JP4538645B2 - トリプトファン含有ダイズ、およびその利用 - Google Patents
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Description
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、をコードしているポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
(a)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(b)以下の(i)もしくは(ii)のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(i)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;もしくは
(ii)配列番号1に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、が導入されていることを特徴としている。
本発明に用いられる(導入される)ポリヌクレオチドは、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子であればよい。例えば、次のポリヌペプチドをコードするポリペプヌクレオチドであればよい。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記「1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、もしくは付加ができる程度の数(例えば20個以下、好ましくは10個以下、より好ましくは7個以下、さらに好ましくは5個以下、特に好ましくは3個以下)のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
(c)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)以下の(i)もしくは(ii)のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(i)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;もしくは
(ii)配列番号1に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも90%の同一性、好ましくは少なくとも95%の同一性、最も好ましくは少なくとも97%の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、60℃で2×SSC 洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。
本発明に係るトリプトファン含有ダイズ(形質転換ダイズ)は、上記(1)に記載したポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組換えベクターが導入されており、かつ、トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドが発現していれば、特に限定されるものではない。
本発明は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて上記(1)のポリペプチドを生産する方法を提供する
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いる。上記(1)に記載のポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能にダイズに導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、ダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターをダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に導入する工程を包含する。
本発明は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いてトリプトファンを生産する方法を提供する。
本発明は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて製造される家畜飼料、水産飼料、食品、栄養補助剤、および工業製品を提供する。また、上述のトリプトファンの生産方法により得られたトリプトファンを用いて製造される家畜飼料、水産飼料、食品、および栄養補助剤を提供する。
非特許文献1に記載された方法により取得したOASA1D遺伝子を、図1(a),(b)に示すように、恒常的プロモータであるカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモータ、あるいは子葉特異的プロモータであるダイズ11Sグロブリン(gy2)プロモータと接続し、ノパリン合成酵素のターミネーター配列と接続させた。
プライマー1:5'-GCGAAGCTTAGAATCCGTTGCATTCACTA-3'(配列番号3)
プライマー2:5'-CGCTCTAGAGTGATGAGTGTTCAAAGACA-3'(配列番号4)
プライマー3::5'-AAGGTACCGGATCCCCCCTCAGAA-3'(配列番号5)
プライマー4:5'-AAGAGCTCCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3'(配列番号6)
である。
<不定胚の誘導と増殖>
ダイズの形質転換および再生システムについては、次の参考文献3〜6を利用した。
参考文献3:Finer J.J. and Nagasawa A. 1988. Development of an embryogenic suspension culture of soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 15: 125-136.
参考文献4:Sato S., Newell C., Kolacz K., Tredo L., Finer J. and Hinchee M. 1993. Stable transformation via particle bombardment in two different soybean regeneration systems. Plant Cell Rep. 12: 408-413.
参考文献5:Parrott W.A., All J.N., Adang M.J., Bailey M.A., Boerma H.R. and Stewart C.N.J. 1994. Recovery and evaluation of soybean plants transgenic for a Bacillus thuringiensis var. Kurstaki insecticidal gene. In Vitro Cell. Dev. Biol. 30: 144-149.
参考文献6:Hadi M.Z., McMullen M.D. and Finer J.J. 1996. Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment. Plant Cell Rep. 15: 500-505
不定胚形成能に優れたダイズ品種JackあるいはJQ系統を温室内で栽培した。栽培は室温25℃、自然日長下で行った。登熟中の莢表面を70%エタノールで2分間滅菌し、滅菌水で3回洗浄した後、未熟子葉(3〜5mm)を取り出し、種皮と胚軸を取り除いた。そして処理された未熟子葉を、向軸側を上にして不定胚誘導培地(MSD40)に置床し、温度25℃、日長23時間、寒白色蛍光灯を用いて光強度5〜10μmolm-1s-2で培養した。すると、図2(a),(b)に示すように、3〜4週間で不定胚を生じた。
増殖した不定胚(約0.8g)を遺伝子導入培地(MSD20、プラスチックシャーレの大きさ90×20mm)の中央、直径約25mmにまんべんなく広げ、表面を乾燥させた。なお、遺伝子導入培地(MSD20)は、MS塩とビタミンB5とから形成し、3%ショ糖とアスパラギン(1gL-1)と2,4−D,20mgml-1とを補充し、pH5.8に調整し、0.2%Gelriteで凝固した。
遺伝子を導入した不定胚は不定胚増殖培地で1週間培養した後、15ml/Lハイグロマイシンを添加した選抜培地で2週間、30mg/Lハイグロマイシンを添加した選抜培地で4週間、45ml/Lハイグロマイシンを含む選抜培地で2週間培養した。この間、培地は毎週交換した。ハイグロマイシン添加培地において8週間培養することにより、ほとんどの不定胚は白化し、図2(d)に示すように、緑色を維持している遺伝子組換え体を容易に識別することができた。
参考文献10(Samoylov VM, Tucker DM, Parrott WA (1998) Liquid medium-based protocol for rapid regeneration from embryogenic soybean cultures. Plant Cell Rep 18:49-54)に記載された方法により、不定胚魂を回復させた。
遺伝子組換え不定胚は実施例2にようにハイグロマイシンで選抜するのに加え、実体蛍光顕微鏡(MZ FLIII;商品名、ライカ製)等によって、GFPの発現を確認することでさらに選抜した。図3(A−w),(A−b),(B−w),(B−b)に遺伝子が導入された不定胚と、図3(C−w),(C−b)に成熟胚とが示される。青色光を照射することで、図3(A−b),(B−b),(C−b)に示すように、遺伝子が導入された箇所(細胞)が分かった。
成熟胚の段階で導入遺伝子の発現とトリプトファン含量の増加とを調査した。以下に導入遺伝子の発現をRT−PCRによって確認する方法を記す。
プライマー5:5'-GACGCTGAGGATATTCAACC-3'(配列番号7)
プライマー6:5'-AGAAATCTGTGAGGTCACGA-3'(配列番号8)
プライマー7:5'-CTGAACTCACCGCGACGTCT-3'(配列番号9)
プライマー8:5'-AGTCCTCGGCCCAAAGCATC-3'(配列番号10)
プライマー9:5'-ACCGCTGCCTCGTCAGGGAGGACG-3'(配列番号11)
プライマー10:5'-CTCAAAACGCTGGCTTAAGAC-3'(配列番号12)
である。
上記実施例3を繰り返し行った。つまり、35S:OASA1Dプラスミドを用いた遺伝子導入は56回、gy2:OASA1Dプラスミドを用いた遺伝子導入は48回行った。
<種子のトリプトファン含量>
非組み換え体(コントロール)、35S:OASA1D遺伝子導入個体、gy2:OASA1D遺伝子導入個体において、種子のトリプトファン含量を調べた。
非組み換え体(コントロール)、35S:OASA1D遺伝子導個体、gy2:OASA1D遺伝子導入個体における、種子のタンパク質組成を比較した。
非組み換え体(コントロール)、35S:OASA1D遺伝子導入個体、gy2:OASA1D遺伝子導入個体において、葉のトリプトファン含量を調べた。個体毎に1gの葉を凍結乾燥させ、乾燥葉をコーヒーミルで粉砕し乾燥葉粉砕物を得た。この乾燥葉粉砕物からの遊離アミノ酸の抽出と分析は、上記<種子のトリプトファン含量>に記載した方法と同様に行った。その分析結果を図9に示す。
高遊離アミノ酸系統であるJQへのOASA1D遺伝子導入を、実施例3と同様に行った。ここでは、実施例1のgy2:OASA1Dプラスミドを用いた。
Claims (7)
- ダイズで発現可能なプロモータと共に、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子が発現可能に導入されているトリプトファン含有ダイズであって、
前記プロモータは、種子特異的であって、配列番号13に記載の塩基配列を有し、
前記イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子は、
トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであり、下記の(a)または(b)のいずれかのポリペプチド:
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
をコードしているポリヌクレオチドからなることを特徴とするトリプトファン含有ダイズ。 - 上記ポリヌクレオチドは、下記の(a)または(b)のいずれかのポリヌクレオチド:
(a)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(b)以下の(i)もしくは(ii)のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(i)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;もしくは
(ii)配列番号1に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、
であることを特徴とする請求項1に記載のトリプトファン含有ダイズ。 - 上記トリプトファン含有ダイズには、細胞、植物個体、その子孫、あるいはこれら由来の組織が含まれることを特徴とする請求項1または2に記載のトリプトファン含有ダイズ。
- 請求項1に記載のポリペプチドの生産に、請求項1〜3の何れかに記載のトリプトファン含有ダイズを用いることを特徴とするポリペプチドの生産方法。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載のトリプトファン含有ダイズを用いることを特徴とするトリプトファンの生産方法。
- 請求項1〜3の何れか1項に記載のトリプトファン含有ダイズを含むことを特徴とする家畜飼料、水産飼料、食品、または栄養補助剤。
- 請求項5に記載の生産方法によりトリプトファンを生産することを特徴とするトリプトファン生産装置。
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