JP2003503370A - 核酸を細胞に導入するための配合剤 - Google Patents
核酸を細胞に導入するための配合剤Info
- Publication number
- JP2003503370A JP2003503370A JP2001506715A JP2001506715A JP2003503370A JP 2003503370 A JP2003503370 A JP 2003503370A JP 2001506715 A JP2001506715 A JP 2001506715A JP 2001506715 A JP2001506715 A JP 2001506715A JP 2003503370 A JP2003503370 A JP 2003503370A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- peptide
- copolymer
- sponge
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
- A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
- A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
- A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
- A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
- A61K47/6937—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol the polymer being PLGA, PLA or polyglycolic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
- C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
- C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
- C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
- C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
- C08G65/333—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen
- C08G65/33396—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing nitrogen having oxygen in addition to nitrogen
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
複合体との配合剤に関する。
ターを使用できることが必須である。しかし、体細胞遺伝子治療をねらいとした
全身適用の場合、既知の遺伝子移入媒体のほとんどが、なおも問題を有する。
問題を解決すべきである:1)生体での適用部位から標的細胞への移入すべき物
質(例えば、プラスミドDNA、オリゴヌクレオチド)の移入(細胞外局面)、お
よび2)細胞表面から細胞質または核への移入すべき物質の移入(細胞局面)。
受容体によって媒介される遺伝子移入に関する本質的な前提条件は、ウイルスの
大きさを有する粒子にDNAを圧縮して、細胞におけるエンドサイトーシスによる
取り込み後に内部小胞からDNAを放出することである。この前提は、DNAを、その
化学的特性によって細胞でのエンドサイトーシスによる取り込み後に内部小胞(
エンドソーム、ライソゾーム)からDNA複合体が確実に放出される特異的陽イオ
ンポリマーと共にDNAを圧縮することによって満たされる(ボーシフ(Boussif)
ら、1995;フェラーリ(Ferrari)ら、1997;ヘーンスラーおよびスゾカ(Haens
ler & Szoka)、1993;タン(Tang)ら、1996)。そのような作用はまた、pH依
存的膜破壊ペプチドをDNA複合体に組み込むことによって得られる(プランク(P
lank)ら、1994;国際公開公報第93/07283号)。DNA複合体の適した組成物を用
いて、特異的取り込みおよび細胞への有効な遺伝子移入は、受容体リガンド相互
作用によって得ることができる(カーチェイス(Kircheis)ら、1997;ザンタ(
Zanta)ら、1997)。陽イオン性ペプチドとのDNAの複合体も同様に、受容体によ
って媒介される遺伝子移入に特に適している(ゴッツチョーク(Gottschalk)ら
、1996;ワドワ(Wadhwa)ら、1997;プランク(Plank)ら、1999)。
って、非ウイルスベクターに関して得ることができる有望な研究知見を臨床的に
実践に移すことはより難しい。この問題の一つの理由は、全身適用(例えば、オ
プソニン化、血清蛋白質の接着)の際に血液および組織成分と強く相互作用する
という非ウイルス遺伝子移入ベクターの物理化学的性質であり、そのために特定
の標的細胞に向けられた受容体媒介遺伝子移入は特に制限される。ポリ(エチレ
ングリコール)によってDNA複合体表面を改変すると、その血液蛋白質との結合
特徴をかなり減少させることが示されている(プランク(Plank)ら、1996;オ
グリス(Ogris)、1998;国際公開公報第98/59064号)。非ウイルスベクターを
用いるもう一つの制限は、インビボでのDNA複合体の不十分な溶解性(または安
定性)である。既知の方法では、DNA複合体は生理食塩液濃度で凝集し、溶液か
ら沈殿するために、十分に高い(例えば、1 mg/ml)濃度で静脈内に使用するた
めにDNAをポリカチオンと複合体を形成させることはこれまで不可能であった。
な」薬剤の分野において、生物学的に分解可能な合成ポリマーは、生物において
確実により長く保持され、標的臓器において所望の生物学的利用率が得られる剤
形で薬剤を包装するために用いられる(「徐放性」)。この目的のため、ポリエ
チレングリコールによるコロイド粒子表面の改変は、望ましくないオプソニン化
が抑制されるように形成される。多数の医学適用において用いられる生物学的に
分解可能なポリマーの合成および特徴付けに関しては、十分な文献がある(クー
ムス(Coombes)ら、1997)。物質と適用に応じて、ポリマーのバックボーンに
おける化学的結合は変化する。生理的環境における望ましい不安定性は、エステ
ル結合、アミド結合、ペプチド結合またはウレタン結合を適切に配置することに
よって得ることができ、それによって酵素の作用に対する感受性を意図的に変化
させることができる。組み合わせ合成原理は、生物学的に有効な物質の迅速かつ
効率的な合成にとって有効であることが証明されている(バルクレンホール(Ba
lklenhohl)ら、1996)。ごく少数のパラメータを系統的に変化させることによ
って、所望の基本構造を有する多くの化合物を得ることができる(ブロッキーニ
(Brocchini)ら、1997)。適した意味のある生物学的選択系を用いて、所望の
特徴を有する化合物を、この化合物プールから選択することが可能である。
側鎖に共有結合している、酸化ポリアルキレンと官能基を有するアルカンとの交
互の単位からなるポリマーが記載されている。
なっている。
ビボでの遺伝子移入に適しており、二級および三級アミノ基を有するポリマーと
の複合体はまた、固有のエンドソーム溶解活性を有し、これによって効率的な遺
伝子移入を得ることができる(ボーシフ(Boussif)ら、1995;タン(Tang)ら
、1996)。
的な結合にとって、および特定のDNA複合体の形成にとって適している(プラン
ク(Plank)ら、1999)。
化する(プランク(Plank)ら、1996)。
よる改変によって減少または阻害しうる;これはまた、ポリカチオンDNA複合体
にも当てはまる(プランク(Plank)ら、1996;オグリス(Ogris)ら、1999)。
新しい改善された非ウイルス遺伝子移入系を提供することであった。
複合体を物理的に安定化させ、それらをオプソニン化から保護する荷電ポリマー
によってコーティングすると仮定した。
る。
、 式中Xは、 i)アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体、ペプチドもしくはペプチド誘導体、また
はスペルミンもしくはスペルミジン誘導体である;または ii)式中、Xは
ある;ならびに b、c、およびdは、同じまたは異なる、選択的にハロゲンもしくはジアルキルア
ミノ置換C1〜C6アルキレンである;または iii)式中、Xは、
ある;ならびに bおよびcは同じまたは異なり、選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換
C1〜C6アルキレンである;または iv)式中、 Xは官能基三つW1Y1Z1を有する置換芳香族化合物であり、式中W、YおよびZは、以
下に示す意味を有する; 式中 W、YまたはZは、同じまたは異なる置換基CO、NH、OもしくはS、またはSH、OH、N
H、またはNH2と反応することができるリンカーであり;および イフェクター分子Eは、 陽イオン性もしくは陰イオン性ペプチドまたはペプチド誘導体、スペルミンもし
くはスペルミジン誘導体、グリコサミノグリカン、または非ペプチド性オリゴ/
ポリカチオンもしくはポリアニオンである; 式中、 mおよびnは独立して互いに0、1、または2である; 式中 pは好ましくは3〜20であり;および lは1〜5であり、好ましくは1である。 lが>1である場合、X-Zm-En部分は同じまたは異なる。
は二環式芳香族炭化水素基であり、これは、上記の置換基を別にして、選択的に
一つまたはそれ以上のさらなる置換基、好ましくはC1〜C6-アルキル、-O-(C1〜C 6 -アルキル)、ハロゲン、好ましくはフッ素、塩素、または臭素、シアノ、ニト
ロ、アミノ、モノ-(C1〜C6-アルキル)アミノ、ジ-(C1〜C6-アルキル)アミノから
なる群より選択される置換基一つ、二つ、または三つによって独立して置換する
ことができる。フェニル基が好ましい。
すなわち、N、O、またはSの基からなる群より選択される環原子一つ、二つ、ま
たは三つを互いに独立して含み、残りの環原子がCである、環原子5〜10個を有
する単環式または二環式芳香族炭化水素基となりうる。
2個の場合、アルキル基2個はまた、環を形成してもよい。特に明記していない
限り、C1〜C6-アルキルは一般的に、互いに異なっていてもよく同じであっても
よい一つまたはそれ以上のハロゲン原子(群)、好ましくはフッ素によって選択
的に置換されうる、炭素原子(群)1〜6個を有する分岐または非分岐炭化水素
基を表す。その例は以下の炭化水素基であってもよい: メチル、エチル、プロピル、1-メチルエチル(イソプロピル)、n-ブチル、1-メチ
ルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、ペンチル、1-メチルブチ
ル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプ
ロピル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、ヘキシル、1-メチルペンチ
ル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブ
チル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジ
メチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-
トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル
、および1-エチル-2-メチルプロピル。
ル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、または1,1-ジメチルエチルのような
炭素原子1〜4個を有する低級アルキル基が好ましい。
もよい一つまたはそれ以上のハロゲン原子(群)、好ましくはフッ素によって選
択的に置換してもよい、炭素原子1〜6個を有する分岐または非分岐の二価炭化
水素架橋を意味する。
クリルアミド、ポリビニルアルコールまたはこれらのポリマーのコポリマーであ
ることが好ましい。
ロピレングリコール、ポリイソプロピレングリコール、ポリブチレングリコール
である。
アミノ誘導体として存在してもよい。
する。
成のために用いることができ、この場合これらの基の二つはポリマーと共重合す
ることができ、一つは、イフェクター分子Eとカップリングすることができる;
この場合Zは不要である。天然のアミノ酸であるグルタミン酸、アスパラギン酸
、リジン、オルニチン、およびチロシンが好ましい。原則として、合成アミノ酸
もまた、天然のアミノ酸の代わりに用いてもよい(例えば、対応するスペルミン
およびスペルミジン誘導体)。
マーと共重合するために官能基二個を有し、イフェクター分子をカップリングす
るためのリンカーによるアミノ酸(グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、ま
たはオルニチン)の改変によって得られる。このように、Zは不要である(m=0
);リンカーの例は、ピリジルチオメルカプトアルキルカルボキシレート(図1
を参照のこと)またはマレイミドアルカンカルボキシレートである。
チド誘導体が電荷を有しない場合、Eをそれに直接、またはZによってカップリン
グさせる。
もしくはスペルミジン誘導体である場合、X自身がイフェクター分子となる(Zお
よびEは不要である、m=n=0)。最も単純な場合、ペプチドはこの場合二つま
たはそれ以上の同一もしくは異なる天然または合成アミノ酸の直鎖状配列からな
り、このときアミノ酸は、ペプチドが全体的に負のまたは正の電荷のいずれかと
なるように選択される。または、ペプチドは分岐してもよい。これらの場合、そ
のようなペプチドはイフェクターであり、Z、およびEは不要である(m=n=0)
。適した陽イオン性ペプチドのタイプの例はプランクら(Plank、1999年)に記
載されている。
)を有する。ペプチドは全体的に負電荷を有するアミノ酸またはアミノ酸誘導体
の配列である。好ましくはペプチドはアミノ酸3個〜30個からなり、より好まし
くはグルタミン酸および/またはアスパラギン酸残基のみからなる。nは、Bに含
まれる官能基に応じた分岐数を表す。Bは分岐分子であり、好ましくはリジン、
またはii)〜iv)の場合にはタイプXの分子である。スペーサーは、アミノ酸2
〜10個からなるペプチドであるか、またはカルボン酸バックボーンにおいて炭素
原子3〜9個を有する有機アミノカルボン酸、例えば6-アミノヘキサン酸である
。スペーサーは、ポリマーバックボーンから荷電イフェクター分子を空間的に引
き離す役割を有する。Xaaは好ましくは、三官能アミノ酸であり、特にグルタミ
ン酸またはアスパラギン酸であり、一般的にi)〜iv)の場合では、タイプXの化
合物となりうる。
ペプチド誘導体となることができ、そのような基の例は、ノイラミン酸またはグ
リコサミノグリカン硫酸塩のような、スルホン酸基または荷電炭化水素基である
。ペプチドの改変は、ペプチド合成の過程で直接または後述の最終的なペプチド
について標準的な方法に従って実施することができる。
オン性ペプチドまたはペプチド誘導体、またはスペルミンもしくはスペルミジン
誘導体となりうる。最も単純な場合において、ペプチドはまた、この場合二つま
たはそれ以上の同一もしくは異なる天然または合成アミノ酸の直鎖状配列であり
、式中アミノ酸はペプチドが全体的に正荷電または負荷電のいずれかとなるよう
に選択される。または、ペプチドは分岐となりうる。適した分枝陽イオン性ペプ
チドのタイプの例はプランクら(Plank、1999年)に記載されている。適した陰
イオン分子Eは、一般式(ペプチド)n-B-スペーサー-(Xbb)を有し、Xbbは、好まし
くはXに直接またはZを通じてカップリングすることができる反応基を有するアミ
ノ酸である。
プチドに存在する反応基、または後に導入された反応基、例えばチオール基(シ
ステイン中の、またはメルカプトアルカン酸基を導入することによって)によっ
て行われる。または、Zに応じて、カップリングは既存のアミノ基またはカルボ
ン酸基によって、または後に導入されたアミノ酸基またはカルボン酸基によって
起こってもよい。
であるペプチド誘導体となりえて、そのような置換基の例は、ノイラミン酸また
は硫酸化炭化水素基のようなスルホン酸基、または荷電炭化水素基である。この
場合もまた、Xとのカップリングは、直接またはZを通じて起こる。
)として改変される。この場合、リンカー位置Zのほとんどにおいて、Eが存在す
る。それらの間に、陽イオン性または陰イオン性イフェクターEの代わりに、細
胞リガンドがリンカーZの個々の位置にカップリングする。または、リガンドは
イフェクター分子Eの個々の位置にカップリングする。好ましくは、E対Lの比は
、約10:1〜4:1である。
抗体、炭化水素基)または合成起源(例えば、RGDペプチド、合成ペプチド、合
成ペプチドの誘導体)であってもよい;適したリガンドの例は、国際公開公報第
93/07283号に記載されている。本発明のコポリマーは、以下の方法に従って生成
することができる。
従って、例えば固相で(固相ペプチド合成、SPPS)合成される。アミノ酸誘導体
はTBTU/HOBtによって、またはHBTU/HOBt(フィールズ(Fields)ら、1991)によ
って活性化される。イオンアミノ酸の位置に関して、以下の誘導体をそのN末端F
moc保護型として用いる: (a)陽イオン側鎖:R(Pbf)、K(Boc、Trt)、オルニチン(Boc)、カルボキシスペ
ルミンまたはスペルミジン(Boc)。 (b)陰イオン側鎖:D(O-tert、Bu)、E(O-tert、Bu)。
岐部位Bに関しては、Fmoc-K-(Fmoc)-OHが用いられる。ペプチドはTFA/DCMによっ
て樹脂から離れている。
ーサー-(Xaa)を有するペプチドである場合、カルボキシル位置でベンジル保護基
を有するグルタミン酸またはアスパラギン酸がXaaの位置で用いられる。これは
水素化分解によって選択的に除去される(フェリックス(Felix)ら、1978)。
ペプチド鎖のN末端アミノ酸位置は、保護基がペプチドとPEGとの共重合後に一段
階で分離することができるように、Boc保護されたアミノ酸を有する。
ルカプトプロピオン酸、6-アミノヘキサン酸)、ペプチド化学の古典的な方法に
従って液相において得ることができる。メルカプトプロピオン酸を、2,2'-ジチ
オジピリジンと反応させて、クロマトグラフィーによって精製する。反応生成物
は、HOBt/EDC活性化を用いて、カルボキシル保護グルタミン酸(O-t.ブチル)と
反応する(図1参照)。6-Fmocアミノヘキサン酸も同様に反応する。カルボキシ
ル保護基をTFA/DCM中で除去し、得られたグルタミン酸誘導体をクロマトグラフ
ィー方法によって精製する。
リマーによって説明する。
酸もしくはアスパラギン酸誘導体と、規定の分子量範囲のPEG高分子単量体(市
販の、分子量400〜20,000、例えばフルカ社(Fluka)との共重合によって、PEGエ
ステルバックボーン上にマトリクスが得られる。これは、生理的環境において加
水分解不安定性の系である(ウルブリッヒ(Ulbrich)ら、1985)。
キシルカルボジイミド/DMAP、好ましくは強く交互の配列(ザリプスキー(Zalip
sky)ら、1984;ナタン(Nathan, A.)、1992)によって形成される。ジクロロ
メタン溶液において側鎖保護ペプチドまたはグルタミン酸もしくはアスパラギン
酸誘導体と共に存在するPEG高分子単量体に対して、DCC/DMAPを加える。得られ
た尿素誘導体を分離した後、冷エーテルによる沈殿によってポリマーを得ること
ができる。残りの側鎖保護基は、ジクロロメタン中でTFAによって分離される(
これらの条件下で、PEG-エステル結合も同様に安定である(ザリプスキー(Zali
psky)ら、1984)。イオンポリマーは、沈殿および最終クロマトグラフィー段階
によって得られる。反応の操作によって、重合度、およびポリマーにおけるPEG
単位あたりの荷電比を制御することができる。
治療適用に用いられる全身適用の場合に、不安定性が高すぎると予想される場合
には、ポリエステルの代わりとして、アミドポリマーマトリクスを構築してもよ
い。この場合、PEG高分子単量体の代わりに、上記の合成と類似の方法で、イオ
ン性ペプチドまたはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸誘導体と共重合するジ
アミノ-PEG誘導体を用いる。この合成の間、加水分解安定性のアミド構造が得ら
れる。ジアミノ改変ポリエチレングリコールは、規定の分子量範囲500〜20,000
の基本物質として市販されている(例えば、フルカ社)。ペプチド成分の残りの
酸不安定側鎖保護基は、例えばTFA/DCMによって分離して、ポリマーをクロマト
グラフィー方法によって精製する。
を、適した反応基を含む陰イオンもしくは陽イオン性ペプチドと反応させる。例
えば、3-(2'-チオ-ピリジル)-メルカプトプロピオニル-グルタミン酸のコポリマ
ーを、遊離のシステイン-チオール基を含むペプチドと反応させる。6-Fmoc-アミ
ノヘキサノイルグルタミン酸から得られたコポリマーから、Fmoc基をアルカリ条
件で除去する。生成物をカルボキシル活性化保護ペプチドと反応させる。ペプチ
ド保護基(t-BocまたはO-t.ブチル)をDCM/TFA中で除去し、得られた生成物をク
ロマトグラフィーによって精製する。または、Ahxのアミノ基を二官能リンカー
によって誘導体にして、その後ペプチドと反応させることができる。
ことによって、またはスクシニミジル-ピリジル-ジチオプロピオネート(SPDP;
ピアス社(Pierce)、またはシグマ社(Sigma))のような二官能リンカーを挿入す
ることによって直接カップリングすることができる。反応生成物はゲル濾過また
はイオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。
この場合、主にポリマーRのタイプと分子量(重合度)、重合化パートナーX-Zm-
Enの同一性、またはイフェクター分子E(例えば、グルタミン酸の増加数を有す
る一連の陰イオン性ペプチド)、および総重合化程度pは、選択可能な変数であ
る。
の占有率とポリマーマトリクスの重合度を変化させることによって、異なるコポ
リマーの相同配列の迅速で平行な構築が可能となり、その後核酸と複合体を形成
した後、様々な非ウイルスベクターの構築が可能となるいくつかのパラメータの
系が確立される。この合成の考え方を、細胞培養プレートの規模(例えばプレー
ト一枚あたり96ウェル)において実践する。この目的のため、化学合成を必要な
ミクロの規模に適合させる(反応容量は500 μlの範囲)。これによって、生物
アッセイ法において同時に合成されたポリマーの直接移入が可能となり、このよ
うに、複数の系の迅速なスクリーニングの一因となり、適した化合物が同定され
る一因となる。遺伝子移入のための本発明のポリマーの好ましい使用に関して生
物学的選択法を実施するために、コポリマーを例えばDNA複合体と反応させ、目
的とする用途(例えば、遺伝子移入)に関してポリマーの特徴の評価を可能にす
る試験を行う。そのような選択方法は、コポリマーによってコーティングしたナ
ノ粒子について用いることができる。そのようなスクリーニングおよび選択方法
は、例えば、96ウェルプレートのフォーマットでの補体活性化試験として役立ち
うる(プランク(Plank)ら、1996)、または同じフォーマットでの血清アルブ
ミンもしくは塩によって誘導された凝集の比濁法となりうる、または同じフォー
マットでのインビトロ遺伝子移入試験となりうる(プランク(Plank)ら、1999
)、または同じフォーマットでの蛍光測光法となりうる。
の溶解度がインビボでの遺伝子移入適用にとって十分となるようにDNA複合体の
表面を改変することに適していること、血液循環中の滞留時間および作用期間が
、標的細胞への受容体媒介遺伝子移入が起こるために十分に増加するように、血
液成分および組織成分との相互作用が減少していることが示される。
られる。
分子と一般式Iの一つまたはそれ以上の荷電コポリマーとを含む複合体に関する
。
。
ってその表面に結合している一般式Iの荷電コポリマーを有するという特徴を有
する、核酸と有機陽イオンもしくは陽イオン性脂質との複合体に関する。
オチド配列および大きさに関して制限はない。本発明の複合体に含まれる核酸は
主に、細胞において得られる生物作用によって定義され、例えば遺伝子治療の範
囲内で用いる場合には、発現されるべき遺伝子もしくは遺伝子断片によって、ま
たは欠損遺伝子もしくは任意の標的配列の意図する置換もしくは修復によって(
ヨーン(Yoon)ら、1996;クレン(Kren)ら、1998)、または阻害されるべき遺
伝子の標的配列によって(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボ
ザイムを用いる場合)定義される。好ましくは、細胞に輸送されるべき核酸は、
治療的に有効な蛋白質をコードする配列を含むプラスミドDNAである。癌治療の
範囲内で用いるために、配列は例えば、インターロイキン-2、IFN-α、IFN-γ、
TNF-αのようなサイトカインの一つまたはそれ以上をコードする、または基質と
組み合わせて用いられる自殺遺伝子をコードする。いわゆる遺伝子腫瘍ワクチン
接種において用いるために、複合体は、一つまたはそれ以上の腫瘍抗原の断片を
コードするDNAを、選択的に一つまたはそれ以上のサイトカインをコードするDNA
と組み合わせて含む。治療的に有効な核酸のさらなる例は国際公開公報第93/072
83号に示される。
および体液成分(例えば、血清蛋白質)とのその望ましくない相互作用を減少ま
たは阻害するという特徴を有する。
知である;負電荷を持つ核酸との相互作用のために、これは圧縮されて、細胞に
よって取り込まれるために適した形にされる。その例は、同種直鎖状イオンポリ
アミノ酸(ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチンのような)、または異
種直鎖混合陽イオン中性ポリアミノ酸(二つまたはそれ以上の陽イオン基および
中性アミノ基からなる)、分岐鎖および直鎖陽イオン性ペプチド(プランク(Pl
ank)ら、1999;ワドワ(Wadhwa)ら、1997)、非ペプチドポリカチオン(直鎖
または分岐鎖ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン)、デンドリマー(規
定の直径および正確な数の末端アミノ基で合成することができる球形ポリカチオ
ン;ヘーンスラーおよびスゾカ(Haensler and Szoka)、1993;タン(Tang)ら
、1996;国際公開公報第95/02397号)、陽イオン炭化水素、例えばキトサン(エ
ルバッヒャー(Erbacher)ら、1998)のような、受容体媒介遺伝子移入のために
用いられるポリカチオン(欧州特許第0388 758号;国際公開公報第93/07283号)
である。ポリカチオンはまた、脂質によって改変してもよい(ゾウ(Zhou)ら、
1994;国際公開公報第97/25070号)。
ら、1997)である(例えば、リポフェクタミン、トランスフェクタム)。
リカチオンと陽イオン性脂質の双方の代理として用いられる。
リジン、およびデンドリマー、例えばポリアミドアミンデンドリマー(「PAMAM
」デンドリマー)である。
と共に形成された複合体が生理的塩濃度で解離しないように選択されるが、これ
はエチジウムブロマイド置換アッセイ法によって容易に決定することができる(
プランク(Plank)ら、1999)。さらなる段階において、規定量の核酸を、選択
したポリカチオンの増加量と共にインキュベートして、形成された複合体をトラ
ンスフェクトすべき細胞に適用して遺伝子発現(一般的にレポーター遺伝子構築
物、例えば、ルシフェラーゼによって)を標準的な方法によって測定する。
して、DNAは、そのような複合体が表面負電荷を示すように過剰量で存在しうる
;逆の場合、すなわち核酸を縮合するポリカチオンが過剰量で存在する場合、複
合体は表面正電荷を有する。本発明の意味において、ポリカチオンは過剰量で存
在する。
20 mV〜+50 mVとなるように調節し、特定のポリカチオン、例えばポリリジンを
用いる場合、上記のレベル以上であってもよい。
記載されているように、確立された標準的な方法に従って行う。
ンドは国際公開公報第93/07283号に記載されている。腫瘍治療の際の標的細胞に
向けられる遺伝子移入の場合、腫瘍細胞への遺伝子移入を増加させることができ
る腫瘍細胞関連受容体に対するリガンドまたは抗体(例えば、CD87;uPA-R)が
好ましい。
するポリカチオン(選択的に、受容体リガンドによって誘導体化する)と共にイ
ンキュベートする。このプロセスの間、受容体媒介エンドサイトーシスによって
細胞によって取り込むことができる粒子が形成される。その後、複合体を本発明
に係って負電荷を持つコポリマー、好ましくはポリエチレングリコールコポリマ
ーと共にインキュベートする。コポリマーにおけるイフェクターEは、ポリカチ
オンペプチドであることが好ましい。または、コポリマーをまず核酸と混合した
後、ポリカチオンとインキュベートする、または第三の方法として、コポリマー
を最初にポリカチオンと混合してから核酸と共にインキュベートする。
してから、陽イオン性コポリマーを加える。この場合も同様に、混合段階の順序
は、上記の陰イオン性コポリマーに関して記述したように、変化しうる。個々の
成分の相対的部分は、得られたDNA複合体が弱い正の、中性の、または弱い負の
ゼータ電位を示すように選択される(+10 mV〜−10 mV)。
一のポリカチオン分子として用いることができる;このように、ポリカチオンま
たは陽イオン性脂質の一部は不要である。この場合、個々の成分の相対的部分は
、得られたDNA複合体が弱い正の、中性の、または弱い負のゼータ電位を示すよ
うに選択される(+10 mV〜−10 mV)。
たは異なる細胞リガンドによって改変される。
って安定化され、このように凝集に対して保護されており、長期間(数週間)溶
液中で保存できるという長所を有する。さらに、それらは結合したコポリマーの
保護作用によって体液の成分(例えば、血清蛋白質)と相互作用しない、または
相互作用の程度が低いという長所を有する。
、および選択的に有機ポリカチオンまたは陽イオン性脂質を含む薬学的組成物に
関する。
容易に用いられる溶液において生理的濃度が得られる量で、蔗糖またはデキスト
ロースのような糖を添加することが好ましい。組成物はまた、凍結濃縮型で存在
しうる。本発明の組成物はまた、超低温型(凍結保存型)または***液として存
在しうる。
典的な薬学的調製物を適用するために開発されたコロイド粒子を立体的に安定化
させる目的、および体液の成分(例えば、血清蛋白質)との望ましくない相互作
用を減少または抑制する目的に役立つ。さらに、受容体リガンドによって改変さ
れた本発明のコポリマーは、標的細胞に対する特異性が増加した薬剤を移入する
ために、上記のナノ粒子の表面に受容体リガンドを結合させるために用いること
ができる(「薬剤のターゲティング」)。
一つまたはそれ以上の本発明のコポリマーとを含む複合体との配合剤に関する。
で接触させることができ、核酸(群)とコポリマー(群)との複合体を有する物
体または物質である。好ましくは、担体は、密着して結合した材料、すなわち固
体物質、特に好ましくは、例えばゲル、スポンジ、ホイル、粉末、顆粒、または
リボンのようなプラスチックまたは変形可能な固体物質である。担体は、生物学
的に非再吸収性または生物学的に再吸収性の材料からなりうる。
ンクによって生成される担体であってもよい。このように、例えば、既知の遺伝
子ベクターを導入する可能性(裸のDNA、裸のRNA、リポプレックス、ポリプレッ
クス)、ならびに本発明に係ってクロスリンクしたポリマーにおいて、選択的に
化学修飾されたオリゴヌクレオチドおよびリボザイムを導入する可能性が存在す
る。この目的のために、クロスリンクは、例えば、インサイチューで遺伝子ベク
ター、DNA、オリゴヌクレオチド等の存在下において、水溶性溶媒または有機溶
媒においてクロスリンクを誘発する物質を加えることによって起こる。クロスリ
ンク剤の性質は、コポリマーの構造に依存する。したがって、例えば、図2に示
されたポリマーバックボーンは、例えば、システイニル-システインまたは非ア
ミノ酸様ジチオールのようなジチオールを加えることによってクロスリンクする
ことができる。カルボン酸を含むコポリマーのクロスリンクは、カルボン酸の活
性化の際に任意のジアミンを加えることによって起こりうる(例えば、インサイ
チューでの活性化エステルに対するカルボン酸の反応)(ナタン(Nathan)ら、
Macromolecules 25(1992)、4476〜4484)。一級または二級アミンを有するポ
リマーバックボーンは、例えば、活性化ジカルボン酸を加えることによって起こ
りうる。クロスリンクの後、調製物は、被膜が形成されるまで乾燥させることが
できる。
。しかし、インプラントとして体内に導入することができる異なる生物学的に非
再吸収性の材料を用いることも可能であり、および/または例えば、形成手術に
おいてすでに用いられている。その例は、PTFE(例えば、血管置換のため)ポリ
ウレタン(例えば、カテーテル)、金属材料(例えば、医療用スチール、内部人
工器官用のチタン合金2;血管支持体として用いられる金属メッシュ(ステント
))である。
ビンまたはフィブリノーゲンから生成されるフィブリン接着剤、キチン、オキシ
セルロース、ゼラチン、ポリエチレングリコールカーボネート、例えば、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸のような脂肪族ポリエステル、およびポリアミドおよびポ
リウレタンまたはポリエーテルのようなそれに由来するアミノ酸化合物、ならび
に対応する混合重合化物である。その上、他の生物学的に分解可能なポリマー、
特にヒドロゲルに基づくいわゆる自己硬化性接着剤を担体として用いることがで
きる。特に、生体内で酵素的におよび/または加水分解プロセスによって分解す
ることができる任意の材料は、生物学的に再吸収性の材料として適している。そ
の例はまた、生体再吸収性の化学的に明確な硫酸カルシウム、燐酸三カルシウム
、ヒドロキシアパタイト、ポリ無水物、精製蛋白質または部分精製細胞外マトリ
クスからなる担体である。担体コラーゲンが特に好ましく、特に、例えばシグマ
社またはコラーゲンコーポレーション(Collagen Corporation)によって販売され
ている軟骨および皮膚コラーゲンから生成されたコラーゲンマトリクスが好まし
い。コラーゲンマトリクス生成の例は、例えば、米国特許第4,394,370号および
第4,975,527号に記載されている。
ジであることが好ましい。一般的に、グルコサミノグリカンのよう負電荷を持つ
多糖類は、イオン的相互作用によってコラーゲンに結合する。結合は、コラーゲ
ン細繊維における正電荷を持つアミノ酸(リジン、ヒドロキシリジンおよびアル
ギニン)に、またはカルシウムのような二価陽イオンによって媒介されると負電
荷を持つアミノ酸にも起こりうる。さらに、コラーゲンのイオン結合特性は、酸
またはアルカリ溶液による前処理およびその後の凍結乾燥によって意図的に影響
を及ぼすことができる。コラーゲン化学における既知のこれらの技術によって、
担体材料としてのコラーゲンとDNA複合体の間にイオン結合を生成するために、
本発明の複合体の懸濁液によってコラーゲン材料を浸漬することが可能である。
い。しかし、担体のそのような構造的特徴は、DNAの効率的な結合にとって必要
である。担体材料とのより強固な結合を得るために、後者をさらに、ペプチド(
プランク(Plank)ら、Human Gene Therapy 10(1999)、319〜333)またはポリ
エチレンイミン(PEI)のような陽イオン物質結合DNAによって誘導体化すること
ができる。この目的のため、コラーゲンスポンジを例えば、二官能能カップリン
グ試薬であるスクシニミジル・ピリジル・ジチオプロピオネート(SPDP)によっ
て改変する。ポリエチレンイミンをイミノチオランによって誘導体化して、これ
によってチオール基を導入する。カップリングすべき陽イオン性ペプチドは、C
末端にシステインを有する。チオール基はジスルフィド架橋を形成することによ
ってSPDP誘導体化コラーゲンスポンジと反応する。そのようにして得られたスポ
ンジ誘導体は、DNAに強固に結合するはずであり、DNAの放出はかなり遅れて起こ
ると予想される。
ース中でDNA/コポリマー複合体と共にインキュベートすることができる。次に
、スポンジを凍結乾燥する。
を吸収するまたはそれと結合するように、対応する担体を、核酸とコポリマーと
の複合体に接触させることによって生成することができる。対応する方法は、当
業者に既知である(ボナディオ(Bonadio)ら、(1999)、Nat. Med. 5(7):753
〜759;シェア(Shea, L.D.)ら、(1999)、Nat. Biotechnol. 17(6):551〜55
4)。実施例において、担体としてのコラーゲンスポンジと、核酸/コポリマー
複合体との配合剤の生成を記述する。
は高等真核細胞に、好ましくは脊椎動物細胞、特には哺乳類の細胞にインビトロ
およびインビボで移入するために用いることができる。
接、または例えば、カテーテル、人工関節、または内部人工器官のコーティング
として導入することが可能である(例えば、組織の組み込みを改善するため)。
可能性がある適用は創傷の被覆であり、例えば火傷または圧迫潰瘍のような広範
囲の皮膚欠損を覆うこと、および現代の組織工学技術のための担体材料としてで
ある(ムーニーおよびミコス(Mooney, D.J. and Mikos, A.G.)ら、Sci. Am. 2
80(4):60〜65)。さらに、コーティングした材料の加工は、一般的な組織接着
剤系によって生物において意図的に導入され、固定され、デポーの形で有効とな
る(トランスフェクション)粉末の形となりうる。
配合剤を含む薬学的組成物にも関する。
リマーと核酸分子との複合体と共に、本発明の主題である。
ピリジル)-メルカプトプロピオン酸のグルタミン酸へのカップリングによって誘
導したi)の場合のアミノ酸誘導体; したがって、Zは省略される(m=0)。
た。トリエチルアミン(アルドリッチ社(Aldrich)))100 μlを加えた後、3-
メルカプトプロピオン酸87 μl(1 mmol)を加えた。1時間後、反応混合物を
少量ずつ逆相HPLCによって分離した:調製的C18-カラム(バイダック(Vydac))
、218TP1022)、流速25 ml/分、0.1%トリフルオロ酢酸、0〜40%アセトニトリ
ルを24分、40〜100%アセトニトリルを5分、100%アセトニトリルを5分。生成
物のピークは、約20%アセトニトリルで溶出された。生成物の画分をプールして
凍結乾燥した。
水を徐々に加えることによって過剰量のDTDPを沈殿させる。沈殿物をエタノール
中で2回再溶解させて、水を加えて再沈殿させた。合わせた水相を上記のように
RP-HPLCによって精製する。
: a)において得られた生成物1(図1を参照:0.5 mmol)をジクロロメタン25
mlに溶解した。グルタミン酸-ジ-t-ブチルエステル(Glu(OtBu)OtBu、バケム社(
Bachem))、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(アルドリッチ社)、N-エチル-N'
-(ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(アルドリッチ社)およびジイソプ
ロピルエチルアミン(アルドリッチ社)各1 mmolを氷中で攪拌して冷却しなが
ら50 mlポリプロピレンチューブに段階的に加えた。反応の48時間後、混合物を
ロータリーエバポレーターによって油性残査まで濃縮した。残査を酢酸エチル20
mlに溶解した。この溶液を0.5 M塩酸によって、飽和炭酸水素ナトリウム溶液お
よび飽和塩化ナトリウム溶液によってそれぞれ2回抽出した。有機層をロータリ
ーエバポレーターによって油性残査まで濃縮して、高真空下で一晩乾燥させた(
生成物2a:図1を参照)。t-ブチル保護基を除去するために、生成物2aをさらに
精製せずにジクロロメタン:トリフルオロ酢酸(2:1)30 mlに再溶解して、
室温で2時間攪拌した。溶液をロータリーエバポレーターで油性残渣になるまで
濃縮し、その後氷冷エーテルで洗浄した。高真空下で乾燥させた後、生成物を10
0 mM HEPES、pH 7.4に溶解して、少量ずつRP-HPLCによって精製した(生成物1
と同じ条件)。生成物の画分をプールした。生成物2b(図1参照)は、収率270
μmol(全ての段階について27%)で得られた。計算分子量は344.05。実際の分
子量は345.0(MH+)であった。
ミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000(ジアミノPEG-6000:フルカ社)と
の共重合化 生成物2bをジメチルホルムアミド3 ml(フルカ社)に溶解してジクロロメタ
ンによって20 mlに希釈した。この溶液5 ml(67.5 μmol)を、ジアミノ-PEG-6
000 506 mg(84 μmol、1.25等量に相当;フルカ社)、ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド30 mg(135 μmol、2等量、1 M DMF溶液135 μl)およびジメチルア
ミノピリジン2 mg(0.25等量、1 M DMF溶液)と共に段階的に混合した。2時
間後、ニンヒドリンアッセイ法のために10μlを採取したところ、ごくかすかな
青色染色を示した。攪拌しながら−20℃に冷却後、粗生成物3(図1参照)をt-
ブチル-メチルエーテルとの反応混合からの沈殿によって得た。生成物を真空で
乾燥させた。一部を水に溶解して、不溶性残査を濾過によって除去した後ゲル濾
過によって精製した(ウルトラフリーMC、ミリポア社)。この目的のため、製造
元の指示に従って、XK16/40カラム(ファルマシア社)にスーパーデックス75(
ファルマシア社)を充填した。粗生成物各20 mgのアリコットを20 mM HEPES、pH
7.3を溶出剤として流速1 ml/分で精製した。主画分は、先行する明らかに分離
された高分子量画分の後に、見かけの分子量40.000 Daで溶出し、これを個々に
回収した。
ミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400(ジアミノPEG-3400:フルカ社)と
の共重合化(生成物4;図1参照) 生成物4は、生成物3と同じセットアップおよび精製法によって得た。生成物
をゲル濾過後、見かけの分子量22.800 Daで溶出する(副画分は64 kDの生成物、
全体の14%、および46 kDaの生成物、全体の32%であった)主な画分(全ての画
分の54%)として単離した。
す:3-メルカプトプロピオン酸を2,2'-ジチオジピリジンと反応させる。生成物
(1)をカルボキシル保護グルタミン酸(生成物2a)とカップリングさせる。t-
ブチル保護基を切断した後、3-(2'-チオピリジル)-メルカプトプロピオニル-グ
ルタミン酸(2b)が得られ、これをO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレング
リコール)6000またはO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400
と共にDCC活性化の下で共重合させた。この手順によって生成物3および4をそ
れぞれ生じる。
イザーを用いてFastMoc(登録商標)プロトコールに従って合成した。
イン)、ジ-Fmoc(リジン)、およびO-t-ブチル(グルタミン酸)を用いるシス
テインローディングクロロトリチル樹脂330 mg(0.5 mmol/g;バケム社)を用い
て合成した。保護アミノ酸各1 mmolを用いた。分岐点(リジン)後、二重カッ
プリングを行った。N末端のアセチル化は、2 mmolジイソプロピルエチルアミン
の存在下で2 mmol無水酢酸のN-メチルピロリドン溶液2 mlを用いて樹脂をカッ
プリングしたペプチド上で実施した。ペプチドは、樹脂から切断した後、粗生成
物として得て(水500 μl、チオアニソール500 μl、エタンジチオール250 μl
のトリフルオロ酢酸溶液10 ml)、ジエチルエーテルによって沈殿させた。粗生
成物は、100 mM HEPES pH 7.9に溶解して、潅流クロマトグラフィーによって精
製した(ポロス20 HQ、ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)社、4
×100 mm PEEKカラムに充填、0〜0.5 M NaCl8分、流速10 ml/分)。50 mM燐酸
ナトリウム緩衝液の6 M塩酸グアニジニウム溶液中でのペプチドの280 nmでの吸
光度係数は、2560 M-1cm-1である(ギルおよびフォンヒッペル(Gill and von H
ippel)、1989)。
いて記述したように、樹脂から切断して、ジエチルエーテルによって沈殿させた
。粗生成物を真空下で乾燥させた。各20 mgのアリコットを1 M炭酸水素トリエ
チルアンモニウム緩衝液pH 8 500 μlに溶解して、ゲル濾過によって精製した
(ファルマシア社のセファデックスG-10をファルマシア社のHR10/30カラムに充
填。流速1 ml/分。溶出剤:20 mM HEPES pH 7.3/150 mM NaClまたは100 mM TE
ABまたは100 mM炭酸水素アンモニウム)。吸光度係数:278 nm 12600;279 nm 1
2665;280 nm 12660 M-1cm-1。
ys(Trt)-クロロトリチル樹脂、バケム社;0.5 mmol/g)、標準的な方法に従っ
て精製した(溶出剤として0.1%TFAを用いるセファデックスG10;逆相HPLC、0.1
%TFA-アセトニトリル勾配)。分岐点でのリジンは、α,ε-ジ-Fmoc-L-リジンで
あり、その後のリジンはα-Fmoc-ε-Boc-L-リジンであった。
模:0.25 mmol Fmoc-Glu-(OBzl)-クロロトリチル樹脂。樹脂のローディングは、
塩化O-クロロトリチル樹脂(アレクシス(Alexis))の対応する量の無水ジクロ
ロメタン懸濁液によって行い、Fmoc-Glu-(OBzl)OHおよびジイソプロピルエチル
アミン各2等量を混合した。数時間振とうさせた後、樹脂を濾過して、ジメチル
ホルムアミド、メタノール、イソプロパノール、ジクロロメタン、およびジエチ
ルエーテルによって数回洗浄した。改変Fmocプロトコールを用いる。N末端アミ
ノ酸は、Boc保護基を有し、配列(E(Boc)[E(tBu)]3)2KGGE(OBzl)OH(E4EPROT)に
よる固相合成から、完全に保護された塩基安定性のペプチド誘導体を生じた。
:1:1で実施した。C末端グルタミン酸のベンジルエステル保護基は、標準的
な方法に従って活性炭上でH2/パラジウムによって選択的に除去した。
って決定した。
リング C末端システイン含有ペプチドと1.1で得られたコポリマーバックボーンの1.2
等量(ポリマー中のチオピリジル基に関して)の20 mM HEPES、pH 7.4溶液を混
合して室温で15時間振とうまたは攪拌する。
釈したポリマー溶液と2-メルカプトエタノールとを反応させ、その後放出された
2-チオピリドンの波長342 nmでの吸光度を測定することによって決定する。シス
テイン含有ペプチドの遊離のチオール基の濃度は、ランバート・ベール法に従っ
て波長412 nmでエルマン試薬によって決定する。
た後、反応混合液の容量を減少させて、生成物をゲル濾過によって分画した(ス
ーパーデックス75、ファルマシア社)。
フィド架橋によってカップリングした分岐ペプチドYE5C、配列(YEEEEE)2K(ahx)C
を用いた。
ドから調製した。生成物として、見かけの分子量35.000 Daの化合物が得られた
。用いたペプチドとコポリマーバックボーンの分子量に関して、このことは、p
=6の重合の程度を意味する(6反復単位)。
プチドから調製した。生成物として見かけの分子量55.800 Daの化合物が得られ
た。重合度は約7である。
ン酸基にシステインチオールのジスルフィド架橋によってカップリングする。
ルエンザペプチドとから調製した。
ルエンザペプチドINF7とから調製した。
これをシステインチオールのジスルフィド架橋によって3-メルカプトプロピオニ
ルグルタミン酸基にカップリングした。コポリマー(4)および(5)をそれぞれ
3.32 μmol(固有のチオピリジル基に関して)を20 mM HEPES pH 7.4に溶解して
、ラクトシル化SFO29-ahx 500 nmolおよびペプチドYE5C 4.48 μmolのHEPES緩衝
液での混合液1.1mlと共にインキュベートした。これは、使用可能なチオピリジ
ル基に対してペプチドからの遊離のチオール基の1.5倍過剰に相当する。総ペプ
チドにおけるラクトシル化ペプチドは10%である。反応は一晩定量的に進行した
。生成物を記載のようにゲル濾過によって精製した(スーパーデックス75)。
ームを図2に示す。遊離のチオール基を有するペプチドを生成物(3)または(4
)にそれぞれ、例えばペプチドINF7(左)またはペプチドYE5Cにカップリングさ
せる。これによって、生成物P3INF7 O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレン
グリコール)3400)、P6INF7 O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコー
ル)6000)を生成し、同様にP3YE5CおよびP6YE5Cを生成する。
よび O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000(ジアミノ-PEG
-6000;フルカ社)、または O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコー
ル)3400(ジアミノ-PEG-3400;フルカ社)の調製 この場合、一般式Iにおいて: W=Y=NH;X=Fmoc-6-アミノヘキサノイル-グルタミン酸である。
によって得られるアミノ酸誘導体であることを意味する。イフェクター分子Eの
カップリングに関して、Zは省略することができ、またはSPDPもしくはEMCSのよ
うな二官能リンカーとなりうる。
は、システインチオールによってリンカー分子Zと反応する(SPDPまたはEMCSの
ように)。
よび1-ヒドロキシベンゾトリアゾール1.2等量をジクロロメタン200 mlに溶解す
る。0℃に冷却した後、N-エチルN'-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド1
.2等量およびジイソプロピルエチルアミン1.7 mlを混合物に加えた(pH=8)。
0℃で1時間後、混合物を室温で18時間攪拌した。溶媒を蒸留によって完全に除
去し、残査を酢酸エチルに溶解して0.5 N塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム溶液お
よび飽和塩化ナトリウム溶液によって抽出した。溶媒を蒸発させた後、凍結乾燥
させるとFmoc-6-アミノヘキサノイル-Glu(OtBu)OtBu(5)が生成された。
:1に溶解して、室温で1時間攪拌した。反応が完了すると(逆相HPLCによって
評価)、溶媒を初回容量の約5%に濃縮した。生成物(6)は、ジエチルエーテ
ルからの沈殿によって生成した。最終精製は、アセトニトリル/水/0.1%TFA勾
配によるRP-HPLCによって実施した。
エチレングリコール)3400'(ジアミノ-PEG-3400、フルカ社)との共重合、生成
物(7): 10 mg(6)、O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400' 1.5
等量、ジシクロヘキシルカルボジイミド2等量、および4-(ジメチルアミノ)-ピ
リジン 0.25等量をジクロロメタン5 mlに溶解する。室温で30分攪拌してその容
積を減少させた後、溶液を濾過して蒸留によって溶媒を完全に除去した。残査を
水500 μlに懸濁して、凍結乾燥した。
液)をポリマーから除去した後、標準的なペプチドカップリング化学によって、
遊離のC末端を示す任意のペプチドとコポリマーを結合させることができる。
ス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000(ジアミノ-PEG-6000;フル
カ社)、または O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400(ジ
アミノ-PEG-3400;フルカ社)の調製 この場合、一般式Iにおいて: W=Y=NHであり;X=分岐ペプチドE4EPROTである。
したがって、ZおよびEを省略する(m=n=0)。
ノ-PEG-6000、フルカ社)(8)との共重合; E4EPROT 50 μmol、O,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)600
0' 1.5等量、ジシクロヘキシルカルボジイミド2等量、および4-(ジメチルアミ
ノ-)ピリジン0.25等量をジクロロメタン10 mlに溶解した。4℃で4時間攪拌し
て、濃縮した後、溶液を濾過してから蒸留によって溶媒を完全に除去した。残査
を水500 μlに懸濁して凍結乾燥した。
好ましくは、エタンジチオール、トリエチルシラン、チオアニソール)を含むト
リフルオロ酢酸を文献に記載された方法に従って加えて、2時間攪拌した。粗生
成物をジエチルエーテルからの沈殿によって単離した。最終精製は、上記のよう
にゲル濾過(スーパーデックス75、ファルマシア社)によって実施した。
タミン酸のカルボキシレート1上のベンジル保護基を、選択的に活性炭上のH2/
パラジウムによって選択的に切断する。生成物をDCC活性化によってO,O'-ビス(2
-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000またはO,O'-ビス(2-アミノエチル
)ポリ(エチレングリコール)3400と共重合する。最終段階において、N末端に配置
されたグルタミン酸の保護基をTFAのDCA溶液によって切断する。
した。
μlをpL 256 μgのHBS 溶液800 μlに加えて、ピペッティングによって混合する
ことによって保存溶液として調製した。これは、計算荷電比6.3に相当する。陽
性対照として、ポリプレックスのこの懸濁液各50 μlを、96ウェルプレートのカ
ラム1 A-Fに加え、GVB2+緩衝液100 μlと混合した。他の全てのウェルにGVB2+緩
衝液50μlを加えた。プランクら(Plank、1996)に記載のように100 μlをカラ
ム1からカラム2等に移した。
mol、および105 nmol(INF7部分を指す)と混合して、15分インキュベーション
の後、GVB2+緩衝液によって1050 μlに希釈した。得られた懸濁液各150 μlを、
96ウェルプレートのカラム1、列A〜Fに分配した。GVB2+緩衝液での一連の1.5倍
希釈および補体活性化アッセイの残りは、上記のように、そしてプランクら(Pl
ank、1996)が記載したように実施した。
び総容積200 μlあたりポリマーに関して0 nmol、5 nmol、10 nmol、15 nmol
(INF7と呼ぶ)である。
の活性化: アッセイ法は以下のように実施した: PEI(25 kD、アルドリッチ社)-DNA複合体は、DNA溶液(20 mM HEPES pH 7.4に
おいて80 μg/ml)およびPEI溶液(20 mM HEPES、pH 7.4において83,4 μg/ml)
の等量を合わせることによって調製した。過剰量の未結合PEIを除去するために
、DNA複合体をセントリコン-100フィルターチューブ(ミリポア社(Millipore))
において350×gで15分間を3回遠心した。遠心の間、試験管に20 mM HEPES pH 7
.4を当初の容積まで満たした。最終遠心段階の後、DNA濃度300 μg/mlに対応す
るDNA複合体保存溶液が得られた。この溶液182 μlのアリコットを20 mM HEPES
pH 7.4によって2520 μlに希釈した。各610 μlのアリコット(各DNA 13.2 μg
に相当)をピペットで採取して、P6YE5Cの20 mM HEPES pH 7.4溶液277.6 μlに
加えた。得られた溶液を5 M NaClによって塩濃度150 mMに調節した。得られた
溶液各150 μlを96ウェルプレートのカラム1、A〜Fに移した。GVB2+緩衝液での
一連の希釈を記載のように実施した(プランク(Plank)ら、1996)。
リマーP3YE5Cの溶液各277.6 μlと共にインキュベートした。溶液は用いたDNA量
に対するペプチドYE5Cの0、1、2、3荷電等量を含んだ。15分後、5 M NaCl
各27.45 μlを加えた(総量915 μlが得られる)。得られた溶液各150 μlを96
ウェルプレートのカラム1、列A〜Fに移した(これは、DNA 8.6 μgおよびPEI各
9μgに対応する)。GVB2+緩衝液における一連の希釈および残りのアッセイ法は
pL-DNAに関して先に記述したように実施した。
による補体の活性化 CH50値は、アッセイ法のセットアップにおいてヒツジ赤血球の50%溶解を生じ
る特定の血清希釈を指す。CH50maxの値は、無処置のヒト血清について得られる
特定のCH50値を意味する。本明細書に記載の実験セットアップにおいて、ヒト血
清を遺伝子ベクターと共にインキュベートした。このように処理した血清につい
て得られたCH50値は、遺伝子ベクターが補体カスケードを活性化する場合にはCH
50maxより低い。データはCH50maxの百分率として示す。ポリリジン-DNA複合体に
ついて認められた強い補体活性化は、コーティングポリマーP6INF7によって完全
に阻害されうる。
。 ポリリジン-DNA複合体に組み入れられると、この補体活性化は消失する。
性化 保護されていないDNA複合体は、補体系の強い活性化因子である。コポリマーP
3YE5Cは、コポリマーの加えた量に依存して補体活性化を減少させるが、調べた
範囲では完全な保護には至らない。
完全に保護する。
検査となる。
ティアから採取して、直ちにアルセバー溶液10 mlに希釈した(ホエイレー(Wha
ley)、1985;プランク(Plank)ら、1996)。各3 mlのアリコットを対応する
緩衝液(クエン酸またはHBS各40 ml;緩衝液を加えた後、振とうして、2500×g
で遠心し、上清を捨てる)。赤血球の濃度は、541 nmでの「吸光度係数」2.394
×10-8 ml/個によって測定する。吸光度係数を得るため、アリコットにおける細
胞数を、ノイバウエル計算盤を用いて決定した後、1%トライトンX-1001μlを
加えて、この溶液の541 nmでの吸光度を測定した。
ウェルプレートのカラム1に、それぞれ10 mMクエン酸ナトリウムpH 5/150 mM N
aCl 150 μlおよびHBS緩衝液に加えた(通常、45 μmolペプチドに対応する)。
他の全てのウェルに緩衝液各150 μlを加えた(それぞれクエン酸およびHBS)。
多チャンネルピペッターを用いて100 μlをカラム1からカラム2に移し、ピペ
ッティングによって混合した。100 μlをカラム2からカラム3に移して同様に
した。カラム11の余剰物100μlは廃棄して、カラム12は緩衝液のみを含む、得ら
れた一連の1.5倍希釈液を緩衝液各50 μlによって100 μlに希釈した(それぞれ
、クエン酸およびHBS)。次に、3×106個ヒト赤血球をそれぞれ加えて、プレー
トをパラフィンによって密封してインキュベーターシェーカー(シリーズ25イン
キュベーターシェーカー;ニューブランズウィックサイエンティフィック社(New
Brunswick Scientific Co.)、ニュージャージー州、アメリカ)で400 rpmで37
℃で1時間振とうする。次に、プレートを2500×gで遠心し、上清各150 μlを平
底96ウェルプレートに移して、放出されたヘモグロビンをELISAプレートリーダ
ーを用いて410 nmで測定した。100%溶解は、1%トライトンX-1001μlをカラ
ム12(平底プレートに移す前)の個々のウェルに加えることによって決定した。
0%溶解は、カラム12における無処置の試料から決定した。
性を示す。コポリマーP3INF7の合成に関して、4つの分画(分子量が小さくなる
順に1〜4)をクロマトグラフィーによる分離(スーパーデックス、ファルマシ
ア社(Pharmacia))によって単離した。これらのうち、画分2と3は、遊離のペ
プチドINF7より高い溶解活性を示した。全ての場合について、溶解活性は厳密に
pH依存的であり、すなわち、中性pHでは溶解を認めなかった(示していない)。
)各40 μgの20 mM HEPES pH 7.4溶液333 μlをピペットで採取してPEI(25 kD
、アルドリッチ社)41.7 μgのHEPES pH 7.4溶液333 μlに加えて混合した。10
〜15分インキュベートした後、ポリマーP3YE5CおよびP6YE5Cのそれぞれ0、0.5
、1、1.5、2荷電等量または3荷電等量のHEPES溶液各333 μlを加えた(または
、第二の実験では0、1、2、3等量および5等量)。ペプチドYE5Cについて述
べると、これはDNA1μgあたりポリマー0 pmol、152 pmol、303 pmol、455 pmo
l、606 pmol、または909 pmolに相当する。DOTAP/コレステロール-DNA複合体はD
OTAP/コレステロール(1:1mol/mol)リポソームの20 mM HEPES pH 7.4溶液33
0 μlおよび等量のDNAから荷電比5で調製した。リポプレックスをコポリマーP3
YE5C0、1、2、3、および5等量の緩衝液溶液330 μlと共にインキュベート
した。複合体の最終DNA濃度は10 μg/mlであった。
ター3000、マルベルンインストルメンツ社(Malvern Instruments))によって測
定し、その後数時間の間様々な時点で測定した。また一方、大きさはエルバッヒ
ャーら(Erbacher、1998)およびエルバッヒャーら(Erbacher、1999)に記載の
ように、電子顕微鏡によって測定した。
鏡写真を示す。
すなわち、プラスミド分子1個が粒子1個にパッケージングされている。
の存在下で一晩インキュベーション コポリマー保護DNA複合体は、同じ条件で直ちに沈殿する保護されていないPEI
-DNA複合体とは対照的に、安定なままであり、凝集しない(示していない)。
折指数、粘度、および誘電率のパラメータは、脱イオン水の値に設定し、これは
概算としての場合に限って有効である。
コレステロール-DNA複合体のゼータ電位を示す。複合体の表面電荷の測定値であ
るゼータ電位は、加えたコポリマーの量を増加させると高度の正から中性を越え
て、わずかに負に低下した。これは、コポリマーがDNA複合体に結合して、その
静電気的電荷を中和または遮蔽していることを示している。
いない限り以下の材料および方法を用いた:
/ウェルの密度で播種する(細胞***速度に応じて。細胞はトランスフェクショ
ンの間70〜80%コンフルエントであるべきである)。
ンのために、培地150 μlを細胞に加えて、次にDNA複合体50 μlを加える。
量20 μlを用いる。最後に、DNA複合体50 μlをトランスフェクションに用いる
。緩衝液:20 mM HEPES pH 7.4/150 mM NaCl=HBS。用いた緩衝液の容量は一定
である。
実験100個を行うように計算すると適当である: DNA:HBS 20×100 μl=総容量2 ml中に1μg×100×1.2=120 μg。
る。
AおよびPEI量に関して2荷電等量(DNAに関して)の量で用いる場合、濃度11.1
μmol/mlでのコーティングポリマーの必要量は、以下の式に従って:
し、例えば、N/P比は4、5、6、7、8でコーティングポリマーの各0、1、
2、3荷電等量を調べる。
らかじめ形成されたPEI-DNA複合体にコーティングポリマーを加え、再度激しく
攪拌する。さらに30分後、DNA複合体各50 μlを、培地150 μl中に存在する細胞
に加える。
Iは、14 mlのポリプロピレンチューブ(例えば、ファルコン2059)において提供
されることが適しているが、他の2つの成分は、6mlチューブ(例えば、ファル
コン2063)で提供される。96ウェルにおける個々の実験に関して、成分はまた96
ウェルにおいて混合することができる。最終容量が1〜1.5 mlの場合、エッペン
ドルフチューブが適している。激しく攪拌する代わりにマイクロピペットを混合
のために用いることができる。
りの容量は例えば各100 μlである。計算は、上記と同様にして行う。12ウェル
プレートの場合、アッセイあたりDNA約1 μgを用いることが適している。
ラスミドDNAと共にインキュベートして、正電荷を持つDNA複合体(例えば、PEI
、N/P=8)を形成する。次に、負電荷を持つコポリマーを加え、これはあらか
じめ形成された複合体に静電気的に結合する。コポリマーは、アステリスクによ
って示すように(右)、受容体リガンドによって改変することができる。
シウム、1 mM ATP、30 μM D-(-)-ルシフェリンの25 mMグリシル-グリシン緩衝
液溶液pH 7.8を用いた。
ラッド社)を用いて測定した:溶解物10 μl(または5μl)に、透明な96ウェ
ルプレート(「平底」タイプ、ヌンク社(Nunc)、デンマーク)の1ウェルあたり
、蒸留水150 μl(または155 μl)およびバイオラッド蛋白質アッセイ色素濃縮
物40 μlを加えた。吸光度は、吸光度リーダー「バイオルミン690」およびコン
ピュータープログラム「Xペリメント」(いずれもモレキュラー・ダイナミクス
社(Molecular Dynamics)、アメリカ)を用いて630 nmで測定した。標準曲線とし
て、濃度50、33.3、22.3、15、9.9、6.6、4.4、2.9、2.0、1.3、0.9ng BSA/μl
、および0 ng BSA/μlを測定した。ウシ血清アルブミン(BSA)は、バイオラッ
ド蛋白質アッセイ標準物質IIとして購入した。このように、結果は最終的に蛋白
質1 mgあたりのルシフェラーゼのpgとして表記しうる。
によるK562細胞への遺伝子移入 K562細胞(ATCC番号 CCL243)は、37℃で5%CO2大気中で、10%FCS、100単位
/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンおよび2 mM グルタミンを添加
したRPMI-1640培地において培養した。トランスフェクション前の夕方、デスフ
ェロキサミンを最終濃度10 μMとなるように加えた。トランスフェクションの直
前に、培地を交換した。培地各160 μl中に細胞50,000個を96ウェルプレートの
ウェルに播種した。トランスフェリン-PEI(hTf-PEI 25 kD)を、本質的にカー
チェイスら(Kircheis、1997)が記載した通りに還元的アミノ付加によって調製
した。PEI分子1個あたりトランスフェリン分子を平均で1.7個をカップリングし
た生成物が得られた。
を明らかに示すhTf-PEIポリプレックスの組成物を決定した。
gのHBS溶液600 μlと合わせた。DNA(pCMVLuc)40 μgのHBS溶液600 μlをピペ
ットによって採取してこの混合物に加えて、混合した。15分後、得られた溶液27
0 μlをポリマーP3YE5CのHBS溶液またはHBSのみの各90 μlにそれぞれ加えた。
これらの溶液は、適用したDNAの荷電に関して0/0.5/1/1.5/2/3荷電等量を含
むポリマー量を含んだ。同様にして、PEIの等量(DNA 40 μg+PEI 42 μg+コ
ーティングポリマー)によってhTfを有しないDNA複合体を調製した。得られた混
合物各60 μl(DNA1μg/ウェルの量に相当)を丸底96ウェルプレートのウェル
5個のそれぞれに加えて、K562細胞50,000個のRPMI培地160 μlをそれぞれ加え
た。24時間後、細胞を遠心によって沈降させた。上清を吸引によって除去して、
溶解緩衝液(250 mMトリスpH 7.8;0.1%トライトンX-100)100 μlを加えた。1
5分間インキュベートして、ピペッティングによって混合した後、96ウェルプレ
ートのフォーマットでルシフェラーゼアッセイを行うために、試料各10 μlを不
透明なプレート(コスター社(Coster))に移した。試料にルシフェリン基質緩衝
液100 μlを加えた。光放出の測定は、マイクロプレートシンチレーションおよ
びルミネッセンスカウンター「トップカウント」(キャンベラ・パッカード社(C
anberra-Packard)、ドライアイヒ)を用いて実施した。計数時間は12秒間であり
、計数の遅延は10分、バックグラウンド計数は自動的に差し引いた。標準物質と
して、各ルシフェラーゼ100、50、25、12.6、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39、0
.2、0.1、0.05、0.025、0.013、0.007 ng、および0 ngの溶解緩衝液溶液(連続
2倍希釈)各10 μlを同じ条件で測定した。較正曲線はこれらの測定から得られ
た。
スフェリンの存在下および非存在下でのK562細胞におけるPEI-DNA複合体(N/P=
8)による遺伝子移入実験の結果を示す。コポリマーは、遺伝子移入を妨害せず
、受容体リガンドがDNA複合体に存在する場合にはその改善でさえも示す。細胞
抽出物における総蛋白質含有量に対して標準化したルシフェラーゼレポーター遺
伝子の発現を示す(1試料あたり3個の平均値および標準偏差)。
ン-DNA複合体による乳癌細胞株MDA-MB435Sのトランスフェクション MDA-MB435S細胞(ATCC??ヒト乳癌細胞株)を37℃で5%CO2大気中で、10%FCS
、100単位/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンおよび2 mM グルタミ
ンを添加したDMEM培地において培養した。トランスフェクション前の夕方、細胞
を平底96ウェルプレートに1ウェルあたり20,000個の密度で播種した。
ルであり、pL170の量は4μgである。この量を1.2倍した。DNA複合体は、下記の
表に示すように混合して、最初にDNAをポリリジンに加えて、15分後、この混合
物をポリマーP3INF7および緩衝液にそれぞれ加えた。実験は1試料あたり3個ず
つ実施した。DNA複合体各60 μlを細胞に加えて、これに培地150 μlを加えた。
4時間後、培地を交換した。24時間後、PBSによって洗浄して、溶解緩衝液100
μlを加えて、ルシフェラーゼおよび蛋白質アッセイ法を実施例9に記載のよう
に実施した。
よるヒト哺乳類癌細胞株MDA-MB435Sへの遺伝子移入実験の結果を示す。コポリマ
ーの非存在下では、測定可能なレポーター遺伝子発現を認めなかった。コポリマ
ーのpH依存的膜破壊、それによるエンドソーム溶解活性は、効率的な遺伝子移入
を生じる。P3INF7の5 nmolおよび10 nmolはそれぞれ、適用したコポリマー結合
ペプチドINF7の量を意味する。
位/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンおよび2 mM グルタミンを添
加したDMEM培地において培養した。
0,000個の密度で播種した。
ソーム242 nmolの同じ緩衝液溶液240 μlを加えた。これによって荷電比(+/-)
は5となる。得られた溶液のうち、210 μlをピペットによって採取して、ポリ
マーP3YE5C6.36 nmolを含む溶液105 μl(ペプチド部分YE5Cに関して;これはDN
A3荷電等量に相当する)に加えた。対照実験に関して、DOTAP/コレステロール-
DNA 210 μlをピペットで採取して20 mM HEPES pH 7.4 105 μlに加えた。得ら
れたDNA複合体各90 μlを細胞に加え、これを新鮮な培地800 μlによって維持し
た。これはDNA 2μg/ウェルに相当する。実験は1試料あたり3個ずつ実施した
。
ipofectamin)(登録商標)について実施した。この場合、荷電比7(+/-)を生
じるリポフェクタミン(DOSPA)の量を用いた。
さらに2mlを加えた。培地は交換しなかった。複合体を添加した22時間後、細胞
をPBSによって洗浄して、溶解緩衝液500 μlによって溶解した。細胞溶解物のア
リコットをルシフェラーゼアッセイ法および蛋白質含有量測定に用いた。
クションの結果を示す。DOTAP/コレステロール-DNAによるトランスフェクション
もリポフェクタミンによるトランスフェクションも有意に減少しなかった(コポ
リマーの3荷電等量。DOTAP/コレステロール-DNAはこの組成物において中性のゼ
ータ電位を示す;図7を参照)。
とPEI-DNAによるHepG2細胞のトランスフェクション HepG2細胞(ATCC HB 8065)を37℃で5%CO2大気中で、10%FCS、100単位/ml
ペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンおよび2 mM グルタミンを添加した
DMEM培地において培養した。
0,000個の密度で播種した。DOTAP/コレステロール-DNAによるトランスフェクシ
ョンは、今回は、ポリマーP6YE5Cを用いたことを除いては、NIH3T3細胞に関して
先に記載した通りに正確に実施した。さらに、DNA7μgのHEPES緩衝液105 μlを
ピペットで採取して同じ容量に溶解したPEI 25 kD 7,3 μgに加えた。15分イン
キュベートした後、この溶液をピペットによって採取して、YE5Cの3荷電等量を
含むポリマーP6YE5C溶液105 μlに加えた。この溶液各90 μlを細胞に加えた。
実験は1試料あたり3個ずつ実施した。
伝子移入を示す。DOTAP/コレステロール-DNAによるトランスフェクションは、有
意に阻害されない。PEI-DNA複合体によるトランスフェクションは減少する(コ
ポリマーの3荷電等量)。
採取してPEI(25 kD、アルドリッチ社)156.4 μlを同容積のHEPES緩衝液溶液に
加えた。15分後、50%グルコース75 μlを加えた。この溶液のうち、各100 μl
をマウスの尾静脈に注入した(動物あたりの用量はDNA 20 μgに相当する)。
バロン(Barron)ら、1998)。この場合、DOTAP対コレステロールのモル比1:
1であって、DOTAPの5%グルコース中での最終濃度が5 mMであるリポソームを
調製した。DNA 130 μgの20 mM HEPES pH 7.4溶液91.1 μlを、リポソーム懸濁
液393.5 μlに加えた。15分後、50%グルコース65 μlを加えた。この溶液のう
ち、各100 μlをマウスの尾静脈に注入した(動物あたりの用量はDNA 20 μgに
相当する)。
しながら加えた。15分後、ポリマーP3YE5C3荷電等量(適用したDNA量の荷電に
関して)のHEPES緩衝液溶液2475 μlを激しく攪拌しながら加えた。さらに30分
後、DNA複合体をセントリコン30チューブにおいて遠心によって濃縮し、DNA濃度
454 μg/mlを得た。次に、50%グルコースおよび20 mM HEPES pH 7.4を加えるこ
とによって、この溶液を最終濃度がDNA 200 μg/ml、および5%グルコースとな
るように調節した。この溶液のうち、各100 μlをマウスの尾静脈に注射した(
動物あたりの用量はDNA 20 μgに相当する)。
65.3 μlに直接加えた。15分後、P3YE5C3荷電等量のHEPES緩衝液216.9 μlを加
えて、さらに30分後、5%グルコース75 μlを加えた。この溶液のうち、各115.
5 μlをマウスの尾静脈に注射した(動物あたりの用量はDNA 20 μgに相当する
)。
3荷電等量)を有するおよび有しないPEI-DNA複合体およびDOTAP/コレステロー
ル-DNA複合体をマウスの尾静脈に注射した(n=6)。動物を注射24時間後に屠
殺して、臓器におけるレポーター遺伝子の発現を測定した。各時間において、注
射部位で最高の活性を測定した。PEI-DNAコポリマーでは、有意なレポーター遺
伝子発現を肺および心臓において認めたのに対し、DOTAP/コレステロール-DNAに
よる肺への遺伝子移入はコポリマーの適用によって阻害された。
N/P=8、0/1.5/3荷電等量のコポリマーP3YE5CおよびP6YE5C)。複合体の大き
さは動的光散乱によって20〜30 nmであると決定された。その後5 M NaClを最終
濃度150 mMとなるように加えた。コポリマーを有しないPEI-DNAは、直ちに凝集
した(5分後、>500 nmの粒子集団が測定可能であった、15分後では粒子の大部
分が>1000 nmであった;複合体は一晩の間に溶液から沈殿した)。P3YE5Cまた
はP6YE5C(1.5または3荷電等量)の存在下ではそれぞれ、粒子の大きさは少な
くとも3日間安定であった。
した。P3YE5CおよびP6YE5C(1.5荷電等量およびそれ以上)の存在下ではそれぞ
れ、粒子径は少なくとも24時間安定であった(図6Cも参照のこと)。
ラーゲンスポンジの調製 プラスミドDNA溶液(CMVプロモーターの制御下でルシフェラーゼをコードする
、濃度0.5 mg/ml水溶液)各500 μlを、マイクロピペットを用いてポリエチレン
イミン溶液(25 kD;アルドリッチ社;521 μg/ml水溶液)各500 μlに加えて、
ピペッティングによって直ちに混合した。得られたベクター溶液をPROCOP(「保
護コポリマー」)P6YE5Cの水溶液500 μlに加え、直ちにピペッティングによっ
て混合した。PROCOP溶液は、P6YE5C各2荷電等量を含んだ。荷電等量はPROCOP中
の(負)電荷とDNAの負電荷の係数を表す。用いられるPROCOPのnmol量を以下の
式によって計算する:
リマーの濃度はポリマー中の(陰イオン)ペプチドの(負)電荷に関して表し、
これは、ペプチドにおけるチロシンの吸光度に基づくペプチド濃度の光分析によ
って決定する。
クロピペッターを用いて4.5×5 cmのタコトップスポンジに適用した(あらかじ
め、市販のスポンジを滅菌ベンチ内でこの大きさの小片に切断して、重量を測定
し、ガラスのペトリ皿に入れて提供する)。室温で2〜3時間インキュベートし
た後、ペトリ皿を短時間、凍結乾燥機(ヘトシックCD4、ヘト社(Heto))の真空
に入れて、その後真空チャンバーから通常の圧力に急激に戻す(「真空負荷」)
。これによって、スポンジにおける気泡が消失し、スポンジは液体に完全に浸漬
する。全体で4時間インキュベートした後、凍結乾燥機で先に凍結せずにスポン
ジをペトリ皿において一晩乾燥させる。その後スポンジは、実験動物に埋め込む
までパラフィン密封したペトリ皿において4℃で保存した。
製 (a) 裸のプラスミドDNAのローディング 滅菌条件において、5%グルコース5 mlに溶解したプラスミドDNA 500 μgを
、ピペットによって4.5×5 cmのタコトップスポンジに適用した。これは、DNA
約20 μg/cm2に相当する。4℃で24時間インキュベートした後、スポンジを凍結
乾燥して(凍結乾燥機ヘトシックCD4、ヘト社、真空<10 μバール)、滅菌条件
で約1.5×1.5 cmの小片に切断した。その結果、そのようなスポンジ片はDNA約45
μgのローディングに対応する。
期間の後に検出不能となる。
あたり濃塩酸80 μlを加えて中和した。この溶液を、セントリコン30濃縮機(ア
ミコン・ミリポア社(Amicon-Millipore))によって、または透析(分子量カット
オフ12〜14 kD)によって低分子量成分から分離した。溶液の濃度は、1級アミ
ンを定量するニンヒドリンアッセイ法によって決定した。
に振とうさせながら加えた。PEIの量は窒素対燐酸比(N/P比)がそれぞれ、8:
1および10:1となるように選択した。この比はPEI中の窒素原子対DNAのヌクレ
オチドの燐酸塩(=負電荷)のモル比である。
位の分子量)
DNA複合体溶液5 mlを、大きさ4.5×5cmのタコトップまたはレソルバスポンジ
にピペットによって適用した。4.5×5 cmあたりDNA 250 μgは、DNA 10 μg/cm 2 に相当し、4.5×5 cmあたりDNA 375 μgは、DNA 15 μg/cm2に相当し、および
4.5×5 cmあたりDNA 500 μgは、DNA 20 μg/cm2に相当する。4℃で24時間イ
ンキュベートした後、調製物を凍結乾燥して滅菌条件で約1.5×1.5 cm片に切断
した(DNA 22,5 μg、34 μg、または45 μgに相当)。
た。
。スポンジ上の発現の増加を認めた(示していない)。
調製した。均一な脂質被膜が試験管の内表面に形成されるように、クロロホルム
をロータリーエバポレーター(ロタベイパーR、ビュキ社(Buchi)、スイス)によ
って除去した。酸素を除去するために、ロータリーエバポレーターにアルゴンガ
スを通気した。試験管を凍結乾燥器の真空に一晩供した。次に、脂質被膜を5%
グルコース溶液15 mlによって、最初は30秒間激しく攪拌しながら、次に超音波
処理(超音波装置:ソノレックスRK510H、バンデリン(Bandelin)30分を行って再
度水和し、これによって安定なリポソーム浮遊液が形成された。
DNA 222 μgが必要である。正電荷がDOTAPに由来し、負電荷がDNAに由来する場
合、荷電比(+/-)は、5:1であるべきである。DNA 222 μgは、負電荷0,67
μmolに相当する。ポリスチレン管において、DOTAPリポソーム3.35 μmolを5%
グルコース溶液によって容量2.5 mlに希釈した。これに、またDNA 222 μgのグ
ルコース溶液2.5 mlを軽く振とうさせながら加えた。
用いて4.5×5 cmタコトップスポンジ上に均一に分布させた。4℃で24時間イン
キュベートした後、スポンジを凍結乾燥してその後1.5×1.5 cmに切断した。
件下で4.5×5 cmのタコトップスポンジに加え、4℃で24時間インキュベートし
て、その後凍結乾燥した。これは1×1 cmあたりDNA 20 μg、1.5×1.5 cmあた
りDNA 45 μgにそれぞれ相当する。
スポンジにローディングすることによって、スポンジ構造全体が溶液で均一に湿
潤していることが証明された。このことから、脂質のクロロホルム溶液に関して
もこれが可能であると結論した。所望の荷電比は5でなければならない。DNA 50
0 μgに関して、これはDOTAP量7.6 μmolを必要とする。したがって、1 mg/ml
DOTAPのクロロホルム溶液5 mlをスポンジにローディングした。その後、スポン
ジを−20℃でインキュベートした後、室温で一晩インキュベートした(クロロホ
ルムを蒸発させるため)。スポンジを滅菌条件で約1.5×1.5 cmの小片に切断し
た。
溶液5 mlをピペットを用いて、4.5×5 cmタコトップ、ティシューフリース、
およびレソルバスポンジにそれぞれ適用し、−20℃で約1時間インキュベートし
た。クロロホルムは室温で一晩蒸発させた。DNA(pCMVLuc)500 μgの5%グル
コース溶液をピペットで4.5×5cmスポンジあたり5 ml適用して、4℃で24時間
インキュベートし、その後凍結乾燥した。これはDNA 20 μg/cm2に相当する。
lである)をクロロホルム各2.5 mlに溶解して、その後合わせた。この溶液をピ
ペットによって4.5×5 cmのタコトップスポンジに適用して、−20℃で1時間イ
ンキュベートした後、室温でクロロホルムを蒸発させた。DNA(pCMVLuc)500 μ
gの5%グルコース溶液5 mlをピペットで4.5×5cmスポンジに適用して、4℃
で24時間インキュベートし、凍結乾燥した。その後、スポンジを約1.5×1.5 cm
の小片に切断した。
度2 mMで調製した。タコトップスポンジ(ナイコムド(Nycomed))を半分(=4.
5×5cm)に切断して、50 mlのポリプロピレンねじ口管においてこの溶液各30 m
lに浸漬した後、シェーカーインキュベーター内で2時間インキュベートした。
スポンジがクロロホルム溶液に完全に浸漬されるように、凍結乾燥器において、
間欠的にキャップを開けてチューブを短時間わずかに排液した(「真空負荷」)
。スポンジを最終的にクロロホルム浴からガラスのペトリ皿に移して、真空下で
一晩乾燥させた。DNA(pCMVLuc)500 μgの5%グルコース溶液5 mlをピペット
で4.5×5cmスポンジに滴下して室温で4時間インキュベートして、凍結乾燥し
た。その後スポンジを1.5×1.5 cm片に切断した。そのような調製物は、実施例1
9に記載したように、インビトロでの遺伝子移入のために用いた。
ンジ上の発現は一定のままであり、長期間持続する。図15。
、混合し、ピペットによって4.5×5 cmのタコトップスポンジに適用して、37℃
で一晩インキュベートした。コラーゲン中のリジンのアミノ基はSPDPにおける活
性化エステルのカルボキシル基との求核置換反応において反応する。
って測定されなくなるまで、蒸留水によって定量的に洗浄した(14 mlファルコ
ンチューブにおいて;ベクトン・ディッキンソン社(Becton Dickinson)、アメリ
カ)。その後、スポンジを凍結乾燥して、約1.5×1.5 cm片に切断する。スポン
ジ片の重量を測定した(ザルトリウス社(Sartorius)のMC1天秤、ゲッチンゲン)
。カップリングしたSPDPを測定するため、スポンジ片をHBS2mlおよびβ-メルカ
プトエタノール3μlと共にインキュベートした。この手順において放出された
チオピリドンを342 nmで光分析によって測定した(ε=8080 l/mol)。置換は、
以下の式に従って計算する:
.45 nmol SPDP/mgコラーゲンを有するスポンジも調製した。
ジにジスルフィド架橋によってカップリングするために、チオール基をPEIに導
入しなければならない。これは、2-イミノチオランのPEIへのカップリングによ
って行った。
た。1/15容量1 M HEPES pH 7.9を加えた。次に反応を室温で約20分継続した。
セントリコン30チューブにおいて繰り返し遠心を行うことによって、過剰量の試
薬を除去した。PEI上の遊離のチオール基をエルマン試薬によって決定した。
ジル基の比に関して)をSPDP-スポンジ片に加えた。室温で7日後、反応は完了
した。これを、342 nmでの吸光度の光分析による測定によって決定した。スポン
ジ上のSPDPの100%がPEI-SHと反応した。
ですすいだ。次にスポンジを凍結乾燥した。
スポンジ片にローディングして、4℃で24時間インキュベートして、凍結乾燥し
た。
ンの平均的な置換を得た。しかし同様に、12.8 nmol SPDP/mgコラーゲンを有す
るスポンジも調製した。配列(KKKK)2KGGCのペプチドSFO7-SHの0.1 M HEPES pH 7
.9溶液300 μlをSPDP基に対して2倍モル濃度過剰量でスポンジに適用した。反
応は、チューブの空気空間をアルゴンで手短にすすいだ14 mlファルコンチュー
ブ中で実施した。室温で2日後、反応は60%完了であった。これは上清の342 nm
での吸光度によって測定した(放出されたチオピリドンの定量)。カップリング
したペプチド量の計算は、PEIに関して記述したように実施した。
洗浄した。その後、スポンジを凍結乾燥した。
ジ片あたり500 μl適用して4℃で24時間インキュベートして、凍結乾燥した。
定 (a) 実験動物 体重300〜400 gの72ヶ月齢のウィスターラット(チャールスリバードイツGm
bH、スルツフェルド)を実験動物として使用した。ラットをマクロロン4型ケー
ジに最大収容5匹の群で維持した。唯一の栄養として、動物に、ラットマウス用
固形飼料アルトロミン1324(アルトロミン社(Altomin)、ラゲ/リッペ、ドイツ
)を自由に与え、水を自由に与えた。動物は滅菌した埃のない軟チップ上で維持
し、これを週に2回交換する。実験動物維持の規則に従って、動物は、室温20〜
25℃で一定の空気換気を維持する従来の動物飼育施設の専用室に順応させた。相
対湿度は60〜70%である。照明は明暗サイクル各12時間である。光の強度は50〜
100ルクスである。動物は施設の動物施設において実験前少なくとも2週間維持
して、手術前に絶食していない。
麻酔装置(MDSマトリクス麻酔装置): これは滅菌空気を処理して新鮮な空気を提供する換気装置を有する循環システ
ムである。長所は、注射された麻薬の必要なく外科的に認容される一定の吸入と
、麻酔の深さの微調整が可能であることである。
ode Chemie)、ハンブルグ、ドイツ) ・ ベパンテン(Bepanthen)(登録商標)ロシュ眼科用軟膏(ホフマン・ラロシ
ュ(Hofman-La Roche) AG、グレンザック-ヴィーレン、ドイツ) ・ ラット識別のための耐水性ペン ・ 滅菌使い捨て手袋 ・ 以下からなる機器の滅菌手術セット: 解剖用鉗子1 手術用鉗子1 鈍麻刃を備えたレクサー鋏1 凸面メッツェンバウム鋏(尖/尖)1 針固定ガーゼ綿1 ・ 手術用縫合糸:モノフィル、ブルー、長さ45 cm、先尖りの添付針を有する4
/0プロレン(4/0 Prolene)(登録商標)縫合糸 ・ 滅菌使い捨て15番メス ・ 1実験群あたり番号をつけて重量を測定したスポンジ14個(動物7匹)
置に接続した全身用チャンバーに、麻酔を開始する前に酸素/4%イソフルラン
(350 cm3/分)を約2分間満たした。これは、最も迅速であることを保証する麻
酔薬の対応する濃度を得るために実施し、麻酔のこのより緩やかな開始を可能に
する(短い興奮段階)。ラットを全身チャンバーに入れて、吸入ガスの初回濃度
を、1〜2分後、正向反射が失われ(ラットは仰向けのままである)、麻酔段階
III. 1〜2に達するまで一定に保持する。ラットをチャンバーから取り出し、腹
部を下に向けて置き、頭部チャンバーを提供する。動物が麻酔段階III. 2、手術
に耐えられる段階(足の引っ込め反射が陰性でなければならない)に達すると、
イソフルランの供給を1.5%に減少する。眼瞼反射の喪失による角膜の乾燥を防
止するために油脂性眼科用軟膏を両眼に適用する。腰部領域(最後の肋骨と後肢
との間の背部領域)に、バリカンを用いて7×2cmの領域の毛を刈った後洗浄し
て、皮膚領域をキュタセプト噴霧ガーゼ綿によって消毒する。皮膚を内側から約
2 cm外科用鉗子でつかみ、背腹方向にメスで1cmの切開部を作成する。メッツ
ェンバウム鋏を用いて、皮膚切開部を鈍器で広げ、皮下組織を頭蓋方向に約3cm
皮下剥離する。創傷の頭蓋末梢部は外科用鉗子によって開いておき、調製したス
ポンジを皮下剥離した組織の中を頭蓋方向に可能な限り遠くに進行させる。切開
部をU型クランプで閉じる。同じ手順を左側についても繰り返す(5〜7を参照
)。O2潅流を継続している間はイソフルランの供給を中止する。燕下反射が再出
現した後、ノバルジン(Novalgin)(登録商標)(活性物質:メタミゾールナトリ
ウム;ヘキストAG社(Hoechst AG)、フランクフルト、ドイツ)0.1 mlを非ステロ
イド性鎮痛薬として動物に経口投与する。動物を意識が完全に回復するまで個別
ケージに収容して、約1時間後元のケージに戻す。
(MDSマトリクス麻酔装置): ・ 蓋付きの透明なアクリルガラス全身チャンバー ・ 頭部チャンバー ・ 滅菌使い捨て手袋 ・ 機器滅菌手術セット(上記参照) ・ 50,000 I.E.ヘパリン(ラチオファーム(ratiopharm)(登録商標)GmbH、ウ
ルム/ドノータル(Ulm/Donautal)、ドイツ、ヘパリンナトリウム25,000 I.Eの
2×5ml注射液)を有する、等張塩化ナトリウム注入液(デルタファーマ(Delta
-Pharma) GmbH、ヒューリンゲン、ドイツ)1000 ml ・ 注入チューブ ・ 蝶型カニューレ19G
る。これは、その後のルシフェラーゼアッセイ法をおそらく妨害する多くの要因
(例えば、ヘモグロビン)を最小限に減少させることをねらいとする。2 mlね
じ付きキャップホモジネーションチューブ(使い捨て、円錐形の2.0 mlのキャッ
プ付きねじ口チューブ、VWRサイエンティフィックプロダクツ(VWR scientific p
roducts)、ウェストチェスター、アメリカ)に、大きいホモジナイゼーションビ
ーズ(ジルコニアビーズ、直径2.5 mm、バイオスペックプロダクツインク(Biosp
ec Products)、バートルスビル、アメリカ)および動物実験用溶解緩衝液各750
μl(10 ml、5×レポーター溶解緩衝液;プロメガコーポレーション(Promega C
orporation)、マジソン、アメリカ;+40 ml dd H2O+プロテアーゼ阻害剤コン
プリート(登録商標);ベーリンガーマンハイムGmbH、ドイツ、1錠)を0.3 ml
の印まで満たす。これらのチューブに回復したスポンジを入れる。
た。動物を背側位に置いた。腹腔をはさみで正中線で切開して、臍帯前胸板から
胸骨柄に伸びる切開部を作製した。減張切開を最終肋骨の左右に作製した。尾大
静脈を暴露して、蝶型カニューレを腎静脈との接合部の尾位に挿入する。注入溶
液を接続する。約5mlを注入した後、尾大静脈を挿入点の尾側位でメスによって
切開する。動物を注入溶液100〜150 mlで潅流して、肝臓の明確な脱色が明らか
になるまで血液を除去(desanguinize)する。ラットを背側位に置く。メスを用
いて、頭蓋方向に腰部領域から伸びる正中領域の皮膚を約7cm切開する;減張切
開を埋め込み創傷の左右尾側に作製する。鋏とメスをそれぞれ用いてスポンジを
大きく解離させ、周辺組織と共に摘出する(結合組織および背側最長筋の約1cm
部分)。各回収したスポンジ(周辺組織)を1×PBS緩衝液で洗浄し;スポンジ
と組織を分離して、予め調製してラベルを付けたホモジナイゼーションチューブ
に移す。次に満たしたチューブを氷中入れて、可能であれば直ちに処理する。
標)(バイオスペックプロダクツインク、バートルスビル、アメリカ)を用いて
3×20秒間ホモジナイズした後、14,000 rpmで4℃で10分遠心する。
96ウェルプレートに移す(半透明プレート-固体黒色96ウェル、コーニングコス
ターコーポレーション(Corning Coster Corporation)、ケンブリッジ、アメリカ
)。ウェル1個あたり、ルシフェラーゼ緩衝液(プロメガルシフェラーゼアッセ
イシステム、プロメガコーポレーション、マジソン、アメリカ)100 μlを加え
て、1分間の計数遅延で12秒間測定する。
スポンジは実施例15および16にそれぞれ記載したように調製し、実施例16に記載
したようにウィスター系ラットの皮下に埋め込んだ。遺伝子発現をまず3日後に
測定した。本発明のコポリマーをコーティングしたPEI-DNA複合体をローディン
グしたコラーゲンスポンジのみが、この実験セットアップにおいて検出可能なレ
ポーター遺伝子発現を生じる(数値はfgルシフェラーゼ/mg蛋白質)。
の放出 (a) ニックトランスレーションによるプラスミドDNAの放射活性標識 アマシャム社(Amersham)のニックトランスレーションキット(# N5500)を用
いた。標識反応あたり、DNA1μg(pCMVβGal)を用いた。直鎖状DNAに関して提
案された15℃で2時間の代わりに反応時間が15℃で15分となるように製造元のプ
ロトコールを変更した。比活性3000 Ci/mmol(アマシャム社、フライブルク)の
[α-32P]dATPをヌクレオシド三燐酸として用いた。取り込まれていない[α-32P]
dATPの分離は、ゲル濾過の原理および「ヌクトラッププローブ精製カラム」とア
クリルガラス遮蔽固定装置「プッシュカラムベータ遮蔽装置」(いずれもストラ
タジーン社(Stratagene))、ハイデルベルク)の製造元のプロトコールに従っ
て実施した。得られたプラスミドをアガロースゲル電気泳動(1%アガロースゲ
ル、100 V、35分、エチジウムブロマイド染色)によって調べた。これを非標識
プラスミドと混合してローディングし、UV光の下で電気泳動後オートラジオグラ
フィーによって可視化して、ゲルを乾燥させた。これによって、ニック標識の間
に形成されたプラスミド断片の大きさと相対的な画分を評価することができる。
放射活性標識DNAを酵素から分離するために、「プロメガウィザード(Promega Wi
zard)(登録商標)PCRプレップスDNA精製システム」(プロメガ社、アメリカ)
を、装置に関する製造元のプロトコールに軽微な改変を加えて用いた。
均重量は5 mgであった。次に、1 mg/ml DOTAPのクロロホルム溶液450 μlをピ
ペットでスポンジに適用して、−20℃で1時間インキュベートした後、室温でク
ロロホルムを蒸発させ、スポンジの重量を測定した。これらのDOTAPスポンジを
6ウェルプレートのウェルに入れた。非標識プラスミド20 μg(1例では40 μg
)とスポンジ5mgあたり放射活性標識生成物それぞれ10 μlおよび30 μlとの混
合物を、5%グルコース溶液の総容量200 μlでピペットを用いてスポンジに適
用し、4℃で2〜24時間インキュベートして、凍結乾燥した。
ンジを6ウェルプレートのウェルに入れた。スポンジ5 mgあたり非標識プラス
ミドDNA 20 μgと放射活性標識DNA 10または30 μl(5%グルコース溶液の総容
量200 μl)をピペットでローディングして、4℃で2〜24時間インキュベート
して凍結乾燥した。
識DNA 122.1 μl(5%グルコース溶液の総容量2ml)をピペットでローディン
グして、4℃で12時間インキュベートして凍結乾燥した。スポンジを約1.5×1.5
cmの小片に切断して、各小片の重量を測定した。スポンジ調製の際の凍結乾燥
時に細胞培養皿に残っている適用したDNA画分を決定するために、プレートの蓋
と底を10×SDS2mlですすぎ、それぞれの40 μlアリコットを測定した。
μg/cm2であった。したがって、DOTAP5mgとコレステロール2.95 mg(各305 nm
ol)をクロロホルム各2.5 mlに溶解して、その後合わせた。この溶液を4.5×5c
mタコトップスポンジにピペットで適用し、−20℃で1時間インキュベートした
後、室温でクロロホルムを蒸発させた。非標識プラスミドDNA 500 μlおよび放
射活性標識DNA 122.1 μlを(総容積5%グルコース溶液2 ml)4.5×5cmスポ
ンジにピペットでローディングして、4℃で24時間インキュベートして凍結乾燥
した。スポンジを1.5×1.5 cmの小片に切断して、各小片の重量を測定した。ス
ポンジ調製の際の凍結乾燥時に細胞培養皿に残っている適用したDNA画分を決定
するために、プレートの蓋と底を10×SDS2mlですすぎ、それぞれの40 μlアリ
コットを測定した。
ドDNA 500 μgと放射活性標識DNA 122.1 μlをN/P比6)をピペットによってロ
ーディングした。4.5×5cmあたりのDNA 500 μgはDNA 20 μg/cm2に相当する。
4℃で24時間インキュベートした後、調製物を凍結乾燥して、約1.5×1.5 cmの
小片に切断して、各小片の重量を測定した。スポンジ調製の際の凍結乾燥時に細
胞培養皿に残っている適用したDNA画分を決定するために、プレートの蓋と底を1
0×SDS2mlですすぎ、それぞれの40 μlアリコットを測定した。
Aを含むことを一つの例外として、実施例16に記載のように調製した。
を一つの例外として、実施例15に記載のように調製した。
培養管、ブランド社(Brand)、ドイツ)にそれぞれPBS1mlと共に入れた。試験管
を3,000 rpmで手短に遠心して(セントリフュージ:メガフュージ2.0 R、ヘラエ
ウス(Heraeus)、ミュンヘン)、80rpmまたは120 rpmの水浴シェーカー中で37℃
で振とうした。1時間後、1日後、3日後、およびその後3日ごとに、上清中の
放射活性DNAの量を決定した。この目的のため、試験管を3,000 rpmで遠心して、
短く激しく攪拌した。上清40 μlを採取して、PBS 40 μlと交換した。試料を、
白色96ウェル不透明プレートのウェル(タイプ、「平底、無処置」、コスター社
、アメリカ)において、マイクロシント20 高効率LSC-カクテル(パッカード社
、アメリカ)160 μlと共に混合し、トップカウント装置(キャンベラ-パッカー
ド社、アメリカ)を用いて半減期を自動的に修正して計数した。計数時間は5分
、計数遅延は10分、そして3回測定の平均値を得た。参考として、標識プラスミ
ドDNA2μlを測定した。DNA(cpm/ml)の測定した濃度を予め採取した試料につ
いて補正した(予め採取した量を合計して、測定値に加えた)。スポンジ調製の
際の凍結乾燥時に細胞培養皿に残っている適用したDNA量を決定するために、デ
ィッシュをPBS 500 μlですすぎ、その40 μlアリコットを測定した。一連の測
定の終了時(例えば、インキュベーション30日後)、適用した用量の100%を回
収できるか否かを決定するために、スポンジを1%SDS溶液によって処理した。
この目的のため、スポンジを新しいファルコンチューブに移して、1%SDS1ml
を加え、試料を繰り返し激しく振とうさせながら1日インキュベートした。次に
、上清40 μlを採取して、白色の96ウェル不透明プレートのウェルにおいて、マ
イクロシント20 160 μlと共に混合し、放射活性をトップカウント装置を用いて
計数した。
放出し、その後ほぼ直線的に遷延性の放出を示した。対照的に、ベクターローデ
ィングスポンジは、せいぜい5%の小さい初回放出を示し、その後時間単位あた
り軽微な放出を長時間示す。このことは、調べたベクターのコラーゲンマトリク
スとの効率的な結合を示す。
小さいエチジウムブロマイド染色1%アガロースゲル上で、上清各20 μlに100
Vで35分間の電気泳動を行った。対照として、非標識プラスミドDNAとリポソーム
-DNA複合体(荷電比5:1)1μgをゲルにローディングした。ゲルをUV光の下
で写真を撮影し、その後乾燥させて、X線フィルム上に露出した。
上でのNIH 3T3細胞のトランスフェクション 細胞培養プレート(TPP社の6ウェルプレート)において、ウェルあたりトリ
プシン処理したNIH 3T3マウス線維芽細胞(接着細胞)約50,000〜400,000個を、
抗生物質(500単位ペニシリン、50 mgストレプトマイシン/500 ml)および10%
仔ウシ胎児血清と共に1.028 g/l N-アセチル-L-アラニル-L-グルタミンを添加し
たDMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)培地4mlにおいて播種する。細胞を5%
二酸化炭素を含む空気中で37℃で1〜2日間インキュベートする。実施例15およ
び16に従ってそれぞれ調製したコラーゲンスポンジ(1.5×1.5 cm)1個を、細
胞を播種した1〜2日後にウェルの適当な数のそれぞれに入れて、5%二酸化炭
素大気中で37℃で約3日間インキュベートする。ルシフェラーゼ発現の第一の測
定は、1〜3日間の間に実施する。この目的のため、コラーゲンスポンジを除去
した後、接着細胞を有するウェルを燐酸緩衝溶液(PBS)によって3回洗浄して
、その後溶解緩衝液(0,1%トライトンの250 mMトリスpH 7.8溶液)500 μlによ
って処理した。その後、ルシフェラーゼ活性を下記のように決定する。
有する新鮮なウェルに入れ、5%二酸化炭素大気中で37℃で約3日間インキュベ
ートする。その後、コラーゲンスポンジをウェルから除去して、接着細胞を洗浄
し、上記のように溶解緩衝液によって処理し、下記のようなルシフェラーゼ活性
の定量を行った。この方法は、開始するために選択した個々のセットアップの数
に応じた任意の回数を繰り返す。このように、A)に従って調製したコラーゲン
スポンジがトランスフェクトすることができる、すなわち細胞においてルシフェ
ラーゼ活性の発現に至る程度を、少なくとも6週間の期間にわたって決定するこ
とができる。
。同じように、組織培養皿における細胞をPBSによって洗浄した。洗浄の際に最
終的にスポンジから剥離した細胞を遠心分離により洗浄溶液から沈殿させて、ル
シフェラーゼ発現を個別に調べた。これに由来する値をスポンジ上でのルシフェ
ラーゼ発現に加えた。スポンジ上の細胞を溶解緩衝液1mlを加えることによって
溶解した。ウェル中の細胞を溶解緩衝液500 μlを加えて溶解した。細胞溶解物1
0〜50 μlを黒色の96ウェルプレートにおいてルシフェリン基質緩衝液各100 μl
と共に混合した。得られた光放出の測定は、マイクロプレートシンチレーション
およびルミネッセンスカウンター「トップカウント」(キャンベラ・パッカード
社、ドライアイヒ)を用いて実施した。計数時間は12秒間であり、計測遅延時間
は10分間、そしてバックグラウンド値は自動的に差し引いた。標準物質としてル
シフェラーゼ100、50、25、12.6、6.25、3.13、1.57、0.78、0.39、0.2、0.1、0
.05、0.025、0.013、0.007 ng、および0 ngの溶解緩衝液溶液(=連続2倍希釈
)各50 μlを同じ条件で測定した。較正曲線はこれらの測定から誘導した。
シフェリンの25 mMグリシル-グリシン緩衝液pH 7.8
ュンヘン)を用いて決定した:溶解物10 μl(または5μl)に、蒸留水150 μl
(または155 μl)とバイオラッド蛋白質アッセイ色素濃縮物40 μlを透明な96
ウェルプレート(「平底」タイプ、ヌンク社、デンマーク)のウェルに加えた。
吸光度は吸光度計「バイオルミン690」およびコンピュータープログラム「Xペ
リメント」(いずれもモレキュラー・ダイナミクス社、アメリカ)を用いて630
nmで測定した。較正曲線として、濃度50、33.3、22.3、15、9.9、6.6、4.4、2.9
、2.0、1.3、0.9 ng BSA/μl、および0 ng BSA/μlを測定した。ウシ血清アル
ブミン(BSA)は、バイオラッド蛋白質アッセイ標準物質IIとして購入した。こ
のように、結果は蛋白質1 mgあたりのルシフェラーゼのpgとして表記しうる。
に示す。コポリマー保護遺伝子ベクターをローディングしたスポンジに関する類
似の実験を図16Bに示す。図16Dは、対照実験の結果を示す。この目的のため、ト
ランスフェクションの前日に(すなわち1日目)、NIH3T3線維芽細胞を6ウェル
プレートのウェルあたり細胞450,000個の密度で播種した。トランスフェクショ
ンの直前に、培地を新鮮な培地1.5 mlに交換した。DNA複合体を総容量500 μlで
加え(2日目)、4時間インキュベートした後、培地を交換した。3日目、コラ
ーゲンスポンジの大きさ1.5×1.5 cmの無処置の小片を各ウェルに加えた。6日
目、新鮮な細胞を新鮮な6ウェルプレートに播種した(細胞450,000個/ウェル
)。7日目、スポンジ3個を除く全てのスポンジをこれらのウェルに移動した。
スポンジ3個と全てのスポンジを採取したウェルにルシフェラーゼアッセイ法を
行った。10日目、スポンジ3個を除く全てを空のウェルに移動させて、培地2ml
中でさらにインキュベートした。これらのスポンジおよびそこからスポンジを移
動した全てのウェルにルシフェラーゼアッセイ法を行った。図16Dにおいて示し
たその後の時点で、スポンジ各3個と、ウェルの底に沈降した細胞をルシフェラ
ーゼ発現に関して分析した。
全く測定できなくなることを示している。このことは、他の場合(図15および16
A〜C)、有意に高いルシフェラーゼ発現は、固定したベクターによる持続的なデ
ノボトランスフェクションに帰因することを意味する。したがって、当初トラン
スフェクトした細胞のいかなる選択も扱っていない。この通りであれば、対照実
験におけるルシフェラーゼ発現は、他の実験と同様に高いレベルで持続しなけれ
ばならない。
びO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000、またはO,O'-ビス
(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400からコポリマーバックボーンの
調製。
チレングリコール)6000からのコポリマーバックボーンの調製。
顕微鏡写真。
PEI-およびDOTAP/コレステロール-DNA複合体のゼータ電位。
-DNA複合体によるK562細胞への遺伝子移入。
るポリリジン-DNA複合体による乳癌細胞株MDA-MB435Sのトラスフェクション。
のリポフェクション。
-DNAおよびPEI-DNAによるHepG2細胞のトランスフェクション。
インビボ静脈内遺伝子移入。
性標識DNAの放出。スポンジは実施例17に記載のように調製した。裸のDNAの場合
、適用した用量の約50%が能動的に結合したのに対し、半数は直ちに放出される
。その後の放出速度論は、ほぼ直線の経過をたどる。遺伝子ベクターをスポンジ
にローディングするとすると、90%の画分が堅固に結合し、指数的放出プロフィ
ールによって長期間にわたって放出される。陽イオン誘導体化スポンジ(「PEI-
SPDP」および「ペプチド-SPDP」)は、裸のDNAに効率よく結合して、ベクターを
ローディングしたスポンジと類似の放出速度論を示す。
マウス線維芽細胞への遺伝子移入。スポンジは実施例16に記載のように調製し(
変法に従って調製した裸のDNA、PEI-DNA、DOTAP-コレステロール-DNA)、実施例
18に記載するように遺伝子輸送に用いた。DOTAP-コレステロールスポンジの場合
、調製物を細胞接着層に加えたか(左)、または新たにトリプシン処理した細胞
をスポンジにローディングした(右)。その後の実験の過程は全てのセットアッ
プについて同一であった。レポーター遺伝子発現は様々な時間経過に対してアッ
セイしたところ、特にスポンジ上/内で増殖する細胞において長期間にわたって
持続する。
採取してPEI(25 kD、アルドリッチ社)156.4 μgを同容積のHEPES緩衝液溶液に
加えた。15分後、50%グルコース75 μlを加えた。この溶液のうち、各100 μl
をマウスの尾静脈に注入した(動物あたりの用量はDNA 20 μgに相当する)。
バロン(Barron)ら、1998)。この場合、DOTAP対コレステロールのモル比1:
1であって、DOTAPの5%グルコース中での最終濃度が5 mMであるリポソームを
調製した。DNA 130 μgの20 mM HEPES pH 7.4溶液191.1 μlを、リポソーム懸濁
液393.5 μlに加えた。15分後、50%グルコース65 μlを加えた。この溶液のう
ち、各100 μlをマウスの尾静脈に注入した(動物あたりの用量はDNA 20 μgに
相当する)。
スポンジは実施例15および16にそれぞれ記載したように調製し、実施例17に記載
したようにウィスター系ラットの皮下に埋め込んだ。遺伝子発現をまず3日後に
測定した。本発明のコポリマーをコーティングしたPEI-DNA複合体をローディン
グしたコラーゲンスポンジのみが、この実験セットアップにおいて検出可能なレ
ポーター遺伝子発現を生じる(数値はfgルシフェラーゼ/mg蛋白質)。
の放出 (a) ニックトランスレーションによるプラスミドDNAの放射活性標識 アマシャム社(Amersham)のニックトランスレーションキット(# N5500)を用
いた。標識反応あたり、DNA1μg(pCMVβGal)を用いた。直鎖状DNAに関して提
案された15℃で2時間の代わりに反応時間が15℃で15分となるように製造元のプ
ロトコールを変更した。比活性3000 Ci/mmol(アマシャム社、フライブルク)の
[α-32P]dATPをヌクレオシド三燐酸として用いた。取り込まれていない[α-32P]
dATPの分離は、ゲル濾過の原理および「ヌクトラッププローブ精製カラム」とア
クリルガラス遮蔽固定装置「プッシュカラムベータ遮蔽装置」(いずれもストラ
タジーン社(Stratagene))、ハイデルベルク)の製造元のプロトコールに従っ
て実施した。得られたプラスミドをアガロースゲル電気泳動(1%アガロースゲ
ル、100 V、35分、エチジウムブロマイド染色)によって調べた。これを非標識
プラスミドと混合してローディングし、UV光の下で電気泳動後オートラジオグラ
フィーによって可視化して、ゲルを乾燥させた。これによって、ニック標識の間
に形成されたプラスミド断片の大きさと相対的な画分を評価することができる。
放射活性標識DNAを酵素から分離するために、「プロメガウィザード(Promega Wi
zard)(登録商標)PCRプレップスDNA精製システム」(プロメガ社、アメリカ)
を、装置に関する製造元のプロトコールに軽微な改変を加えて用いた。
びO,O'-ビス(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)6000、またはO,O'-ビス
(2-アミノエチル)ポリ(エチレングリコール)3400からコポリマーバックボーンの
調製。
チレングリコール)6000からのコポリマーバックボーンの調製。
顕微鏡写真。
PEI-およびDOTAP/コレステロール-DNA複合体のゼータ電位。
-DNA複合体によるK562細胞への遺伝子移入。
るポリリジン-DNA複合体による乳癌細胞株MDA-MB435Sのトラスフェクション。
のリポフェクション。
-DNAおよびPEI-DNAによるHepG2細胞のトランスフェクション。
インビボ静脈内遺伝子移入。
性標識DNAの放出。スポンジは実施例18に記載のように調製した。裸のDNAの場合
、適用した用量の約50%が能動的に結合したのに対し、半数は直ちに放出される
。その後の放出速度論は、ほぼ直線の経過をたどる。遺伝子ベクターをスポンジ
にローディングするとすると、90%の画分が堅固に結合し、指数的放出プロフィ
ールによって長期間にわたって放出される。陽イオン誘導体化スポンジ(「PEI-
SPDP」および「ペプチド-SPDP」)は、裸のDNAに効率よく結合して、ベクターを
ローディングしたスポンジと類似の放出速度論を示す。
マウス線維芽細胞への遺伝子移入。スポンジは実施例16に記載のように調製し(
変法に従って調製した裸のDNA、PEI-DNA、DOTAP-コレステロール-DNA)、実施例 19 に記載するように遺伝子輸送に用いた。DOTAP-コレステロールスポンジの場合
、調製物を細胞接着層に加えたか(左)、または新たにトリプシン処理した細胞
をスポンジにローディングした(右)。その後の実験の過程は全てのセットアッ
プについて同一であった。レポーター遺伝子発現は様々な時間経過に対してアッ
セイしたところ、特にスポンジ上/内で増殖する細胞において長期間にわたって
持続する。
Claims (15)
- 【請求項1】 担体と、一つまたはそれ以上の核酸分子と一つまたはそれ以
上の一般式Iの荷電コポリマーとを含む複合体との配合剤: 【化1】 式中Rは、両親媒性ポリマーまたはそのホモもしくはヘテロ二官能誘導体である
、および 式中Xは i) アミノ酸もしくはアミノ酸誘導体、ペプチドもしくはペプチド誘導体、ま
たはスペルミンもしくはスペルミジン誘導体である;または ii) Xは 【化2】 であり、式中 aはH、または選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換、C1〜C6アルキル
である;ならびに b、c、およびdは、同じまたは異なり、選択的にハロゲンもしくはジアルキルア
ミノ置換C1〜C6アルキレンである;または iii) Xは 【化3】 であり、式中 aは、H、または選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置換C1〜C6アルキル
である、および bおよびcは、同じまたは異なり、選択的にハロゲンもしくはジアルキルアミノ置
換C1〜C6アルキレンである;または iv) 式中、Xは W、Y、およびZが以下の意味を有する、三つの官能基W1Y1Z1を有する置換芳香族
化合物である; 式中、 W、YまたはZは、同じまたは異なる基CO、NH、OもしくはS、またはSH、OH、NH、
もしくはNH2と反応することができるリンカーを有する; およびイフェクター分子Eは、 陽イオン性もしくは陰イオン性ペプチドもしくはペプチド誘導体、スペルミンも
しくはスペルミジン誘導体、グリコサミノグリカン、または非ペプチド性オリゴ
/ポリカチオンもしくは陰イオンである; mおよびnは独立して互いに0、1、または2である; pは好ましくは3〜20である;ならびに lは1〜5、好ましくは1である。 - 【請求項2】 コポリマーの両親媒性ポリマーが酸化ポリアルキレンである
、請求項1記載の配合剤。 - 【請求項3】 コポリマーの両親媒性ポリマーがポリアルキレングリコール
である、請求項2記載の配合剤。 - 【請求項4】 コポリマーにおけるXまたはEが荷電ペプチドまたはペプチド
誘導体である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の配合剤。 - 【請求項5】 高等真核細胞に対するリガンドがコポリマーにカップリング
している、請求項1〜4のいずれか一項に記載の配合剤。 - 【請求項6】 核酸分子(群)が有機ポリカチオンまたは陽イオン性脂質分
子と縮合し、それによって形成された複合体の表面に、一般式Iの一つまたはそ
れ以上の荷電コポリマーがイオン相互作用を通じて結合する、請求項1〜5のい
ずれか一項に記載の配合剤。 - 【請求項7】 治療的に有効な核酸分子を含む、請求項1〜6のいずれか一
項に記載の配合剤。 - 【請求項8】 担体が生物学的に再吸収されない材料からなる、請求項1〜
7のいずれか一項に記載の配合剤。 - 【請求項9】 担体が生物学的に再吸収可能な材料からなる、請求項1〜7
のいずれか一項に記載の配合剤。 - 【請求項10】 生物学的に再吸収可能な材料がコラーゲンである、請求項
9記載の配合剤。 - 【請求項11】 担体がコラーゲンスポンジである、請求項10記載の配合剤
。 - 【請求項12】 担体が、請求項1において定義したコポリマーのクロスリ
ンクによって得ることができる担体である、請求項1〜7のいずれか一項に記載
の配合剤。 - 【請求項13】 核酸を細胞に移入するための、請求項1〜12のいずれか一
項に記載の配合剤の使用。 - 【請求項14】 請求項1〜12のいずれか一項に記載の配合剤を含む薬学的
組成物。 - 【請求項15】 担体と、請求項1において定義したコポリマーまたは複合
体とを含むキット。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP99112260A EP1063254A1 (de) | 1999-06-25 | 1999-06-25 | Copolymere für den Transport von Nukleinsäuren in die Zelle |
EP99112260.7 | 1999-06-25 | ||
DE1999156502 DE19956502A1 (de) | 1999-11-24 | 1999-11-24 | Kombinationen zur Einführung von Nucleinsäuren in Zellen |
DE19956502.3 | 1999-11-24 | ||
PCT/EP2000/005778 WO2001000708A1 (de) | 1999-06-25 | 2000-06-21 | Kombinationen zur einführung von nucleinsäuren in zellen |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003503370A true JP2003503370A (ja) | 2003-01-28 |
JP2003503370A5 JP2003503370A5 (ja) | 2007-08-16 |
JP5025059B2 JP5025059B2 (ja) | 2012-09-12 |
Family
ID=26055629
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001506715A Expired - Fee Related JP5025059B2 (ja) | 1999-06-25 | 2000-06-21 | 核酸を細胞に導入するための配合剤 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20030026840A1 (ja) |
EP (1) | EP1198489B1 (ja) |
JP (1) | JP5025059B2 (ja) |
AT (1) | ATE265488T1 (ja) |
AU (1) | AU776715B2 (ja) |
CA (1) | CA2377207C (ja) |
DE (1) | DE50006269D1 (ja) |
ES (1) | ES2219346T3 (ja) |
WO (1) | WO2001000708A1 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005525290A (ja) * | 2001-08-16 | 2005-08-25 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 改良dnaリポフェクションならびに/または徐放性プロドラッグおよび薬物療法のための試薬の合成と使用 |
JP2006312689A (ja) * | 2005-05-09 | 2006-11-16 | Osaka Prefecture Univ | 高分子化合物 |
JP2009263339A (ja) * | 2008-04-03 | 2009-11-12 | Osaka Prefecture Univ | コラーゲン医薬組成物及びその製造方法 |
WO2012008361A1 (ja) | 2010-07-10 | 2012-01-19 | 財団法人北九州産業学術推進機構 | 細胞への核酸導入方法および核酸複合体 |
JPWO2011096408A1 (ja) * | 2010-02-02 | 2013-06-10 | 国立大学法人 東京大学 | 複合体微粒子およびその製造方法、ならびに該複合体微粒子を用いた薬学組成物 |
Families Citing this family (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020099438A1 (en) | 1998-04-15 | 2002-07-25 | Furst Joseph G. | Irradiated stent coating |
US20030040790A1 (en) * | 1998-04-15 | 2003-02-27 | Furst Joseph G. | Stent coating |
US8070796B2 (en) | 1998-07-27 | 2011-12-06 | Icon Interventional Systems, Inc. | Thrombosis inhibiting graft |
US7967855B2 (en) * | 1998-07-27 | 2011-06-28 | Icon Interventional Systems, Inc. | Coated medical device |
US8740973B2 (en) * | 2001-10-26 | 2014-06-03 | Icon Medical Corp. | Polymer biodegradable medical device |
WO2003059382A2 (en) * | 2001-12-28 | 2003-07-24 | Supratek Pharma Inc. | Pharmaceutical compositions comprising polyanionic polymers and amphiphilic block copolymers and methods of use thereof to improve gene expression |
US8016881B2 (en) * | 2002-07-31 | 2011-09-13 | Icon Interventional Systems, Inc. | Sutures and surgical staples for anastamoses, wound closures, and surgical closures |
JP5153072B2 (ja) | 2003-04-18 | 2013-02-27 | 独立行政法人国立循環器病研究センター | ベクター |
US7883720B2 (en) * | 2003-07-09 | 2011-02-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Charge-dynamic polymers and delivery of anionic compounds |
US7211108B2 (en) * | 2004-01-23 | 2007-05-01 | Icon Medical Corp. | Vascular grafts with amphiphilic block copolymer coatings |
US8323333B2 (en) * | 2005-03-03 | 2012-12-04 | Icon Medical Corp. | Fragile structure protective coating |
US7540995B2 (en) * | 2005-03-03 | 2009-06-02 | Icon Medical Corp. | Process for forming an improved metal alloy stent |
WO2006096251A2 (en) * | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Icon Medical Corp. | Improved metal alloys for medical device |
WO2006110197A2 (en) | 2005-03-03 | 2006-10-19 | Icon Medical Corp. | Polymer biodegradable medical device |
US9107899B2 (en) | 2005-03-03 | 2015-08-18 | Icon Medical Corporation | Metal alloys for medical devices |
US20060201601A1 (en) * | 2005-03-03 | 2006-09-14 | Icon Interventional Systems, Inc. | Flexible markers |
US20060264914A1 (en) * | 2005-03-03 | 2006-11-23 | Icon Medical Corp. | Metal alloys for medical devices |
US8734851B2 (en) * | 2005-04-29 | 2014-05-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Localized delivery of nucleic acid by polyelectrolyte assemblies |
US20060263328A1 (en) * | 2005-05-19 | 2006-11-23 | Sang Van | Hydrophilic polymers with pendant functional groups and method thereof |
KR100777249B1 (ko) * | 2006-02-14 | 2007-11-28 | (주)바이오니아 | 건조 올리고뉴클레오티드 조성물 및 이의 제조 방법 |
WO2008008291A2 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Icon Medical Corp. | Stent |
US8834918B2 (en) * | 2007-01-22 | 2014-09-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Modified multilayered film |
US20090105375A1 (en) * | 2007-10-09 | 2009-04-23 | Lynn David M | Ultrathin Multilayered Films for Controlled Release of Anionic Reagents |
US8324333B2 (en) * | 2008-06-05 | 2012-12-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Anionic charge-dynamic polymers for release of cationic agents |
JP2011528038A (ja) * | 2008-07-14 | 2011-11-10 | サーモディクス,インコーポレイテッド | 医療用デバイスおよび核酸の送達方法 |
DK3165234T3 (da) | 2009-07-31 | 2019-06-24 | Ethris Gmbh | Rna med en kombination af umodificerede og modificerede nukleotider til proteinekspression |
US8398916B2 (en) | 2010-03-04 | 2013-03-19 | Icon Medical Corp. | Method for forming a tubular medical device |
WO2012175617A1 (en) * | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Stichting Dutch Polymer Institute | Diblock copolymer |
CA2916800C (en) | 2013-06-28 | 2022-10-25 | Ethris Gmbh | Compositions comprising a component with oligo(alkylene amine) moieties |
AU2014384269A1 (en) | 2014-02-26 | 2016-09-08 | Ethris Gmbh | Compositions for gastrointestinal administration of RNA |
EP3160397A4 (en) | 2014-06-24 | 2018-03-21 | Icon Medical Corp. | Improved metal alloys for medical devices |
BR112017009505A2 (pt) | 2014-11-10 | 2018-02-06 | Ethris Gmbh | composição farmacêutica, e, matriz ou suporte. |
EP3034539A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-22 | Ethris GmbH | Compositions for introducing nucleic acid into cells |
EP3115039B1 (de) * | 2015-07-09 | 2021-12-15 | beniag GmbH | Verfahren zum herstellen einer fusionsmischung zur übertragung eines geladenen moleküls in und/oder durch eine lipidmembran |
US11766506B2 (en) | 2016-03-04 | 2023-09-26 | Mirus Llc | Stent device for spinal fusion |
US11174288B2 (en) | 2016-12-06 | 2021-11-16 | Northeastern University | Heparin-binding cationic peptide self-assembling peptide amphiphiles useful against drug-resistant bacteria |
EP3565605A1 (en) | 2017-01-03 | 2019-11-13 | ethris GmbH | Ornithine transcarbamylase coding polyribonucleotides and formulations thereof |
MX2021009388A (es) | 2019-02-14 | 2021-09-10 | Ethris Gmbh | Tratamiento de ciliopatias. |
WO2024121160A1 (en) | 2022-12-05 | 2024-06-13 | Ethris Gmbh | Regulator(s) of energy homeostasis-encoding rna molecule(s) with increased translation efficiency |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994009056A1 (en) * | 1992-10-14 | 1994-04-28 | Sterling Winthrop Inc. | Chelating polymers |
US5455027A (en) * | 1990-07-06 | 1995-10-03 | Enzon, Inc. | Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon |
WO1996021036A2 (en) * | 1994-12-30 | 1996-07-11 | Chiron Viagene, Inc. | Nucleic acid condensing agents with reduced immunogenicity |
WO1997025067A2 (en) * | 1996-01-06 | 1997-07-17 | Danbiosyst Uk Limited | Polymers |
JPH1028583A (ja) * | 1996-07-16 | 1998-02-03 | Hisamitsu Pharmaceut Co Inc | 核酸運搬体 |
WO1998019710A2 (en) * | 1996-11-06 | 1998-05-14 | Etienne Honore Schacht | Delivery of nucleic acid material to target cells in biological systems |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5763416A (en) * | 1994-02-18 | 1998-06-09 | The Regent Of The University Of Michigan | Gene transfer into bone cells and tissues |
US5863984A (en) * | 1995-12-01 | 1999-01-26 | Universite Laval, Cite Universitaire | Biostable porous material comprising composite biopolymers |
-
2000
- 2000-06-21 CA CA2377207A patent/CA2377207C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-21 AT AT00936907T patent/ATE265488T1/de active
- 2000-06-21 WO PCT/EP2000/005778 patent/WO2001000708A1/de active IP Right Grant
- 2000-06-21 ES ES00936907T patent/ES2219346T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-21 EP EP00936907A patent/EP1198489B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-21 DE DE50006269T patent/DE50006269D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-21 AU AU52228/00A patent/AU776715B2/en not_active Ceased
- 2000-06-21 JP JP2001506715A patent/JP5025059B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-12-17 US US10/023,317 patent/US20030026840A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-08-26 US US12/229,900 patent/US20090239939A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5455027A (en) * | 1990-07-06 | 1995-10-03 | Enzon, Inc. | Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon |
WO1994009056A1 (en) * | 1992-10-14 | 1994-04-28 | Sterling Winthrop Inc. | Chelating polymers |
WO1996021036A2 (en) * | 1994-12-30 | 1996-07-11 | Chiron Viagene, Inc. | Nucleic acid condensing agents with reduced immunogenicity |
WO1997025067A2 (en) * | 1996-01-06 | 1997-07-17 | Danbiosyst Uk Limited | Polymers |
JPH1028583A (ja) * | 1996-07-16 | 1998-02-03 | Hisamitsu Pharmaceut Co Inc | 核酸運搬体 |
WO1998019710A2 (en) * | 1996-11-06 | 1998-05-14 | Etienne Honore Schacht | Delivery of nucleic acid material to target cells in biological systems |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005525290A (ja) * | 2001-08-16 | 2005-08-25 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | 改良dnaリポフェクションならびに/または徐放性プロドラッグおよび薬物療法のための試薬の合成と使用 |
JP2006312689A (ja) * | 2005-05-09 | 2006-11-16 | Osaka Prefecture Univ | 高分子化合物 |
JP2009263339A (ja) * | 2008-04-03 | 2009-11-12 | Osaka Prefecture Univ | コラーゲン医薬組成物及びその製造方法 |
JPWO2011096408A1 (ja) * | 2010-02-02 | 2013-06-10 | 国立大学法人 東京大学 | 複合体微粒子およびその製造方法、ならびに該複合体微粒子を用いた薬学組成物 |
WO2012008361A1 (ja) | 2010-07-10 | 2012-01-19 | 財団法人北九州産業学術推進機構 | 細胞への核酸導入方法および核酸複合体 |
US9057067B2 (en) | 2010-07-10 | 2015-06-16 | Kinki University | Method for transfecting nucleic acid to cell and nucleic acid complex |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2219346T3 (es) | 2004-12-01 |
WO2001000708A1 (de) | 2001-01-04 |
US20030026840A1 (en) | 2003-02-06 |
EP1198489A1 (de) | 2002-04-24 |
JP5025059B2 (ja) | 2012-09-12 |
US20090239939A1 (en) | 2009-09-24 |
CA2377207C (en) | 2013-01-08 |
DE50006269D1 (de) | 2004-06-03 |
ATE265488T1 (de) | 2004-05-15 |
AU776715B2 (en) | 2004-09-16 |
AU5222800A (en) | 2001-01-31 |
CA2377207A1 (en) | 2001-01-04 |
EP1198489B1 (de) | 2004-04-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5025059B2 (ja) | 核酸を細胞に導入するための配合剤 | |
AU705035B2 (en) | Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell | |
US7413739B2 (en) | Conjugate addition reactions for the controlled delivery of pharmaceutically active compounds | |
US20020041898A1 (en) | Novel targeted delivery systems for bioactive agents | |
Walsh et al. | Bioinspired star-shaped poly (l-lysine) polypeptides: efficient polymeric nanocarriers for the delivery of DNA to mesenchymal stem cells | |
JP2002515418A (ja) | 肝細胞を標的とするポリエチレングリコール接合ポリ−l−リシンのポリマー遺伝子キャリヤー | |
US6372720B1 (en) | Liposome fusion and delivery vehicle | |
US10994047B2 (en) | Peptide dendrimers comprising fibrinogen-binding peptides | |
RO117861B1 (ro) | Complex de acid nucleic si compozitie pentru introducerea acestuia in celulele eucariote superioare | |
JP2011504943A (ja) | ヌクレオチド送達を亢進するための、還元可能なポリ(アミドエチレンイミン)に対する切断可能な修飾 | |
MXPA01012802A (es) | Copolimeros para el transporte de acidos nucleicos a las celulas. | |
US11723985B2 (en) | Protein delivery to membranes | |
DE19956502A1 (de) | Kombinationen zur Einführung von Nucleinsäuren in Zellen | |
AU4758300A (en) | Novel liposomal vector complexes and their use in gene therapy | |
TW201304804A (zh) | 核酸傳遞化合物 | |
CA2241040A1 (en) | Improved pharmaceutical compositions |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070530 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20070531 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070605 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070625 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110202 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110428 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120427 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120523 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120619 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150629 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |