JP4540318B2

JP4540318B2 - サイトカイン産生促進剤

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Publication number: JP4540318B2
Application number: JP2003302500A
Authority: JP
Inventors: 良二高田; 隆章矢内; 敏幸大久保; 充克佐藤
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 2002-08-28
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2010-09-08
Anticipated expiration: 2023-08-27
Also published as: JP2004107660A

Description

本発明はカシス果汁由来の新規な多糖類および該多糖類を有効成分とするサイトカイン産生促進剤および健康食品に関するものである。

近年、消費者の健康に対する意識はますます高まりを見せている。一方で、不況下の現代社会には、不規則な生活習慣、食事の偏り、精神的ストレスなど、免疫機構にダメージを与える要因が氾濫している。逆に免疫力が賦活されると、発癌抑制、制癌作用、抗感染症、抗アレルギー作用、さらには体調リズムの回復・恒常性維持など様々な効果が期待できる。免疫機構には、多くの種類の細胞が関与しているが、特に白血球の役割は大きい。なかでもマクロファージは全動物に普遍的に存在しており、免疫応答の特に初期段階での働きを含め、あらゆる段階に関与している重要な白血球の一種である。近年、白血球の働きが物質レベルで解明されてきており、白血球の機能や細胞間相作用は、白血球が分泌する微量タンパク質(サイトカイン)によって担われていることがわかってきた。

サイトカインには多くの種類があり、なかでも腫瘍壊死因子（TNF）やインターロイキン（IL）類が注目されている。それらのなかで、TNF-α、IL-1β、IL-12p70などの炎症性サイトカインは、主にマクロファージから放出され、最終的には抗癌作用や抗感染症作用などを示すことが報告されている。これらのサイトカインを遺伝子工学的手法により製造し薬剤として利用する方法も研究されているが、その一方で、自然界の素材やその抽出物を利用し、体内におけるある種のサイトカイン誘導量を高めることで宿主の免疫力や抵抗力を高めるための素材探索や検討も広くなされている（非特許文献１、２参照）。しかしながら、従来の免疫賦活剤や健康食品に含まれる有効成分は、その殆どが細菌や真菌（きのこ）由来のものであった。しかも、一般には入手困難であったり価格が高かったり、あるいは食品で使用する場合は安全性の問題やイメージが良くなかったりするものが少なくなかった。

An Immunomodulatory Polysaccharide-Rich Substance from the Fruit Juice of Morinda citrifolia(Noni) with Antitumour Activity(Phytotherapy Research 13,380-387(1999)) Immunopharmacological activity of Echinacea preparations following simulated digestion on murine macrophages and human peripheral blood mononuclear cells(J. Leukocyte Biology 68(10),503-510(2000))

本発明は、体内におけるTNF-αやある種のインターロイキン等のサイトカインの産生を促進させる物質を日常摂取されている食品中に見出し、該物質あるいは精製された抽出物を利用することで、安全性が高く優れた免疫賦活作用をもつ健康食品を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため、日常的に食用に供されている食物、特に果実類の中に免疫賦活物質を探索した。より具体的にはマウス腹腔マクロファージを用い、各種果実類の果汁、果皮抽出物のサイトカイン産生促進活性を測定したところ、ユキノシタ科スグリ属に属する植物であるカシス（別名ブラックカラント、クロフサスグリ）の果汁が他の果実類に比べ格段に優れたサイトカイン産生促進活性を有すること、さらにその活性物質が２種類の多糖類（多糖類Ａと多糖類Ｂ）であることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、カシス果汁由来の下記の新規な多糖類および該多糖類を有効成分とするサイトカイン産生促進剤および健康食品を提供するものである。
１．下記（１）〜（５）の性質を有する多糖類Ａ。
（１）平均分子量が約45,000であり、
（２）構成糖として、少なくともグルコース、ガラクトースおよびアラビノースを含み、それらの重量組成比が21:64:15であり、
（３）水および約35％（v/v）以下のエタノール水溶液に易溶であり、
（４）70％（v/v）以上のエタノール水溶液に不溶であり、
（５）65％飽和以上の硫酸アンモニウム水溶液に不溶である。
２．カシス果汁から得られる前記１記載の多糖類Ａ。

３．下記（１）〜（５）の性質を有する多糖類Ｂ。
（１）平均分子量が約430,000であり、
（２）構成糖として、少なくともグルコース、ガラクトースおよびアラビノースを含み、それらの重量組成比が41:50:9であり、
（３）水に易溶であり、
（４）約35％（v/v）以上のエタノール水溶液に不溶であり、
（５）65％飽和以上の硫酸アンモニウム水溶液に不溶である。
４．カシス果汁から得られる前記３記載の多糖類Ｂ。
５．前記１または２記載の多糖類Ａおよび前記３または４記載の多糖類Ｂを有効成分として含むサイトカイン産生促進剤。
６．前記１または２記載の多糖類Ａおよび前記３または４記載の多糖類Ｂを有効成分として含む健康食品。

本発明の多糖類は例えば、以下のような方法で得ることができる。まず、カシス果実を破砕し果皮等の固形分を分離し果汁とした後、アンモニア水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液等を用いてpH7.2〜7.4に調整し、生じる不溶物を遠心分離で除去し、上清を得る。原料となるカシスは、その産地、時期などに特に限定はなく、また市販されている果汁をpH未調整のままで使用して以下の工程に適用してもよい。

得られた上清からのさらなる有効成分の分離・精製は、通常の天然物からの多糖類の精製法に準じて行うことができる。まず、例えば、アンバーライトIR 120B H AG（オルガノ社製）、CM セファロース FF（ファルマシア社製）、AG 50W-X2（バイオラッド社製）等の陽イオン交換カラム、およびアンバーライト IRA 410 OH AG（オルガノ社製）、DEAE セファロース FF（ファルマシア社製）、AG 1-X2（バイオラッド社製）等の陰イオン交換カラムに順次通液することで各種のイオン性物質を除去する。なお、陽イオン交換処理と陰イオン交換処理はどちらを先に行ってもよく、樹脂は混床で使用しても良い。次いで、SEP-PAK(C18)（ウオータース社製）等の逆相カラムに通液してポリフェノール類を除去し、抽出液を得る。さらに必要により、凍結乾燥、噴霧乾燥等の乾燥処理をおこない、本発明の２種の多糖類ＡおよびＢを含有する乾燥物を得ることができる。また本発明の２種の多糖類は、さらにこの乾燥物あるいは乾燥する前の抽出液を次のエタノール分画法により精製することによりそれぞれ得ることができる。

本発明の２種の多糖類を含む抽出液に少量の塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩溶液を加えることにより極性を上げた状態で、約35％（v/v）となるようエタノールを加え遠心分離を行うことで、沈殿画分に多糖類Ｂを得ることができる。上清画分からは、透析や限外濾過によって単糖、二糖、オリゴ糖などの低分子糖類を除去することで、多糖類Ａを得ることができる。

あるいは、極性を上げた状態で、まず、70％（v/v）以上となるようエタノールを加え遠心分離することにより、多糖類Ａと多糖類Ｂを共沈させ、生じた沈殿を適当な水溶液で懸濁した後に約35％（v/v）となるようエタノールを加え遠心することにより、上清画分に多糖類Ａを、沈殿画分に多糖類Ｂを得ることができる。なお、多糖類Ａと多糖類Ｂを共沈させるには、65％飽和以上となるよう硫酸アンモニウムを加えても良い。

こうして得られた２種類の多糖類の物理化学的性質は以下のとおりである。
１．多糖類Ａの物理化学的性質
（１）分子量
高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した平均分子量は約45,000である。
（２）糖組成
塩酸加水分解後、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した糖組成は、構成糖として、少なくともグルコース、ガラクトースおよびアラビノースを含み、それらの重量組成比が21:64:15である。
（３）溶解性
水および約35％（v/v）以下のエタノール水溶液に易溶であり、70％（v/v）以上のエタノール水溶液には不溶である。約35％（v/v）〜70％（v/v）付近までのエタノール水溶液には一部が不溶である。65％飽和以上の硫酸アンモニウム水溶液には不溶である。

（４）各種クロマトグラフィーにおける吸着特性
多糖類Ａの構成多糖類は陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂に結合せず、一部がコンカナバリンA−セファロース樹脂（ファルマシア社製）に結合した。
（５）赤外線吸収スペクトル
多糖類Ａの赤外線吸収スペクトルを図１に示す。純水に溶解した多糖類Ａは、950〜1200cm^-1付近で、まとまって高い吸収パターンが見られた。
（６）紫外可視吸収スペクトル
多糖類Ａの紫外可視吸収スペクトルを図３に示す。
（７）比旋光度
多糖類Ａの比旋光度は〔α〕D＝+123（c 0.25,H2O）である。

（８）熱安定性
多糖類Ａと多糖類Ｂが共存する状態で、100℃，10分間の加熱処理を行った結果、マクロファージに対するサイトカイン産生促進活性は失活しなかった。
（９）呈色反応
フェノール−硫酸法による呈色反応は陽性である。
（１０）物質の色
純水で透析した後、凍結乾燥したものは、薄い褐色である。

（１１）酵素処理安定性
多糖類Ａの構成多糖類のうち、コンカナバリンA−セファロースに結合する画分は、エンドタイプのガラクトシダーゼ活性を有するendo-β-Galactosidase（Escherichia freundii：生化学工業社製）とβ-Glucanase FBP（Bacillus subtilis：日本バイオコン社製）を使用した酵素処理では分解されない。
（１２）¹³C-核磁気共鳴スペクトル(125MHz)
内部標準としてアセトンを使用し、重水中で測定した多糖類Ａの¹³C−核磁気共鳴スペクトルを図５に示す。
（１３）¹H-核磁気共鳴スペクトル(500MHz)
重水中で測定した多糖類Ａの¹H−核磁気共鳴スペクトルを図６に示す。

２．多糖類Ｂの物理化学的性質
（１）分子量
高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した平均分子量は約430,000である。
（２）糖組成
塩酸加水分解後、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した糖組成は、構成糖として、少なくともグルコース、ガラクトースおよびアラビノースを含み、それらの重量組成比が41:50:9である。
（３）溶解性
水に易溶であり、約35％（v/v）以上のエタノール水溶液には不溶である。10％（v/v）〜約35％（v/v）付近までのエタノール濃度では一部が不溶である。65％飽和以上の硫酸アンモニウム水溶液には不溶である。

（４）各種クロマトグラフィーにおける吸着特性
多糖類Ｂの構成多糖類は陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂に結合せず、コンカナバリンA−セファロース樹脂にも結合しなかった。
（５）赤外線吸収スペクトル
多糖類Ｂの赤外線吸収スペクトルを図２に示す。純水に溶解した多糖類Ｂは、1040cm^-1付近で特に特異的に高い吸収パターンが見られた。
（６）紫外可視吸収スペクトル
多糖類Ｂの紫外可視吸収スペクトルを図４に示す。
（７）比旋光度
多糖類Ｂの比旋光度は〔α〕D＝+177（c 0.25,H2O）である。

こうして得られる多糖類Ａおよび多糖類Ｂは、サイトカイン産生促進活性をもつので健康食品に利用可能である。多糖類Ａおよび多糖類Ｂを健康食品に利用するには、どのような精製段階のものでも使用可能であり、例えば、各種精製段階のものを各種食品、例えば、清涼飲料、ジュース、茶、紅茶、アルコール飲料、あめ、各種加工食品等に添加することにより、サイトカインの産生を促進し免疫機構を活性化させる健康食品を得ることができる。

本発明により得られる多糖類およびそれを含む抽出物は、サイトカイン産生促進剤、免疫賦活剤、もしくは前記物質または成分が添加された機能性食品および健康食品として有用なものであり、かつ、日常的に食されている果実からの抽出物であるため、毒性が極めて低く、長期の連用においても人体に何等の悪影響は与えないものである。

次に実施例を記載して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１：各種果汁、果皮抽出物およびハーブ抽出物のサイトカイン産生促進効果
パッションフルーツ、シークワシャー、ピーチ、スイカ、プルーン、イチジク、キウイ、アプリコット、グアバ、パパイア、カシス（英名：ブラックカラント）、ラフランス、レッドラズベリー、レッドプラム、マンゴー、クランベリー、ライチ、ウメ、ビワ、オレンジ、グレープフルーツ、ユズ、レモン、アムラ、ナツミカン、ライム、ライム、ブルーベリー、アセロラ、パインアップル、ザクロ、ルビーグレープフルーツ、バナナ、リンゴ、ブラッドオレンジ、メロン、ブドウ（カベルネソービニヨン）およびブドウ（ソービニヨンブラン）の各種果汁、オレンジ果皮、バナナ果皮、レモン果皮、グレープフルーツ果皮およびユズ果皮の各種果皮抽出物、さらに、ハーブ（エキナケア）の抽出物について、マウス腹腔マクロファージの系を用いて、サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-12p70）産生促進効果について試験した。

（試験サンプルの調製）
果汁については、脱イオン水で２倍に希釈後、1規定の水酸化ナトリウム水溶液でpH7.2〜7.4に調整し、さらに脱イオン水を加え、最終的に４倍希釈液を調製した。これを遠心分離（15,000rpm×5分）し、得られた上清を試験サンプルとした。果皮については、等量の脱イオン水を加え、ミキサーで十分撹拌破砕した。pH7.2〜7.4に調整後、さらに脱イオン水を加え、最終的に４倍希釈液を調製した。これを遠心分離（1,5000rpm×5分）し、得られた上清を試験サンプルとした。

ハーブについては、エキス末を生薬の重量に換算して４倍希釈となるように脱イオン水を加え、15分間スターラーで攪拌、次いで遠心分離（15,000rpm×5分）し、得られた上清を試験サンプルとした。

（サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-12p70)産生能の測定）
マウス（ICR、8週令、雄）の腹腔内に2.98％チオグリコレート培地(ディフコ社製)2.7mlを注射した。４日後に腹腔内の細胞を採取した結果、約1×10⁷cells/マウスのマクロファージが得られた。PBS^-（リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）:ディフコ社製）で洗浄後、最終的にマクロファージ濃度が１×10⁶cells/mlとなるように１％FCS−RPMI1640に懸濁した。これを96ウエル・プレートに200μlずつ分注し、CO₂インキュベータ内で37℃、2時間静置した。ウエルをPBS^-で２回洗浄した後、抗生物質（ペニシリン（100units/ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml））を含む5％FCS−RPMI1640を各ウエルに180μlずつ添加した。これに試験サンプルまたはコントロールを20μl添加し、20時間培養した。なお、ポジティブ・コントロールには、LPS（Escherichia coli 0111：フナコシ社製）を脱イオン水で１μg/mlとなるように調製したものを用いた。ネガティブ・コントロールには、PBS^-を用いた。培養液を遠心（1000rpm、10分）し、得られた上清中のサイトカイン濃度をサイトカインELISA定量キット(Quantikine mouse TNF-α、IL-1β、IL-12p70：R&Dシステムズ社製)により、添付されたマニュアルに従って測定した。

結果を表1-1および表1-2に示す。

表1-1および表1-2に示したとおり、果汁の中では、カシス、イチジク、ライチ、ビワなどが強いサイトカイン産生促進能を示した。中でもカシスのサイトカイン産生促進能、特にTNF-αおよびIL-1βの誘導活性は群を抜いており、免疫力を高めるハーブとして広く知られており、マウス・マクロファージを活性化するという報告もあるエキナケアよりも高い活性を示した。さらに、カシスの場合は、TNF-αの誘導活性と比較してIL-1βの誘導活性が、他の果実に比べて相対的に極めて高かった。

実施例２：カシスからのサイトカイン産生促進成分の分離（１）
カシス果実を破砕し、遠心（10,000rpm、10分間）することによって、固形分を分離した。1規定の水酸化ナトリウム水溶液でpH7.2〜7.4に調整し、生じた不溶物を遠心（10,000rpm、10分間）除去し上清を回収した。陽イオン交換樹脂（アンバーライト IR 120B H AG:オルガノ社製）と陰イオン交換樹脂（アンバーライト IRA 410 OH AG :オルガノ社製）に流速SV4で通し、素通り画分を回収した。次いで、メタノールで活性化したSEP-PAK(C-18)カラム（ウオータース社製）に通し、素通り画分を回収した。

実施例３：カシスからのサイトカイン産生促進成分の分離（２）
SEP-PAK(C-18)カラム工程によって得られた画分に終濃度0.1mole/lとなるよう塩化ナトリウムを添加した。これにエタノールを種々の濃度（v/v）となるよう添加した。遠心（15,000rpm、10分間）により上清画分と沈殿画分に分離し、沈殿画分には元の容量となるようPBS^-を加え懸濁した。各エタノール濃度における上清画分と沈殿画分のTNF-α誘導活性について測定したところ、図７に示すとおり、エタノール濃度が30〜40％（v/v）のところで明らかに２つの成分に分離した。

次に、エタノール濃度が70％（v/v）となるよう添加した場合に得られた沈殿画分をPBS^-に懸濁し、今度は35％（v/v）の濃度となるよう再度エタノールを添加した。これを遠心により上清画分と沈殿画分に分離し、上清画分と沈殿画分単独の場合と両者を混合した場合でのサイトカイン産生促進活性（TNF-α誘導活性）を調べると、図８に示すように２つの成分が共存しているときに限り、強いサイトカイン産生促進活性が現れた。

実施例４：カシスからのサイトカイン産生促進成分の分離（３）
上記上清画分と沈殿画分を分画分子量10,000の限外濾過（ミリポア社製）により洗浄・濃縮することで単糖、二糖やオリゴ糖のような低分子物質を除去し、Protein Assay Kit（バイオラッド社製）とフェノール−硫酸法により、それぞれの画分のタンパク質含有量と多糖類含有量を測定した。分画操作前の即ちカシス果汁の状態での濃度に換算すると、上清画分に含まれるタンパク質含有量と糖含有量は、それぞれ3μg/mlと360μg/mlであった。一方、沈殿画分に含まれるタンパク質含有量と糖含有量は、それぞれ39μg/mlと4400μg/mlであった。このように、両画分はいずれも多糖類がほぼ全てを占めていた。そして、上清画分と沈殿画分に含まれる多糖類をそれぞれ多糖類Ａと多糖類Ｂとした。また、この場合において、多糖類Ａの比旋光度は〔α〕D＝+123（c 0.25,H2O）であり、多糖類Ｂの比旋光度は〔α〕D＝+177（c 0.25,H2O）であった。

次に、多糖類Ａと多糖類Ｂの分子量を測定した。種々の重合度をもつデキストラン（ファルマシア社製）を分子量マーカーとして、ゲル濾過用カラムOHpak SB-805 HQ（昭和電工社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーによって測定した。その結果、多糖類Ａと多糖類Ｂの見かけ上の平均分子量はそれぞれ約45,000と約430,000であった。

さらに、構成糖の組成比を調べた。終濃度が0.7規定となるよう塩酸を添加し、100℃、12時間放置することで多糖類を加水分解した。遊離した単糖類を糖分析用カラムSUGAR SC1011（昭和電工社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーによってグルコース、ガラクトースおよびアラビノースの定量を行った。その結果、多糖類Ａと多糖類Ｂの糖組成比は重量比でそれぞれ21:64:15と41:50:9であった。

精製された多糖類Ａの赤外線吸収スペクトルのチャートを示す。縦軸は多糖類Ａの水溶液とブランクである純水の各波数での吸収差を吸光度で示したものである。精製された多糖類Ｂの赤外線吸収スペクトルのチャートを示す。縦軸は多糖類Ｂの水溶液とブランクである純水の各波数での吸収差を吸光度で示したものである。精製された多糖類Ａの紫外可視吸収スペクトルを示す。精製された多糖類Ｂの紫外可視吸収スペクトルを示す。

精製された多糖類Ａの¹³C−核磁気共鳴スペクトル(125MHz)を示す。精製された多糖類Ａの¹H-核磁気共鳴スペクトル(500MHz)を示す。カシス果汁中のサイトカイン産生促進成分（多糖類Ａと多糖類Ｂ）の各エタノール濃度画分における所在状況を示す。所在はTNF-α誘導活性の強さで示す。カシス果汁の35％エタノール濃度分画における上清画分（多糖類Ａを含む）と沈殿画分（多糖類Ｂを含む）を併せることによるTNF-α誘導活性の回復（相乗効果）を示す。

Claims

下記（１）〜（５）の性質を有する多糖類Ａ。
（１）平均分子量が約45,000であり、
（２）構成糖として、少なくともグルコース、ガラクトースおよびアラビノースを含み、それらの重量組成比が21:64:15であり、
（３）水および約35％（v/v）以下のエタノール水溶液に易溶であり、
（４）70％（v/v）以上のエタノール水溶液に不溶であり、
（５）65％飽和以上の硫酸アンモニウム水溶液に不溶である。
カシス果汁から得られる請求項１記載の多糖類Ａ。
下記（１）〜（５）の性質を有する多糖類Ｂ。
（１）平均分子量が約430,000であり、
（２）構成糖として、少なくともグルコース、ガラクトースおよびアラビノースを含み、それらの重量組成比が41:50:9であり、
（３）水に易溶であり、
（４）約35％（v/v）以上のエタノール水溶液に不溶であり、
（５）65％飽和以上の硫酸アンモニウム水溶液に不溶である。
カシス果汁から得られる請求項３記載の多糖類Ｂ。
請求項１または２記載の多糖類Ａおよび請求項３または４記載の多糖類Ｂを有効成分として含むTNF-α産生促進剤。
請求項１または２記載の多糖類Ａおよび請求項３または４記載の多糖類Ｂを有効成分として含むIL-1β産生促進剤。