyde, glyoxal and dialdehyde starch, examples of epoxies include glycerol diglycidyl ether, examples of carbodiimides include water-soluble carbodiimide, and examples of isocyanates include hexamethylene diisocyanate. Glutaraldehyde is preferred. The collagen single yarn is usually crosslinked by immersing the collagen single yarn in a solution of a crosslinking agent. The solvent for the crosslinking agent solution is not particularly limited, but water, ethanol, and the like are preferable, and ethanol is particularly optimal. It is possible to control the degradation absorbability and biocompatibility by the concentration of the crosslinking agent solution and the immersion time. When the cross-linking agent is glutaraldehyde, the concentration of the solution is usually about 0.001% to 25% by volume, preferably about 0.01% to 1.0% by volume.
[0029]
The nonwoven fabric layer made of collagen fibers obtained by the above method may be subjected to a binder treatment for the purpose of improving its physical strength. The binder treatment means that the nonwoven fabric layer is impregnated with an aqueous solution of (1) collagen or (2) a mixture of collagen and hyaluronic acid, and then subjected to appropriate drying such as natural drying, drying under blowing, drying under reduced pressure, drying at low temperature, etc. It is the process which bonds the fibers of a nonwoven fabric layer by drying with a drying method.
The nonwoven fabric layer obtained by this binder treatment has a much improved physical strength than the untreated nonwoven fabric layer, and therefore the suture strength is also greatly improved. Depending on the degree of physical strength required, this impregnation and drying process may be repeated once to several tens of times or more.
[0030]
However, when the binder treatment is performed, when the nonwoven fabric layer made of only collagen fibers is not subjected to a crosslinking treatment, (1) when impregnated with an aqueous solution of collagen or (2) a mixture of collagen and hyaluronic acid The nonwoven fabric layer itself may be dissolved. Therefore, it is desirable to perform a crosslinking treatment in advance by the above-described method or the like.
In addition to the method of impregnating the nonwoven fabric layer with an aqueous solution of collagen (2) or a mixture of collagen and hyaluronic acid, the binder treatment method includes collagen or collagen together with the nonwoven fabric layer in an appropriate container or mold. There are also a method of casting or filling a mixture of hyaluronic acid and a method of directly applying a collagen solution or a mixture of collagen and hyaluronic acid to the nonwoven fabric layer.
[0031]
In the present invention, a binder treatment method using a sponge layer may be used. For example, a membrane-like material obtained by sandwiching a nonwoven fabric layer with a collagen layer previously dried in a sponge shape, or a membrane-like shape in which the sponge layer and the nonwoven fabric layer are compressed at the same time, and the nonwoven fabric layer is embedded in the sponge layer The product is placed under normal pressure or reduced pressure in the presence of dilute collagen or a solution of the above-mentioned base salt or acid addition salt or water to dissolve the collagen in the sponge layer, and the solution is sufficiently applied to the nonwoven fabric layer. After infiltrating, a method of drying by various drying methods is used.
In the binder treatment method using the sponge layer, since the fibers of the nonwoven fabric layer are bonded to each other, a very small amount of a solvent component such as moisture is sufficient with respect to the amount of collagen actually used. Therefore, there is a great merit that the drying is completed in a short time in the subsequent process and the shrinkage and deformation at the time of drying are very small. In the normal impregnation step, the amount of substantial collagen in the collagen solution for impregnation is about several percent due to the practical solution viscosity, and the remaining 90% or more is a solvent component such as moisture. Therefore, it takes time for the impregnation and drying operations, and it is necessary to repeat this operation itself, but there is an advantage that the operation is very simple. Of course, these methods are representative examples, and any method may be used as long as the fibers of the nonwoven fabric layer or the compressed nonwoven fabric layer are joined together using collagen, and the above representative examples are particularly limited. Not. In addition to the collagen aqueous solution described above, a hyaluronic acid solution, an aqueous solution of a mixture of collagen and hyaluronic acid, or the like can be used for the binder treatment.
[0032]
Next, a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid is formed on the nonwoven fabric layer made of collagen fibers obtained by the above method. The formation method can be easily carried out by a method such as freeze-drying according to a conventional method. There are no particular limitations on the order, method, and the like in the manufacturing process to be formed. As a specific production method, for example, a non-woven fabric layer made of collagen fibers and a sponge-like or film-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid are laminated, or a sponge-like shape containing a mixture of collagen and hyaluronic acid There is a method in which the coating layer is independently produced, and then the coating layer and the nonwoven fabric layer made of collagen fibers are bonded using an aqueous solution of collagen, hyaluronic acid, or a mixture of collagen and hyaluronic acid. In addition, a nonwoven fabric layer made of collagen fibers is frozen once after being immersed in an aqueous solution of collagen, and is again immersed in an aqueous solution containing a mixture of collagen and hyaluronic acid in the same manner. There is a method of obtaining an adhesion-preventing film having two layers of a nonwoven fabric layer made of collagen fibers and a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid at the same time by drying.
[0033]
In addition, after immersing the non-woven fabric layer made of collagen fibers in a solution containing a mixture of collagen and hyaluronic acid filled in a container, freeze with a freezer and freeze-dry to contain a mixture of collagen and hyaluronic acid It is also possible to mold in a state where a collagen nonwoven fabric is contained in a sponge-like coating layer. However, these are merely examples of the processing method of the present invention, and the purpose of these processing is to produce a sponge-like coating layer or film layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid and a nonwoven fabric layer composed of collagen fibers. The purpose is to be integrated without being easily separated and separated at the time of implantation in the body, and any processing order and method may be used as long as this is achieved.
[0034]
For preparation of a sponge-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid, a general-purpose freezer is prepared by casting a collagen solution or an aqueous solution containing a mixture of collagen and hyaluronic acid into a container or filling it to a desired thickness. After sufficiently freezing with, for example, a uniform sponge layer is obtained by drying with a freeze dryer. At this time, the fine pore size formed in the sponge layer made of a mixture of collagen and hyaluronic acid is the concentration of the collagen solution or the solution made of a mixture of collagen and hyaluronic acid, its solvent, temperature and freezing time at freezing, etc. It depends on.
[0035]
Regarding the total amount of various raw materials and the thickness of the sponge-like coating layer in the sponge-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid, the effect of preventing adhesion at the target site, repair of damaged / cut sites, tissue regeneration It is desirable that the sponge layer remains in the body for about 1 to 4 weeks so as not to hinder the induction. The thickness of the sponge-like coating layer made of a mixture of collagen and hyaluronic acid, and the total amount of raw materials used for the formation of the sponge layer will lead to the induction of degradation / absorption time and tissue regeneration when implanted in vivo. It is possible to control arbitrarily in consideration of the influence of Each of the thicknesses of the sponge layers is specifically about 50 μm to 20 mm, preferably 100 to 1000 μm. Especially, the thickness at the end of drying is 1 to 10 mm. When these are used after being compressed, 100 μm It is preferable that the thickness is ˜1 mm. In consideration of these situations, the concentration range of the aqueous solution of collagen and the solution containing a mixture of collagen and hyaluronic acid is desirably 0.1 to 60% by weight, preferably 0.5 to 10% by weight. The freezing temperature is −200 to −10 ° C., preferably −80 to −10 ° C., which can be set with a general-purpose freezer or deep freezer. The freeze dryer is not particularly limited as long as it can be stably dried.
[0036]
Furthermore, the filling amount of the aqueous collagen solution and the aqueous solution containing a mixture of collagen and hyaluronic acid may be such that the finished sponge has a thickness of about 50 μm to 20 mm, preferably about 10 to 1000 μm. These values can be changed at any time according to the purpose of use, and are not limited to these examples.
[0037]
The coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid that exhibits an anti-adhesion effect is not limited to the shape of a sponge. For example, it is processed into a film shape obtained by a normal casting method or the like. Also good. In addition, when forming a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid to give an adhesion prevention effect, various forms such as one side or both sides, or part or whole surface of the membrane can be selected according to the purpose. The method for forming a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid, or the site thereof, is not particularly limited, and any combination is possible.
[0038]
The target to be subjected to the crosslinking treatment by the above various crosslinking methods includes a nonwoven fabric layer constituting the membrane, a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid, and an adhesion preventing membrane in which these are integrated and laminated. Some or all of them are eligible. The order of crosslinking and the combination of crosslinking methods are arbitrary and are not particularly limited. However, most preferably, a non-woven fabric layer made of collagen fibers is crosslinked using aldehydes such as glutaraldehyde, and then a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid is formed and integrated therewith. Is subjected to thermal dehydration crosslinking. These methods include a method of mixing a coagulant such as ethanol and a cross-linking agent typified by glutaraldehyde in the step of spinning or forming a non-woven fabric, and performing the step of spinning and cross-linking at once. .
If acid-solubilized collagen is used as it is as a material for an adhesion-preventing membrane, it may acidify surrounding body fluids. In order to avoid this, in an aqueous solution, alkali metal carbonate (eg, sodium carbonate, potassium carbonate, etc.), hydrogen carbonate alkali metal (eg, sodium hydrogen carbonate, etc.), alkali metal hydroxide (eg, sodium hydroxide, etc.), etc. It may be used as a hydrated salt. The alkali-solubilized collagen may be used as a salt neutralized with an inorganic acid (eg, dilute hydrochloric acid, dilute nitric acid, etc.), an organic acid (eg, acetic acid, citric acid, etc.) (the same applies in the following cases). You may neutralize and use with acids (dilute hydrochloric acid, dilute nitric acid, acetic acid, etc.). Neutral solubilized collagen may be used as it is.
[0039]
The anti-adhesion membrane of the present invention is an anti-adhesion membrane excellent in terms of suture strength, biocompatibility, biodegradability / absorbability, and promotion / induction of tissue regeneration. When a binder treatment is performed on a nonwoven fabric layer made of collagen fibers, the layer formed thereby is preferably thermally dehydrated and crosslinked. However, this is merely an example. For example, even if all layers are processed by thermal dehydration crosslinking, there is no problem. For example, γ rays may be irradiated for both sterilization and crosslinking.
[0040]
The adhesion-preventing membrane having a non-woven fabric layer obtained by the above method and a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid can be further compression molded. After the coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid is compressed alone, it may be integrated in combination with a non-compressed nonwoven fabric layer. Particularly preferably, in the final step of the film formation, a nonwoven fabric layer and a sponge-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid are simultaneously compressed. This is because the film thickness is reduced and the film is made thinner by compressing. When actually using an anti-adhesion film at the surgical site, the penetrability of the suture needle in the suturing, handling such as cutting to any shape, etc. In particular, transplantation surgery and the like can be performed more smoothly. The compression method can be performed with a general-purpose press. However, for the purpose of medical use, it is aseptically used with a sufficiently strong sterilized packaging material such as an aluminum pack or a high-strength resin packaging material. It is desirable to compress in a packaged state. Further, the pressure for compressing the adhesion-preventing membrane is not particularly limited as long as the membrane body is not destroyed, but usually 10 to 1000 kgf / cm. 2 It is desirable that the degree.
[0041]
The anti-adhesion membrane of the present invention has good biocompatibility, has few side effects, exhibits an anti-adhesion effect stably for a long period in vivo, and can be sutured. For example, the pleura, pericardium, cerebral dura mater It is used as a membrane for in-vivo membranous tissue, such as serosa, and a defect part or cut surface of various organs, or as a prosthetic membrane. The adhesion-preventing membrane of the present invention can be safely used for humans and animals by a method known per se.
[0042]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples and experimental examples.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
The collagen used in the examples of the present invention is an atherosized acid-solubilized collagen porcine-derived type I mixed collagen powder (manufactured by Nippon Ham Co., Ltd., SOFD type, Lot No.0102226), and hyaluronic acid is a hirunate injection kit. (Hishiyama Pharmaceutical Co., Ltd.) was used.
[0043]
(Example 1) Preparation of anti-adhesion membrane (two layers)
(1) Preparation of a nonwoven fabric layer made of collagen fibers
150 mL of a 7% by weight aqueous solution of acid-solubilized collagen was extruded into 99.5 vol% ethanol (manufactured by Wako Pure Chemicals, special grade) 3 L coagulation bath, and after dehydration and coagulation, the resulting collagen thread was treated by the method described in JP-A-2000-93497 To obtain a collagen nonwoven fabric. Next, the obtained collagen non-woven fabric was air-dried in a clean bench, and then kept in a vacuum dry oven (EYELA: VOS-300VD type) under high vacuum (1 torr or less) at 120 ° C. for 24 hours. Then, a thermal dehydration crosslinking reaction was performed.
After the cross-linking reaction, in order to fill a gap between yarns of the cross-linked collagen non-woven fabric, a 1% by weight collagen aqueous solution was applied to the collagen non-woven fabric as a binder treatment, followed by drying. By repeating the coating operation and the drying operation three times, a nonwoven fabric layer made of collagen fibers was obtained. Thereafter, the collagen was heated and heated at 120 ° C. for 12 hours in a vacuum dry oven (EYELA: VOS-300VD type) under a high vacuum (1 torr or less), and the coated collagen was subjected to a thermal dehydration crosslinking reaction. After the crosslinking reaction, the collagen membrane was immersed in a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution for 30 minutes for neutralization, and then taken out from the aqueous sodium hydroxide solution. Sodium hydroxide remaining on the surface of the nonwoven fabric layer made of collagen fibers was washed with distilled water and air-dried in a clean bench.
[0044]
(2) Sponge-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid
A 1 wt% hyaluronic acid aqueous solution and an equal amount of 1 wt% collagen aqueous solution were mixed to obtain 250 mL of an equal amount mixture of collagen and hyaluronic acid. The mixture in an acidic state was neutralized with a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution, then filled into a metal container (11 cm long, 11 cm wide) having a rectangular parallelepiped space, and frozen overnight at −20 ° C. . The frozen product is freeze-dried under a reduced pressure (1 torr or less) for about 24 hours with a freeze dryer (EYELA: FDU-830 type) to obtain a sponge-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid. It was.
[0045]
(3) The sponge-like coating layer obtained in (2) above is 100 kgf / cm using a compressor (manufactured by Inoue Seieido Co., Ltd .: 15t press machine). 2 After compressing at a pressure of 1, a solution containing a mixture of collagen and hyaluronic acid was adhered onto the non-woven fabric layer made of collagen fibers obtained in (1) above. In this way, an anti-adhesion film having a laminated structure composed of two layers of a sponge-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid on one surface of a nonwoven fabric layer made of collagen fibers was obtained. After that, the adhesion preventing collagen and hyaluronic acid were heated at 110 ° C. for 24 hours under high vacuum (1 torr or less) in a vacuum dry oven (EYELA: VOS-300VD type) in the same manner as the above-mentioned crosslinking reaction. Then, thermal dehydration crosslinking reaction was performed. Thus, two types of layers, a sponge-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid as an outer layer as an adhesion prevention layer, and a non-woven fabric layer made of collagen fibers for maintaining the strength capable of withstanding suture fixation in the inner layer An anti-adhesion membrane having a thickness of about 2 mm was obtained.
[0046]
(Example 2) Preparation of anti-adhesion membrane
A collagen yarn obtained by extruding 150 mL of a 7 wt% collagen aqueous solution into a 99.5 vol% ethanol (manufactured by Wako Pure Chemical Co., Ltd.) coagulation bath was laminated according to a conventional method to obtain a nonwoven fabric layer composed of collagen fibers. Next, the nonwoven fabric layer made of the collagen fibers thus obtained was air-dried in a clean bench, and then kept in a vacuum dry oven (EYELA: VOS-300VD type) under high vacuum (1 torr or less) at 120 ° C. The thermal dehydration cross-linking reaction was performed for 24 hours. After the crosslinking reaction, the nonwoven fabric layer made of collagen fibers was immersed in a 0.1N sodium hydroxide aqueous solution for neutralization treatment, washed with distilled water, and air-dried in a clean bench. After washing, the following solution was applied to the dried nonwoven fabric layer.
[0047]
A 1% by weight collagen aqueous solution and an equal amount of 1% by weight hyaluronic acid were mixed to obtain 150 mL of an equal amount mixture of collagen and hyaluronic acid. The mixed aqueous solution in an acidic state was neutralized with a 0.1N sodium hydroxide aqueous solution, and then applied to a nonwoven fabric layer made of collagen fibers. Thereafter, drying was performed, and coating and drying were repeated three times to obtain an anti-adhesion film having a nonwoven fabric layer made of collagen fibers and an outer layer having a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid. The obtained anti-adhesion membrane was subjected to thermal dehydration cross-linking treatment in the same manner as the non-woven fabric layer made of collagen fibers in a vacuum dry oven (EYELA: VOS-300VD type) under high vacuum (1 torr or less), 110 ° C., 12 By applying under conditions of time, an anti-adhesion film having a thickness of about 1.5 mm was obtained.
[0048]
(Example 3) Preparation of anti-adhesion membrane (two layers)
A nonwoven fabric layer made of collagen fibers and one sponge-like coating layer containing a mixture of compressed collagen and hyaluronic acid were each produced using the same method as in Example 1. A sponge-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid was adhered to one side of the nonwoven fabric layer made of collagen fibers in the same manner as in Example 1, and heat dehydration crosslinking was performed with a vacuum dry oven (EYELA: VOS-300VD). In a mold) under high vacuum (1 torr or less) at 110 ° C. for 24 hours. In this way, the nonwoven fabric layer composed of collagen fibers that bear the strength that can withstand stitching at the center, on one side thereof, had a sponge-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid that exhibited adhesion prevention ability, An anti-adhesion membrane having a total thickness of 2 mm having a two-layer structure was obtained.
[0049]
(Example 4) Preparation of sponge and application to nonwoven fabric
After producing a nonwoven fabric layer made of collagen fibers in the same manner as in Example 1, 250 mL of an aqueous solution (solution 1) consisting of an equal mixture of a 1% by weight collagen solution and an aqueous 1% by weight hyaluronic acid solution was prepared, and 0.1N water The solution was neutralized with an aqueous sodium oxide solution. Next, a non-woven fabric layer 12 made of collagen fibers is placed on a metal flat plate 11, a polyfluorinated ethylene fiber rubber packing 13 for preventing liquid leakage is placed thereon, and an opening 141 is formed at the top. The metal filling container 14 was covered and firmly fixed (FIG. 1). Subsequently, the solution 1 was filled into the filling container 14 from the uppermost opening 141 of the filling container 14 (length 15 cm, width 15 cm), and frozen at −20 ° C. for 12 hours. The frozen product is freeze-dried under reduced pressure (1 torr or less) for about 24 hours with a freeze dryer (EYELA: FDU-830), and a mixture of collagen and hyaluronic acid is placed on the nonwoven fabric layer made of collagen fibers. A two-layer structure having a sponge-like coating layer was obtained.
[0050]
(Example 5) Preparation of anti-adhesion membrane (three layers)
(1) After the cross-linking reaction, the non-woven fabric layer made of collagen fibers is immersed in a 7.5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution for 30 minutes for neutralization, and then taken out from the aqueous sodium hydrogen carbonate solution and applied to the surface of the non-woven fabric layer made of collagen fibers. A nonwoven fabric layer made of collagen fibers was obtained in the same manner as in Example 1 except that the remaining sodium hydrogen carbonate was washed with distilled water and air-dried in a clean bench.
(2) Separately, two sponge-like coating layers containing a mixture of collagen and hyaluronic acid were produced in the same manner as in Example 1.
(3) Next, the sponge-like coating layer is adhered to both surfaces of the non-woven fabric layer made of collagen fibers using the same method as in Example 1 and subjected to thermal dehydration crosslinking, so that the strength that can withstand stitching is provided at the center. An anti-adhesion membrane having a total thickness of about 3 mm having a non-woven fabric layer composed of collagen fibers and a sponge-like covering layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid that exhibits anti-adhesion properties on both surfaces is obtained. It was.
[0051]
(Example 6) Preparation of anti-adhesion membrane (three layers)
(1) A nonwoven fabric layer made of collagen fibers was produced in the same manner as in Example 5.
(2) Separately, two sponge-like coating layers containing a mixture of collagen and hyaluronic acid were prepared by the following procedure.
After preparing and mixing 125 mL of 1 wt% collagen aqueous solution and 125 mL hyaluronic acid 1 wt% aqueous solution, 1N HNO 3 To adjust the pH to 1.5. The mixture was frozen at −20 ° C. for 24 hours and thawed at room temperature to obtain a gel-like product composed of a mixture of collagen and hyaluronic acid. The obtained gel was neutralized by immersing it in a phosphate buffer solution for 30 minutes, then washed in sterile distilled water for 30 minutes, and washing was performed three times in total. The neutralized gel was freeze-dried in the same procedure as in Example 1 to obtain a sponge-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid.
[0052]
(3) Other operations are carried out in the same manner as in Example 1, and a non-woven fabric layer made of collagen fibers having strength capable of withstanding suturing at the center, and a mixture of collagen and hyaluronic acid exhibiting anti-adhesion ability on both surfaces. An adhesion-preventing membrane having a total three-layer structure having a sponge-like coating layer and having a thickness of about 3 mm was obtained.
[0053]
(Example 7) Preparation of anti-adhesion membrane (three layers)
(1) A nonwoven fabric layer made of collagen fibers was produced in the same manner as in Example 5.
[0054]
(2) Separately, a film-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid was prepared by the following procedure.
A 1% by weight aqueous solution of hyaluronic acid and an equal amount of 1% by weight aqueous collagen solution were mixed to obtain about 125 mL of an equal amount mixture of hyaluronic acid and collagen. The mixture in an acidic state is neutralized with a 0.1N sodium hydroxide aqueous solution, then filled into a filling container having an opening at the top, and air-dried in a clean bench, thereby containing a mixture of collagen and hyaluronic acid. Two film-like coating layers were produced.
[0055]
(3) A mixture of collagen and hyaluronic acid on both sides of the non-woven fabric layer made of collagen fibers obtained in (1) above with the film-like coating layer containing the mixture of collagen and hyaluronic acid obtained in (2) above It adhered with the solution containing. After that, the adhesion prevention collagen and hyaluronic acid were heated in a vacuum dry oven (EYELA: VOS-300VD type) under high vacuum (1 torr or less) at 110 ° C. for 24 hours in the same manner as the crosslinking reaction described above. Then, thermal dehydration crosslinking reaction was performed. In this way, two types of layers, a film-like coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid as an adhesion preventing layer, and a non-woven fabric layer made of collagen fibers for maintaining the strength capable of withstanding suturing and fixing at the center layer. An adhesion-preventing membrane having a three-layer laminated structure with a thickness of about 3 mm was obtained.
[0056]
(Experiment 1) Degradation resistance test
As Samples 1 to 3, adhesion prevention films having sponge-like coating layers with different mixing ratios of collagen and hyaluronic acid (3: 7, 5: 5, 7: 3) were produced in the same manner as in Example 1. The sample was cut into 1 cm × 1 cm square and used for the test. As a comparative sample, an anti-adhesion film having a sponge-like coating layer made of hyaluronic acid was prepared, and cut in the same manner as in samples 1 to 3, and used for the test. Each sample was subjected to thermal dehydration crosslinking in a vacuum dry oven (EYELA: VOS-300VD type) under high vacuum (1 torr or less) at 110 ° C. for 24 hours. Each sample was stored at a constant temperature of 37 ° C. in distilled water for injection at 37 ° C., and the area of the coating layer was measured at 3 points after 30 minutes, 24 hours and 3 days. The degree was observed, and the decomposition resistance was evaluated according to the evaluation criteria shown in Table 1. The evaluation results are shown in Table 2.
[0057]
[Table 1]
Degradation resistance scoring
[Table 2]
Degradation resistance test
As is clear from Table 2, the comparative sample (hyaluronic acid alone) was completely dissolved after 1 day. Actually, it completely dissolved within 30 minutes to 1 hour.
[0060]
(Experiment 2) Implantation test
The anti-adhesion membrane obtained in Example 1 was implanted in the back muscle of a rabbit (n = 8), and the tissue reaction was observed with the naked eye and an optical microscope to evaluate biocompatibility. The implant sample was used by cutting the adhesion-preventing film obtained in Example 1 into a size of 1.5 mm × 10 mm. As a comparative sample, a high density polyethylene plate was cut into the same size as the sample. The comparative sample was used after EOG sterilization. The sample film was sterilized by irradiating with 25 kGy of γ rays and used for the implantation test. First of all, the rabbit (weight approximately 2.5 kg to 3.0 kg) is subjected to normal inhalation anesthesia, then the rabbit spinal cord is aseptically sandwiched, with the comparative sample on the left and the right side spaced apart. Each kind was implanted. In the implantation method, a sterilized 15-gauge injection needle is inserted from an angle of about 30 ° with respect to the skin surface, the sample film and the comparative sample filled in the injection needle are pushed out, and the rabbit is injected. Implanted in muscle. Thereafter, 4 birds 1 week after implantation and 4 birds after 4 weeks were used as observation objects. At each observation time, about 2 out of 4 rabbits, the specimen implantation site was cut open under anesthesia, and the implantation part and surrounding tissues were observed visually, focusing on inflammatory reaction and the like.
[0061]
From these observation results, in any observation time and in all rabbits, the sample membrane does not show a remarkable inflammatory reaction or the like with respect to the comparative sample, and the biocompatibility of the adhesion-preventing membrane obtained by the present invention is good It turns out that. In addition, when 4 weeks passed after implantation, it was found that a part of the sample film was decomposed and absorbed.
[0062]
(Experimental example 3) Adhesion prevention test
The anti-adhesion membrane (hereinafter referred to as sample 1) having a sponge-like coating layer made of a mixture of collagen and hyaluronic acid obtained in Example 1 was used as an abdominal wall defect (1 cm square) and intestine of a rabbit (n = 8). The serosa was implanted and secured to the part where it was peeled off with a scalpel. After 1 week and 6 weeks after implantation, the abdomen was opened, and the anti-adhesion effect was observed from the remaining amount of the anti-adhesion film from the decomposition resistance and the degree of adhesion. At this time, a comparative evaluation was performed using a part having only a defect (hereinafter referred to as “Comparative 1”) and an adhesion preventing film (hereinafter referred to as “
[0063]
As a result of comparing sample 1 with
[0064]
Further, the adhesion prevention effect was evaluated based on the judgment criteria shown in Table 3. Table 4 shows the evaluation criteria.
[0065]
[Table 3]
Criteria for determining the degree of adhesion
[Table 4]
Evaluation results of adhesion prevention effect
As is clear from Table 4, there were no cases where adhesion was observed in sample 1 after 6 weeks, whereas in comparison 1,
From the above, it is clear that the adhesion-preventing film of the present invention is excellent in the adhesion-preventing effect and the decomposition resistance by having a coating layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid on the surface thereof.
[0068]
[Effect of the present invention]
The adhesion-preventing film of the present invention has a combination of suture strength, biocompatibility, and adhesion-preventing performance. In particular, an anti-adhesion layer containing a mixture of collagen and hyaluronic acid has a high resistance to decomposition, and dramatically extends the duration of the anti-adhesion effect. Therefore, it is very useful as an artificial biomembrane that can be sutured, which can prevent the damaged or bleeding site in a living body in surgery or the like and the adhesion between them and a normal site.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram of
[Explanation of symbols]
1. Flat plate
2. Nonwoven fabric layer made of collagen fibers
3. Packing
4). Filling container
41. Aperture
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