CN107488208B - 一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法，属于蛋白样品分离分析领域。所述方法采用纸通道、酸性溶液、碱性溶液、两性样品、两个电极及直流电源组成回路，所述两个电极分别***酸性溶液和碱性溶液中，所述纸通道采用酸性溶液或碱性溶液中的任一种润湿后其两端分别与酸性和碱性溶液接触，所述两个电极通过导线与直流电源连接，两性样品直接加载至酸性溶液或碱性溶液内或纸通道上。与现有技术相比，本发明无需借助自由载体两性电解质即可实现两性样品的快速聚焦和分离，且分离组分容易回收，便于和其他分析方法联用。当采用挥发性弱酸和挥发性弱碱体系时，与质谱兼容性更好。

Description

一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法

技术领域

本发明属于蛋白样品分离分析领域，涉及一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法。

背景技术

等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)是针对具有等电点的两性组分的电泳分离和浓集的模式之一，广泛应用于复杂蛋白质的分离、提纯及等电点的表征。在具有pH梯度的分离通道上，在电场作用下两性组分根据等电点的差异向与其pI相同的pH位置迁移而实现聚焦和分离。现有技术中形成pH梯度的方法主要分为两种：一种是借助自由载体两性电解质(carrier ampholyte，CA)，CA是一类两性化合物的混合物，施加电压后，具有紧密等电点间隔的系列两性化合物的混合物在电场的作用下迁移，形成相应的pH梯度，两性分子在此梯度内得以聚焦分离。但是，载体两性电解质不仅价格高，而且在与其他分析方法如质谱联用时会产生干扰。另一种是基于IPG(immobilized pH gradient)胶条，以丙烯酰胺为基质利用不同pK的两性单体，交联后形成具有一定pH梯度的聚合物。但是，市售的IPG胶条不仅价格高，而且完成IEF耗时长。为了避免载体两性电解质的使用，研究人员也尝试过无载体两性电解质的等电聚焦方法，如自聚焦、热致pH梯度以及电解形成pH梯度等，但pH梯度未定量给出，***复杂且操作繁琐。

自从2007年Whitesides课题组首次将纸基分析装置引入到微流控分析领域以来，纸基微流控分析装置(Paper based analytical device，PAD)便引起了人们广泛的关注。PAD具有价廉、便携、耗样少、制备简单及生物相容性好等优点。目前纸基微流控的应用范围已涵盖众多领域，如食品安全、环境监测及临床诊断等。

目前，已经提出一种基于载体两性电解质的纸基等电聚焦和分离方法。由于该方法借助于载体两性电解质，在纸基分析装置上采用等电聚焦方法来实现两性样品的快速聚焦和分离。因此，该方法不仅成本高，而且载体两性电解质在与其他分析方法(如质谱分析)联用时会产生干扰，不利于分离回收组分的质谱表征。

综上所述，亟需寻求一种无需借助载体两性电解质，能够实现两性样品的快速聚焦和分离，分离组分容易回收和利于质谱表征的等电聚焦和分离的方法。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种无需借助自由载体两性电解质，能够实现两性样品的快速聚焦和分离，分离组分容易回收和利于质谱表征的等电聚焦和分离的方法。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法，所述方法采用纸通道、酸性溶液、碱性溶液、两性样品、两个电极及直流电源组成回路，所述两个电极分别***酸性溶液和碱性溶液中，所述纸通道采用酸性溶液和碱性溶液中的任一种润湿后其两端分别与酸性溶液和碱性溶液接触，所述两个电极通过导线与直流电源连接，两性样品直接加载至酸性溶液或碱性溶液内或纸通道上。

作为无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法的优选方案，所述酸性溶液的浓度为0.1mM-1.0M，所述碱性溶液的浓度为0.1mM-1.0M。

作为无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法的优选方案，所述酸性溶液为挥发性弱酸HAc溶液或HCOOH溶液，所述碱性溶液为挥发性弱碱NH₃·H₂O溶液。

作为无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法的优选方案，所述两个电极中的阳极采用铂电极，阴极采用铂电极。

作为无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法的优选方案，所述纸通道为采用纤维材质制作而成的分离通道。

作为无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法的优选方案，所述纸通道为玻璃纤维膜，所述纸通道的长度为5-100mm，宽度为100μm-10mm。

作为无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法的优选方案，施加于所述纸通道上的电场强度范围为3-300V/cm。

(三)有益效果

与现有技术相对比，本发明的优势具体如下：

1、本发明无需借助一定范围的自由或固定载体两性电解质，在纸基分析装置上采用无载体两性电解质的等电聚焦方法来实现复杂两性样品(蛋白样品)的快速聚焦和分离，分离组分容易回收，不仅降低了成本，而且避免了载体两性电解质在与后续其他分析(如质谱分析)联用时产生的干扰，有利于分离回收组分的质谱表征。

2、两性样品直接加载至酸性阳极溶液或碱性阴极溶液内或纸通道上，具有两方面的优势：一方面能够使两性样品带电，在施加直流电压后，有利于两性样品组分在电场的作用下迁移；另一方面可简化操作。

附图说明

图1是本发明实施例1中纸基分析装置的结构示意图；

图2是本发明实施例1中等电聚焦和分离藻蓝蛋白和牛血红蛋白混合样品的聚焦分离结果以及聚焦分离过程中电流随时间的变化曲线图；

图3是本发明实施例1中纸通道上的pH分布图以及聚焦完成后纸通道上的信号强度分布图；

图4是本发明实施例1中的纸通道上的信号强度分布图；

图5是本发明实施例1中聚焦待回收组分的SDS-PAGE表征图及质谱图；

图6为本发明的可调控性分析图。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

实施例1

本实施例提出在图1所示的开放纸基分析装置上不借助载体两性电解质进行藻蓝蛋白和牛血红蛋白混合样品等电聚焦和分离的方法，该方法采用纸通道、酸性溶液、碱性溶液(以挥发性弱酸、挥发性弱碱溶液为例进行说明)、两性样品、两个电极及直流电源组成回路。

具体的，在阳极储液池中加入浓度为10mM的HAc溶液，pH＝4.3，HAc溶液内含有质量体积分数(即HEC的质量与HAc溶液的体积比，m/V)为0.2％的HEC(其中，HEC为羟乙基纤维素，属于非离子型表面活性剂，用来抑制电渗流。纸通道表面有硅羟基，带负电，导致纸通道上的溶液带正电，溶液有整体向负极移动的趋势，称为电渗流。在电泳分析中，当电渗流过大时，常用表面活性剂来进行抑制。)，***铂电极作为阳极。在阴极储液池加入包含浓度为0.5mg/mL藻蓝蛋白和浓度为1.0mg/mL牛血红蛋白的混合样品，该混合样品的基质选用浓度为10mM的NH₃·H₂O溶液(pH＝9.8)，***铂电极作为阴极。纸通道采用上述的HAc溶液润湿，润湿后的纸通道的两端分别与HAc溶液和NH₃·H₂O溶液接触，阴阳两电极通过导线与直流电源相连，构成回路。纸通道选择玻璃纤维膜，该纸通道的尺寸长为35mm，宽为3mm。施加电场强度为100V/cm的直流电压，在电场的作用下，纸通道上形成了一定的pH梯度。上述纸通道直接采用阳极的HAc溶液润湿的目的是使整个电路形成回路。当然，上述的纸通道还可以采用其他纤维材质制成分离通道。

本发明的原理如下：用酸性支持电解质润湿纸通道，并将其两端分别浸入酸性阳极支持电解质溶液和碱性阴极电解质溶液中。施加直流电压后，阴极储液池的OH^-向阳极端迁移，阳极池的H⁺向阴极迁移，两者相遇时发生中和反应，此中和界面从阴极端开始发生，并逐渐向阳极端移动；阴极端至中和界面的区域，由于OH^-迁移会形成碱性递减的区域，存在的物质主要为OH^-。阳极端至中和界面的区域，由于H⁺的迁移会形成酸性递减的区域，存在的物质主要为H⁺。中和反应界面处，存在的物质主要为H₂O，呈现为中性。H⁺不仅受电场的作用迁移至纸通道，而且电渗流也会将其泵入至纸通道上，所以中和反应不会进行到阳极储液池。由于中和反应生成了电导率低的水，电流降低，带电物质的电迁移减弱，最终***达到平衡状态并在纸通道上形成了稳定的pH梯度。

藻蓝蛋白(等电点约为4.45)和牛血红蛋白(等电点约为6.8)样品处于高于其等电点的样品基质(pH 10)中而带负电，在电场的作用下向阳极迁移，当迁移至接近其等电点的pH位置电荷为零，而在此聚焦，使得不同等电点的样品得以分离。

用固定夹将手机固定在体视显微镜的目镜筒上，利用专业拍照软件Camera FV-5观察整个聚焦过程，设置拍照间隔为10s，聚焦分离结果如图2所示，当拍照时间为590s时，藻蓝蛋白和牛血红蛋白得到了同时聚焦和分离。根据电流时间曲线可知，从拍照时间350s开始，电流下降并维持在很低水平，约为30μA，此***可长时间稳定存在。

下面通过以下操作方法来获取纸通道上的pH信息以及藻蓝蛋白和牛血红蛋白的分离度。具体的，在图1所示的开放纸基分析装置上不借助载体两性电解质进行两性组分等电聚焦和分离的方法，在样品空白的情况下进行实验，其他实验条件参见上述操作条件。以5mm为间距，用精密pH试纸表征拍照时间590s时纸通道上的pH信息。以五次平行测定实验为结果，可知在纸通道上形成的pH范围为4.3-9.8(参见图3)。将图2得到的藻蓝蛋白和牛血红蛋白在590s时的聚焦图像置于此梯度内，可知藻蓝蛋白聚焦的pH位置约为4.5，与其等电点4.45接近，牛血红蛋白聚焦的pH位置约为6.5，与其等电点6.8接近。将聚焦图像经过ImageJ处理，得到纸通道上的信号强度分布图(参见图4)。根据纸通道上的信号强度分布图和分离度R的计算公式

式中，t_R2：相邻两峰中后一组分的保留时间，t_R1：相邻两峰中前一组分的保留时间，W₂、W₁：此相邻两峰的峰底宽，可知t_R2＝1435，t_R1＝958，W₂＝133，W₁＝137，由此计算得到藻蓝蛋白和牛血红蛋白的分离度R为3.53，表明两者已达到完全分离(色谱中分离度为1.5时即可认为两组分完全分离)。

可聚焦完成后，对纸通道上聚焦的藻蓝蛋白和牛血红蛋白进行回收，回收过程具体如下：1、将图2所示拍照时间590s时的纸通道上的聚焦带裁剪，置于两个离心管内；2、每个离心管内加去离子水振荡溶解；3、将两个离心管放入离心机进行离心，离心后保留上清液，即得到回收样品。将上述藻蓝蛋白和牛血红蛋白的回收样品分别在图1所示的开放纸基分析装置上再次等电聚焦，还能聚焦分离出藻蓝蛋白和牛血红蛋白，证明采用本实施例的方法还可以实现样品的回收。

为了验证所建立的方法可将混合蛋白分离，我们将纸通道切割为五等份(如图5a所示)，并将回收组分置于EP管内，然后利用上样缓冲溶液振荡溶解，加热变性进行SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE)分析。如图5b所示，第1泳道为低分子量蛋白质marker，第2至6泳道依次为1至5号回收组分，第7泳道为藻蓝蛋白和牛血红蛋白混合物。根据纸通道上的pH分布及所用模型蛋白的pI，第2、5和6泳道应无蛋白条带出现；藻蓝蛋白和牛血红蛋白应分别出现在第3和第4泳道。已有文献表明，藻蓝蛋白含有α和β两个亚基，且两者的分子量分别约为18kDa和19kDa；牛血红蛋白含有四个分子量接近的亚基，分子量为15kDa或16kDa。SDS-PAGE表征结果如图5b所示，第3泳道出现分子量约为18、19kDa的条带，第4泳道出现了约为15kDa和30kDa的条带(可能由于蛋白变性未完全，已有文献也有类似现象，解释主要归为牛血红蛋白纯度不高或变性未完全)。SDS-PAGE电泳结果与文献中的报道中的一致，表明所建立的方法可同时实现混合蛋白的聚焦和分离。

从图5b的SDS-PAGE表征图可知，只有2号和3号回收组分出现了蛋白条带，其他回收组分无蛋白条带的出现。所以在进行基质辅助激光解析电离-飞行时间串联质谱仪(MALDI-TOF/TOF)验证所建立的体系质谱兼容性好时，我们只选取2号和3号回收组分进行分析。醋酸和氨水均为挥发性组分，是质谱友好型电解质。在与质谱联用时可不经过脱盐处理，直接进样检测。

我们将2号和3号回收组分置于EP管内，用蒸馏水振荡溶解，超声取上清液然后与基质SA(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)混合，MALDI-TOF/TOF在线性模式下检测。为了便于比对，我们对未经过PAD-CAF-IEF的蛋白样品(溶剂为水)也进行了MALDI-TOF/TOF分析。已有文献说明藻蓝蛋白含有α和β两个亚基，分子量分别为18.188kDa和19.220kDa。如图5c所示，深色和浅色谱线分别为藻蓝蛋白样品和2号回收组分的谱图，MALDI-TOF/TOF测定结果显示，藻蓝蛋白和2号回收组分均含有18.192kDa和19.289kDa两个亚基，表明两者为同一物质，且与文献值较为符合。同理，有文献表明牛血红蛋白含有四个亚基，分子量约为15kDa或16kDa。如图5d所示，深色和浅色谱线分别为牛血红蛋白样品和3号回收组分的谱图，MALDI-TOF/TOF测定结果显示，牛血红蛋白和3号回收组分均含有15.055kDa和15.959kDa两个亚基，表明3号为牛血红蛋白，且测定结果与文献值较为一致。

实施例2-10

同实施例1的等电聚焦和分离方法类似，实施例2-10是通过调整阳极电解质HAc溶液的浓度(0.1mM-1M)、阴极电解质NH₃·H₂O溶液的浓度(0.1mM-1M)、纸通道的长宽尺寸(长度5-100mm，宽度100μm-10mm)以及施加直流电压的电场强度(3-300V/cm)等参数条件来分离藻蓝蛋白和牛血红蛋白。实施例2-10分离藻蓝蛋白和牛血红蛋白的操作情况具体如表1所示。

表1实施例2-10分离藻蓝蛋白和牛血红蛋白的操作情况。

从表1可以看出，采用实施例1所述的等电聚集和分离方法，在不改变其他参数条件的情况下，通过调整阳极电解质HAc溶液的浓度(0.1mM-1M)、阴极电解质NH₃·H₂O溶液的浓度(0.1mM-1M)、纸通道的长宽尺寸(长度5-100mm，宽度100μm-10mm，大尺寸可一次分离更多种类的两性样品)以及施加直流电压的电场强度(3-300V/cm)等参数，均能聚集和分离出藻蓝蛋白和牛血红蛋白，且聚焦分离的蛋白组分易于回收，同时也利于质谱表征。

本发明的纸通道除了可以采用阳极电解质HAc溶液进行润湿，还可以采用阴极电解质NH₃·H₂O溶液进行润湿，润湿的作用是为了使整个电路形成可通电回路，以便于在纸基分析装置上采用等电聚焦方法聚焦分离出蛋白组分。

本发明的阳极电解质溶液除了采用上述的弱酸HAc溶液，还可以采用挥发性弱酸HCOOH溶液、HF溶液、H₂S溶液以及H₂CO₃溶液，当然还可以采用以下酸性溶液：如高氯酸HClO₄、氢碘酸HI、硫酸H₂SO₄、氢溴酸HBr、盐酸HCl、硝酸HNO₃、碘酸HIO₃、草酸H₂C₂O₄、亚硫酸H₂SO₃、磷酸H₃PO₄、丙酮酸CH₃COCOOH、亚硝酸HNO₂、柠檬酸C₆H₈O₇、氢氟酸HF、苹果酸C₄H₆O₅、葡萄糖酸C₆H₁₂O₇、碳酸H₂CO₃、乳酸CH₃CH(OH)COOH、苯甲酸C₆H₅COOH、丙烯酸CH₂＝CHCOOH、丙酸CH₃CH₂COOH、硬脂酸CH₃(CH₂)₁₆COOH、氢硫酸H₂S、次氯酸HClO、硼酸H₃BO₃、硅酸H₂SiO₃以及酸性缓冲体系等。

本发明的阴极电解质除了采用上述的NH₃·H₂O溶液，还可以替换成其他碱性溶液，如氢氧化钾KOH、氢氧化钠NaOH、氢氧化钡Ba(OH)₂、氢氧化钙Ca(OH)₂以及碱性缓冲体系等。

进一步的，在图1所示的开放纸基装置上不借助载体两性电解质进行两性组分等电聚焦和分离的方法，通过调节酸性和碱性电解质的浓度(即pH值)，在纸通道上形成相应的pH范围，等电点在此pH范围的两性分子均可聚焦。如图6a所示，阳极支持电解质为10mMHAc，pH＝4.3，HAc溶液内含有质量体积分数为0.2％的HEC并用其润湿纸通道；阴极为0.5mgmL^-1细胞色素C(pI-10.0)蛋白样品，样品基质为1M NH₃·H₂O溶液，pH＝11.8，其他实验条件参见实施例1。可知，细胞色素C在pH范围为4.3-11.8的纸通道上得到了聚焦。由此，阳极选用酸性支持电解质，阴极选用碱性支持电解质，即可在纸通道上形成一定的pH范围，等电点在此pH范围的两性分子即可得到聚焦分离。

我们用如下实验进行验证，如图6b所示，阳极支持电解质为1mM H₃PO₄溶液，pH＝3.0，H₃PO₄溶液内含有质量体积分数为0.2％HEC，并用其润湿纸通道；阴极池：0.5mg mL^-1藻蓝蛋白和1.0mg mL^-1牛血红蛋白，样品基质为1mM NaOH，pH＝9.4，其他实验条件参见实施例1。可知，阳极和阴极支持电解质分别选用磷酸和氢氧化钠时，藻蓝蛋白和牛血红蛋白亦得到了聚焦分离。

当选用挥发性弱酸溶液和/或挥发性弱碱溶液时，质谱友好，从而有利于分离回收组分的质谱表征，当分离组分进行质谱表征时，可不经除盐操作处理，直接与质谱分析联用，从而降低了操作工序。

本发明的阳极电解质优选为挥发性弱酸溶液HAc溶液，阴极电解质优选为挥发性弱碱NH₃·H₂O溶液。选择挥发性弱酸弱碱的好处是：一方面，可以分别提供H⁺和OH^-；另一方面，HAc和NH₃·H₂O均为挥发性组分，是质谱友好型支持电解质，有利于分离组分的回收和质谱表征。当分离组分进行质谱表征时，可不经除盐操作处理，直接与质谱分析联用，从而降低了操作工序，也不会引入新的物质，造成对后续其他分析(如质谱分析)联用时的干扰。

总之，本发明无需借助一定范围的自由或固定载体两性电解质，在纸基分析装置上采用无载体两性电解质等电聚焦的方法来实现复杂两性样品(蛋白样品)的快速聚焦和分离，不仅降低了成本，而且避免了载体两性电解质在与后续其他分析(如质谱分析)联用时产生的干扰。

在本发明中，两性样品直接加载至酸性阳极溶液或碱性阴极溶液内或纸通道上，具有两方面的优势：一方面能够使两性样品带电，在施加直流电压后，有利于两性样品组分在电场的作用下迁移；另一方面可简化操作。

以上结合具体实施方式描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明保护范围之内。

Claims (7)

1.一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法，其特征在于，所述方法采用纸通道、酸性溶液、碱性溶液、两性样品、两个电极及直流电源组成回路，所述两个电极分别***酸性溶液和碱性溶液中，所述纸通道采用酸性溶液和碱性溶液中的任一种润湿后其两端分别与酸性溶液和碱性溶液接触，所述两个电极通过导线与直流电源连接，两性样品直接加载至酸性溶液或碱性溶液内或纸通道上；所述两性样品中不含载体两性电解质。

2.如权利要求1所述的一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法，其特征在于，所述酸性溶液的浓度为0.1mM-1.0M，所述碱性溶液的浓度为0.1mM-1.0M。

3.如权利要求2所述的一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法，其特征在于，所述酸性溶液为挥发性弱酸HAc溶液或HCOOH溶液，所述碱性溶液为挥发性弱碱NH3·H₂O溶液。

4.如权利要求3所述的一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法，其特征在于，所述两个电极中的阳极采用铂电极，阴极采用铂电极。

5.如权利要求4所述的一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法，其特征在于，所述纸通道为采用纤维材质制作而成的分离通道。

6.如权利要求5所述的一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法，其特征在于，所述纸通道为玻璃纤维膜，所述纸通道的长度为5-100mm，宽度为100μm-10mm。

7.如权利要求6所述的一种无载体两性电解质的等电聚焦和分离的方法，其特征在于，施加于所述纸通道上的电场强度范围为3-300V/cm。

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