JP4531570B2

JP4531570B2 - 封入体結合タンパク質をコードする遺伝子（ｉｂｐＡおよび／またはｉｂｐＢ）を欠失あるいは増幅させて目的タンパク質を製造する方法

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Publication number: JP4531570B2
Application number: JP2004569376A
Authority: JP
Inventors: サンユプイ; メジュンハン; シイェパク
Original assignee: コリアアドバンスドインスティチュートオブサイエンスアンドテクノロジィ
Priority date: 2003-03-14
Filing date: 2003-07-10
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2023-07-10
Also published as: AU2003247177A1; CN1742078A; JP2006513710A; KR20040081237A; EP1604015B1; CN100591758C; EP1604015A1; US7291325B2; AU2003247177B2; KR100530988B1; EP1604015A4; US20060194277A1; WO2004081202A1

Description

本発明は、封入体関連タンパク質（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子（ｉｂｐＡおよび／またはｉｂｐＢ）を欠失あるいは増幅させて目的タンパク質を製造する方法に係り、より詳しくは、ｉｂｐＡおよび／またはｉｂｐＢを欠失させたバクテリアを用いて目的タンパク質を分泌・生産するか、あるいは、ｉｂｐＡおよび／またはｉｂｐＢが増幅されたバクテリアを用いて目的タンパク質を封入体の形で得る方法に関する。

組換えＤＮＡ技術の発展には目を見張るものがあり、そのおかげで、天然の状態では微量でしか得られなかった医薬用・産業用の有効タンパク質を細菌、酵母、カビ、動植物及び昆虫細胞で大量生産することが可能になった。しかしながら、宿主細胞で目的タンパク質を大量生産すれば、細胞はこれをストレスとして認識し、自分を保護するために多数の分子シャペロン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ）を生産することになる。分子シャペロンはほとんどが熱ショックタンパク質（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＨＳＰｓ）であり、全ての細胞に１以上ずつ存在する。

大腸菌の場合、前記ＨＳＰｓとしてＳｅｃＢ，ＤｎａＫ，ＤｎａＪ，ＧｒｐＥ，ＧｒｏＥＬ，ＧｒｏＥＳ，ＩｂｐＡ，ＩｂｐＢなどが知られており、これらは、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ合成、タンパク質の合成、折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）、再循環（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）、細胞の***と成長などに重要な役割を果たす（例えば、下記の非特許文献１参照）。大腸菌の細胞質内における最も代表的なＨＳＰｓは、ＤｎａＫ−ＤｎａＪ−ＧｒｐＥとＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳである。ＤｎａＫは変性されたタンパク質の疎水性部分に結合し、ＤｎａＪにより加水分解された後、ＧｒｐＥによりＤｎａＫが再循環されつつ天然タンパク質（ｎａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ）に復旧される。このような変性タンパク質の折り畳みは、ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳにより加速化される。

ＨＳＰｓを用いて目的タンパク質の生産性を高めようとする種々なる研究が活発になされている。今までの研究は、大きく目的タンパク質を水溶性の形で生産する方法と、不溶性の封入体として生産する方法とに大別できる。前者は、ＨＳＰｓを同時に発現させて目的タンパク質の生産性及び活性を高める方法であることを特徴とする。Ｇｏｌｏｕｂｉｎｏｆｆは、ＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳを用いて活性を有する外来リブロースビスフォスフェイトカルボキシラーゼ（ｒｉｂｕｌｏｓｅｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ；Ｒｕｂｉｓｃｏｓ）タンパク質の生産性を高めた（例えば、下記の非特許文献２参照）。さらに、ＧｅｏｒｇｉｏｕとＶａｌａｘは、ＧｒｏＥＬとＧｒｏＥＳまたはＤｎａＫとＤｎａＪをβ−ガラクトシダーゼ（b−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の生産に用いた（例えば、下記の非特許文献３参照）。Ｍｕｒｂｙは、細胞自体のタンパク質や目的タンパク質の発現と分泌（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）に必須となるタンパク質ＤｎａＫをアルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）や融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ）と共に発現させた（例えば、下記の非特許文献４参照）。

しかしながら、このようなシステムは、目的タンパク質を生産するのにいくつかの問題点を有している：（１）ＨＳＰｓタンパク質を過量で同時に発現させるため、全体のタンパク質のうちＨＳＰｓタンパク質が占める割合が大きくなり（３０−５０％）、細胞が目的タンパク質を合成できる最大限の能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を相対的に下げる；（２）２つの発現ベクターを用いるため、プラスミドの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が低下する；（３）目的タンパク質の正確な折り畳みは多数の他の分子シャペロンが互いに働くことでなされるため、１ないし２種のシャペロンでは不可能である（例えば、下記の非特許文献５参照）。最近には、このような問題点を一部補完するために、ＨＳＰｓ自体に突然変異が誘発された菌株を用いる方法が開発されている。Ｂａｎｅｙｘは、ＤｎａＫ突然変異体を用いて活性を有する目的タンパク質を２ないし４倍と増やした（例えば、下記の特許文献１参照）。

後者は、ＨＳＰｓの調節因子（ｒｐｏＨ）を欠失させた菌株を用いて目的タンパク質の生産性を高める方法であることを特徴とする。ｒｐｏＨ遺伝子（シグマ３２：σ^３２）を欠失させた菌株は、変性されたタンパク質の折り畳みと分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に関連するＨＳＰｓの合成を減らすので、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）により分解され易いタンパク質や不溶性の封入体として生産される目的タンパク質の生産に向いている。Ｅａｓｔｏｎは、ｒｐｏＨ欠失菌株を用いて細胞質内に封入体としてｂＩＧＦ２（ｂｏｖｉｎｅｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ２）を２０−２５％ほど生産した（例えば、下記の非特許文献６参照）。Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚは、新規なｒｐｏＨ欠失菌株を用いて目的タンパク質の生産性を大幅に高めた（例えば、下記の非特許文献７参照）。さらに、Ｇｏｌｄｂｅｒｇは、ｒｐｏＨとｌｏｎを欠失させた菌株を用いて目的タンパク質の分解を減らすことにより、目的タンパク質の生産性を高めた（例えば、下記の特許文献２参照）。しかしながら、これらのシステムも目的タンパク質を生産するに当たり、細胞の成長に致命的な影響を与えるという問題点がある。

今まで、ｓＨＳＰｓ（ｓｍａｌｌｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、目的タンパク質の生産に全く用いられていなかった。ｓＨＳＰｓは小さな分子量（１５−３０ｋＤａ）を有するＨＳＰｓであり、熱や目的タンパク質の過剰生産などのストレスにより誘導され、タンパク質の変性を保護する。ｓＨＳＰｓは、真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）から原核生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ）に至るまでのあらゆる生物に存在する。今まで究明されているものとしては、ヒト（Ｈｕｍａｎ）由来のｓＨＳＰｓ（ＨＳＰ２７，aＡ−，bＢ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎ）、マウス由来のＨＳＰ２５、エンドウ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ（ｐｅａ））由来のＨＳＰ１８．１、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＨＳＰ２６、ダイズ根粒菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）由来のｓＨＳＰｓ（ＨＳＰＨ，ＨＳＰＢ，ＨＳＰＣ，ＨＳＰＦ）、メタン生成菌（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）由来のＨＳＰ１６．５、シネココッカス・ブルカヌス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｖｕｌｃａｎｕｓ）由来のＨＳＰ１６、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＨＳＰ１６．３が報告されている（例えば、下記の非特許文献８参照）。

特に、組換え大腸菌で目的タンパク質を生産時、ｓＨＳＰｓに属する封入体結合タンパク質であるＩｂｐＡおよび／またはＩｂｐＢが目的タンパク質に結合されるということが報告されている（例えば、下記の非特許文献９参照）。このため、ｓＨＳＰｓに含まれるＩｂｐＡおよび／またはＩｂｐＢが生物（特に、バクテリア）からストレスにより変性されたタンパク質を保護するということは明らかな事実である。

組換え大腸菌から目的タンパク質を周辺細胞質（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）や培養液に分泌する方法は、下記のようなメリットを有している：（１）周辺細胞質や培地内には細胞質内に比べて遥かに少量のタンパク質が存在するため、所望とする目的タンパク質は高純度にて分離及び精製可能である（例えば、下記の非特許文献１０参照）；（２）周辺細胞質や培養液に分泌された目的タンパク質は、ほとんどのプロテアーゼが存在する細胞質から分離されるため、細胞質内のプロテアーゼによる分解を予防することができ、目的タンパク質の収率を高めることができる（例えば、下記の非特許文献１１参照）；（３）周辺細胞質は細胞質内よりも一層酸化が進んだ環境であるため、ジスルフィド（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）の結合が遥かに容易になされ、その結果、生産されたタンパク質の正しい折り畳みが形成されることにより、不溶性封入体の形成が顕著に低減する（例えば、下記の非特許文献１１参照）。しかしながら、分泌が全くなされないか、あるいは、分泌されたタンパク質が活性を有さない不溶性封入体を形成する場合もしばしばある。

一方、あるタンパク質は、不溶性封入体の形で得ることが有利になる場合もある。今まで、封入体の生成に関する研究が活発に行われてきているが、未だ封入体の形成に働く正確なメカニズムは知られておらず、いかなる一般的な関連性も明らかになっていないのが現状である（例えば、下記の非特許文献１３参照）。封入体の形成は宿主−ベクターシステム、タンパク質の特性、培養及び発現条件によって変わるため、所望とするシステムにおける実験を通じてのみ明らかになる。

そこで、本発明者らは、バクテリアを用いて目的タンパク質の生産性を高める菌株システムを開発するために鋭意研究した結果、大腸菌由来の封入体結合タンパク質をコードする遺伝子（ｉｂｐＡおよび／またはｉｂｐＢ）を欠失させたバクテリアを用いて目的タンパク質の分泌・生産性と活性が高められることと、大腸菌由来の封入体結合タンパク質をコーディングする遺伝子（ｉｂｐＡおよび／またはｉｂｐＢ）が増幅されたバクテリアを用いて細胞質内に生産される目的タンパク質の生産性が高められること、及び目的タンパク質が不溶性封入体の形で得られることを確かめ、本発明を完成するに至った。
ＬａＲｏｓｓａａｎｄＶａｎＤｙｋ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５，５２９−３４，１９９１Ｇｏｌｏｕｂｉｎｏｆｆｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，４４−７，１９８９ＧｅｏｒｇｉｏｕａｎｄＶａｌａｘ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７，１９０−７，１９９６Ｍｕｒｂｙｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４，３３６−４６，１９９１Ｌａｎｇｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５６，６８３−９，１９９２Ｅａｓｔｏｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０１，２９１−５，１９９１Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８，１５１１−２３，１９９２ＳｔｕｄｅｒａｎｄＮａｒｂｅｒｈａｕｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，３７２１２−８，２０００Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，６９３８−４７，１９９２Ｎｏｓｓａｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１，３０５５−６２，１９６６ＭｅｅｒｍａｎａｎｄＧｅｏｒｇｉｏｕ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７２１，２９２−３０２，１９９４Ｈｏｃｋｎｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ，１２，４５６−６３，１９９４Ｍａｋｒｉｄｅｓ，ＳＣ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６０，５１２−３８，１９９６ＵＳ５，５５２，３０１ＵＳ４，７５８，５１２

本発明の目的は、目的タンパク質を効率よく分泌・生産するためにｉｂｐＡおよび／またはｉｂｐＢ遺伝子を欠失させたバクテリア及びこのバクテリアを培養することを特徴とする目的タンパク質の分泌・生産方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、ｉｂｐＡおよび／またはｉｂｐＢ遺伝子が増幅されたバクテリア及びこのバクテリアを培養することを特徴とする目的タンパク質を不溶性封入体の形で得る方法を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ遺伝子が欠乏されたバクテリア及びこのバクテリアを培養することを特徴とする目的タンパク質の分泌・生産方法を提供する。

本発明において、好ましくは、前記バクテリアは大腸菌である。また、前記バクテリアは、目的タンパク質をコードする遺伝子を含有し、シグナル配列をさらに含有することを特徴とすることができる。

また、本発明は、バクテリアにおいてｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ遺伝子を増幅させる機能を有するプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ，ｐＡＣＩｂｐＡＢ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡまたはｐＡＣＴａｃＩｂｐＢを提供する。

さらに、本発明は、ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ遺伝子が増幅されたバクテリア及びこのバクテリアを培養することを特徴とする目的タンパク質を不溶性封入体の形で製造する方法を提供する。

より具体的には、前記プラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ，ｐＡＣＩｂｐＡＢ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡまたはｐＡＣＴａｃＩｂｐＢに形質転換してｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ遺伝子を増幅させたバクテリアを提供する。

本発明において、好ましくは、前記バクテリアは大腸菌である。また、前記バクテリアは、目的タンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とする。さらに、ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ遺伝子を増幅させることにより、水溶性の形で生産されていた目的タンパク質を不溶性封入体の形で生産することが可能になる。前記封入体の形の目的タンパク質は細胞質内に蓄積される。

さらに、本発明は、ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ遺伝子を増幅または欠失させて目的タンパク質の生成方式を水溶性または不溶性に調節する方法を提供する。

今までは、ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ遺伝子が目的タンパク質の生産に及ぼす影響についてほとんど報告されておらず、目的タンパク質の生産に全く用いられていなかった。本発明においては、大腸菌由来の封入体結合タンパク質をコードする遺伝子（ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ）を欠失させたバクテリアを用いて目的タンパク質の分泌・生産及び活性を高めている。併せて、大腸菌由来の封入体結合タンパク質をコードする遺伝子（ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ）を増幅させたバクテリアを用いて細胞質内に生産される目的タンパク質の生産性を高めると共に、目的タンパク質を不溶性封入体の形で生産している。

本発明によれば、封入体の形成を所望の通りに操作可能であるため、医薬用・産業用の有効タンパク質の工程システムとタンパク質の特性によって、下記のような多数のメリットを得ることができる：（１）ベクターの製作及び培養条件が単純であり、細胞の高濃度培養などの方法により大量生産が可能である（Ｌｅｅ，ＳＹ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，９８−１０５，１９９６）；（２）培養後に菌体の回収及び破壊を経て低速遠心分離により普通８０−９８％の純度に精製されるので、初期の分離段階において１−３０％の純度しか得られなかった水溶性タンパク質と比較したとき、分離が遥かに容易になる（ＪｅｏｎｇａｎｄＬｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６５，３０２７−３２，１９９９）；（３）細胞内のプロテアーゼに敏感なために分解が起こるタンパク質の場合、封入体の形成によりプロテアーゼの攻撃から保護可能である（ＫａｎｅａｎｄＨａｒｔｌｅｙ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６，９５−１０１，１９８８）。さらに、封入体の溶解（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）と再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）過程が実験によってきちんと定立されているため、水溶性の形よりは封入体の形で得た方が一層優れた生産システムになりうる（Ｄｅｎｅｆｌｅｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，５６，６１−７０，１９８７；Ｓａｉｔｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１２８１−８８，１９８７；Ｇｉｌｌｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３，６４３−６，１９８５；ＷｅｉｒａｎｄＳｐａｒｋｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２４５，８５−９１，１９８７）。

プラスミドｐＳＫＩｂｐＡＢＫｍの遺伝子マップである。ｉｂｐＡ’はｓｉｂｐＡ遺伝子の以前の５’から５００ｂｐ、ｉｂｐＢ’はｉｂｐＢ遺伝子の３’から５００ｂｐを示す。プラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡの遺伝子マップである。プラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＢの遺伝子マップである。プラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢの遺伝子マップである。プラスミドｐＡＣＩｂｐＡＢの遺伝子マップである。プラスミドｐＴａｃ９９ＧＦＰの遺伝子マップである。プラスミドｐ２２３−３ＩＦＮ−γの遺伝子マップである。プラスミドｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０の遺伝子マップである。組換えプラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０からの誘導発現後４時間が経過した後に得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上おいて分析した結果を示す電気泳動写真である。組換えプラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された組換え大腸菌ＷＩｂｐＡとＷＩｂｐＢから得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。組換えプラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された組換え大腸菌ＷＩＢ１０１からの誘導発現後４時間が経過した後に得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。組換えプラスミドｐＴｒｃＳＯｂ４で形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０とＷＩＢ１０１からの誘導発現後４時間が経過した後に得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。プラスミドｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０，ＷＩｂｐＡ，ＷｉｂｐＢ及びＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＢまたはｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ）とｐＹＫＭ−Ｉ_１で同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢまたはｐＡＣＩｂｐＡＢ）とｐＹＫＭ−Ｉ_１に同時で形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０とＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢまたはｐＡＣＩｂｐＡＢ）とｐ２２３−３ＩＦＮ−γで同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０とＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢまたはｐＡＣＩｂｐＡＢ）とｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０で同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０とＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢまたはｐＡＣＩｂｐＡＢ）とｐＴａｃ９９ＧＦＰで同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０とＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍまたはｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ）とｐＴａｃ９９ＧＦＰで同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ）由来ＧＦＰの緑色蛍光の明るさを測定して示す結果である。

発明の詳細な説明

以下、実施例を挙げて本発明を詳述する。しかし、これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲がこれらの実施例に何ら限定されないということは当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。

《実施例１》ｉｂｐＡ，ｉｂｐＢまたはｉｂｐＡＢ遺伝子を欠失させた大腸菌の製造
大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ３９９３６）の染色体ＤＮＡをサムブルーク等の方法により分離・精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）。大腸菌Ｗ３１１０を５００ｍｌのＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉｍｅｄｉｕｍ）において２４時間をかけて培養した。初期の対数成長期の菌株を遠心分離により回収した後、１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＳｉｇｍａＣｏ．，ＵＳＡ）が含まれているＴＥ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ；ｐＨ７．６）５０ｍｌに懸濁した。前記菌株懸濁液を２４時間をかけて徐々に攪拌しつつ常温において培養した。

菌株の破砕とタンパク質の除去のために、前記培養液に１０％のＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）溶液１６ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ，ＳｉｇｍａＣｏ．，ＵＳＡ）５７０μｌを加え、３７°Ｃで１時間をかけて反応させた。次いで、５ＭＮａＣｌ溶液１４ｍｌと０．７ＭＮａＣｌ溶液に溶解されている１０％のＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＳｉｇｍａＣｏ．，ＵＳＡ）１０．６６ｍｌを加えた後、６５°Ｃで１０分をかけて反応させた。その後、前記反応液と同じ体積を有するクロロホルム-イソアミルアルコール（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ＝２４：１）を加え、常温で２時間をかけて注意深く混合した。前記混合液を６，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上澄み液をビーカに移し、ここに２倍の体積を有する冷却エタノールを徐々に加えて染色体ＤＮＡを沈殿させた後、ガラス棒を用いてＤＮＡを巻き上げた。前記ガラス棒を自然乾燥させてエタノールを除去し、１ｍｌのＴＥ溶液にＤＮＡを溶解させた。前記ＤＮＡ溶液にＲＮａｓｅ（ＳｉｇｍａＣｏ．，ＵＳＡ）を最終濃度が５０ｇ／ｍｌになるように加え、３７°Ｃで１時間をかけて反応させた。

反応が終わった後、前記反応液と同じ体積を有するクロロホルム-イソアミルアルコール（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ：ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ＝２４：１）をさらに加え、常温で２時間をかけて注意深く混合した。前記混合液を６，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上澄み液をビーカに移し、ここに２倍の体積を有する冷却エタノールを徐々に加えて染色体ＤＮＡを沈殿させた後、ガラス棒を用いてＤＮＡを巻き上げた。前記ガラス棒を自然乾燥させてエタノールを除去し、最終的に１ｍｌのＴＥ溶液に精製された大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを溶解させた。

大腸菌からｉｂｐＡ，ｉｂｐＢまたはｉｂｐＡＢ遺伝子を除去するために、バクテリオファージlのレッド・オペロン（ｏｐｅｒｏｎ）を用いた（ＪｅｏｎｇａｎｄＬｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８，４９７９−８５，２００２）。相同性組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を用いた突然変異の製作のために、バクテリオファージlのレッド・オペロンが含有されているｐＴｒｃＥＢＧに大腸菌Ｗ３１１０を形質転換した後、１ｍＭＩＰＴＧを加えて形質転換されたＷ３１１０（ｐＴｒｃＥＢＧ）からレッド・オペロンの発現を誘導した。この大腸菌を用いてエレクトロポレーションコンピテント細胞（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌ）を製作した。

同種組換えを用いた突然変異の製作のために、大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１と２のプライマーを用いてｉｂｐＡＢ遺伝子のプロモータ部分を含有している５００ｂｐと、配列番号３と４のプライマーを用いてｉｂｐＡＢ遺伝子の３’末端基から５００ｂｐを増幅させてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）の制限酵素ＮｏｔＩとＸｂａＩの認識部位及び制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩの認識部位にそれぞれ挿入し、配列番号５と６のプライマーを用いてカナマイシン抵抗遺伝子６００ｂｐを増幅させて上記の方法により製造されたプラスミドの中間となる制限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＩの認識部位に挿入することにより、プラスミドｐＳＫＩｂｐＡＢＫｍを得た（図１）。

前記プラスミドｐＳＫＩｂｐＡＢＫｍを鋳型とし、配列番号１と４のプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物を前記製造されたエレクトロポレーションコンピテント細胞に挿入することにより、ｉｂｐＡＢ遺伝子を除去した。ｉｂｐＡＢが除去された突然変異大腸菌をＷＩＢ１０１と名付けた。ＷＩＢ１０１菌株から染色体を分離し、染色体内のｉｂｐＡＢ遺伝子の位置にカナマイシン遺伝子が挿入されているかどうかを配列番号５と６のプライマーを用いてＰＣＲ方法により確かめた。

さらに、ｉｂｐＡまたはｉｂｐＢ遺伝子が突然変異された大腸菌を得るために、ｉｂｐＡまたはｉｂｐＢ遺伝子の５’末端から６０ｂｐ、３’末端から６０ｂｐずつを含有しているカナマイシン抵抗遺伝子をそれぞれ配列番号７と８、配列番号９と１０のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより増幅させた。増幅したＰＣＲ産物を前記のようにして製造されたエレクトロポレーションコンピテント細胞に挿入することにより、ｉｂｐＡまたはｉｂｐＢ遺伝子を除去した。ｉｂｐＡまたはｉｂｐＢが除去された突然変異大腸菌をそれぞれＷＩｂｐＡ，ＷＩｂｐＢと名付けた。

全てのＰＣＲにおいて、最初の変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）は９５°Ｃで５分間１回、２回目の変性は９５°Ｃで５０秒間、アニール（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）は５５°Ｃで１分間、そして延長（ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）は７２°Ｃで１分３０秒間行った。また、これらの過程を３０回繰り返し行い、その後、７２°Ｃで５分間最後の延長を１回行った。

５’−ａｔａａｇａａｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃａｇｃｔｇｔｇｇａｔｃａｃｃｇａａａｃｔｇａｔ−３’（配列番号１）
５’−ｇｃｔｃｔａｇａｔｇｃａｔａｇａｃｔｇａｇｇｇｇｇｃａｇｃａ−３’（配列番号２）
５’−ｇｇａａｔｔｃｔｔｔｃｇａｃｔｇｔｔｔａａｇａｔａｔｔｔｃｇｇ−３’（配列番号３）
５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｇｇａｇａａａａｔｃｃｃｃａｇｃａｃｔａｃｃｇｇ−３’（配列番号４）
５’−ｇｃｔｃｔａｇａｇｃｃａｃｇｔｔｇｔｇｔｃｔｃａａａ−３’（配列番号５）
５’−ｃｇａａｔｔｃｔｔａｇａａａａａｃｔｃａｔｃｇａｇｃａ−３’（配列番号６）
５’−ａｔｇｃｇｔａａｃｔｔｔｇａｔｔｔａｔｃｃｃｃｇｃｔｔｔａｃｃｇｔｔｃｔｇｃｔａｔｔｇｇａｔｔｔｇａｃｃｇｔｔｔｇｔｔｔｇｃｃａｃｇｔｔｇｔｇｔｃｔｃａａａａｔｃｔｃ−３’（配列番号７）
５’−ｔｔａｇｔｔｇａｔｔｔｃｇａｔａｃｇｇｃｇｃｇｇｔｔｔｔｔｔｃｇｃｔｔｃｃｇｇａａｔｃａｃｇｃｇｔｔｃｇａｇａｔｃｇａｔｔｔａｇａａａａａｃｔｃａｔｃｇａｇｃａ−３’（配列番号８）
５’−ａｔｇｃｇｔａａｃｔｔｃｇａｔｔｔａｔｃｃｃｃａｃｔｇａｔｇｃｇｔｃａａｔｇｇａｔｃｇｇｔｔｔｔｇａｃａａａｃｔｇｇｃｃｇｃｃａｃｇｔｔｇｔｇｔｃｔｃａａａａｔｃｔｃ−３’（配列番号９）
５’−ｔｔａｇｃｔａｔｔｔａａｃｇｃｇｇｇａｃｇｔｔｃｇｃｔｇａｔａｇｃｇａｔａｃｇｃｔｇｃｇｃｔｇｃｇａｔｇｇｇｔｔｃａｇｇｔｔａｇａａａａａｃｔｃａｔｃｇａｇｃａ−３’（配列番号１０）

《実施例２》ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ遺伝子を導入した組換えプラスミドの製造
ＩｂｐＡとＩｂｐＢタンパク質を発現させるために、下記のようにして組換えプラスミドを製作した。

大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、それぞれ配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、配列番号１５と１６のプライマーを用いて実施例１の方法と同様にしてＰＣＲを行い、ｉｂｐＡ，ｉｂｐＢ及びｉｂｐＡＢ遺伝子を得た。得られたｉｂｐＡ，ｉｂｐＢ及びｉｂｐＡＢ遺伝子をそれぞれＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩに切断された組換えプラスミドｐＴａｃ９９Ａに挿入することにより、それぞれプラスミドｐＴａｃ９９ＩｂｐＡ，ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢ及びｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＢを製作した。組換えプラスミドｐＴａｃ９９Ａは、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のｔｒｃプロモータをｐＫＫ２２３−３（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のｔａｃプロモータに切り換えたプラスミドである。前記切り換えられたプラスミドは、ｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモータを制限酵素ＰｖｕＩＩとＥｃｏＲＩにより処理して得た後、ｔａｃプロモータの遺伝子断片を同じ制限酵素で切断されたｐＴｒｃ９９Ａに挿入することにより得られた。

それぞれの前記プラスミドｐＴａｃ９９ＩｂｐＡ，ｐＴａｃ９９ＩｂｐＢ及びｐＴａｃ９９ＩｂｐＡＢを制限酵素ＳｓｐＩで切断して制限酵素ＤｒａＩとＰｖｕＩＩで切断されたプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）に挿入し、それぞれプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＢ及びｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢを製作した（図２ないし図４）。

ｉｂｐＡＢ遺伝子をセルフプロモータを用いて発現させるために、大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、それぞれ配列番号１７と１８のプライマーを用いて実施例１の方法と同様にしてＰＣＲを行うことにより、ｉｂｐＡＢプロモータとｉｂｐＡＢ遺伝子を含むＰＣＲ産物を得た。得られた遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩに切断し、同じ酵素に切断されたｐＡＣＹＣ１８４（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）に挿入することにより、プラスミドｐＡＣＩｂｐＡＢを製作した（図５）。

５’−ｇｇａａｔｔｃａｔｇｃｇｔａａｃｔｔｔｇａｔｔｔａｔｃｃｃ−３’（配列番号１１）
５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｔｔａｇｔｔｇａｔｔｔｃｇａｔａｃｇｇｃｇｃ−３’（配列番号１２）
５’−ｇｇａａｔｔｃａｔｇｃｇｔａａｃｔｔｃｇａｔｔｔａｔｃｃｃｃａｃｔｇ−３’（配列番号１３）
５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｔｔａｇｃｔａｔｔｔａａｃｇｃｇｇｇａｃｇｔｔｃｇｃｔ−３’（配列番号１４）
５’−ｇｇａａｔｔｃａｔｇｃｇｔａａｃｔｔｔｇａｔｔｔａｔｃｃｃ−３’（配列番号１５）
５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｔｔａｇｃｔａｔｔｔａａｃｇｃｇｇｇａｃｇｔｔｃｇｃｔ−３’（配列番号１６）
５’−ｇｇａａｔｔｃｃａｇｃｔｇｔｇｇａｔｃａｃｃｇａａａｃｔｇ−３’（配列番号１７）
５’−ｇｇａａｔｔｃａｇａａｃｇｔｇｃｃｇａａａｔａｔｃｔｔａ−３’（配列番号１８）

《実施例３》目的タンパク質の遺伝子を導入した組換えプラスミドの製造
オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰ（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させるために、ｇｆｐ_ｕｖ遺伝子を含むプラスミドｐＧＦＰ_ｕｖ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を鋳型とし、配列番号１９と２０のプライマーを用いて実施例１の方法と同様にしてＰＣＲを行うことにより、ＧＦＰ遺伝子を得た。得られたＧＦＰ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じ酵素で切断されたｐＴａｃ９９Ａに挿入することにより、プラスミドｐＴａｃ９９ＧＦＰを製作した（図６）。

ＩＮＦ−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）タンパク質を発現させるために、サイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）バンク（ｈｔｔｐ：／／ｃｙｔｏｋｉｎｅ．ｃｈｏｎｂｕｋ．ａｃ．ｋｒ／）から分譲されたヒト由来のＩＮＦ−γ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１８／ＩＦＮ−γを鋳型とし、配列番号２１と２２のプライマーを用いて実施例１の方法と同様にしてＰＣＲを行うことにより、ＩＮＦ−γ遺伝子を得た。得られたＩＮＦ−γ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じ酵素で切断されたｐＫＫ２２３−３（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に挿入することにより、プラスミドｐ２２３−３ＩＦＮ−γを製作した（図７）。

ヒト由来のインターロイキン１２ベータ鎖（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１２ β ｃｈａｉｎ：ＩＬ−１２ｐ４０）タンパク質を発現させるために、サイトカインバンク（ｈｔｔｐ：／／ｃｙｔｏｋｉｎｅ．ｃｈｏｎｂｕｋ．ａｃ．ｋｒ／）から分譲されたヒト由来のインターロイキンベータ鎖遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ１８／ｐ４０を鋳型とし、配列番号１９と２０のプライマーを用いて実施例１の方法と同様にしてＰＣＲを行うことにより、ＩＬ−１２ｐ４０遺伝子を得た。得られたＩＬ−１２ｐ４０遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同じ酵素で切断されたｐＴａｃ９９Ａに挿入することにより、プラスミドｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０を製作した（図８）。

５’−ｇｇａａｔｔｃａｔｇａｇｔａａａｇｇａｇａａｇａａｃｔｔｔ−３’（配列番号１９）
５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｔｔａｔｔｔｇａｔｇａｇｃｔｃａｔｃｃ−３’（配列番号２０）
５’−ｇｇａａｔｔｃａｔｇｔｇｔｔａｃｔｇｃｃａｇｇａｃｃｃａｔａｔ−３’（配列番号２１）
５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｔｔａｃｔｇｇｇａｔｇｃｔｃｔｔｃｇａｃｃ−３’（配列番号２２）

《実施例４》ｉｂｐＡＢ遺伝子を欠失させた大腸菌からの大腸菌由来のアルカリフォスファターゼタンパク質の分泌・生産
既存のアルカリフォスファターゼ発現プラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡ（Ｃｈｏｉｅｔａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６４０−５，２０００）を用いて前記実施例１に従い製造された大腸菌ＷＩｂｐＡ，ＷＩｂｐＢ，ＷＩＢ１０１と母菌株Ｗ３１１０をそれぞれ形質転換した。カナマイシンとアンピシリンが両方ともに加えられたＬＢ平板培地、またはアンピシリンのみ加えられたＬＢ平板培地においてそれぞれの形質転換菌株を選別した。それぞれの組換え大腸菌をＬＢ培地（３７°Ｃ）において培養した。アルカリフォスファターゼタンパク質の発現は、分光光度計により６００ｎｍ波長で測定された光学密度（Ｏ．Ｄ．）が０．７となる時点で、１ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を加えることにより誘導した。誘導発現後４時間が経過した後に培養液を１ｍｌずつ取り、全体タンパク質、水溶性タンパク質、不溶性タンパク質、周辺細胞質タンパク質及び細胞質タンパク質にそれぞれ分画し、同時に培養液を０．１ｍｌずつ取ってアルカリフォスファターゼの活性を測定した。

全体タンパク質、水溶性タンパク質、不溶性タンパク質、周辺細胞質タンパク質及び細胞質タンパク質には、下記のようにしてそれぞれ分画した：全体タンパク質は培養液１ｍｌを４°Ｃで６，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して得た沈殿物を０．５ｍｌのＴＥ溶液により１回洗浄した後、さらに４°Ｃで６，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して沈殿物を得、これを０．２ｍｌのＴＥ溶液に懸濁して超音波破砕することにより分画した。前記全体タンパク質を４°Ｃで１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上澄み液を水溶性タンパク質とし、沈殿物を不溶性封入体とした。

周辺細胞質タンパク質及び細胞質タンパク質を分画するために、培養液１ｍｌを４°Ｃで６，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して得られた沈殿物に２０％のサッカロースを含む３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を０．４ｍｌほど入れて十分に混ぜた後、１ｍＭＥＤＴＡを加えて約１０分間常温で攪拌した。次いで、さらに４°Ｃで１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して沈殿物を得、冷たい５ｍＭＭｇＳＯ_４溶液を０．４ｍｌほど入れて注意深く混ぜた後、氷中で約１０分間攪拌し、その後、４°Ｃで１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して上澄み液及び沈殿物をそれぞれ取った。このとき、上澄み液は細胞の周辺細胞質にあるタンパク質とし、沈殿物は０．２ｍｌのＴＥ緩衝溶液に懸濁し、且つ、超音波破砕して細胞質タンパク質とした（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９８９）。

このようにして得られたタンパク質含有溶液を２００μｌずつ取り、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル溶液（２５％のグリセロール、２％のＳＤＳ、１４．４ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．１％のブロモフェノールブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌｂｌｕｅ）、６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）５０μｌと混合して１０分間沸騰した後、これを１２％分離用ゲル（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇｇｅｌ）においてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った。次いで、ゲルを染色溶液（メタノール４０％、酢酸１０％、０．２５ｇ／ＬクマシーブリリアントブルーＲ（ＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅＲ））に２時間以上担漬して染色を行い、さらに脱色溶液（４０％のメタノール、７％の酢酸）に２時間以上ずつ２回担漬して脱色を行った（図９）。

図９は、組換えプラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図９において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１ないし５は誘導発現後４時間が経過した後に形質転換菌株から得られた全体タンパク質、水溶性タンパク質、不溶性タンパク質、周辺細胞質タンパク質及び細胞質タンパク質をそれぞれ示す。さらに、矢印（←）は分泌されたアルカリフォスファターゼタンパク質を示す。

図９に示すように、大腸菌Ｗ３１１０内においてアルカリフォスファターゼのほとんどは不溶性封入体の形で存在し、このタンパク質に対してＮ−末端塩基配列（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）分析を行った結果、分泌信号配列が切断されていない形であって、周辺細胞質に分泌されなかった。併せて、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果はデンシトメータを用いたタンパク質の定量に用いられ、全体タンパク質のうちアルカリフォスファターゼが占める割合は約１５％であった。

図１０は、組換えプラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された組換え大腸菌ＷＩｂｐＡとＷＩｂｐＢから得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図１０において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１ないし３は誘導発現後４時間が経過した後に形質転換菌株ＷＩｂｐＡから得られた全体タンパク質、水溶性タンパク質、不溶性タンパク質をそれぞれ示す。そして、レーン４ないし６は誘導発現後４時間が経過した後に形質転換菌株ＷＩｂｐＢから得られた全体タンパク質、水溶性タンパク質、不溶性タンパク質をそれぞれ示す。さらに、矢印（←）は分泌されたアルカリフォスファターゼタンパク質を示す。

図１０に示すように、大腸菌ＷＩｂｐＡとＷＩｂｐＢ内においてアルカリフォスファターゼのほとんどは不溶性封入体の形で存在し、このタンパク質に対してＮ−末端塩基配列分析を行った結果、シグナル配列が切断されていない形であって、周辺細胞質に分泌されなかった。

図１１は、組換えプラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された組換え大腸菌ＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図１１において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１ないし５は誘導発現後４時間が経過した後に形質転換菌株から得られた全体タンパク質、水溶性タンパク質、不溶性タンパク質、周辺細胞質タンパク質及び細胞質タンパク質をそれぞれ示す。さらに、矢印（¬）は分泌されたアルカリフォスファターゼタンパク質を示す。

図１１に示すように、大腸菌ＷＩＢ１０１内において分泌作用が起こった後、シグナル配列が切断されたアルカリフォスファターゼのほとんどは水溶性アルカリフォスファターゼの形で存在しており、周辺細胞質タンパク質に含まれた水溶性アルカリフォスファターゼの量は相対的に高いということが分かった。併せて、前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果はデンシトメータを用いたタンパク質の定量に用いられ、全体タンパク質のうち分泌されたアルカリフォスファターゼが占める割合は約３０％であって、ほとんど周辺細胞質として分泌されていた。

分泌されたアルカリフォスファターゼの活性は下記のような方法により測定した（ＢｒｉｃｋｍａｎａｎｄＢｅｃｋｗｉｔｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９６，３０７−１６，１９７５）。上記において得られた大腸菌は５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液１ｍｌに懸濁し、ここにクロロホルム０．１ｍｌを加えた後に３７°Ｃにおいて５分間反応させた。次いで、０．４％のＰＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）０．１ｍｌを加えてさらに３７°Ｃにおいて５分間反応させた後、１ＭＫ_２ＨＰＯ_４溶液０．１ｍｌにより反応を止め、１２，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して上澄み液のみを取った。この上澄み液を５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液により希釈し、分光光度計を使って４２０ｎｍと５５０ｎｍの二つの波長における吸光度を測定した。アルカリフォスファターゼの活性度（Ｕ／ｍｌ）は下記のような計算式により算出され、その結果を下記表１に示す：

数式１

表１において、対照区はプラスミドｐＪＳ１０１ΔＰで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、ＷＩｂｐＡ、ＷＩｂｐＢ及びＷＩＢ１０１の培養液を上述したような方法により処理して測定したアルカリフォスファターゼの活性とした。

前記表１に示すように、プラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１のアルカリフォスファターゼが、プラスミドｐＴｒｃＳ１ＰｈｏＡで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０，ＷＩｂｐＡ及びＷＩｂｐＢよりもほとんど３倍以上高い活性を示し、対照区となるプラスミドｐＪＳ１０１ΔＰで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０，ＷＩｂｐＡ，ＷＩｂｐＢ及びＷＩＢ１０１はほとんど活性を示さなかった。これより、アルカリフォスファターゼは細胞内においては活性を有することができず、必ず周辺細胞質に分泌されて初めて活性を有するという点を考慮した時、形質転換された組換え大腸菌ＷＩＢ１０１で生産されたアルカリフォスファターゼは周辺細胞質に成功的に分泌されていることが分かった。

しかしながら、形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０，ＷＩｂｐＡ及びＷＩｂｐＢにおいては、生産されたアルカリフォスファターゼが周辺細胞質に分泌できず、細胞質において不溶性封入体として形成された。これより、形質転換された組換え大腸菌ＷＩＢ１０１においては、アルカリフォスファターゼがほとんど全ての水溶性の形で存在し、活性も遥かに高いということが確かめられた。さらに、形質転換された組換え大腸菌ＷＩＢ１０１の細胞濃度が形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０に比べて２倍以上高いので、実際には同一時間でアルカリフォスファターゼの活性が６倍以上高く現れる。これより、ｉｂｐＡＢを欠失させた大腸菌ＷＩＢ１０１は水溶性及び活性を有するアルカリフォスファターゼタンパク質の分泌・生産に有効な菌株であることが確認できた。

《実施例５》ｉｂｐＡＢ遺伝子を欠失させた大腸菌からのヒト由来レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）の分泌・生産
既存のレプチン発現プラスミドｐＴｒｃＳＯｂ４（ＪｅｏｎｇａｎｄＬｅｅ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７，３９８−４０７，２０００）で前記実施例１に従い製造された大腸菌ＷＩＢ１０１と母菌株Ｗ３１１０をそれぞれ形質転換した。次いで、前記実施例４の方法と同様に細胞培養を行った。レプチンタンパク質の発現は、分光光度計を用いて６００ｎｍの波長で測定した吸光度が０．７となる時点で、１ｍＭのＩＰＴＧを加えることにより誘導した。誘導発現後４時間が経過した後に培養液を１ｍｌずつ取り、前記実施例４の方法と同様にして全体タンパク質、水溶性タンパク質及び封入体タンパク質にそれぞれ分画した（図１２）。

図１２は、組換えプラスミドｐＴｒｃＳＯｂ４で形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０とＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図１２において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１ないし３は誘導発現後４時間が経過した後で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０から得られた全体タンパク質、水溶性タンパク質及び不溶性封入体をそれぞれ示す。そして、レーン４ないし６は誘導発現後４時間が経過した後で形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１から得られた全体タンパク質、水溶性タンパク質及び不溶性封入体をそれぞれ示す。さらに、矢印（←）は分泌されたヒト由来レプチンタンパク質を示す。

図１２に示すように、形質転換された大腸菌Ｗ３１１０においては全体レプチンタンパク質の約５０％が不溶性封入体を形成するのに対し、形質転換大腸菌ＷＩＢ１０１においては形成された全てのレプチンタンパク質がほとんど水溶性の形で存在するということが確認できる。さらに、形質転換された組換え大腸菌ＷＩＢ１０１の細胞濃度が形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０に比べて３倍ほど高いので、実際には、同一時間で水溶性レプチンの濃度は３倍以上高く現れる。これより、ｉｂｐＡＢを欠失させた大腸菌ＷＩＢ１０１は、水溶性レプチンタンパク質の分泌・生産に有効な菌株であることが確認できた。

《実施例６》ＩｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ発現システムによる細胞質内へのＩＧＦ−Ｉ（ｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ−Ｉ）タンパク質の生産
前記実施例１に従い製造された大腸菌ＷＩＢ１０１，ＷＩｂｐＡ，ＷＩｂｐＢと母菌株Ｗ３１１０を既存のＩＧＦ−Ｉ発現プラスミドｐＹＫＭ−Ｉ_１（ＫｉｍａｎｄＬｅｅ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８，９７−１０５，１９９６）でそれぞれ形質転換した。細胞の培養は、前記実施例４の方法と同様にして行った。ヒト由来ＩＧＦ−Ｉタンパク質の発現は、分光光度計を用いて６００ｎｍの波長において測定した吸光度（Ｏ．Ｄ．）が０．７となる時点で、１ｍＭのＩＰＴＧを加えることにより誘導した。ヒト由来ＩＧＦ−Ｉタンパク質の誘導発現後４時間が経過した後に培養液を集めて遠心分離器により回収した後、各形質転換菌株のヒト由来ＩＧＦ−Ｉタンパク質を実施例４の方法と同様にして全体タンパク質に分画した（図１３）。

図１３は、プラスミドｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０，ＷＩｂｐＡ，ＷＩｂｐＢ，ＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図１３において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１はｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン２はｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌ＷＩｂｐＡ、レーン３はｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌ＷＩｂｐＢ、レーン４はｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１の全体タンパク質をそれぞれ分画した結果を示す。さらに、矢印（←）はヒト由来ＩＧＦ−Ｉタンパク質を示す。

図１３に示すように、大腸菌Ｗ３１１０，ＷＩｂｐＡ，ＷＩｂｐＢにヒト由来ＩＧＦ−Ｉタンパク質がほとんど同量にて発現されるのに対し、ｉｂｐＡＢが両方ともに欠失した大腸菌ＷＩＢ１０１においては、細胞質内に生産される目的タンパク質を発見することができなかった。これより、目的タンパク質の生産に当たっては、ＩｂｐＡまたはＩｂｐＢタンパク質が必ず必要となるということが確認できた。

さらに、前記実施例２に従い製造されたそれぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＢ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ，ｐＡＣＩｂｐＡＢ）と既存のＩＧＦ−Ｉ発現プラスミドｐＹＫＭ−Ｉ_１で前記実施例１に従い製造された大腸菌ＷＩＢ１０１と母菌株Ｗ３１１０を同時に形質転換した。細胞の培養とヒト由来ＩＧＦ−Ｉタンパク質の誘導は、上述した方法と同様にして行った。

図１４は、それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＢまたはｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ）とｐＹＫＭ−Ｉ_１で同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図１４において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１は組換えプラスミドｐ１８４ΔＣｍとｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン２は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢとｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン３は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡとｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン４は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＢとｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０の全体タンパク質をそれぞれ分画した結果を示す。さらに、矢印（←）はヒト由来ＩＧＦ−Ｉタンパク質を示す。

図１５は、それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢまたはｐＡＣＩｂｐＡＢ）とｐＹＫＭ−Ｉ_１で同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０とＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図１５において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１は組換えプラスミドｐ１８４ΔＣｍとｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン２は組換えプラスミドｐ１８４ΔＣｍとｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１、レーン３は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢとｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン４は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢとｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１、レーン５は組換えプラスミドｐＡＣＩｂｐＡＢとｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン６は組換えプラスミドｐＡＣＩｂｐＡＢとｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１の全体タンパク質をそれぞれ分画した結果を示す。さらに、矢印（←）はヒト由来ＩＧＦ−Ｉタンパク質を示す。

図１４と図１５に示すように、大腸菌Ｗ３１１０にｉｂｐＡ，ｉｂｐＢまたはｉｂｐＡＢを同時に発現させることにより、ヒト由来ＩＧＦ−Ｉタンパク質が対照区（ｐＹＫＭ−Ｉ_１で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０）よりも約２倍ほど増えていることが確認できた。さらに、ｉｂｐＡＢを欠失させた大腸菌ＷＩＢ１０１においては、細胞質内に生産される目的タンパク質を発見することができなかった。

これより、細胞質内に生産される目的タンパク質の場合、ｉｂｐＡ，ｉｂｐＢまたはｉｂｐＡＢが目的タンパク質の生産性を高めるということが確認できた。本発明において、細胞質内に生成される他の目的タンパク質の適用有無を確認するために、ｉｂｐＡＢ（ｐＡＣＴａｃｉｂｐＡＢとｐＡＣｉｂｐＡＢ）のみをもってさらなる実験を行った。

《実施例７》ＩｂｐＡＢ発現システムによる細胞質内へのヒト由来ＩＦＮ−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）の生産
前記実施例２に従い製造されたそれぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ，ｐＡＣＩｂｐＡＢ）と実施例３に従い製造したヒト由来インターフェロン・ガンマタンパク質のプラスミドｐ２２３−３ＩＦＮ−γで前記実施例１に従い製造された大腸菌ＷＩＢ１０１、母菌株Ｗ３１１０を同時に形質転換した。細胞の培養は、前記実施例４の方法と同様にして行った。ヒト由来インターフェロン・ガンマタンパク質の発現は、分光光度計を用いて６００ｎｍの波長で測定した吸光度が０．７となる時点で、１ｍＭのＩＰＴＧを加えることにより誘導した。ヒト由来インターフェロン・ガンマタンパク質の誘導発現後４時間が経過した後に培養液を集めて遠心分離器により回収した後、各形質転換菌株のヒト由来インターフェロン・ガンマタンパク質を実施例４の方法と同様にして全体タンパク質に分画した（図１６）。

図１６は、それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢまたはｐＡＣＩｂｐＡＢ）とｐ２２３−３ＩＦＮ−γで同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０とＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図１６において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１は組換えプラスミドｐ１８４ΔＣｍとｐ２２３−３ＩＦＮ−γで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン２は組換えプラスミドｐ１８４ΔＣｍとｐ２２３−３ＩＦＮ−γで形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１、レーン３は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢとｐ２２３−３ＩＦＮ−γで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン４は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢとｐ２２３−３ＩＦＮ−γで形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１、レーン５は組換えプラスミドｐＡＣＩｂｐＡＢとｐ２２３−３ＩＦＮ−γで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン６は組換えプラスミドｐＡＣＩｂｐＡＢとｐ２２３−３ＩＦＮ−γで形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１の全体タンパク質をそれぞれ分画した結果を示す。さらに、矢印（←）はヒト由来ＩＦＮ−γタンパク質を示す。

図１６に示すように、大腸菌Ｗ３１１０にＩｂｐＡＢを同時に発現させることにより、ヒト由来インターフェロン・ガンマタンパク質が対照区（ｐ１８４ΔＣｍとｐ２２３−３ＩＦＮ−γで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０）よりも約２倍ほど増えていることが確認できた。さらに、ＩｂｐＡＢを欠失させた大腸菌ＷＩＢ１０１においては、細胞質内に生産される目的タンパク質を発見することができなかった。

《実施例８》ＩｂｐＡＢ発現システムによる細胞質内へのヒト由来インターロイキン１２ベータ鎖（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１２ β ｃｈａｉｎ）タンパク質の生産
前記実施例２に従い製造されたそれぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ，ｐＡＣＩｂｐＡＢ）と実施例３に従い製造されたヒト由来インターロイキン１２ベータ鎖プラスミドｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０で前記実施例１に従い製造された大腸菌ＷＩＢ１０１、母菌株Ｗ３１１０を同時に形質転換した。細胞の培養は、前記実施例４の方法と同様にして行った。ヒト由来インターロイキン１２ベータ鎖タンパク質の発現は、分光光度計を用いて６００ｎｍの波長で測定した吸光度が０．７となる時点で、１ｍＭのＩＰＴＧを加えることにより誘導した。ヒト由来インターロイキン１２ベータ鎖タンパク質の誘導発現後４時間が経過した後に培養液を集めて遠心分離器により回収した後、各形質転換菌株のヒト由来インターロイキン１２ベータ鎖タンパク質を実施例４の方法と同様にして全体タンパク質に分画した（図１７）。

図１７は、それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢまたはｐＡＣＩｂｐＡＢ）とｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０で同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０とＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図１７において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１は組換えプラスミドｐ１８４ΔＣｍとｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン２は組換えプラスミドｐ１８４ΔＣｍとｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０で形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１、レーン３は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢとｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン４は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢとｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０で形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１、レーン５は組換えプラスミドｐＡＣＩｂｐＡＢとｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン６は組換えプラスミドｐＡＣＩｂｐＡＢとｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０で形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１の全体タンパク質をそれぞれ分画した結果を示す。さらに、矢印（←）はヒト由来インターロイキン１２ベータ鎖タンパク質を示す。

図１７に示すように、大腸菌Ｗ３１１０にＩｂｐＡＢを同時に発現させることにより、ヒト由来インターロイキン１２ベータ鎖タンパク質が対照区（ｐ１８４ΔＣｍとｐＴａｃ９９ＩＬ−１２ｐ４０で形質転換された大腸菌Ｗ３１１０）よりも約１．５倍ほど増えていることが確認できた。さらに、ＩｂｐＡＢを欠失させた大腸菌ＷＩＢ１０１においては、細胞質内に生産される目的タンパク質を発見することができなかった。

《実施例９》ＩｂｐＡＢ発現システムによる細胞質内へのオワンクラゲ（Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰの生産
前記実施例２に従い製造されたそれぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡ，ｐＡＣＩｂｐＡＢ）と実施例３に従い製造されたオワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミドｐＴａｃ９９ＧＦＰで前記実施例１に従い製造された大腸菌ＷＩＢ１０１、母菌株Ｗ３１１０を同時に形質転換した。細胞の培養は、前記実施例４の方法と同様にして行った。ＧＦＰの発現は、分光光度計を用いて６００ｎｍの波長で測定した吸光度が０．７となる時点で、１ｍＭのＩＰＴＧを加えることにより誘導した。ＧＦＰ誘導発現後４時間が経過した後に培養液を集めて遠心分離器により回収した後、各形質転換菌株の緑色蛍光タンパク質に対し実施例４の方法と同様にして、全体タンパク質、水溶性タンパク質及び不溶性タンパク質に分画した（図１８ないし図２０）。

図１８は、それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍ，ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢまたはｐＡＣＩｂｐＡＢ）とｐＴａｃ９９ＧＦＰで同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０とＷＩＢ１０１から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図１８において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１は組換えプラスミドｐ１８４ΔＣｍとｐＴａｃ９９ＧＦＰで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン２は組換えプラスミドｐ１８４ΔＣｍとｐＴａｃ９９ＧＦＰで形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１、レーン３は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢとｐＴａｃ９９ＧＦＰで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン４は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢとｐＴａｃ９９ＧＦＰで形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１、レーン５は組換えプラスミドｐＡＣＩｂｐＡＢとｐＴａｃ９９ＧＦＰで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０、レーン６は組換えプラスミドｐＡＣＩｂｐＡＢとｐＴａｃ９９ＧＦＰで形質転換された大腸菌ＷＩＢ１０１の全体タンパク質をそれぞれ分画した結果を示す。さらに、矢印（←）はＧＦＰを示す。

図１８に示すように、大腸菌Ｗ３１１０にＩｂｐＡＢを同時に発現させることにより、ＧＦＰが対照区（ｐ１８４ΔＣｍとｐＴａｃ９９ＧＦＰで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０）よりも約２倍以上増えていることが確認できた。さらに、ＩｂｐＡＢを欠失させた大腸菌ＷＩＢ１０１においては、細胞質内に生産される目的タンパク質を発見することができなかった。

図１９は、それぞれの組換えプラスミド（ｐ１８４ΔＣｍまたはｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ）とｐＴａｃ９９ＧＦＰで同時に形質転換された組換え大腸菌Ｗ３１１０から得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において分析した結果を示す電気泳動写真である。図１９において、レーンＭはタンパク質の標準分子量を示し、レーン１ないし３はそれぞれ組換えプラスミドｐ１８４ΔＣｍとｐＴａｃ９９ＧＦＰで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０の全体タンパク質、水溶性タンパク質及び不溶性タンパク質を、そして、レーン４ないし６は組換えプラスミドｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢとｐＴａｃ９９ＧＦＰで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０をそれぞれ全体タンパク質、水溶性タンパク質及び不溶性タンパク質に分画した結果を示す。さらに、矢印（←）はＧＦＰを示す。

図１９に示すように、大腸菌Ｗ３１１０にＩｂｐＡＢを同時に発現させることにより、水溶性の目的タンパク質がほとんど１００％不溶性封入体に切り換えられていることが確認できた。

図２０は、オワンクラゲ由来ＧＦＰの緑色蛍光の明るさを測定して示す結果である。図２０において、レーン１はＷ３１１０、レーン２はＷ３１１０（ｐＴａｃ９９ＧＦＰ）、レーン３はＷＩＢ１０１（ｐＴａｃ９９ＧＦＰ）、レーン４はＷ３１１０（ｐＴａｃ９９ＧＦＰ＋ｐＡＣＴａｃＩｂｐＡＢ）である。図２０を参照すれば、緑色蛍光の明るさは、上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果と一致している。本発明を通じて、我々は、有用タンパク質の特性と工程システムによって封入体の形成を所望の通りに操作することが可能であることが確認できた。

本発明は、大腸菌由来の封入体結合タンパク質をコードする遺伝子（ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢ）を用いた２種類の目的タンパク質の製造方法を提供する。一つは、ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢを欠失させたバクテリアを用いて目的タンパク質の分泌・生産性及び活性を高める方法である。前記バクテリアを用いると、分泌されたタンパク質が活性を有さない不溶性封入体として形成されることを、活性を有する水溶性タンパク質として分泌・生産するように操作することができ、生物工程の生産性の向上が図れる。もう一つは、ｉｂｐＡ及び／またはｉｂｐＢが増幅されたバクテリアを用いてバクテリアの細胞質内に生産される目的タンパク質の生産性を高めると共に、目的タンパク質を不溶性封入体として生産する方法である。前記組換えベクターの導入を通じて封入体の形成を所望の通りに操作することができるので、有用タンパク質の特性と工程システムによって封入体を形成することにより、生物工程の生産性の向上が図れる。

Claims

微生物を培養することにより、周辺細胞質（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）又は細胞の細胞外空間において分泌型の目的タンパク質を製造する方法であって、前記目的タンパク質をコードする遺伝子によって形質転換された、ｉｂｐＡ及びｉｂｐＢ遺伝子が欠失したバクテリアを培養し、前記目的タンパク質が細胞を破壊することなく得られることを含む、前記製造方法。
前記バクテリアが、更にシグナル配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記目的タンパク質が、レプチン又はアルカリフォスファターゼである、請求項１又は２に記載の方法。
前記バクテリアが、大腸菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。