CN1317304C - 一种融合蛋白及其编码基因与表达方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白及其编码基因与表达方法和应用，其目的是提供一种融合蛋白及其编码基因与表达方法和以该融合蛋白为活性成分的抗过敏药物。本发明所提供的融合蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。本发明的融合蛋白不但具有IgE单克隆抗体的阻断IgE受体的作用，而且更重要的是启动了过敏反应在细胞内信号传导***的抑制***，从而强有力地抑制了细胞过敏反应，将在过敏性疾病的治疗中发挥重要作用。

Description

一种融合蛋白及其编码基因与表达方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程和免疫学领域中的一种融合蛋白及其编码基因与表达方法和应用，特别是涉及一种融合蛋白及其编码基因与表达方法和以该融合蛋白为活性成分的抗过敏药物。

背景技术

过敏性疾病是引起急，慢性疾病的第六大因素，它有30-60％的遗传机率。常见的有过敏性鼻炎，哮喘，过敏性皮炎，过敏性关节炎，蕁麻症，过敏性休克等疾病。约有10-15％的中国人及约20％的美国人受过敏性疾病的困扰。

目前用于治疗过敏性疾病的药物大多为控制临床症状，包括有类固醇激素，抗组胺药物，减充血剂，色甘酸钠，支气管扩张剂；最近美国FDA批准了于临床试验的抗IgE单克隆抗体。这些药物均有不同程度的副作用，各研究所、大学及医药公司正在寻找一种新型的抗过敏药物。

过敏反应的机理是：当抗原(过敏原，变应原)进入肌体，与附着在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE分子(嗜细胞抗体)结合，触发该细胞的ImmunoreceptorTyrosine-based Activation Motif(ITAM)激活，促使细胞释放生物活性物质，引起平滑肌收缩，血管通透性增加，浆液分泌增加等临床病理变化。在这一病理过程中，人的肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的亲和性IgE受体(Fc_εRI)在过敏性疾病中起关键作用。同时肥大细胞和嗜碱性粒细胞膜表面表达Fc_γRII抑制性受体，当二分子IgG同该受体结合时，产生聚合而引发Immunoreceptor Tyrosine-based InhibitionMotif(ITIM)磷酸化并抑制Fc_εRI的激活信号。最新的研究表明，如果将Fc_γRII受体与Fc_εRI受体交联，可诱发肥大细胞或嗜碱性粒细胞内的抑制信号，阻断细胞内的激活通路，从而抑制活性介质的释放，进一步抑制了过敏反应。因此，运用该反应机理来研究一种具有激活过敏反应中的抑制信号的融合蛋白，是崭新的抗过敏途径。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种融合蛋白及其编码基因，该蛋白具有抗过敏活性。

本发明所提供的融合蛋白，名称为FP4，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中序列2的氨基酸残基序列是由554个氨基酸残基组成的蛋白质。FP4的结构如图1所示，它由三部分组成：A区(Fc-ε)(自氨基端第1-300位氨基酸残基)，B区(Fc-γ)(自氨基端第318-554位氨基酸残基)和C区(hinge)(自氨基端第301-317位氨基酸残基)。其中，A区来源于人的IgE免疫球蛋白，具有与IgE受体Fc_εRI结合的部位；B区来源于人的IgG免疫球蛋白，具有与IgG受体Fc_γRII结合的部位；C区来源于人的免疫球蛋白，为绞连结构。

一种融合蛋白编码基因，名称为FP4，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列1中的DNA序列由1665个碱基组成，该基因的开放阅读框架为自5’端第1到第1665位碱基。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。

扩增FP4中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的第二个目的是提供一种表达融合蛋白FP4的方法。

本发明所提供的表达融合蛋白FP4的方法，是将含有融合蛋白编码基因FP4的表达载体转化到SP2/0细胞中，得到阳性克隆，培养所述阳性克隆，表达融合蛋白FP4。

含有融合蛋白编码基因的表达载体可按常规方法将FP4连接入表达载体pSecTag得到。

本发明的第三个目的是提供一种抗过敏药物，它的活性成分是融合蛋白FP4。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明的药物可以制成用于静脉注射等的注射剂，用于皮下注射、表皮外敷等的皮剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂，片剂，粉剂，粒剂，胶囊，口服液，膏剂，霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为0.01-1ug/kg/day疗程一般为10至20天。

本发明的融合蛋白FP4组成成份全部来源于人源(human)性免疫球蛋白，因此，该蛋白作为一种药物进入人体，没有任何异体蛋白的免疫源性。融合蛋白FP4的C区(hinge)灵活，可转动，可将Fc_εRI和Fc_γRII交联在一起，从而诱发细胞内的抑制信号，阻止细胞释放各种生物活性物质，抑制过敏反应的发生。体内外实验结果均证明融合蛋白FP4可以有效地交联肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的Fc_εRI和Fc_γRII，从而抑制过敏反应。本发明的融合蛋白FP4不但具有IgE单克隆抗体的阻断IgE受体的作用，而且更重要的是启动了过敏反应在细胞内信号传导***的抑制***，从而强有力地抑制了细胞过敏反应，将在过敏性疾病的治疗中发挥重要作用。

附图说明

图1为FP4的结构示意图

图2为FP4的表达过程示意图

图3A为Fc_εDNA PCR扩增产物电泳图谱

图3B为Fc_γDNA PCR扩增产物电泳图谱

图4为FP4与Fc_εRI受体结合能力鉴定结果

图5为FP4与Fc_γRII受体结合能力鉴定结果

图6为FP4蛋白抑制嗜碱性粒细胞释放组胺实验结果

图7为FP4抑制转基因老鼠的过敏反应结果

具体实施方式

实施例1、融合蛋白FP4的表达

融合蛋白FP4的表达过程如图2所示，具体包括以下步骤：按照常规方法进行以下操作：从人外周血中分离、纯化B淋巴细胞，提取基因组DNA，用特异性引物：

P1(Fc_ε):5’-GTGGCCCAGCCGGCCTTCACCCCGCCCACCGTGAAG-3’；

P2(Fc_ε):5’-GTGGATCCTTTACCGGGATTTACAGACAC-3’；

P3(Fcγ):5’-GGGGATCCGAGCCCAAATCTTGTGAC-3’；

P4(Fcγ):5’-GTGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’。

PCR扩增Fc_ε和Fcγ基因，将Fc_ε和Fc_γ基因的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3A和图3B所示，Fc_εDNA PCR扩增产物为1155bp；Fc_γDNA PCR扩增产物为928bp。将PCR产物分别直接克隆至pCR4-TOPO(INVITROGEN，CA)得到FPEFc-ε和FPGFc-γ，进行核苷酸序列分析；在得到了100％正确的核苷酸序列后，将Fc_ε和Fcγ基因分别利用SfiI-BamHI和BamHI-NotI限制性内切酶(NEW ENGLANDBIOLABS)进行酶切，并用限制性内切酶SfiI-NotI酶切pSecTag(INVITROGEN，CA)表达载体，然后进行连接，得到质粒pSecTagFP4，对质粒pSecTagFP4进行核苷酸序列分析，表明***的外源基因序列如序列表中的序列1所示。然后将此质粒利用常规电穿孔法转染至小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，经ZEOCIN抗药性筛选及ELISA鉴定(用常规方法制备的鼠抗人IgE抗体包备ELISA平板，加入标本上清，然后加入羊抗人IgE酶标抗体)，得到高表达FP4(其氨基酸序列如序列表中的序列2)的克隆。

利用RPMI1640(INVITROGEN，CA)培养基，在37℃，5％CO₂培养上述阳性克隆(含有质粒pSecTagFP4的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞)15天，2000rpm离心后，收集上清，再用鼠抗人IgE亲和层析法(将鼠抗人IgE交联至CNBr-ACTIVATED SEPHAROSE4B(PHARMACIA)分离纯化FP4蛋白。

实施例2、FP4与Fc_εRI受体结合实验

将1×10⁶CHO3D10细胞与5微克实施例1中纯化的FP4蛋白在4℃反应1小时，加入5微升FITC标记的抗人IgE抗体(CALTAG，CA)，用流式细胞仪检测细胞。结果如图4所示，表明FP4蛋白可与Fc_εRI受体结合，CHO3D10细胞呈FITC阳性。图4中，SSC-H为细胞内颗粒数，FSC-H为细胞大小，FL2-H为PE，FL1-H为FITC。

实施例3、FP4与FcγRII受体结合实验

将1×10⁶HMC-1细胞与5微克实施例1中纯化的FP4蛋白在4℃反应1小时，加入5微升FITC标记的抗人IgG FITC标记抗体(CALTAG，CA)，用流式细胞仪检测细胞。结果如图5所示，表明FP4蛋白可与FcγRII受体结合，HMC-1细胞呈FITC阳性。图5中，SSC-H为细胞内颗粒数，FSC-H为细胞大小，FL2-H为PE，FL1-H为FITC。

实施例4、FP4蛋白的体外功能实验

按照常规方法从人外周血中分离、纯化嗜碱性粒细胞，将分离的1×10⁶嗜碱性粒细胞与1-10微克人特异性抗NP-IgE(SEROTECH)37℃反应2小时后，加入2微克过敏原NP，然后用ELISA检测细胞培养上清中的组胺水平。结果如图6所示，表明该蛋白(FP4)处理后，组胺释放明显减弱，呈明显的剂量依赖的抑制作用。图6中，Hu IgE表示人IgE，NS IgE表示正常对照IgE，NP-BSA表示过敏原，+表示加入，-表示不加入。

实施例5、FP4蛋白的体内功能实验

人Fc_εRIα链转基因鼠(购自University of California，San Diego)，经局部皮内注射特异性人抗NP-IgE(SEROTECH)，4小时后静脉注入100微克过敏原NP和1％EVANS氏蓝色染料，如致敏部位发生过敏反应，局部皮肤由于血管通透性增加，蓝色染料从血管内渗出，进入组织间隙，呈蓝色反应。当在对应皮肤部位致敏的同时加入等量的融合蛋白(FP4)，则过敏反应完全被抑制，局部皮肤无任何改变，如图7所示。本实验结果进一步证明FP4蛋白在动物体内的抗过敏作用。

                                 序列表

<160>2

<210>1

<211>1665

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ttcaccccgc ccaccgtgaa gatcttacag tcgtcctgcg acggcggcgg gcacttcccc     60

ccgaccatcc agctcctgtg cctcgtctct gggtacaccc cagggactat caacatcacc    120

tggctggagg acgggcaggt catggacgtg gacttgtcca ccgcctctac cacgcaggag    180

ggtgagctgg cctccacaca aagcgagctc accctcagcc agaagcactg gctgtcagac    240

cgcacctaca cctgccaggt cacctatcaa ggtcacacct ttgaggacag caccaagaag    300

tgtgcagatt ccaacccgag aggggtgagc gcctacctaa gccggcccag cccgttcgac    360

ctgttcatcc gcaagtcgcc cacgatcacc tgtctggtgg tggacctggc acccagcaag    420

gggaccgtga acctgacctg gtcccgggcc agtgggaagc ctgtgaacca ctccaccaga    480

aaggaggaga agcagcgcaa tggcacgtta accgtcacgt ccaccctgcc ggtgggcacc    540

cgagactgga tcgaggggga gacctaccag tgcagggtga cccaccccca cctgcccagg    600

gccctcatgc ggtccacgac caagaccagc ggcccgcgtg ctgccccgga agtctatgcg    660

tttgcgacgc cggagtggcc ggggagccgg gacaagcgca ccctcgcctg cctgatccag    720

aacttcatgc ctgaggacat ctcggtgcag tggctgcaca acgaggtgca gctcccggac    780

gcccggcaca gcacgacgca gccccgcaag accaagggct ccggcttctt cgtcttcagc    840

cgtctagagg tgaccagggc cgaatgggag cagaaagatg agttcatctg ccgtgcagtc    900

catgaggcag ctagcccctc acagaccgtc cagcgagcgg tgtctgtaaa tcccggtaaa    960

ggatccgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa   1020

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc   1080

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc   1140

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag   1200

gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg   1260

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag   1320

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca   1380

tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat   1440

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc   1500

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac   1560

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac   1620

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatga                   1665

<210>2

<211>554

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly

 1               5                   10                  15

Gly Gly His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser

                20                   25                  30

Gly Tyr Thr Pro Gly Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly

                35                   40                  45

Gln Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu

                50                   55                  60

Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys

                65                   70                  75

His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln

                80                   85                  90

Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn

                95                  100                 105

Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp

                110                 115                 120

Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp

                125                 130                 135

Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala

                140                 145                 150

Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln

                155                 160                 165

Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr

                170                 175                 180

Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His

                185                 190                 195

Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser

                200                 205                 210

Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu

                215                 220                 225

Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln

                230                 235                 240

Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu

                245                 250                 255

Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys

                260                 265                 270

Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr

                275                 280                 285

Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val

                290                 295                 300

His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser

                305                 310                 315

Val Asn Pro Gly Lys Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

                320                 325                 330

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

                335                 340                 345

Ser Val Pro Leu Pro Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

                350                 355                 360

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

                365                 370                 375

Glu Asp Pro Glu Val Lys Pro Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

                380                 385                 390

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

                395                 400                 405

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

                410                 415                 420

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

                425                 430                 435

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

                440                 445                 450

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

                455                 460                 465

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Pro Tyr

                470                 475                 480

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

                485                 490                 495

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

                500                 505                 510

Pro Pro Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

                515                 520                 525

Gln Gly Asn Val Pro Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

                530                 535                 540

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                545                 550             554

Claims (9)

1、一种融合蛋白，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO：2所示。

2、一种融合蛋白编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2的多核苷酸。

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述融合蛋白编码基因是序列表中的SEQ ID NO：1。

4、含有权利要求2所述基因的表达载体。

5、含有权利要求2所述基因的细胞系。

6、一种表达权利要求1所述融合蛋白的方法，是将含有融合蛋白编码基因的表达载体转化到SP2/0中，得到阳性克隆，培养所述阳性克隆，表达融合蛋白FP4；所述融合蛋白编码基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2的多核苷酸。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述含有融合蛋白编码基因的表达载体是将所述融合蛋白编码基因连接入表达载体pSecTag中得到的。

8、以权利要求1所述融合蛋白为活性成分的抗过敏药物。

9、权利要求1所述融合蛋白在制备抗过敏药物中的应用。

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