JP2003161888A

JP2003161888A - 特定の波長で照明できる顕微鏡

Info

Publication number: JP2003161888A
Application number: JP2001359710A
Authority: JP
Inventors: Ten Fukano; 天深野; Atsushi Miyawaki; 敦史宮脇; Noriyuki Shimizu; 敬之清水; Yoshihiro Kono; 芳弘河野
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2001-11-26
Filing date: 2001-11-26
Publication date: 2003-06-06
Also published as: US20030161039A1; US6903869B2

Abstract

(57)【要約】【課題】わずらわしい蛍光の励起フィルターの切替を無
くすことができ、また、任意のかつ、複数の波長で同時
に照明できる、特定の波長で照明できる顕微鏡を提供す
る。【解決手段】標本を照明する光源１と、光源１からの光
を分散させる第１の分光素子４と、第１の分光素子４で
分散された光を選択的に反射する選択的反射部材５と、
選択的反射部材５で反射された光を合成させる第２の分
光素子６と、ダイクロイックミラー７と、対物レンズ８
と、撮像素子１１とを備えて構成されている。第１の分
光素子４が、第１のレンズ２３の前側の焦点位置に配置
され、選択的反射部材５が、第１のレンズ２３の後ろ側
の焦点位置と第２のレンズ２４の前側の焦点位置とが一
致する位置に配置され、第２の分光素子６が、第２のレ
ンズ２４の後ろ側の焦点位置に配置されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光顕微鏡、分光
顕微鏡などの特定の波長で照明可能な顕微鏡に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】顕微鏡
を使い、分子の挙動や、細胞内の分子の挙動、また更
に、生きた細胞などの生理学的挙動を高速でみたいとい
う要求がある。この場合、標本を複数の波長の光で高速
に切り替えて照明しなければならない。従来は、特開平
９−５２４３号公報に示されているように、蛍光顕微鏡
に複数個の励起フィルターを装着させ、このフィルター
を回転させることによって切り替えていた。

【０００３】しかし、特開平９−５２４３号公報に示さ
れているような切り替えでは、高速で波長を切り替える
のに困難をきたしていた。このような問題点が発生する
原因は、励起波長の切り換えに時間がかかる、励起フィ
ルタの切り換えが必要である、振動が発生する、複数の
波長で同時に照明できないなどの問題を抱えていること
による。

【０００４】特に近年、カルシウム指示薬としてｆｕｒ
ａ−２，ＢＴＣ，または、ＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕ
ｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）を基に作製された
カルシウム指示薬が開発され多くの研究者に利用されて
いる。これらの指示薬としては、ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉ
ｃ−ｐｅｒｉｃａｍ,ｐＨ指示薬（ｐＨｌｕｏｒｉｎ）
などが挙げられる。これらは、いずれも２波長励起１波
長測光型の指示薬である。そして、このような指示薬を
用いて、２波長励起１波長測光を行おうとする場合に
は、２つの異なる波長の励起光を励起フィルターの切り
替えで行っていた。しかし、この場合には、切り替えの
スピードが遅い、２つの励起光間の強度バランスがコン
トロールしにくい、切り替えに伴う機械的振動がある、
などの問題があった。

【０００５】また、顕微鏡を使い、分子の挙動や、細胞
内の分子の挙動、また更に、生きた細胞などの生理学的
挙動をケージド指示薬を用い実験を高速でみたいという
要求がある。細胞の特定の部分のみカルシウムイオンの
濃度を高くしたい場合や、特定の部分に特定に物質の濃
度を高くしたい場合に、ケージド化合物を使った実験が
行われる。このケージド化合物は、３００−３６０ｎｍ
程度のＵＶ光を照射すると化合物が光化学変化を起こし
特定の物質を放出する特性をもっている。このケージド
試薬を細胞にロードして、その細胞の特定部位に紫外線
を照射してケージドを解除する為の照明系が必要であ
る。

【０００６】従来は、高価なＵＶレーザーを照射しなけ
ればならなかった。他の方法では、顕微鏡にフィルター
ホイールを取り付け、ＵＶ用フィルターと蛍光観察用フ
ィルターとを切り替えて実験しなければならなかった。
また、フィルターホイールを高速で回転させるのが困難
な為、時間分解能を高めることが難しかった。

【０００７】さらに、従来の顕微鏡は、ドイツ特許公開
明細書第２，６２６，５４０号に記載のような反射干渉
顕微鏡を使って像を取ることはできたが、反射干渉の照
明波長を切り替えるのは、容易ではなかった。そして、
従来は、フィルターホイールを取り付け、波長の異なる
フィルターを挿入し、各波長で像をとる必要があった。
また、高価なバンドパスフィルターを複数枚買うのは多
額の費用が必要であった。

【０００８】本発明は、上記問題点に鑑みてなされたも
のであり、わずらわしい蛍光の励起フィルターの切替を
無くすことができ、また、任意のかつ、複数の波長で同
時に照明できる、特定の波長で照明できる顕微鏡を提供
することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】上記課題を達成するた
め、本発明による特定の波長で照明できる顕微鏡は、標
本を照明する光源と、光源からの光を分散させる第１の
分光素子と、第１の分光素子で分散された光を選択的に
反射する選択的反射部材と、選択的反射部材で反射され
た光を合成させる第２の分光素子と、ダイクロイックミ
ラーと、対物レンズと、撮像素子とを備えて構成されて
いることを特徴とする。本発明によれば、コンフォーカ
ル顕微鏡より像が明るいといわれている通常の顕微鏡
で、かつ、積分球も用いることなく、分光照明が可能と
なる。

【００１０】

【発明の実施の形態】実施例の説明に先立ち、本発明の
作用を図１を用いて説明する。本発明の顕微鏡の照明方
法について説明する。光源１を出射した光は、コレクタ
ーレンズ２、または、図示していないリフレクターなど
を介して集光される。

【００１１】次に、光は例えば反射型グレーティング、
透過型グレーティングやプリズムなどで構成された第１
の分光素子４に導かれる。分光素子４に入射した光は、
波長分散を起こす。分散した光は、レンズ２３を介して
選択的反射部材５に導かれる。選択的反射部材５は、反
射型の空間光変調器（ＳＬＭ）であればどのような構成
のものでも使用可能である。しかし、実用上は、本発明
の光学系を蛍光照明に用いる場合が多いので、紫外光か
ら可視光までをほぼ一様な高反射率で反射することが可
能なＤｉｇｉｔａｌＭｉｃｒｏ−ｍｉｒｒｏｒＤｅ
ｖｉｃｅ（ＤＭＤ）を用いるのが最も望ましい。

【００１２】選択的反射部材５は、２次元上に配置され
た微小ミラーで構成されており、各微小ミラーは、夫々
反射角度を変えることができる構造となっている。ここ
で、微小ミラーの機能について説明する。微小ミラー
は、電気的にオンとオフの切り替えができる。なお、本
発明では、光源から放射された光を次にくる光学部材、
たとえば図1の場合レンズ２４の方向に光を導くことが
できるようにミラーの角度を電気的にセットした場合を
オンの状態といい、導かれない角度にセットした場合を
オフの状態という。そして、オンの状態では、光は最終
的に顕微鏡に導かれ、標本が照明される。一方、オフの
状態では、光は最終的に顕微鏡に導かれず、標本は照明
されない。

【００１３】ＤＭＤなどの選択的反射部材５で反射され
た光は、再度、グレーティングなどで構成された第２の
分光素子６に入射する。この分光素子６は、第１の分光
素子４を介して一度分散した光を同一光軸上に集まるよ
うに構成されている。第２の分光素子６により同一光軸
上に集められた光は、ダイクロイックミラー７で反射さ
れ、対物レンズ８に導かれる。そして、照明光源１の
像、スリット像、または、ピンホール像が、対物レンズ
８の後ろ側焦点位置近傍に投影され、最終的に標本９を
照明することができる。

【００１４】蛍光照明の場合は、選択的反射部材５で反
射された光が、標本９を励起する光となり、励起によっ
て標本から発した蛍光が対物レンズ８に入射し、ダイク
ロイックミラー７を透過し、吸収フィルター２７を透過
して、撮像素子１１に入射する。

【００１５】このように構成にすると、約数十ｍｓｅｃ
で選択的反射部材５の反射面の切替が可能になるので高
速で波長切替ができるようになる。その結果、通常の蛍
光顕微鏡の問題点である、励起波長の切替にかかる時間
を短縮化でき、励起波長の切替を数十ｍｓｅｃの速さに
することができる。また、励起フィルター用電動ターレ
ットを用いることなく、選択的反射部材５のミラーのオ
ン、オフの切り替えだけで励起波長の切替ができる。ま
た、選択的反射部材を用いたことで、任意のかつ、複数
の波長で同時に照明できる光学系を提供することができ
る。さらに、複数の波長の光の明るさを独立に調整する
ことができる。

【００１６】ここで、第１の分光素子４と、選択的反射
部材５と、レンズ２３との配置関係について説明する。
図２は、図１の第１の分光素子４と選択的反射部材５と
第２の分光素子６の部分拡大図である。第１の分光素子
４を、第１の分光素子４と選択的反射部材５との間にあ
るレンズ２３の前側の焦点位置に配置するとともに、選
択的反射部材５を、レンズ２３の後ろ側の焦点位置に配
置すれば、光源１のアーク像、または、絞り３が、選択
的反射部材５の上に分光されて投影される。

【００１７】また、選択的反射部材５を、選択的反射部
材５と第２の分光素子との間にあるレンズ２５の前側の
焦点位置に配置するとともに、第２の分光素子を、レン
ズ２５の後ろ側焦点位置に配置すれば、選択的反射部材
５の上に投影された分光された光を一つに合成すること
ができる。

【００１８】上述のような配置関係の条件を満たすため
には、分光素子４とレンズ２３との間隔をＡ、選択的反
射部材５とレンズ２３との間隔をＢとした場合、ＡとＢ
の間隔をほぼ同等の長さにする。また、選択的反射部材
５とレンズ２４との間隔をＣ、分光素子６とレンズ２４
との間隔をＤとした場合、ＣとＤの間隔をほぼ同等の長
さにする。そのようにしないと、分光した光を再び一つ
に合成するのが困難になる。

【００１９】なお、通常、分光装置は、ランプの発光点
の大きさによって、波長分解能が決まるので、波長分解
能を小さくしたい場合は、スリット、または、ピンホー
ルを照明系に挿入し、一度、ランプのアーク像をピンホ
ールに投影する。このときに、スリットを細くするか、
ピンホールを小さくすると波長分解能は設計上高くでき
る。例えば、図１では絞り３にスリットまたはピンホー
ルを形成する。

【００２０】そして、上述したような照明装置を備えた
本発明の顕微鏡を構成した蛍光顕微鏡、または、分光顕
微鏡を用いると、次のような作用がある。カルシウム指
示薬としてｆｕｒａ−２，ＢＴＣ,またはＧＦＰ（Ｇｒ
ｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）を基
に作製されたカルシウム指示薬ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ
−ｐｅｒｉｃａｍ，ｐＨ指示薬ｐＨｌｕｏｒｉｎなどは
いずれも２波長励起１波長測光型の指示薬である。従来
は、２つの異なる波長の励起光を励起フィルターの切り
替えで行っていたが、本発明の顕微鏡を用いれば、切り
替えのスピードが遅い、２つの励起光間の強度バランス
がコントロールしにくい、切り替えに伴う機械的振動が
ある、などといった問題を軽減することができる。

【００２１】生きた細胞を複数の蛍光プローブでラベル
し、複数の細胞内事象を同時観察する必要が高まってい
る。当該システムはサンプルへの照明の波長、強度を自
由自在に高速でコントロールすることを可能にする。た
とえば細胞にＧＦＰ融合蛋白質とＲＦＰ融合蛋白質とを
共発現させ、この２つの蛍光シグナルを完全に同時に取
得することを考える。当該システムを使えば市販のｍｕ
ｌｔｉｃｈｒｏｉｃｍｉｒｒｏｒの反射帯域に合わせて
２色の照明光をデザインすることが容易にできる。最近
登場した市販のｄｕａｌｐｅａｋ励起フィルターに比
べて本発明が優れる点は、２色の照明光の強度を独立に
調節できることである。

【００２２】しかも、強度のコントロールは２つのモー
ドが可能で、一つはサンプルにおける光強度密度を変え
る方式、もう一つは光強度密度一定のまま時間的にある
周期でオン−オフを繰り返す方式である。それぞれの蛍
光色素の褪色の機構（高次励起状態への遷移あるいは酵
素分子との反応）を考慮した上で、褪色の程度の低いイ
メージングを目指して、どちらかのモードを選択するこ
とができる。更にreflectorとして高い透過率を示すガ
ラスを用いれば、単純に蛍光フィルター（吸収フィルタ
ー）との兼ね合いで自由自在に照明光を選択することが
できる。

【００２３】また、カルシウムイオンの動きを観察する
場合、具体的に例えば、蛍光色素Ｆｕｒａ２を用いた場
合においては、ＤＭＤを用いた照明系で、２つの波長３
４０ｎｍと３８０ｎｍとを交互に切り替えて、それぞれ
の波長で励起した画像を撮像し、それらの比を演算する
ことにより、蛍光色素の部分的な染まり具合の多少や、
蛍光色素の褪色に影響をうけることなくカルシウム濃度
の変化をイメージングすることができる。

【００２４】本発明に用いる照明系は、任意の波長で照
明できるので、たとえば、ケイジド化合物の解除にも使
用できる。たとえば、ＤＭＤを用いた照明系を紫外光を
反射するようにセットして標本を照明することで、標本
中にあるケイジド化合物を解除することができる。そし
て、解除してすぐに標本中にある蛍光色素を励起する波
長にＤＭＤ照明系を切替えて、蛍光像を観察することが
できる。

【００２５】また、更に、ＣＦＰとＹＦＰ、ＦＭ１−４
３など複数の異なる蛍光色素を用いて間欠的な長時間に
わたる標本のタイムラプス像を取りたい場合も、ＤＭＤ
を用いた照明系の励起波長を切替えて標本を励起して、
その像を撮像することで可能となる。

【００２６】なお、ダイクロイックミラーの代わりに、
複数の波長を反射するミラーを用いると、例えば、標本
を複数の波長で染色している場合にも、簡単に複数の波
長で励起することができる。または、２％以上６％以下
の反射率を有するミラーを用いても、複数の波長で標本
を励起することができる。２％未満の反射率で励起光を
反射し光を照射して蛍光像を観察すると、励起光がすご
く暗くなり、その結果、標本の蛍光像も暗くなってしま
う。また、６０％以上の反射率のミラーで励起光を反射
すると、励起光は明るくすることができるが、蛍光像の
減衰も６０％になってしまうので無駄なく蛍光像を得る
ことができない。

【００２７】また、複数の波長で標本を励起する場合
は、様々な波長を反射するダイクロイックミラーを電動
で切替え可能にすることでも対応できる。

【００２８】また、本発明によれば、反射干渉像におけ
る０次縞の同定および接着斑の峻別に用いることができ
る。すなわち、ＤＭＤを用いた照明系で、複数の異なる
波長幅のスペクトルを作りだして、順次、反射干渉像を
撮像していく。これら複数の画像上における干渉縞の位
置の変化から、０次の縞を容易に特定することができ、
細胞の接着斑を特定することができる。このような観察
を行う場合も、波長の異なるフィルターを購入する必要
がないので、安価に実験を行うことができる。

【００２９】

【実施例】次に、本発明の実施例を図面を用いて説明す
る。第１実施例図１は本発明による特定の波長で照明できる顕微鏡の第
１実施例を示す概略構成図である。第１実施例の顕微鏡
は、分光素子をグレーティングを用いて構成した分光照
明装置を有する顕微鏡として構成されている。光源１か
ら出射した光は、コレクターレンズ２、投影レンズ２１
を介して集光されて、矩形開口、または、ピンホール開
口を構成した絞り３の位置で一旦結像してランプの像を
作る。その後、絞り３を通り抜けた光は、レンズ２２に
入射し、レンズ２２を介して無限遠に投影される。無限
遠に投影された光は、グレーティング４に入射し、図２
に示すように短波長から長波長にわたって分光（波長分
散）される。

【００３０】分光された光は、レンズ２３に入射し、Ｄ
ＭＤ５に導かれる。図３は絞り３の位置に配置した矩形
のスリット形状を表す図と、分光された光のＤＭＤ５に
おける入射箇所を示す図である。絞り３の位置にスリッ
トを配置した場合、スリットは、ＤＭＤ５の上に分光さ
れた形で投影される。ＤＭＤ５は、微小ミラー群で構成
されていて、個々の微小ミラーの角度を変えることで、
所望の波長の光のみを選択的に反射してレンズ２４に導
く。たとえば、短波長の光が投影されているＤＭＤ５の
部分のみオンにして、標本に短波長の光のみ導くことが
できる。ＤＭＤ５でオンになった部分の光のみが導かれ
たレンズ２４では、分光されスリット像を無限遠に投影
する。無限遠に投影された分光されたスリット像は、グ
レーティング６に入射する。グレーティング６を介して
分光によって波長分散した光は、グレーティング６を介
して再合成されて一つの光軸上に集められた後、レンズ
２５に入射する。

【００３１】入射した光は、レンズ２５を介して絞り３
の像として一旦結像し、視野絞り２８を経た後、レンズ
２６を介して投影され、ダイクロイックミラー７で反射
される。反射され絞り３の像は、対物レンズ８の後ろ側
焦点位置で結像する。そして、標本９の面ではケーラー
照明になり、標本９を照明する。

【００３２】さらに、この照明系を蛍光観察に用いる場
合は、照明光が標本９を励起する光となり、標本９から
発せられた蛍光がダイクロイックミラー７を透過し、励
起光の漏れ光をカットする吸収フィルター２７を経て、
結像レンズ１０を介してＣＣＤ１１上に結像する。

【００３３】ここで、光の波長をＤＭＤでコントロール
する方法について説明する。図４は光の波長をＤＭＤで
制御する場合についての原理説明図である。図４中、線
で囲まれてＯＮと書いてある部分は、ＤＭＤ素子のオン
状態になった部分を表す。図４(a)は、ある波長幅をも
った光のうち単一の波長のみを顕微鏡に導く場合のＤＭ
Ｄの制御状態を示している。図４(a)に示すように、Ｄ
ＭＤ５の一部分をオンにすると、特定の波長のみを顕微
鏡に導くことができる。この場合、縦方向のＤＭＤ５を
全てオンにすることで、最大の明るさで標本を照明でき
る。

【００３４】なお、明るさを減少させたい場合は、２つ
の方法がある。一つは、顕微鏡の露光時間より高い周波
数でミラーを振動させることで、オンとオフの時間比を
コントロールすることで明るさをコントロールすること
ができる。または、第２の方法としては、図４(b)に示
すように、部分的にＤＭＤをＯＮにすることで光量を調
整することができる。図４(c)は、２波長で照明する場
合のＤＭＤのＯＮの部分を表した原理説明図である。さ
らに、波長ごとの明るさ比を調整したい場合は、図４
(d)のようにＤＭＤのＯＮの部分を制御すればよい。

【００３５】なお、照明系を通常の落射の分光照明系と
して使用したい場合は、ダイクロイックミラー７の代わ
りにハーフミラーを用いて構成すればよい。また、照明
系を蛍光観察に使用する場合は、ダイクロイックミラー
の代わりに、多重励起フィルターや、４％程度の反射作
用があるガラス板を用いてもよい。

【００３６】第２実施例図５は本発明による特定の波長で照明できる顕微鏡の第
２実施例を示す概略構成図である。第２実施例の顕微鏡
は、分光素子をプリズムを用いて構成した分光照明装置
を有する顕微鏡として構成されている。光源１から出射
した光は、コレクターレンズ２、光源投影レンズ２１を
介して集光されて、矩形開口、または、ピンホール開口
を構成した絞り３の位置近傍で一旦結像してランプの像
を作る。その後、絞り３を通り抜けた照明光は、レンズ
２２を介して無限遠に投影され、プリズム４１を介して
分光される。なお、分光は、図２に示す第１実施例の顕
微鏡と同様に短波長から長波長にわたる。

【００３７】分光された光は、レンズ２３を介して、分
光された絞り３の像としてＤＭＤ５の上に投影される。
ＤＭＤ５で選択的に反射された光は、レンズ２４を透過
してプリズム６１に入射する。プリズム６１を透過した
光はプリズムによって逆方向に分光され、その結果、プ
リズム６１に入射した分光された光が再合成され、レン
ズ２５に入射する。なお、分光された光がＤＭＤ５に導
かれる様子、及びＤＭＤによる光の波長の制御は、図３
及び図４に示した第１実施例と同様である。

【００３８】入射した光は、レンズ２５を介して絞り３
の像として結像される。このとき、照明光を顕微鏡方向
に導くために、照明光はミラー２７で反射される。ミラ
ー２７で反射された光は、照明レンズ２６に入射し、ダ
イクロイックミラー７で反射され、対物レンズ８に導か
れて標本９を励起する。標本９から蛍光として発せられ
た光は、対物レンズ８を介して無限遠光束となり、ダイ
クロイックミラー７を透過し、励起光の漏れ光をカット
する吸収フィルター２７を経て、結像レンズ１０を介し
てＣＣＤ１１の上に結像する。

【００３９】第３実施例図６は本発明による特定の波長で照明できる顕微鏡の第
３実施例を示す概略構成図である。第３実施例の顕微鏡
は、分光素子を透過型グレーティングを用いて構成した
分光照明装置を有する顕微鏡として構成されている。光
源１から出射した光は、コレクターレンズ２、光源投影
レンズ２１を介して集光されて、矩形開口、または、ピ
ンホール開口を構成した絞り３の位置で一旦結像してラ
ンプの像を作る。その後、絞り３を通り抜け、レンズ２
２を介して無限遠に投影され、透過型グレーティング４
２を介して分光される。なお、分光は、図２に示す第１
実施例の顕微鏡と同様に短波長から長波長にわたる。

【００４０】分光された光は、レンズ２３に入射し、絞
り３の像としてＤＭＤ５の上に投影される。ＤＭＤ５で
選択的に反射された光は、レンズ２４を透過して透過型
グレーティング６２に入射し、透過型グレーティング６
２を介して逆方向に分散が与えられ、その結果光が再合
成され、その後レンズ２５に入射する。なお、分光され
た光がＤＭＤ５に導かれる様子、及びＤＭＤによる光の
波長の制御は、図３及び図４に示した第１実施例と同様
である。

【００４１】入射した光は、レンズ２５を介して絞り３
の像として結像する。このとき、照明光を顕微鏡方向に
導くために、照明光はミラー２７で反射される。ミラー
２７で反射された光は、照明レンズ２６に入射し、ダイ
クロイックミラー７で反射され、対物レンズ８に導かれ
て標本９を励起する。標本９で蛍光として発せられた光
は、対物レンズ８を通り無限遠光束となり、ダイクロイ
ックミラー７を透過し、励起光の漏れ光をカットする吸
収フィルター２７を透過し、結像レンズ１０を介してＣ
ＣＤ１１の上に結像する。

【００４２】第４実施例図７は本発明による特定の波長で照明できる顕微鏡の第
４実施例を示す概略構成図である。第４実施例の顕微鏡
は、第１の分光素子４３及び第２の分光素子６３が、グ
レーティング自体にパワーをもつグレーティングを用い
て構成されており、図１に示した第１実施例の顕微鏡に
おけるレンズ２２〜２５を設けない構成となっている。
また、第４実施例では、ＤＭＤ５は、グレーディング６
３の方向に反射光を導くように任意の角度に微小ミラー
を振ることができるようになっている。光源１から出射
した光は、コレクターレンズ２、光源投影レンズ２１を
介して集光されて、矩形開口、または、ピンホール開口
を構成した絞り３の位置で一旦結像してランプの像を作
る。その後、絞り３を通り抜け、パワーを持つ反射型グ
レーティング４３を介して分光される。なお、分光は、
図２に示す第１実施例の顕微鏡と同様に短波長から長波
長にわたる。

【００４３】分光された光は、絞り３の像としてＤＭＤ
５の上に投影される。ＤＭＤ５で選択的に反射された光
は、パワーを持つ反射型グレーティング６３に入射し、
反射型グレーティング６３を介して分光された光が再合
成される。なお、分光された光がＤＭＤ５に導かれる様
子、及びＤＭＤによる光の波長の制御は、図３及び図４
に示した第１実施例と同様である。

【００４４】再合成された光は、レンズ２６を介して絞
り３の像として、ダイクロイックミラー７へと投影さ
れ、ダイクロイックミラー３で反射され、対物レンズ８
の後側焦点位置で結像される。対物レンズ８に導かれた
照明光は、標本９を励起する。標本９で蛍光として発せ
られた光は、対物レンズ８を介して無限遠光束となり、
ダイクロイックミラー７を透過し、励起光の漏れ光をカ
ットする吸収フィルター２７を経て、結像レンズ１０を
介してＣＣＤ１１の上に結像する。

【００４５】以上説明したように、本発明の特定の波長
で照明できる顕微鏡は、特許請求の範囲に記載された発
明の他に、次に示すような特徴も備えている。

【００４６】（１）前記第１の分光素子と前記選択的反
射部材との間に第１のレンズを、前記選択的反射部材と
前記第２の分光素子との間に第２のレンズを有し、前記
第１の分光素子が、前記第１のレンズの前側の焦点位置
に配置され、前記選択的反射部材が、前記第１のレンズ
の後ろ側の焦点位置と前記第２のレンズの前側の焦点位
置とが一致する位置に配置され、前記第２の分光素子
が、前記第２のレンズの後ろ側の焦点位置に配置されて
いることを特徴とする請求項１に記載の特定の波長で照
明できる顕微鏡。

【００４７】（２）前記選択的反射部材の反射角度を時
間的に制御することで、照明光の標本への照射時間をコ
ントロールすることができるようにしたことを特徴とす
る請求項１に記載の特定の波長で照明できる顕微鏡。

【００４８】（３）前記光源と前記第１の分光素子との
間に絞りを有し、前記選択的反射部材が、前記対物レン
ズの瞳位置とほぼ共役な位置に配置されていることを特
徴とする請求項１に記載の特定の波長で照明できる顕微
鏡。

【００４９】（４）前記第１又は第２の分光素子が、独
自にパワーを持つグレーティングを有して構成されてい
ることを特徴とする請求項１に記載の特定の波長で照明
できる顕微鏡。

【００５０】（５）前記ダイクロイックミラーの代わり
に、複数の波長を反射するミラー、又は、２％以上６０
％以下の反射率を有するミラーを用いたことを特徴とす
る請求項１に記載の特定の波長で照明できる顕微鏡。

【００５１】（６）標本を照明する光源と、光源からの
光を分散させる第１の分光素子と、第１の分光素子で分
散された光を選択的に反射する選択的反射部材と、選択
的反射部材で反射された光を対物レンズに導くために必
要な反射角度を変える為の稼動部を有する反射部材と、
ダイクロイックミラーと、対物レンズと、撮像素子とを
備えて構成された分光照明系を有することを特徴とする
特定の波長で照明できる顕微鏡。

【００５２】（７）前記選択的反射部材が、複数の部分
で光を対物レンズ側光路に反射させて、複数の波長の光
を顕微鏡に導くように構成されていることを特徴とする
請求項１に記載の特定の波長で照明できる顕微鏡。

【００５３】（８）分子、または、細胞内の分子に２波
長励起１波長測光型の指示薬を導入した標本を請求項１
に記載の顕微鏡を用いて観察又は測定を行うことを特徴
とする顕微鏡を用いた観察又は測定方法。

【００５４】（９）２波長励起１波長測光型指示薬に、
ｆｕｒａ−２，ＢＴＣ，又は、ＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）を基に作成さ
れたカルシウム指示薬、ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ−ｐｅ
ｒｉｃａｍ，ｐＨ指示薬（ｐＨｌｕｏｒｉｎ）を導入し
た標本を請求項１に記載の顕微鏡を用いて観察又は測定
を行うことを特徴とする顕微鏡を用いた観察又は測定方
法。

【００５５】

【発明の効果】本発明の顕微鏡によれば、積分球を用い
ることなく、明るい照明像が得られる。また、フィルタ
ーホイールで蛍光励起波長を切替える従来の顕微鏡に比
べて、高速で、しかも、振動を発生させることなく、波
長切替えをすることができる。また、任意、かつ、複数
の波長で同時に照明でき、複数の波長の明るさを別々に
調整することができる。さらにまた、コンフォーカル方
式を用いない為、退色の少ない、明るい蛍光像が得られ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による特定の波長で照明できる顕微鏡の
第１実施例を示す概略構成図である。

【図２】第１実施例の顕微鏡において短波長から長波長
にわたって分光される様子を示す説明図である。

【図３】第１実施例の顕微鏡において分光された光がＤ
ＭＤ上に投影される様子を示す説明図であり、(a)は絞
り３の位置に配置した矩形のスリット形状を表す図、
(b)は分光された光のＤＭＤ５における入射箇所を示す
図である。

【図４】第１実施例の顕微鏡における光の波長をＤＭＤ
でコントロールする場合についての原理説明図であり、
(a)は、ある波長幅をもった光のうち単一の波長のみを
顕微鏡に導く場合のＤＭＤの制御状態を示す図、(b)は
明るさを減少させるＤＭＤの制御状態を示す図、(c)は
２波長で照明する場合のＤＭＤのオンの部分を表した原
理説明図、(d)は波長ごとの明るさ比を調整する場合の
ＤＭＤのオンの部分を表した原理説明図である。

【図５】本発明による特定の波長で照明できる顕微鏡の
第２実施例を示す概略構成図である。

【図６】本発明による特定の波長で照明できる顕微鏡の
第３実施例を示す概略構成図である。

【図７】本発明による特定の波長で照明できる顕微鏡の
第４実施例を示す概略構成図である。

【符号の説明】１光源２コレクターレンズ３絞り４，６反射型グレーティング５ＤＭＤ７ダイクロイックミラー８対物レンズ９標本１０結像レンズ１１ＣＣＤ２１光源投影レンズ２２，２３，２４，２５，２６レンズ２７吸収フィルター４１，６１プリズム４２，６２透過型グレーティング４３，６３パワーを持つ反射型グレーティン
グ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者宮脇敦史埼玉県和光市広沢２番１号理化学研究所内 (72)発明者清水敬之東京都渋谷区幡ヶ谷２丁目43番２号オリンパス光学工業株式会社内 (72)発明者河野芳弘東京都渋谷区幡ヶ谷２丁目43番２号オリンパス光学工業株式会社内Ｆターム(参考） 2G043 AA03 BA01 BA16 CA07 DA02 EA01 FA02 FA06 GA02 GB01 GB03 GB28 HA01 HA02 HA08 HA15 JA02 JA04 JA05 KA02 KA03 LA03 MA11 2H052 AA09 AB24 AC04 AC14 AC19 AC27 AD31 AD34 AF07 AF14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標本を照明する光源と、光源からの光を
分散させる第１の分光素子と、第１の分光素子で分散さ
れた光を選択的に反射する選択的反射部材と、選択的反
射部材で反射された光を合成させる第２の分光素子と、
ダイクロイックミラーと、対物レンズと、撮像素子とを
備えて構成されていることを特徴とする特定の波長で照
明できる顕微鏡。
【請求項２】前記第１の分光素子、または前記第２の
分光素子が、反射型グレーティング、透過型グレーティ
ング、またはプリズムを用いて構成されていることを特
徴とする請求項１に記載の特定の波長で照明できる顕微
鏡。
【請求項３】前記選択的反射部材が、ＤＭＤ（Ｄｉｇ
ｉｔａｌＭｉｃｒｏ−ｍｉｒｒｏｒＤｅｖｉｃ
ｅ）、またはＳＬＭ（空間光変調器）を用いて構成され
ていることを特徴とする請求項１に記載の特定の波長で
照明できる顕微鏡。