JP4566129B2 - 新規ウイルスベクター - Google Patents

Description

本発明は、ウイルス粒子表面に水溶性ポリマーが結合し、かつ、当該水溶性ポリマーにインテグリンに親和性のある外来性ペプチドが結合した構造を有するウイルスベクターに関する。

現在、遺伝子導入に用いられているベクターとしてアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびリポソーム等が知られている。その中でもアデノウイルスベクターは、１）遺伝子導入効率および遺伝子発現効率が高い、２）増殖停止期の細胞やその他多くの細胞種に対して遺伝子導入が可能、３）ｉｎ ｖｉｖｏにおける組織への直接遺伝子導入にも有効、４）比較的大きな外来遺伝子を導入することが可能、５）高力価ベクターの作製が容易、および６）細胞毒性を引き起こす可能性が低い、などの利点を有していることから汎用されている。
また、アデノウイルスの感染様式として、まずウイルス粒子表面から突出するファイバーが感染細胞表面に存在するアデノウイルス受容体ＣＡＲ（ｃｏｘａｃｋｉｅ−ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合し、その後ウイルス粒子表面に存在するペントンベース（アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）の配列を５個有する）が細胞表面に存在するインテグリン（αＶβ３、αＶβ５）に結合することでウイルス粒子が細胞内に取込まれ、感染が成立することが知られている（ティー・ジェイ・ウィックハム（Ｔ．Ｊ．Ｗｉｃｋｈａｍ）ら著，「セル（Ｃｅｌｌ）」，第７３巻，３０９−３１９頁，１９９３年参照）。
しかしながら、遺伝子導入用のベクターとして使用する場合、アデノウイルスは、１）免疫原性が高いため投与量によっては個体に対して炎症反応を引き起こす、２）血中半減期が短い、３）肝集積性が高く、肝障害発症の危険性がある、４）ＣＡＲ低発現細胞（例えば、気道上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、Ｔ細胞、造血幹細胞、樹状細胞など）に対しては遺伝子導入効率が低い、５）抗原性が高いため、中和抗体や貧食細胞の攻撃を受けやすく遺伝子導入効率が低下する、などの問題点がある。
これら問題点を解決するために、アデノウイルスベクターを局所投与する方法、アデノウイルスの抗原性を示す部位を遺伝子工学的に削除する方法、アデノウイルスゲノムを遺伝子工学的に改変する方法などが試みられているが、全ての問題点が解決されたわけではない。
一方、最近では、ウイルスに対する中和抗体や貧食細胞の作用による遺伝子導入効率の低下の回避および血中安定性の向上を目的として、ウイルス粒子表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させたアデノウイルスベクター（以下、ＰＥＧ−アデノウイルスベクターという）（特表２００１−５２１３８１号公報参照）や、ＣＡＲ非発現および低発現細胞における遺伝子導入効率の向上を目的として、標的細胞表面に存在するインテグリンに結合することが知られているアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）を基本配列として有するペプチドモチーフ（以下、ＲＧＤモチーフという）を遺伝子工学的手法によりウイルスのファイバー先端のノブに組込んだアデノウイルスベクター（以下、ファイバー変異アデノウイルスベクターという）（エイチ，・ミズグチ（Ｈ．Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ）ら著，「ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）」，第８巻，７３０−７３５頁，２００１年参照）や、前記のＰＥＧ−アデノウイルスベクターのＰＥＧの最外部に気道上皮細胞に特異性を有するペプチド（ｓｓｓ．１７ペプチド、ＳＤＱＬＡＳＰＹＳＨＰＲ）を付加したアデノウイルスベクター（以下、気道上皮細胞特異的ペプチド−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターという）（エイチ・ロマンクザック（Ｈ．Ｒｏｍａｎｃｚｕｋ）ら著，「ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」，第１０巻，２６１５−２６２６頁，１９９９年参照）が報告されている。
しかしながら、前記のＰＥＧ−アデノウイルスベクターでは、ＰＥＧによりウイルス粒子とＣＡＲとの結合が阻害され、ＣＡＲ発現細胞における遺伝子導入効率が低下するという問題が生じている（シイ・アール・オリオールダン（Ｃ．Ｒ．Ｏ’ｒｉｏｒｄａｎ）ら著，「ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」，第１０巻，１３４９−１３５８頁，１９９９年参照）。また、かかる遺伝子導入効率の低下に起因して、ＰＥＧ−アデノウイルスベクターを組織に投与しても標的細胞内に取り込まれず、血流にのって肝臓に集積し肝障害を引き起こす可能性もある。
また、前記のファイバー変異アデノウイルスベクターでは、ウイルスのファイバーにＲＧＤモチーフが挿入されているだけなので、通常のアデノウイルスベクターと同様の抗原性を有するため、中和抗体や貪食細胞の作用により遺伝子導入効率が低下するという問題点がある。
さらに、前記の気道上皮細胞特異的ペプチド−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターでは、気道上皮細胞のみにしか遺伝子導入することができず、また、ｓｓｓ．１７ペプチドが標的とする気道上皮細胞表面の物質も明らかとなっていない。さらに、前記エイチ・ロマンクザック（Ｈ．Ｒｏｍａｎｃｚｕｋ）ら著の表１および図２から見ると、気道上皮細胞に対する結合にはｓｓｓ．１７の全１２個のアミノ酸残基が必要であることが示唆されるが、一般的に１２個ものアミノ酸残基からなるペプチドは投与した生体に対して免疫原性を示す可能性が高く、ｓｓｓ．１７ペプチドを含むウイルスベクターをｉｎ ｖｉｖｏで投与するには問題がある。
また、前記の気道上皮細胞特異的ペプチド−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターでは、その作製方法にも種々の問題点が存在する。すなわち、当該ベクターは、ｓｓｓ．１７ペプチドの末端に活性ＳＨ基を有するシステインを付加してｓｓｓ．１７ペプチド誘導体を合成し、一方でアデノウイルス表面のリジン残基と反応する基と前記のｓｓｓ．１７ペプチド誘導体の活性ＳＨ基と反応する基とをそれぞれＰＥＧの両末端側に有する異二価反応性ＰＥＧをアデノウイルスに結合させ（ＰＥＧ−アデノウイルス）、その後に、前記のｓｓｓ．１７ペプチド誘導体をこのＰＥＧ−アデノウイルスに結合させることによって作製している。しかし、このベクター作製方法では、活性ＳＨ基を有するｓｓｓ．１７ペプチド誘導体同士が反応の間に分子間架橋してＰＥＧと結合できなくなったり、アデノウイルスが２段階の反応系に暴露されることから元来のウイルス自体が有する有用な能力が低下するなどという問題点も存在していた。
したがって、これらの従来使用されているウイルスベクターが有する問題点ないし欠点が解決されたウイルスベクターの開発が望まれていた。
本発明は、上述の従来使用されているウイルスベクターが有する有用点を保持しつつ、それぞれの欠点が克服されたウイルスベクターを提供することを目的とする。
特に、上述のＰＥＧ−アデノウイルスベクター、ファイバー変異アデノウイルスベクターおよび気道上皮細胞特異的ペプチド−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの有用点を保持しつつ、それぞれの欠点が克服されたウイルスベクターを提供することを目的とする。すなわち、１）アデノウイルスベクターが有する免疫原性を低下させ、個体に対する炎症反応を回避し、２）アデノウイルスベクターが有する抗原性を低下させ、中和抗体や貪食細胞からの攻撃を回避し、３）ＰＥＧ−アデノウイルスベクターにおける遺伝子導入効率低下の問題を改善し、４）ファイバー変異アデノウイルスベクターの血中安定性をより向上させ、免疫原性の改善、中和抗体や貧食細胞からの攻撃を回避し、５）気道上皮細胞特異的ペプチド−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターにおける遺伝子導入し得る標的細胞の範囲を広げ、６）ウイルスベクターの作製を簡便かつ効率的とし、７）元来のアデノウイルス自体が有する有用な能力を保持しつつウイルスベクターを作製する、などを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ウイルス粒子の表面に水溶性ポリマーが結合し、かつ、細胞表面に存在するインテグリンに親和性のある外来性ペプチドが当該水溶性ポリマーに結合した構造を有するウイルスベクターが、従来の遺伝子導入用のウイルスベクターが有していた課題を解決し、かつ有用性を保持するのに有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、その第１の態様において、
１）ウイルス粒子表面に水溶性ポリマーが直接または間接的に結合し、かつ標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性を有する外来性ペプチドが当該水溶性ポリマーに結合していることを特徴とするウイルスベクター；
２）前記水溶性ポリマーがリンカーアミノ酸および架橋剤を介してウイルス粒子表面に結合している１）記載のウイルスベクター；
３）前記ウイルスがアデノウイルスである１）または２）記載のウイルスベクター；
４）前記水溶性ポリマーがポリエチレングルコールまたはその誘導体である１）ないし３）いずれか１記載のウイルスベクター；
５）前記ポリエチレングリコールの分子量が３０００〜４０００である４）記載のウイルスベクター；
６）前記リンカーアミノ酸がシステインであって、前記架橋剤がチオール基およびアミノ基に対して結合能を有する架橋剤である２）ないし５）いずれか１記載のウイルスベクター；
７）前記架橋剤がＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）（ＥＭＣＳ）である６）記載のウイルスベクター；
８）前記インテグリンがαＶβ３またはαＶβ５である１）ないし７）いずれか１記載のウイルスベクター；
９）前記外来性ペプチドがアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）を含む配列である１）ないし８）いずれか１記載のウイルスベクター；
１０）前記外来性ペプチドが一つ以上のβアラニンを含む配列である９）記載のウイルスベクター；
１１）前記外来性ペプチドがリジン（Ｋ）を含み、当該リジンを介して分岐していることを特徴とする９）または１０）記載のウイルスベクター；
１２）前記外来性ペプチドがチロシン（Ｙ）−グリシン（Ｇ）−グリシン（Ｇ）−アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）−トレオニン（Ｔ）−プロリン（Ｐ）−βアラニン（Ｘ）−リジン（Ｋ）−βアラニン（Ｘ）−プロリン（Ｐ）−トレオニン（Ｔ）−アスパラギン酸（Ｄ）−グリシン（Ｇ）−アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−グリシン（Ｇ）−チロシン（Ｙ）に示されるアミノ酸配列であることを特徴とする１１）記載のウイルスベクターを提供する。
また、本発明は、その第２の態様において、
１３）１）ないし１２）いずれか１記載のウイルスベクターを用いることを特徴とする遺伝子導入方法を提供する。
さらに、本発明は、その第３の態様において、
１４）ａ）水溶性ポリマーの１の末端にリンカーアミノ酸を結合させて水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸を得；
ｂ）この水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸の水溶性ポリマーに、インテグリンに親和性を有する外来性ペプチドを結合させて外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸を得；
ｃ）得られた外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸のリンカーアミノ酸に架橋剤を結合させ；ついで
ｄ）その架橋剤を介して外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸とウイルスとを結合させる
工程を含むウイルスベクターの作製方法；
１５）ａ）およびｂ）の工程をリンカーアミノ酸を樹脂（Ｒｅｓｉｎ）に結合して行い、その後、生成した外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸を樹脂から切断してｃ）およびｄ）の工程を行う１４）記載のウイルスベクターの作製方法；
１６）前記水溶性ポリマーがポリエチレングルコールまたはその誘導体である１４）または１５）記載のウイルスベクターの作製方法；
１７）前記リンカーアミノ酸がシステインであって、前記架橋剤がチオール基およびアミノ基に対して結合能を有する架橋剤である１４）ないし１６）いずれか１記載のウイルスベクターの作製方法を提供する。
本発明によれば、投与する生体に対して免疫原性が低く、抗原性が低いため中和抗体や貧食細胞による攻撃を受け難くて血中半減期が比較的長く、細胞に対して高効率の遺伝子導入が可能であり、またそれにより肝集積性が低く、さらに、ウイルス元来の有用な能力を低下させることなく簡便かつ効率的に作製でき、長期低温保存後に融解・再凍結を繰り返しても安定な遺伝子導入用ベクターならびに遺伝子導入方法が提供される。
なお、本明細書中にて用いる「ウイルス粒子表面」とは、ウイルスの外殻（カプシド）を構成するヘキソン、ペントンベース、ペントンベース上に突出するファイバーおよびノブのすべての部位をいう。
また、本明細書中にて用いる「外来性ペプチド」とは、人工的にウイルスベクターに付与するペプチドをいう。
また、本明細書中で用いる「インテグリン」とは、細胞外マトリックスとの結合能力を有し、αサブユニットとβサブユニットからなる非共有的に結合した膜貫通型糖タンパク質をいい、当該インテグリンには、細胞外マトリックス成分であるフィブロネクチンに親和性を有するものとしてα４β１、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、αＩＩｂβ３など、ラミニンに親和性を有するものとしてα１β１、α２β１、α３β１、α６β１、α７β１、α６β４、αＶβ８など、ビトロネクチンに親和性を有するものとしてα８β１、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ８、αＩＩｂβ３など、コラーゲンに親和性を有するものとしてα１β１、α２β１、αＶβ８など、ＶＣＡＭ−１に親和性を有するものとしてα４β１、α４β７など、テイネシン−Ｃに親和性を有するものとしてα８β１、α９β１、αＶβ６など、トロンボスポンジンに親和性を有するものとしてα４β１、αＶβ３など、ＩＣＡＭ−１に親和性を有するものとしてαＬβ２、αＭβ２、αＤβ２など、オステオポンチンに親和性を有するものとしてαＶβ３など、フィブリノーゲンに親和性を有するものとしてαＶβ３、αＩＩｂβ３、αＭβ２、αＸβ２など、Ｅ−カドヘリンに親和性を有するものとしてαＥβ７など、フォンビルブラント因子に親和性を有するものとしてαＶβ３、αＩＩｂβ３などが知られており、これらすべてのものが含まれる。
なお、本明細書中でアミノ酸配列を示す場合は、慣用されている一文字表記または三文字表記で表す。

図１は、ヒト肺上皮癌Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１８５、図１Ａ）およびマウスメラノーマＢ１６ＢＬ６細胞（東北大学加齢医学研究所：ＴＫＧ０５９８、図１Ｂ）を用いて行った、対照アデノウイルスベクター、ＰＥＧ−アデノウイルスベクター、ファイバー変異アデノウイルスベクターおよびＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの遺伝子発現効率の比較実験の結果を示すグラフである。
図２は、ヒト肺上皮癌Ａ５４９細胞（図２Ａ）およびマウスメラノーマＢ１６ＢＬ６細胞（図２Ｂ）を用いて行った、対照アデノウイルスベクター、ＰＥＧ−アデノウイルスベクター、ファイバー変異アデノウイルスベクターおよびＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの中和抗体存在下での遺伝子発現効率の比較実験の結果を示すグラフである。
図３は、ヒト肺上皮癌Ａ５４９細胞（図３Ａ）およびマウスメラノーマＢ１６ＢＬ６細胞（図３Ｂ）を用いて行った、対照アデノウイルスベクター、ＰＥＧ−アデノウイルスベクター、ファイバー変異アデノウイルスベクター、およびＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの作製直後と、長期低温保存の後、凍結融解を繰り返した場合との遺伝子発現効率を示すグラフある。

本発明のウイルスベクターに使用できるウイルスとしては、遺伝子導入用のウイルスベクターに用いることが知られているウイルスであれば特に限定されるものではないが、好ましくはアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス、特に好ましくはアデノウイルスが挙げられる。また、遺伝子導入用のウイルスベクターに使用するアデノウイルスとしては、遺伝子工学的に適宜改変されたウイルスも使用できる。例えば、アデノウイルスゲノムのＥ１遺伝子領域やＥ３遺伝子領域を欠損させたアデノウイルス、当該領域に外来遺伝子を挿入したアデノウイルスなどをベクターを作製するためのウイルスとして使用できる。
本発明のウイルスベクターに使用できる水溶性ポリマーとしては、医薬上許容し得る水溶性ポリマーであれば特に限定されるものではないが、分子量３０００〜４０００のポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール、その他、スチレンマレイン酸共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどのポリビニル共重合体などが好ましく、特にポリエチレングルコールが好ましい。また、この水溶性ポリマーには、水溶性ポリマーの末端が保護および／または活性化された誘導体も包含される。水溶性ポリマーの末端が保護されたものはペプチド合成に好適であり、特にＦｍｏｃ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）またはｔ−Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）等で保護されたものを使用するのが好ましい（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社：カタログ番号１Ｐ２Ｚ０Ｆ０２、２Ｚ５３０Ｆ０２）。また、水溶性ポリマーの末端が活性化されたものとしては、アミノ酸の一部（アミノ基、カルボキシル基、チオール基など）と結合する活性基を有しているものが挙げられる。
本発明のウイルスベクターに使用できるインテグリンに親和性を有する外来性ペプチドとしては、インテグリンに対して実質的な親和性を有するペプチドであれば特に限定されるものではないが、フィブロネクチンに存在するＲＧＤ、ＬＤＶ、ＲＥＤＶモチーフ、ラミニンに存在するＲＹＶＶＬＰＲ、ＬＧＴＩＰＧ、ＰＤＳＧＲ、ＹＩＧＳＲ、ＬＲＥ、ＩＫＶＡＶ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ、ＲＧＤモチーフ、ビトロネクチンに存在するＲＧＤモチーフ、コラーゲンに存在するＲＧＤモチーフ、トロンビンに存在するＲＧＤモチーフ、フィブリノーゲンに存在するＧＰＲＰ、ＲＧＤモチーフ、その他インテグリンに親和性があると報告されているＥＩＬＤＶ、ＫＱＡＧＤＶ、ＤＥＧＡモチーフを含むペプチドが好ましい。
上記に示したインテグリン親和性モチーフのうち、特に、フィブロネクチンモチーフ（ＲＧＤ、ＬＤＶ、ＲＥＤＶ）、ラミニンモチーフ（ＲＹＶＶＬＰＲ、ＬＧＴＩＰＧ、ＰＤＳＧＲ、ＹＩＧＳＲ、ＬＲＥ、ＩＫＶＡＶ、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ、ＲＧＤ）、ビトロネクチンモチーフ（ＲＧＤ）を含むペプチドが好ましい。
また、上述のα４β１、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、αＩＩｂβ３（フィブロネクチンに親和性を有するインテグリン）、α１β１、α２β１、α３β１、α６β１、α７β１、α６β４、αＶβ８（ラミニンに親和性を有するインテグリン）、α８β１、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ８、αＩＩｂβ３（ビトロネクチンに親和性を有するインテグリン）に親和性を有するペプチドも本発明のインテグリンに親和性を有する外来性ペプチドとして好適に使用することができる。これらペプチドは、公知のペプチドモチーフ（例えば、α５β１：ＲＧＤ、α２β１：ＤＥＧＡ、α４β１またはα４β７：ＥＩＬＤＶ、α６β１：ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲまたはＩＫＶＡＶ）を含むものを使用してもよく、ファージディスプレイ法によって上記インテグリンに親和性を有するペプチドを探索して得ることもできる。
また、アデノウイルスはＣＡＲに結合した後、αＶβ３またはαＶβ５に結合することが報告されているので、αＶβ３またはαＶβ５に親和性を有するペプチド（例えば、ＲＧＤ、ＬＤＶ、ＲＥＤＶ、ＧＰＲＰなど）を含むペプチドも本発明のインテグリンに親和性を有する外来性ペプチドとして好適に使用できる。
また、上記示したインテグリンに親和性のあるペプチドのアミノ酸配列の片末端または両末端に、適宜アミノ酸などが付与されたペプチド誘導体も、重大な抗原性を示さない限り本発明に利用することができる。
本発明のウイルスベクターは、前記のウイルス、水溶性ポリマーおよび外来性ペプチドを必須の要素として作製し得るが、ウイルス粒子と水溶性ポリマーと外来性ペプチドとの間における各々の要素の結合数、結合部位、結合形式は、本発明の効果を損じない限り特に限定されるものではなく、適宜、下記の方法または自体公知の方法に準じて増減または変更することができる。
簡単には、本発明のウイルスベクターは、（ｉ）水溶性ポリマーの１の末端にリンカーアミノ酸を結合させて水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸を得、（ｉｉ）この水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸の水溶性ポリマーのもう１の末端において、インテグリンに親和性を有する外来性ペプチドをそのカルボキシル末端から順次合成して外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸を得；（ｉｉｉ）得られた外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸のリンカーアミノ酸に架橋剤を結合させ；ついで、（ｉｖ）その架橋剤を介して外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸とウイルスとを結合させる工程によって作製することができる。より簡単には、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とし、また、リンカーアミノ酸をシステインとし、架橋剤をチオール基およびアミノ基に対して結合能を有する架橋剤とすることができる。
詳細に説明すると、標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性の有する外来性ペプチドを合成するには、公知のペプチド合成方法（例えば、固相法など）によって行うことができる。本発明の外来性ペプチドには、標的細胞に存在するインテグリンに親和性のあるアミノ酸配列だけでなく、その他のアミノ酸もスペーサーとして用いることができる。特にインテグリンに親和性のあるアミノ酸配列とＰＥＧとの距離間を広げるためには、これらの間にβアラニンなどのアミノ酸を１ないし数個スペーサーとして挿入するのが好ましい。具体的には、
ＲＧＤ−βＡｌａ−ＰＥＧ
ＲＧＤ−βＡｌａ−βＡｌａ−ＰＥＧ
ＲＧＤＴＰ−βＡｌａ−ＰＥＧ
ＹＧＧＲＧＤＴＰ−βＡｌａ−ＰＥＧ
などの配列が好ましい。
外来性ペプチドを２個以上水溶性ポリマーに付加させたい場合には、アミノ基２個を有するアミノ酸を１個以上含ませて、外来性ペプチドを分岐構造とすることができる。これにより、本発明のウイルスベクターの標的細胞表面に存在するインテグリンへの結合能が増強される。特に本願明細書の実施例に記載のようなインテグリンに親和性のあるアミノ酸配列とＰＥＧとの間にリジンを含ませて外来性ペプチドを分岐構造とすることが好ましい。また、インテグリンに親和性のあるアミノ酸配列とリジンとの距離間を広げるために、これらの間にβアラニンなどのアミノ酸を１ないし数個スペーサーとして挿入するのがさらに好ましい。具体例として

などの分岐構造をもつ外来性ペプチドとするのが好ましい。
標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性を有する外来性ペプチドが結合した水溶性ポリマーをウイルス粒子表面に結合させるためには、当該水溶性ポリマーとウイルス粒子表面を直接結合させることもできるが、当該水溶性ポリマーの片末端に二価性架橋剤（好ましくは、異反応性二価性架橋剤）と結合することのできるアミノ酸（以下、リンカーアミノ酸という）を少なくとも１個付加し、当該リンカーアミノ酸と二価性架橋剤とを結合させた後、二価性架橋剤の一方の端とウイルス粒子表面とを結合させること、すなわち、水溶性ポリマーとウイルス粒子表面との間にリンカーアミノ酸と二価性架橋剤を存在させるのが好ましい。この方法は、標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性のある外来性ペプチドに酸性アミノ酸が含まれる場合に有効である。なぜなら、標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性のある外来性ペプチドが結合した水溶性ポリマーを直接ウイルス粒子表面に結合させる場合には、当該水溶性ポリマーの末端を活性化させる必要があるが、標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性のある外来性ペプチドに酸性アミノ酸が含まれる場合には当該酸性アミノ酸も活性化されてしまい本来の性質が変化してしまうからである。従って、特に標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性のある外来性ペプチドに酸性アミノ酸が含まれる場合には、標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性のある外来性ペプチドが結合した水溶性ポリマーを活性化させることなく、リンカーアミノ酸と二価性架橋剤を用いてウイルス粒子表面に結合させることが好ましい。
このリンカーアミノ酸としては、チオール基を有するシステイン、塩基性アミノ酸であるリジン、中性アミノ酸であるアラニン、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸その他のアミノ酸が使用できるが、好ましくは少なくともシステインを１個含むものが好ましい。
水溶性ポリマーのみをリンカーアミノ酸に結合させる際には、水溶性ポリマーの末端に活性基を付与する必要がある。アミノ酸のアミノ基と結合する活性基としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、スクシンイミジル基、カルボキシル基、アルデヒド基、ベンゾトリアゾール基などが挙げられる。アミノ酸のカルボキシル基と結合する活性基としては、アミノ基などが挙げられる。アミノ酸のチオール基と結合する活性基としては、マレイミド基、ビニルスルホン基などが挙げられる。その中でも、アミノ酸のアミノ基と結合する活性基を有する誘導体を使用するのが好ましく、特に末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド基またはスクシンイミジル基を有する誘導体が好ましい。
架橋剤と水溶性ポリマーの間には、必要に応じてアミノ酸を１ないし数個スペーサーとして挿入することができる。特に本願明細書の実施例に記載のようにβアラニンを挿入することが好ましい。
次に、標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性のある外来性ペプチドが結合した水溶性ポリマーをウイルス粒子表面に結合させるためには、上記リンカーアミノ酸とアミノ基、カルボキシル基、チオール基等に結合できる二価性架橋剤とを使用するのが好ましい。特に、ウイルス粒子表面との結合にはウイルス粒子表面に存在するアミノ基を標的にすることが好ましいため、少なくともアミノ基に対して結合能を有する架橋剤を使用する必要がある。また、リンカーアミノ酸としてシステインを使用した場合には、少なくともチオール基に対して結合能を有する架橋剤を使用する必要がある。
二価性架橋剤には、チオール基およびアミノ基に対して結合能を有する架橋剤（主としてマレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基またはスクシンイミジル基を分子内に持つ）、例えばテクノケミカル（株）より市販されているＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（４−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、ＭＢＳ（ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、ＳＡＴＡ（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓ−ａｃｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＭＣＣ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＳＭＰＢ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ）、ＳＰＤＰ（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｌｏｘｙ）ｓｕｌｃｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６−（３’（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｅ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ（ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−（ｐ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）−ｂｕｔｙｒａｔｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＳＢＥＤ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（２−６−（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）−２−（ｐ−ａｚｉｄｏｂｅｎｚａｍｉｄｏ）−ｈｅｘａｎｏａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ−１，３’−ｄｉｔｈｉｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）などが挙げられる。その他、Ｎ−スクシンイミジル−Ｎ−マレイミドアセテート（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏａｃｅｔａｔｅ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド）ブチレート（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）、Ｎ−スクシミジル−６−（マレイミド）ヘキサノエート（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｍｉｄｙｌ−６−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｍ−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）、Ｎ−スクシンイミジル−ｍ−（Ｎ−マレイミド）ベンゾエート（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｍ−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）なども利用できる。また、二価性架橋剤として、２つのアミノ基に対し結合能を有する架橋剤（主としてＮ−ヒドロキシスクシンイミド基、スクシンイミジル基を分子内に持つ）、例えばテクノケミカル（株）より市販されているＢＳ３（Ｂｉｓ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＤＭＰ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｂｅｒｕｎｕｄａｔｅ）、ＤＭＳ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ）、ＤＳＧ（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｇｌｕｔａｒａｔｅ）、ＤＳＰ（Ｌｏｍａｎ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）、ＤＳＳ（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）、ＤＴＳＳＰ（３，３’−Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ））、ＥＧＳ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ））、Ｓｕｌｆｏ−ＥＧＳ（Ｅｔｈｙｌｅｎ ｇｌｙｃｏｌ ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）などが挙げられる。また、二価性架橋剤として、アミノ基とカルボキシル基に対し結合能を有する架橋剤、例えばテクノケミカル（株）より市販されているＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）などが挙げられる。また、二価性架橋剤として、２つのチオール基に対し結合能を有する架橋剤（主としてマレイミド基を分子内に持つ）、例えばテクノケミカル（株）より市販されているＢＭＨ（ＢｉｓＭａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｅ）が挙げられる。その中でも、標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性のある外来性ペプチドが結合した水溶性ポリマーをウイルス粒子表面に結合させるために使用する二価性架橋剤としては、チオール基およびアミノ基に対して結合能を有する架橋剤（主としてマレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、スクシンイミジル基を分子内に持つ）が好ましい。
好ましい実施形態としては、まず、樹脂にリンカーアミノ酸を結合させ（リンカーアミノ酸−樹脂の形成）、次にリンカーアミノ酸に水溶性ポリマーを結合させ（水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸−樹脂の形成）、その後標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性を有する外来性ペプチドを水溶性ポリマーに結合させる（インテグリン親和性外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸−樹脂の形成）。次に、インテグリン親和性外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸を樹脂から切断し、インテグリン親和性外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸を得る。その後、リンカーアミノ酸に二価性架橋剤を結合させ（インテグリン親和性外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸−二価性架橋剤の形成）、最後にこれをウイルス粒子表面と結合させる（インテグリン親和性外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸−二価性架橋剤−ウイルス粒子の形成）工程が含まれる。この本発明のウイルスベクターの作製方法は、公知のペプチド合成法によって行うことができる。
さらに好ましい実施形態としては、リンカーアミノ酸はシステインを含むものであり、二価性架橋剤がチオール基およびアミノ基に結合能を有する（主としてマレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、スクシンイミジル基を分子内に持つ）ものである。この方法は、標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性のある外来性ペプチドに酸性アミノ酸が含まれる場合に特に有効であるが、酸性アミノ酸が含まれない場合にも使用できる。
なお、水溶性ポリマーに結合する外来性ペプチド配列は、前記のようにウイルスベクターとしての生体の免疫原性を低下させる観点からはできるだけ短い鎖長を有することが好ましい。また、ウイルスベクターとしての標的細胞に対する親和性を高める観点から、外来性ペプチドを１つ以上含めてもよい。外来性ペプチドの鎖長および個数については、ウイルスベクターとしての効果を勘案しつつ適宜調整することができる。さらに、外来性ペプチド中には１種類以上のインテグリン親和性モチーフを含むこともできる。
上述のように作製した本発明のウイルスベクターにおける水溶性ポリマーの修飾率の測定は、水溶性ポリマー−アデノウイルスベクターの残存アミノ基をフルオレスカミン法（エー・クロイル・マリア（Ａ．Ｃｒｏｙｌｅ Ｍａｒｉａ）ら著，「ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」，第１１巻，１７１３−１７２２頁，２０００年）に準じて行うことができる。これにより、当業者であれば遺伝子導入効率において適宜最適の水溶性ポリマー修飾率を決定することができ、これを本発明に応用することができる。具体的には、０．４２ｍｇ／ｍＬのフルオレスカミン／ジオキサン溶液（商品名Ｆｌｕｒａｍ、Ｆｌｕｋａ社製）に対して３倍量の５×１０^１１粒子／ｍＬの水溶性ポリマー−アデノウイルスベクターを添加し、激しく撹拌する。室温で１０分間インキュベート後、蛍光強度（励起波長Ｅｘ：３９２ｎｍ、蛍光波長Ｅｍ：４８０ｎｍ）を測定する。未修飾アデノウイルスベクターで検量線を作製し、水溶性ポリマー−アデノウイルスベクターの水溶性ポリマー修飾率を算出する。
水溶性ポリマー−アデノウイルスベクターの粒子経の測定には、ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ ３０００ＨＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて測定することができる。上記修飾率と同様に、当業者であれば遺伝子導入効率において適宜最適の粒子経を決定し、最適な分子量をもつ水溶性ポリマーを選択することができ、これを本発明に応用することができる。また、本発明者らは水溶性ポリマー−アデノウイルスベクターの水溶性ポリマー修飾率とＺＥＴＡＳＩＺＥＲで測定した平均粒子径は、水溶性ポリマーの添加量、添加回数に相関して増加していることを確認している。従って、アデノウイルスベクターの水溶性ポリマー修飾は、水溶性ポリマーの添加量および添加回数により制御可能である。
ウイルス粒子数の測定はＭａｉｚｅｌらの方法（ジェイ・ブイ・ジュニア・マイゼル（Ｊ．Ｖ．Ｊｒ．Ｍａｉｚｅｌ）ら著，「バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」，第３６巻，１１５−１２５頁，１９６８年）に従って行うことができ、当業者であれば、適宜遺伝子導入の際に使用するウイルス数を決定できる。すなわち、精製したウイルス液を適量とり１％ＳＤＳ／ＰＢＳ（−）で溶解した後、吸光度計によりＯＤ２６０ｎｍで測定する。ウイルス粒子数は１．１×１０^１２粒子／ＯＤ_２６０として換算する。
本発明のウイルスベクターを治療目的に用いる際に対象となる個体としては、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどが挙げられる。また、本発明のウイルスベクターの対象となる投与部位としては、脳、肝臓、腎臓、脾臓、前立腺、小腸、大腸、肺、気管支、皮膚、食道、胃、十二指腸、骨格筋などが挙げられる。また、本発明のウイルスベクターの対象となる細胞としては、生体由来細胞（上皮細胞、筋肉細胞、脳神経細胞など）、ガン細胞、培養細胞などが挙げられる。また、本発明のウイルスベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏにて用いる際に対象となる細胞としては、Ａ５４９細胞、Ｂ１６ＢＬ６細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。また、本発明のウイルスベクターをｅｘ ｖｉｖｏにて用いる際に対象となる細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、ＥＳ細胞などが挙げられる。
インテグリンは種々の部位で発現または生理機能を発揮しているが、少なくとも、α１β１は神経突起、リンパ球、α２β１は血小板、癌細胞、α３β１は腎臓、肺、癌細胞、α４β１はリンパ球、単球、好酸球、α５β１は各種細胞、α６β１は上皮細胞、神経突起、癌細胞、α７β１は骨格筋、α８β１は腎臓、神経細胞、α９β１は気管上皮、αＶβ１は各種細胞、癌細胞、αＶβ３血管、骨、αＶβ５血管、上皮、αＶβ６は上皮、αＶβ８は神経突起、α４β７はリンパ球、α６β４は上皮細胞、αＬβ２は白血球、αＭβ２は好中球、単球、αＸβ２は単球、顆粒球、αＤβ２は泡沫細胞、αＩＩｂβ３は血小板、αＥβ７はリンパ球、にそれぞれ発現しているかまたは生理機能を発揮しているものと考えられるが、これに限定されるものではない。一般的に、α９β１は気管上皮で発現し、β２鎖は白血球の表面に発現しており、αＬβ２はＬＦＡ−１（リンパ球機能付随タンパク）、αＭβ２はＭａｃ−１（マクロファージの表面タンパク）で発現している。また、β３鎖は血小板を含む様々な細胞で発現している。
上記細胞または部位特異的に発現しているインテグリンに対し、親和性のある外来性ペプチドを得（例えばファージディスプレイ法などによってスクリーニングして得る）、当該得られた外来性ペプチドを本発明のウイルスベクターに応用することにより、標的とするインテグリンが発現している細胞または部位に特異的に遺伝子導入する。
本発明のウイルスベクターの投与経路は、ｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、組織や臓器へ局所投与、静脈内投与、経粘膜投与、筋肉内投与、経口投与など適宜選択することができる。
さらに、本発明のウイルスベクターには、ｐ５３遺伝子（癌細胞のアポトーシス誘導）、チミジンキナーゼ遺伝子（癌細胞のアポトーシス誘導）、アデノシンアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子（アデノシンアミナーゼ欠損症）、などの治療用遺伝子を組み込むことが可能である。
アデノウイルス、ＲＧＤ−ＰＥＧ、ＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの混合物から本発明のＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターを単離するには、例えばＣｓＣｌ密度勾配を用いた遠心分離法を用いることができる。また、透析を行うことにより単離することもでき、ＣｓＣｌ密度勾配を用いた超遠心法と透析を組み合わせて単離することもできる。具体的には、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ／Ｐｒｏ ＣＥ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｅｓｔｅｒ）Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｄｉｓｐｏ Ｄｉａｌｙｚｅｒ（ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製、分画分子量（ＭＷＣＯ）；３００，０００）を用いることができる。なお、透析の確認には、ＰＥＧおよびＲＧＤ−ＰＥＧより大きい分子量であるＦＩＴＣ−デキストランが透析膜を通過することを確認することで達成できる。

実施例１ 各種アデノウイルスベクターにおける遺伝子発現効率の比較
本願発明のアデノウイルスベクターの遺伝子発現効率を検討するために、各種アデノウイルスベクターを作製し、比較検討を行った。すなわち、次の１）〜４）に示したように、１）対照としてのアデノウイルスベクター、２）ＰＥＧ−アデノウイルスベクター、３）ファイバー変異アデノウイルスベクター、および４）本願発明のアデノウイルスベクターを作製した。
１）対照アデノウイルスベクターの作製
対照アデノウイルスベクターは、Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉらが作製したベクターを使用した。当該ベクターは、アデノウイルスベクターのＥ１およびＥ３領域が欠損しており、このＥ１欠損領域にルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれているものである。
対照アデノウイルスベクターを増殖させて単離精製するために、まず、このウイルスを５％ウシ胎児血清添加Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社製）とともに添加し２９３細胞に感染させた。約２〜３日後、ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）の確認できた２９３細胞を培養上清とともに回収し、３０００ｒｐｍ、５分間遠心した。次に、得られた細胞を少量の培養液で懸濁し、凍結融解を４回繰り返すことで細胞を破壊し、ウイルスを溶液中に遊離させた。その後、３０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を粗ウイルス溶解液（ＣＶＬ：ｃｒｕｄｅ ｖｉｒｕｓ ｌｙｓａｔｅ）として得た。ＳＷ４１チューブにＣｓＣｌ（比重１．２５／ＴＤ溶液［７５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ＝７．４］）を注ぎ、そしてＣｓＣｌ（比重１．４０／ＴＤ溶液）を下層し密度勾配を作製した。次に、回収した粗ウイルス溶解液を重層しＳＷ４１ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて１８℃、３５０００ｒｐｍ、１時間遠心した（一次遠心）。その後、チューブ内にできた下方の白いバンドを回収し（一次精製）、次に、ＳＷ４１チューブにＣｓＣｌ（比重１．３４／ＴＤ溶液）を注ぎ、一次精製で得られたウイルス液を重層し、同様にＳＷ４１ローターを用いて１８℃、３５０００ｒｐｍ、１８時間遠心した（二次遠心）。その後、二次遠心でチューブ内にできた下方の白いバンドを回収した（二次精製）。ここで得られたウイルス液を透析チューブに回収し、ＰＢＳ（−）に入れ、スターラーで回転させながら４℃で透析を行った。透析液は１時間おきに３回取り替え、最後に１０％のグリセリンを含んだＰＢＳ（−）で２時間以上透析を行った。透析を終了したウイルス液は実験開始時まで−８０℃で保存し、これを対照アデノウイルスベクターとして使用した。以上の操作は無菌的に行った。
２）ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの作製
ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの作製には、上記１）で作製した対照アデノウイルスベクターを使用し、これにメトキシポリエチレングリコール−スクシンイミジルプロピオネート（ｍｅｔｈｏｘｙ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ：ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、分子量５０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社製、カタログ番号：２Ｍ４Ｍ０Ｄ０１）を用いた。
すなわち、１粒子のアデノウイルスベクターの外殻タンパク質（ヘキソン、ペントンベース、ファイバー）に存在する一級アミンに対して、１００倍モル量のｍＰＥＧ−ＳＰＡを１×１０^１２粒子／ｍＬの対照アデノウイルスベクターに添加し、３００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃、１５分間反応させることによりアデノウイルスを結合させ、さらに３０分間同条件下で反応させることにより反応を完了させた。これによりＰＥＧが結合したアデノウイルスベクター（ＰＥＧ−アデノウイルスベクター）を得た。
３）ファイバー変異アデノウイルスベクターの作製
アデノウイルスファイバーのノブに存在するアミノ酸配列の一部をアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）なるペプチドに遺伝子工学的に変異させたファイバー変異アデノウイルスベクターは、Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉらが作製したベクターを使用した（エイチ，ミズグチ（Ｈ．Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ）ら著，「ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）」，第８巻，７３０−７３５頁，２００１年参照）。当該ベクターはアデノウイルスベクターのＥ１領域およびＥ３領域が欠損しており、このＥ１欠損領域にルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれており、ＣＡＲ非発現細胞に対してもインテグリンを介して結合し、効率よく遺伝子導入できる特徴を有するものである。なお、ファイバー変異アデノウイルスベクターの増殖および単離精製は上記１）と同様に行った（エイチ，ミズグチ（Ｈ．Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ）ら著，「ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．）」，第８巻，７３０−７３５頁，２００１年参照）。
ファイバー部のＨＩループをコードしている遺伝子配列部分をＣｓｐ４５１とＣｌａＩ部位をもったベクタープラスミドｐＡｄＨＭ１５を両制限酵素で切断し、アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）配列に相当する合成オリゴＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏライゲーションで導入した。その後、ルシフェラーゼ遺伝子をＥ１欠損部位に挿入した。生じたプラスミドをＰａｃＩで切断し、２９３細胞にトランスフェクションし、アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）配列をファイバーに有するルシフェラーゼ発現アデノウイルスベクターを得た。
４）アデノウイルスベクター（ＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクター）の 作製
本発明の１の実施態様において、アデノウイルスベクターの作製方法を下記の反応チャートに参照して説明する。
４−１）Ｆｍｏｃ−Ｋ（Ｆｍｏｃ）−ＰＥＧ−βＡＣ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎ（化合物ｄ）の合成
インテグリンに親和性を有するアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）の３アミノ酸を含む（Ａｃ−ＹＧＧＲＧＤＴＰβＡ）_２Ｋ−ＰＥＧ−βＡＣ−ａｍｉｄｅ（化合物ｆ）の合成を行うために、まず、Ｆｍｏｃ−Ｋ（Ｆｍｏｃ）−ＰＥＧ−βＡＣ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎ（下記反応チャート、化合物ｄ）を合成した。ここで、リンカーアミノ酸として使用するシステイン（Ｃｙｓ）はＳＨ基と特異的に結合する異反応性二価性試薬であるマレイミド体との結合に重要である。また、リンカーアミノ酸とＰＥＧとの間に存在するβアラニン（βＡｌａ）は、反応を進行させやすくするためのスペーサとして用いている。アミノ基を２個有するリジン（Ｌｙｓ）は、インテグリンへの親和性を高める目的でＰＥＧ１分子当りに２個のＲＧＤ配列を結合させるために導入した。
合成は保護基としてＦｍｏｃを用いた固相法に準じて行った。すなわち、Ｆｍｏｃ−Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎ（官能基含量０．６６ｍｍｏｌ／ｇ）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１．５ｇ（１．０ｍｍｏｌ相当）秤取してプロピレン製反応容器（国産化学株式会社製）に入れてシェーカー（ＩＫＡ社製、ＶＩＢＲＡＸ ＶＸＲ）にセットし、これにジクロルメタン（ＤＣＭ）を加えて膨潤させた。２０％−ピペリジン／ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）でＦｍｏｃ基を除去し、ＤＭＦで洗浄した後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを１ｍｏｌ／Ｌ−ＤＩＰＣ／ＤＭＦ（ＤＩＰＣ＝ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）と１ｍｏｌ／Ｌ−ＨＯＢｔ／ＤＭＦ（ＨＯＢｔ＝Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）でカルボン酸を活性化させてから樹脂に加えて縮合させた（化合物ａ）。以後、固相上でのＦｍｏｃ保護基の除去（脱保護）、すなわちアミノ基の遊離 → ＤＭＦ洗浄 → Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体と各ステップに適切な縮合反応試薬によるＨＯＢｔの活性エステルによる遊離アミノ基との反応〈カップリング〉 → ＤＭＦ洗浄、の操作を繰り返して縮合反応を進めた。同様にピペリジンによるＦｍｏｃ基の除去〈脱保護〉およびＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨとの縮合（化合物ｂ）を行い、その後脱保護を行ってＨ−βＡｌａ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎを得た。次に、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社製、カタログ番号１Ｐ２Ｚ０Ｆ０２、分子量３４００）との反応は、反応活性体であるこのＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳのみでは反応の進行が非常に遅いため、ＤＩＥＡ（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）存在下、０．４５ｍｏｌ／Ｌ−ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＭＦ（ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３，−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を縮合試薬として反応させた（化合物ｃ）。ピペリジンによる脱保護後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨとの反応は、前述の１ｍｏｌ／Ｌ−ＤＩＰＣ／ＤＭＦと１ｍｏｌ／Ｌ−ＨＯＢｔ／ＤＭＦを用いて行い、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＰＥＧ−βＡｌａ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎ（化合物ｄ（ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎ））を得た。
４−２）〔Ａｃ−Ｙ（Ｂｕ^ｔ）ＧＧＲ（Ｐｍｃ）ＧＤ（ＯＢｕ^ｔ）Ｔ（Ｂｕ^ｔ）ＰβＡ〕_２Ｋ−ＰＥＧ−βＡＣ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎ（化合物ｅ）の合成
次に、実施例１の４−１）にて作製したＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＰＥＧ−βＡｌａ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎ（化合物ｄ）について、ペプチド合成機（機種名：ＡＢＩ４３３Ａ、合成プログラム：ＦａｓｔＭｏｃ０．２５ΩＭｏｎＰｒｅｖＰｋ）を用いて、Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｕ^ｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕ^ｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕ^ｔ）−ＯＨを順次使用し、脱保護と縮合を繰り返してペプチド伸長を行った。ここで、ＲＧＤとＰＥＧとの間に存在するβアラニンは、反応を進行させやすくするためのスペーサとして用いている。
その結果、（Ｆｍｏｃ−Ｙ（Ｂｕ^ｔ）ＧＧＲ（Ｐｍｃ）ＧＤ（ＯＢｕ^ｔ）Ｔ（Ｂｕ^ｔ）ＰβＡ）_２Ｋ−ＰＥＧ−βＡＣ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎを合成した。次いで、実施例１の４−４）に示したＥＭＣＳがアデノウイルス粒子表面に存在する一級アミンのみに反応するように、ＲＧＤ配列を含む外来性ペプチドのＮ末端遊離アミノ基をアセチル化して塞いだ。すなわち、脱保護後のＤＩＥＡ存在下、無水酢酸との反応により、遊離のアミノ基をアセチル化し、〔Ａｃ−Ｙ（Ｂｕ^ｔ）ＧＧＲ（Ｐｍｃ）ＧＤ（ＯＢｕ^ｔ）Ｔ（Ｂｕ^ｔ）ＰβＡ〕_２Ｋ−ＰＥＧ−βＡＣ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎ（化合物ｅ（ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎ））を得た。
４−３）〔Ａｃ−Ｙ（Ｂｕ^ｔ）ＧＧＲ（Ｐｍｃ）ＧＤ（ＯＢｕ^ｔ）Ｔ（Ｂｕ^ｔ）ＰβＡ〕_２Ｋ−ＰＥＧ−βＡＣ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ（化合物ｆ（ＲＧＤ−ＰＥＧ））の単離と精製
実施例１の４−２）によって得られた〔Ａｃ−Ｙ（Ｂｕ^ｔ）ＧＧＲ（Ｐｍｃ）ＧＤ（ＯＢｕ^ｔ）Ｔ（Ｂｕ^ｔ）ＰβＡ〕_２Ｋ−ＰＥＧ−βＡＣ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ Ｒｅｓｉｎ（化合物ｅ（ＲＧＤ−ＰＥＧ−Ｒｅｓｉｎ））中の〔Ａｃ−Ｙ（Ｂｕ^ｔ）ＧＧＲ（Ｐｍｃ）ＧＤ（ＯＢｕ^ｔ）Ｔ（Ｂｕ^ｔ）ＰβＡ〕_２Ｋ−ＰＥＧ−βＡＣ（Ｔｒｔ）−Ａｍｉｄｅ（化合物ｆ（ＲＧＤ−ＰＥＧ））をＲｅｓｉｎから単離した。すなわち、トリフルオロ酢酸：ＴＩＰＳ（ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｓｉｌａｎ）：水＝９０：５：５の組成より成るカクテルを用いた処理によりＲＧＤ−ＰＥＧを樹脂から切り離し、溶媒留去後に凍結乾燥することにより粗化合物ｆ（化合物ｆ（ＲＧＤ−ＰＥＧ））を得た。次に、粗化合物ｆの精製を行うために、当該試料２０ｍｇを１ｍＬの１０％アセトニトリル／超純水に溶解し、遠心分離し、その上清をＨＰＬＣに供した（分取カラム：ＤＡＩＳＯＰＡＫ ＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−Ｂ、２０×２５０ｍｍ、流速：１０ｍＬ／分、移動相Ａ：０．０１％−トリフルオロ酢酸／アセトニトリル、移動相Ｂ：０．０１％−トリフルオロ酢酸／超純水、濃度勾配：６０分間でＡ／Ｂ＝１／９〜Ａ／Ｂ＝７／３のリニアグラディエント）。リテンションタイム４５〜６０分の分画を収集し、エバポレーターにて溶媒留去、凍結乾燥を行い純化合物ｆ（化合物ｆ（ＲＧＤ−ＰＥＧ））を得た。
４−４）化合物ｆとＥＭＣＳ（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）との架橋
実施例１の４−３）で得られた純化合物ｆ（ＲＧＤ−ＰＥＧ）とウイルス粒子表面とを結合させるために、アミノ基とＳＨ基との架橋反応が可能な異反応性二価性試薬であるＥＭＣＳを用いて純化合物ｆ（ＲＧＤ−ＰＥＧ）を修飾した。なお、ＥＭＣＳはマレイミド基とＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを分子の両端に持ち、アミノ基に対しては活性エステルが反応し、ＳＨ基に対してはマレイミド基が選択的に反応することが知られている。
まず、純化合物ｆ（ＲＧＤ−ＰＥＧ）を１０ｍｍｏｌ／Ｌ−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、ＥＭＣＳをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した溶液を滴下した。室温下３０分間反応の後、１０ｍｍｏｌ／Ｌ−リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を加えて次の使用まで凍結保存し、ＥＭＣＳで修飾された化合物ｇ（ＲＤＧ−ＰＥＧ）を得た。
４−５）ＲＤＧ−ＰＥＧとアデノウイルスベクターとの結合
実施例１の４−４）で得た化合物ｇ（ＲＤＧ−ＰＥＧ）を、実施例１−１）で作製したアデノウイルスベクターに結合させた。すなわち、１粒子のアデノウイルスベクターの外殻タンパク質（ヘキソン、ペントンベース、ファイバー）に存在する一級アミンに対して、２５０倍モル量の化合物ｇ（ＲＤＧ−ＰＥＧ）を１×１０^１２粒子／ｍＬのアデノウイルスベクターに添加し、３００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃、１５分間反応させることによりアデノウイルスを結合させ、さらに３０分間同条件下で反応させることにより反応を完了させた。これにより化合物ｇが結合したアデノウイルスベクター（ＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクター）を得た。

５）遺伝子発現効率の比較実験
上記実施例１の１）〜４）にて作製した、対照アデノウイルスベクター、ＰＥＧ−アデノウイルスベクター、ファイバー変異アデノウイルスベクターおよびＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの遺伝子発現効率の比較実験を行った。
実験は、ＣＡＲ高発現細胞であるヒト肺上皮癌Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１８５、図１Ａ）およびＣＡＲ低発現細胞であるマウスメラノーマＢ１６ＢＬ６細胞（東北大学加齢医学研究所：ＴＫＧ０５９８、図１Ｂ）を用いて行った。Ａ５４９細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで継代培養し、サブコンフレント状態のものを実験に供した。また、Ｂ１６ＢＬ６細胞は、７．５％ウシ胎児血清を含むＥａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社製）で継代培養し、サブコンフレント状態のものを実験に供した。
４８穴プレートにＡ５４９細胞およびＢ１６ＢＬ６細胞を２×１０^４細胞／０．５ｍＬ／ウェルで播種し、２４時間培養した。それぞれの細胞の培地で調製した各ベクターをそれぞれ３００、１０００、３０００、１００００粒子／細胞／０．５ｍＬでウェルに加え、３７℃、飽和蒸気圧、５％ＣＯ_２条件下２４時間培養した。
また、ウイルスベクターの遺伝子発現効率の指標としてのルシフェラーゼ活性の測定は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１００μＬで細胞を溶解させた後、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、Ｍｉｃｒｏｌｕｍａｔ Ｐｌｕｓ ＬＢ９６（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて測定した。活性は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＲＬＵ（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ）／ｗｅｌｌ）として表した。
その結果を、各細胞当りのウイルス粒子を変化させた場合のルシフェラーゼ活性の変化として図１に示す。ＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターは、ＣＡＲ高発現細胞であるＡ５４９細胞に対してＰＥＧ−アデノウイルスベクターより数百倍高い遺伝子発現を示し、対照アデノウイルスベクターと同等の遺伝子発現を示した。また、対照アデノウイルスベクターにおいて遺伝子導入効率の低いＣＡＲ低発現細胞であるＢ１６ＢＬ６細胞に対して、ＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターは対照アデノウイルスベクターより百倍以上高い遺伝子発現を示した。しかもその発現は、アデノウイルス粒子表面から突出しているファイバーにＲＧＤ配列を挿入することでＣＡＲ低発現細胞に対しても高い遺伝子発現が可能となったファイバー変異アデノウイルスベクターと同等であった。
このことから、ＰＥＧ−アデノウイルスベクターのＰＥＧに、ＲＧＤをはじめとするインテグリン親和性外来性ペプチドを付与することで、標的細胞に接着し効率よく遺伝子導入を行うことができ、さらに導入された遺伝子も効率よく発現することが判明した。
ファイバー変異アデノウイルスベクターは、ＲＧＤを自身のファイバーに組み込んであるために、対照アデノウイルスベクターのウイルス粒子径およびウイルス質量とほぼ同等であると考えられる。一方、ＰＥＧ−アデノウイルスベクターはファイバー変異アデノウイルスベクターおよび対照アデノウイルスベクターと比較して、ウイルス粒子径およびウイルス質量共に格段に大きいと言える。本発明のＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターは、分子量３４００のＰＥＧを用い、かつインテグリン親和性外来性ペプチドであるＲＧＤを付与している分、ＰＥＧの分子量が２０００であるＰＥＧ−アデノウイルスベクターと比較して、ウイルス粒子経およびウイルス質量は共にさらに大きいと言える。一般的に、本発明のＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの様な巨大構造を有するものは、たとえ当該構造の中にインテグリンに親和性のあるペプチドを有していたとしても、ウイルスベクターとしてインテグリンに結合する能力が弱くなり、その結果、ファイバー変異アデノウイルスベクターよりも遺伝子導入効率が低下することが予想される。しかしながら、本実施例の結果、当該巨大構造を有するＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターは、ファイバー変異アデノウイルスベクターと同等に効率よく遺伝子導入できたことから、高いインテグリン親和性を保持していると考えられる。わずかアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）の３アミノ酸のみでファイバー変異アデノウイルスベクターと同等の遺伝子導入効率が示されたことは、全く予想し得なかった結果である。
この結果により、インテグリンに親和性を有するペプチドを水溶性ポリマーに結合させることにより、水溶性ポリマーが多数結合し巨大構造化したウイルスベクターにおいても、効率よく遺伝子導入できることが証明された。
また、アデノウイルスは細胞表面に存在するＣＡＲに結合した後、ペントンベースに存在するＲＧＤがαＶβ３、αＶβ５に結合することが知られているので、本発明のＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの結合にもインテグリン、特にαＶβ３、αＶβ５が関与しているものと考えられる。
実施例２ 中和抗体存在下での各種アデノウイルスベクターにおける遺伝子発現効率の比較実験
上記実施例１の１）〜４）にて作製した、対照アデノウイルスベクター、ＰＥＧ−アデノウイルスベクター、ファイバー変異アデノウイルスベクターおよびＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの中和抗体存在下での遺伝子発現効率の比較実験を行った。
実験は、ＣＡＲ高発現細胞であるヒト肺上皮癌Ａ５４９細胞（図２Ａ）およびＣＡＲ低発現細胞であるマウスメラノーマＢ１６ＢＬ６細胞（図２Ｂ）を用いて行った。Ａ５４９細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで継代培養し、サブコンフレント状態のものを実験に供した。また、Ｂ１６ＢＬ６細胞は、７．５％ウシ胎児血清を含むＥａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社製）で継代培養し、サブコンフレント状態のものを実験に供した。
４８穴プレートにＡ５４９細胞、Ｂ１６ＢＬ６細胞を１×１０^４細胞／０．５ｍＬ／ウェルで播種し、２４時間培養した。抗アデノウイルスベクター抗体を含むＩＣＲマウス血清存在下および非存在下において、それぞれの細胞の培地で調整した各ベクターをそれぞれ１０００粒子／細胞／０．５ｍＬでウェルに加え、３７℃、飽和蒸気圧、５％ＣＯ_２条件下２４時間培養した。なお、ルシフェラーゼ活性の測定は実施例１の５）に準じて行った。また、ＩＣＲマウス血清は、対照アデノウイルスベクターをＩＣＲマウスに約１０^１０粒子／マウスで３回投与して作製した。
その結果を、抗アデノウイルス血清の希釈率を変化させた場合のルシフェラーゼ活性の変化として図２に示す。ＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターは、ＣＡＲ高発現細胞および低発現細胞の両方に対して抗アデノウイルスベクター抗体存在下で、対照アデノウイルスベクターおよびファイバー変異アデノウイルスベクターを遙かに越える高い遺伝子発現を保持していた。例えば、Ａ５４９細胞では、各ベクターの抗体非存在下における遺伝子発現を１００％とした場合、抗血清１／１００００希釈存在下では、対照アデノウイルスベクターおよびファイバー変異アデノウイルスベクターの遺伝子発現はそれぞれ２４％および４２％にまで減少しているが、ＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターでは、１００％の遺伝子発現を保持していた。
Ｂ１６ＢＬ６細胞では、抗血清１／１００００および１／３０００希釈存在下において対照アデノウイルスベクター、ＰＥＧ−アデノウイルスベクターおよびファイバー変異アデノウイルスベクターのいずれの遺伝子発現も著しく低下しているが、ＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターはその他のベクターを遙かに越える高い遺伝子発現を示した。従って、ＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターは他のベクターと比較して、中和抗体の影響を受けにくく、標的細胞に遺伝子導入しやすいことが明らかとなった。
このことから、本発明のＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターは、ファイバー変異アデノウイルスベクターより優れた遺伝子導入ベクターになり得ることが判明し、かつ、ＰＥＧを介してインテグリン親和性外来性ペプチドであるＲＧＤを付与することで、ＰＥＧの利点を保持しつつ標的細胞に接着し、それに続く遺伝子導入および遺伝子発現を効率よく達成できることが判明した。
従って、ＲＧＤをはじめとするインテグリン親和性外来性ペプチドを付与したＰＥＧ−アデノウイルスベクターはファイバー変異アデノウイルスベクターのような高い遺伝子導入および発現能を備え、さらにＰＥＧ−アデノウイルスベクターが有する抗体回避能を有していることが判明した。
実施例３ −８０℃で１ヶ月間保存後、凍結融解を繰り返した各種アデノウイルスベクターにおける遺伝子発現効率の比較実験
上記実施例１の１）−４）にて作製した対照アデノウイルスベクター、ＰＥＧ−アデノウイルスベクター、ファイバー変異アデノウイルスベクター、およびＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターをそれぞれリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に−８０℃で１ヶ月間保存した。その後、各種アデノウイルスベクターを室温で融解、−８０℃で凍結のステップを５回繰り返した後に、各々の遺伝子発現効率の比較実験を行った。
実験は、ＣＡＲ高発現細胞であるヒト肺上皮癌Ａ５４９細胞（図３Ａ）、およびＣＡＲ低発現細胞であるマウスメラノーマＢ１６ＢＬ６細胞（図３Ｂ）を用いて行った。Ａ５４９細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで継代培養し、サブコンフレント状態のものを実験に供した。また、Ｂ１６ＢＬ６細胞は、７．５％ウシ胎児血清を含むＥａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社製）で継代培養し、サブコンフレント状態のものを実験に供した。
４８穴プレートにＡ５４９細胞、およびＢ１６ＢＬ６細胞を２×１０^４細胞／０．５ｍＬ／ウェルで播種し、２４時間培養した。それぞれの細胞の培地で調整した各ベクターをそれぞれ３０００粒子／細胞／０．５ｍＬでウェルに加え、３７℃、飽和蒸気圧、５％ＣＯ_２条件下２４時間培養した。
なお、各種アデノウイルスベクターによる遺伝子発現効率の指標としてのルシフェラーゼ活性測定は、実施例１の５）に準じて行った。
その結果を、各種アデノウイルスベクターの作製直後、および長期低温保存し、凍結融解後の遺伝子発現として図３に示す。
まず、Ａ５４９細胞における、作製直後のＰＥＧ−アデノウイルスベクターは実施例１の５）と同様にその他のベクターと比較して低い遺伝子発現効率となっていることが確認できた。また、１ヶ月保存後、凍結融解を５回繰り返した対照アデノウイルスベクター、ＰＥＧ−アデノウイルスベクター、ファイバー変異アデノウイルスベクター、およびＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターは作製時とほぼ同等の遺伝子発現を保持していた。
次に、Ｂ１６ＢＬ６細胞における、作製直後のＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの遺伝子発現は、実施例１の５）と同様に対照アデノウイルスベクターより約１００倍高く、ファイバー変異アデノウイルスベクターと同等であることが確認できた。また、１ヶ月保存後、凍結融解を５回繰り返した場合もＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターは、作製時とほぼ同等の遺伝子発現を保持していた。
このことから、本発明のＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターの遺伝子発現は、長期低温保存後、凍結融解を繰り返した場合であっても、十分保持されており、安定性が高いと言える。
一般的に、本発明のＲＧＤ−ＰＥＧのような巨大な構造をアデノウイルスベクター表面に付与した場合、ＲＧＤとアデノウイルスベクターとが架橋剤、システイン、ＰＥＧ、リジン、およびβアラニンを介して結合することとなり、安定性が低いと予想される。しかしながら、本実施例の結果、長期低温保存後、凍結融解を繰り返した場合においても本発明のＲＧＤ−ＰＥＧ−アデノウイルスベクターは、優れた遺伝子発現効率を保持していた。ＲＧＤ−ＰＥＧのような巨大構造をもつアデノウイルスベクターの安定性が長期低温保存後、凍結融解を繰り返した場合においても十分保持されていたのは、予想外の結果であった。

産業上の利用の可能性

本発明によれば、投与する生体に対して免疫原性が低く、抗原性が低いため中和抗体や貧食細胞による攻撃を受け難くて血中半減期が比較的長く、広範な細胞に対して高効率の遺伝子導入が可能であり、またそれにより肝集積性が低く、さらに、ウイルス元来の有用な能力を低下させることなく簡便かつ効率的に作製でき、長期低温保存後に融解・再凍結を繰り返しても安定な遺伝子導入用ベクターならびに遺伝子導入方法が提供される。

Claims (13)

1. ウイルス粒子表面に水溶性ポリマーがリンカーアミノ酸および架橋剤を介して結合し、かつ標的細胞表面に存在するインテグリンに親和性を有する外来性ペプチドが当該水溶性ポリマーに結合しており、ここに該外来性ペプチドが、リジンと、該リジン中の２個のアミノ基を介して各々結合した２個のアルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）を含むペプチドとを含むことを特徴とするウイルスベクター。
2. 前記ウイルスがアデノウイルスである請求項１記載のウイルスベクター。
3. 前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである請求項１または２記載のウイルスベクター。
4. 前記ポリエチレングリコールの分子量が３０００〜４０００である請求項３記載のウイルスベクター。
5. 前記リンカーアミノ酸がシステインであって、前記架橋剤がチオール基およびアミノ基に対して結合能を有する架橋剤である請求項１ないし４いずれか１項記載のウイルスベクター。
6. 前記架橋剤がＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide）（ＥＭＣＳ）である請求項５記載のウイルスベクター。
7. 前記インテグリンがαＶβ３またはαＶβ５である請求項１ないし６いずれか１項記載のウイルスベクター。
8. 前記外来性ペプチドが１ないし数個のβアラニンを含むペプチドである請求項１ないし７いずれか１項記載のウイルスベクター。
9. 前記外来性ペプチドがチロシン（Ｙ）−グリシン（Ｇ）−グリシン（Ｇ）−アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）−トレオニン（Ｔ）−プロリン（Ｐ）−βアラニン（Ｘ）−リジン（Ｋ）−βアラニン（Ｘ）−プロリン（Ｐ）−トレオニン（Ｔ）−アスパラギン酸（Ｄ）−グリシン（Ｇ）−アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−グリシン（Ｇ）−チロシン（Ｙ）で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１ないし８のいずれか１項記載のウイルスベクター。
10. １）水溶性ポリマーの１の末端にリンカーアミノ酸を結合させて水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸を得；
    ２）この水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸の水溶性ポリマーに、チロシン（Ｙ）−グリシン（Ｇ）−グリシン（Ｇ）−アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−アスパラギン酸（Ｄ）−トレオニン（Ｔ）−プロリン（Ｐ）−βアラニン（Ｘ）−リジン（Ｋ）−βアラニン（Ｘ）−プロリン（Ｐ）−トレオニン（Ｔ）−アスパラギン酸（Ｄ）−グリシン（Ｇ）−アルギニン（Ｒ）−グリシン（Ｇ）−グリシン（Ｇ）−チロシン（Ｙ）で示されるアミノ酸配列を有する外来性ペプチドを結合させて外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸を得；
    ３）得られた外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸のリンカーアミノ酸に架橋剤を結合させ；ついで
    ４）その架橋剤を介して外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸とウイルスとを結合させる
    工程を含むウイルスベクターの作製方法。
11. １）および２）の工程をリンカーアミノ酸を樹脂（Resin）に結合して行い、その後、生成した外来性ペプチド−水溶性ポリマー−リンカーアミノ酸を樹脂から切断して３）および４）の工程を行う請求項１０記載のウイルスベクターの作製方法。
12. 前記水溶性ポリマーがポリエチレングリコールである請求項１０または１１記載のウイルスベクターの作製方法。
13. 前記リンカーアミノ酸がシステインであって、前記架橋剤がチオール基およびアミノ基に対して結合能を有する架橋剤である請求項１０ないし１２いずれか１項記載のウイルスベクターの作製方法。

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