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免疫グロブリン受容体
免疫グロブリン受容体(Fc受容体とも呼ばれる)は、免疫グロブリンの定常領域に結合する細胞表面受容体であり、抗原結合の他に免疫グロブリンの様々な機能を媒介する。
IgE分子のFc受容体は、免疫系の多くの細胞型上で見られる(Fridman, W., FASEB J., 5(12):2684-90 (1991))。IgEについては現在2つの異なる受容体が知られている。IgEは、複数鎖を持つ高親和性受容体FcεRI及び低親和性受容体FcRIIを介して抗体としてその生体応答を媒介する。高親和性FcεRI(肥満細胞、好塩基球及びランゲルハンス細胞の表面上に発現される)は、免疫グロブリン遺伝子のスーパーファミリーに属し、α-鎖と、β-鎖と、受容体発現及びシグナル伝達に必要な2本のジスルフィド結合γ-鎖(Adamczewski, M.,及びKinet, J.P., Chemical Immun., 59:173-190 (1994))と、で構成される4量体構造を有する(Tunon de Lara, Rev. Mal. Respir., 13(1):27-36 (1996))。この受容体のα-鎖は、IgE重鎖の第3定常ドメインの遠位部分と相互作用する。ヒトFcεRIへの結合に関与するヒトIgEの具体的なアミノ酸は、Arg-408、Ser-411、Lys-415、Glu-452、Arg-465、及びMet-469を含むものとして同定されている(Prestaら, J. Biol. Chem. 269:26368-73 (1994))。この相互作用は、結合定数が約1010M-1であり、特異性が高い。
低親和性FcεRII受容体(好酸球、白血球、Bリンパ球及び血小板を含む炎症性細胞の表面上に提示される)は、免疫グロブリンのスーパーファミリーから進化したものではない、幾つかの動物レクチンと実質的な相同性を有し(Yodoiら, Ciba Found. Symp., 147:133-148 (1989))、細胞質内NH2末端を有する膜貫通鎖で構成されている。低親和性受容体FcεRII(CD23)は、現在では、2つの形態(FcεRIIa及びFcεRIIb)を有すること知られており、これら2つの形態はいずれもクローニング及び配列決定されている。これらは、N末端の細胞質領域のみが異なり、細胞外ドメインは全く同じである。FcεRIIaは通常はB細胞上で発現されるが、FcεRIIbは、サイトカインIL-4により誘導されるとT細胞、B細胞、単球及び好酸球上で発現される。
高親和性IgE受容体FcεRIを介して、IgEは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、重度の食物アレルギー、慢性じんま疹及び血管性水腫を含む多数の急性及び慢性のアレルギー反応、ならびにアナフィラキシー性ショックの生理学的重篤状態(例えば蜂刺されやペニシリンアレルギーにより起こるようなもの等)において重要な役割を担う。肥満細胞及び好塩基球の表面上のFcεRIに特異的に結合した抗原特異的IgEへの多価抗原(アレルゲン)の結合は、複雑な一連のシグナル伝達を刺激してついには宿主の血管作用性及び炎症促進性(proinflammatory)介在因子を放出させ、急性アレルギー反応及び遅発相アレルギー反応の両方の一因となる(Metcalfeら, Physiol. Rev., 77:1033-1079 (1997))。
Bリンパ球の表面上に見られる低親和性IgE受容体RcεRII(CD23とも呼ばれる)の機能は、FcεRIの機能に比べて殆ど確立されていない。多量体状のFcεRIIはIgEに結合し、この結合は、B細胞により産生される抗体のタイプ(クラス)の制御において役割を担い得る。
これまでに、細胞表面上において、ヒトIgGの定常領域に結合する受容体の3つのグループ(FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、及びFcγRIII(CD16))が同定されており、これらは全て、免疫グロブリン遺伝子のスーパーファミリーに属する。これら3つのFcγ受容体は、沢山の様々なアイソフォームを有する。
刺激性FcεRIと共に、肥満細胞及び好塩基球は、免疫受容体チロシン・ベース阻害モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM)を含む阻害性低親和性受容体FcγRIIbを一緒に発現する。このFcγRIIbは、抗体機能の負のレギュレーターとして働く。FcγRIIbは、構造的に及び機能的に似ている阻害性受容体の増大しつつあるファミリー(growing family)である阻害性受容体スーパーファミリー(IRS)の代表的なものである。IRSは、免疫受容体チロシン・ベース活性化モチーフを含む免疫受容体(Ott and Cambier, J. Allergy Clin. Immunol., 106:429-440 (2000))及び多様な一連の細胞応答を負に調節する。IRSメンバーと活性化受容体とが凝集すると、特徴的なITIMチロシンのリン酸化及びそれに続くSHドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼSHP-1及びSHP-2ならびにSH2ドメイン含有ホスホリパーゼSHIP及びSHIP2の漸増(recruitment)につながる(Cambier, J.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5993-5995 (1997))。この凝集の結果起こり得るものとしては、FcγRIIbと、B細胞受容体、T細胞受容体、活性化受容体(RcεRIを含む)、又はサイトカイン受容体との凝集により示されるような細胞活性化の阻害が挙げられる(Malbecら, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 244:13-27 (1999))。
これまでの多くの研究は、FcγRIIのメカニズム、特にFcγRIIbの機能の解明に焦点が当てられていた。FcγIIb受容体の3つの選択的にスプライシングされたアイソフォーム(そのうち、FcγRIIb1はマウスにおいてのみ見られ、FcγRIIb1及びFcγRIIbは、ヒト及びマウスの両方において発現される)は、Ig様ループ及び保存されたITIMを有するが、これらの細胞質ドメインは異なる。高親和性FcεRI受容体と阻害性低親和性受容体FcγRIIとの架橋により、多くのプロセス(FcεRI介在性分泌、IL-4産生、Ca2+動員、Sykリン酸化、ならびにFcεRI介在性の好塩基球及び肥満細胞の活性化を含む)が遮断される。B細胞内において、B細胞受容体とFcγRIIbとの架橋は、B細胞受容体介在性細胞活性化を阻害し(Cambier, J.C., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:5993-5995 (1997); Daeron, M., Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997))、そして特に、B細胞受容体誘導型幼若化及び増殖を阻害し(Chanら, Immunology, 21:967-981 (1971); Phillips及びParker, J. Immunol., 132:627-632 (1984))、アポトーシスを刺激する(Ashmanら, J. Immunol, 157:5-11 (1996))。ラット好塩基球性白血病細胞内におけるFcγRIIb1又はFcγRII2とFcεRIとの凝集は、セロトニン及びTNF-αのFcεRI介在性放出を阻害する(Daeronら, J. Clin. Invest., 95:577-85 (1995); Daeronら, Immunity, 3:635-646 (1995))。
FcεRIと結合したときにIgE介在性肥満細胞活性化を妨げるといわれている肥満細胞上に発現される他のITIM含有受容体は、gp49b1(gp91)と呼ばれる免疫グロブリンスーパーファミリーの49kDa糖タンパク質メンバーである(例えばWagtmannら, Current Top. Micobiol. Immunol. 244:107-113 (1999); Katz, H.R., Int. Arch Allergy Immunol. 118:177-179 (1999);及びLu-Kuoら, J. Biol. Chem. 274:5791-96 (1999)を参照されたい)。gp49b1は最初はマウスにおいて同定されたが、ヒトにおいてgp49ファミリーに相当するもの(gp49b1を含む)が、Armら, J. Immunol. 15:2342-2349 (1997)によってクローニングされた。更なるITIM含有受容体(幾つかは肥満細胞、好塩基又はB細胞内で発現される)については、Sinclair NR, Scand. J. Immunol., 50:10-13 (1999)により概説されている。
高親和性IgE受容体FcεRIを介して、IgEは、免疫応答において重要な役割を果たす。抗原特異的IgE/FcεRI経路を介する抗原(即ちアレルゲン)による肥満細胞及び好塩基球の活性化により、宿主の血管作用性及び炎症促進性の介在因子の放出(即ち脱顆粒)が起こり、これは、アレルギー反応の一因となる(Oliverら, Immunopharmacology 48:269-281 [2000]; Metcalfeら, Physiol. Rev., 77:1033-1079 [1997])。これらの及び他の生化学的な出来事は、ヒスタミン等の炎症介在因子の急速な分泌につながり、その結果、局所的な組織炎症、血管拡張、血管透過性及び粘膜透過性の増大、ならびに他の免疫系細胞(更なる好塩基球及び肥満細胞を含む)の局所的な漸増を含む生理学的反応が起こる。適度な場合、これらの反応は、寄生虫及び他の微生物に対する免疫性において有益な役割を有する。しかし過剰になると、この生理学的反応は、I型過敏症としても知られるアレルギーの様々な病理学的状態をもたらす。
アレルギー状態
アレルギーは、幅広い一連の状態及び関連症状(軽度のもの、慢性のもの、急性のもの及び/又は生命を脅かすようなものまで)で現れる。これらの様々な病理としては、例えばアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、重度の食物アレルギー、慢性じんま疹、及び血管性水腫、ならびにアナフィラキシー性ショックの生理学的重篤状態が挙げられる。多様な種類の抗原がアレルゲンとして働くことが知られており、これらのアレルゲンへの曝露は、アレルギー病理をもたらす。一般的なアレルゲンとしては、蜂刺され、ペニシリン、様々な食物アレルギー、花粉、動物の残骸(animal detritus)(特にイエダニ、猫、犬、及びゴキブリ)等、ならびに真菌アレルゲンが挙げられるが、これらに限定されない。アレルゲンに対する最もひどい反応は、気道狭窄及びアナフィラキシー性ショックをもたらす場合があり、これらはいずれも死に至る可能性のある状態である。アレルギー反応を制御する細胞及び分子のメカニズムの理解が進歩し治療法が改善されたにも関わらず、アレルギー性疾患(特にアレルギー性喘息)の発病率は、先進国及び発展途上国の両方において近年劇的に増加している(Beasleyら, J. Allergy Clin. Immunol. 105:466-472 (2000); Peat及びLi, J. Allergy Clin. Immunol. 103:1-10 (1999))。したがって、アレルギー性疾患の治療法を開発することが非常に必要とされている。
アレルギー性喘息は、いたるところにある環境アレルゲンに曝露されることにより引き起こされる状態であり、過敏症の個体において、炎症反応及び上気道の狭窄をもたらす。多くの患者において、軽度の喘息は、比較的低用量のコルチコステロイドの吸入によって通常は制御することができるが、中程度の喘息は、長時間作用型βアンタゴニスト又はロイコトリエン阻害因子の吸入投与をさらに行うことによって通常は管理される。重度の喘息の治療は、未だに深刻な医学的問題である。更に、アレルギー治療で現在使用されている療法の多くは、深刻な副作用を有する。現在臨床試験中の抗-IgE抗体(rhuMAb-E25, Genetech, Inc.)及び他の実験的療法で使用されている抗-IgE抗体(例えばIL-4のアンタゴニスト等)は、有望な結果を示しているが、アレルギー性疾患(喘息、重度の食物アレルギー、ならびに慢性のじんま疹及び血管性水腫等)を制御するための更なる治療的戦略及び作用物質の開発が必要とされている。
アレルギー性疾患の治療のための1つのアプローチは、アレルゲンをベースとした免疫療法の使用によるものである。この方法論は、丸ごとの抗原(whole antigen)を「アレルギーワクチン」として使用し、そして今では比較的アレルギー耐性の状態を誘導することが認められている。アレルギーを治療するためのこの技法は、しばしば「脱感作(desensitization)」又は「除感作(hyposensitization)」療法と呼ばれる。この技法において、典型的には注射により、長時間かけて、しばしば数ヶ月又は数年かけて、より大量のアレルゲンが被験者に投与される。この療法の作用のメカニズムは、IgG阻害性抗体の誘導、肥満細胞/好塩基球反応性の抑制、T細胞応答の抑制、T細胞アネルギーの促進、及び/又はクローン消失(clonal delation)を含むと考えられ、そして長期的には、アレルゲン特異的IgEのレベルの低下を含むと考えられる。しかしこのアプローチの使用は、多くの場合、アレルゲンの臨床投与によってそれが抑制しようとする重度のアレルギー反応を誘導する場合、効きめの乏しさ及び深刻な副作用(死に至る可能性のある全身性アナフィラキシー反応を引き起こす危険性を含む)によって妨げられている(TePasら, Curr. Opin. Pediatrics 12:574-578 [2000])。
この技法の改良形態は、アレルゲン分子のより小さな部分(ここでこの小さな部分(即ちペプチド)はアレルギー反応を調節するT細胞に対する免疫優性エピトープ(immunodominant epitope)をおそらく含む)を用いる。これらのアレルギー誘発性部分を用いた免疫寛容療法はペプチド療法とも呼ばれ、典型的には注射によってより大量のアレルギー誘発性ペプチドが被験者に投与される。この療法の作用のメカニズムは、T細胞応答の抑制、T細胞アネルギーの促進、及び/又はクローン消失を含むと思われる。これらのペプチドはT細胞にのみ結合しアレルギー誘発性(IgE)抗体には結合しないように設計されるので、このアプローチを用いても治療に対するアレルギー反応は誘導されないと思われていた。残念ながら、これらのペプチド療法の実験は期待外れな結果となり、治療に対してアレルギー反応がしばしば観察される。これらのペプチド療法の開発は大部分が中断されていた。
自己免疫疾患
アメリカ人口の20%もの人が、あるタイプの自己免疫疾患を持っていると推定されている。自己免疫疾患は、女性において圧倒的に多く、自己免疫疾患を患う患者の75%もの人が女性であると見積もられている。自己免疫疾患の幾つかの形態は独特で珍しいものであるが、慢性関節リウマチや自己免疫性甲状腺炎等の幾つかの疾患は、自己免疫疾患人口の中で大きな罹患率を占めている(Rose及びMacKay (編), The Autoimmune Diseases, 第3版, Academic Press [1998])。
自己免疫疾患は身体の機能不全から生じて、自己反応性(self-reactive)T細胞及びB細胞を免疫レパートリーから排除し、被験者自身の生理機能にもともと備わった分子に対する免疫応答を特定及び誘導することができるB細胞産物(即ち自己反応性抗体)及びT細胞を循環させてしまう。特定の自己免疫疾患は一般に器官特異的(即ち細胞型特異的)又は全身性(即ち器官非特異的)として分類することができるが、幾つかの疾患はこの連続体の両端の様相を示す。器官特異的疾患としては、例えば橋本甲状腺炎(甲状腺)及びインスリン依存性糖尿病(膵臓)等が挙げられる。全身性疾患の例としては、慢性関節リウマチ及び全身性紅斑性狼瘡が挙げられる。自己免疫応答は潜在的に体内のあらゆる器官又は組織に対して生じ得るので、自己免疫疾患は多数の徴候及び症状を示す。さらに、自己免疫性脈管炎等のように血管が自己免疫攻撃の標的である場合、全ての器官が関与する可能性がある。自己免疫疾患は、軽度のものから生命を脅かすようなもの、急性のものから慢性のもの、及び再発性のものまで、広い範囲で様々な重症度を示す(Rose及びMacKay (編), The Autoimmune Diseases, 第3版, Academic Press [1998];ならびにDavidson及びDiamond, N. Engl. J. Med., 345(5):340-350 [2001])。
幾つかの自己免疫疾患において自己反応性抗原(即ち自己抗原)の幾つかの分子的な正体は公知であるが、全ての自己免疫疾患においてこれらの正体が分かっている訳ではない。ある自己免疫疾患を患う患者が複数のタイプの自己反応性抗体を持っている可能性があり、またその逆に、1つのタイプの自己反応性抗体が時々複数の自己免疫疾患状態において観察される、というこれらの疾患の不規則な性質によって、自己免疫疾患の診断及び研究は複雑である(Mocciら, Curr. Opin. Immunol., 12:725-730 [2000];ならびにDavidson及びDiamond, N. Engl. J. Med., 345(5):340-350 [2001])。さらに、自己反応性抗体又はT細胞が個体において存在していても、その個体は疾患又は他の病理を全く示さない場合がある。このように、多くの自己抗原の分子的な正体が分かっていても、これらの自己抗原の正確な病原的役割はほとんどはっきりしないままである(ただし、例えば重症筋無力症(myesthenia gravis)、自己免疫性甲状腺疾患、多発性硬化症、及び真性糖尿病等の顕著な例外がある)。
自己免疫疾患の治療法は存在するが、各方法はその方法特有の特定の欠点を有する。自己免疫疾患のための既存の治療法は、概ね2つのグループに分けることができる。第一の(そして最も重要な)グループは、生理学的な欠陥を補うための治療法であり、典型的には、その患者の体内に存在しないホルモン又は他の産物を補給する(replacement)ことによるものである。例えば、自己免疫性糖尿病はインスリンの投与によって治療することができるが、自己免疫性甲状腺疾患は甲状腺ホルモンを与えることによって治療する。他の疾患の治療法は、様々な血液成分(例えば免疫性血小板減少症の場合は血小板)の補給を行うもの、又は免疫に基づく貧血症においては赤血球の産生を刺激するための薬物(例えばエリスロポエチン等)の使用を伴うものである。例えばループス腎炎及び慢性関節リウマチ等の幾つかのケースでは、組織移植片又は機械的代用品が可能性のある治療オプションを提供する。残念なことに、これらのタイプの治療法は疾患の症状を単に和らげるだけで、根本的な自己免疫病理及び様々な疾患関連併発症の発症を補正するものではなく、最適なものとは言えない。根本的な自己免疫活性はなお存在するので、患部組織、組織移植片、又は代替タンパク質(replacement protein)は、同じ免疫低下に陥りがちである。
自己免疫疾患の治療法の第2のカテゴリーは、炎症反応及び免疫応答の総括的な抑制をもたらすこれらの療法である。このアプローチは、疾患を引き起こす免疫応答を抑制しつつ感染と戦う身体能力を保持するというバランスが必要であるため、難しい。自己免疫疾患を治療するための従来の抗炎症療法で最も一般に使用されている薬物は、非ステロイド系抗炎症薬(例えばアスピリンやイブプロフェン等)である。残念なことに、これらの薬物は炎症及びそれに伴う痛みや他の症状を単に和らげるだけであって、その疾患の進行を修正するものではない。シクロスポリンA、アザチオプリン、シクロホスファミド、及びメトトレキセート等の広域作用型の免疫抑制薬は、症状を治療するため、及び首尾よくいけば自己免疫プロセスの過程を改善するために、一般に使用される。自己免疫組織の損傷の制御においてはある程度成功しているものの、これらの広域作用型の強力な薬物はしばしば、新生物の発生、骨髄及び他の急速に分割する細胞や組織の破壊、ならびに肝臓や腎臓の損傷の危険性等の深刻な副作用を有する。さらにこれらの薬物は患者の免疫系を抑制するという望ましくない結果を有し、これは、深刻な感染性併発症の危険性を持つ。これらの理由のため、免疫系の総括的な抑制は、皮膚筋炎及び全身性紅斑性狼瘡(SLE)等の重度の自己免疫疾患の治療のために、又は心臓等の重要な器官が関与する場合のためにたいていとっておかれる。
より好ましくは、成功した自己免疫疾患の免疫抑制療法は、脱感作を誘導するためのアレルゲン免疫寛容療法について提案されたものと似たように、自己抗原特異的に免疫系を抑制する(即ち抗原限定的寛容, antigen-restricted tolerance)(Harrison及びHafler, Curr. Opin. Immunol., 12:704-711 [2000]; Weiner, Annu. Rev. Med., 48:341-351 [1997];ならびにMocciら, Curr. Opin. Immunol., 12:725-730 [2000])。このアプローチの改良された方法は、経口及び非経口投与プロトコールを用いて、免疫優性エピトープを含む自己抗原(即ち自己抗原性ペプチド)のさらに小さな部分を使用した。アレルギーペプチド療法と同様に、自己抗原ペプチドの投与には、アレルギー/過敏性反応及び死に至る可能性のあるアナフィラキシー反応の大きな危険性が伴うことが現在認められている。これらの危険性により、一回の投与で投与することができるペプチドの量も制限される。これら及び他の理由のため、ヒトの自己免疫疾患の治療のためのペプチド免疫寛容療法は問題が多く、多くのものは、幅広い適用性がみつからなかった。アレルギー反応の危険性を克服することができない限り、これらの寛容療法はほとんど役にたたないままである。
自己免疫性I型糖尿病は、インスリン又はインスリンを産生するこれらの細胞(即ち膵島β細胞等)の免疫認識から生じるインスリン依存型糖尿病のある種の形態であり、β細胞の免疫介在性破壊及びインスリンの産生又は活性の低下をもたらすものである。この疾患は、複数の病因(それら全ての病因がインスリン欠乏をもたらす)により始まると考えられる。自己免疫性糖尿病の公知の自己抗原標的には、インスリン及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)が含まれる(Chaillousら, Diabetologia 37(5):491-499 [1994]; Naquetら, J. Immunol., 140(8):2569-2578 [1988]; Yoonら, Science 284(5417):1183-1187 [1999]; Nepomら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(4):1763-1768 [2001]))。インスリン及びGAD以外にも、更なるβ細胞自己抗原が存在するという理論がたてられている(Nepom, Curr. Opin. Immunol., 7(6):825-830 [1995])。
非経口経路又は経口経路により投与される糖尿病自己抗原(インスリン及びGADを含む)を取り入れた寛容療法が、実験モデル及びヒト被験者において試された。しかし、ヒト試験の大半は、期待外れのものであった。さらに、ヒトにおける自己免疫性糖尿病を治療するためのペプチド療法の広範な適用は、幾つかのケースにおいてペプチド投与が疾患の進行を実際には加速する場合があるという観察結果によって阻まれていた(Pozzilliら, Diabetologia 43:1000-1004 [2000]; Gale, Lancet 356(9229):526-527 [2000]; Chaillousら, Lancet 356:545-549 [2000]; Blanasら, Science 274:1707-1709 [1996]; McFarland, Science 274(5295):2037 [1996];ならびにBellmannら, Diabetologia 41:844-847 [1998])。
慢性関節リウマチ(RA)は、自己免疫疾患人口のかなりの割合に影響を及ぼす他の重度の自己免疫疾患である。RAは、主に関節を裏打ちする滑膜の慢性炎症を特徴とする全身性疾患であるが、この疾患は肺などの多数の他の組織に影響を及ぼし得る。この関節の炎症は、慢性的な痛み、機能低下、そして最終的には関節の破壊につながる。滑液中のT細胞の存在及び他の一連の証拠は、自己免疫疾患の原因を示している。II型コラーゲン、ヒト軟骨タンパク質gp39及びgp130-RAPSを含むこの疾患の沢山の自己抗原候補が、仮同定されている。RAのための既存の治療養生法としては、抗炎症薬(ステロイド系及び非ステロイド系の両方)、細胞傷害性治療薬(例えばシクロスポリンA、メトトレキセート及びレフルノミド(leflunomide)等)、及び生物学的免疫モジュレーター(例えばインターロイキン-1及び-2受容体アンタゴニスト、抗腫瘍壊死因子α(TNFα)モノクローナル抗体、ならびにTNFα受容体IgG1融合タンパク質等、しばしばメトトレキセートと協働的に作用する)が挙げられる(Davidson及びDiamond, N. Engl. J. Med., 345(5):340-350 [2001])。しかし、これらの生物学的修飾因子による療法(biological modifier therapy)は、様々な理由、特にこれらの特定の有効性及び毒性(例えば沢山のサイトカイン(例えばIL-2等)の投与に伴って見られる全身性サイトカイン放出症候群等)、又は最近認められた抗TNFα治療に伴う感染の危険性の上昇などのために、最適なものとは言えない。
この疾患の患者から単離したT細胞の中で、疾患を持たない被験者に比べて幾つかのT細胞受容体(TCR)βサブユニット可変ドメイン(Vβ)が優先的に利用されるようである、という観察結果が得られた。これらの優先的に利用されるTCR Vβドメインに対応するペプチドは、ワクチン接種により疾患特異的抗-TCR抗体が得られるペプチドワクチン接種療法で使用することができ、そして上手くいけばその疾患を軽減することができる、と提案されている(Bridges及びMoreland, Rheum. Dis. Clin. North Am., 24(3):641-650 [1998];ならびにGoldら, Crit. Rev. Immunol., 17(5-6):507-510 [1997])。この療法は、現在開発中であるが(Morelandら, J. Rheumatol., 23(8):1353-1362 [1996];及びMorelandら, Arthritis Rheum., 41(11):1919-1929 [1998])、実験動物で観察されたものとは対照的に、ヒトにおけるTCRの使用では一貫性に欠けるため、問題が多いことが判明した。
慢性関節リウマチ及び他の自己免疫疾患のための抗体ベース療法に代わるものとして提案されているのが、自己反応性ペプチドに共有結合させた主要組織適合性複合体クラスIIタンパク質(MHC II)を取り入れた療法である(Sharmaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:11465-11469 [1991];及びSpackら, Autoimmunity 8:787-807 [1995])。MHCをベースとした療法のあるバリエーションは、二量体MHC/抗原融合ポリペプチドを産生するために共有結合させたFcγドメインを取り入れたものである(Casaresら, Protein Eng., 10(11):1295-1301 [1997];及びCasaresら, J. Exp. Med., 190(4):543-553 [1999])。しかし、MHC II融合タンパク質に関係した人為的抗原提示に基づくこれらのアプローチは、ヒトMHC遺伝子座が複対立遺伝子的である(すなわち多くのハプロタイプ変形が存在する)ため、ヒト系において広く適用できるわけではなさそうである。
自己免疫疾患人口のかなりの割合に影響を及ぼす他の自己免疫疾患は多発性硬化症(MS)であり、合衆国だけでおよそ250,000人を悩ませている。MSは主に成人において現れ、何十年もかけて予測不可能に変化し、そして再発、進行、もしくは自然寛解する広範な種類の神経関連症状を示す。現在のところ、MSによって引き起こされる原発性経性能力障害(primary neurologic disability)の進行を食い止めることができる療法は存在しない。現在の療法はグルココルチコステロイドの使用を好むが、残念ながらコルチコステロイド療法は、この疾患の長期的行程を変更するとも考えられない。さらに、コルチコステロイドは、感染症、骨粗鬆症、胃出血、白内障及び高血圧症の危険性の増加を含む多くの副作用を有する。進行性MSにおいて免疫抑制薬が時々試されているが、決定的な結果は得られていない。免疫応答をダウンレギュレートしこの疾患の進行を制御する試みにおいて、インターフェロンα及びβ1aやコポリマーI等の生物学的免疫モジュレーターも試されてきた。多発性硬化症患者の全体的な免疫機能を抑制するためのインターフェロン-βの投与は、ある程度の限られた成功を収めている(Rose及びMacKay (編), The Autoimmune Diseases, 第3版, Academic Press, p.572-578 [1998]; Davidson及びDiamond, N. Engl. J. Med., 345(5):340-350 [2001])。しかし、これらの生物学的修飾因子は、限られた効果及び発熱やインフルエンザ様反応の全身性副作用という欠点を有する。
MSの多様な神経関連症状は、中枢神経系(CNS)の中のニューロンを囲む髄鞘の変性ならびに髄鞘に付着しこれを支えている細胞(即ちオリゴデンドロサイト)の喪失(その下にある軸索に確実にダメージを与える)の結果、起こるものである。MS患者から単離したT細胞は、増殖して炎症促進性サイトカインを分泌することにより、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)に反応する。このことは、内因性MBPが、この疾患の患者において認識される自己抗原の少なくとも1種であることを示している。MBPタンパク質上の免疫優性エピトープは、MBP83-99領域の中にあることが分かった。多くの自己免疫疾患の場合と同様に、多発性硬化症患者における原因物質として少なくとも1種の他の自己抗体の関与が指摘されている。この自己抗体は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)に特異的であり、優性なエピトープはMOG92-106にあるようである。
MBPエピトープを用いてMSを治療するペプチド免疫療法が、動物及びヒトにおいて試されている(例えばWeinerら, Science 259(5099):1321-1324 [1993]; Warrenら, Jour. Neuro. Sci., 152:31-38 [1997]; Goodkinら, Neurology 54:1414-1420 [2000]; Kapposら, Nat. Med., 6(10):1176-1182 [2000]; Bielekovaら, Nat. Med., 6(10):1167-1175 [2000];ならびにSteinman及びConlon, Jour. Clin. Immunol., 21(2):93-98 [2001])。残念なことに、ヒト被験者を用いたこれらの研究は、期待外れの結果となり、大きな毒性及び過敏性反応が報告された。さらに、多発性硬化症自己抗原免疫療法は、あるケースでは、この疾患を実際に悪化させ得る(McFarland, Science 274(5295):2037 [1996];及びGenainら, Science 274:2054-2057 [1996])。
必要とされているのは、不適切もしくは不要な免疫応答から生じる免疫疾患の治療のための改良された及び/又は新規の治療戦略である。必要なのは、多くの自己免疫疾患に広く適用可能であり、広域免疫抑制薬の毒性作用を持たず、そして自己抗原限定的に作用することによって患者の免疫機能を保つ、自己免疫疾患の治療方法である。したがって、過敏症反応(特にアナフィラキシー反応)の危険性の低いペプチド寛容免疫療法のための改良された方法が必要である。同様に、過敏症反応を誘導する危険性のない、伝統的なペプチド寛容治療薬のより高い投薬量を可能とする組成物及び方法が必要である。
好適な実施形態の詳細な説明
I.定義
特に断らない限り、本明細書中で使用される科学技術用語は、この発明が属する技術において通常の知識を有する者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。当業者であれば、本発明の実施において使用することができるであろう、本明細書中に記載されるものと似た又は同等な多くの方法及び物品を思いつくであろう。実際には、本発明は、記載される方法及び物品に限定されない。本発明の目的のために、用語を以下に定義する。
本明細書中の融合分子に含まれる第1及び第2のポリペプチド配列に関する「機能し得る形で結合した」という用語は、このような第1及び第2のポリペプチド配列がそれぞれの受容体に結合する能力を保持していることを示すために用いられる。したがって、第2のポリペプチド配列に結合した後、第1のポリペプチド配列は、低親和性FcγRIIb受容体等の天然IgG阻害性受容体に特異的に結合する能力を保っている。同様に、第1ポリペプチド配列に結合した後、第2ポリペプチド配列は、天然ヒトFcεRI等の天然高親和性IgE受容体やFcεRII等の天然低親和性IgE受容体等の天然IgE受容体に直接又は第3のポリペプチド配列を介して間接的に特異的に結合する能力を保っている。その結果、互いに機能し得る形で結合した第1及び第2のポリペプチド配列を含む融合分子は、それぞれの天然受容体(例えばFcγRIIb及びFcεRI又はFcεRII等)を架橋することができる。本発明の融合分子の中で2つの結合性配列の間の機能し得る形での結合を達成するためには、これらの配列が、天然免疫グロブリン重鎖又はその受容体に結合する他の天然ポリペプチドの結合親和性と同様の結合親和性で対応する受容体に結合する能力を保っていることが好ましい。
結合する標的(例えばIgG又はIgE受容体)に対するある分子の結合親和性が他のどの公知の天然ポリペプチドへのその分子の結合親和性に比べてかなり高い(好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも約4倍、最も好ましくは少なくとも約6倍高い)場合、その結合は「特異的」である。
「阻害性受容体」という用語は最も広い意味で用いられ、ダウンレギュレーションが発生するメカニズムの如何に関わらず、他の受容体が介在する生物学的反応をダウンレギュレートすることができる受容体を指す。
「免疫受容体チロシン・ベース阻害性モチーフ(ITIM)を含む受容体」及び「ITIM含有受容体」という用語は、1以上の免疫受容体チロシン・ベース阻害性モチーフ(ITIM)を含む受容体を指すために用いられる。ITIMモチーフは、一般式Val/Ile-Xaa-PTyr-Xaa-Xaa-Leu/Val (式中Xaaは任意のアミノ酸を表す)で一般に表すことができる。TIMI含有受容体としては、FcγRIIb、gp49b1/gp91(Armら, J. Biol. Chem. 266:15966-73 (1991))、p91/PIR-B(Hayamiら, J. Biol. Chem. 272:7320-7 (1997))、LIR1-3、5、8、LAIR-1;CD22 (van Rossenbergら, J. Biol. Chem., 276(16):12967-12973 [2001]);CTL-4、CD5、p58/70/140 KIR、PIRB2-5; NKB1、Ly49 A/C/E/F/G、NKG2-A/B、APC-R、CD66、CD72、PD-1、SHPS-1、SIRP-α1、IL T1-5、MIR7、10、hMIR(HM18)、hMIR(HM9)、Fas(CD95)、TGFβ-R、TNF-R1、IFN-γ-R(α鎖及びβ鎖)、肥満細胞機能Ag(mast cell function Ag)、H2-M、HLA-DM、CD1、CD1-d、CD46、c-cbl、Pyk2/FADK2、P130 Ca rel prot, PGDF-R、LIF、LIR-R、CIS、SOCS13及び3(Sinclair NRら(前掲)に概説)が挙げられるがこれらに限定されない。これらの受容体の多くのリガンドも公知である。例えば、CD95のリガンドはCD95リガンドと呼ばれ、CTLA-4のリガンドはCD80及びCD86であり、IFN-γ受容体のリガンドはIFN-γである等。CD22のリガンドは、塩基性(basic)結合モチーフNau5Ac-a(2,6)-Lacを含み、例えばvan Rossenbergら, 2001(前掲)に記載されている。
「IgG阻害性受容体」という用語は、現在公知である又は今後発見される、FcεRI等の高親和性IgE受容体もしくは低親和性IgE受容体を介して作用するIgE又はFcεRに対する自己抗体等の他のメカニズムのどちらが介在するかにかかわらず、FcεR介在性反応を弱めることができる阻害性受容体スーパーファミリー(IRS)のメンバーを定義するために使用される。この反応は好ましくは、I型(即時型過敏症)反応等のIgE介在性アレルギー反応であるが、慢性特発性じんま疹の症例の約半数において報告されている抗FcεRIα鎖抗体による自己免疫応答も含み得る。
「天然の」又は「天然配列」という用語は、天然で生じるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。本発明に従って、ポリペプチドは、その起源、調製方法又は精製状態にかかわらず「天然」であると考えることができる。よって、このような天然配列ポリペプチドは、自然界から単離したものであっても、組換え及び/又は合成手段によって生成したものであってもよい。「天然の」及び「天然配列」という用語は、特に、ポリペプチドの、天然に生じるトランケートされた又は分泌された形態(例えば細胞外ドメイン配列)、天然に生じる変異形態(例えば選択的にスプライシングされた形態)及び天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
「天然FcγRIIb」、「天然配列FcγRIIb」、「天然低親和性IgG阻害性受容体FcγRIIb」及び「天然配列低親和性IgG阻害性受容体FcγRIIb」という用語は交換可能に使用され、天然に生じるようなあらゆる哺乳動物種を含む任意の種のFcγRIIb受容体を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。FcγRIIbは、免疫受容体チロシン・ベース阻害モチーフ(ITIM)を含む低親和性IgG受容体FcγRIIのアイソフォームである。この受容体は、ヒト末梢血好塩基球及び臍帯血由来肥満細胞中の主なFcγRII種である。更なる詳細については、例えばMalbec及びFridman, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 244:13-27 (1999); Cambier, J.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5993-5995 (1997);ならびにOtt及びCambier, J. Allergy Clin. Immunol. 106(3):429-440 (2000)を参照されたい。FcγRIIbは、選択的にスプライシングされた3つの形態(FcγRIIb1、FcγRIIb1’、及びFcγRIIb2と呼ばれる)を有し、これらはその細胞質ドメイン配列のみが異なる。これら3つの選択的にスプライシングされたアイソフォームは、2つの細胞外Ig様ループとその細胞質内テイルの中に1つの保存されたITIMモチーフとを含み、将来同定される可能性のある他のスプライス変異体と一緒にFcγRIIbの定義の中に明確に含まれる。
「天然FcεRI」、「天然配列FcεRI」、「天然高親和性IgE受容体FcεRI」及び「天然配列高親和性IgE受容体FcεRI」という用語は交換可能に使用され、天然に生じるあらゆる哺乳動物種を含む任意の種のFcεRI受容体を指す。FcεRIは、内因性の酵素活性を持たないが細胞質チロシンキナーゼとの会合を通じて細胞内シグナルを変換する細胞表面受容体のマルチサブユニット免疫応答受容体(MIRR)ファミリーのメンバーである。更なる詳細については、例えばKinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 17:931-972 (1999)ならびにOtt及びCambier, J. Allergy Clin. Immunol., 106:429-440 (2000)を参照されたい。
「天然FcεRII(CD23)」、「天然配列FcεRII(CD23)」、「天然低親和性IgE受容体FcεRI(CD23)」及び「天然配列低親和性IgE受容体FcεRII(CD23)」という用語は交換可能に使用され、天然に生じるあらゆる哺乳動物種を含む任意の種のFcεRII(CD23)受容体を指す。幾つかのグループが、様々な種の低親和性IgE受容体のクローニング及び発現を行っている。ヒト低親和性IgE受容体のクローニング及び発現は、例えばKikutaniら, Cell 47:657-665 (1986)、及びLudinら, EMBO J. 6:109-114 (1987)により報告されている。対応するマウス受容体のクローニング及び発現は、例えばGollnickら, J. Immunol. 144:1974-82 (1990)、及びKondoら, Int. Arch. Allergy Immunol. 105:38-48 (1994)により開示されている。ウシ及びウマのCD23の分子クローニング及び配列決定が近年Watsonら, Vet. Immunol. Immunopathol. 73:323-9 (2000)により報告された。また、低親和性IgE受容体の初期の概説については、Delespesseら, Immunol. Rev. 125:77-97 (1992)も参照されたい。
「哺乳動物」又は「哺乳動物種」という用語は、ヒト、家畜家禽、動物園の動物、競技用動物又はペット動物(例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等)、ならびにげっ歯類(例えばマウス及びラット等)を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本明細書中で使用される「被験者」又は「患者」という用語は交換可能に使用され、調査、治療、分析、検査又は診断の被験者となる任意の動物、好ましくは哺乳動物を指す。1つの実施形態において、ヒトは好適な被験者である。被験者もしくは患者は、疾患又は他の病理状態を持つものであっても持たないものであってもよい。
本明細書中で使用される単数形又は複数形の「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は全て、共有ペプチド結合によって互いに直鎖状に結合された複数のアミノ酸からなる一次配列を指す。一般に、ペプチドは少数のアミノ酸残基から構成され(典型的には2〜約50アミノ酸長)、タンパク質よりも短い。当分野で使用される「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」及び「オリゴマー」と交換可能に使用することができる。「ポリペプチド」という用語は、ペプチド及びタンパク質を包含する。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、天然起源に由来するものであっても、組換え又は合成されたものであってもよい。本明細書中で定義されるポリペプチドは、20種の天然アミノ酸以外のアミノ酸を含んでいても良く、また修飾アミノ酸を含んでいても良い。修飾はポリペプチド分子の中のどの場所でもよく(例えば末端アミノ酸等)、また自然な過程によるもの(例えばプロセッシング及び他の翻訳後修飾等)であっても、当分野において周知である化学的及び/又は酵素的な修飾技法により生じたものであってもよい。公知の修飾法としては、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール(phosphotidylinositol)の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩(pyroglutamate)の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、糖鎖結合、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移RNAが介在するタンパク質へのアミノ酸付加(例えばアルギニル化等)、及びユビキチン化が挙げられるが、これらに限定されない。このような修飾は当業者に周知であり、例えばCreighton, T. E., Proteins--Structure And Molecular Properties, 第2版, W. H. Freeman and Company, New York (1993); Wold, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects," in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, Johnson, B. C.編, Academic Press, New York (1983), pp. 1-12; Seifterら, "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors," Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990)、及びRattanら, Ann. N.Y Acad. Sci. 663:48-62 (1992)等の科学文献に非常に詳しく説明されている。
修飾は、ポリペプチドの中の、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、アミノ末端及びカルボキシル末端を含むいずれの場所でも発生し得る。実際には、共有結合修飾によるポリペプチドの中のアミノ基もしくはカルボキシル基の一方又は両方の封鎖(blockage)は、天然ポリペプチド及び合成ポリペプチドにおいて一般的であり、このような修飾が本発明のポリペプチドの中に存在していてもよい。例えば、大腸菌の中で作製されたタンパク質分解プロセッシング前のポリペプチドのアミノ末端残基はほぼ常に、N-ホルミルメチオニンである。従って、糖鎖結合させたい場合、ポリペプチドは、糖鎖結合を行う宿主(一般には真核宿主細胞)の中で発現される。昆虫細胞はしばしば哺乳動物細胞と同じ翻訳後糖鎖結合を行い、この理由により、天然の糖鎖結合パターンを有する哺乳動物タンパク質を効率良く発現するために、昆虫細胞発現系が開発された。
ポリペプチドは必ずしも直鎖状ではないことを理解されたい。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果分岐状でとなったものであってもよく、また分岐のあるもしくは分岐のない環状(一般には天然プロセッシング及び天然では起こらないヒトの操作によりもたらされる出来事を含む翻訳後の出来事の結果できたもの)であってもよい。環状、分岐状、及び分岐環状ポリペプチドは、翻訳以外の天然プロセスによって合成されたものであっても、完全な合成方法によって合成されたものであってもよい。このような構造は、本明細書中で定義されるポリペプチドの範囲内に含まれる。
アミノ酸は、当分野で一般に実施されるこれらの汎用1文字コード又は3文字コードで表される。したがって、20種の天然アミノ酸の表示は、以下の通りである:アラニン=Ala (A);アルギニン=Arg (R);アスパラギン酸=Asp (D);アスパラギン=Asn (N);システイン=Cys (C);グルタミン酸=Glu (E);グルタミン=Gln (Q);グリシン=Gly (G);ヒスチジン=His (H);イソロイシン=Ile (I);ロイシン=Leu (L);リシン=Lys (K);メチオニン=Met (M);フェニルアラニン=Phe (F);プロリン=Pro (P);セリン=Ser (S);トレオニン=Thr (T);トリプトファン=Trp (W);チロシン=Tyr (Y);バリン=Val (V)。本明細書中に記載されるポリペプチドは、全てのL-アミノ酸、全てのD-アミノ酸又はこれらの混合物を含み得る。D-アミノ酸で全て構成されるポリペプチドは、ヒトの体内で天然に見られるプロテアーゼに対して耐性があると思われ、より長い半減期を有し得るという点で、有利である。
「アミノ酸配列変異体」という用語は、基準(例えば天然配列)ポリペプチドと比べてそのアミノ酸配列が若干異なる分子を指す。アミノ酸の変更は、天然アミノ酸配列の中の置換、挿入、欠失、又はこのような変化の任意の所望の組合せであってもよい。
置換変異体は、天然配列の中の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され同じ位置のその場所に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は単一置換(つまりその分子の中のたった1つのアミノ酸が置換されたもの)であってもよいし、また多重置換(つまり同じ分子の中の2個以上のアミノ酸が置換されたもの)であってもよい。
挿入変異体は、天然アミノ酸配列の中の特定の位置のアミノ酸のすぐ隣に1つ以上のアミノ酸が挿入されたものである。あるアミノ酸のすぐ隣とは、そのアミノ酸のα-カルボキシ官能基又はα-アミノ官能基のいずれかに接続されていることを意味する。
欠失変異体は、天然アミノ酸配列の中の1つ以上のアミノ酸が取り除かれたものである。通常、欠失変異体は、その分子の特定の領域の中の少なくとも1つのアミノ酸が欠失されたものである。
「配列同一性」という用語は、配列を整列させ及び必要であれば最大配列同一性%を達成するためにギャップを導入した後の、基準ポリペプチド配列(例えば天然ポリペプチド配列)の中のアミノ酸残基と同じ候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、あらゆる「保存的置換」は配列同一性の一部として考慮しない。ここで保存的アミノ酸置換とは、1つのアミノ酸が同様の化学的特性を有する異なるアミノ酸に置き換わることである。配列同一性の%値は、Altschulら, (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res., 25:3389-3402により定義されたようにNCBI BLAST2.0により作製される。パラメータはデフォルト値に設定される。ただし、ミスマッチのペナルティは例外で、-1に設定される。
本明細書中で使用される「配列類似性」という用語は、上記のようなアミノ酸配列同一性の測度であり、そしてさらに保存的アミノ酸置換も含む。
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件は配列依存的であり、環境パラメータ(例えば塩濃度及び有機物の存在等)が異なれば異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、決められたイオン強度及びpHでの特定の核酸配列の熱融点(Tm)よりも低い約5℃〜20℃に選択される。好ましくは、ストリンジェントな条件は、完全に相補的な核酸に結合する特定の核酸の熱融点より低い約5℃〜10℃である。Tmは、タグ核酸等の核酸の50%が完全にマッチしたプローブに(決められたイオン強度及びpH未満で)ハイブリダイズする温度である。
「ストリンジェントな」洗浄条件は通常、対応するプローブアレイへの各セットのタグのハイブリダイゼーションについて経験的に決定される。(典型的にはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で)まずアレイをハイブリダイズさせた後、異なる濃度の(連続的に濃度を低くした)塩もしくは異なる濃度の(連続的に濃度を高くした)洗浄剤を含むバッファーで、又は非特異的ハイブリダイゼーションに対する特異的ハイブリダイゼーションのS/N比が特異的ハイブリダイゼーションの検出が容易になる程高くなるまで温度を上げて、洗浄する。ストリンジェントな温度条件は通常、約30℃高い、より一般的には約37℃高い、時には約45℃高い温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、通常は約1000mM未満、一般的には約500mM、より一般的には約400mM未満、典型的には約300mM未満、好ましくは約200mM未満、より好ましくは約150mM未満である。しかし、パラメータの組合せは、どの単独パラメータの測定値よりも重要である(例えばWetmurら, J. Mol. Biol. 31:349-70 (1966), 及びWetmur, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 26(34):227-59 (1991)を参照されたい)。
本明細書中で使用される「相補体」、「相補性」、「相補的」という用語は、逆平行塩基対の法則に関係づけて一本鎖ポリヌクレオチドを説明するために使用される。例えば、配列5'-CTAGT-3'は、配列5'-ACTAG-3'に完全に相補的である。相補性は塩基のペアリングが100%未満である「部分的」なものであってもよく、また相補性は2つのポリヌクレオチドの間に完全な100%逆平行相補性があることを示す「完全な」もしくは「全体的な」ものであってもよい。当分野における慣習により、一本鎖核酸分子はその5'端を左側に及びその3'端を右側にして記載される。
「免疫グロブリン」(Ig)という用語は、血清のグロブリンタンパク質の免疫性供与部分及び他の糖タンパク質(天然には発生しないが同じ機能的特性を有するものであってもよい)を指すために用いられる。「免疫グロブリン」すなわち「Ig」という用語は、具体的には「抗体」(Ab)を含む。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体及び抗原特異性を持たない他の抗体様分子の両方を含む。天然免疫グロブリンは、形質細胞と名付けられた分化したB細胞によって分泌され、抗原特異性が同定されていない免疫グロブリンは、免疫系によって低レベルで恒常的に産生され、骨髄腫によってより高レベルで産生される。本明細書中で使用される「免疫グロブリン」、「Ig」及びそれらを文法的に変形させた用語は、抗体、及び抗原特異性が未知であるもしくは抗原結合性領域を持たないIg分子を含むものとして使用される。
本明細書中で使用される「特異的抗体」という用語は、指定された抗原に対する結合特異性を有する抗体を示すものである。全ての抗体は本来は少なくとも1つのエピトープに対して特異的であるが、「特異的抗体」という表現は、その抗体が特定の公知抗原に対して特異的に結合することを意味する。結合特異性は、重鎖及び軽鎖のIg可変ドメインのアミノ酸配列及びコンホメーション、ならびに認識されるエピトープのコンホメーションによって決まる。抗原性エピトープは典型的には(ただし絶対的ではない)小さなアミノ酸配列ドメインから構成される。例えば、抗-ミエリン塩基性タンパク質(MBP)抗体は、MBP抗原に対して、より具体的にはMBP83-99領域に対して特異的である。「特異的結合」及び「特異的に結合する」とは、抗原性エピトープ及び抗体の相補的構造の存在に依存する、抗体とその特異的抗原との間の相互作用を指す。
天然免疫グロブリンは通常、2つの同じ軽(L)鎖と2つの同じ重(H)鎖とからなる約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。また各重鎖及び軽鎖は、規則的に間隔を設けた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン(VH)を持ち、その後に幾つかの定常ドメインを持つ。各軽鎖は一端に可変ドメイン(VL)を持ち、反対側端部に定常ドメインを持つ。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第1定常ドメインとアラインメントされ、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインメントされる。特定のアミノ酸残基は軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の境界面を形成すると考えられる。
血清中に見られる主なIgアイソタイプ(クラス)及びそれに対応するIg重鎖(括弧内に示す)を以下に列挙する。
IgG(γ鎖):血清中の主なIgであって、抗原に反応して生じる主な抗体。4つの主なサブタイプがあり、そのうち幾つかは胎盤を通過する。
IgE(ε鎖):このIgは、肥満細胞及び好塩基球にしっかりと結合し、そしてさらに抗原に結合すると、ヒスタミン及び即時型過敏症の他の介在因子の放出を引き起こす。花粉症、喘息及びアナフィラキシーを含むアレルギー反応において主要な役割を担っており、寄生虫に対する防御的役割を果たすことができる。
IgA(α鎖):このIgは、唾液、涙、粘液及び初乳等の外分泌物中に存在する。
IgM(μ鎖):抗原に反応して最初に誘導されるIg。後から産生される抗体に比べて親和性が低く、5量体である。
IgD(δ鎖):このIgは臍帯血の中で比較的高濃度で見られ、抗原の早期細胞受容体(early cell receptor)として主に働き、主なリンパ球細胞表面分子である。
IgG、IgE、IgA、IgM及びIgDアイソタイプの抗体は、それらの重鎖の定常領域が異なる場合でも、同じ可変領域(即ち同じ抗原結合孔部分(cavity))を有し得る。免疫グロブリン(例えば抗体)の定常領域は、抗原への抗体の結合には直接関与しないが、抗体が介在する異なるエフェクター機能(例えば補体の活性化、又は好塩基球、肥満細胞、リンパ球、単球及び顆粒球上に発現される抗体Fc受容体の1つ以上への結合等)と相関関係を有する。
主な抗体アイソタイプ(クラス)の幾つかは、さらにサブクラスに分けられる。IgGは4つの公知のサブクラスIgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、及びIgG4(γ4)を有し、IgAは2つの公知のサブクラスIgA1(α1)及びIgA2(α2)を有する。
Ig分子の軽鎖はκ又はλ鎖である。
免疫グロブリン重鎖の定常領域はさらに球形の構造的に別個のドメイン(重鎖定常ドメインと呼ばれる)に分けられる。例えば、IgG1免疫グロブリン重鎖の定常領域は、3つの定常ドメインCH1、CH2及びCH3、ならびにCH1ドメインとCH2ドメインとの間にヒンジ領域を含む。IgE免疫グロブリン重鎖は、4つの定常ドメインCH1、CH2、CH3及びCH4を含み、ヒンジ領域を持たない。免疫グロブリン重鎖定常領域の配列を含む免疫グロブリン配列は当分野において周知であり、例えばKabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991)に開示されている。また、ヒトIgG1重鎖定常領域(γ1)の説明については、Ellisonら, Nucl. Acid Res. 10:4071-4079 (1982);及びTakahashiら, Cell 29:671-679 (1982)も参照されたい。またヒトIgG2定常領域(γ2)の説明については、Krawinkelら, EMBO J. 1:403-407 (1982); Ellisonら, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79:1984-1988 (1982);及びTakahashiら. (1982)(前掲)も参照されたい。また、ヒトIgG3重鎖定常領域(γ3)の説明については、Krawinkelら(1982)(前掲)、及びTakahashiら(1982)(前掲)も参照されたい。また、ヒトIg4重鎖定常領域(γ4)の説明については、Ellisonら, DNA 1:11-18 (1982)、Krawinkelら(1982)(前掲)、及びTakahashiら(1982)(前掲)も参照されたい。また、ヒトIgE重鎖定常領域(ε)の説明については、Maxら, Cell 29:691-699 (1982)も参照されたい。IgEアイソフォームは、Saxonら, J. Immunol. 147:4000 (1991);Pengら, J. Immunol. 148:129-136 (1992);Zhangら, J. Exp. Med. 176:233-243 (1992);及びHellman, Eur. J. Immunol. 23:159-167 (1992)に記載されている。
本明細書中で使用される「抗原」という用語は、抗体によって認識されるあらゆる作用物質を指し、「免疫原」という用語は、被験者の体内で免疫学的応答を引き出すことができるあらゆる物質を指す。「抗原」及び「免疫原」という用語はいずれもポリペプチドを包含するが、これに限定されない。全てではないが多くの場合、抗原も免疫原である。本明細書中で使用される「アレルゲン」という用語及びこれを文法的に変形させた用語は、IgE介在性反応(例えばアレルギー等)を誘導することができる抗原を指す。アレルゲンは、抗原として働いてIgE介在性アレルギー反応を刺激するほぼあらゆるものであってもよい。一般的なアレルゲンは、例えば食物、花粉、黴、ハウスダスト(ダニを含み得る)の中だけでなく、ハウスペットの鱗屑、及びミツバチやスズメバチ、蚊等の昆虫の毒の中にも見られる。
本明細書中で使用される「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、特定の抗体可変領域と接触してその抗原/抗体結合に特異性を付与する抗原の部分を指す。1つの抗原が2以上のエピトープを持つこともある。免疫優性エピトープは、抗原上にある、その抗原に対する抗体によって優先的に認識されるエピトープである。幾つかのケースでは、抗原がタンパク質である場合、エピトープは「マッピング」されることができ、「抗原性ペプチド」は、そのタンパク質の中のその抗体/抗原特異性の一因となるちょうどこれらのアミノ酸にほぼ対応して生成される。このような「抗原性ペプチド」は、ペプチド免疫療法において用途がある。
本明細書中で使用される「自己抗原(autoantigen及びself antigen)」という用語ならびにそれらと文法的に同等な用語は、個体の免疫系の細胞成分(T細胞受容体)又は体液成分(抗体)によって認識されるその個体の生理機能に内生する抗原を指す。自己抗原の存在ならびに(従って当然のことながら)自己抗体及び/又は自己反応性T細胞の存在は、絶対的ではないが大抵は疾患状態と関係がある。自己抗体は、疾患を持たない個体において検出されることができる。自己抗原は絶対ではないがたいていポリペプチドである。自己抗原の認識の基盤となるメカニズム、正常な自己認識の低下、又は自己免疫性を誘導するメカニズムの理解は、本発明を実施又は使用するために必要ではない。
本明細書中で使用される「自己抗体」という用語は、宿主生物により産生される、上記に定義した自己抗原に特異的に結合する抗体を指すものとする。自己抗体及び/又は自己反応性T細胞の存在は、本明細書中において「自己免疫性」と呼ばれる。被験者の体内にある自己抗体又は自己反応性T細胞の存在は、絶対的にではないがしばしば疾患と関係がある(即ち自己免疫疾患)。
「疾患」、「障害」及び「状態(condition)」という用語は、本明細書中では交換可能に用いられ、正常な身体機能の乱れ、又は任意のタイプの病状の現れを指す。正常な生理機能の乱れを引き起こす病因となる物質は、公知のものであっても未知のものであってもよい。さらに、2人の患者が同じ疾患を持つと診断されたとしても、これらの個体が示す具体的な症状が同じである場合もあるし、同じでない場合もある。
本明細書中で交換可能に使用される「自己免疫疾患」、「自己免疫状態」又は「自己免疫障害」という用語は、発現される自己免疫レパートリーの質的及び/又は量的欠陥によって示される免疫恒常性の変化に関係する、持続性の器官特異的なもしくは全身性の臨床的症状及び兆候のセットを指す。自己免疫疾患の病理は、自己免疫応答により誘導される構造的又は機能的なダメージの結果として現れる。自己免疫疾患は、自己抗原上のエピトープに対する体液性(例えば抗体介在型)、細胞性(例えば細胞傷害性Tリンパ球介在型)、又はこれら両タイプの免疫応答の組合せ、を特徴とする。罹患した個体の免疫系は、これらの特定の自己抗原を提示する細胞又は組織を狙った炎症性カスケードを活性化する。攻撃された抗原、組織、細胞型又は器官が破壊されると、その疾患の症状が生じる。全てではないが、幾つかの自己免疫疾患の自己抗原が公知である。
本明細書中で使用される「免疫療法」、「脱感作療法」、「除感作療法」及び「寛容療法」等の用語は、アレルゲン又は自己抗原の回避が不可能である又は実際的ではない様々な過敏症疾患の治療方法を言う。本明細書で使用されるこれらの用語は、大部分は交換可能に使用される。これらの方法は一般に、管理された方法で被験者へ抗原性物質を送達して、その抗原に環境的に曝露されると生じる免疫応答をダウンレギュレートする及び/又はその抗原に対する寛容を誘導するものである。これらの療法は、典型的には、次第に用量を増やしてより長期間(数ヶ月又は数年)かけて抗原(例えばアレルゲン又は自己抗原)を注入するものである。免疫療法で使用される抗原は、絶対的ではないが、典型的にはポリペプチドである。例えば、花粉症の脱感作療法は、被験者に花粉抽出物を注射して空中の花粉に対するアレルギー反応をダウンレギュレートするものである。臨床的な見地から、注射は典型的に苦痛を伴い且つ不便であるため、これらの治療は最適なものとは言えない。さらに、治療中に生命を脅かす可能性のあるアナフィラキシー反応が起こる高い危険性がある。自己抗原に対する寛容を誘導することにより内因性自己抗原又は自己抗原性組織の免疫破壊を無くそうとして自己抗原を被験者に投与するような、様々な自己免疫疾患の治療のための順応性のある免疫療法(adapting immunotherapy)の技法が提案されている。例えば、自己免疫性I型糖尿病及び多発性硬化症をダウンレギュレートするためにそれぞれ動物モデル及びヒトにインスリン及びミエリン塩基性タンパク質を送達していた。
本明細書中で使用される「ペプチド療法」及び「ペプチド免疫療法」等という用語は、被験者に送達される抗原(例えばアレルゲン又は自己抗原)が短いポリペプチド(即ちペプチド)であるような免疫療法の方法を言う。さらに、ペプチド療法中に送達されるペプチドは、好ましくは免疫優性エピトープを画定するこれらのアミノ酸(例えばミエリン塩基性タンパク質エピトープ(MBP83-99))のみを含むものであってもよい。
本明細書中で交換可能に使用される「ワクチン療法」、「ワクチン接種」及び「ワクチン接種療法」という用語は、一般に、免疫学的な予防をもたらすあらゆる方法を指す。1つの態様において、ワクチン療法は、特定の抗原に対して免疫応答を誘導することによってその抗原に対して長期的に作用する免疫性を誘導する。これらの方法は一般に、免疫原性物質を被験者に送達して免疫性を誘導するものである。この場合、免疫原性物質は一般に、毒性株の死菌微生物、生きた弱毒化株、又は毒性病原体の誘導体もしくは産物である。他の態様において、「ワクチン療法」とは、(例えばアレルギー反応を抑制するために)特定の抗原に対する潜在免疫能力をダウンレギュレートする方法を指す。またこのタイプのワクチン療法は「寛容療法」とも呼ばれる。ワクチン療法は典型的には長期間にわたる免疫原性物質の一連の非経口又は経口投与を伴う。
本明細書中で交換可能に使用される「フラグメント(断片)」、「部分」及び「一部」という用語は、それが由来する物質の組成全体よりも小さいその物質の任意の構成部分を指す。例えばポリペプチドの一部のサイズ範囲は、2アミノ酸残基長から(全アミノ酸配列)-(1アミノ酸)長である。しかし多くの場合、「一部」又は「フラグメント」はその意図する用途に必須な活性又は質を維持することが望ましい。例えば、抗原の有用な部分とは、エピトープ決定基を保有するこれらの部分である。また1つの実施形態において、免疫グロブリン重鎖定常領域の有用な部分とは、共有結合ホモダイマー構造を形成する能力を維持しており且つFcγ受容体に結合することができるこれらの部分である。
本明細書中で使用される「少なくとも一部」という用語は、物質の一部だけでなくその物質の組成全体も含むものとする。
本明細書中で使用される「I型アレルギー反応」、「即時型過敏症」、「アトピー性アレルギー」及び「I型過敏症」等の用語は、IgEが肥満細胞又は好塩基球上のその高親和性受容体(FcεRI)に結合することにより感作されたこれらの細胞に体内に入り込んだ抗原が出会ったときに生じる生理学的応答を指す。アレルゲンは、感作された肥満細胞又は好塩基球に達すると、表面に結合したIgEに架橋し、これにより細胞内カルシウム(Ca2+)が増加し、ヒスタミンやプロテアーゼ等の既製の介在物質及びロイコトリエンやプロスタグランジン等の新しく合成された脂質由来介在物質が放出される引金となる。これらのオータコイドは、アレルギーの臨床症状を生じる。さらに、脱顆粒している好塩基球及び肥満細胞からはIL-4やTNF-α等のサイトカインが放出され、IgE反応を伴う炎症反応を促進するのに貢献する(例えばImmunology, 第5版, Roittら編, 1998, pp. 302-317を参照されたい)。敏感なもしくはアレルギー体質の被験者における過敏症反応の具体的な発現は、アレルゲン曝露の部位、アレルゲン曝露の量、被験者の器官の反応性(例えば過剰反応する肺又は鼻等)、及びその被験者におけるアレルゲンに対する一斉の(the full panoply of)免疫応答に依存する。
I型過敏症反応に伴う症状及び徴候は、関与し得る組織及び器官が広範囲に及ぶため、極端にバラエティーに富んでいる。これらの症状及び徴候としては、皮膚、目及び喉のかゆみ、皮膚の腫れ及び発疹(血管性水腫及びじんま疹)、声帯エリアの腫れによる嗄声及び呼吸困難、身体の至るところに生じるデコボコな紅斑痕、唾液及び体液の産生量増加に加えて、(気道内の筋肉の締めつけ及び気道の詰まり即ち気管支収縮からくる)短呼吸及び喘鳴、気道筋肉の建設(construction)による胸部の締めつけ感及び痛み、低血圧による悪心、嘔吐下痢、眩暈及び失神、ならびに気道及び/又は心臓の弱体化(compromise)による速い又は不規則な心拍及び最悪の場合は死が挙げられるが、これらに限定されない。
アレルギー反応から生じて過敏症の症状及び/又は徴候を示す疾患状態の例としては、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性(外因性)喘息、場合によってはじんま疹及び血管性水腫、食物アレルギー、ならびに致命的となり得る全身性の汎発的な反応性及び血圧低下が起こるアナフィラキシーショックが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中で交換可能に使用される「アナフィラキシー」、「アナフィラキシー応答」、「アナフィラキシー反応」及び「アナフィラキシーショック」等の用語は、感作抗原を受けて前もって感作した被験者において生じる急性の(しばしば爆発性の)IgE介在性全身性生理反応を言う。アナフィラキシーは、事前感作に使用した抗原が循環に達した時に生じる。抗原が好塩基球及び肥満細胞上のIgEと反応するとき、ヒスタミン、ロイコトリエン、及び他の炎症介在物質が放出される。これらの介在物質は、アナフィラキシーの特徴である平滑筋の収縮(喘鳴及び胃腸症状の原因となる)及び血管拡張(低血圧の原因となる)を引き起こす。血管拡張及び組織中への血漿の逸脱はじんま疹及び血管性水腫を引き起こし、有効な血漿量の減少をもたらし、これがショックの主な原因となる。体液は肺気胞中へと逃げ、肺水腫を生じる可能性がある。上気道の閉塞性血管性水腫も生じ得る。反応が長引けば、不整脈及び心臓性ショックが発生する場合がある。「アナフィラキシー様反応」という用語は、アナフィラキシー反応の特徴を示す生理学的反応を指す。
アナフィラキシー反応の症状は患者によってかなり異なる。典型的には約1〜15分以内に(しかし稀に2時間も後に)起こり、症状としては、興奮及び潮紅、動悸、感覚異常、かゆみ、耳の拍動、咳、くしゃみ、じんま疹及び血管性水腫、血管拡張、ならびに喉頭水腫又は気管支痙攣による呼吸困難が挙げられる。ときには悪心、嘔吐、腹痛及び下痢も観察される。さらに1〜2分以内にショックが起こる場合があり、患者は痙攣を起こして失禁し、応答しなくなり、そして心停止、大量血管性水腫、血液量減少、重度の低血圧及び血管運動虚脱及び原発性心血管虚脱に臥す。アンタゴニストであるエピネフリンがすぐに手に入らなければ、こので時点で死は免れないであろう。アナフィラキシー反応の軽度のものは、汎発性のかゆみ、じんま疹、血管性水腫、軽度の喘鳴、悪心、及び嘔吐を含む様々な症状をもたらす。アナフィラキシーの危険性が最も高い患者は、特定の薬物又は抗原に対して以前反応を起こした患者である。
「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「構築物」及び「ポリヌクレオチド構築物」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。この発明のポリヌクレオチドベクターは、幾つかある形態(RNA、DNA、レトロウイルスコートの中にカプセル化されたRNA、アデノウイルスコードの中にカプセル化されたDNA、他のウイルスもしくはウイルス様形態(単純疱疹ウイルスやアデノ随伴ウイルス(AAV)等)の中にパッケージングされたDNA、リポソームの中にカプセル化されたDNA、DNAとポリリシンとの複合体、DNAと合成ポリカチオニック分子(polycationic molecule)との複合体、DNAとトランスフェリンとのコンジュゲート、ポリエチレングリコール(PEG)等の化合物とDNAとの複合体であって当該分子を免疫学的に「マスキング」及び/又は半減期を増長したもの、又は非ウイルスタンパク質とDNAとのコンジュゲートを含むがこれらに限定されない)のうちのいずれであってもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドはDNAである。本明細書中で使用される「DNA」とは、A、T、C及びG塩基だけでなく、これらの類似体又はこれらの塩基の修飾形態(メチル化ヌクレオチド、非荷電結合及びチオエート(thioate)等のヌクレオチド内修飾、糖類似体の使用、ならびにポリアミド等の修飾された及び/又は他の骨格構造(alternative backbone structure)等)のいずれかも含む。
「宿主細胞」とは、この発明のいずれかのベクターを受容し得る又は受容した個々の細胞又は細胞培養物を含む。宿主細胞は1つの宿主細胞の子孫を含み、この子孫は、天然の、偶発的な又は意図的な突然変異及び/又は変化があるため、(形態学的に又は全DNA相補体において)元の親細胞と完全に同一である必要はない。宿主細胞は、本発明の核酸を含むベクターをin vivoにおいて形質導入した又は感染させた細胞を含む。
「プロモーター」という用語は、目的のDNA配列に機能し得る形で結合したときにそのDNA配列の転写を促進するヌクレオチド配列を意味する。
核酸は、他の核酸配列と機能可能な関係に配置されたときに、「機能し得る形で結合した」という。例えば、前駆配列(presequence)又は分泌リーダーのDNAは、あるポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのDNAに機能し得る形で結合している、といい、プロモーター及びエンハンサーは、あるコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に機能し得る形で結合している、といい、また、リボソーム結合部位は、翻訳を促進する位置に配置された場合、コード配列に機能し得る形で結合している、という。一般に、「機能し得る形で結合している」とは、結合したDNA配列同士が隣接していることであり、分泌リーダーの場合は隣接し且つ読取り相(reading phase)にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は、都合の良い制限部位での連結によって行われる。このような部位が存在しない場合、従来の慣習に従って合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
「IgE介在性生物学的反応」という用語は、高親和性IgE受容体FcεRI及び低親和性IgE受容体FcεRIIを含むIgE受容体を介するシグナル伝達を特徴とする状態又は疾患を指すために使用される。この定義は、アナフィラキシー過敏症及びアトピー性アレルギーに関係する状態(例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、慢性じんま疹及び血管性水腫)、ならびにアナフィラキシーショックの生理学的重篤状態(通常はハチ刺され又はペニシリンなどの介在物質により引き起こされる)を含むがこれらに限定されない。
「治療する」又は「治療」という用語は、望ましくない生理学的変化又は異常を予防する又は減速させる(緩和する)ことを目的とする治療的処置及び予防もしくは防止方法の両方を指す。この発明の目的のために、有益又は望ましい臨床結果としては、症状の緩和、疾患の範囲の縮小、安定した(即ち悪化しない)疾患状態、疾患の進行の遅延もしくは減速、疾患状態の緩和もしくは一時的緩和、及び(部分的な又は全体的な)寛解(検出可能なものであっても検出不可能なものであってもよい)が挙げられるがこれらに限定されない。治療を必要とする者には、その状態又は異常に既に罹った者だけでなく、その状態もしくは異常に罹りやすい者や、その状態又は異常を予防しようとする者が含まれる。
「慢性的」投与とは、急性モードとは異なり、長期間かけて作用物質の所望の効果又はレベルを維持するための継続的モードでの作用物質の投与を指す。
「断続的な」投与とは、中断することなく連続的に行われるわけではなく、むしろ事実上周期的に行われる治療である。
1以上の更なる治療薬との「組み合わせた(in combination with)」投与とは、同時(共同)投与及び任意の順序での連続投与を含む。
「有効量」とは、有益なもしくは望ましい治療(予防を含む)結果を得るのに十分な量である。有効量は、1回以上の投薬で投与することができる。
本明細書中で使用される「担体」とは、使用される用量及び濃度においてそれに曝露されている細胞もしくは哺乳動物に対して毒性を持たない薬学上許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤を含む。生理学的に許容可能な担体はたいていの場合、pH緩衝水溶液である。生理学的に許容可能な担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等の緩衝液、アスコルビン酸等の酸化防止剤、低分子量(約10残基未満)のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン等のアミノ酸、グルコース、マンノースもしくはデキストリン等の単糖類、2糖類及び他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール、ナトリウム等の塩形成対イオン、ならびに/又はTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール(PEG)及びPLURONICS(商品名)等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。
「プロテアーゼ」、「ペプチダーゼ」又は「プロテイナーゼ」という用語及び本明細書中で交換可能に使用されている文法的に同等な用語は、共有ペプチド結合を切断することができる任意のポリペプチドを指す。これらのプロテアーゼ、ペプチダーゼ及びプロテイナーゼをまとめて「タンパク質分解酵素」と呼ぶことができる。多くのタンパク質分解酵素が公知であり、それらの切断特異性又はその欠如によって大まかに分類することができる。切断特異性は、標的ポリペプチド中のアミノ酸の一次配列及びこれらのアミノ酸の空間的なコンホメーションによって決定することができる。例えば、エキソペプチダーゼのタンパク質分解作用は、大きなポリペプチドからアミノ末端(N末端)アミノ酸又はカルボキシ末端(C末端)アミノ酸のいずれかを切断する。エンドペプチダーゼ酵素は、ポリペプチドの内部の(すなわちN末端又はC末端アミノ酸位置ではない)ペプチド結合を切断する。幾つかのタンパク質分解酵素は、大変ややこしい切断特異性を有し、切断にはより長い(extended)アミノ酸標的配列の認識が必要である。あるいは、幾つかのペプチダーゼは、切断部位認識のための必要要件がより緩く、タンパク質分解を標的とするために単一のアミノ酸の存在のみを必要とする。例えば、システイン、アスパラギン酸又はアルギニンファミリーのエンドプロテアーゼは、内部のシステイン、アスパラギン酸又はアスパラギンアミノ酸残基でそれぞれ切断する。幾つかのケースでは、システイン、アスパラギン酸又はアスパラギンエンドプロテアーゼは、切断を行うために、標的となるシステイン、アスパラギン酸又はアルギニン残基に隣接する又はそれらの近くにある他のアミノ酸の存在又は不在を必要とする。例えば、幾つかのアスパラギン酸ファミリーエンドペプチダーゼは、隣接するアミノ酸がプロリンである場合、アスパラギン酸ペプチド結合を切断することができない。このように、本明細書中で使用されるペプチダーゼ「切断部位」は、切断のためのたった1つの標的残基だけでなく、2以上のアミノ酸も包含する。
II.ある好適な実施形態の説明
1. 融合分子の設計
1つの実施形態において、本発明は、肥満細胞及び/又は好塩基球上に発現される阻害性受容体をIgE受容体と架橋させることによって、アナフィラキシー過敏症を伴う状態(アレルギー疾患又は自己免疫疾患の治療のためのペプチド療法により引き起こされるアナフィラキシー反応を含む)、及びアトピー性アレルギー等のFcεRが介在する生物学的応答を弱めることができる融合分子を提供する。融合分子の実際の配列は、例えば様々な形態のFcγRIIb、gp49ファミリーの阻害性メンバー(特にgp49b1、p91/PIR-B、LAIR-1、LIR-1又はCD22等)等のITIM含有受容体等の標的となる阻害性受容体によって、ならびに例えばFcεRI又はFcεRII等の標的とされるIgE受容体によって、異なる。
好適な実施形態において、阻害性受容体は天然低親和性FcγRIIb受容体であり、IgE受容体は天然高親和性もしくは低親和性IgE受容体(即ちFcεRIもしくはFcεRII、より好ましくはFcεRI)である。したがって、融合分子の中に存在する第1ポリペプチド配列は天然低親和性FcγRIIb受容体に結合し、第1ポリペプチドに機能し得る形で結合されている第2ポリペプチド配列は、天然FcεRI又はFcεRII(好ましくはFcεRI)に結合する。本発明の一本鎖融合分子の中に存在する第1及び第2のポリペプチド配列のそれぞれの受容体への結合を指令することによって天然FcγRIIb受容体を天然FcεRI受容体と架橋させることが目的である場合、この第1及び第2のポリペプチド配列(これらは機能し得る形で結合される)は、必ずしもというわけではないが、天然IgG及びIgEとそれぞれ本質的に同じ領域でそれぞれの受容体に結合するように設計されるのが好ましい。IgG FcドメインのCH2-CH3間の境界面は、FcγRIIb低親和性受容体を含む複数のFc受容体の結合部位を含むと報告されている(Winesら, J. Immunol. 164(10):5313-5318 (2000))。FcεRI結合の研究結果に基づいて、Prestaら, J. Biol. Chem. 269:26368-26373 (1994)は、ヒトIgE重鎖CH3ドメインの最も剥き出しとなっている側の外側***を形成すると計算により推定される3つのループ(C-D、E-F及びF-G)の中に位置する6個のアミノ酸残基(Arg-408、Ser-411、Lys-415、Glu-452、Arg-465、及びMet-469)が、主に静電的な相互作用によって高親和性受容体FcεRIへの結合に関与していると提案した。Helmら, J. Cell Biol. 271(13):7494-7500 (1996)は、IgE分子の中の高親和性受容体結合部位はIgE重鎖のCH3ドメインの中のPro343-Ser353ペプチド配列を含むが、受容体結合コンホメーションの維持のための構造的な足場材料を提供するためには、このコアペプチドのN-又はC-末端側にある配列も必要である、と報告している。特に彼らは、ε鎖のC末端領域の中のHisを含む複数の残基がIgEとFcεRIとの間の相互作用の高親和性の維持に重要な貢献を果たすことを見出した。本発明の融合分子の中の第1及び第2のポリペプチド配列は、好ましくはこのような結合領域の中の残基に結合するように設計される。
本発明の融合分子の他のクラスにおいて、第1ポリペプチド配列は、肥満細胞、好塩基球及び/又はB細胞上に発現されるFcγRIIb以外のITIM含有受容体に結合する。例えば、第1のポリペプチド配列は、gp49b1等のgp49ファミリー(免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、肥満細胞及び単核マクロファージ上に優先的に発現され、そしてその細胞質ドメインの中に2つのITIMモチーフを含む)の阻害性メンバーに特異的に結合することができる領域を含んでいてもよい。他のITIM含有阻害性受容体はp91(PIR-Bとも呼ばれる)であり、これは、B細胞及び骨髄性系列細胞上に発現されることが知られている。本発明の融合分子の標的となり得る更なるITIM含有受容体としては、NK細胞、T細胞及び単球に加えてB細胞上で発現されるLAIR-1、B細胞及び単球上で発現されるLIR-1、ならびにB細胞上で発現されるCD22が挙げられるが、これらに限定されない。ITIM含有受容体及び関連技術の概説については、例えばMustelinら, Front. Biosci. 3:d1060-1096 (1998)、及びSinclairら、1999(前掲)を参照されたい。
本発明の融合分子の第2クラスは、第1及び第2のポリペプチド配列を含み、第2ポリペプチド配列は、天然アレルゲン又は自己抗原アミノ酸配列の一部もしくは全体あるいはその変異体を含み、第2ポリペプチド配列とIgE受容体との間の結合は、特定のIgE分子を介して間接的に生じるものである。アレルゲンもしくは自己抗原に由来する配列は、肥満細胞もしくは好塩基球上の高親和性IgE受容体(FcεRI)に結合した特定のIgE分子及び/又はBリンパ球上の低親和性IgE受容体(FcεRII、CD23)に結合する。この第1の阻害性受容体結合性配列は、上記のように設計される。好適な実施形態において、該分子のアレルゲン又は自己抗原部分は、肥満細胞表面上のIgEに抗原が架橋するのを避けるために、単一のIgE結合部位(すなわち単一の免疫優性エピトープ)のみを含むフラグメントである。
好適な実施形態において、本発明の融合分子の中に存在する第1のポリペプチド配列は、天然IgG(例えばIgG1免疫グロブリン、好ましくは天然ヒトIgG1)のヒンジ部-CH2-CH3領域のアミノ酸配列と少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、より更に好ましくは少なくとも約95%、最も好ましくは少なくとも約99%の配列同一性を有する。特に好適な実施形態において、配列同一性は、配列番号3に記載のヒトのγヒンジ部-CHγ2-CHγ3配列を基準に定義される。
他の好適な実施形態において、本発明の融合分子の中に存在する第1のポリペプチド配列は、肥満細胞、好塩基球及び/又はB細胞上に発現されるgp49b1又はp91/PIR-B等の他のITIM含有受容体(IFN-α、IFN-γ及びIL-6により活性化される細胞質シグナル伝達タンパク質)又は肥満細胞機能Agの天然リガンドのアミノ酸配列と少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、より更に好ましくは少なくとも約95%、最も好ましくは少なくとも約99%の配列同一性を有する。
さらに他の好適な実施形態において、本発明の融合分子の中に存在する第1のポリペプチド配列は、c-Kitのアミノ酸配列と、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、より更に好ましくは少なくとも約95%、最も好ましくは少なくとも約99%の配列同一性を有する(例えばYardenら, EMBO J., 6:3341-3351 [1987]を参照されたい)。
1つの実施形態において、本発明の融合分子の中に存在する第2のポリペプチド配列は、天然IgE免疫グロブリン(好ましくは天然ヒトIgE)のCH2-CH3-CH4領域のアミノ酸配列と、又は天然アレルゲンもしくは自己抗原タンパク質の配列と、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%、より更に好ましくは少なくとも約95%、最も好ましくは少なくとも約99%の配列同一性を有する。特に好適な実施形態において、配列同一性は、配列番号6に記載のヒトCHε2-CHε3-CHε4配列を基準にして、又は以下の表1に列挙したアレルゲン配列のうちの1つに関して、あるいは1つの好適な実施形態において、2つのAra h2クローン(それぞれ配列番号10及び11により表される)のうちの1つに関して、定義される。
他の実施形態において、融合分子の第2のポリペプチドのアミノ酸配列は、自己抗原配列を基準に定義される。自己抗原配列の例を以下の表2に挙げる。表2に記載した自己抗原の一部も融合ポリペプチドで使用するのに適している。この一部とは、少なくとも1つの自己抗原エピトープを保有し、自己抗体又は自己反応性T細胞受容体に特異的に結合する能力を維持しているものである。例えば、多発性硬化症自己抗原ミエリン塩基性タンパク質の有用な部分(アミノ酸83〜99)、プロテオリピドタンパク質の有用な部分(アミノ酸139〜151)、及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の有用な部分(アミノ酸92〜106)が公知であり、これらの部分は少なくとも1つの自己抗原性エピトープを保有する。
有用な自己抗原配列は表2に記載されるこれらの配列に限定されるものではなく、例えば自己免疫血清プローブを用いて発現ライブラリーをスクリーニングするSEREX技法(組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定)等の更なる自己抗原の同定方法が当分野において公知である(Bachmannら, Cell 60:85-93 [1990];及びPietromonacoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1811-1815 [1990];Folgoriら, EMBO J., 13:2236-2243 [1994])。同様に、自己免疫病因を有する更なる疾患が将来同定されるであろうため、本発明の組成物及び方法を用いて治療することができる自己免疫疾患は、表2に記載された疾患に限定されないものとする。
本発明の幾つかの実施形態において、融合分子の中に存在する第1のポリペプチド配列は、ストリンジェントな条件下で天然γヒンジ部-CHγ2-CHγ3配列のコード配列、好ましくはγヒンジ部-CHγ2-CHγ3をコードする配列(配列番号1の中から由来する)の相補体、又はIgG結合に必要な他の免疫グロブリン重鎖定常領域配列のコード配列にハイブリダイズする核酸によってコードされる配列を含んでいてもよい。
第1ポリペプチド配列が肥満細胞、好塩基球又はB細胞上に発現されるITIM含有受容体に特異的に結合する場合、第1ポリペプチド配列は、ストリンジェントな条件下でその受容体の天然リガンドのコード配列の相補体にハイブリダイズする核酸によって好ましくはコードされる。
同様に、本発明の融合分子の中に存在する第2ポリペプチド配列は、ストリンジェントな条件下で天然CHε2-CHε3-CHε4配列のコード配列(好ましくは配列番号4の中から由来するCHε2-CHε3-CHε4コード配列)の相補体に、又は表1及び表2に記載されたもの等の天然アレルゲンもしくは自己抗原のコード配列の相補体にハイブリダイズする核酸によってコードされる配列を含むものであってもよい。
本発明の融合分子の中に含まれる第1及び/又は第2のポリペプチド配列が天然免疫グロブリン定常領域配列のアミノ酸変異体である場合はいつでも、天然IgG阻害性受容体(例えばFcγRIIb)等の対応する天然受容体及び天然高親和性IgE受容体(例えばFcεRI)又は天然低親和性IgE受容体(FcεRII、CD23)にそれぞれ結合する能力を保持する必要がある。上記のように、天然IgG及びIgE重鎖定常領域配列の中の受容体結合ドメインが同定された。この知識に基づいて、アミノ酸配列変異体は、受容体結合に必須な天然アミノ酸残基を保持するように、又はこのような残基の位置にアミノ酸の保存的変更(例えば置換)のみを行うように、設計されてもよい。
対応する天然配列の必要な結合特性を保持するアミノ酸配列変異体を作製するにあたり、アミノ酸の疎水親水指数(hydropathic index)を考慮してもよい。例えば、ある種のアミノ酸は、生物学的活性に大きな変化をもたらすことなく、同様の疎水親水指数もしくはスコアを有する他のアミノ酸に置換できることが知られている。このように、イソロイシン(+4.5の疎水親水指数を有する)は一般に、その置換が行われたポリペプチドの生物学的活性に大きなインパクトを与えることなく、バリン(+4.2)又は(3.8)ロイシンと置換可能である。同様に通常は、元になるポリペプチドの生物学的特性に大きな変化が予想されることなくリシン(-3.9)をアルギニン(-4.5)に置換可能である。
アミノ酸置換を選択する際に考慮される他の事項としては、側鎖置換基の類似性(例えば様々なアミノ酸のサイズ、求電子的特徴、電荷等)が挙げられる。一般に、アラニンとグリシンとセリン、アルギニンとリシン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとトレオニン、及びバリンとロイシンとイソロイシンは、生物学的特性に大きな変化が予想されることなく、交換可能である。このような置換は一般に保存的アミノ酸置換と呼ばれ、上記に記載のように、本発明のポリペプチドにおける好適なタイプの置換である。
あるいは又は更に、アミノ酸の変更は、本発明の融合分子の受容体結合特性を強化する働きがある。受容体結合性が改善された結果優れた生物学的特性を持つようになった変異体は、アラニン走査突然変異誘発(alanine-scanning mutagenesis)、PCR突然変異誘発もしくは他の突然変異誘発技法等の標準的な突然変異誘発技法を、以下に記載のもしくは実施例に記載のアッセイのような受容体結合アッセイと一緒に用いて、簡単に設計することができる。
好適な実施形態において、本発明の融合分子は、IgG1重鎖の定常領域の機能的に活性なヒンジ部、CH2及びCH3ドメイン(γヒンジ部-CHγ2-CHγ3配列)を含む第1のポリペプチド配列のC末端が、IgE重鎖の定常領域の機能的に活性なCH2、CH3及びCH4ドメイン(CHε2-CHε3-CHε4配列)を含む第2のポリペプチド配列のN末端に結合したものを含む。特に好適な実施形態において、第1のポリペプチド配列は、天然ヒトIgG1重鎖の機能的に活性なヒンジ部、CH2及びCH3領域から構成され、そのC末端は、天然ヒトIgE重鎖定常領域の機能的に活性なCH2、CH3及びCH4ドメインから構成される第2のポリペプチドのN末端に結合している。
IgG重鎖定常領域配列(又は相同配列)のC末端をIgE重鎖定常領域配列(又は相同配列)のN末端に融合することが好ましいが、IgE重鎖定常領域配列(又は相同配列)のC末端がIgG重鎖定常領域配列(又は相同配列)のN末端に融合された融合分子も、本発明の範囲に含まれる。この融合分子は、同じもしくは異なるIgG及び/又はIgE重鎖定常領域配列の反復配列も含み得る。例えば、IgG重鎖定常領域配列の2つの反復配列(それぞれIgG阻害性受容体結合性ドメインを含む)の後にIgE重鎖定常領域配列(GGE構造)が続いてもよいし、又は同じもしくは異なるIgG重鎖定常領域配列がIgE重鎖定常領域配列(GEG構造)等をフランキングしていてもよい。標的受容体(例えばFcγRIIb受容体)に対する2以上の結合性配列を含む融合分子は、優れた生物学的(例えば抗アレルギー)特性を持つと期待される。
第2のポリペプチド配列が、アレルゲンもしくは自己抗原タンパク質を含むか、これらそのものであるか、又はそれらから由来するものである融合分子の構造には、同じ考慮事項が当てはまる。このような分子もまた、アレルゲン配列の片側もしくは両側に融合されたIgG重鎖定常領域配列の反復配列を含み得る。
同様に、第1ポリペプチド配列が肥満細胞及び/又は好塩基球上に発現される異なる阻害性受容体(例えばFcεRI 等のIgE受容体に直接もしくは間接的に結合する第2のポリペプチド配列に機能し得る形で結合したITIM含有阻害性受容体等)に結合する分子は、阻害性受容体結合性領域及び/又はIgE結合性領域からなる複数の繰り返し配列を含み得る。
全ての実施形態において、これら2つのポリペプチド配列は機能可能な形で結合する。これは、これらのポリペプチドがそれぞれの天然受容体(例えば低親和性FcγRIIb受容体等の天然IgG阻害性受容体等)及び所望により天然高親和性IgE受容体(例えばFcεRI受容体)又は低親和性IgE受容体に結合する能力を保持していることを意味する。その結果、機能可能な形で互いに結合した第1及び第2のポリペプチド配列を含む融合分子は、それぞれの天然受容体(例えばFcγRIIbとFcεRI又はFcγRIIとFcεRII等)を架橋することができる。本発明の融合分子の中の2つの結合性配列の間に機能可能な結合を達成するためには、これらの配列が、対応する受容体の天然免疫グロブリンリガンドの結合親和性と同様の結合親和性を持ってこれらの受容体に結合する能力を保持していることが好ましい。
本発明の融合分子は、典型的には、上記の融合分子のうち2つが互いに共有結合されたものを含むホモダイマー又はヘテロダイマーとして産生され、機能する。この共有結合は好ましくは1つ以上のジスルフィド結合を介して達成される。例えば、GE2と呼ばれるプロトタイプタンパク質は、2つのγヒンジ部-CHγ2-CHγ3-15aaリンカー-CHε2-CHε3-CHε4鎖が鎖間のジスルフィド結合によって互いに結合されたものであって免疫グロブリン様構造をなすホモダイマーとして生成される。2つの異なる融合分子が1つ以上の共有結合(例えばジスルフィド結合等)により互いに結合されたヘテロダイマーを生成することも可能である。このような2官能性構造は、同じ又は異なるIgεRを異なる阻害性受容体と架橋することができるという点で、有利であろう。
受容体結合性は、競合結合アッセイや直接及び間接サンドイッチアッセイ等の任意の公知のアッセイ方法を用いてテストすることができる。このように、本明細書中に記載される融合分子の中に含まれる第1のポリペプチド配列の低親和性IgG阻害性受容体への結合、又はそれに含まれる第2のポリペプチド配列の高親和性もしくは低親和性IgE受容体への結合は、RIAやELISAを含む競合結合アッセイ等の従来の結合アッセイを用いてテストすることができる。リガンド/受容体複合体は、濾過、遠心分離、フローサイトメトリー等の伝統的な分離方法を用いて同定することができ、結合アッセイの結果を、スキャッチャード分析等の結合データの任意の従来のグラフィック表示を用いて分析することができる。アッセイは、例えば精製受容体又は該受容体を発現する無傷の細胞を用いて行うことができる。結合パートナーの一方又は両方を固定化させる及び/又は標識することができる。特定の細胞を用いた結合アッセイを、以下の実施例に記載する。
本発明の融合分子の中に存在する2つのポリペプチド配列は、これらを関連する受容体に架橋させる任意の手段によって1個ずつ会合させてもよい。このように、会合は直接的もしくは間接的な共有結合により起こるものであっても良い。ここで「間接的な」共有結合とは、2つのポリペプチド配列が、直接もしくは間接的に互いに相互作用する別々の分子の一部であることを意味する。例えば、各ポリペプチド配列は、相互作用する分子のペア(例えばビオチン/アビジンといったペア)の一方のメンバーに直接結合されたものであってもよい。あるいは、これら2つのポリペプチド配列は、共通のリガンドに会合する物体(entity)への結合に基づく「2量体形成(dimerizer)」系(例えばシクロスポリンA、FK506、ラパマイシン、カウンターマイシン(countermycin)等に基づく2量体形成系)を用いて結合させることができる。
好適な実施形態において、第1及び第2のポリペプチド配列(例えば2つの免疫グロブリン定常領域セグメント又は免疫グロブリン定常領域配列と、アレルゲンもしくは自己抗原配列)は、ポリペプチドリンカーによって接続される。ポリペプチドリンカーは「スペーサ」として機能し、その機能は、アレルゲン又は自己抗原の中の機能可能な受容体結合性ドメイン又はFcγ受容体結合性ドメインとIgE-結合性配列とを隔て、これらが独立してそれぞれの独特な3次コンホメーションを形成することができるようにすることである。ポリペプチドリンカーは通常、約5〜約25個の残基を含み、好ましくは少なくとも約10個、よりこの好ましくは少なくとも約15個のアミノ酸を含み、協働して親水性の比較的構造化されていない領域を提供するアミノ酸残基で構成される。2次構造を殆どもしくは全く持たないアミノ酸配列の結合はうまくいく。スペーサの中の具体的なアミノ酸は様々であるが、システインは避けるべきである。適当なポリペプチドリンカーは、例えば国際公開WO88/09344(1988年12月1日公開)に、このようなリンカーを含む多機能タンパク質の作製方法として、開示されている。
1つの実施形態において、アレルゲン又は自己抗原配列を含む融合分子は、二重の目的(融合分子が、(a)阻害性ITIM含有受容体と刺激性IgE受容体とを架橋させることによりアレルギー反応を弱めるように、及び(b)伝統的な脱感作免疫療法で使用するのに適した抗原性物質を提供するように、という目的)を有するよう設計される。この二重機能は、アレルギーもしくは自己免疫疾患のための脱感作療法で使用するのに適した物質を提供し、また同時に、脱感作免疫療法中の被験者への抗原含有融合ポリペプチドの投与により引き起こされ得るアナフィラキシー反応を抑える固有の能力を有するので、価値あるものである。
脱感作療法(本発明の融合ポリペプチドを用いるものを含む)は、クラスIもしくはクラスII主要組織適合複合体(MHC I又はMHC II)分子の関係でポリペプチドのインターナライゼーションが起こった後に細胞内プロセッシング及び細胞(抗原提示細胞等、ただしこれに限定されない)の表面への提示が起こるというメカニズムを利用する。当分野で公知の一定の条件下でその抗原への「耐性」の望ましい効果をもたらすのは、T細胞への抗原及びMHCの同時提示である。
脱感作療法のためのワクチン材料として使用する場合、本発明の融合ポリペプチドは被験者に投与された後にインターナライゼーションにより、細胞内に入る。インターナライゼーションは任意のメカニズムにより行われることができるが、エンドサイトーシス、食作用、ピノサイトーシスを含むメカニズム、又は受容体もしくは非受容体介在性インターナライゼーションの任意の他のメカニズムが考えられる。融合ポリペプチドのインターナライゼーション及びその後のプロセッシングは、T細胞への提示にとって必要である。
MHC I及びMHC IIによる細胞表面への抗原提示は、2つの別個のメカニズムを利用する。MHC I提示は、ATP依存的に小胞体及び細胞質ゾルから抗原をプロセッシングする。簡単に言うと、このプロセスは、ユビキチン化により分解させるために抗原をマーキングした後、プロテアソーム依存的にタンパク質分解によるプロセッシングを行うものである。MHC Iとの同時提示に適したペプチドの生成には、更なる「トリミング(trimming)」プロテアーゼの関与も示唆されている(Rock及びGoldberg, Annu. Rev. Immunol., 17:739-779 [1999];Pamer及びCresswell, Annu. Rev. Immunol., 16:323-358 [1998];ならびにLuckeyら, Jour. Immunol., 167:1212-1221 [2001])。これに対し、MHC IIとの同時提示のための抗原のプロセッシングは、エンドサイトーシス、及び細胞質ゾルから抗原を仕切るエンドソーム/リソソーム経路を利用し、そして様々な切断特異性を有する複数の異なるATP依存性酸性(acid-optimal)プロテアーゼを利用する(Watts, Annu. Rev. Immunol., 15:821-850 [1997];及びWatts, Curr. Opin. Immunol., 13:(1):26-31 [2001])。
プロテアーゼ経路を介してプロセッシングを行うためにMHC I抗原をマーキングするシグナル配列の幾つかが公知である。大きなかさばった又は電荷を帯びたアミノ末端を有する抗原は急速にユビキチン化及び分解されるが、N末端メチオニン又は他の小さなN末端残基を有する同タンパク質はユビキチンによる分解に対する耐性が高いことが知られている(Varshavsky, Cell 69:725-735 [1992])。さらに、プロテアソームは少なくとも3つの異なるプロテアーゼ活性を含むことが分かった。これらは、(1)大きな疎水性残基の後のペプチド結合を好むこと(即ちキモトリプシン様活性)、(2)塩基性残基の後の切断特異性、及び(3)酸性残基の後の切断を好むこと、である(Rock及びGoldberg, Annu. Rev. Immunol., 17:739-779 [1999];Pamer及びCresswell, Annu. Rev. Immunol., 16:323-358 [1998])。これらの活性はアロステリック的に制御されること、及びキモトリプシン様活性は支配的もしくは律速的であるようであること、が報告されている(Kisselevら, Mol. Cell 4(3):395-402 [1999])。
APC上にMHC IIと一緒に提示するための特殊なエンドソーム・コンパートメントの中での抗原のプロセッシングに関与する細胞内プロテアーゼも公知であり、それらの切断特異性が決定された(Watts, Annu. Rev. Immunol., 15:821-850 [1997]; Villadangosら, Immunol. Rev., 172:109-120 [1999];Antoniouら, Immunity 12(4):391-398, [2000];Villadangos及びPloegh, Immunity 12(3):233-239 [2000];ならびにWatts, Curr. Opin. Immunol., 13:(1):26-31 [2001])。エンドソームでの分解経路の中での抗原プロセッシングに関与するこれらのプロテアーゼの多くは、システイン、アスパラギン酸又はアルギニンエンドプロテアーゼである。抗原のプロセッシングに関与するプロテアーゼは、以下の表3に列挙したものを含むがこれらに限定されない。
本発明の幾つかの実施形態において、融合ポリペプチドは、(a)リンカーのプロテアーゼ切断又は(b)抗原の一般的なタンパク質分解プロセッシングを容易にするアミノ酸配列を含み、これにより、より簡単にプロセッシングされて細胞表面上(例えばAPCの表面上)に提示される抗原性物質を提供することが想定される。幾つかの実施形態において、これらのタンパク質分解シグナルは、融合ポリペプチドの抗原部分とFcγ部分とを連結するリンカー配列の中にある。他の実施形態において、タンパク質分解促進配列は、融合ポリペプチドの他のパーツの中(例えば融合ポリペプチドのN末端又はC末端の中)にある。
より詳細には、本発明の融合ポリペプチドは、該ポリペプチドのユビキチン・ターゲッティングを促進する様々なアミノ酸配列を含むことができ、また、プロテアソームプロセッシング及びMHC Iの同時提示のために該ポリペプチドを標的とするための様々なアミノ酸残基も含むことができる。例えば、融合ポリペプチドは、ユビキチン・ターゲッティングを促進するために、大きなかさばったもしくは電荷を帯びたアミノ酸残基をアミノ末端に含むよう構成することができる。あるいは又は同時に、融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドの中のどこかで(及び最も有利なのはポリペプチドリンカー領域の中で)プロテアソーム切断を指令するために、大きな疎水性の塩基性もしくは酸性残基を含むことができる。しかし、本発明を実施及び使用するために、抗原のプロセッシング及び提示の分子メカニズムを理解する必要はない。
同様に、本発明の融合ポリペプチドは、エンドソーム/リソソームのタンパク質分解プロセッシング及びMHC IIの同時提示を促進するために、様々なアミノ酸配列を含むことができると想定される。例えば、融合ポリペプチドは、システイン、アスパラギン酸又はアルギニン残基に富むものであってもよい。好適な実施形態において、融合ポリペプチドのリンカー領域は、融合ポリペプチドを半分に切断し易くするためにこれらの残基を豊富に含む。その際、アレルゲン又は自己抗原配列を含む半分はさらにプロセッシングされて、MHC IIと一緒にAPC上に提示されることができる。しかし、本発明を実施及び使用するために、抗原のプロセッシング及び提示の分子メカニズムを理解する必要はない。
次に好適な実施形態において、IgG及びIgE定常領域配列、IgG定常領域配列、ならびにアレルゲンもしくは自己抗原配列、又はこのような配列と高い配列同一性を示す配列は、互いに直接融合されてもよいし、非ポリペプチドリンカーにより接続されてもよい。このようなリンカーは、例えば、受容体(抗体)結合機能を損なうことなくこれら2つの配列を連結することができる共有結合2官能性架橋剤の残基であってもよい。2官能性架橋試薬は、それらの官能基の特異性に従って分けることができる(例えばアミノ、スフルヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異性基等)。これらのうち、遊離アミノ基に向けられる試薬は、これらが市販されていること、合成が簡単であること、及びこれらを適用することができる反応条件が緩やかであることにより、特に評判がよくなった。ヘテロ2官能性架橋試薬の大部分は、第1級アミン反応基及びチオール反応基を含む(概説については、Ji, T. H. "Bifunctional Reagents" in: Meth. Enzymol. 91:580-609 (1983)を参照されたい)。
更なる具体的な実施形態において、これら2つのポリペプチド配列(天然配列の変異体を含む)は、両親媒性ヘリックスによって2量体化される。遺伝子調節タンパク質の中のアミノ酸ロイシン(Leu)の反復的なコピーは、2つのタンパク質分子を一緒に「ジッパーを閉じる(zip)」ようにして2量体を提供する歯(teeth)として機能することができることは公知である。ロイシンジッパー(本発明の目的のためのリンカーとして機能し得る)の更に詳細については、例えばLandschulz, W. H.ら. Science 240:1759-1764 (1988);O'Shea, E. K.ら, Science 243: 538-542 (1989);McKnight, S. L., Scientific American 54-64, April 1991;Schmidt-Dorr. T.ら, Biochemistry 30:9657-9664 (1991);Blondel, A.及びBedouelle, H. Protein Engineering 4:457-461 (1991)、ならびにこれらの文献に引用された参考文献を参照されたい。
他のアプローチでは、これら2つのポリペプチド配列(天然配列の変異体を含む)は、米国特許第5,329,028号に開示されたもの等の糖質特異的2官能性架橋剤(carbohydate-directed bifunctional cross-linking agent)により連結される。
肥満細胞及び/又は好塩基球上に発現される阻害性受容体(例えば、FcγRIIb等のIgG阻害性受容体を含むITIM含有受容体等)とFcεRI等の高親和性IgE受容体又はFcεRII等の低親和性IgE受容体との架橋は、FcεR介在性の生物学的応答を阻害する。このような生物学的応答は、好ましくは、RcεRを介したアレルギー反応又は自己免疫応答(例えば喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、慢性じんま疹及び血管性水腫、膜翅目(hymenophthera)(例えばミツバチやスズメバチ等)によるハチ刺され又はペニシリン等の介在物質に対するアレルギー反応等のIgE介在性反応に関連する状態を含むがこれらに限定されない)の仲介役である。これらの反応には、アナフィラキシーショックの深刻な生理学的反応(アレルゲン(例えばミツバチの毒等)への偶発的曝露により発生し得る、あるいはアレルギー状態もしくは自己免疫疾患の治療のためのペプチド療法中のようなアレルゲン又は自己抗原の意図的投与により発生し得る)も含む。
2. 融合分子の調製
融合分子が、第1及び第2のポリペプチド配列が直接融合した又はポリペプチドリンカーによって機能し得る形で結合されたポリペプチドである場合、これらのポリペプチド配列は、組換えDNA技法又は伝統的な化学合成の周知方法によって調製することができる。ポリペプチドが組換え宿主細胞によって産生される場合、本発明の所望のポリペプチドをコードするcDNAを複製可能なベクターに挿入してクローニング及び発現を行う。上記のように、天然免疫グロブリン定常領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列(天然IgG及びIgE定常領配列を含む)は、当分野において周知であり、例えばKabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)より簡単に入手可能である。
多数のアレルゲンの配列も当分野では周知である。WHO/IUISアレルゲン命名小委員会(WHO/IUIS Allergen Nomenclature Subcommittee)により確立されたアレルゲンの命名システムに従って、任意の特定のアレルゲンの表記(designation)は、その属の最初の3文字、スペース、種の名前の最初の1文字、スペース及びアラビア数次で構成される。2種の名前が全く同じ表記を持つ場合、それぞれの種の表記に1文字以上を加えて互いを区別する。この表記法を用いると、アレルゲンAln G 1は、ハンノキ(Alnus)属のglutinosa種に由来する主な花粉アレルゲンであり、その配列は、SWISS-PROTデータベースから入力名MPAC_ALNGL (アクセッション番号(Primary Accession number ):P38948)で入手可能である(Breitenderら, J. Allergy Clin. Immunol. 90:909-917 (1992))。SWISS-PROTデータベースに載っている公知抗原のリスト(これらの起源、入力名及びアクセッション番号を含む)を表1に記載する。多くの食物アレルゲンの分子量は、10,000〜70,000Daである。Ara h 1(63.5kDa)及びAra h 2(17kDa)等の幾つかのアレルゲンは、例えば200〜300kDaのより大きなポリマーとして生じる。
同様に、ヒト疾患への関与が示唆されている公知自己抗原のリストを表2に記載する。この表は、自己抗原の名前、及びその具体的な自己抗原に対する抗体の存在に関係する疾患状態を挙げている。この表は、自己抗原の分子同定が行われた自己免疫疾患のみを挙げている。表を見て分かるように、1つの自己免疫疾患に罹った複数の患者がしばしば2以上の自己反応性抗体を示す、又は逆に、特定の自己抗原が2以上の自己免疫疾患に関与し得るので、1つの特定の疾患に対する1つの特定の自己抗体の割当てはしばしば複雑である。本発明は、表2に記載されたこれらの配列のみの使用に限定されるものではない。更なる自己免疫疾患において自己抗原が同定されれば、これらの分子配列も本発明で使用できる。
先に述べたように、本発明の融合分子において、単一のIgE結合性部位又は免疫優性エピトープのみを含む天然もしくは変異型のアレルゲン又は自己抗原のフラグメントを使用することが有用であろう。表1及び2に挙げたアレルゲンタンパク質の多くについて、IgE結合性部位及び免疫優性エピトープが決定された。例えば、ヒカゲミズ属Parietaria judaica花粉の主なアレルゲンであるPar j 2のIgE結合性エピトープがCostaら, Allergy 55:246-50 (2000)により決定された。幾つか例を挙げるとすれば、主なピーナッツアレルゲンAra h 1のIgE結合性エピトープ(Burksら, Eur. J. Biochem. 254:334-9 (1997));Ara h 2 (Stanleyら, Arch Biochem. Biophys. 342:244-53 (1997));及びAra h 3 (Rabjohnら, J. Clin. Invest. 103:535-42 (1999))も公知である。また、CNSミエリン塩基性タンパク質(MBP)の自己抗原については、だいたい第83〜99位のアミノ酸を含む小さなドメインに免疫優性エピトープがマッピングされている(Otaら., Nature 346:183-187 [1990];Warren及びCatz, J. Neuroimmunol., 39:81-90 [1992];Warren及びCatz, J. Neuroimmunol., 43:87-96 [1993];ならびにWarrenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11061-11065 [1995])。このエピトープに対応する短い合成ペプチドが、多発性硬化症のペプチド免疫療法で使用されている(例えばWarrenら, J. Neurol. Sci., 152:31-38 [1997])。
適当なベクターは、組換えDNA技術の標準的な技法を用いて調製され、例えば“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第2版 (Sambrookら, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait編, 1984);“Animal Cell Culture” (R.I. Freshney編, 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.);“Handbook of Experimental Immunology”, 第4版(D.M. Weir & C.C. Blackwell編, Blackwell Science Inc., 1987);“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J.M. Miller & M.P. Calos編, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubelら編, 1987);“PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullisら編, 1994);ならびに“Current Protocols in Immunology” (J.E. Coliganら編, 1991)に記載されている。単離したプラスミド及びDNAフラグメントを切断し、調整し、特定の順番で連結して所望のベクターを作製する。連結した後、発現させたい遺伝子を含むベクターを適当な宿主細胞中に形質転換する。
宿主細胞は、異種タンパク質を発現させることが公知である任意の真核生物宿主であっても原核生物宿主であってもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、真核微生物(酵母)又は多細胞生物から単離した細胞(哺乳動物細胞培養物)、植物及び昆虫細胞等の真核生物宿主内で発現させることができる。異種ポリペプチドの発現に適した哺乳動物細胞系の例としては、SV40により形質転換したサル腎CV1細胞系(COS-7、ATCC CRL 1651)、ヒト胚腎細胞系293S(Grahamら, J. Gen. Virol. 36:59 [1977])、ベビーハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL 10);チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 [1980]);サル腎細胞(CVI-76, ATCC CCL 70);アフリカ緑ザル細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);ヒト子宮頚癌細胞(HELA, ATCC CCL 2);イヌ腎細胞(MDCK, ATCC CCL 34);ヒト肺細胞(W138, ATCC CCL 75);及びヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065)が挙げられる。一般的な骨髄腫細胞(特に内因性抗体を産生しないもの)、例えば非免疫グロブリン産生骨髄腫細胞系SP2/0は、本明細書中に記載の融合分子の産生に好ましい。
昆虫細胞宿主を用いた真核生物発現系は、プラスミドもしくはバキュロウイルス発現系に頼るものである。典型的な昆虫宿主細胞は、ヨトウガSpodoptera frugiperdaに由来するものである。外来タンパク質を発現させるためには、これらの細胞を、バキュロウイルスAutographa californicaの核多角体病ウイルスの組換え形態(このウイルスのポリヘドリンプロモーターの制御下で発現される目的の遺伝子を有する)で感染させる。このウイルスに感染させた他の昆虫としては、イラクサキンウワバTrichoplusia niに由来する「High 5」(Invitrogen社)として商業的に公知である細胞系が挙げられる。時折使用される他のバキュロウイルスは、蚕Bombyx moriに感染するBombyx mori核多面体ウイルスである。多くのバキュロウイルス発現系が、例えばInvitrogen社(Bac-N-Blue(商品名))、Clontech社(BacPAK(商品名)バキュロウイルス発現系)、Life Technologies社(BAC-TO-BAC(商品名))、Novagen社(Bacベクター系(商品名))、Pharmingen and Quantum Biotechnologies社から市販されている。他の昆虫細胞宿主は、一般的なミバエであるショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)であり、そのための一過性のもしくは安定なプラスミドベースのトランスフェクションキットは、Invitroten社(The DES(商品名)System)から市販されている。
サッカロミセス・セレビシエは、低級真核生物宿主の間で最も一般的に使用されるものである。しかし、ピキア酵母Pichia pastoris (EP 183,070;Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol., 28:165-278 [1988])等の沢山の他の属、種及び株もここでは利用可能且つ有用である。酵母発現系は市販されており、例えばInvitrogen社(カリフォルニア州サンディエゴ)から購入することができる。2官能性タンパク質発現に適した他の酵母としては、Kluyveromyces lactis 等の酵母Kluyveromyces宿主(米国特許第4,943,529号); ***酵母Schizosaccharomyces pombe(Beach及びNurse, Nature 290:140 (1981);黒色アスペルギルスA. niger(Kelly及びHynes, EMBO J., 4:475-479 [1985])及び為巣性こうじ菌A. nidulans(Balanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]) 等のアスペルギルス宿主、ならびにHansenula polymorpha等のハンゼヌラ(Hansenula)宿主が挙げられるがこれらに限定されない。酵母は安価な(最少)培地上で急速に増殖し、組換体は、相補性によって簡単に選択することができ、発現されたタンパク質は、細胞質内の局在化又は細胞外輸送のために特に遺伝子操作することができ、大規模発酵に非常に適している。
原核生物は最初のクローニングステップに好適な宿主であり、特に、大量のDNAの高速生産、部位特異的突然変異誘発に使用される一本鎖DNAテンプレートの生産、多くの突然変異体の同時スクリーニング、及び生成された突然変異体のDNA配列決定に有用である。本発明のペプチドの生成に適した大腸菌株としては、例えば誘導可能T7 RNAポリメラーゼ遺伝子を保有するBL21(Studierら, Methods Enzymol., 185:60-98 [1990]);AD494 (DE3);EB105;ならびにCB (大腸菌B)及びそれらの誘導体;K12株214 (ATCC 31,446); W3110(ATCC 27,325);X1776(ATCC 31,537);HB101(ATCC 33,694);JM101(ATCC 33,876); NM522(ATCC 47,000);NM538(ATCC 35,638);NM539(ATCC 35,639)等が挙げられる。原核生物の多くの他の種及び属も使用することができる。実際に、本発明のペプチドは、アフィニティー精製で使用される切断可能なリガンドにペプチドを融合させて、細菌内での組換えタンパク質発現を利用することによって、大量に生成することが簡単にできる。
様々な宿主細胞内で発現させるために適したプロモーター、ベクター及び他の成分は、当分野では周知であり、例えば上記テキストブックに開示されている。
特定の細胞もしくは細胞系が本明細書中のポリペプチドを機能的に活性な形態で生成するのに適しているか否かは、経験的分析によって決定することができる。例えば、所望の分子のコード配列を含む発現構築物を用いて、候補細胞系を形質導入してもよい。次に形質導入した細胞を培養して増殖させ、培地を回収し、分泌されるポリペプチドの存在について分析する。次に、当分野で公知の方法によって(例えば該分子のIgG,IgE又はアレルゲン部分に特異的に結合する抗体を用いたELISAによって)生成物を定量することができる。
ある特定の場合、特に本発明の2官能性分子を構成する2つのポリペプチド配列が非ポリペプチドリンカーによって結合されている場合、例えば上記組換え法のいずれかによって、第1及び第2のポリペプチド配列を別々に合成した後、これら2つの配列を機能可能な形で結合することが有利であろう。
あるいは、2つのポリペプチド配列又は分子全体は、固相ペプチド合成等の化学合成によって調製してもよい。このような方法は当業者に周知である。一般にこれらの方法は、基本的なテキストブック(例えば固相ペプチド合成技法についてはJ. M. Stewart及びJ. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 第2版, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)や、G. Barany及びR. B. Merrifield, The Peptide: Analysis Synthesis, Biology,編集者E. Gross及びJ. Meienhofer, 第2巻, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254;ならびに典型的な液相合成についてはM. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984)や、E. Gross及びJ. Meienhofer編, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology(前掲)第1巻等)に記載されている固相又は液相合成法を使用する。
本発明の融合分子は、天然免疫グロブリン(例えばIgG及び/又はIgE)、アレルゲン(例えばAra h 2配列)又は自己抗原(例えばミエリン塩基性タンパク質)のアミノ酸配列変異体を含み得る。このようなアミノ酸配列変異体は、基礎をなすDNA配列を適当な組換え宿主細胞の中で発現させることによって、又は上記のように所望のポリペプチドのin vitro合成によって、生成することができる。ポリペプチド変異体をコードする核酸配列は、好ましくは、対応する天然(例えばヒト)ポリペプチドをコードする核酸配列の部位特異的突然変異誘発によって調製される。特に好適なのは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅を用いた部位特異的突然変異誘発である(例えば1987年7月28に発行された米国特許第4,683,195号;及びCurrent Protocols In Molecular Biology, 第15章(Ausubelら編, 1991)を参照されたい)。他の部位特異的突然変異誘発技法も当分野では周知であり、例えば以下の出版物に記載されている:Current Protocols In Molecular Biology,(前掲), 第8章; Molecular Cloning: A Laboratory Manual.,第2版(Sambrookら, 1989); Zollerら, Methods Enzymol. 100:468-500(1983);Zoller & Smith, DNA 3:479-488(1984);Zollerら, Nucl. Acids Res., 10:6487(1987);Brakeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4642-4646(1984);Botsteinら, Science 229:1193(1985);Kunkelら, Methods Enzymol. 154:367-82(1987), Adelmanら, DNA 2:183(1983);ならびにCarterら, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)。カセット突然変異誘発(Wellsら, Gene, 34:315 [1985])及び制限選択突然変異誘発(Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 [1986])を用いることもできる。
2つ以上のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列変異体は、幾つかある方法のうち1つを用いて生成することができる。これらのアミノ酸がポリペプチド鎖の中で互いに近くに位置する場合、これらは所望のアミノ酸置換の全てをコードする1つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に突然変異させることができる。しかしこれらのアミノ酸が互いにある程度の距離を置いて位置する(例えば11アミノ酸以上離れている)場合、所望の変化全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを作製することはより難しい。その代わりに、選択肢として2つの方法のうちの一方を用いることができる。第1の方法では、置換させるそれぞれのアミノ酸について別々のオリゴヌクレオチドを作製する。次にこれらのオリゴヌクレオチドを該一本鎖テンプレートDNAに同時にアニーリングするものであり、該テンプレートから合成されるDNAの第2鎖は、所望のアミノ酸置換の全てをコードすることになる。もう1つの方法は、突然変異誘発を2回以上行って所望の突然変異体を作製するものである。
また本発明のポリペプチドは、例えば国際特許公開PCT WO92/09300号に開示されたようなコンビナトリアル・ペプチドライブラリー法によって調製することもできる。この方法は、与えられた所定の配列の変異体である複数の分子を調製及び分析するのに特に適しており、従って、生物学的特性が改善されたポリペプチド(次に、組換えDNA技術及び/又は化学合成法等の当分野で公知である任意の技法により作製することができる)を同定するのに特に有用である。
3. 本発明の融合分子の治療的用途
本発明は、過剰もしくは不適切な免疫応答から生じる免疫疾患を治療するための新しい治療的戦略、及びアナフィラキシー反応の予防方法を提供する。特に本発明は、高親和性IgE受容体が介在するI型過敏症疾患を治療するため、ならびに自己免疫疾患(例えば自己免疫性糖尿病、慢性関節リウマチ、及び多発性硬化症等)を治療するための化合物及び方法を提供する。本発明は、自己免疫疾患を治療するための既存の方法よりも優れた利点を提供する。本明細書中に記載される方法は任意の哺乳動物被験者の治療において使用することができるが、好適な被験者はヒトである。
標的とされる疾患の性質
アレルギー反応は、誘導される免疫応答のタイプ及び抗原に対し反応して発生する組織の損傷に応じて、ゲル&クームス分類(Gell and Coombs Classification)に従って分類される。I型反応(即時型過敏症)は、抗原(この場合はアレルゲンと呼ばれる)が、体内に入り込み、このアレルゲンに特異的なIgEがその高親和性受容体FcεRIに結合した結果このアレルゲンに感作された肥満細胞又は好塩基球に出会ったときに生じる。感作された細胞に達すると、このアレルゲンはFcεRIに結合したIgE分子と架橋し、細胞内カルシウム(Ca2+)を増加させ、これがヒスタミンやプロテアーゼ等の前もって形成された介在物質及びロイコトリエンやプロスタグランジン等の新しく合成される脂質由来介在物質の急激な放出(すなわち脱顆粒)の引金となる。これらのオータコイドの過剰な放出は、アレルギーの急性臨床症状を生じさせる。刺激された好塩基球及び肥満細は、炎症促進性介在物質も産生及び放出し、これらの介在物質はアレルギー反応の急性期及び遅延期に関わる。
上記に記載し上記表1に示したように、バラエティーに富んだアレルゲンがこれまでに同定されており、事実上毎日のように新しいアレルゲンが同定、クローニング及び配列決定されている。
アレルゲンを摂取すると、胃腸及び全身のアレルギー反応が起こる。関与する最も一般的な食物アレルゲンとしては、落花生、貝、牛乳、魚、大豆、小麦、卵及び木の実(例えばクルミ等)が挙げられる。罹患しやすい人々において、これらの食物は様々なアレルギー症状(例えば悪心、嘔吐、下痢、じんま疹、血管性水腫、喘息、及び本格的なアナフィラキシー等)を引き起こし得る。
空気中のアレルゲンを吸い込むと、アレルギー性鼻炎及びアレルギー性喘息が起こり、これらは曝露の性質によって急性又は慢性のものとなる。空気中のアレルゲンに目が曝されると、アレルギー性結膜炎となる。一般的な空気中アレルゲンとしては、花粉、カビの胞子、塵ダニ、及び他の昆虫タンパク質が挙げられる。ネコ、塵ダニ及びゴキブリアレルゲンは通年性のアレルギー性鼻炎の最も一般的な原因であり、草、雑草及び木の花粉は季節的な花粉症及びアレルギー性喘息の最も一般的な原因である。
アレルゲン(例えばラテックス製手袋に見られるような天然ゴムラテックスタンパク質等)に皮膚が曝されると、アレルゲンに接触した箇所にじんま疹としてはっきり現れる局部的なアレルギー反応が起こる場合がある。アレルゲンの経皮吸収は、全身性の症状を引き起こす場合もある。
蜂刺され、ペニシリンの注射、又は外科手術中における患者の体内での天然ゴムラテックス(NRL)手袋の使用で生じるようなアレルゲンへの全身性曝露は、皮膚、胃腸及び呼吸性の反応(気道閉塞及び本格的なアナフィラキシーまでもを含む)をもたらす場合がある。膜翅目昆虫による虫刺されは一般にアレルギー反応を引き起こし、しばしばアナフィラキシーショックにつながる。例としては、様々な刺す昆虫(例えばミツバチ、スズメバチ、オオクマバチ、キマダラハナバチ及びwhite-faced hornet(顔などに顕著な白斑のある米国産クロスズメバチ属の一種)等)が挙げられる。フシアリ(Solenopsis invicta)として知られるある種の刺すアリは、米国においてその生息範囲を拡大しているので、この国において深刻なアレルギーを引き起こす原因として広まっている。NRL手袋に含まれるタンパク質は、保健労働者及び患者にとって大きな心配事となり、現時点では、この問題の解決策は使用を避けること以外に成功していない。
また、多数の自己免疫疾患、ならびに自己免疫疾患の病理に関与すると思われる自己抗体により認識される自己抗原も同定されており、表2に示したものや、当分野において公知であるものがある(例えばvan Venrooij及びMaini (編), Manual of Biological Markers of Disease, Kluwer Academic Publishers [1996];Rose及びMacKay (編), The Autoimmune Diseases, 第3版, Academic Press [1998];ならびにLydyard及びBrostoff (編), Autoimmune Disease: Aetiopathogenesis, Diagnosis and Treatment, Blackwell Science Ltd. [1994]を参照されたい)。表2に記載の自己抗原及び自己免疫疾患のリストは、全てを網羅するものではなく、自己免疫性病因を持つ新しい疾患及び自己抗原が将来同定されることが考えられるため、限定的なものではない。本発明は表2に教示された疾患の治療に限定されるものではなく、本発明で使用できる自己抗原配列は表2に記載されたこれらの配列に限定されるものではない。それについての自己抗原が現在のところ分かっていないが将来同定されるであろう自己免疫疾患の例としては、ベーチェット病、クローン病、川崎病、自己免疫性男性不妊症、レーノー病、高安動脈炎及び巨細胞性動脈炎が挙げられるが、これらに限定されない。
標的とする疾患に対する化合物の使用
本明細書中に開示される化合物を使用して、多数の免疫疾患(アレルギー疾患、自己免疫疾患、及びアナフィラキシーショック反応等)を治療及び予防することができる。本発明は、過剰なもしくは不適切な免疫応答により生じる免疫疾患を治療するための新しい治療戦略を提供する。特に、本発明は以下に記載する用途に使用できる組成物及び方法を提供する。ここに箇条書きにされる用途は限定的なものではなく、これらの用途の変形は、当分野に精通したものであれば自明であろう。
(a)本発明は、高親和性IgE受容体が介在するI型過敏症疾患(例えばアレルギー性喘息等のアレルギー疾患)の治療において使用できる。これらの方法において、FcεR受容体は、本発明の融合ポリペプチドを介して阻害性FcγR受容体に架橋され、IgE及びFcεR活性のダウンレギュレーションをもたらす。本明細書中に開示される化合物は、主な環境アレルゲン及び職業的アレルゲンに対する急性もしくは慢性のIgE介在性反応を阻害又は予防するために使用することができる。
本発明の融合ポリペプチド組成物がIgG重鎖定常領域配列及びアレルゲン配列を含む場合、免疫抑制はこの特定のアレルゲンに対して特異的となる。本発明の融合ポリペプチド組成物がIgG重鎖定常領域配列及びIgE重鎖定常領域配列を含む場合、I型過敏症反応の抑制は全体的なものであり、特定のアレルゲンに対して特異的なものではない。
(b)本発明の幾つかの融合ポリペプチド組成物は、特定のアレルゲンに対してアレルギー反応性ではない状態を誘導する(即ち脱感作又はアレルギー耐性)アレルギー免疫療法に適したワクチン材料を提供するために使用することができる。この能力で使用する場合、融合ポリペプチド材料は、IgG重鎖定常領域配列及びアレルゲン配列を含む。この場合、融合ポリペプチドはインターナライズされ、プロセッシングされ、そして細胞(例えばAPCが挙げられるがこれに限定されない)の表面上に提示されると想定される。このような融合ポリペプチドの使用は、この融合ポリペプチドが、該融合ポリペプチドのアレルゲン配列成分に反応して生じ得る任意の急性I型過敏症反応(例えばアナフィラキシー反応)を予防もしくはダウンレギュレートする固有の能力を有するので、既存のワクチン材料よりも有利である。この予防又はダウンレギュレーションは、融合ポリペプチド及びそのアレルゲン配列に特異的な内因性IgEを介して刺激性Fcε受容体と阻害性Fcγ受容体とが架橋されることによって起こると考えられる。しかし、本発明を実施又は使用するためにダウンレギュレーションを担うメカニズムを理解する必要はない。この実施形態において、融合ポリペプチドは、寛容を誘導するために抗原配列とMHC I又はMHC IIとを同時に提示し易くするターゲッティング及びタンパク質分解プロセッシングを促進する特定のアミノ酸配列を含んでいても良いし、含んでいなくても良い。
(c)IgG重鎖定常領域配列及び自己抗原配列(例えばミエリン塩基性タンパク質)を含む本発明の幾つかの融合ポリペプチド組成物は、自己免疫疾患(例えば多発性硬化症等)の治療において、免疫療法での使用に適したワクチン材料として使用できる。この能力で使用する場合、このポリペプチド材料はプロセッシングされて抗原提示細胞(APC)上に提示されると想定される。この実施形態において、融合ポリペプチドは、ターゲッティング及び寛容を誘導するためにMHC I又はMHC IIと自己抗原配列とを同時に提示しやすくするタンパク質分解プロセッシングを促進する特定のアミノ酸配列を含んでいてもよいし、含んでいなくても良い。この治療様式で使用される融合ポリペプチド材料は、該融合ポリペプチド上の自己抗原性成分に対する反応性から生じ得る任意の急性I型過敏症反応(例えばアナフィラキシー反応)を予防又はダウンレギュレートする固有の能力を有する、という更なる利点を有する。このダウンレギュレーションは、融合ポリペプチド及び自己抗原配列に対して特異的な内因性IgEを介して刺激性Fcε受容体と阻害性Fcγ受容体とを架橋することにより生じると考えられる。しかし、本発明を実施及び使用するために、ダウンレギュレーションを担うメカニズムを理解する必要はない。
(d)本発明の融合ポリペプチドは、しばしば伝統的な免疫療法に反応して観察される危険なアナフィラキシー反応を予防するために、アレルギー又は自己免疫疾患の治療において、伝統的な全抗原脱感作(whole antigen desensitization)又はペプチド免疫療法と一緒に使用することができる。この能力で使用する場合、本発明の融合ポリペプチド組成物は、IgE重鎖定常領域配列、アレルゲンペプチド配列、又は自己抗原ペプチド配列だけでなく、IgG重鎖定常領域配列も含む。この融合ポリペプチドは、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患の治療において免疫療法物質に反応して生じるアナフィラキシー反応を予防するために、他の伝統的なペプチド療法の送達前、送達中又は送達後に、被験者に送達することができると考えられる。好適な実施形態において、融合ポリペプチド組成物は、免疫療法中に特定の丸ごとの抗原又はペプチドに対してI型過敏症を以前示したことがあるためそれと同じ抗原を用いて将来行われる免疫療法に対して過敏症反応を示す危険性のある被験者に与えることができる。本発明の融合ポリペプチドのこの用途は、これらが全身性過敏症作用を誘導してしまう(例えばアナフィラキシー反応を引き起こす)ために以前放棄された伝統的なペプチド療法を復帰させるプラットフォームを提供する。
(e)本発明の組成物及び方法は、危険性のある個体(例えば遺伝的に喘息にかかる危険性がある者や職場で職業的アレルゲンにさらされている者)に投与したときに、環境的及び職業的なアレルゲンに対するアレルギー増感(sensitization)を防ぐことによりアレルギー疾患に対する予防的な効果を提供することができる。
(f)本発明の融合ポリペプチドを用いて被験者を治療するための方法は、所望の治癒的もしくは予防的効果を得るために2以上の融合ポリペプチドを同時に送達するものであることが考えられる。例えば、アレルゲン又は自己抗原は、1つの免疫優性エピトープを持たなくても良い、あるいは天然IgE分子によって認識される複数のエピトープを有するものであってもよい。この場合、各々が異なるエピトープを含む複数の融合ポリペプチドを被験者に送達することができる。
他の例では、自己免疫疾患を示す患者はしばしば2以上のタイプの自己抗体の存在についてのテストで陽性である(test positive)ので、2以上の生理学的自己抗原を有する。その場合、その患者を治療するための方法は、所望の免疫抑制効果を得るために2以上の融合ポリペプチド(各融合ポリペプチドは異なる適当な自己抗原配列を含む)を同時に送達してもよいと考えられる。この場合、融合ポリペプチドは、自己抗原寛容療法中に生じ得るアナフィラキシー反応を予防する目的で予防的に与えることもできる。
(g)また、本発明の幾つかの実施形態において、例えば生物学的改変因子(例えば腫瘍壊死因子α(TNFα)、IL-1、IL-2、インターフェロン-α(INF-α)、及びINF-βを含む炎症反応介在因子のアンタゴニスト等)、免疫抑制治療薬(例えばメトトレキセート、カルシニューリン・インヒビター、又はステロイド等)、又は当分野で公知である様々なアジュバント等との同時送達など、融合ポリペプチドを他の治療と組み合わせて使用することも考えられる。
本発明の利点
記載される2官能性γ-ε化合物(即ち融合ポリペプチド)は、任意の特定のアレルゲン又はアレルゲン群に対するアレルギー反応を予防するために使用することができる。喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、種々の形態の自己免疫性じんま疹及び血管性水腫等(アナフィラキシーショックまで含む)(ただしこれらに限定されない)を予防するために、臨界数のFcεRI受容体を占領することにより、これらの分子は任意のアレルゲンに反応する好塩基球及び肥満細胞の能力を阻害する。このようにこれらの化合物は、治療薬(例えばペニシリン等)の投与を安全に行うことができるように、患者を脱感作するために急性的に使用することができる。同様に、これらの化合物は、標準的なアレルゲンワクチン接種(例えば落花生又はラテックス治療等)がより安全に行われるように、患者を脱感作するために使用することができる。またこれらは食物や吸引したアレルゲン等の環境アレルゲンに対する臨床反応を防ぐために慢性的療法として使用することもできる。
本発明は、様々なIgE介在性アレルギー反応(喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、じんま疹及び血管性水腫等(アナフィラキシーショックまで含む)を含むがこれらに限定されない)の治療においてより安全かつ効果的である新規形態のアレルギーワクチン接種で使用するためのγ-アレルゲン2官能性融合分子を提供する。肥満細胞及び好塩基球上のFcγRIIbに結合する分子にアレルゲンを融合させると、そのアレルゲンが局所性もしくは全身性のアレルギー反応を誘導するのを防ぐ。このような局所性もしくは全身性のアレルギー反応は、現在実施されているアレルゲンワクチン接種における大きな問題である。γ-アレルゲン融合タンパク質は、標準的なアレルゲン療法に比べて短い間隔で且つより安全に、高用量で与えることができる。本発明のこれらの利点は、自己免疫疾患の治療のための伝統的なワクチンの送達により深刻なIgE介在性(即ちアレルギー性)免疫応答(アナフィラキシーショックを含む)を引き起こす場合がある状況にも等しく適用可能である。
さらに、γ-アレルゲン化合物の使用は、その特定のアレルゲンに対する抗原特異的脱感作を引き起こす。従ってγ-アレルゲン化合物は、患者がアレルギー(IgE)反応を発症した対象である治療的モノクローナル抗体を用いる時に必要であるように、急性もしくは繰返し治療として、又は落花生アレルゲンで生じるような意図的ではない曝露を防ぐための慢性的治療として、アレルゲンに対する安全な曝露の窓口を提供する。
組換えDNA及びタンパク質技術の発展とともに、過敏症反応を抑制することができる、ということの重要性が増してくると期待される。近い将来に治療的用途に使用できる組換えポリペプチド生成物の数は増えてきているので、これらの組換え生成物は超免疫応答の引金となる可能性が高くなっている。またγ-アレルゲン化合物は従来のアレルゲンワクチン接種と一緒に使用すると、大量の標準的アレルゲンを与えているときの安全性の限界範囲に余裕を持たせることもできる。同様に、本発明の融合ポリペプチドは、組換え療法に対する超免疫応答の危険性を低下させるために組換えポリペプチド治療と組み合わせて使用することができる。
記載される2官能性自己抗原-Fcγ融合ポリペプチドは、自己免疫疾患の治療のための自己抗原寛容療法で使用される自己抗原配列に対するI型過敏症反応を防ぐために予防的に使用することができる。臨界数のFcε及び阻害性Fcγ受容体は、融合ポリペプチド及び自己抗原配列に対して特異的な内因性IgEを含む架橋の形成を介して架橋される、と考えられる(ただし、本発明を実施又は使用するために免疫抑制のメカニズムを理解する必要はない)。このように、これらの融合ポリペプチドは、(例えば寛容療法中に遭遇するような)外から供給された自己抗原に反応する好塩基球及び肥満細胞の能力を阻害して、I型過敏症反応(アナフィラキシーショックをも含む)を予防する。これらの融合ポリペプチドは、自己抗原ペプチドの治療的投与(即ち寛容療法)をより安全に行われるように、患者を脱感作するために使用することができる。
本発明は、自己免疫疾患の治療においてより安全且つ効果的な新規形態の自己免疫ワクチン接種で使用するための自己抗原-Fcγ融合ポリペプチドを提供する。融合ポリペプチドは単離自己抗原と一緒に投与することができる、あるいは補助的な自己抗原は投与されない。肥満細胞及び好塩基球上のFcγRIIbに結合する分子に自己抗原配列を融合させると、自己抗原配列(それ自体で又は融合ポリペプチドの一部として)は局所性又は全身性I型過敏症反応を誘導することができないようになる。このような局所性又は全身性アレルギー反応は、現在実施されているワクチン接種療法において大きな関心事である。自己抗原及びFcγを含む融合ポリペプチドは、標準的な自己抗原単独ペプチド療法に比べて、自己抗原配列をより高用量で短い間隔で且つより安全に投与できるようにする。
あるいは、遊離自己抗原と一緒に使用する場合、I型過敏症反応を抑制するために脱感作療法中にFcε及びFcγを含む融合ポリペプチドを使用することができる。このFcε-Fcγ融合ポリペプチドは、特定の自己抗原配列から誘導された反応だけでなく任意のIgE介在性I型過敏症反応を抑制するために使用することができる、という付加的な利点を有する。
更に、自己抗原-Fcγ融合化合物を使用すると、その特定の自己抗原に対する抗原特異的抑制(即ち脱感作)が起こる。広範囲な抑制は、(シクロスポリンAやメトトレキセート等の強力な免疫抑制薬の副作用に加えて)生命を脅かす可能性のある感染症に患者を罹り易くするので、この抗原特異的免疫抑制は、全体的な免疫抑制よりもはるかに好ましい。
更に、本明細書中のキメラγ-ε化合物は自己免疫性慢性じんま疹及び血管性水腫の治療に対して非常に有望である。じんま疹は、アレルギーを伴い得る皮膚の症状であるが、たいてい突発性である。これは、局在化した皮膚の肥満細胞の脱顆粒により引き起こされる比較的一般的な疾患であり、結果的に皮膚血管透過性が高くなって、最終的にはそう痒症の腫れ物となる。血管性水腫は、局在化した肥満細胞の脱顆粒により引き起こされる深い真皮組織、皮下組織又は粘膜下組織を含む血管反応である。これは最終的にそう痒症又は痛みを伴う組織の腫れとなる。慢性じんま疹及び血管性水腫はたいてい一緒に起こるが、別々に起こることもある。これらの状態は一般的であり、いったん6ヶ月以上存在してりまうと、これらはしばしば十年以上続く。致命的なものではないが、再発発作の頻度が日々の活動を乱すことにより重大な病的状態をもたらすため、これらは患者を非常に困らせるものである。標準的な療法はこれらの症状に対して効果を収めることなく、苦肉の策として、最近は、シクロスポリンA及び他の強力な免疫抑制薬を用いた化学療法が提唱されるに至った。これらの症状を有する患者の60%もが実際に自己免疫疾患を有することを示す証拠はだんだん増えており、彼らはFcεRI受容体に対する機能的抗体を作成する。更に詳細についてはHideら, N. Engl. J. Med. 328:1599-1604 (1993); Fiebigerら, J. Clin. Invest. 96:2606-12 (1995); Fiebigerら, J. Clin. Invest. 101:243-51 (1998); Kaplan,A.P., Urticaria and Angioedema, In: Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates (Galliin及びSnyderman編), 第3版, Lippincott & Wilkins, Philadelphia, 1999, pp. 915-928を参照されたい。本発明の融合分子は、FcεRIへのアクセスを安全に遮断することにより、これらの疾患の新規且つ有効な治療の基盤を形成すると考えられる。
本発明の組成物及び製剤
予防を含む治療的用途のために、本発明の化合物は製薬上許容可能な担体もしくは希釈剤と混ぜて医薬組成物として製剤化することができる。医薬製剤の作成方法は当分野において周知である。技法及び製剤はRemington’s Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990に一般に記載されている。また、Wang及びHanson “Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers”, Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42-2S (1988)も参照されたい。好適な投与形態は、医師により各患者について個別に決定するのが最も良い。
本発明の医薬組成物は、従来の担体及び場合により他の成分と一緒に本発明の融合分子を含み得る。
好適な形態は、一部には、用法及び入り込む経路(例えば経口、経皮、吸入又は注射)に依存する。このような形態は、標的細胞が多細胞宿主中にあるか又は培養中にあるかにかかわらず、作用物質又は組成物が標的細胞に到達することができるようにするものでなければならない。例えば、血流中に注射される薬理学的な作用物質又は組成物は、可溶性でなければならない。他の要因は当分野において公知であり、例えば作用物質もしくは組成物がその効果を発揮するのを妨げる形態や毒性等の考慮事項が挙げられる。
また、化合物を投与し易くするために担体又は賦形剤を使用することもできる。担体及び賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類(例えば乳糖、ブドウ糖又はショ糖等)、又は様々なタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール及び生理適合溶媒が挙げられる。組成物又は医薬組成物は、経口、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、鼻腔内、又は肺内経路を含む(ただしこれらに限定されない)様々な経路で投与することができる。
組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム又は他の製薬上許容可能な作用物質(例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、ポリオール(マンニトールやソルビトール等)、又は他の無機もしくは有機溶質等)を用いて得ることができる。
全身投与のためには、注射(例えば筋肉内、静脈内又は動脈内等)が好ましい。注射用に、本発明の化合物は液体溶液(好ましくはハンクス溶液やリンガー溶液等の生理適合緩衝液)中で製剤化される。あるいは、本発明の化合物は、米国薬局方基準により定義されるものと同様の安全性があると一般に認められている1種以上の賦形剤(例えばプロピレングリコール)中に製剤化される。これらは、例えば不活性油(ゴマ油、落花生油、オリーブ油等の植物油が適当である)又は他の許容可能な担体中に懸濁することができる。好ましくはこれらは、水性担体中、例えばpH約5.6〜7.4の等張緩衝液中に懸濁される。これらの組成物は、従来の殺菌技法によって滅菌してもよいし、滅菌濾過してもよい。組成物は、生理学的状態に近づけるのに必要な製薬上許容可能な補助物質(例えばpH緩衝剤等)を含むことができる。有用な緩衝液としては例えば酢酸ナトリウム/酢酸緩衝液が挙げられる。経皮注射もしくは送達の後に何時間も又は何日間もかけて治療的有効量の調製物が血流に送達されるように、貯臓型即ち「デポー」徐放性調製剤の形態を用いることができる。さらに、化合物を固体形態で製剤化し、使用する直前に再溶解もしくは懸濁させることができる。凍結乾燥形態も含まれる。
あるいは、本発明に従って同定されるある種の分子は経口投与することができる。経口投与の場合、化合物は従来型の経口用剤形(例えばカプセル剤、錠剤及びトニック剤等)として製剤化される。
また全身投与は経粘膜もしくは経皮で行うこともできる。経粘膜もしくは経皮投与の場合、浸透させるべきバリアに適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野において一般公知であり、例えば経粘膜投与の場合は胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに、浸透し易くするために界面活性剤を使用することができる。経粘膜投与は例えば鼻腔内スプレーにより又は坐剤を用いて行うことができる。
本発明の化合物の投与に好ましい経路は、鼻腔内及び/又は肺内送達のための吸入である。吸入による投与の場合、通常は、吸入可能な乾燥粉末状組成物又はエアロゾル組成物が使用され、その粒子又は液滴のサイズは、呼吸器管の所望の部分(例えば喉、上気道又は肺等)の中に有効成分がきちんと沈着するように選択される。吸入可能な組成物及びそれらを投与するためのデバイスは当分野において周知である。例えば、吸入するためのエアロゾル薬物の送達用デバイスが公知である。このようなデバイスの1つは、デバイスを作動させる度に患者に同じ投与量の薬物を送達する定量噴霧式吸入器(metered dose inhaler)である。定量噴霧式吸入器は典型的には、薬物及び加圧した推進薬のリザーバと、一定体積の定量チャンバーとを収容したキャニスターを含む。キャニスターは、薬物を患者に送達するためのマウスピースもしくはノーズピースを有する本体又はベースの中の受け口(receptacle)に挿入される。患者は手でキャニスターを本体に押し入れて充填バルブを閉め、チャンバーの中の定量の薬物を捕捉し、放出バルブを開いて用量チャンバーの中に捕捉された一定体積の薬物を雰囲気中にエアロゾルのミストとして放出することにより、このデバイスを使用する。これと同時に患者はマウスピースを介してこのミストを吸引し、気道内に取り込む。次に患者は、放出バルブが閉まり充填バルブが開いて次の薬物投与のために用量チャンバーを再充填するように、キャニスターを解放する。例えば米国特許第4,896,832号及び3Mヘルスケア社からエアロゾル・シーズド・アクチュエータ&キャップ(Aerosol Sheathed Actuator and Cap)として入手可能な製品を参照されたい。
他のデバイスは、患者の吸息運動に応じて計量された用量を自動的に提供するよう動作する呼吸作動式定量噴霧式吸入器(breath actuated metered dose inhaler)である。呼吸作動式デバイスの1つのスタイルは、放出バルブの引金を引くために呼吸運動により機械的なレバーを動かすときに用量を放出するものである。他のスタイルは、熱線風速計により検出された検出流量が予め設定された閾値を超えたときに用量を放出するものである。例えば米国特許第3,187,748号、第3,565,070号、第3,814,297号、第3,826,413号、第4,592,348号、第4,648,393号、及び第4,803,978号を参照されたい。
また、乾燥粉末状の薬物を患者の気道に送達するため(例えば米国特許第4,527,769号を参照されたい)、及び固体エアロゾル前駆物質を加熱することによりエアロゾルを送達するため(例えば米国特許第4,922,901号を参照されたい)のデバイスも存在する。これらのデバイスは典型的には、リザーバから薬物を引き出して気道内に入れるために、又は加熱エレメントを作動して固体エアロゾル前駆体を気化させるために、患者の呼吸の流量を頼りに、患者の吸息の初期段階の間に薬物を送達するように、動作する。
エアロゾルの粒径を制御するためのデバイスも公知である(例えば米国特許第 4,790,305号、第4,926,852号、第4,677,975号、及び第3,658,059.号を参照されたい)。
表面塗布の場合、本発明の化合物は、当分野で一般公知である軟膏、軟膏剤、ゲル又はクリームとして製剤化される。
望ましい場合は、メチルセルロース等の増粘剤を用いて上記組成物の溶液を増粘することができる。これらは、乳化形態(油中水又は水中油)として調製することができる。例えばアカシア粉末、非イオン界面活性剤(Tween等)又はイオン界面活性剤(アルカリポリエーテルアルコール硫酸塩もしくはスルホン酸塩等、例えばTriton)を含む様々な種類の製薬上許容可能な乳化剤のうち任意のものを用いることができる。
本発明で有用な組成物は、一般的に認められている手法に従って成分を混合することによって調製される。例えば、選択された成分をブレンダー又は他の標準的なデバイスの中で単純に混合して濃縮混合物を作成し、次にこれを、水又は増粘剤、及び場合によりpHを制御するための緩衝液又は等張性を制御するための追加的な溶質を加えることにより最終的な濃度及び粘度に調節することができる。
本発明の方法で使用するための様々な化合物の投与されるべき量は、標準的な手法によって決定することができる。一般に、治療的有効量は、患者の年齢及びサイズ、ならびにその患者に関係する疾患又は障害に応じて、約100mg〜10-12mg/kgである。一般にこの量は、治療対象となる個体の体重あたり約0.05〜50mg/kg、より好ましくは約1.0〜10mg/kgである。実際の用量の決定は医師の能力の範囲内で十分行うことができる。
本発明の化合物は、IgE介在性アレルギー疾患又は状態の治療のための1種以上の更なる治療剤と組み合わせて投与してもよい。このような更なる治療剤としては、コルチコステロイド、β-アンタゴニスト、テオフィリン、ロイコトリエンインヒビター、アレルゲンワクチン(vaccination)、可溶性組換えヒト可溶性IL-4受容体(Immunogen社)、抗-IL-4モノクローナル抗体(Protein Design Labs社)、及び抗-IgE抗体(例えばアトピー性喘息、及びアレルギー性鼻炎やアトピー性皮膚炎等の他のアレルギー疾患を有する患者の治療のための進歩した臨床試験に現在かけられている組換えヒト抗-IgEモノクローナル抗体rhuMAb-E25(Genentech, Inc.社))が挙げられるがこれらに限定されない(例えばBarnes, The New England Journal of Medicine 341:2006-2008 (1999)を参照されたい)。このように、本発明の化合物は、コルチコステロイドの吸入又は経口投与を用いて行われるコルチコステロイド療法などの伝統的なアレルギー療法を補うために使用することができる。
4.製品
また本発明は、本明細書中の一本鎖融合化合物を含む製品も提供する。この製品は、容器、及び容器に付ける又は添付するラベル又は添付文書を含む。適当な容器としては、例えばボトル、バイアル、シリンジ等が挙げられる。容器はガラスやプラスチック等の様々な材料から形成することができる。容器は、状態を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを持つものであってもよい(例えば容器は皮下注射針により穴あけが可能なストッパを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい)。また容器は上記のような吸入デバイスであってもよい。組成物中の少なくとも1つの有効成分は、本発明の融合化合物である。ラベル又は添付文書は、アレルギー状態(例えば喘息又は上記IgE介在性アレルギーのいずれか)等の選択された状態を治療するために該組成物が使用されることを示す。この製品はさらに、注射用静菌水(BWFI)等の製薬上許容可能な緩衝液、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含むさらなる容器を含んでいてもよい。この製品はさらに、商業的な及びユーザの視点から見て望ましい他のマテリアル(他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む)を含んでもよい。
以下の非限定的な例によって、本発明の更なる詳細を示す。