JP4590615B2 - 二次元電気泳動方法 - Google Patents
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すなわち、本発明は下記を含む。
(1)ストリップ状の第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔をおいて一つの支持基板上に担持され、膨潤して前記第1および前記第2の電気泳動分離媒体を接続しうる乾燥ゲルが、該間隔中、第1の電気泳動分離媒体と接触しない位置に配置されている、二次元電気泳動基板を提供する工程、
(2)前記第1の電気泳動分離媒体にサンプルを含浸させる工程、
(3)前記第1の電気泳動分離媒体に電場を与えて、前記サンプル中の成分を一次分離する工程、
(4)一次分離を実施した後、前記乾燥ゲルに第2の膨潤溶液を添加して、第1の電気泳動分離媒体と第2の電気泳動分離媒体との間が膨潤したゲルにより接続されるまで、該乾燥ゲルを膨潤させる工程、および
(5)前記第1の電気泳動分離媒体および第2の電気泳動分離媒体の双方に、前記第1の電気泳動分離媒体の長手方向に対して実質的に垂直方向に電場を与え、前記第2の電気泳動分離媒体において、前記一次分離された成分を二次分離する工程。
〔2〕 前記乾燥ゲルが、前記間隔の基板上に配置されている〔1〕に記載の方法。
〔3〕 前記乾燥ゲルが、
前記工程(1)において、第1の電気泳動分離媒体および前記第2の電気泳動分離媒体のいずれとも接触しない位置に配置され、
前記工程(4)において、第1の電気泳動分離媒体方向および第2の電気泳動分離媒体方向へ膨潤するゲルである、〔1〕または〔2〕に記載の方法。
〔4〕 前記乾燥ゲルは、原料ゲルを乾燥させて収縮したゲルであり、該原料ゲルは前記第1の電気泳動分離媒体と第2の電気泳動分離媒体間との間を接続しうる大きさを有している、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法。
〔5〕 前記乾燥ゲルが、前記原料ゲルを圧縮しながら乾燥して得られた、〔4〕に記載の方法。
〔6〕 前記乾燥ゲルが、乾燥したアクリルアミドである、〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の方法。
〔7〕 前記工程(1)の第1の電気泳動分離媒体がストリップ状の乾燥した電気泳動媒体であり、乾燥した第1の電気泳動分離媒体に第1の膨潤溶液を添加して、前記乾燥した第1の電気泳動分離媒体を飽和状態まで膨潤させる、〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の方法。
〔8〕前記第1の膨潤溶液が、水よりも極性が高い有機溶媒を含有する、〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法。
〔9〕 前記乾燥ゲルが、下記(a)および(b):
(a)水酸化ナトリウム、および、ホウ酸塩、グリシン塩、クエン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、グルタル酸塩、酢酸塩、フタル酸塩、フタル酸水素塩およびマレイン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも1種;
(b)コハク酸、乳酸、ホウ酸、クエン酸、リン酸、グルタル酸、酢酸、フタル酸およびマレイン酸からなる群から選ばれる少なくとも1種、および、ホウ酸塩、グリシン塩、クエン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、グルタル酸塩、酢酸塩、フタル酸塩、フタル酸水素塩およびマレイン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも1種;
のうちの少なくとも1グループの成分およびマイナスイオンを含み、
前記第(4)工程において乾燥ゲルを膨潤させたゲルがpH6.8である、〔1〕〜〔8〕のいずれかに記載の方法。
〔10〕 前記工程(4)の第2の膨潤溶液が、pH6.8で、さらにマイナスイオンを含有する緩衝液である、〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の方法。
〔11〕 前記工程(1)の前記間隔において、前記第1の電気泳動分離媒体と第2の電気泳動分離媒体とが、気体により隔てられている、〔1〕〜〔10〕のいずれかに記載の方法。
〔12〕 ストリップ状の第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔をおいて一つの支持基板上に担持され、
膨潤して前記第1および前記第2の電気泳動分離媒体を接続しうる乾燥ゲルが、該間隔中の第1の電気泳動分離媒体と接触しない位置に配置されている、二次元電気泳動用キット。
〔13〕 前記支持手段が、さらに、サンプルの一次分離後に前記乾燥ゲルを膨潤させる第2の膨潤溶液の供給手段を有している、〔12〕に記載のキット。
前記工程(1)で供給される二次元電気泳動基板において、前記第1の電気泳動分離媒体は、水又は水溶性溶液の吸収により膨潤するゲルである。該ゲルは乾燥ゲルであっても、既に膨潤したゲルであってもよく、好ましくは通常、乾燥ゲルを使用する。
このようなゲルとしては、ポリアクリルアミドゲルが挙げられる。このようなゲルは、等電点電気泳動を行うIPGゲル(固定化pH勾配ゲル)である。
第1の電気泳動分離媒体の寸法に限定はないが、本発明では、膨潤後においても、極めて細く薄い形状のものを採用できる。たとえば、飽和状態まで膨潤したものにおいて、厚さ0.1〜1.0mm、短手方向の長さ0.5〜5.0mmであるようなものを用いることもできる。長手方向の長さは、基板の大きさにより異なり限定されない。
電気泳動に先立って、タンパク質等のサンプルは蛍光標識しておくことができる。またこのとき、同じ条件で等電点マーカーも泳動しておくことができる。
前記乾燥ゲルは、第2の膨潤溶液を添加すると膨潤する。
このような乾燥ゲルとしては、第2の膨潤溶液を吸収して所望の膨潤をする性質を有していれば限定はないが、たとえば、アガロース、アクリルアミドなどを用いることができ、このうち、アクリルアミドが好ましい。
したがって、原料ゲルは、第1および第2の電気泳動分離媒体とを接続して間隔をほぼ密閉する大きさであることが好ましい。具体的には、原料ゲルは、前記第1および第2の電気泳動分離媒体の向合う間隔を接続する幅および高さを有している。
原料ゲル幅:前記第1の電気泳動分離媒体および第2の電気泳動分離媒体が向き合う面の間の平均距離(本明細書において「媒体間幅」という。)とほぼ同じ大きさの幅である。
原料ゲル高さ:少なくとも第1の電気泳動分離媒体の基板からの高さ(本明細書において「一次媒体高さ」という。)以上の高さである。
原料ゲル長さ:少なくとも第1の電気泳動分離媒体の長手方向の長さ(本明細書において「一次媒体長さ」という。)とほぼ同じ長さである。
本明細書において「原料ゲル高さ」とは、原料ゲルを基板面上に置いたときの、原料ゲルの底面から頂面までの大きさである。
本明細書において「原料ゲル長さ」とは、第1の電気泳動分離媒体の長手方向に対応する、原料ゲルの長手方向の長さである。
このように予め、原料ゲルを圧縮して乾燥ゲルを製造すると、膨潤時、圧縮方向と逆方向に迅速に膨潤させることができる。このため、圧縮して乾燥させた乾燥ゲルを、適切な方向に配置することにより、乾燥ゲルの膨潤により第1および第2の電気泳動分離媒体の相互接続を極めて迅速に行うことができる。
また、このように圧縮しておくことにより、サイズを小型化することもできる。特に、前記媒体間の幅が極めて微小である場合、原料ゲル幅方向の圧縮は有効である。
第1の電気泳動分離媒体の第1の膨潤溶液は公知のものを用いることができ、限定されない。
前記第1の膨潤溶液は、純水、水溶性溶液などである。水溶性溶媒としては、等電点電気泳動に悪影響のないものであればよく、たとえば塩化ナトリウム水溶液などを用いることができる。
溶媒の極性は、誘電率測定などの方法により、測定することができる。
前記水よりも極性が高い有機溶媒の含有割合が上記の量以上であると、前記乾燥した第1の電気泳動分離媒体の膨潤溶液の膨潤時間を著しく短縮化できる。特に、ポリアクリルアミドゲルのIPGゲルの迅速な膨潤に好適である。
前記第1の電気泳動分離媒体を第1の膨潤溶液で膨潤させた後、該膨潤した第1の電気泳動分離媒体の長手方向の両端から電流を流し、一次元目の分離を実施する。前記第1の膨潤溶液は、そのまま一次元目の泳動媒体として機能する。
温度制御方法は特に限定されないが、たとえば、ペルチェ素子を第1の電気泳動分離媒体の裏側、あるいは、第1の電気泳動分離媒体の結合する支持手段の裏側に設けることができる。
一次分離を実施した後、乾燥ゲルに第2の膨潤溶液を添加し、該乾燥ゲルを、第1の電気泳動分離媒体と第2の電気泳動分離媒体との間の間隔が接続されるまで膨潤させる。これにより、第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが該乾燥ゲルが膨潤した膨潤ゲルにより相互接続される。
(a)水酸化ナトリウム、および、ホウ酸塩、グリシン塩、クエン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、グルタル酸塩、酢酸塩、フタル酸塩、フタル酸水素塩およびマレイン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも1種;
(b)コハク酸、乳酸、ホウ酸、クエン酸、リン酸、グルタル酸、酢酸、フタル酸およびマレイン酸からなる群から選ばれる少なくとも1種、および、ホウ酸塩、グリシン塩、クエン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、グルタル酸塩、酢酸塩、フタル酸塩、フタル酸水素塩およびマレイン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも1種;
のうちの少なくとも1グループの成分およびマイナスイオンを含み、
前記乾燥ゲルを膨潤させたゲルがpH6.8である。
第(4)工程において乾燥ゲルを膨潤させたゲルは、上記1グループの成分及びマイナスイオンを含む。
一次元目のゲルに展開された個々の成分は、上記の膨潤した膨潤ゲルを通って、1次元目のゲルから最も近い二次元目のゲルに移動し、分子量にしたがって展開される。このとき、通常、分子量マーカーを同じ条件で電気泳動しておく。
二次元目の電気泳動は、公知の方法と同様に実施すればよく、特に限定はない。二次元目の電気泳動は、たとえば、トリス−グリシン緩衝液、トリス−ホウ酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、トリス−トリシン緩衝液、トリス−リン酸二水素ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液等のような一般にタンパク質などの電気泳動用緩衝液として使用される緩衝液を用いて行うことができる。前記緩衝液は、一般にタンパク質の緩衝液として使用される濃度で使用できる。
本発明に係る二次元電気泳動用キットは、ストリップ状の第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔をおいて一つの支持基板上に担持され、
膨潤して前記第1および前記第2の電気泳動分離媒体を接続しうる乾燥ゲルが、該間隔中の第1の電気泳動分離媒体と接触しない位置に配置されている。
第2の膨潤溶液の供給手段は、前記支持手段に備えられており、これにより、膨潤溶液を簡便に乾燥ゲルに添加することができる。
第1の電気泳動分離媒体1、および第2の電気泳動分離媒体2は、支持基板6上に隙間(ジャンクション部)7を有して備えられる。第1の電気泳動分離媒体1と、第2の電気泳動分離媒体2とは互いに平行な面で対面して配置されている。また、二次元目の電気泳動用バッファー槽3、4が設けられている。間隔7には、基板6上に乾燥ゲル5が備えられている。
図2aは、乾燥ゲルが配置された二次元電気泳動用キットの断面図および上面図、図2bは、乾燥ゲルを膨潤させて間隔を相互接続させた後の状態の断面図および上面図を示す。
図2aの乾燥ゲル5は、X方向およびY方向に膨潤するように、間隔7と同サイズの原料ゲルを乾燥したもので、第2の膨潤溶液の添加により、図2bに示すように乾燥ゲル5は膨潤し、第1の電気泳動分離媒体1と第2の電気泳動分離媒体2とを膨潤ゲル8で接続することができる。ここで、原料ゲルを圧縮して乾燥すると膨潤割合を向上させるとともに乾燥ゲル5のサイズを小さくできる。特にY方向に圧縮して乾燥すると、Y方向へのサイズを小さくできるとともに、Y方向への膨潤割合を増加向上させることができる。
これにより、一次元目の電気泳動に際し、通電に伴って、簡便に第1の電気泳動分離媒体1の冷却を簡便かつ効率よく実施できる。
また、支持手段6には、乾燥状態にある第1の電気泳動分離媒体1を膨潤するための第1の膨潤溶液の供給手段が備えられていてもよい(図示せず)。該膨潤溶液の供給手段は、第1の膨潤溶液を放出する液だめなどである。
このような第2の膨潤溶液の供給手段9、第1の膨潤溶液の供給手段が備えられていると、操作の自動化を図ることができ、迅速で正確な電気泳動を実施できる。特に、たとえば、前記乾燥ゲル5の幅が数ミリ単位、あるいは前記間隔7も数ミリ単位となっても、正確にこれらの溶液の供給が可能となるという利点がある。
〔実施例1〕
一次元目の電気泳動後の一次元目ゲルと二次元目ゲルの接続方法について実験した。
ゲル1の長手方向の横は、支持基板6の壁と接することが無いよう空間でさえぎられ、ゲル1とゲル2とは互いに接触しない用に配置され、ゲル1とゲル2とは互いに電気的に絶縁されている。
図4にゲル5が膨張してゲル1とゲル2を接続した写真を示した。
〔実施例2〕
実施例1で示した接続方法を用いて二次元電気泳動を行った。
図5に一次元目の電気泳動に続いて行った二次元目の電気泳動後にサンプルが分離された二次元目ポリアクリルアミドゲルの像を示す。
2 第2の電気泳動分離媒体
3 緩衝溶液槽
4 緩衝溶液槽
5 乾燥ゲル
6 支持基板
7 間隔(ジャンクション)
8 膨潤ゲル
9 第2の膨潤溶液の供給手段
10 電極
11 電極
Claims (13)
- 下記工程を含む、二次元電気泳動方法:
(1)ストリップ状の第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔をおいて一つの支持基板上に担持され、膨潤して前記第1および前記第2の電気泳動分離媒体を接続しうる乾燥ゲルが、該間隔中、第1の電気泳動分離媒体と接触しない位置に配置されている、二次元電気泳動基板を提供する工程、
(2)前記第1の電気泳動分離媒体にサンプルを含浸させる工程、
(3)前記第1の電気泳動分離媒体に電場を与えて、前記サンプル中の成分を一次分離する工程、
(4)一次分離を実施した後、前記乾燥ゲルに第2の膨潤溶液を添加して、第1の電気泳動分離媒体と第2の電気泳動分離媒体との間が膨潤したゲルにより接続されるまで、該乾燥ゲルを膨潤させる工程、および
(5)前記第1の電気泳動分離媒体および第2の電気泳動分離媒体の双方に、前記第1の電気泳動分離媒体の長手方向に対して実質的に垂直方向に電場を与え、前記第2の電気泳動分離媒体において、前記一次分離された成分を二次分離する工程。 - 前記乾燥ゲルが、前記間隔の基板上に配置されている請求項1に記載の方法。
- 前記乾燥ゲルが、
前記工程(1)において、第1の電気泳動分離媒体および前記第2の電気泳動分離媒体のいずれとも接触しない位置に配置され、
前記工程(4)において、第1の電気泳動分離媒体方向および第2の電気泳動分離媒体方向へ膨潤するゲルである、請求項1または2に記載の方法。 - 前記乾燥ゲルは、原料ゲルを乾燥させて収縮したゲルであり、該原料ゲルは前記第1の電気泳動分離媒体と第2の電気泳動分離媒体間との間を接続しうる大きさを有している、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記乾燥ゲルが、前記原料ゲルを圧縮しながら乾燥して得られた、請求項4に記載の方法。
- 前記乾燥ゲルが、乾燥したアクリルアミドである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記工程(1)の第1の電気泳動分離媒体がストリップ状の乾燥した電気泳動媒体であり、乾燥した第1の電気泳動分離媒体に第1の膨潤溶液を添加して、前記乾燥した第1の電気泳動分離媒体を飽和状態まで膨潤させる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の膨潤溶液が、水よりも極性が高い有機溶媒を含有する、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記乾燥ゲルが、下記(a)および(b):
(a)水酸化ナトリウム、および、ホウ酸塩、グリシン塩、クエン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、グルタル酸塩、酢酸塩、フタル酸塩、フタル酸水素塩およびマレイン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも1種;
(b)コハク酸、乳酸、ホウ酸、クエン酸、リン酸、グルタル酸、酢酸、フタル酸およびマレイン酸からなる群から選ばれる少なくとも1種、および、ホウ酸塩、グリシン塩、クエン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、グルタル酸塩、酢酸塩、フタル酸塩、フタル酸水素塩およびマレイン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも1種;
のうちの少なくとも1グループの成分およびマイナスイオンを含み、
前記第(4)工程において乾燥ゲルを膨潤させたゲルがpH6.8である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。 - 前記工程(4)の第2の膨潤溶液が、pH6.8で、さらにマイナスイオンを含有する緩衝液である、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記工程(1)の前記間隔において、前記第1の電気泳動分離媒体と第2の電気泳動分離媒体とが、気体により隔てられている、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- ストリップ状の第1の電気泳動分離媒体と、第2の電気泳動分離媒体とが、互いに間隔をおいて一つの支持基板上に担持され、
膨潤して前記第1および前記第2の電気泳動分離媒体を接続しうる乾燥ゲルが、該間隔中の第1の電気泳動分離媒体と接触しない位置に配置されている、二次元電気泳動用キット。 - 前記支持手段が、さらに、サンプルの一次分離後に前記乾燥ゲルを膨潤させる第2の膨潤溶液の供給手段を有している、請求項12に記載のキット。
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