JP4546056B2 - 顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡に関する。特に標本の分光情報が取得可能な顕微鏡に関する。

近年、医学、生命科学の発展に伴って、生体組織、細胞などの微細構造を精密に研究するための顕微鏡が強く求められている。そのため標本の分光情報を取得して観察対象の詳細な分析することができる顕微鏡が種々提案されている。例えば、標本を特定の組織、細胞、タンパク質ごとに蛍光染色して、その蛍光を分光観察することができる顕微鏡などが知られている。
例えば、特許文献１には、試料（標本）上に照明光を照射し、その透過光の光路上にレンズ、分光素子である直視プリズム、および光検出器を光検出器の入射開口と試料とが共役となるように配置するとともに、試料を光軸と直交する方向に走査可能とした分光型走査顕微鏡が記載されている。
また、例えば、特許文献２には、標本上を走査可能なレーザ光源を照明手段とし、標本からの光を集光する位置に共焦点絞りを設け、その後段に分光素子であるグレーティングを設け、分光された光の波長に応じた所定位置にスリットを配置して特定波長の光を検出する光検出器を設けた走査型光学顕微鏡が記載されている。
特開平５−１７２７４１号公報（第３頁、図１−４） 特開平８−４３７３９号公報（第４−５頁、図１−６）

しかしながら、上記のような従来の顕微鏡には以下のような問題があった。
特許文献１に記載の技術では、標本と光検出器の入射開口が共役の位置関係にあるので、標本上の１点もしくは微小領域からの光が直視プリズムにより分光され、光検出器に入射する。そのため受光強度が小さくなり、それがさらに分光されるので、Ｓ／Ｎ比が大きくとれないという問題がある。特に、標本からの光が、もともと光強度が小さい蛍光観察などを行う場合には、きわめて微弱な受光強度となっていた。
一方、標本を劣化させないためには照明光強度には限界があるから、光検出器の受光量をより大きくしようとすれば、分光素子の入射開口を大きくする必要がある。その場合、波長分解能が低下してしまうので、精密な計測ができないという問題がある。
また標本上の全面の分光情報を取得するには、標本を走査しなければならないので、測定に時間がかかるという問題がある。
また特許文献２に記載の走査型顕微鏡は共焦点顕微鏡であるから、特許文献１と同様、標本上の１点もしくは微小領域の光を分光し、共役な位置にある光検出器に導くものであり、受光量が小さく、標本上を走査する必要がある点では特許文献１と同様の問題がある。

本発明は、上記のような問題に鑑みてなされたものであり、標本を走査することなく、標本上の比較的広い領域の分光情報をまとめて取得できる顕微鏡を提供することを目的とする。

上記の課題を解決するために、請求項１に記載の発明では、光源と、該光源から出射される光により標本を照明する照明光学系と、前記照明された標本からの光を結像する対物レンズと、前記標本からの光を分光する分光光学系とを備えた顕微鏡であって、前記分光光学系の入射開口と前記対物レンズの瞳とを共役とする結像光学系を備える。
この発明によれば、結像光学系により、対物レンズの瞳、すなわち対物レンズの後側焦点面と分光光学系の入射開口とを共役とするので、標本での反射光および標本から発せられた蛍光のうち光軸に平行なものがすべて分光光学系の入射開口に到達する。したがって、標本からの光を、対物レンズの有効径範囲内で分光光学系にまとめて取り込むことができる。

請求項２に記載の発明では、請求項１に記載の顕微鏡において、前記照明光学系が標本上の照明範囲を可変できるように構成される。
この発明によれば、照明範囲を可変することにより、標本や光学系を走査することなく、照明された標本上の領域の光を分光光学系の入射開口に到達させて、分光情報を取得することができる。

請求項３に記載の発明では、請求項１または２に記載の顕微鏡において、前記結像光学
系が前記対物レンズの瞳を縮小投影する光学系である。
この発明によれば、対物レンズの瞳が縮小投影されるので、対物レンズの瞳を通過する
光を効率よく集光することができるとともに、分光光学系の入射開口による光量損失を防
止することができるので、光利用効率の高い分光観察を行うことができる。
請求項４に記載の発明では、請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡において、前記照明光学系が標本上の照明範囲を可変できるよう開口の大きさを可変できる視野絞りを備えることを特徴とする。
請求項５に記載の発明では、請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡において、前記照明光学系が標本上の照明範囲を可変できるよう光軸に対して開口中心を偏心させて配置ができる視野絞りを備えることを特徴とする。
請求項６に記載の発明では、請求項１から５のいずれかに記載の顕微鏡において、前記入射開口がスリット状であり、前記結像光学系に前記入射開口に入射する光束がスリットに平行な扁平状となるよう光学素子を備えたことを特徴とする。

本発明の顕微鏡によれば、標本での反射光および標本から発せられた蛍光のうち光軸に平行なものがすべて分光光学系の入射開口に到達するので、標本を走査することなく、標本上の比較的広い領域の分光情報をまとめて取得でき、明るい分光観察を迅速に行うことができるという効果を奏する。

以下では、本発明の実施の形態を、添付図面を参照して説明する。なおすべての図面において、実施形態が異なる場合であっても、同一または相当する部材には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
図１は、本発明の実施形態に係る顕微鏡の概略構成について説明するための構成ブロック図である。図２（ａ）、（ｂ）は、それぞれ本発明の実施形態に係る顕微鏡に用いることができる分光光学系の構成例を説明するための概略説明図である。
なおこれらは概略図であり、例えば複数のレンズやレンズ群であっても、便宜上、図示では一つの部材として表している。

本発明の実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示したように、落射型顕微鏡であり、その概略構成は、照明光学系５、対物レンズ６、接眼レンズ１５、結像光学系１２および分光器１４（分光光学系）からなる。
照明光学系５は、例えば水銀ランプなどの光源２と、視野調整を行うための視野絞り３と、視野絞り３を透過した光を対物レンズ６を通して、標本の配置された物体面８上に照明するレンズ４とを備える。レンズ４による照明法は、例えばケーラー照明など周知の照明法を採用することができる。ハーフミラー９は、集光レンズ４から出射された光束を対物レンズ６の光軸上に導くためのものである。
なお図示しないが、照明光学系５は、顕微鏡１の観察用途の必要に応じて、例えばフィルタ素子や偏光板素子など、適宜の光学素子を備えているものである。

本実施形態において、視野絞り３は、例えば対物レンズ６の倍率に応じて開口の大きさを可変できることは当然であるが、光軸中心に照明範囲を可変するために自由に開口の大きさを可変できるものである。
さらに、物体面８に配置された標本上の照明範囲を可変できるように、光軸に対して開口中心を偏心させて配置することができる構成とされている。また、視野絞り３の開口形状も、円形以外の適宜形状に可変できるようにしておいてもよい。

対物レンズ６は、本実施形態の場合、標本からの光を結像するためのもので、後側焦点面に対物レンズの瞳面７が形成される。対物レンズ６は、例えばターレット方式により複数のレンズを切り替え配置したり、対物レンズ６をズームレンズとしたりして、倍率が可変できる構成とされている。
接眼レンズ１５は、対物レンズ６により形成された標本の像を拡大するためのものである。図１において、符号５０は瞳を示す。

結像光学系１２は、ハーフミラー９と接眼レンズ１５の間の光路上に設けられた結像レンズ１０と、結像レンズ１０を透過した光束の一部を光軸外に分岐するハーフミラー１３と、ハーフミラー１３で分岐された光束の光路上に設けられたレンズ１１とからなり、対物レンズの瞳面７と分光器１４の入射開口１４ａとが共役であり、縮小倍に投影されるように配置される。

分光器１４は、入射光束の分光情報を取得するための光学系である。
分光器１４の光学系は、分光観察の目的に応じて周知の種々の分光光学系を採用することができる。ここで、それらの例について簡単に説明する。
図２（ａ）に示したのは、分光器１４が、いわゆるツェルニー・ターナー(Czerny-Turner)型分光器からなる例である。
本例では、光路に沿って、入射開口１４ａ、凹面鏡１６、回折格子１７、凹面鏡１８およびラインセンサ１９が配置されている。
入射開口１４ａを透過した発散光は、凹面鏡１６で集光されて略平行光とされ、回折格子１７により、入射光の波長に応じた方向に回折される。そして、凹面鏡１８によりそれらの光束を結像する。結像面には、各波長光の結像位置における光強度を検出するためのラインセンサ１９を配置し、分光強度分布を測定できるようにする。
本例では、検出波長帯の回折効率を落とさない程度に、回折格子１７の格子本数を増やしておくことが好ましい。そうすれば分散が大きくなるので、入射開口１４ａのスリット幅が広くても結像面上の分光成分が混ざりにくくなり、効率よく分光できるという利点がある。

図２（ｂ）に示したのは、分光器１４が、プリズムを用いた分光器からなる例である。
本例では、光路に沿って、入射開口１４ａ、レンズ２０、プリズム２１、レンズ２２およびラインセンサ１９が配置されている。
入射開口１４ａを透過した発散光は、レンズ２０で集光されて略平行光とされ、プリズム２１により、入射光の波長に応じた方向に屈折される。そして、レンズ２２それらの光束を結像する。結像面には、ラインセンサ１９が配置される。
なお、以上の２例では、分光分布測定手段として、ラインセンサ１９を用いた例で説明したが、エリアセンサでもよいし、光検出器上をスリットがスキャンするセンサなどを用いてもよい。

本実施形態の顕微鏡１の作用について、その分光観察時の作用を中心に説明する。
照明光学系５により、物体面８上の標本が照明される。その際、視野絞り３を光軸中心の略円形開口とすることにより、対物レンズ６の開口数に応じた範囲内で、標本を全体的に照明することができる。そして、光軸に略平行に射出する標本からの反射光もしくは蛍光が対物レンズ６により、対物レンズの瞳面７の中心付近に集光する。
対物レンズの瞳面７の中心付近を透過した光束は発散しつつハーフミラー９を透過し、結像レンズ１０により集光され、ハーフミラー１３で一部が光軸外に反射される。そして、レンズ１１により入射開口１４ａの位置に集光する。
ここで、対物レンズの瞳面７と入射開口１４ａとが共役とされているので、標本の照明範囲の全体にわたる情報が入射開口１４ａに集光する。また、結像光学系１２の倍率は、対物レンズの瞳面７を縮小投影する光学系とされているので、縮小倍率を適宜の値とすることにより、瞳径の範囲の像を入射開口１４ａの開口幅よりも小さな径に縮小することができる。それにより、対物レンズの瞳全体が入射開口１４ａに光量損失なく入射される。
入射開口１４ａに入射した光束は、分光器１４により分光分布が計測され、標本の分光情報が取得できる。

このように、本実施形態の顕微鏡１によれば、対物レンズの瞳面７を通過する光束を全体的に入射開口１４ａに導くことができるから、光量損失のない効率的な分光観察を行うことができるという利点がある。また、標本を走査することなく、分光器１４により標本の像の全体的な分光情報をまとめて取得できるので、迅速に分光情報を取得できるという利点がある。

また、顕微鏡１によれば、視野絞り３を縮径して、照明範囲を光軸中心に縮径することもできる。
また、視野絞り３を縮径したり、開口形状を可変したりして、照明範囲を狭めることができ、さらに光軸中心に対して偏心させることにより、標本上の照明範囲の大きさ、位置を可変することができる。例えば、図１における領域Ｗの範囲に照明範囲を制限することができ、図示したような光路をたどって、標本上の領域Ｗの反射光のみが入射開口１４ａに到達する。このようにすれば、標本上の所望の領域の分光情報を取得することができるという利点がある。
例えば、蛍光観察時において、標本の特定領域に蛍光波長が近接する蛍光タンパク質が分布していて肉眼観察では正確な識別ができない場合などに、その特定領域を照明し、精密な分光分布を計測するといったことが可能となる。その際、ノイズとなる他の領域の波長光をあらかじめ排除することができるから、ダイナミックレンジの大きな測定を行うことが可能となるという利点がある。

なお本実施形態では、顕微鏡１が落射型顕微鏡であるとして説明したが、透過型顕微鏡であっても同様な作用効果を備えることは言うまでもない。図１の照明光学系５に代えて、透過型照明光学系を設けることはきわめて容易である。
また、入射開口１４ａはスリット状とされるので、分光分解能を確保しつつ光利用効率を向上するには、入射開口１４ａに入射する光束がスリットに平行な偏平状とすることが好ましい。そのために、結像光学系１２において、例えばシリンドリカルレンズなどの光学素子を備えるようにしてもよい。

本実施形態の変形例として、照明光学系５を変更した例を挙げることができる。以下、上記の実施形態と異なる点を中心に簡単に説明する。
図３は、本発明の実施形態の第１変形例の顕微鏡の概略構成について説明するための構成ブロック図である。図４は、本発明の実施形態の第２変形例の顕微鏡の概略構成について説明するための構成ブロック図である。

本実施形態の第１変形例の顕微鏡１００は、レーザ顕微鏡であり、特に２フォトン励起またはマルチフォトン励起（以下、これらを総称して、マルチフォトン励起と略称する。）のレーザ顕微鏡に好適となるものである。図３に示したように、上記の照明光学系５に代えて照明光学系２４を備える。
照明光学系２４は、レーザ２５（光源）、スキャナ２６、およびレンズ２７、２８からなる。
レーザ２５は、マルチフォトン励起を行うための光源である。
スキャナ２６は、レーザ２５のスポットを標本上で走査するための機構で、例えばガルバノミラーなどの光走査素子により構成される。
レンズ２７、２８は、レーザ２５から出射された光束を物体面８上で微小スポット径に結像するとともに、適宜速度で走査するための走査光学系である。

マルチフォトン励起とは、例えば蛍光分子などを励起するための励起光として、励起光波長のｎ倍の波長を有する光束を照射する励起方式である。このような長波長の励起光は、蛍光分子に対してｎ個のフォトンが吸収されることにより、本来の励起波長光のフォトン１個が吸収されたのと同様の光励起を起こすことができる。したがって、標本へのダメージが少ない長波長光を用いて蛍光観察できるという利点があることが知られている。
しかしながら、１フォトン励起では光束の透過域内で多数の光励起が発生するのに対して、ｎフォトン励起では特定の蛍光分子にｎ個のフォトンが同時に（極めて短い時間に）吸収される確率がきわめて小さいため、実質的にはエネルギー密度の高い焦点位置のみで光励起が発生する。したがって１フォトン励起に比べて光量が小さく、分光観察する際にＳ／Ｎ比が小さくなってしまうという問題があった。

ところが、本変形例の顕微鏡１００によれば、瞳面を通る光束を入射開口１４ａの幅内に集光させることができるので、標本からの光が微小であっても、効率的に分光器１４に入射させることができ、比較的高いＳ／Ｎ比を得ることができるという利点がある。したがって、顕微鏡１００は、２フォトン励起またはマルチフォトン励起用のレーザ顕微鏡としてきわめて好適である。

本実施形態の第２変形例の顕微鏡１０１は、全反射蛍光観察が可能な顕微鏡であり、図４に示したように、上記の照明光学系５に代えて照明光学系２９を備え、対物レンズ６に代えて油浸対物レンズ３３（対物レンズ）を備える。
照明光学系２９は、カバーガラス８ａ上に配置された標本８ｂにカバーガラス８ａの側から全反射する照明光を照射し、標本８ｂ側にしみ出すエバネッセント光によりカバーガラス８ａ面の近傍の標本８ｂを照明するものである。このような照明光学系は、透過型、落射型のいずれの顕微鏡でも設けることができるが、図４では落射型の構成を示した。
照明光学系２９の構成は、周知のエバネッセント照明光学系と同様であり、レーザ２５（光源）、レンズ３０、視野絞り３１、レンズ３２および油浸対物レンズ３３からなる。

レーザ２５から照射された光束はレンズ３０に偏心して入射され、レンズ３０の焦点を通過する平行光束とされる。視野絞り３１は、焦点位置を透過する光束の大きさを規制して、照明範囲を規制するためのものである。
視野絞り３１を透過した光束は、レンズ３２により集光され、ハーフミラー９で反射されて、油浸対物レンズ３３に偏心して入射する。ここで、レンズ３０、３２により、レーザ２５の発光点と油浸対物レンズ３３の後側焦点面である対物レンズの瞳面７とが共役とされた光学系が構成される。
油浸対物レンズ３３は、対物レンズの瞳面７から拡散しながら偏心して入射した光束を平行光束としつつ、光軸中心に斜行させ、カバーガラス８ａの内面側で全反射させる光学素子である。符号３３ａはオイルである。

このような顕微鏡１０１によれば、照明光学系２９によりエバネッセント照明された標本８ｂからの光が油浸対物レンズ３３により対物レンズの瞳面７上に集光され、結像光学系１２に入射して入射開口１４ａから、分光器１４に入射される。
エバネッセント照明は全反射面から数百ｎｍ程度の範囲にしみ出すエバネッセント光を用いるので、標本８ｂからの光はきわめて微弱な光である。そのため、例えば標本の一点もしくは微小領域部分の光量を分光器に導く場合には一層微弱な光となるが、本変形例では、標本全体からの光を分光器１４に入射させることができるので、Ｓ／Ｎ比の高い分光計測を行うことができるという利点がある。

なお、上記の説明では、効率的な分光観察を行うために、いずれも入射開口１４ａと対物レンズの瞳面７とが共役となる構成としているが、従来のように標本を走査して分光観察を行うことができるように、結像光学系１２のレンズ配置を可変できるようにしておいてもよい。すなわち、レンズ配置を切り替えることにより、入射開口１４ａが対物レンズの瞳面７と共役になる状態と、物体面８と共役となる状態とを、切り替えられるようにしておいてもよい。その際、入射開口１４ａの前に共焦点とするためのピンホールスリットを配置することが好ましい。
このように構成すれば、従来の分光観察の機能を併せ持つ顕微鏡とすることができるという利点がある。

本発明の実施形態に係る顕微鏡の概略構成について説明するための構成ブロック図である。 本発明の実施形態に係る顕微鏡に用いることができる分光光学系の構成例を説明するための概略説明図である。 本発明の実施形態の第１変形例の顕微鏡の概略構成について説明するための構成ブロック図である。 本発明の実施形態の第２変形例の顕微鏡の概略構成について説明するための構成ブロック図である。

符号の説明

１、１００、１０１ 顕微鏡
２ 光源
３ 視野絞り
５、２４、２９ 照明光学系
６ 対物レンズ
７ 対物レンズの瞳面
８ 物体面
８ｂ 標本
１２ 結像光学系
１４ 分光器（分光光学系）
１４ａ 入射開口
１５ 接眼レンズ
１７ 回折格子
１９ ラインセンサ
２１ プリズム
２５ レーザ（光源）
２６ スキャナ
３３ 油浸対物レンズ（対物レンズ）

Claims (6)

1. 光源と、該光源から出射される光により標本を照明する照明光学系と、前記照明された標本からの光を結像する対物レンズと、前記標本からの光を分光する分光光学系とを備えた顕微鏡であって、
   前記分光光学系の入射開口と前記対物レンズの瞳とを共役とする結像光学系を備えることを特徴とする顕微鏡。
2. 前記照明光学系が標本上の照明範囲を可変できるように構成されたことを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記結像光学系が前記対物レンズの瞳を縮小投影する光学系であることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡。
4. 前記照明光学系が標本上の照明範囲を可変できるよう開口の大きさを可変できる視野絞りを備えることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
5. 前記照明光学系が標本上の照明範囲を可変できるよう光軸に対して開口中心を偏心させて配置ができる視野絞りを備えることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微鏡。
6. 前記入射開口がスリット状であり、前記結像光学系に前記入射開口に入射する光束がスリットに平行な扁平状となるよう光学素子を備えたことを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の顕微鏡。

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