JP4508645B2 - アミロイド−βペプチド関連疾患の予防および治療用の組成物および方法 - Google Patents

アミロイド−βペプチド関連疾患の予防および治療用の組成物および方法 Download PDF

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Description

本発明は米国国立衛生研究所により授与された補助金番号5P01AG009464-07のもとに政府の支持によりなされた。米国政府は本発明に或る種の権利を有し得る。
関連出願
本出願は2002年１月４日に出願された米国仮出願第60/345,009号（これは参照によりそのまま本明細書に組み入れられる）の35U.S.C.第119条(e)に基づく優先権を主張する。
１．技術分野
本発明は細胞又は組織により示されるアミロイド-βペプチド（Ａβ）のレベルをモジュレートするための方法および組成物に関する。また、本発明は医薬組成物およびＡβレベルをモジュレートする化合物についてのスクリーニング方法に関する。また、本発明はATP依存性γ-セクレターゼ活性の選択的モジュレート（例えば、阻害）によるＡβレベルのモジュレートに関する。また、本発明はATP依存性γ-セクレターゼ活性の選択的阻害剤又は活性（又は最適活性）γ-セクレターゼの生成を減少する薬剤を含むが、これらに限定されないγ-セクレターゼのモジュレーターを投与することにより、Ａβ関連疾患を含むが、これに限定されない疾患の症状を予防、治療又は軽減する方法に関する。また、本発明はアルツハイマー病の症状を予防、治療又は軽減するためのATP依存性γ-セクレターゼ活性の阻害剤の使用に関する。
２．発明の背景
アミロイド-β（Ａβ）ペプチドはアルツハイマー病関連前駆体タンパク質、β-アミロイド前駆体タンパク質(APP)の代謝産物であり、アルツハイマー病(AD)の主要病的決定因子であると考えられている。これらのペプチドは主として40〜42アミノ酸、夫々、Ａβ1-40（「Ａβ40」）およびＡβ1-42（「Ａβ42」）からなる。Ａβ40およびＡβ42はAPPのＣ末端近くに生じる２つの酵素開裂により生成される。その開裂を担う酵素、β-セクレターゼおよびγ-セクレターゼは、夫々、ＡβのＮ末端およびＣ末端を生成する。Ａβのアミノ末端はAPPのメチオニン残基596とアスパラギン酸塩残基597の間のβ-セクレターゼ開裂により形成される（APP695イソ型ナンバリング）（たとえば、米国特許第6,440,698号、および米国特許第5,744,346号を参照のこと）。
γ-セクレターゼ活性はこのβ-セクレターゼ開裂のＣ末端の種々の位置38番、40番又は43番の残基で開裂してＡβペプチドを放出する（γ-セクレターゼおよびγ-セクレターゼ活性の総説について、例えば、米国特許出願第20020025540号を参照のこと）。γ-セクレターゼ酵素の完全分子同一性は依然として知られていない。プレセニリン１、又は密接に関連するプレセニリン２が、γ-セクレターゼ活性に必要とされる。γ-セクレターゼ活性はプレセニリン１を遺伝的に欠失した胚に由来する培養細胞中で80％低下する。全てのγ-セクレターゼ活性がプレセニリン１およびプレセニリン２の両方を欠いている細胞中で失われる。γ-セクレターゼ活性のペプチド擬態（peptidomimetic）阻害剤はプレセニリン１および２に架橋でき、これらのタンパク質が開裂のための触媒サブユニットであることを示唆する。しかしながら、細胞から単離されたγ-セクレターゼ活性は1Mダルトンより大きい複合体としてクロマトグラフィーで分離される。最近の遺伝子研究により、γ-セクレターゼ活性に必要とされる更なる３種のタンパク質；ニカストリン、aph-1およびpen-1が同定された（Francisら, 2002, Developmental Cell 3(1): 85-97; Steinerら, 2002, J. Biol. Chemistry: 277(42): 39062-39065; およびLiら, 2002, J. Neurochem. 82(6): 1540-1548）。高分子量複合体へのプレセニリンの蓄積はこれらのタンパク質を欠いている細胞中で変化される。
第三の酵素、α-セクレターゼは、β-開裂部位とγ-開裂部位の間で前駆体タンパク質を開裂し、こうしてＡβ生成を妨げ、P3（これは非病原性である）として知られている約3 kDaペプチドを放出する。β-セクレターゼ開裂およびα-セクレターゼ開裂の両方はまた、夫々sAPPβおよびsAPPαとして知られている、APPの可溶性の、分泌された末端断片を生じる。sAPPα断片は神経保護性であると示唆されていた。
正常な個体では、Ａβペプチドが２つの優占形態、主要Ａβ-40（Ａβ1-40としても知られている）形態および非主要Ａβ42（Ａβ1-42としても知られている）形態で見られ、夫々が異なるCOOH末端を有する。ADの主要組織学的病変は冒された脳領域で生じる神経炎プラークおよび神経繊維のもつれである。神経炎プラークはＡβペプチド、主としてＡβ40およびＡβ42からなる。健康なニューロンはＡβ42と較べて少なくとも10倍多いＡβ40を生じるが、プラークは可溶性の低いＡβ42をより大きい比率で含む。家族性アルツハイマー病の最も普通の形態を有する患者はＡβ42形態の量の増加を示す。Ａβ40形態はアミロイドプラークの早期の沈着と関連しない。対照的に、Ａβ42形態は柔組織プラーク中に早く、かつ優先的に蓄積し、Ａβ42が家族性アルツハイマー病患者でアミロイドプラーク沈着に主要な役割を果たすという強力な証拠がある（Roherら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10836; Iwatasubo, T.ら, 1994 Neuron 13:45; Yamaguchiら, 1995, Amyloid Int. J. Clin. Invest. 2:7-16; およびMannら, 1996 Am. J. Pathol. 148:1257）。
神経繊維のもつれは凝集したタウタンパク質からなり、ＡＤ病因におけるそれらの役割は明らかではない。ＡＤ症候はプラークよりむしろ全脳Ａβと最も密接に相関している。ＡＤ症例の約10％はAPP又はプレセニリン１遺伝子およびプレセニリン２遺伝子中の突然変異の常染色体優性遺伝から生じる。いずれの場合にも、全Ａβ又はＡβ42vsＡβ40の生成の増大が生じる。Ａβペプチドがアルツハイマー病の発病に重要であるという強力な証拠がある。それ故、これらのペプチドの活性および／又はレベルをモジュレートする組成物が所望される。
たとえば、米国特許出願第20020128319A1は或る種の非ステロイド抗炎症薬(NSAIDS)がAPPの開裂に由来するＡβ40およびＡβ42を発現する細胞培養物中でＡβ42の生成および／又はレベルを低下することを記載している。高いＡβ42レベルがＡＤの主要リスク因子であるという良い証拠があるので、このような薬物はＡＤの進行を予防、遅延又は反転するのに有益であるかもしれない。しかしながら、このような薬物の使用の欠点は多用量のNSAIDSがＡβ42の有意な低下に必要とされ、出血性潰瘍を含む、重大な胃腸副作用が多用量でのNSAIDSの長期使用と関連していることである（Langmanら, 1994, Lancet 343:1075-1078）。加えて、Ａβ40およびＡβ42低下薬により影響されないその他の形態からのアミロイド形成に起因するアルツハイマー病について知られていないリスクが存する。
それ故、Ａβ生成の調節に関連する疾患又は障害についての治療を開発することへの要望が当業界にある。更に、このような疾患又は障害を治療するための化合物を同定するのに使用し得るスクリーニング方法を開発することへの要望がある。
この出願の節２、又はいずれかのその他の節におけるいずれかの文献の引用又は同定は、このような文献が本発明の従来技術として利用できることを認めるものと考えられるべきではない。
３．発明の概要
本発明は、細胞におけるγ-セクレターゼ活性がアミロイド-βペプチド（「Ａβ」）をAPPから最適に生成するためにアデノシン三リン酸(ATP)を必要とし、またATPの選択的競合物質がＡβレベル、特に、分泌Ａβのレベルを低下させるという本出願人の驚くべき発見に一部基づいている。
それ故、本発明は、一般に、γ-セクレターゼ活性の如きATP依存性酵素活性をモジュレート、たとえば、阻害する化合物の投与によりアルツハイマー病の如きＡβ関連疾患を予防又は治療するための方法および組成物に関する。
本発明は細胞又は組織をアミロイド-βペプチド（Ａβ）レベルをモジュレートするのに充分な量の化合物と接触させることを含んでなる、前記細胞又は組織により示される前記Ａβレベルのモジュレート方法を提供し、前記化合物はATP依存性酵素活性をモジュレートする。
１つの実施形態において、Ａβレベルが低下する。別の実施形態において、Ａβレベルが上昇する。別の実施形態において、ＡβがＡβ40である。別の実施形態において、ＡβがＡβ42である。
別の実施形態において、モジュレートがＡβ40対Ａβ42の比の増大を生じる。別の実施形態において、モジュレートがC99の増大を生じる。
別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示す酵素に結合する。別の実施形態において、化合物がATP酵素活性を調節する分子に結合する。
別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性、たとえば、γ-セクレターゼ活性を示す酵素との複合体中に存在する分子に結合する。
別の実施形態において、その分子がATPによりアロステリック的に調節される分子である。
別の実施形態において、化合物がATPモジュレーターである。別の実施形態において、ATPモジュレーターが選択的モジュレーターである。
別の実施形態において、ATPモジュレーターがATP結合部位との結合においてATPと競合する。別の実施形態において、ATP結合部位がATP依存性酵素活性を示す酵素上に存在する。別の実施形態において、ATP結合部位がATP依存性酵素活性を調節する分子上に存在する。
別の実施形態において、化合物がβ-アミロイド前駆体生成物(APP)の全細胞レベルに影響しない。別の実施形態において、化合物が分泌APP(sAPP)のレベルを低下しない。別の実施形態において、化合物がsAPPαのレベルを増大する。別の実施形態において、分泌Ａβのレベルがモジュレートされる。別の実施形態において、化合物がNotch-1開裂を阻害しない。別の実施形態において、化合物がタウリン酸化を阻害しない。
別の実施形態において、化合物が血液脳関門を通過する。
別の実施形態において、酵素活性がγ-セクレターゼ活性である。別の実施形態において、化合物がγ-セクレターゼ活性を阻害する。別の実施形態において、化合物はATPモジュレーターである。別の実施形態において、ATPモジュレーターは選択的モジュレーターである。
別の実施形態において、化合物はATP依存性酵素活性を示すγ-セクレターゼ酵素に結合する。別の実施形態において、ATPモジュレーターがATP結合部位との結合においてATPと競合する。
別の実施形態において、化合物がSTI-571もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物がSTI-571のメシレート塩である。別の実施形態において、化合物がWGB-BC-15もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物１もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物２もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物３もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物４もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物５もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。
別の実施形態において、酵素活性はキナーゼ活性である。別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すキナーゼ酵素に結合する。別の実施形態において、化合物がキナーゼ上のATP結合部位との結合においてATPと競合する。別の実施形態において、化合物がキナーゼ上のATP結合部位以外の部位に結合する。別の実施形態において、キナーゼはチロシンキナーゼである。別の実施形態において、チロシンキナーゼがAb1キナーゼ、BCR-Ab1キナーゼ、ARGキナーゼ、srcキナーゼ、c-kit又は血小板由来成長因子受容体である。別の実施形態において、キナーゼがセリン／スレオニンキナーゼ、炭水化物キナーゼ又は脂質キナーゼである。
別の態様において、本発明は細胞又は組織をＡβレベルをモジュレートするのに充分な量のATPモジュレーターと接触させることを含んでなる、細胞又は組織により示されるＡβレベルのモジュレート方法を提供する。
１つの実施形態において、Ａβレベルが低下される。別の実施形態において、Ａβレベルが上昇される。別の実施形態において、ＡβがＡβ40である。別の実施形態において、ＡβがＡβ42である。
別の実施形態において、モジュレートがＡβ40対Ａβ42の比の増大を生じる。別の実施形態において、モジュレートがC99の増大を生じる。別の実施形態において、ATPモジュレーターがATP結合部位との結合においてATPと競合する。
別の実施形態において、ATP結合部位がATP依存性酵素活性を示す酵素上に存在する。別の実施形態において、ATP結合部位がATP依存性酵素活性を調節する分子上に存在する。別の実施形態において、化合物がβ-アミロイド前駆体生成物(APP)の全細胞レベルに影響しない。別の実施形態において、化合物が分泌APP(sAPP)のレベルを低下しない。別の実施形態において、化合物がsAPPαのレベルを増大する。
別の実施形態において、分泌Ａβのレベルがモジュレートされる。
別の実施形態において、化合物がNotch-1開裂を阻害しない。別の実施形態において、化合物がタウリン酸化を阻害しない。別の実施形態において、化合物が血液脳関門を通過する。別の実施形態において、酵素活性がγ-セクレターゼ活性である。別の実施形態において、化合物がγ-セクレターゼ活性を阻害する。
別の実施形態において、化合物がATPモジュレーターである。別の実施形態において、ATPモジュレーターが選択的モジュレーターである。別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すγ-セクレターゼ酵素に結合する。
別の実施形態において、化合物がSTI-571もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物がSTI-571のメシレート塩である。別の実施形態において、化合物がWGB-BC-15もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物1-5のいずれかもしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。
別の実施形態において、酵素活性がキナーゼ活性である。別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すキナーゼ酵素に結合する。別の実施形態において、化合物がキナーゼ上のATP結合部位との結合においてATPと競合する。別の実施形態において、化合物がキナーゼ上のATP結合部位以外の部位に結合する。別の実施形態において、キナーゼがチロシンキナーゼである。別の実施形態において、チロシンキナーゼがAb1キナーゼ、BCR-Ab1キナーゼ、ARGキナーゼ、srcキナーゼ、c-kit又は血小板由来成長因子受容体である。別の実施形態において、キナーゼがセリン／スレオニンキナーゼ、炭水化物キナーゼ又は脂質キナーゼである。
別の実施形態において、化合物がγ-セクレターゼによるＡβへのAPPの開裂を調節する代謝経路でγ-セクレターゼ以外の標的との結合においてATPと競合する。特別な実施形態において、標的がキナーゼ（又はキナーゼドメイン）、プロテアーゼ（たとえば、ミトコンドリア内膜に局在化される種類のAAAプロテアーゼ）、ホスファターゼ又は分子シャペロン分子（たとえば、hsp60、hsp70、hsp90）である。
１つの態様において、本発明は細胞又は組織をＡβレベルをモジュレートするのに充分な量の化合物と接触させることを含んでなる前記細胞又は組織におけるＡβレベルのモジュレート方法を提供し、前記化合物は下記のファーマコフォア：
Figure 0004508645
［式中、ＸはCH-、Ｏ、NH又はN-CO-である。］
を含む。
１つの実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は図Ｉの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図Ｉ
Figure 0004508645
［式中、
ＡはCH又はＮであり、
ＢおよびＣは独立してCH、Ｎ又はN+-O-であり、
R1はＨ、SO2Ra、(C=O)rOsRaであり、
R2、R3、R4およびR5は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRbRcであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRc又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
前記アルキル-ヘテロシクリルは場合によってOHで置換されていてもよく、
Raは(C1-C6)アルキル、アリール又はヘテロシクリルであり、そして
RbおよびRcは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2Raであり、
ｒおよびｓは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、ＡがCHであり、ＢがＮであり、ＣがCHである。
別の実施形態において、R1がＨである。
別の実施形態において、R2がＨであり、R3がヘテロアリールである。
別の実施形態において、R4が(C=O)rOs(C1-C10)アルキルであり、R5が(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R3が3-ピリジニルである。
別の実施形態において、ｒが０であり、ｓが０であり、(C1-C10)アルキルがメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキルが直接結合(C0)であり、RbがＨであり、Rcが(C=O)rOsヘテロアリール又は(C=O)rOsヘテロシクリルである。
別の実施形態において、(C=O)rOsヘテロシクリルが以下に示される、4-ヒドロキシ-1-ピペラジノ又はその薬学上許容し得る塩である。
Figure 0004508645
別の実施形態において、(C=O)rOsヘテロアリールが以下に示される、3-ピリジニル又はその薬学上許容し得る塩である。
Figure 0004508645
別の実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は図IIの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図II
Figure 0004508645
［式中、
Ａ、ＢおよびＣは独立してCH、Ｎ又はN+-O-であり、
ＤはＯ、Ｓ又はN-R5であり、
R1はＨ、SO2Ra、(C=O)rRa又はCO2Raであり、
R2、R3およびR4は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRbRcであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R5はＨ、アリール又は(C1-C6)アルキルであり、
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRc又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
Raは(C1-C6)アルキル、アリール又はヘテロシクリルであり、そして
RbおよびRcは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2Raであり、
ｒおよびｓは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、R1がＨである。
別の実施形態において、R2がＨであり、R3が(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R4がヘテロアリールである。
別の実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は、図IIIの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図III
Figure 0004508645
［式中、
Ａはアリール又はヘテロアリールであり、
前記アリール又はヘテロアリールは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
ＸはNH、N-アシル、Ｏ又はＳであり、
R1およびR2は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRaRbであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R3は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOsSt(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRaRb又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
RaおよびRbは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2R1、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2R1であり、
ｒ、ｓおよびｔは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、Ａがアリールである。
別の実施形態において、そのアリールが2,5-ジクロロフェニルである。
別の実施形態において、R1が(C0-C6)アルキル-NRaRbであり、R2が(C=O)rOs(C1-C10)アルキルである。
別の実施形態において、(C=O)rOs(C1-C10)アルキルがメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキル-NRaRbが
Figure 0004508645
又はこれらの薬学上許容し得る塩である。
別の態様において、本発明は
Ａβレベルをモジュレートするのに充分な量の請求項１から２１のいずれか１項記載の化合物、および
薬学上許容し得る賦形剤又は担体
を含んでなる、細胞又は組織におけるＡβレベルをモジュレートするのに有用な医薬組成物を提供する。
１つの実施形態において、医薬組成物は細胞又は組織により示されるＡβレベルをモジュレートするのに有用である。
別の実施形態において、化合物が前記Ａβレベルをモジュレートするのに充分な量で存在する。
図Ｉの化合物は当業者に公知の種々の方法により調製し得る。特に、ＡがCHであり、ＢがＮであり、ＣがCHであり、R1がＨである図Ｉの化合物は、下記の方法により調製し得る。
a)図IV
図IV
Figure 0004508645
［式中、ＹおよびＺは(C1-C6)アルキル基を構成し、R2およびR3は先に定義されたとおりである。］
の化合物を図Ｖ
図Ｖ
Figure 0004508645
［式中、R4およびR5は先に定義されたとおりである。］
の化合物と反応させる。
１つの実施形態において、本発明の方法により利用される化合物は下記のファーマコフォア：
Figure 0004508645
［式中、ＸはCH-、Ｏ、NH又はN-CO-である。］
を含む。
１つの実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は図Ｉの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図Ｉ
Figure 0004508645
［式中、
ＡはCH又はＮであり、
ＢおよびＣは独立してCH、Ｎ又はN+-O-であり、
R1はＨ、SO2Ra、(C=O)rOsRaであり、
R2、R3、R4およびR5は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRbRcであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRc又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
前記アルキル-ヘテロシクリルは場合によってOHで置換されていてもよく、
Raは(C1-C6)アルキル、アリール又はヘテロシクリルであり、そして
RbおよびRcは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2Raであり、
ｒおよびｓは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、ＡがCHであり、ＢがＮであり、ＣがCHである。
別の実施形態において、R1がＨである。
別の実施形態において、R2がＨであり、R3がヘテロアリールである。
別の実施形態において、R4が(C=O)rOs(C1-C10)アルキルであり、R5が(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R3が3-ピリジニルである。
別の実施形態において、ｒが０であり、ｓが０であり、(C1-C10)アルキルがメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキルが直接結合(C0)であり、RbがＨであり、Rcが(C=O)rOsヘテロアリール又は(C=O)rOsヘテロシクリルである。
別の実施形態において、(C=O)rOsヘテロシクリルが以下に示される、4-ヒドロキシ-1-ピペラジノ又はその薬学上許容し得る塩である。
Figure 0004508645
別の実施形態において、(C=O)rOsヘテロアリールが以下に示される、3-ピリジニル又はその薬学上許容し得る塩である。
Figure 0004508645
別の実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は図IIの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図II
Figure 0004508645
［式中、
Ａ、ＢおよびＣは独立してCH、Ｎ又はN+-O-であり、
ＤはＯ、Ｓ又はN-R5であり、
R1はＨ、SO2Ra、(C=O)rRa又はCO2Raであり、
R2、R3およびR4は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRbRcであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R5はＨ、アリール又は(C1-C6)アルキルであり、
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRc又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
Raは(C1-C6)アルキル、アリール又はヘテロシクリルであり、そして
RbおよびRcは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2Raであり、
ｒおよびｓは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、R1がＨである。
別の実施形態において、R2がＨであり、R3が(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R4がヘテロアリールである。
別の実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は、図IIIの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図III
Figure 0004508645
［式中、
Ａはアリール又はヘテロアリールであり、
前記アリール又はヘテロアリールは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
ＸはNH、N-アシル、Ｏ又はＳであり、
R1およびR2は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRaRbであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R3は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOsSt(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRaRb又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
RaおよびRbは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2R1、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2R1であり、
ｒ、ｓおよびｔは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、Ａがアリールである。
別の実施形態において、そのアリールが2,5-ジクロロフェニルである。
別の実施形態において、R1が(C0-C6)アルキル-NRaRbであり、R2が(C=O)rOs(C1-C10)アルキルである。
別の実施形態において、(C=O)rOs(C1-C10)アルキルがメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキル-NRaRbが
Figure 0004508645
又はこれらの薬学上許容し得る塩である。
本発明はまた包装材料ならびに包装材料内に含まれるATP依存性Ａβレベルを低下する化合物、および薬学上許容し得る担体を含む医薬組成物を含んでなる製品を提供し、前記医薬組成物は被験者への投与に適した形態である。１つの実施形態において、製造の物品は医薬組成物の使用又は投与に関する印刷された指示を更に含む。１つの実施形態において、指示はＡβ関連疾患の症状の予防、治療、又は軽減のための投薬養生法を示唆する。別の実施形態において、指示はアルツハイマー病の症状の予防、治療、又は軽減のための投薬養生法を示唆する。
別の実施形態において、製品は医薬組成物の使用又は投与に関するラベルを更に含む。別の実施形態において、ラベルはＡβ関連疾患の症状の予防、治療、又は軽減のための投薬養生法を示唆する。別の実施形態において、ラベルはアルツハイマー病の症状の予防、治療、又は軽減のための投薬養生法を示唆する。
別の実施形態において、製品は酸化防止剤、非選択的COX阻害剤又はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を更に含む。別の実施形態において、医薬組成物が酸化防止剤、非選択的COX阻害剤又はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を更に含む。
本発明はまた
(a) 細胞又は組織におけるγ-セクレターゼ活性の第１のレベルを測定し、
(b) 前記細胞又は組織を試験化合物と接触させ、そして
(c) 前記細胞又は組織におけるγ-セクレターゼ活性の第２のレベルを測定することを含んでなる細胞又は組織により示されるＡβレベルをモジュレートする化合物を同定する方法を提供し、γ-セクレターゼ活性の前記第１のレベルと前記第２のレベルの差がＡβレベルをモジュレートする前記試験化合物の能力を示す。
１つの実施形態において、γ-セクレターゼ活性の差がＡβレベルをモジュレートする前記試験化合物の能力を示す。別の実施形態において、Ａβレベルがモジュレートされる。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性がATP依存性酵素活性である。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性がＡβの生成である。
本発明はまた
(a)細胞又は組織を試験化合物と接触させ、そして
(b)前記細胞又は組織におけるγ-セクレターゼの活性のレベルを測定することを含んでなる細胞又は組織により示されるＡβレベルをモジュレートする化合物を同定する方法を提供し、前記レベルと試験化合物と接触されなかった匹敵する細胞又は組織におけるγ-セクレターゼ活性の対照レベルの差がＡβレベルをモジュレートする前記試験化合物の能力を示す。
１つの実施形態において、γ-セクレターゼ活性の差がＡβレベルをモジュレートする前記試験化合物の能力を示す。別の実施形態において、Ａβレベルがモジュレートされる。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性がATP依存性酵素活性である。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性がＡβの生成である。
本発明はまた
(a) 細胞又は組織中でγ-セクレターゼを潜在的薬剤と接触させ、そして
(b) γ-セクレターゼ活性の量を測定することを含んでなるＡβ関連疾患の治療を要する患者のこのような疾患を治療する能力について試験される薬剤を同定する方法を提供し、その薬剤はγ-セクレターゼ活性の低下が潜在的薬剤の存在下で検出される場合に同定され、その薬剤はＡβレベルをモジュレートする。
１つの実施形態において、Ａβ関連疾患を治療する能力が試験される。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性がATP依存性酵素活性である。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性がＡβの生成である。
別の態様において、本発明は
(a) 細胞又は組織におけるγ-セクレターゼ活性の第１のレベルを測定し、
(b) 前記細胞又は組織を潜在的薬剤と接触させ、そして
(c) 前記細胞又は組織におけるγ-セクレターゼ活性の第２のレベルを測定することを含んでなる細胞又は組織により示されるＡβレベルをモジュレートする能力について試験される薬剤を同定する方法を提供し、γ-セクレターゼ活性の前記第１のレベルと前記第２のレベルの差がＡβレベルをモジュレートする前記潜在的薬剤の能力を示す。１つの実施形態において、その方法は
(d) Ａβレベルがモジュレートされるか否かを測定する付加的な工程を含む。
別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性がATP依存性酵素活性である。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性がＡβの生成である。
本発明はまた
(a) 細胞又は組織を潜在的薬剤と接触させ、そして
(b) 前記細胞又は組織におけるγ-セクレターゼ活性のレベルを測定することを含んでなる細胞又は組織により示されるＡβレベルをモジュレートする能力について試験される薬剤の同定方法を提供し、前記レベルと試験化合物と接触されなかった匹敵する細胞又は組織におけるγ-セクレターゼ活性の対照レベルの差がＡβレベルをモジュレートする前記潜在的薬剤の能力を示す。
１つの実施形態において、その方法が
(c) Ａβレベルがモジュレートされるか否かを測定する付加的な工程を含む。
別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性がATP依存性酵素活性である。
別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性がＡβの生成である。
本発明はまた
(a) 潜在的治療薬を動物に投与し、
(b) 前記潜在的治療薬に対する前記動物の応答を測定し、
(c) 前記動物の応答を潜在的治療薬が投与されなかった対照動物の応答と比較し、そして
(d) 潜在的治療薬を前記動物と前記対照動物の間で観察された応答の差に基づいて選択することを含んでなる潜在的治療薬をＡβ関連疾患の治療における使用について選択する方法を提供し、その潜在的治療薬はATP依存性γ-セクレターゼ活性をモジュレートする。
１つの実施形態において、動物がモルモットである。別の実施形態において、疾患がアルツハイマー病である。
本発明はまた
(a) 潜在的治療薬を動物に投与し、
(b) γ-セクレターゼの活性をモジュレートする薬剤の投与に対する前記動物の応答を測定し、
(c) 前記動物の応答を潜在的治療薬が投与されなかった対照動物の応答と比較し、そして
(d) 潜在的治療薬を前記動物と前記対照動物の間で観察された応答の差に基づいて選択することを含んでなるＡβ関連疾患の治療における使用について潜在的治療薬を選択する方法を提供し、潜在的治療薬はATP依存性γ-セクレターゼ活性をモジュレートする。
１つの実施形態において、動物がモルモットである。別の実施形態において、疾患がアルツハイマー病である。
本発明はまた
(a) 潜在的治療薬を動物に投与し、
(b) 前記動物の応答を測定し、その応答は
(i)モーリス水迷路における挙動の提示、および
(i)Ｙ迷路における挙動の提示
からなる群から選ばれ、
(c) 前記動物の応答を潜在的治療薬が投与されなかった対照動物の応答と比較し、そして
(d) 潜在的治療薬を前記動物と前記対照動物の間で観察された応答の差に基づいて選択することを含んでなるＡβ関連疾患の治療における使用について潜在的治療薬を選択する方法を提供し、潜在的治療薬はＡβレベルをモジュレートする。
１つの実施形態において、動物がモルモットである。別の実施形態において、疾患がアルツハイマー病である。
本発明はまた
(a) Ａβ関連疾患の進行の予防、遅延、又は反転を要する哺乳類を同定し、そして
(b) 前記哺乳類にATP依存性γ-セクレターゼ活性をモジュレートするのに充分な量の薬剤を投与することを含んでなるその疾患の進行を予防、遅延又は反転する方法を提供し、Ａβレベルがモジュレートされる。
１つの実施形態において、薬剤がATP依存性γ-セクレターゼ活性を阻害又は低下する。
別の実施形態において、哺乳類がヒトである。別の実施形態において、疾患がアルツハイマー病である。
別の実施形態において、薬剤がATP依存性γ-セクレターゼ活性を促進又は増大する。
別の実施形態において、薬剤が経口投与される。
別の実施形態において、薬剤がNSAIDとともに投与される。特別な実施形態において、NSAIDが硫化スリンダック、フルフェナム酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、メフェナム酸、インドメタシン、カルプロフェン、メクロフェナム酸である。
別の実施形態において、薬剤が酸化防止剤とともに投与される。別の実施形態において、酸化防止剤がビタミンＥ、ビタミンＣ、クルクミン、およびギンコ・ビロバからなる群から選ばれる。
別の実施形態において、薬剤がアセチルコリンエステラーゼ阻害剤とともに投与される。
本発明はまたＡβ関連疾患の症状の治療又は軽減を要する被験者に被験者のＡβレベルを低下するのに充分な量の化合物を投与することを含んでなるこのような疾患の症状を治療又は軽減する方法を提供し、その化合物はATP依存性酵素活性をモジュレートし、その結果、Ａβ関連疾患が治療され、又はＡβ関連疾患の症状が軽減される。
１つの実施形態において、Ａβ関連疾患がアルツハイマー病である。別の実施形態において、Ａβ関連疾患の進行が遅くされる。別の実施形態において、Ａβ関連疾患の進行が反転される。
別の実施形態において、被験者がヒト被験者である。特別な実施形態において、被験者がアルツハイマー病の家族性形態のおそれのある被験者である。
別の実施形態において、ATP依存性酵素活性が低下される。別の実施形態において、化合物が血液脳関門を通過する。別の実施形態において、化合物が経口投与される。
別の実施形態において、化合物がNSAIDとともに投与される。特別な実施形態において、NSAIDが硫化スリンダック、フルフェナム酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、メフェナム酸、インドメタシン、カルプロフェン、メクロフェナム酸である。
別の実施形態において、化合物が酸化防止剤とともに投与される。特別な実施形態において、酸化防止剤がビタミンＥ、ビタミンＣ、クルクミン、およびギンコ・ビロバからなる群から選ばれる。
別の実施形態において、化合物がアセチルコリンエステラーゼ阻害剤とともに投与される。
別の実施形態において、化合物がATPモジュレーターである。別の実施形態において、化合物がATPモジュレーターであり、選択的モジュレーターである。
別の実施形態において、酵素活性がγ-セクレターゼ活性である。別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すγ-セクレターゼ酵素に結合する。
別の実施形態において、ATPモジュレーターがATP結合部位に結合するのにATPと競合する。
別の実施形態において、化合物がSTI-571もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物がSTI-571のメシレート塩である。別の実施形態において、化合物がWGB-BC-15もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物1-5のいずれかもしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。
１つの実施形態において、酵素活性がキナーゼ活性である。１つの実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すキナーゼ酵素に結合する。１つの実施形態において、化合物がキナーゼのATP結合部位に結合するのにATPと競合する。別の実施形態において、化合物がキナーゼのATP結合部位以外の部位に結合する。
特別な実施形態において、キナーゼがチロシンキナーゼである。別の実施形態において、チロシンキナーゼがAb1キナーゼ、BCR-Ab1キナーゼ、ARGキナーゼ、srcキナーゼ、c-kit、血小板由来成長因子受容体である。
特別な実施形態において、キナーゼがセリン／スレオニンキナーゼ、炭水化物キナーゼ又は脂質キナーゼである。
別の実施形態において、酵素活性がプロテアーゼ（たとえば、ミトコンドリア内膜に局在化される種類のAAAプロテアーゼ）、ホスファターゼ、又は分子シャペロン分子（たとえば、hsp60、hsp70、hsp90）の活性である。
本発明はまたＡβ関連疾患を治療し、又はその症状を軽減することを要する被験者に被験者のＡβレベルを低下するのに充分な量のATPモジュレーターを投与することを含んでなるこのような治療又は軽減方法を提供し、その結果、Ａβ関連疾患が治療され、又はＡβ関連疾患の症状が軽減される。
１つの実施形態において、Ａβ関連疾患がアルツハイマー病である。１つの実施形態において、被験者がヒト被験者である。
１つの実施形態において、被験者がアルツハイマー病の家族性形態のおそれのある被験者である。
別の実施形態において、ATP依存性酵素活性が低下される。
別の実施形態において、ATPモジュレーターが血液脳関門を通過する。
別の実施形態において、ATPモジュレーターが経口投与される。別の実施形態において、ATPモジュレーターがNSAIDとともに投与される。別の実施形態において、NSAIDが硫化スリンダック、フルフェナム酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、メフェナム酸、インドメタシン、カルプロフェン、メクロフェナム酸である。
別の実施形態において、ATPモジュレーターが酸化防止剤とともに投与される。別の実施形態において、酸化防止剤がビタミンＥ、ビタミンＣ、クルクミン、およびギンコ・ビロバからなる群から選ばれる。
別の実施形態において、ATPモジュレーターがアセチルコリンエステラーゼ阻害剤とともに投与される。
別の実施形態において、ATPモジュレーターが選択的モジュレーターである。
別の実施形態において、酵素活性がγ-セクレターゼ活性である。
１つの実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すγ-セクレターゼ酵素に結合する。別の実施形態において、ATPモジュレーターがATP結合部位に結合するのにATPと競合する。
１つの実施形態において、化合物がSTI-571もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物がSTI-571のメシレート塩である。別の実施形態において、化合物がWGB-BC-15もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物1-5のいずれかもしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。
１つの実施形態において、酵素活性がキナーゼ活性である。１つの実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すキナーゼ酵素に結合する。１つの実施形態において、化合物がキナーゼのATP結合部位に結合するのにATPと競合する。別の実施形態において、化合物がキナーゼのATP結合部位以外の部位に結合する。
特別な実施形態において、キナーゼがチロシンキナーゼである。別の実施形態において、チロシンキナーゼがAb1キナーゼ、BCR-Ab1キナーゼ、ARGキナーゼ、srcキナーゼ、c-kit、血小板由来成長因子受容体である。
特別な実施形態において、キナーゼがセリン／スレオニンキナーゼ、炭水化物キナーゼ又は脂質キナーゼである。
別の実施形態において、酵素活性がプロテアーゼ（たとえば、ミトコンドリア内膜に局在化される種類のAAAプロテアーゼ）、ホスファターゼ、又は分子シャペロン分子（たとえば、hsp60、hsp70、hsp90）の活性である。
本発明はまたＡβ関連疾患を治療し、又はその症状を軽減する方法であって、そのような治療又は軽減が必要な被験者に該被験者のＡβレベルを低下するのに充分な量の化合物を投与することを含んでなり、その結果、Ａβ関連疾患が治療され、又はＡβ関連疾患の症状が軽減され、その化合物は下記のファーマコフォア：
Figure 0004508645
［式中、ＸはCH-、Ｏ、NH又はN-CO-である。］
を含む、該方法を提供する。
１つの実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は図Ｉの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図Ｉ
Figure 0004508645
［式中、
ＡはCH又はＮであり、
ＢおよびＣは独立してCH、Ｎ又はN+-O-であり、
R1はＨ、SO2Ra、(C=O)rOsRaであり、
R2、R3、R4およびR5は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRbRcであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRc又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
前記アルキル-ヘテロシクリルは場合によってOHで置換されていてもよく、
Raは(C1-C6)アルキル、アリール又はヘテロシクリルであり、そして
RbおよびRcは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2Raであり、
ｒおよびｓは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、ＡがCHであり、ＢがＮであり、ＣがCHである。
別の実施形態において、R1がＨである。
別の実施形態において、R2がＨであり、R3がヘテロアリールである。
別の実施形態において、R4が(C=O)rOs(C1-C10)アルキルであり、R5が(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R3が3-ピリジニルである。
別の実施形態において、ｒが０であり、ｓが０であり、(C1-C10)アルキルがメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキルが直接結合(C0)であり、RbがＨであり、Rcが(C=O)rOsヘテロアリール又は(C=O)rOsヘテロシクリルである。
別の実施形態において、(C=O)rOsヘテロシクリルが以下に示される、4-ヒドロキシ-1-ピペラジノ又はその薬学上許容し得る塩である。
Figure 0004508645
別の実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は図IIの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図II
Figure 0004508645
［式中、
Ａ、ＢおよびＣは独立してCH、Ｎ又はN+-O-であり、
ＤはＯ、Ｓ又はN-R5であり、
R1はＨ、SO2Ra、(C=O)rRa又はCO2Raであり、
R2、R3およびR4は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRbRcであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R5はＨ、アリール又は(C1-C6)アルキルであり、
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRc又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
Raは(C1-C6)アルキル、アリール又はヘテロシクリルであり、そして
RbおよびRcは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2Raであり、
ｒおよびｓは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、R1がＨである。
別の実施形態において、R2がＨであり、R3が(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R4がヘテロアリールである。
別の実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は、図IIIの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図III
Figure 0004508645
［式中、
Ａはアリール又はヘテロアリールであり、
前記アリール又はヘテロアリールは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
ＸはNH、N-アシル、Ｏ又はＳであり、
R1およびR2は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRaRbであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R3は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOsSt(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRaRb又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
RaおよびRbは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2R1、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2R1であり、
ｒ、ｓおよびｔは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、Ａがアリールである。
別の実施形態において、そのアリールが2,5-ジクロロフェニルである。
別の実施形態において、R1が(C0-C6)アルキル-NRaRbであり、R2が(C=O)rOs(C1-C10)アルキルである。
別の実施形態において、(C=O)rOs(C1-C10)アルキルがメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキル-NRaRbが
Figure 0004508645
又はこれらの薬学上許容し得る塩である。
別の実施形態において、薬剤が経口投与される。
１つの実施形態において、化合物がNSAIDとともに投与される。別の実施形態において、NSAIDが硫化スリンダック、フルフェナム酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、メフェナム酸、インドメタシン、カルプロフェン、メクロフェナム酸である。
１つの実施形態において、化合物が酸化防止剤とともに投与される。特別な実施形態において、酸化防止剤がビタミンＥ、ビタミンＣ、クルクミン、およびギンコ・ビロバからなる群から選ばれる。
別の実施形態において、化合物がアセチルコリンエステラーゼ阻害剤とともに投与される。
3.1.用語
本発明に使用されるように、酵素、たとえば、γ-セクレターゼの酵素活性は(i)酵素の活性化状態（活性のレベル）が酵素へのATPの結合によりモジュレートされ、(ii)酵素の活性が酵素を含む酵素複合体中の分子へのATPの結合によりモジュレートされ、(iii)酵素の活性が酵素複合体の集合、局在化又は安定性に影響する分子へのATPの結合によりモジュレートされ、又は(iv)酵素の活性が酵素複合体の活性化状態（活性のレベル）に影響する分子へのATPの結合によりモジュレートされる場合に「ATP依存性」である。
本明細書に使用される「モジュレーション」、「モジュレートされる」又は「モジュレート」という用語はそれらの通常の意味を有するべきであり、「増進する」、「促進する」、「増大する」、「作用する」、「阻害する」、「低下する」又は「拮抗作用する」という用語の意味を包含する。
本明細書に使用される「アゴニスト」は分子に直接又は間接に作用して薬理学的効果を生じるあらゆる化合物であり、一方、「アンタゴニスト」は薬理学的効果の刺激を阻止するあらゆる化合物である。
本明細書に使用される化合物の「充分な量」又は「...するのに充分な化合物の量」は意図される結果を得るのに必要な少なくとも最小量を含む量を表す。このような量は本明細書に開示されたような分析の方法を使用する研究からのデータに基づいて当業者によりルーチンで決められる。このようなデータとして、以下に説明されるような、IC50測定からの結果が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に使用される「Ａβ関連疾患」又は「Ａβ疾患」という用語はＡβレベルの異常又は調節不全を伴う疾患（たとえば、アルツハイマー病）又は症状（たとえば、老人性痴呆）である。Ａβ関連疾患として、アルツハイマー病、ダウン症候群および封入体筋炎が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に使用される「障害」および「疾患」という用語は被験者の症状を表すのに互換可能に使用される。
本明細書に使用される「小有機分子」は一般に約３キロダルトン以下、好ましくは約1.5キロダルトン以下の分子量を有する有機化合物（又は無機化合物（たとえば、金属）と錯生成された有機化合物）である。小有機分子は経口投与でき、かつ／又は血液脳関門を通過することができることが好ましい。
本明細書に使用される「約」という用語は10〜15％の範囲内、好ましくは５〜10％の範囲内を意味する。
本明細書に使用される「ATPモジュレーター」という用語は、細胞中でATP機能をモジュレートする化合物を表す。たとえば、ATPモジュレーターは通常ATP結合により影響される分子に結合し、その分子への結合により、その分子へのATPの通常の作用をモジュレートし、たとえば、阻害する化合物であってもよい。このようなATPモジュレーターは分子のATP結合部位又は分子の或る種のその他の部位で分子に結合し得る。ATPモジュレーターは分子に結合するのにATPと競合することにより、たとえば、ATP結合部位に結合するのに競合することにより作用し得る。ATPモジュレーターは選択的ATPモジュレーターであることが好ましい。
本明細書に使用される「選択的ATPモジュレーター」又は「選択的ATPモジュレート」という用語は細胞中でATP機能に影響する分子間で識別し、特別な個々の分子、又は分子のクラスもしくはサブセット（「モジュレートプロフィール」）のみをモジュレートするモジュレーター（又はモジュレート）を表す。たとえば、化合物が種々のキナーゼの収集を阻害する際の活性についてアッセイされてもよく、それがキナーゼの関連クラス中でATP機能をモジュレートする場合に選択的ATPモジュレーターとして認識される。１つの実施形態において、選択的モジュレーターはSTI-571、STI-571のメシレート塩、化合物１又は化合物２により示されるモジュレートプロフィールと同じ、又は実質的に同様のモジュレートプロフィールを示すものである。
本明細書に使用される「治療する」、「治療」および「治療すること」という用語は細胞又は組織により示されるＡβレベルを低下する１種以上の化合物の投与により生じるＡβ関連疾患の軽減を表す。それはまた疾患の処理、又は疾患の進行の遅延および／又は反転を表す。
Ａβ関連疾患の症状は当業者に公知である。たとえば、アルツハイマー疾患の症状が当業界で公知であり、たとえば、記憶喪失、軽度の認識機能障害、認識低下、重度の認識機能障害および人格変化（これらは、たとえば、10年の経過にわたって機能的能力の損失をもたらす）が挙げられる。衰弱状態で、患者は通常重度の機能障害を示し、自律神経機能のみを保持する。アルツハイマー病の症状としてまた、細胞内神経繊維のもつれならびに細胞外の柔組織および脳血管のアミロイドを含む、或る種の当業界で公知の神経病理学的病変が挙げられる。
本明細書に使用される「処理する」、「処理すること」および「処理」という用語は被験者が細胞又は組織により示されるＡβレベルを低下する化合物（これは疾患の治癒をもたらさない）の如き化合物から得る有益な効果を表す。或る実施形態において、疾患の進行又は悪化を防止し、又は遅延するように疾患を「処理する」ために被験者が１種以上のこのような薬剤を投与される。
本明細書に使用される「予防する」、「予防すること」および「予防」という用語は被験者のＡβ関連疾患又はＡβ関連疾患の１つ以上の症状の再発又は発病の防止を表す。
本明細書に使用される「プロトコル」は投薬スケジュールおよび投薬養生法を含む。本明細書のプロトコルは使用の方法であり、予防プロトコルおよび治療プロトコルを含む。
本明細書に使用される「被験者」および「患者」という用語は互換可能に使用される。本明細書に使用される「被験者」および「患者」という用語は動物、好ましくは非霊長類（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ）および霊長類（たとえば、サル、たとえば、カニクイザル、ゴリラ、チンパンジー、およびヒト）を含む哺乳類を表す。１つの実施形態において、被験者がアルツハイマー病の被験者である。
本明細書に使用される「薬学上許容し得る」という用語は米国の連邦の規制当局又は州政府により認可され、又は動物、更に特別には、ヒトにおける使用について米国薬局方もしくはその他の一般に認められた薬局方にリストされた、組成物、たとえば、担体、賦形剤、又は塩を意味する。
５．発明の詳細な説明
限定のためではなく、開示の明瞭化のために、発明の詳細な説明が以下に示される細区分に分けられる。
5.1. アミロイドβペプチド（Ａβ）レベルのモジュレート方法
本発明は細胞又は組織をアミロイド-βペプチド（Ａβ）レベルをモジュレートするのに充分な量の化合物と接触させることを含んでなる前記細胞又は組織により示される前記Ａβレベルをモジュレートする方法を提供し、前記化合物はATP依存性酵素活性をモジュレートする。
細胞又は組織として、興奮性細胞、たとえば、知覚神経細胞、運動神経細胞、又は介在ニューロン；グリア細胞；細胞の一次培養物、例えば、神経細胞又はグリア細胞の一次培養物；神経細胞系又はグリア細胞系に由来する細胞；解離細胞；全細胞又は無傷細胞；透過性化細胞；破壊された細胞調製物；分離され、かつ／又は精製された細胞調製物；細胞抽出物又は精製酵素調製物；組織又は器官、例えば、脳、脳構造、脳切片、脊髄、脊髄切片、中枢神経系、末梢神経系、又は神経；組織切片、および全動物が挙げられるが、これらに限定されない。或る実施形態において、脳構造が脳皮質、海馬、又はその他の哺乳類種中のそれらの解剖学的相当物および／又は機能的相当物である。或る実施形態において、細胞又は組織がN2a細胞、神経細胞一次培養物又は海馬組織外殖体である。
１つの実施形態において、Ａβレベルが低下される。別の実施形態において、Ａβレベルが上昇される。別の実施形態において、ＡβがＡβ40である。別の実施形態において、ＡβがＡβ42である。
別の実施形態において、モジュレートがＡβ40対Ａβ42の比の増大をもたらす。別の実施形態において、モジュレートがC99の増加をもたらす。
別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示す酵素に結合する。別の実施形態において、化合物がATP酵素活性を調節する分子に結合する。
別の実施形態において、分子がATPによりアロステリック的に調節される分子である。
別の実施形態において、化合物がATPモジュレーターである。別の実施形態において、ATPモジュレーターが選択的モジュレーターである。
別の実施形態において、ATPモジュレーターがATP結合部位に結合するのにATPと競合する。別の実施形態において、ATP結合部位がATP依存性酵素活性を示す酵素に存在する。別の実施形態において、ATP結合部位がATP依存性酵素活性を調節する分子に存在する。
結合は当業界で公知の方法に従って、あらゆる通常の当業界で公知の生理学的条件下で測定されてもよい。
別の実施形態において、化合物がβ-アミロイド前駆体生成物(APP)の全細胞レベルに影響しない。別の実施形態において、化合物が分泌APP(sAPP)のレベルを低下しない。別の実施形態において、化合物がsAPPαのレベルを増加する。別の実施形態において、分泌Ａβのレベルがモジュレートされる。別の実施形態において、化合物がNotch-1開裂を阻害しない。別の実施形態において、化合物がタウリン酸化に影響しない。
別の実施形態において、化合物が血液脳関門を通過する。
別の実施形態において、酵素活性がγ-セクレターゼ活性である。別の実施形態において、化合物がγ-セクレターゼ活性を阻害する。別の実施形態において、化合物がATPモジュレーターである。別の実施形態において、ATPモジュレーターが選択的モジュレーターである。
別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すγ-セクレターゼ酵素に結合する。別の実施形態において、ATPモジュレーターがATP結合部位に結合するのにATPと競合する。
別の実施形態において、化合物がSTI-571もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物がSTI-571のメシレート塩である。別の実施形態において、化合物がWGB-BC-15もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物１もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物２もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物３もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物４もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物５もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。
別の実施形態において、酵素活性がキナーゼ活性である。別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すキナーゼ酵素に結合する。別の実施形態において、化合物がキナーゼのATP結合部位に結合するのにATPと競合する。別の実施形態において、化合物がキナーゼのATP結合部位以外の部位に結合する。別の実施形態において、キナーゼがチロシンキナーゼである。別の実施形態において、チロシンキナーゼがAb1キナーゼ、BCR-Ab1キナーゼ、ARGキナーゼ、srcキナーゼ、c-kit又は血小板由来成長因子受容体である。別の実施形態において、キナーゼがセリン／スレオニンキナーゼ、炭水化物キナーゼ又は脂質キナーゼである。
別の態様において、本発明は細胞又は組織をＡβレベルをモジュレートするのに充分な量のATPモジュレーターと接触させることを含んでなる前記細胞又は組織により示されるＡβレベルのモジュレート方法を提供する。
１つの実施形態において、Ａβレベルが低下される。別の実施形態において、Ａβレベルが上昇される。別の実施形態において、ＡβがＡβ40である。別の実施形態において、ＡβがＡβ42である。
別の実施形態において、モジュレートがＡβ40対Ａβ42の比の増大を生じる。別の実施形態において、モジュレートがC99の増大を生じる。別の実施形態において、ATPモジュレーターがATP結合部位に結合するのにATPと競合する。
別の実施形態において、ATP結合部位がATP依存性酵素活性を示す酵素に存在する。別の実施形態において、ATP結合部位がATP依存性酵素活性を調節する分子に存在する。別の実施形態において、化合物がβ-アミロイド前駆体生成物(APP)の全細胞レベルに影響しない。別の実施形態において、化合物が分泌APP(sAPP)のレベルを低下しない。別の実施形態において、化合物がsAPPαのレベルを増大する。
別の実施形態において、分泌Ａβのレベルがモジュレートされる。
別の実施形態において、化合物がNotch-1開裂を阻害しない。別の実施形態において、化合物がタウリン酸化に影響しない。別の実施形態において、化合物が血液脳関門を通過する。別の実施形態において、酵素活性がγ-セクレターゼ活性である。別の実施形態において、化合物がγ-セクレターゼ活性を阻害する。
別の実施形態において、化合物がATPモジュレーターである。別の実施形態において、ATPモジュレーターが選択的モジュレーターである。別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すγ-セクレターゼ酵素に結合する。
別の実施形態において、化合物がSTI-571もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物がSTI-571のメシレート塩である。別の実施形態において、化合物がWGB-BC-15もしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。別の実施形態において、化合物が化合物1-5のいずれかもしくはその血液脳関門透過性変異体、又はこれらの薬学上許容し得る塩である。
別の実施形態において、酵素活性がキナーゼ活性である。別の実施形態において、化合物がATP依存性酵素活性を示すキナーゼ酵素に結合する。別の実施形態において、化合物がキナーゼのATP結合部位に結合するのにATPと競合する。別の実施形態において、化合物がキナーゼのATP結合部位以外の部位に結合する。別の実施形態において、キナーゼがチロシンキナーゼである。別の実施形態において、チロシンキナーゼがAb1キナーゼ、BCR-Ab1キナーゼ、ARGキナーゼ、srcキナーゼ、c-kit又は血小板由来成長因子受容体である。別の実施形態において、キナーゼがセリン／スレオニンキナーゼ、炭水化物キナーゼ又は脂質キナーゼである。
別の実施形態において、化合物がγ-セクレターゼによりＡβへのAPPの開裂を調節する代謝経路でγ-セクレターゼ以外の標的に結合するのにATPと競合する。特別な実施形態において、標的がキナーゼ（又はキナーゼドメイン）、プロテアーゼ（たとえば、ミトコンドリア内膜に局在化される種類のAAAプロテアーゼ）、ホスファターゼ、又は分子シャペロン分子（たとえば、hsp60、hsp70、hsp90）である。
或る実施形態において、γ-セクレターゼ活性がタンパク質複合体の集合、アロステリック活性化、又は安定化を反映し得る。或る実施形態において、γ-セクレターゼ活性のレベルがこのタンパク質複合体のレベルであり、タンパク質複合体のレベルが複合体中の成分タンパク質のレベルを当業界で公知の方法、たとえば、イムノブロッティングにより測定することにより測定し得る。
別の実施形態において、化合物がそうしないとATPにより占有され得るγ-セクレターゼ、又はγ-セクレターゼの成分タンパク質（プレセニリン、ニカストリンおよびAPH1を含み得るγ-セクレターゼ多分子複合体におけるような）の部位に結合することによりγ-セクレターゼ活性を阻害する（ATP結合がキナーゼ活性又はγ-セクレターゼ活性の促進に必要である場合）。本発明によれば、このような化合物はATPに拮抗作用する。また、或る実施形態において、これらの化合物がATP結合部位でγ-セクレターゼ活性のモジュレーターに結合してもよく、前記モジュレーターはγ-セクレターゼ活性の集合、安定性、トラフィッキング又は活性化に必要であり、化合物の結合により拮抗作用される因子である。
別の実施形態において、Ａβのレベルがγ-セクレターゼ活性のモジュレーションを介してモジュレートされる。
１つの態様において、本発明は細胞又は組織をＡβレベルをモジュレートするのに充分な量の化合物と接触させることを含んでなる、細胞又は組織におけるＡβレベルのモジュレート方法を提供し、前記化合物が下記のファーマコフォア：
Figure 0004508645
［式中、ＸはCH-、Ｏ、NH又はN-CO-である。］
を含む。
１つの実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は図Ｉの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図Ｉ
Figure 0004508645
［式中、
ＡはCH又はＮであり、
ＢおよびＣは独立してCH、Ｎ又はN+-O-であり、
R1はＨ、SO2Ra、(C=O)rOsRaであり、
R2、R3、R4およびR5は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRbRcであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRc又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
前記アルキル-ヘテロシクリルは場合によってOHで置換されていてもよく、
Raは(C1-C6)アルキル、アリール又はヘテロシクリルであり、そして
RbおよびRcは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2Raであり、
ｒおよびｓは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、ＡがCHであり、ＢがＮであり、ＣがCHである。
別の実施形態において、R1がＨである。
別の実施形態において、R2がＨであり、R3がヘテロアリールである。
別の実施形態において、R4が(C=O)rOs(C1-C10)アルキルであり、R5が(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R3が3-ピリジニルである。
別の実施形態において、ｒが０であり、ｓが０であり、(C1-C10)アルキルがメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキルが直接結合(C0)であり、RbがＨであり、Rcが(C=O)rOsヘテロアリール又は(C=O)rOsヘテロシクリルである。
別の実施形態において、(C=O)rOsヘテロシクリルが以下に示される、4-ヒドロキシ-1-ピペラジノ又はその薬学上許容し得る塩である。
Figure 0004508645
別の実施形態において、(C=O)rOsヘテロアリールが以下に示される、3-ピリジニル又はその薬学上許容し得る塩である。
Figure 0004508645
別の実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は図IIの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図II
Figure 0004508645
［式中、
Ａ、ＢおよびＣは独立してCH、Ｎ又はN+-O-であり、
ＤはＯ、Ｓ又はN-R5であり、
R1はＨ、SO2Ra、(C=O)rRa又はCO2Raであり、
R2、R3およびR4は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRbRcであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R5はＨ、アリール又は(C1-C6)アルキルであり、
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRc又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
Raは(C1-C6)アルキル、アリール又はヘテロシクリルであり、そして
RbおよびRcは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2Raであり、
ｒおよびｓは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR6から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、R1がＨである。
別の実施形態において、R2がＨであり、R3が(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R4がヘテロアリールである。
別の実施形態において、前記ファーマコフォア含有化合物は、図IIIの化合物又はその薬学上許容し得る塩を含んでなる。
図III
Figure 0004508645
［式中、
Ａはアリール又はヘテロアリールであり、
前記アリール又はヘテロアリールは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
ＸはNH、N-アシル、Ｏ又はＳであり、
R1およびR2は独立してＨ、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル又は(C0-C6)アルキル-NRaRbであり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよく、
R3は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOsSt(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRaRb又は(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリルであり、
RaおよびRbは独立してＨ、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2R1、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール又はCO2R1であり、
ｒ、ｓおよびｔは独立して０又は１であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールは場合によってR3から選ばれた１つ以上の置換基で置換されていてもよい。］
別の実施形態において、Ａがアリールである。
別の実施形態において、そのアリールが2,5-ジクロロフェニルである。
別の実施形態において、R1が(C0-C6)アルキル-NRaRbであり、R2が(C=O)rOs(C1-C10)アルキルである。
別の実施形態において、(C=O)rOs(C1-C10)アルキルがメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキル-NRaRbが
Figure 0004508645
又はこれらの薬学上許容し得る塩である。
別の態様において、本発明は
Ａβレベルをモジュレートするのに充分な量の前記化合物、および
薬学上許容し得る賦形剤又は担体
を含んでなる、細胞又は組織におけるＡβレベルをモジュレートするのに有用な医薬組成物を提供する。
１つの実施形態において、医薬組成物が細胞又は組織により示されるＡβレベルをモジュレートするのに有用である。
別の実施形態において、化合物が前記Ａβレベルをモジュレートするのに充分な量で存在する。
図Ｉの化合物は当業者に公知の種々の方法により調製し得る。特に、ＡがCHであり、ＢがＮであり、ＣがCHであり、R1がＨである、図Ｉの化合物は下記の方法により調製し得る。
a)図IV
図IV
Figure 0004508645
［式中、ＹおよびＺは(C1-C6)アルキル基を構成し、R2およびR3は先に定義されたとおりである。］
の化合物を図Ｖ
図Ｖ
Figure 0004508645
［式中、R4およびR5は先に定義されたとおりである。］
の化合物と反応させる。
或る実施形態において、化合物が本発明の方法により同定される化合物であり、その化合物はγ-セクレターゼ活性、たとえば、ATP依存性γ-セクレターゼ活性をモジュレートし、γ-セクレターゼ活性のモジュレーションが細胞又は組織により示されるＡβのレベルの変化をもたらす。γ-セクレターゼ活性は当分野で周知であり、γ-セクレターゼ開裂領域におけるAPPの開裂を含む。
１つの実施形態において、目的の細胞又は組織におけるγ-セクレターゼ活性をin vitroでモジュレートするための方法が提供される。
別の実施形態において、目的の細胞又は組織におけるγ-セクレターゼ活性がin situ又はin vivoでモジュレートされる。in vitro適用、in situ適用およびin vivo適用は先に開示された細胞又は組織のいずれかにおける活性をモジュレートすることを含み得るが、これに限定されない。
本発明によれば、「細胞又は組織により示される」物質は、それが細胞若しくは組織により生成され、貯蔵(sequestered)され、摂取され、又は放出される物質、および細胞（若しくは組織）内に留まり、すなわち、細胞内にあり、又は細胞（若しくは組織）により分泌もしくは放出される（細胞外）物質を含む。
5.1.1. 治療方法
本発明は、アルツハイマー病などのAβ関連疾患の予防、治療、例えば管理、またはAβ関連疾患の症状の改善のための方法を提供する。ある症状の治療および/または改善の関係で本明細書に記載した方法は予防プロトコルの一部として常用的に利用することもできるものと解釈される。
本発明は、Aβ関連疾患の治療または症状の改善の方法であって、こうした治療または改善を必要とする被験者に、その被験者のAβレベルを低下させるのに十分な量の化合物を投与することを含む方法をも提供する。この際、この化合物がATP依存性酵素活性をモジュレートすることによって、Aβ関連疾患を治療するか、またはAβ関連疾患の症状を改善する。
１実施形態において、Aβ関連疾患はアルツハイマー病である。別の実施形態において、Aβ関連疾患の進行が緩慢化される。別の実施形態において、Aβ関連疾患の進行が逆行される。
別の実施形態において、被験者はヒト被験者である。特定の１実施形態において、被験者は家族性アルツハイマー病の危険性がある被験者である。
別の実施形態において、ATP依存性酵素活性が低下される。別の実施形態において、化合物は血液脳関門を通過する。別の実施形態において、化合物は経口投与される。本明細書で使用する場合、これは、同時または順次投与のいずれかを意味する。
別の実施形態において、化合物をNSAIDとともに投与する。特定の１実施形態において、NSAIDは硫化スリンダック、フルフェナム酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、メフェナム酸、インドメタシン、カルプロフェン、メクロフェナム酸である。
別の実施形態において、化合物を抗酸化剤とともに投与する。特定の１実施形態において、抗酸化剤はビタミンE、ビタミンC、クルクミン、およびギンコ・ビロバ(Gingko biloba)からなる群から選択される。
別の実施形態において、化合物はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤とともに投与される。
別の実施形態において、化合物はATPモジュレーターである。別の実施形態において、ATPモジュレーターは選択的モジュレーターである。
別の実施形態において、酵素活性はγ-セクレターゼ活性である。別の実施形態において、化合物はATP依存性酵素活性を示すγ-セクレターゼ酵素に結合する。
別の実施形態において、ATPモジュレーターはATP結合部位への結合についてATPと競合する。
１実施形態において、化合物はSTI-571もしくは血液脳関門透過性のその変異体、または薬学上許容し得るそれらの塩である。別の実施形態において、化合物はSTI-571のメシレート塩である。別の実施形態において、化合物はWGB-BC-15もしくは血液脳関門透過性のその変異体、または薬学上許容し得るそれらの塩である。別の実施形態において、化合物は化合物1-5のいずれかもしくは血液脳関門透過性のその変異体、または薬学上許容し得るそれらの塩である。
１実施形態において、酵素活性はキナーゼ活性である。１実施形態において、化合物はATP依存性酵素活性を示すキナーゼ酵素に結合する。１実施形態において、化合物はキナーゼ上のATP結合部位への結合についてATPと競合する。別の実施形態において、化合物はキナーゼ上のATP結合部位以外の部位に結合する。
特定の１実施形態において、キナーゼはチロシンキナーゼである。別の実施形態において、チロシンキナーゼはAb1キナーゼ、BCR-Ab1キナーゼ、ARGキナーゼ、srcキナーゼ、c-キット、血小板由来成長因子受容体である。
特定の１実施形態において、キナーゼはセリン/スレオニンキナーゼ、炭水化物キナーゼ、または脂質キナーゼである。
別の実施形態において、酵素活性はプロテアーゼ(例えばミトコンドリア内膜に局在する種類のAAAプロテアーゼ)、ホスファターゼまたは分子シャペロン分子(例えばhsp60、hsp70、hsp90)の活性である。
本発明は、Aβ関連疾患の治療または症状の改善の方法であって、こうした治療または改善を必要とする被験者に、その被験者のAβレベルを低下させることによって、Aβ関連疾患を治療するか、またはAβ関連疾患の症状を改善するのに十分な量のATPモジュレーターを投与することを含む方法をも提供する。
１実施形態において、Aβ関連疾患はアルツハイマー病である。１実施形態において、被験者はヒト被験者である。
１実施形態において、被験者は家族性アルツハイマー病の危険性がある被験者である。
別の実施形態において、ATPモジュレーターは血液脳関門を通過する。
別の実施形態において、ATPモジュレーターは経口投与される。別の実施形態において、ATPモジュレーターをNSAIDとともに投与する。別の実施形態において、NSAIDは硫化スリンダック、フルフェナム酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、メフェナム酸、インドメタシン、カルプロフェン、メクロフェナム酸である。
別の実施形態において、ATPモジュレーターを抗酸化剤とともに投与する。別の実施形態において、抗酸化剤はビタミンE、ビタミンC、クルクミン、およびギンコ・ビロバからなる群から選択される。
別の実施形態において、ATPモジュレーターはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤とともに投与される。
別の実施形態において、ATPモジュレーターは選択的モジュレーターである。
別の実施形態において、酵素活性はγ-セクレターゼ活性である。
１実施形態において、化合物はATP依存性酵素活性を示すγ-セクレターゼ酵素に結合する。別の実施形態において、ATPモジュレーターはATP結合部位への結合についてATPと競合する。
１実施形態において、化合物はSTI-571もしくは血液脳関門透過性のその変異体、または薬学上許容し得るそれらの塩である。別の実施形態において、化合物はSTI-571のメシレート塩である。別の実施形態において、化合物はWGB-BC-15もしくは血液脳関門透過性のその変異体、または薬学上許容し得るそれらの塩である。別の実施形態において、化合物は化合物1-5のいずれかもしくは血液脳関門透過性のその変異体、または薬学上許容し得るそれらの塩である。
１実施形態において、酵素活性はキナーゼ活性である。１実施形態において、化合物はATP依存性酵素活性を示すキナーゼ酵素に結合する。１実施形態において、化合物はキナーゼ上のATP結合部位への結合についてATPと競合する。別の実施形態において、化合物はキナーゼ上のATP結合部位以外の部位に結合する。
特定の１実施形態において、キナーゼはチロシンキナーゼである。別の実施形態において、チロシンキナーゼはAb1キナーゼ、BCR-Ab1キナーゼ、ARGキナーゼ、srcキナーゼ、c-キット、血小板由来成長因子受容体である。
特定の１実施形態において、キナーゼはセリン/スレオニンキナーゼ、炭水化物キナーゼ、または脂質キナーゼである。
別の実施形態において、酵素活性はプロテアーゼ(例えばミトコンドリア内膜に局在する種類のAAAプロテアーゼ)、ホスファターゼまたは分子シャペロン分子(例えばhsp60、hsp70、hsp90)の活性である。
本発明は、Aβ関連疾患の治療または症状の改善の方法であって、こうした治療または改善を必要とする被験者に、その被験者のAβレベルを低下させることによって、Aβ関連疾患を治療するか、またはAβ関連疾患の症状を改善するのに十分な量の化合物を投与することを含む方法であって、この際、化合物が以下のファーマコフォアを含有するもの、をも提供する。
Figure 0004508645
［式中、XはCH-、O、NH、またはN-CO-である。］
１実施形態において、上記ファーマコフォアを含有する化合物は図Ｉの化合物または薬学上許容し得るその塩を含む：
図Ｉ
Figure 0004508645
［AはCHまたはN;
BおよびCは独立してCH、NまたはN+-O-;
R1はH、SO2Ra、(C=O)rOsRa;
R2、R3、R4およびR5は独立してH、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル、または(C0-C6)アルキル-NRbRc、
この際、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選択される１以上の置換基で置換されており、
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRcまたは(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリル、
この際、前記アルキル-ヘテロシクリルは場合によってOHで置換されており;
Raは(C1-C6)アルキル、アリールまたはヘテロシクリル; そして
RbおよびRcは独立してH、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリールまたはCO2Raであり、
この際、rおよびsは独立して0または1であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールは場合によってR6から選択される１以上の置換基で置換されている。］
別の実施形態において、AはCH、BはN、そしてCはCHである。
別の実施形態において、R1はHである。
別の実施形態において、R2はH、そしてR3はヘテロアリールである。
別の実施形態において、R4は(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、そしてR5は(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R3は3-ピリジニルである。
別の実施形態において、rは0、sは0、そして(C1-C10)アルキルはメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキルは直接結合(C0)、RbはH、そしてRcは(C=O)rOsヘテロアリールまたは(C=O)rOsヘテロシクリルである。
別の実施形態において、(C=O)rOsヘテロシクリルは以下に図示する4-ヒドロキシ-1-ピペラジノまたは薬学上許容し得るその塩である。
Figure 0004508645
別の実施形態において、ファーマコフォアを含有する化合物は図IIの化合物または薬学上許容し得るその塩を含む：
図II
Figure 0004508645
［A、BおよびCは独立してCH、NまたはN+-O-;
DはO、SまたはN-R5;
R1はH、SO2Ra、(C=O)rRaまたはCO2Ra;
R2、R3およびR4は独立してH、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル、または(C0-C6)アルキル-NRbRc、
この際、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選択される１以上の置換基で置換されており、
R5はH、アリールまたは(C1-C6)アルキル;
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRcまたは(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリル;
Raは(C1-C6)アルキル、アリールまたはヘテロシクリル; そして
RbおよびRcは独立してH、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリールまたはCO2Raであり、
この際、rおよびsは独立して0または1であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールは場合によってR6から選択される１以上の置換基で置換されている。］
別の実施形態において、R1はHである。
別の実施形態において、R2はH、そしてR3は(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R4はヘテロアリールである。
別の実施形態において、上記ファーマコフォアを含有する化合物は図IIIの化合物または薬学上許容し得るその塩を含む：
図III
Figure 0004508645
［Aはアリールまたはヘテロアリール、
この際、前記アリールまたはヘテロアリールは場合によってR3から選択される１以上の置換基で置換されており;
XはNH、N-アシル、OまたはS;
R1およびR2は独立してH、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル、または(C0-C6)アルキル-NRaRb、
この際、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR3から選択される１以上の置換基で置換されており;
R3は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOsSt(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRaRbまたは(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリル;
RaおよびRbは独立してH、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2R1、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリールまたはCO2R1であり、
この際、r、sおよびtは独立して0または1であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールは場合によってR3から選択される１以上の置換基で置換されている。］
別の実施形態において、Aはアリールである。
別の実施形態において、アリールは2,5-ジクロロフェニルである。
別の実施形態において、R1は(C0-C6)アルキル-NRaRb、そしてR2は(C=O)rOs(C1-C10)アルキルである。
別の実施形態において、(C=O)rOs(C1-C10)アルキルはメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキル-NRaRbは次式化合物または薬学上許容し得るその塩である。
Figure 0004508645
別の実施形態において、薬剤は経口投与される。
一実施形態において、化合物をNSAIDとともに投与する。別の実施形態において、NSAIDは硫化スリンダック、フルフェナム酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、メフェナム酸、インドメタシン、カルプロフェン、メクロフェナム酸である。
一実施形態において、化合物を抗酸化剤とともに投与する。特定の１実施形態において、抗酸化剤はビタミンE、ビタミンC、クルクミン、およびギンコ・ビロバからなる群から選択される。
別の実施形態において、化合物はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤とともに投与される。
5.1.2. モジュレート化合物
5.1.2.1. Aβレベルをモジュレートする化合物
本発明は、限定するわけではないが、本明細書中で以後開示する以下の化合物(または薬剤)を含む、細胞または組織が示すAβレベルをモジュレートするための組成物をも提供する。また、本発明は、限定するわけではないが、本明細書中で以後開示する以下の薬剤、薬物、化合物または小分子を含む、γ-セクレターゼの活性をモジュレートすることによってAβレベルをモジュレートするための組成物をも提供する。
１実施形態において、本発明はATP依存性γ-セクレターゼ活性のモジュレーターおよび薬学上許容し得るベヒクルを含む、細胞または組織が示すAβレベルをモジュレートするための組成物を提供する。この実施形態の１態様において、Aβレベルを低下させる。別の態様において、Aβレベルを上昇させる。別の態様において、AβはAβ40である。別の態様において、AβはAβ42である。別の態様において、モジュレーターはキナーゼの１つに結合する。別の態様において、モジュレーターはキナーゼ上のATP結合部位への結合についてATPと競合する。別の態様において、化合物はATPモジュレーターである。別の態様において、キナーゼは例えばAb1キナーゼ、BCR-Ab1キナーゼ、ARGキナーゼ、srcキナーゼ、c-キットまたは血小板由来成長因子受容体である。別の態様において、モジュレーターはAb1キナーゼ活性をモジュレートしない。別の態様において、モジュレーターはATP依存性酵素活性の阻害剤である。別の態様において、モジュレーターはNotch-1切断を阻害しない。別の態様において、モジュレーターは血液脳関門を通過することができる。別の態様において、阻害剤は選択的阻害剤である。別の態様において、選択的阻害剤はSTI-571、WGB-BC-15、化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5または血液脳関門透過性のその変異体である。
中でも好ましい化合物は、ATPモジュレーターであるものである。
いくつかの実施形態において、ATP阻害剤などのATPモジュレーターとしては、限定するわけではないが、以下のものが含まれる：フェニルアミノピリミジンチロシンキナーゼ阻害剤、例えば2-フェニルアミノピリミジン、ピリミジニルピリジオンチロシンキナーゼ阻害剤、2-(プリン-9-イル)-テトラヒドロフラン-3,4-ジオール誘導体；ピリドキシンおよびピリドキサール類似体；N-6 ヘテロサイクリック 8-修飾アデノシン誘導体；N-6 ヘテロサイクリック 5'-修飾アデノシン誘導体；ピルビン酸キナーゼのアロステリック阻害剤；8-フェニルキサンチン、8−シクロアルキルキサンチンまたは8-置換キサンチン誘導体；N-6置換アデノシン-5'-ウロナミド；プリン、ピロロ[2,3,d]ピリミジンおよびピラゾロ[3,4,d]ピリミジンヌクレオシド類似体。
別の実施形態において、化合物、例えばATPモジュレーターとして、限定するわけではないが、以下の化合物が含まれる：
ヘテロサイクリック-ヒドロキシイミノフルオレン核化合物；3-アニリノメチレンオキシインドール類；3-(4'-ブロモベンジルインデニル)-2-インドリノン類似体；インデノ[1,2,c]-ナフトール[1,2,c]およびベンゾ[6,7]シクロヘプタ[1,2,c]ピラゾール誘導体；3'-エピメリック k-252a誘導体；キナゾリン類；3-シアノ-[1,7],[1,5]および[1,8]-ナフチリジン類似体；N-[4-(3-クロロ-4-フルオロ-フェニルアミノ)-7-(3-モルホリン4-イル-プロポキシ)-キナゾリン-6-イル]-アクリルアミド；ピリミジン誘導体；ベンズイミダゾール類；２環式ヘテロ芳香族化合物；ピロロピリミジン類；キノリンおよびキノキサリン誘導体；インドリノン類；2-ピリミジンアミン誘導体；置換ピリド[3,2,d]ピリミジン類；融合多環式 2-アミノピリミジン誘導体；2環式 4-アラルキルアミノピリミジン誘導体；N-7-ヘテロシクリルピロロ[2,3,d]ピリミジン類；3-シアノキノリン誘導体；ピラゾール誘導体；ピリミド[5,4,d]ピリミジン類；4-アニリノキナゾリン誘導体；6-アリールナフチリジン類；アミノ含有ピリド[2,3,d]ピリミジン類のN-オキシド；5-アミノピラゾール類；5,10-ジヒドロピリミド[4,5,b]キノリン-4(1H)-オン；キノリメチレン-オキシインドール類似体；アクリロニトリル-スルホンアミド誘導体；3-(4'-ジメチルアミノベンジリデニル)-2-インドリン類；3-(2'-アルコキシベンジリデニル)2-インドリン類；3-(4'-ブロモベンジリデニル)-2-インドリン類；ベンジリデン-Z-インドリン化合物；4,6-ジアニリノ-ピリミジン誘導体；置換インドリルメチレン-オキシインドール類似体；水溶性3-アリーリデン-2-オキシインドール類似体；3-(2'-ハロベンジリデニル)-2-インドリノン化合物；3-ヘテロアリール-2-インドリノン化合物；ベンゾイルエチレン誘導体；尿素およびチオ尿素型化合物；ベンゾピラン誘導体；ピリド[2,3,d]ピリミジン類；6-アリール-ピリド[2,3,d]ピリミジン類およびナフチリジン類；置換3-アリーリデン-7-アザオキシインドール化合物；チエニル化合物；アリールおよびヘテロアリールキナゾリン化合物；アリー
リデンおよびヘテロアリーリデンオキシインドール誘導体；N-置換-ベータ-アリール-およびベータ-ヘテロアリール-アルファ-シアノアクリルアミド誘導体；2-イミノクロメン誘導体；4-アミノピロロ[2,3,d]ピリミジン類；4-アミノピラゾロ(3,4,d)ピリミジン誘導体；4-アミノピラゾロ(3,4,d)ピリジン誘導体；3-(シクロアルカノヘテロアリーリデニル)-2-インドリノン類；イソキサゾール-4-カルボキサミド化合物；3-(シクロアルカノヘテロアリーリデニル)-2-インドリノン類；置換フェニルアクリロニトリル化合物；ベンジリデン-Z-インドリン化合物；3-(2'-ハロベンジリデニル)-2-インドリノン化合物；ベンゾピラン化合物；または4-アミノピリミジン類；イソキサゾール化合物。こうした化合物は例えばキナーゼモジュレーター、例えば阻害剤として使用することができる。
適切な化合物として例えば以下のものも含まれる：STI-571、STI-571のメシレート塩(イマチニブメシレート、GLEEVEC(商標), Novartis Pharmaceuticals)、およびその同属体、2-フェニルアミノピリミジンクラスの化合物のメンバー、化合物1-5など、さらにはBcr-Ab1、Ab1キナーゼ、またはc-キット、血小板由来成長因子受容体(PDGFR)、およびSTI-571によって阻害されることが知られているかこれから示される、その他のあらゆるキナーゼ上のATP結合部位について競合する化合物。あるいは、ピリジオンチロシンキナーゼ阻害剤クラスなどの関連化合物も本発明での使用のための候補と成り得る。
別の実施形態において、本発明の薬剤は、γ-セクレターゼ上またはγ-セクレターゼの成分タンパク質上のいずれかの部位に結合することによって、γ-セクレターゼ活性を阻害する。
さらに、本発明の方法の一部として使用することができる化合物として、限定するわけではないが、以下のファーマコフォアを含む化合物が含まれる。
Figure 0004508645
［式中、XはCH-、O、NH、またはN-CO-である。］
１実施形態において、上記ファーマコフォアを含有する化合物は図Ｉの化合物または薬学上許容し得るその塩を含む：
図Ｉ
Figure 0004508645
［AはCHまたはN;
BおよびCは独立してCH、NまたはN+-O-;
R1はH、SO2Ra、(C=O)rOsRa;
R2、R3、R4およびR5は独立してH、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル、または(C0-C6)アルキル-NRbRc、
この際、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選択される１以上の置換基で置換されており、
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRcまたは(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリル、
この際、前記アルキル-ヘテロシクリルは場合によってOHで置換されており;
Raは(C1-C6)アルキル、アリールまたはヘテロシクリル; そして
RbおよびRcは独立してH、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリールまたはCO2Raであり、
この際、rおよびsは独立して0または1であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールは場合によってR6から選択される１以上の置換基で置換されている。］
別の実施形態において、AはCH、BはN、そしてCはCHである。
別の実施形態において、R1はHである。
別の実施形態において、R2はH、そしてR3はヘテロアリールである。
別の実施形態において、R4は(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、そしてR5は(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R3は3-ピリジニルである。
別の実施形態において、rは0、sは0、そして(C1-C10)アルキルはメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキルは直接結合(C0)、RbはH、そしてRcは(C=O)rOsヘテロアリールまたは(C=O)rOsヘテロシクリルである。
別の実施形態において、(C=O)rOsヘテロシクリルは以下に図示する4-ヒドロキシ-1-ピペラジノまたは薬学上許容し得るその塩である。
別の実施形態において、(C=O)rOsヘテロアリールは以下に図示する3-ピリンジニルまたは薬学上許容し得るその塩である。
別の実施形態において、ファーマコフォアを含有する化合物は図IIの化合物または薬学上許容し得るその塩を含む：
図II
Figure 0004508645
［A、BおよびCは独立してCH、NまたはN+-O-;
DはO、SまたはN-R5;
R1はH、SO2Ra、(C=O)rRaまたはCO2Ra;
R2、R3およびR4は独立してH、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル、または(C0-C6)アルキル-NRbRc、
この際、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR6から選択される１以上の置換基で置換されており、
R5はH、アリールまたは(C1-C6)アルキル;
R6は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOs(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRbRcまたは(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリル;
Raは(C1-C6)アルキル、アリールまたはヘテロシクリル; そして
RbおよびRcは独立してH、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2Ra、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリールまたはCO2Raであり、
この際、rおよびsは独立して0または1であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールは場合によってR6から選択される１以上の置換基で置換されている。］
別の実施形態において、R1はHである。
別の実施形態において、R2はH、そしてR3は(C0-C6)アルキル-NRbRcである。
別の実施形態において、R4はヘテロアリールである。
別の実施形態において、上記ファーマコフォアを含有する化合物は図IIIの化合物または薬学上許容し得るその塩を含む：
図III
Figure 0004508645
［Aはアリールまたはヘテロアリール、
この際、前記アリールまたはヘテロアリールは場合によってR3から選択される１以上の置換基で置換されており;
XはNH、N-アシル、OまたはS;
R1およびR2は独立してH、OH、CHO、CN、ハロゲン、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、(C=O)rOs(C2-C10)アルケニル、(C=O)rOs(C2-C10)アルキニル、(C=O)rOsシクロアルキル、(C=O)rOsシクロアルケニル、(C=O)rOsシクロアルキニル、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリール、(C=O)rOsパーフルオロアルキル、または(C0-C6)アルキル-NRaRb、
この際、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールおよびパーフルオロアルキルは場合によってR3から選択される１以上の置換基で置換されており;
R3は(C=O)rOsNRaRb、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロシクリル、ハロゲン、OH、オキソ、(C=O)rOs(C1-C3)パーフルオロアルキル、(C=O)rOsSt(C1-C6)アルキル、CHO、CO2H、CN、(C0-C6)アルキル-NRaRbまたは(C1-C6)アルキル-ヘテロシクリル;
RaおよびRbは独立してH、(C=O)rOs(C1-C10)アルキル、SO2R1、(C=O)rOsヘテロシクリル、(C=O)rOsアリール、(C=O)rOsヘテロアリールまたはCO2R1であり、
この際、r、sおよびtは独立して0または1であり、前記アルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールは場合によってR3から選択される１以上の置換基で置換されている。］
別の実施形態において、Aはアリールである。
別の実施形態において、アリールは2,5-ジクロロフェニルである。
別の実施形態において、R1は(C0-C6)アルキル-NRaRb、そしてR2は(C=O)rOs(C1-C10)アルキルである。
別の実施形態において、(C=O)rOs(C1-C10)アルキルはメチルである。
別の実施形態において、(C0-C6)アルキル-NRaRbは次式化合物または薬学上許容し得るその塩である。
Figure 0004508645
図Ｉの化合物は当業者に公知の各種の方法によって調製することができる。特に、AがCH、BがN、CがCH、そしてR1がHの場合の図Ｉの化合物は以下の方法によって調製することができる：
a) 図IVの化合物を図Vの化合物と反応させる。
図IV
Figure 0004508645
［式中、YおよびZは(C1-C6)アルキル基を構成し、そしてR2およびR3は上記定義の通りである。］
図V
Figure 0004508645
［式中、R4およびR5は上記定義の通りである。］
図IIの化合物は当業者に公知の各種の方法によって調製することができる。特に、AがN、BがN、CがCH、そしてR1がHの場合の図IIの化合物は以下の方法によって調製することができる：
a) 図VIの化合物を図VIIの化合物と反応させる。
図VI
Figure 0004508645
［式中、YおよびZは(C1-C6)アルキル基を構成し、そしてR2およびR3は上記定義の通りである。］
図VII
Figure 0004508645
［式中、DおよびR4は上記定義の通りである。］
図IIIの化合物は当業者に公知の各種の方法によって調製することができる。特に、XがOの場合の図IIIの化合物は以下の方法によって調製することができる：
a) 図VIIIの化合物を塩基性条件下で図IXの化合物と反応させる。
図VIII
Figure 0004508645
［式中、R1およびR2は上記定義の通りである。］
図IX
Figure 0004508645
［式中、Xは(C1-C6)アルキル基、そしてAは上記定義の通りである。］
１実施形態において、本発明の方法によって利用される化合物は米国特許第5,385,915号(その全部を参照により本明細書中に引用する)、特に第11欄、13-20行に開示されたいずれのものでもない。
候補化合物は例えば以下のような標準アッセイを使用して常套的にアッセイし、適切なATPモジュレーターであることを判定することができる：Xuら、1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94: 3748-3752、またはZhangら、2001, Biochemistry 40: 5049-5055。
好ましくは、治療方法で投与される化合物(または薬剤)は、Aβ関連疾患の治療を可能にするのに十分な量および十分な速度で血液脳関門を通過することができる。こうした１実施形態において、化合物を静脈内投与する。別の実施形態において、化合物は経口投与する。より好ましくは、化合物は担体を伴わないで血液脳関門を通過することができる(投与方法および経路については、第5.1.2.5節参照)。
しかし、Aβは脳組織中および中枢神経系(CNS)中のみに存在するのではなく、脳外の血液などの末梢組織中および大部分の臓器中にも存在する。そこで、AβはAPPのプロセシングによっても産生される。脳内Aβと脳外Aβ間には均衡が存在している(DeMattosら、2001, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(15): 8850-8855)。末梢中のAβの減少は脳内Aβの減少をもたらす。これは可溶性Aβの再分配によるものと推定される。こうして、血液脳関門を通過しない化合物でも、Aβレベルをモジュレートし、Aβ関連疾患、またはその症状を予防または治療するのに利用することができる。
5.1.2.2. 医薬組成物および製剤
本発明は、本明細書に開示する本発明の薬剤、薬物または化合物の医薬組成物を提供する。
１実施形態において、本発明は、細胞または組織におけるAβレベルをモジュレートするのに十分な量の本明細書中の上記の化合物および薬学上許容し得る賦形剤もしくは担体を含む医薬組成物を提供する。
別の実施形態において、医薬組成物は、細胞または組織におけるATP依存性Aβレベルを低下させる化合物、以下の群から選択される化合物、および薬学上許容し得る賦形剤もしくは担体を含む：NSAID、例えば硫化スリンダック、フルフェナム酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、メフェナム酸、インドメタシン、カルプロフェン、メクロフェナム酸、抗酸化剤、例えばビタミンE、ビタミンC、クルクミン、およびギンコ・ビロバ、非選択的COX阻害剤、ならびにアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
薬剤、薬物もしくは化合物、または生理学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物は、以下の投与用に製剤化することができる：注射用、または経口、局所、経鼻、吸入、吹き込み(口もしくは鼻経由)、バッカル、非経腸、直腸投与用、またはその他の投与形態用。いくつかの実施形態において、浸透圧ポンプによるくも膜下投与、経口強制投与、または腹腔内投与によって、投与を達成させる。
本発明は、十分な量の本発明の薬剤(群)とともに製薬上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、賦形剤および/または担体を含む医薬組成物を提供する。こうした組成物には、各種バッファー含有物(例えばTris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、pHおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤(例えばTween80、ポリソルベート80)、抗酸化剤(例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(Thimerosal、ベンジルアルコール)ならびに増量物質(例えばラクトース、マンニトール)などの添加剤が含まれる。
組成物を、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、その他などのポリマー化合物またはリポソームの粒子調製物中に組み入れることもできる。ヒアルロン酸も使用することができる。生体適合性吸収性ポリマーは脂肪族ポリエステル、コポリマーおよびブレンドからなる群から選択することができる。これらとして限定するわけではないが以下のもののホモポリマーおよびコポリマーが含まれる：ラクチド(これにはD-、L-乳酸ならびにD-、L-、およびメソラクチドが含まれる)、クリコリド(グリコール酸を含む)、イプシロン-カプロラクトン、p-ジオキサノン(1,4-ジオキサン-2-オン、米国特許第4,052,988号に開示されている)、p-ジオキサノンのアルキル置換誘導体(すなわち、6,6-ジメチル-1,4-ジオキサン-2-オン、米国特許第5,703,200号に開示されている)、炭酸トリエチレン(1,3-ジオキサン-2-オン)、1,3-ジオキサノンのアルキル置換誘導体(米国特許第5,412,068号に開示されている)、デルタ-バレロラクトン、ベータ-ブチロラクトン、ガンマ-ブチロラクトン、イプシロン-デカラクトン、ヒドロキシブチレート、ヒドロキシバレレート、1,4-ジオキセパン-2-オン(米国特許第4,052,988号に開示されている、およびそのダイマー、1,5,8,12-テトラオキサシクロテトラデカン-7,14ジオン)、1,5-ジオキセパン-2-オン、ならびにこれらのポリマーブレンド。
こうした組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、in vivo放出速度、ならびにin vivoクリアランス速度に影響を与えることができる。例えば、以下を参照されたい：Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.,(1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)、1435-1712ページ。組成物を液体形態として、または凍結乾燥形態などの乾燥粉末として調製することができる。
本発明での使用に想定するものは経口固形投与剤形である。これは以下に開示されている：Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.1990 (Mack Publishing Co., Easton, PA 18042)、第89章。固形剤形には錠剤、カプセル、ピル、トローチもしくはバッカル錠、カシェまたはペレットが含まれる。また、リポソームもしくはプロテノイドカプセル封入を使用して、本発明の組成物を製剤化することもできる(例えば米国特許第4,925,673号に報告されているプロテノイドミクロスフェア)。リポソームカプセル封入を使用してもよく、このリポソームは各種のポリマーから誘導することができる(例えば米国特許第5,013,556号)。治療薬として可能な固形投与剤形についての記載が以下にある：Marshall,K., Modern Pharmaceutics, G.S.Banker and C.T.Rhodes 編集、第10章, 1979。一般的に、製剤には薬剤と不活性成分を含ませる(これは胃環境に対する保護と腸内での生物学的活性物質の放出を可能にするためである)。
完全な耐胃液性を確実にするため、少なくともpH 5.0まで非透過性のコーティングが有用である。腸溶コーティングとして使用するさらに一般的な不活性成分の例は以下のものである：セルロースアセテートトリメリテート(CAT)、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、ポリビニルアセテートフタレート(PVAP)、オイドラギット（Eudragit） L3OD、アクアテリック（Aquateric）、セルロースアセテートフタレート(CAP)、オイドラギット L、オイドラギット S、およびシェラック（Shellac）。これらのコーティングを混合フィルムとして使用することもできる。
胃に対する保護を意図するものではないコーティングまたはコーティングの混合物を錠剤上に使用することもできる。これらとして、糖類コーティング、または錠剤の飲み込みをより容易にするコーティングが含まれる。カプセルは乾燥治療薬、すなわち粉末の送達のためには硬質外殻(ゼラチンなど)で構成し、液剤のためには軟質ゼラチン外殻を使用することができる。カシェの外殻材は濃厚でんぷんまたはその他の可食性ペーパーとする。ピル、トローチ、成型錠剤または粉薬錠剤のためには、湿式集塊技法を使用することができる。
製剤中に、治療薬を顆粒またはペレットの形態の微小多粒子として含ませることができる。カプセル投与用の材料の製剤も粉末、軽く圧縮したプラグ、またはタブレット状とすることもできる。治療薬は圧縮によって調製することもできる。
着色剤および香味剤もすべて含ませることができる。例えば、タンパク質(または誘導体)を(リポソームまたはミクロスフェアカプセル封入によるなどして)製剤化し、次に着色剤および香味剤を含有する冷蔵飲料などの可食性製品中にさらに含ませることができる。
治療薬を不活性材料または充填剤によって希釈するか、その体積を増加させてもよい。これらの希釈剤または充填剤として以下のものが含まれる：炭水化物、特にマンニトール、a-ラクトース、無水ラクトース、セルロース(例えば微結晶セルロース)、ショ糖、リン酸水素カルシウムで修飾したデキストランおよびでんぷん。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含む一定の無機塩も充填剤として使用することができる。市販の希釈剤のいくつかとして、Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompressおよびアビセル（Avicell）がある。
治療薬の製剤中に、崩壊剤を含ませて固形投与剤としてもよい。崩壊剤として使用する材料として、限定するわけではないが、でんぷん(例えばジャガイモでんぷんまたは市販のでんぷん基剤の崩壊剤、Explotab)が含まれる。グリコール酸ナトリウムでんぷん、アンバーライト（Amberlite）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトもすべて使用することができる。崩壊剤の別の形態は不溶性カチオン交換樹脂である。粉末化ガムを崩壊剤および結合剤として使用することができ、これらとしてアガー、カラヤまたはトラガカントなどの粉末化ガムが含まれる。アルギン酸およびそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
治療用薬剤をまとめた硬質錠剤の形態を保持するために、結合剤を使用することができる。これらとしてアカシア、トラガカント、でんぷん(例えば事前ゼラチン化トウモロコシでんぷん)およびゼラチンなどの天然産物からの材料が含まれる。その他として、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)およびカルボキシメチルセルロース(CMC)が含まれる。ポリビニルピロリドン(PVP)およびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は両方ともアルコール性溶液として治療薬を顆粒化するために使用することができる。
製剤工程中の粘着を防止するため、治療薬の製剤中に抗摩擦剤を含ませることができる。治療薬とダイ壁との間の一層として、潤滑剤を使用することができ、これらとして限定するわけではないが以下のものが含まれる：マグネシウム塩およびカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン(PTEE)、液体パラフィン、植物油およびワックス、タルクならびにシリカ。以下のような可溶性潤滑剤も使用することができる：ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、各種分子量のポリエチレングリコール、カーボワックス（Carbowax） 4000および6000。
製剤中に薬物の流動特性を改善し、圧縮時の再構成を促進するために、流動促進剤を添加することができる。流動促進剤としてでんぷん、タルク、超微粉 (パイロジェン)シリカおよび水和シリコアルミネートが含まれる。
水性環境中への治療薬の溶解を促進するため、界面活性剤を湿潤剤として添加することができる。界面活性剤として、以下のようなアニオン性洗浄剤が含まれる：ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルナトリウムスルホスクシネートおよびジオクチルナトリウムスルホネート。カチオン性洗浄剤も使用することができ、これらとして塩化ベンズアルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが含まれる。界面活性剤として製剤中に含ませることができる可能な非イオン性洗浄剤を以下に列挙する：ラウロマクロゴール 400、ポリオキシル 40 ステアレート、ポリオキシエチレン水素化カスター油 10、50および60、グリセロールモノステアレート、ポリソルベート 40、60、65および80、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロースならびにカルボキシメチルセルロース。これらの界面活性剤はタンパク質または誘導体の製剤中に単独または各種比率での混合物としてのいずれかで存在させることができる。
薬剤の摂取能力を強化する添加剤は、例えば脂肪酸、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
制御放出経口製剤が望ましい。拡散または浸出機構のいずれかによって放出を可能にする不活性マトリックス、例えばガム中に薬剤を組み入れることができる。徐々に変成するマトリックスも製剤中に組み入れることができる。腸溶コーティングのいくつかも遅延放出効果を持っている。
本治療薬の別の制御放出の形態は、Oros治療システム(Alza Corp.)に基づく方法による。すなわち、薬物を半透過性膜中に封入し、この膜が、単一の小さい開口部を通る、浸透圧効果による水の浸入と、薬物の押し出しを可能にするものである。
その他のコーティングもこの製剤のために使用することができる。これらとして、コーティングパン中に適用することができる各種の糖類が含まれる。治療薬剤をフィルムコーティングした錠剤として提供することもできる。この例で使用する材料は２つのグループに分けられる。第１は非腸溶性材料であって、以下の者が含まれる：メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ-エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース、ナトリウムカルボキシ-メチルセルロース、プロビドンおよびポリエチレングリコール類。第２グループは腸溶性材料であり、一般的にはフタル酸のエステルである。
最適フィルムコーティングを提供するため、混合材料を使用することができる。フィルムコーティングはパンコーティング機中または流動床中で、あるいは圧縮コーティングによって実施することができる。
経口投与用の液体調製物は例えば溶液、シロップもしくは懸濁液の形態とするか、または使用前に液体もしくはその他の好適なベヒクルと組成するための乾燥製品として提供することができる。こうした液体調製物は以下のような薬学上許容し得る添加物とともに慣用手段によって調製することができる：懸濁剤(例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化可食性脂肪)；乳化剤(例えばレシチンまたはアカシア)；非水性ベヒクル(例えばアーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは分留植物油)；および保存剤(メチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)。この調製物に適宜バッファー塩、香味剤、着色剤および甘味剤を含ませてもよい。
薬剤の経鼻送達も想定している。経鼻送達は、治療薬製品を鼻に投与した後、その製品を肺に蓄積させる必要がなく、タンパク質を直接血流に通過させることができる。経鼻送達用の製剤にはデキストランまたはシクロデキストランを含むものがある。
吸入による投与用には、本発明の化合物を例えば以下のような好適な噴射剤を使用する、加圧パックまたはネブライザーからのエアゾルスプレー提供の形態で好都合に送達される：ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の好適な気体。加圧エアゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを装備することによって投与単位を確定することができる。吸入器または吹き込み器での使用のための、化合物とラクトースまたはでんぷんなどの好適な粉末基剤の粉末混合物を含む、例えばゼラチンのカプセルまたはカートリッジを製剤化することができる。
化合物を注射、例えばボーラス注射または連続注入による非経腸投与用に製剤化することができる。注射用製剤は保存剤を添加した例えばアンプル中、または多回投与用容器中の単位投与剤形で提供することができる。
組成物は油性もしくは水性ベヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形態とすることができ、懸濁剤、安定剤および/または分散剤などの製剤化剤を含ませることができる。あるいは、活性成分を、使用前に好適なベヒクル、例えば滅菌した発熱物質を含まない水で組成することができる。
化合物を、例えばカカオバターまたはその他のグリセリドなどの慣用の座薬基剤を含有させて、坐剤または貯留性浣腸剤などの直腸用組成物に製剤化することができる。
上記開示の製剤のほかに、化合物をデポ調製物として製剤化することもできる。こうした長期作用性製剤をインプラント(例えば皮下もしくは筋内)によるかまたは筋内注射によって投与することができる。こうして、例えば、化合物を好適なポリマーもしくは疎水性材料とともに(例えば許容される油中のエマルジョンとして)、またはイオン交換樹脂とともに製剤するか、あるいは難溶性誘導体、例えば難溶性塩として製剤化することができる。
所望ならば、組成物を、活性成分を含む１単位剤形以上を含有するパックまたは分配器具で提供することができる。パックは例えば金属またはプラスチックホイルからなり、例えばブリスターパックである。パックまたは分配器具には投与説明書を添付することができる。
その他の医薬組成物を本発明の医薬組成物と共に(順次または同時)共投与することができる。共投与は上記のものと同一または別種の医薬組成物中のその他の医薬組成物の投与によって達成することができる。１実施形態において、例えば以下のようなNSAIDを共投与する：硫化スリンダック、フルフェナム酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、メフェナム酸、インドメタシン、カルプロフェンまたはメクロフェナム酸。別の実施形態において、非選択的COX阻害剤を共投与する。別の実施形態において、抗酸化剤を共投与する。特定の実施形態において、抗酸化剤は、ビタミンE、ビタミンC、クルクミン、およびギンコ・ビロバからなる群から選択される。別の実施形態において、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤を共投与する。
5.1.2.3. 製品
本発明は、パッケージング材とこのパッケージング材中に含ませた本発明の医薬組成物を含む製品であって、この医薬組成物が被験者、好ましくはヒトへの投与に好適な形態であるか、または被験者への投与のために希釈するか再構成することができる形態のものをも提供する。１実施形態において、この製品はさらに医薬組成物の使用もしくは投与を指示する印刷された説明書および/またはラベルを含む。
特に、この製品は、パッケージング材とこのパッケージング材中に含ませたATP依存性Aβレベルを低下させる化合物および薬学上許容し得る担体を含む医薬組成物が含まれた製品であって、この医薬組成物が被験者への投与に好適な形態であるもの、を含む。こうした製品にはさらに医薬組成物の使用もしくは投与に関する印刷された説明書を含ませることができる。例えば、説明書では、アルツハイマー病の予防、治療または症状の改善などの、Aβ関連疾患の予防、治療または症状の改善のための投与計画が示唆される。本発明の製品にはさらに医薬組成物の使用または投与に関するラベルを含ませることができる。例えばラベルでは、アルツハイマー病などのAβ関連疾患の予防、治療または症状の改善のための投与計画を示唆することができる。１実施形態において、製品はさらに抗酸化剤、非選択的COX阻害剤またはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を含むことができる。
いずれの医薬製品についてもそうであるように、保存および輸送中の製品の安定性を保護するように、本発明の製品のパッケージング材および容器を設計する。より特定すると、本発明は箱、ビン、チューブ、バイアル、容器、噴霧器、吹き込み器、静脈(i.v.)バッグ、包装材などのパッケージング材；ならびにこのパッケージング材中に含ませた少なくとも１単位投与剤形の本発明の医薬組成物を含む製品を提供する。
5.1.2.4. 投薬量
こうした化合物の毒性および治療効力は、例えばLD50(集団の50%が死亡する用量)およびED50(集団の50%に治療上効果がある用量)の判定について、細胞培養物中または実験動物で標準的医薬操作法によって判定することができる。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、比率、LD50/ED50として表現することができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することはできるが、罹患していない細胞への損傷の可能性を最少にすることによって副作用を減少させるため、こうした化合物が罹患組織の部位を標的とする送達システムを設計するように、注意すべきである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から取得したデータを、人での使用のための投薬量範囲を製剤する際に使用することができる。こうした化合物の投与量は好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を持たないED50を含む循環濃度範囲内とする。投薬量は、使用する投与剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変更させることができる。本発明方法で使用するどんな化合物についても、治療上十分な用量は、最初に細胞培養アッセイから見積もることができる。細胞培養において決定したIC50(すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデル中での１用量を製剤化することができる。こうした情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
いくつかの実施形態において、当分野で公知の軽度認知障害を評価するための標準的方法を使用して、被験者または患者での軽度認知障害の最初の徴候時に、治療を開始することができる。別の実施形態において、例えば被験者が家族性アルツハイマー病の危険性がある場合に、軽度認知障害の発症前に、治療を開始することができる。
いくつかの実施形態において、１治療計画を予防または抑制措置として使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、例えば65才またはそれ以上の高齢者に１治療計画を施用する。別の実施形態において、当分野で利用し得る人口統計データを参考にして、対象の集団中のアルツハイマー病の発症の平均年齢を決定することができる。
特定の１実施形態において、本発明の医薬組成物を継続的に、例えば毎日投与する。１実施形態において、医薬組成物、例えばSTI-571(またはそのメシレート塩)のメシレート塩の血液脳関門透過性変異体を経口投与によって、最少10μg/日および最大800μg/日の投与量で、毎日投与する。
5.1.2.5. 投与経路
本発明の治療用組成物の成分または成分群を非経腸、局所または経粘膜で、例えば経口、経鼻、もしくは経直腸で導入するか、または経皮導入することができる。いくつかの実施形態において、投与は非経腸、例えば静脈注射によるものであり、また限定するわけではないが、以下のものも含まれる：細動脈内、筋内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内投与。いくつかの実施形態において、本発明の治療用組成物の成分または成分群を、浸透圧ポンプ(例えば補充可能な浸透圧ポンプ)によるくも膜下投与、経口強制投与、または腹腔内注射によって導入することができる。
本発明の好ましい１実施形態において、薬剤(または薬物または化合物)は血液脳関門を通過できるもの、さらに好ましくは容易に通過できるものであって、これによって例えば経口、非経腸または静脈投与が可能になるものである。あるいは、血液脳関門を通過できるか、輸送されることができるように、薬剤を修飾するか、その他の変更をすることができる。分子が血液脳関門を通過するように、多くの当分野で公知の戦略を利用することができる。これとして、限定するわけではないが、分子の疎水性特性を増加させる、血液脳関門内の受容体を標的として移動させるなどの担体と、またはドコサヘキサエン酸、その他とのコンジュゲートとして分子を導入する、などが含まれる。
特定の１実施形態において、本発明の薬剤が経口送達され、血液脳関門を容易に通過することができる。
別の実施形態において、頭蓋中に薬剤を投与するための小孔をドリルで開ける標準的方法によって、本発明の薬剤を投与する。
その他の実施形態において、分子を頭蓋内または脳室内投与することができる。別の実施形態において、血液脳関門の浸透圧撹乱を使用して、薬剤の脳への送達効果をあげることができる(Nilaverら、1995, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9829-9833)。さらに別の実施形態において、血液脳関門を標的とするリポソーム内の薬剤を投与することができる。リポソーム内の医薬の投与は既知である(Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Treatら、1989, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss, New York, pp.317-327 および353-365、参照)。こうした方法の全部が本発明中に包含される。
１化合物の脳内への進入の速度および程度は、分配係数、イオン化定数(群)、および分子サイズによって決定されるものと、一般的に考えられている。例えばオクタノール-水システムが特に注目をあび、Hanschと共同研究者は、約100のこのシステムでの分配係数が中枢神経系(CNS)への進入に最適であることを示唆した(Glave and Hansch, 1972, J.Pharm.Sci. 61:589；Hanschら、1987, J.Pharm Sci. 76:663)。オクタノール-水分配システムは、化合物が血液脳関門を通過する能力の定性的指標を提供する。オクタノール-水分配以外のその他の要因を操作して、血液脳関門を通過する性向に影響を与えることができる。例えば、化合物の全体としての水素結合能力の減少を使用して、化合物の血液脳関門通過を促進することができる。さらに、Begleyらが使用した方法論を使用することができる。これには以下が含まれる：(1) トリチウム化薬剤化合物についての次式による脳取り込み指数(BUI)の測定：
BUI = [脳3H/脳14C)/(注入物3H/注入物14C)] x 100、
この際、14C参照化合物は14Cブタノールまたは類似の溶媒である；(2) 脳灌流試験；(3) 静脈ボーラス注射試験；および(4) 培養脳毛細血管内皮による試験。
全身性副作用を低下させるために使用する別の実施形態において、治療用化合物を小胞、特にリポソーム中で送達する(Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Treatら、1989, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler(eds.), Liss: New York, pp.317-327 および353-365、参照)。
別の実施形態において、治療用化合物を制御放出システムで送達することができる。例えば、薬剤を、静脈注入、インプラント可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、またはその他の投与モードを使用して、投与することができる。１実施形態において、ポンプを使用することができる(Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Sefton, 1987, CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201；Buchwaldら、1980, Surgery 88:507；Saudekら、1989, N.Engl.J.Med.321:574、参照)。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise(eds.), 1974, CRC Press:Boca Raton, Florida；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), 1984, Wiley:New York；Ranger and Peppas, 1983, J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61、参照；さらにLevyら、1985, Science 228:190；Duringら、1989, Ann.Neurol.25:351；Howardら、1989, J.Neurosurg.71:105、参照)。別の実施形態において、制御放出システムを治療標的、すなわち脳の近傍に置くことによって、全身用量の一部のみを必要とするようにすることができる(例えばGoodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, 上記、vol.2, pp.115-138、参照)。その他の制御放出システムがLangerによる総説(1990, Science 249:1527-1533)中で考察されている。
5.2. Aβレベルをモジュレートする化合物のスクリーニング方法
本発明は、細胞または組織によって提示されるAβレベルをモジュレートすることについて、薬剤、薬物または化合物を同定するためのin vivo、in situ、およびin vitro方法を提供する。いくつかの実施形態において、薬剤はγ-セクレターゼの活性のモジュレートによって、Aβレベルを刺激または阻害のいずれかをする能力を持つ。１実施形態において、γ-セクレターゼはATP依存性γ-セクレターゼである。
１態様において、本方法は、限定するわけではないがAβ関連疾患を含む疾患を治療する能力について、薬剤を同定することを含む。こうした方法を単独で、または互いに組み合わせて使用することができる。
いくつかの実施形態において、本発明は細胞または組織内のATP依存性Aβペプチド産生および/またはAβレベルをモジュレートする薬剤、薬物または化合物の能力を同定する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、試験すべき化合物でのATP依存性Aβ産生系の処理の前および後の両方でのγ-セクレターゼ活性の決定に基づく、薬剤、薬物または化合物のγ-セクレターゼ活性をモジュレートする能力の同定方法を提供する。こうした系は破壊細胞(Xuら、1997, Proc.Natl.Acad.Aci.USA 94: 3748-3752)または単離した膜(Zhangら、2001, Biochemistry 40:5049-5055)のいずれかから確立することができる。
本発明はまた、以下を含む、細胞または組織によって提示されるAβレベルをモジュレートする化合物を同定する方法を提供する：
(a) 該細胞または組織におけるγ-セクレターゼ活性の第１のレベルを決定し；
(b) 該細胞または組織と試験化合物とを接触させ；そして
(c) 該細胞または組織におけるγ-セクレターゼ活性の第２のレベルを決定し、
この際、γ-セクレターゼ活性の該第１のレベルと第２レベルの差異が該試験化合物のAβレベルをモジュレートする能力の指標となる。
１実施形態において、γ-セクレターゼの活性の差異が該試験化合物のAβレベルをモジュレートする能力の指標となる。別の実施形態において、Aβレベルがモジュレートされる。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性はATP依存性酵素活性である。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性はAβの産生である。
本発明はまた、以下を含む、細胞または組織によって提示されるAβレベルをモジュレートする化合物を同定する方法を提供する：
(a) 該細胞または組織と試験化合物とを接触させ；そして
(b) 該細胞または組織におけるγ-セクレターゼ活性のレベルを決定し、
この際、該レベルと、試験化合物と接触させない、比較し得る細胞または組織中でのγ-セクレターゼ活性の対照レベルの差異が該試験化合物のAβレベルをモジュレートする能力の指標となる。
１実施形態において、γ-セクレターゼの活性の差異が該試験化合物のAβレベルをモジュレートする能力の指標となる。別の実施形態において、Aβレベルがモジュレートされる。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性はATP依存性酵素活性である。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性はAβの産生である。
本発明はまた、以下を含む、Aβ関連疾患の治療を必要とする患者におけるこうした治療の能力について、試験すべき薬剤を同定する方法を提供する：
(a) 細胞または組織におけるγ-セクレターゼと可能性がある薬剤とを接触させ；そして
(b) γ-セクレターゼ活性の量を検出し、
この際、可能性がある薬剤の存在中でγ-セクレターゼ活性の減少が検出されたならば、その薬剤はAβレベルをモジュレートするものとして同定する。
１実施形態において、Aβ関連疾患を治療する能力を試験する。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性はATP依存性酵素活性である。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性はAβの産生である。
別の態様において、本発明は、以下を含む、細胞または組織によって提示されるAβレベルをモジュレートする能力について、試験すべき薬剤を同定する方法を提供する：
(a) 該細胞または組織におけるγ-セクレターゼ活性の第１のレベルを決定し；
(b) 該細胞または組織と可能性がある薬剤とを接触させ；そして
(c) 該細胞または組織におけるγ-セクレターゼ活性の第２のレベルを決定し、
この際、γ-セクレターゼ活性の該第１のレベルと第２レベルの差異が可能性がある薬剤のAβレベルをモジュレートする能力の指標となる。１実施形態において、本方法はさらに以下のステップを含む：
(d) Aβレベルがモジュレートされるかどうかを判定する。
別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性はATP依存性酵素活性である。別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性はAβの産生である。
本発明はまた、以下を含む、細胞または組織によって提示されるAβレベルをモジュレートする能力について、試験すべき薬剤を同定する方法を提供する：
(a) 該細胞または組織と可能性がある薬剤とを接触させ；そして
(b) 該細胞または組織におけるγ-セクレターゼ活性のレベルを決定し、
この際、該レベルと、試験化合物と接触させない、比較し得る細胞または組織中でのγ-セクレターゼ活性の対照レベルの差異が可能性がある薬剤のAβレベルをモジュレートする能力の指標となる。
１実施形態において、本方法はさらに以下のステップを含む：
(c) Aβレベルがモジュレートされるかどうかを判定する。
別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性はATP依存性酵素活性である。
別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性はAβの産生である。
本発明はまた、以下を含む、Aβ関連疾患の治療での使用について、可能性がある治療薬を選択するための方法を提供する：
(a) １動物に可能性がある治療薬を投与し；
(b) 該可能性がある治療薬に対する該動物の応答を測定し；
(c) 該動物の応答を、可能性がある治療薬を投与しなかった対照動物のものと比較し；そして
(d) 該動物と該対照動物間で観察された応答の差異に基づいて可能性がある治療薬を選択し、
この際、可能性がある治療薬はATP依存性γ-セクレターゼ活性をモジュレートするものである。
１実施形態において、動物はモルモットである。別の実施形態において、疾患はアルツハイマー病である。
本発明はまた、以下を含む、Aβ関連疾患の治療での使用について、可能性がある治療薬を選択するための方法を提供する：
(a) １動物に可能性がある治療薬を投与し；
(b) γ-セクレターゼの活性をモジュレートする１薬剤の投与に対する該動物の応答を測定し；
(c) 該動物の応答を、可能性がある治療薬を投与しなかった対照動物のものと比較し；そして
(d) 該動物と該対照動物間で観察された応答の差異に基づいて可能性がある治療薬を選択し、
この際、可能性がある治療薬はATP依存性γ-セクレターゼ活性をモジュレートするものである。
１実施形態において、動物はモルモットである。別の実施形態において、疾患はアルツハイマー病である。
本発明はまた、以下を含む、Aβ関連疾患の治療での使用について、可能性がある治療薬を選択するための方法を提供する：
(a) １動物に可能性がある治療薬を投与し；
(b) 該動物の応答を測定し、この際応答は以下の群から選択され：
(i) モリスの水迷路における挙動の提示；および
(i) Y-迷路における挙動の提示；
(c) 該動物の応答を、可能性がある治療薬を投与しなかった対照動物のものと比較し；そして
(d) 該動物と該対照動物間で観察された応答の差異に基づいて可能性がある治療薬を選択し、
この際、可能性がある治療薬はATP依存性γ-セクレターゼ活性をモジュレートするものである。
１実施形態において、動物はモルモットである。別の実施形態において、疾患はアルツハイマー病である。
本発明はまた、以下を含む、Aβ関連疾患の進行の抑制、遅延、または逆行のための方法を提供する：
(a) 該疾患の進行の抑制、遅延、または逆行を必要とする１哺乳動物を同定し；そして
(b) ATP依存性γ-セクレターゼ活性をモジュレートするのに十分な量の薬剤を該哺乳動物に投与し、
この際、Aβレベルがモジュレートされるものである。
１実施形態において、薬剤はATP依存性γ-セクレターゼ活性を阻害するか、または低下させる。
別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。別の実施形態において、疾患はアルツハイマー病である。
別の実施形態において、薬剤はATP依存性γ-セクレターゼ活性を促進するか、または増大させる。
別の実施形態において、薬剤を経口投与する。
別の実施形態において、薬剤をNSAIDと共に投与する。特定の１実施形態において、NSAIDは、硫化スリンダック、フルフェナム酸、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、メフェナム酸、インドメタシン、カルプロフェン、メクロフェナム酸である。
別の実施形態において、化合物を抗酸化剤とともに投与する。別の実施形態において、抗酸化剤はビタミンE、ビタミンC、クルクミン、およびギンコ・ビロバからなる群から選択される。
別の実施形態において、薬剤はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤とともに投与される。
本発明において、「対照」レベルとは、試験化合物と接触させなかった比較可能な細胞または組織によって提示される別個の基準値、あるいは試験化合物と接触させる前の細胞または組織によって提示されるレベルを意味する。対照レベルは既知の標準参照レベルに回帰させてもよい。
当業者が明確に理解し得るように、Aβレベルをモジュレートすることができる薬剤、薬物または化合物を同定するために本明細書に開示したいずれかの、および/またはすべての実施形態を、本明細書に開示した合理的な薬物設計を組み込んだ操作法を含め、組み合わせて、別の薬物のスクリーニングおよびアッセイを形成することができる。このすべてを本発明で想定する。
本発明の方法にしたがって、γ-セクレターゼ活性および/またはAβレベルを、細胞または組織の試験化合物による処理の前および後の両方で測定することができる。
当業者は、本発明にしたがって、ある化合物が例えば既知の改善性化合物によってもたらされるものと同様のγ-セクレターゼおよび/またはAβレベルをもたらす能力があると同定された後は、その化合物をAβ関連疾患の治療に使用することができることを理解するはずである。こうした症状として、限定するわけではないが、アルツハイマー病、ダウン症候群および封入体筋肉炎が含まれる。本発明のこの領域において、同定された化合物を十分な用量で、または本明細書に示したような研究からのデータに基づいて当業者が決定することができる量で、投与することとなる。こうしたデータとして、限定するわけではないが、IC50からの結果が含まれる。
あるモジュレーターが選択的ATPモジュレーターであるかどうかを判定するため、技術専門家は当分野で周知の方法を使用して、対象の細胞中でATP機能に影響を与える分子の中で、候補モジュレーターが識別されるかどうか、そしてこれが特定の個別の分子のみ、またはその分子のクラスもしくはサブセットをモジュレートするかどうかを、判定する。例えば、一群の各種キナーゼを阻害する活性についてある化合物をアッセイし、これが関連するクラスのキナーゼでATP機能をモジュレートするならば、選択的ATPモジュレーターとして認識する。いくつかの実施形態において、一連の標準的キナーゼアッセイを実施して、あるモジュレーターが特定のサブセットまたはクラスのキナーゼのATP機能のみをモジュレートするかどうかを判定する。特定の１実施形態において、標準的ルシフェラーゼ(ATP依存性)アッセイを使用することができる。いくつかの実施形態において、非特異的ATPモジュレーターはこのアッセイでルシフェラーゼ産生をモジュレートするが、特異的阻害剤はモジュレートしないはずである。
別の実施形態において、選択的ATPモジュレーターはタウリン酸化(例えば米国特許第5,955,444号参照)またはNotch切断(第10節参照)に影響を与えない。
１実施形態において、ATPモジュレーターの選択性プロフィルはSTI-571(またはそのメシレート塩、GLEEVEC(商標))、STI-571変異体 WGB-BC-15または化合物1-5のいずれかのものと類似または同一である。
いくつかの実施形態において、モジュレーターは本明細書に開示するように、ATP依存性細胞プロセスをモジュレートする。しかし別の実施形態においてでは、モジュレーターはATP以外のエネルギー源(例えばGTP)を利用する別のエネルギー依存性(例えばGTP依存性)プロセスをモジュレートすることを想定している。
本発明はまた、γ-セクレターゼ活性のモジュレートを介してAβレベルをモジュレートすることができる薬剤を同定するin vivo方法をも提供する。こうした方法を単独で、または本明細書に開示したin vitroおよびin situ方法と組み合わせて使用することができる。
本発明にしたがって、本発明の１実施形態において、当業者は、阻害剤の存在または不在中で産生されるAβペプチドのレベルについてのスクリーニングの結果に基づいて、Aβレベルのモジュレーター、例えばATPモジュレーターまたはγ-セクレターゼの阻害剤を投与する。化合物のこうしたスクリーニングは当業者にとって常套方法である(Durkinら、1999, J.Biol.Chem.274(29):20499-20504；Petanceska and Gandy, 1999, J.Neurochem.73:2316-2320；De Strooperら、1999, Nature 398:518-522；Vandermeerenaら、2001, Neuroscience Letters 315:145-148)。選択的γ-セクレターゼ阻害活性を持つものとして、またはAβ産生を選択的に阻害するものとして同定されたいずれの化合物でも、例えば薬学的に許容されるベヒクル中で、動物、例えばヒトに投与することとなる。
こうしたin vivo方法は薬剤の非ヒト哺乳動物への投与を含む。次に、γ-セクレターゼの活性化の量(および/または速度)を決定する。薬剤の不在中に比較して、薬剤の存在中でγ-セクレターゼ活性化の量(および/または速度)が増加または減少する場合に、その薬剤をγ-セクレターゼ活性のモジュレートを介してAβのレベルをモジュレートすることができるものとして同定する。特定の１実施形態において、γ-セクレターゼ活性はATP依存性γ-セクレターゼ活性である。１実施形態において、非ヒト哺乳動物はげっ歯類、例えば野生型モルモットである。その他の実施形態において、非ヒト哺乳動物は疾病または疾患についての動物モデルである。こうした動物モデルは本明細書に開示されている。
別の実施形態において、実験動物を使用して、限定するわけではないがAβ関連疾患などの１疾患について、可能性がある薬剤の効果を確認する。次に、疾患を改善する可能性があるモジュレーターを選択する。
例えば、いくつかの実施形態において、その薬剤の存在および不在中で、１動物の学習および/または記憶行動の応答を判定することができる。特定の実施形態において、動物、例えばトランスジェニックマウス、Tg2576マウスなど、の学習および/または記憶行動の応答を判定する。Tg2576トランスジェニックマウスはヒトAPP695を発現し、アミロイドプラクを含むアルツハイマー病の神経病理学的徴候を進行させ、学習および/記憶欠損を提示する(Hsiaoら、1996, Science 274, 99-102；米国特許第5,877,399号)。別の有用なモデルはヒトAPPおよび家族性アルツハイマー病遺伝子を発現するトランスジェニックマウス(「ヒトAPP-Swedish」)である(Borcheltら、1996, Neuron 17:1005-1013)。こうした動物モデルの学習および/または記憶行動応答は、標準的方法、例えばY-迷路またはモリスの水迷路を使用して測定することができる(例えば米国特許第5,877,399号参照)。
動物または動物モデル中での可能性がある治療薬(例えば候補薬物、潜在的モジュレーター、その他)の試験方法は当分野で周知である。こうして、可能性がある治療薬を使用して全動物を処置することができる。潜在的モジュレーターを、提案される使用法に応じて、以下のような各種の方法で投与することができる：局所、経口、皮下、または腹腔内(腹腔内注射など)。最適用量は経験的に確定されることとなる。
限定するわけではないがAβ関連疾患などの疾患の病理学的症状を緩和するこれらの化合物の潜在的効力を、疾病についての動物モデルで評価することができる。例えば、１実施形態において、動物モデルはTg2576、ヒトAPP695を発現するトランスジェニックマウスである。Tg2576トランスジェニックマウスはアミロイドプラクを含むアルツハイマー病の神経病理学的徴候を進行させ、学習および/記憶欠損を提示する(Hsiaoら、1996, Science 274, 99-102；米国特許第5,877,399号)。別の有用なモデルはヒトAPPおよび家族性アルツハイマー病遺伝子を発現するトランスジェニックマウス(「ヒトAPP-Swedish」)である(Borcheltら、1996, Neuron 17:1005-1013)。
本発明のいくつかの実施形態において、Aβ1-40レベルのモジュレートについてスクリーニングする。Aβ1-40はβ-セクレターゼおよびγ-セクレターゼ酵素活性によるAPPの異化作用の主要産物である。Aβ1-40のアミノ酸配列はヒトAPPの695アミノ酸イソタイプの残基597-636に相当する。
Figure 0004508645
別の実施形態において、Aβ1-42レベルのモジュレートについてスクリーニングする。Aβ1-42はAPPの異化作用の副次産物であり、典型的にはAβ1-40レベルの10%産生され、急速に原線維形態に凝集する。Aβ1-42のアミノ酸配列はヒトAPPの残基597-638に相当する。
Figure 0004508645
これらなどのモデルを使用して、本明細書に開示したどの潜在的治療薬の効力についても評価することができる。一般的には、アッセイには少なくとも２つのグループの動物を使用し、少なくとも１グループは潜在的治療薬を含まない投与ベヒクルを投与する対照グループである。
本発明の別の態様は、限定するわけではないがAβ関連疾患を含む疾患の治療での使用の有望性について治療薬を選択する方法であって、推測上の治療薬を動物モデルに投与し、該当する疾患に関与すると信じられる、動物モデルの表現型の特徴のいずれかに対する推定上の治療薬の効果を測定および/または判定することを含むものである。
試験物応答と正常(すなわち天然または対照)応答間に統計上の有意差があるかどうかに基づいて、可能性がある治療薬を選択する。測定/判定した特徴の統計的に有意な変化を示す潜在的治療薬を選択する。好ましい１実施形態において、治療薬の存在中での対照(またはベヒクルで処置した)動物の応答は、薬剤を投与しなかった対照(またはベヒクルで処置した)動物の応答と特徴的に差異がある。
さらに別の本発明の態様は、限定するわけではないがAβ関連疾患を含む疾患の治療での使用の可能性について治療薬を選択する方法であって、推測上の治療薬をある疾患についての動物モデルに投与し、該当する疾患に関与すると信じられる、上記概説のいずれかの表現型の特徴に対する推定上の治療薬の効果を測定および/または判定することを含むものである。
別の実施形態において、薬剤を拮抗薬とともに投与する。次にγ-セクレターゼ活性のモジュレートの量(および/または速度)を測定する。薬剤の不在中での、例えば拮抗薬の投与はγ-セクレターゼ活性の増加をもたらすべきであるから、薬剤の不在中に比較して薬剤の存在中で活性化の量(および/または速度)が有意に増加または減少する場合に、その薬剤をγ-セクレターゼの活性をモジュレートする能力があるものとして同定する。
別の実施形態において、薬剤をヌクレオシド三リン酸とともに投与する。次にγ-セクレターゼ活性のモジュレートの量(および/または速度)を測定する。薬剤の不在中での、ヌクレオシド三リン酸の投与はγ-セクレターゼ活性の増加をもたらすべきであるから、薬剤の不在中に比較して薬剤の存在中で活性化の量(および/または速度)が有意に増加または減少する場合に、その薬剤をγ-セクレターゼの活性をモジュレートする能力があるものとして同定する。
いくつかの実施形態において、薬物候補として、別種の構造骨格(例えばプリン)に基づく化合物のコンビナトリアルライブラリー、ならびに無関係な天然に生起する化合物を、試験することができる。このタイプの好ましい１実施形態において、本明細書に開示する、自動化ロボット利用技術による高スループット技法を使用して、アッセイを実施する。陽性結果(「ヒット」)とは、対照反応(薬物候補をアッセイに含ませない場合)に比較して、γ-セクレターゼの活性低下または増加のいずれかに相当する。
薬物候補が選択された後、その薬物候補の構造変異体を試験することができる。これらの化合物を精査して、膜透過性、効果の特異性、および毒性などのパラメーターについて改変することもできる。この二次スクリーニングで選択された(例えば最も強力な)化合物
を次にin situおよび動物モデル(第9節参照)で評価して、副作用が最少であるかもしくは全く伴わないで、選択された化合物がγ-セクレターゼの活性を変更し、かつ/または予想された行動の変更を誘発するかどうかを判定することができる。こうした行動異常については、限定するわけではないが、本明細書に開示するように、自発運動、または学習および記憶の試験が含まれる(また例えば、米国特許第5,877,399号；およびKostenら、J.Pharmacol., Exp.Ther.269:137-144(1994)、参照)。特定の実施形態において、当分野で一般に知られている学習および記憶についての試験方法、例えばY-迷路またはモリス水試験を使用することができる(例えば、米国特許第5,877,399号参照)。
次に、これらの試験の後、ヒトでの臨床治療試験を実施することができる。あるいは、いくつかの実施形態において、動物試験無しで、ヒトの臨床治療試験を実施することができる。以下に例示する別の標的を使用して、γ-セクレターゼ以外の標的に影響を与える化合物も同様にスクリーニングすることができる。
あるいは、例えば組換えバクテリオファージによって産生されるランダムペプチドライブラリー(例えば、Scott and Smith, Science 249:386-390(1990)；Cwirlaら、1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382；およびDevlinら、1990, Science 249:404-406、参照)または化合物ライブラリーの１つをスクリーニングすることによって、γ-セクレターゼのモジュレーター(例えばアクチベーターまたは阻害剤)を取得することができる。「ファージ法」を使用して、非常に大きなライブラリー(106-108化学物質)を構築することができる。第２の手法は化学的方法を使用するものである。この中で、Geysen法(Geysenら、1986, Molecular Immunology 23:709-715；Geysenら、1987, J.Immunologic Method 102:259-274)およびFodorらの方法(1991, Science 251:767-773)が実例である。Furkaら(1988, 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR:013；Fruka, 1991, Int.J.Peptide Protein Res.37:487-493)、Houghton(米国特許第4,631,211号)およびRutterら(米国特許第5,010,175号)はペプチドの混合物を製造するための方法を開示している。こうしたペプチドをγ-セクレターゼ活性の潜在的モジュレーターとして試験することができる。
別の態様において、合成ライブラリー(Needelsら、1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10700-4；Ohlmeyerら、1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10922-10926；Lamら、国際特許公開番号 WO92/00252；Kocisら、国際特許公開番号 WO94/28028)などを使用して、本発明にしたがって、γ-セクレターゼ活性化のモジュレーターについてスクリーニングすることができる。可能性があるモジュレーターを同定した後、化学的類似体を市販のもの(例えばChembridge Corporation, San Diego, CA、またはEvotec OAI, Abingdon, UKからのもの)などの化学物質ライブラリーから選択するか、あるいはde novo合成することができる。見込みがある薬剤(薬物)をいずれかの標準的アッセイにかけて、γ-セクレターゼ活性化の活性に対する影響を試験することができる。次に、γ-セクレターゼ活性化の活性をモジュレートする薬物を選択する。
本発明は、例えばγ-セクレターゼにin vivoで結合して、これを阻害または活性化する分子などの、小分子、その類似体、ならびに天然のγ-セクレターゼモジュレーターについてのスクリーニングも想定している。あるいは、例えばγ-セクレターゼ活性をモジュレートする分子について、本発明のアッセイを使用して、天然産物ライブラリーをスクリーニングすることができる。
本発明の別の態様において、可能性があるモジュレーターを、本明細書に開示する結合アッセイとは独立に、またはこれに続いて、Aβのレベルをモジュレートする能力について、アッセイすることができる。こうしたアッセイは当分野で知られている。こうして、次に、本発明の方法にしたがって、Aβのレベルをモジュレートするγ-セクレターゼ活性のモジュレーターを選択する。
別の実施形態において、可能性があるモジュレーターを培養細胞系または組織外植体に添加することができる。細胞または組織のサンプルを各種濃度の潜在的モジュレーターで処置して、その後サンプルをAβレベルについて分析することができる。Aβレベルの潜在的モジュレーターを例えば完全ニューロン上でin situ試験することもできる。これらの化合物の効果を、最適濃度およびインキュベーション時間を経験的に確定することによって、試験することができる。
本発明は本明細書に開示した方法によって同定した組成物をも含む。当業者は、本発明の方法でAβレベルをモジュレートする能力があるものとして同定した後、Aβレベルが関与すると考えられる症状を治療するために、本発明の化合物をニューロン細胞中で治療的に使用して、Aβレベルをモジュレートすることができることを理解するはずである。
当業者は、本発明の方法でγ-セクレターゼ活性をモジュレートする能力があるものとして同定した後、γ-セクレターゼ活性が関与すると考えられる症状を治療するために、本発明の化合物を細胞、例えばニューロン中で治療的に使用して、γ-セクレターゼ活性をモジュレートすることができることを理解するはずである。こうした症状として、限定するわけではないが、Aβ関連疾患が含まれる。
本発明はさらに、γ-セクレターゼの活性をモジュレートすることによって、限定するわけではないがAβ関連疾患を含む、疾患を改善することができる薬物を開発するための、合理的な薬物設計の実施方法を提供する。出発点として、γ-セクレターゼの阻害剤(またはアクチベーター)として同定された化合物を使用して、こうした合理的な薬物設計を実施することができる。こうして、本発明は、より特異的な阻害剤(またはアクチベーター)を同定することを可能にするスクリーニングおよびアッセイを提供する。こうした合理的な薬物の設計方法は当分野で周知である。特定の１実施形態において、参照として全文を本明細書に引用する、以下の特許出願に開示された合理的な薬物設計法を使用する：Bibbらによる米国特許出願第09/419,379号「ドーパミンシグナリング中のリン酸化/脱リン酸を調節する薬剤の同定方法」(1999年10月15日出願)およびBibbらによる米国特許出願第09/687,959号「ドーパミンシグナリング中のリン酸化/脱リン酸を調節する薬剤の同定方法」(2000年10月13日出願)。
実際、可能性があるATP依存性酵素活性のモジュレーター、例えばγ-セクレターゼをモジュレートするものなどのATPモジュレーターとして化合物を同定するために、GRAM、DOCK、またはAUTODOCK(Dunbrackら、1997, Folding & Design 2:27-42)などのドッキングプログラムを使用する、コンピュータモデリングの使用によって、可能性があるモジュレーターを検討することができる。次にこうしたモジュレーターをその効果について試験することができる。１実施形態において、この操作には、潜在的モジュレーターの形状および化学的構造がどの程度うまくγ-セクレターゼと結合するかを確認するための、潜在的モジュレーターのγ-セクレターゼ複合体へのコンピュータフィッティングが含まれる(例えば、Buggら、1993, Scientific American 269(6):92-98；Westら、1995, TIPS, 16:67-74、参照)。そのサブユニットのモジュレーター/阻害剤による誘引、相反、および立体妨害を評価するためにも、コンピュータプログラムを使用することができる。一般的に、フィットが緊密であるほど、立体妨害は低く、誘引力は大きく、潜在的モジュレーターとしてより強力である。なぜならば、これらの性質はより緊密な結合定数と符合するからである。さらに、潜在的薬物の設計上、より特異的であるほど、薬物はその他のタンパク質とはさほど相互作用しない。これは、別のタンパク質との望ましくない相互作用による可能な副作用を最少にすることとなる。
最初に、１実施形態において、γ-セクレターゼを調節するか、またはγ-セクレターゼを含有する酵素複合体に影響を与える何らかの分子上で、γ-セクレターゼに結合することが知られている化合物を、１種以上の見込みがある類似体が同定されるまで、コンピュータモデリングプログラムによって、系統的に修飾することができる。その上、選択された類似体の系統的修飾物を次に１種以上のさらに可能性がある類似体が同定されるまで、コンピュータモデリングプログラムによって、系統的に修飾することができる。こうした分析法は当業者に周知であり、例えばHIVプロテアーゼ阻害剤の開発において有効であることが示された(例えば、Lamら、1994, Science 263:380-384；Wlodawerら、1993, Ann.Rev.Biochem.62:543-585；Appelt, 1993, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:23-48；Erickson, 1993, Perspectives in drug Discovery and Design 1:109-128、参照)。
可能性がある薬剤または可能性がある薬剤の標的(例えば、γ-セクレターゼ、Aβ、キナーゼ、ATP)のいずれでも、標識することができる。好適な標識として、以下のものが含まれる：酵素(例えば、アルカリホスファターゼもしくは西洋わさびペルオキシダーゼ)、発蛍光団(発蛍光団をいくつか挙げると、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコエリトリン(PE)、Texasレッド(TR)、ローダミン、遊離もしくはキレート化ランタニド系列塩、特にEu3+)、発色団、放射性同位元素、キレート剤、染料、金コロイド、ラテックス粒子、リガンド(例えば、ビオチン)、化学発光剤、磁性ビーズ、または磁気共鳴画像化標識。対照マーカーを使用する場合、受容体および対照マーカーについて同一または異なる標識を使用することができる。
同位元素、3H、14C、32P、34S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、および186Reなどの放射性標識を使用する実施形態において、当分野で知られている標準的計数操作法を利用することができる。
標識が酵素である実施形態において、当分野で知られ、現在利用されている比色法、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定法または気体測定法のいずれによっても、検出を成功させることができる。
本発明の方法で使用することができる標識の一例は直接標識である。直接標識は、裸眼で(例えば、複合もしくは解剖光学顕微鏡での眼識検査による)、あるいは光学フィルターおよび/または刺激の適用、例えば蛍光を促進するためのU.V.光の使用、によって、自然の状態で容易に見ることができる実体である。本発明の方法で使用することができる着色標識の例として、以下が含まれる：金属ゾル粒子、例えばLeuvering(米国特許第4,313,734号)が開示しているような金ゾル粒子；Gribnauら(米国特許第4,373,932号)およびMayら(WO 88/08534)が開示しているような染料ゾル粒子；Mayら(WO 88/08534)、Synder(EP-A 0280 559および0281 327)が開示しているような染色ラテックス；またはCampbellら(米国特許第4,703,017号)が開示しているようなリポソーム中に封入した染料。
その他の直接標識として以下が含まれる：放射性ヌクレオチド、発光部分分子、または限定するわけではないが、例えば緑色蛍光タンパク質の修飾/融合キメラなどの蛍光部分分子(米国特許第5,625,048号(1997年4月29日交付)およびWO 97/26333(1997年7月24日交付)に開示されているものなど、この全文を参照として本明細書中に組み入れる)。
これらの直接標識手段の他に、酵素を含む間接標識も本発明で使用することができる。各種タイプの酵素結合イムノアッセイが当分野で周知であり、例えばアルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはウレアーゼを使用する酵素結合イムノアッセイがある。これらおよびその他の類似のアッセイは当分野で周知であり、例えば以下に開示されている：Engvall(1980,"Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT" Methods in Enzymology, 70:419-439)および米国特許第4,857,453号。
いくつかの実施形態において、タンパク質を代謝標識によって標識することができる。代謝標識は、[35S]-メチオニンまたは[32P]-オルトリン酸塩などの代謝標識を補充した培養培地の存在中での、そのタンパク質を発現する細胞のin vitroインキュベート中に発生する。[Cl2]-メチオニンでの代謝(または生合成)標識の他に、本発明はさらに[14C]-アミノ酸および[3H]-アミノ酸(非不安定部分でトリチウム置換されたもの)による標識を想定している(例えば、以下を参照されたい：米国特許出願番号 09/419,379, Bibbら、名称「ドーパミンシグナリング中のリン酸化/脱リン酸を調節する薬剤の同定方法」1999年10月15日出願、および米国特許出願番号 09/687,959, Bibbら、名称「ドーパミンシグナリング中のリン酸化/脱リン酸を調節する薬剤の同定方法」2000年10月13日出願、これらの全文を参照として本明細書中に組み入れる)。
5.2.1. γ-セクレターゼ活性のアッセイ
本発明において、γ-セクレターゼのモジュレーター(例えば、阻害剤またはアクチベーター)を、当分野で普通に知られている方法を使用して検出および単離し、かつ/または単離した酵素の直接アッセイによって同定することができる。こうしたアッセイは当業者にとって周知である。
１実施形態において、Robertsらの方法を使用する(米国特許出願 20020025540、2002年2月28日公開、名称「機能的に活性なガンマセクレターゼタンパク質複合体の単離ならびにその活性および阻害剤の検出方法」)。
別の実施形態において、Zhangらの方法(2001, Biochemistry 40:5049-5055)を使用する。
別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性を例えば以下の方法などの、当分野で知られている方法にしたがってアッセイすることができる：De Strooperら、1999, Nature 398:518-522；Hsiaoら、1996, Science 274:99-102；Liら、2000, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6138-6143；Lichtenthalerら、1999, FEBS Lett.453:288-292；McLendonら、2000; FASEB J.14:2383-2386；またはSeiffertら、2000, Brain.Res.Mol.Brain Res.84:115-126。
別の実施形態において、APPまたはAPP様タンパク質以外のタンパク質の切断についてアッセイする方法にしたがって、γ-セクレターゼ活性をアッセイすることができる。例えば、脊椎動物および非脊椎動物中での多くの細胞運命決定に介在する１回膜貫通ドメイン細胞表面受容体である、Notchタンパク質 (Artavanis-Tsakonasら、1996, Science 268:225-232；Kopan and Turner, 1996, Curr.Opin.Neurobiol.6:594-601；Weinmaster, 1997, Mol.Cell.Neurosci.9:91-102) のタンパク質切断を、Rayら(1999, J.Biol.Chem.274:36801-36807)またはSchroeterら(1998, Nature 393:382-386)の方法を使用して、アッセイすることができる。これらの文献の全部を参照として本明細書中に組み入れる。
γ-セクレターゼは、例えばγ-セクレターゼに特異的な市販の抗体を使用する、標準的方法を使用して、脳ホモジネートから免疫沈降させることができる。
さらに別の実施形態において、γ-セクレターゼ活性を以下、例えば実施例４に開示する方法にしたがってアッセイする。
5.2.2. Aβレベルのアッセイ
Aβレベルは当分野で公知のいずれの方法によって決定しても良い。１実施形態において、AβレベルをXuら(1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3748-3752)の方法によって測定する。
別の実施形態において、Aβレベルを以下、例えば実施例１、２または３に開示する方法にしたがって測定する。
別の実施形態において、Aβペプチドを、例えば、脳ホモジネート中で、サンドイッチELISA(例えばBiosource International, Camarillo, CA)を製造者の推奨に従って使用してアッセイすることができる。
5.2.3. 動物モデル
APPのAβへのプロセシングおよびアルツハイマー病などのAβ関連疾患のin vivo動物モデルは当業者に周知である。こうした動物モデルを使用して、例えば本明細書に示す方法によって同定された化合物をさらにスクリーニングすることができる。あるいは、こうしたモデルを使用して、本発明のモジュレート、予防、治療および症状の改善方法での使用効力について、化合物を常套的に確認することができる。
１実施形態において、野生型モルモットを動物モデルとして使用する。例えば、野生型モルモットを、APPのAβへのプロセシング、Aβの産生および/または脳中でのAβの蓄積についてのモデルとして、使用することができる。これらはヒトAβと免疫学的に同一のAβペプチドを産生することが知られている。したがって、モルモットは、例えば、薬物処置を伴う場合と伴わない場合のAPP代謝の摂動を試験するための動物モデルとなる。
別の実施形態において、アルツハイマー病のマウスモデルを使用する。例えば、ヒトAPP-Swedishを発現するトランスジェニックマウスがあり(例えば、Borcheltら、1996, Neuron 17:1005-1013、参照)、これはアルツハイマー病患者と同様の神経病理学的症状を提示する。さらに、アルツハイマー病のラットモデルを使用することができる。別の実施形態において、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデル、例えばTg2576トランスジェニックマウス(米国特許第5,877,399号)を使用することができる。こうした動物モデルを使用して、アルツハイマー病の治療に有用な化合物を、例えば変更されたヒトAβレベルの提示によって、スクリーニングすることができる。
これらなどのモデルを使用して、以下に開示する任意の潜在的薬剤の効力についても評価することができる。一般的に、アッセイでは少なくとも２つのグループの動物を使用し、少なくとも１つのグループを、潜在的治療薬を含まないベヒクルを投与する対照グループとする。
本発明において、いくつかの実施形態において、神経系の生理学的調節が変更されている動物モデルを使用することによって、その動物またはこれに由来する組織を、γ-セクレターゼ活性のレベル、特にγ-セクレターゼの活性化についてATPと(直接もしくは間接的に)競合するレベルに作用する、潜在的治療薬および/または治療計画のスクリーニングに利用することができるようにする。こうした動物モデルが提示する欠陥のいずれかを逆行させることができる薬物は、APPのAβへの切断の基礎となる異化経路のどこかで作用し、したがって治療上の使用の可能性がある。その上、欠陥のいくつかは行動レベルで発生するので、これらの行動欠陥の変化またはモジュレートが、こうした行動のモジュレートにおける治療上の使用について高い予測上の価値を持ち得る。
本発明の方法にしたがって、このようにして動物モデルをスクリーニング手段として使用して、正常および罹患患者集団の両方に関与するAPPのAβへの切断の機構を明らかにすることができる。例えば、このように動物モデルを利用して、各種の神経学的疾病および障害に苦しむ患者の治療に使用することができる、可能性がある多様な治療戦略および治療薬に対する応答を評価することができる。
動物モデルを使用して、効力の強化および副作用の最少化などの、有利な効果の可能性について、各種の小分子薬をスクリーニングすることができる。こうしたスクリーニングのための典型的な候補物質は、いくつかの市販の薬物ライブラリーのいずれからでも取得することができる。
動物モデルを利用することができる特定の疾病として、限定するわけではないが、本明細書に開示するように、Aβ関連疾患が含まれる。動物モデル中で、内在性および外来性薬剤の投与に対して応答した各種の特性を測定し、これらの特性を可能性がある治療薬で処置した動物中でのものと比較することによって、その潜在的治療薬の特定の疾患または疾病状態の予防および/もしくは治療での有用性の評価を行うことができる。例えば、潜在的治療薬をある特定のAβ関連疾患の動物モデルに投与すると、対照動物(例えばベヒクルを投与した動物)におけるAβレベルが、 潜在的治療薬の価値の指標となる。
本発明の別の態様は、限定するわけではないがAβ関連疾患を含む疾患の治療での使用の可能性について、治療薬をスクリーニングするための方法であって、推測される治療薬を動物モデルに投与し、この疾患に関連すると考えられるいずれかの表現型の特性に対するその推定上の治療薬の効果を決定および/または判定することを含む、方法である。
本発明のこの態様の１実施形態において、推測される治療薬を動物モデル、例えばAβ関連疾患の動物モデルに投与し、その動物モデルについてAβレベルを決定する。この際、治療薬の不在中でのこの動物モデルのAβレベルは対照(例えば野生型)動物のものとは特徴的に差異がある。試験特性、例えば試験Aβレベルと正常特性、例えば正常Aβレベル間に統計的有意差があるかどうかに基づいて、可能性がある治療薬を選択する。決定または判定した特性に統計的に有意な変化を示す、潜在的薬剤を選択する。好ましい実施形態において、治療薬の不在中での動物モデルの試験特性は潜在的治療薬を投与しなかった対照(例えば野生型)動物のものとは差異がある。
本発明のさらに別の態様は、アルツハイマー病の治療での使用の可能性について、治療薬をスクリーニングするための方法であって、推測される治療薬を動物モデル、例えばアルツハイマー病の動物モデルに投与し、アルツハイマー病に関連すると考えられるいずれかの表現型の特性に対するその推定上の治療薬の効果を決定および/または判定することを含む、方法である。
以下の実験実施例は説明のために提供するものであって、限定するためのものではない。
6. 実施例１：Aβの産生はATP依存性である
ここに示す実践例は、Aβの産生がATP依存性であることを証明し、またβ-セクレターゼ活性が少なくとも部分的にATP依存性でなく、一方最適γ-セクレターゼ活性にはATPを必要とすることを示すデータを提供する。
6.1. 材料および方法
ヒトSwedish APP突然変異誘発およびプレセニリン-1(PS1)突然変異体、ΔE9によって二重トランスフェクトしたN2a全細胞を透過性化前に5Sパルス標識し、新たに合成された35S標識APPの、APPの主要な所在地であってAβ産生の優先部位であるゴルジ装置への局在化を、20℃で追跡した。次に細胞をXuらの方法(1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3748-3752)にしたがって透過性化し、細胞質ゾルを取り除き、ATP再生システムを含ませるか、または残留ATPおよびその他のヌクレオチド三リン酸を加水分解するためのアピラーゼを含ませて、37℃でインキュベートし、Aβ産生をアッセイした。Aβ産生についての無細胞アッセイ系へのATP再生システムの添加の影響を、Xuらの方法(1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3748-3752)にしたがって定量した。
単離されたγ-セクレターゼ活性のアッセイについては、Zhangらの方法 (2001, Biochemistry 40:5049-5055) にしたがって、組換えγ-セクレターゼ基質、C99を発現するN2a細胞から膜を単離した。この系でのヒトC99(βC末端断片またはβCTFとしても知られている)の蓄積は、トランスジーンの発現の結果であって、マウスAPPの内在性BACE(β-セクレターゼ)切断の結果ではない。さらに、ヒト特異的抗Aβ抗体の使用によって実験条件下で産生された少量の内在性マウスAβは有効に分解されないので、ヒトC99に対するγ-セクレターゼの作用によって産生されるAβのみの決定が可能になる。また、ATPがγ-セクレターゼ活性の刺激に主として原因するかどうかを判定するため、それまでのエネルギー再生システムをATPの濃度のみを維持し、GTPは維持しないように設計されたものと置換した。単離した膜からのAβの放出をELISA(Biosource International, Camarillo, CA)によって測定した。
6.2. 結果
Aβ産生で考えられるエネルギー要求性を調べるための研究を実施した。Aβ産生を、細胞内膜およびオルガネラは完全に残して、その細胞質ゾルを洗い出した、透過性化細胞で構成される、無細胞系で再構成した。
ATPを必要とするとされるAPPプロセシング経路でのステップを同定するため、ヒトSwedish APP突然変異誘発およびプレセニリン-1(PS1)突然変異体、ΔE9によって二重トランスフェクトしたN2a細胞で構成される無細胞系中での35Sパルス標識を使用して、APP代謝物の蓄積を研究した。両突然変異体とも、より高いAβ42/Aβ40比に特徴がある、家族性アルツハイマー病の結果をもたらす(Borcheltら、1996, Neuron 17:1005-1013)。この細胞系は大量のAβペプチドおよびC99、APPのβ-セクレターゼ切断の産物の１つでかつAβの中間前駆体、を産生することがわかっている。ATPの除去に対するβ-セクレターゼおよびγ-セクレターゼ活性の応答を決定および比較した。
ATPは20℃での追跡中に蓄積していた当初Aβレベル以上のAβの産生を刺激した。ゴルジ装置中で蓄積した前駆体からの放射性標識Aβの産生を示す、これらの実験の結果を、図１に示す。特に、エネルギー再生システムではアピラーゼ処理サンプルに比較して、Aβ産生の３倍増加(図１)と、同時にC99(βC末端断片またはβCTFとしても知られている)の2/3の減少(図２)の結果となった。
ATP不在中では、非常に少量のAβが産生され、Aβの産生がATP依存性であることが証明された。
対照的に、ATP不在中ではAPPからのC99産生が増加し、β-セクレターゼの活性が少なくとも部分的にATP依存性であることが示された。この結果はまた、C99の増加はγ-セクレターゼ活性の減少の結果であり、これによってAβ前駆体が蓄積されるらしいことも意味している。これは図２に示すオートラジオグラムから明らかである。
事実上、アピラーゼを除外し、サンプルをエネルギー再生システムの不在中でインキュベートしたとき、同一の結果が得られた(データは示していない)。
これらの結果は、Aβ産生との関係では、最適γ-セクレターゼ活性にはヌクレオチド三リン酸を必要とすること、また実質的なβ部位のAPP切断酵素(β-セクレターゼまたは「BACE」としても知られている)の活性はこれらが不在でもなお発揮されることを示している。
単離されたγ-セクレターゼ活性がATP依存性であるかどうかを試験するため、単離されたγ-セクレターゼ活性のアッセイを実施した。単離されたγ-セクレターゼアッセイ中でのAβの産生はATPおよび再生システムの添加によって強力に刺激された(Xuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3748-3752)(図３)。これらの膜に化合物１(下記参照)を添加すると、Aβ生成の用量依存性減少が観察された(図４)。
総合すると、ここに示した結果は、Aβの産生がATP依存性であることを証明している。この結果はさらに、β-セクレターゼ活性が少なくとも部分的にATP依存性であり、最適γ-セクレターゼ活性にはATPが必要であることを示している。
7. 実施例２：Aβレベルのモジュレート
ここに示す実践例は、Aβレベルをモジュレート、特に低下させる化合物の効果的な使用を証明する。
7.1. 材料および方法
Aβ産生に対する化合物の効果をアッセイするために、ヒトSwedish APP突然変異誘発および正常ヒトプレセニリン1もしくはΔE9突然変異プレセニリン1(PS1)のいずれかでトランスフェクトしたN2a細胞を使用した。
培地に化合物を濃度 0、10-9、10-8、10-7および10-6 Mで添加し、細胞を37℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を上記のように化合物の存在中で、35S-メチオニンおよび35S-システインととも４時間インキュベートした。
培地および細胞を別々に収穫し、抗体 4G8(Senetek, Napa, California)で免疫沈降させた。これはAβの残基 17-28 に相当するエピトープを認識するものである。抗体 4G8は培地からAβを、そして細胞からAβプラス全長APPを免疫沈降させる。培地から抗体 4G8および結合したAβを除去した後、上清を22C11(Chemicon International)と反応させた。これはsAPPβおよびsAPPαを免疫沈降させる抗体である。免疫沈降物をPAGEにかけ、標準的方法にしたがってオートラジオグラフィーによって解析した。APP代謝物を標準的方法にしたがってデンシトメトリーによって比較した。
別の実験中、標準的方法を使用して、非標識(非放射性標識)N2a細胞について、免疫沈降およびその後のウエスタンブロット分析を実施した。検出のためには6E10(Senetek, Napa, California)または22C11抗体を使用した。
CiphergenProteinChip System(Ciphergen Biosystems Inc., Fremont, CA)を使用し、製造元が設定した標準的プロトコルを使用して、N2a細胞からの培地について、質量分析を実施して、Aβ40 およびAβ42ペプチドを検出した。これはSeldiおよび飛行時間型質量分析に基づくものである。実験操作は、免疫沈降/ウエスタンブロッティングについて上記開示のものと同様としたが、代謝標識は含ませなかった。免疫沈降/ウエスタンブロッティングとは異なり、培地にはラウリル硫酸ナトリウム(SDS)を含ませなかったが、Triton X-100界面活性剤を含ませた。洗浄剤処理した培地のアリコートを、あらかじめ6E10などの抗体と接触させた金属チップと接触させた。この抗体は適用するサンプル中で、AβなどのAPP代謝物と結合する。抗体から抗原を解離させるレーザーパルスの後、結合した抗原を検出した。
Aβペプチドはグラフ上で、分子量を表すX軸上に位置する各種高さのピークとして分解された。こうして、Aβ40およびAβ42はそれぞれ約4333および4519ダルトンの位置に別々に分解された。所定のスペクトル中でピークの下の相対的高さまたは面積が検出体の相対的濃度を表した。分子量で表して同一種に相当するピークを別種のサンプルを反映する別種のスペクトル間で比較して、一組のサンプル中でAβの相対的量を決定した。
これらの免疫沈降実験を、最少処理時間、一晩ではなく１時間を使用して、繰り返した。
7.2. 結果
Aβレベルをモジュレートする能力について、化合物を試験した。特に、ファーマコフォアがフェニルアミノピリミジンクラスのメンバー、STI-571を試験した。特定すると、STI-571のメシレート塩(GLEEVEC(商標), Novartis, としても知られている；図20参照)を試験した。STI-571は、BCR-Ab1 チロシンキナーゼ上のATP結合部位を標的とし、またAb1、c-キットおよび血小板由来成長因子受容体(PDGFR)を阻害することが知られている、ATP競合体である。STI-571変異体の１つ、WGB-BC-15(図20参照)も試験した。その上、ピリミジニルピリドンチロシンキナーゼ阻害剤クラスの分子のメンバーである、化合物１および２(図20参照)を試験した。
APPおよび正常ヒトプレセニリン１もしくはΔE9変異体プレセニリン１のいずれかを発現するN2a細胞中、1 x 10-6Mの範囲の濃度で、STI-571はIC50を提示した(すなわち、Aβの合計レベルを50%阻害した)。WGB-BC-15もまた、分泌されたAβのレベルを阻害した。化合物１も合計Aβレベルを阻害したが、IC50は10-6Mよりも小さかった。
化合物の存在中では、細胞内Aβレベルも減少した。これらの結果は免疫沈降/ウエスタンブロット分析から導かれたものであり、35S-メチオニンのAPP取り込みについての研究結果によって確証された。
APPの２つの主要な分泌代謝物、sAPPαおよびsAPPβのレベルはこれらの化合物によって阻害されなかった。sAPPαのレベルは化合物が高濃度になると増加した。これらの結果は、分泌Aβレベルで観察された減少は細胞のタンパク質分泌能力に対する何らかの非特異的有害効果によるものではないことを証明している。
標準的方法にしたがって質量分析を実施したところ、これによってAβ40およびAβ42が明確に分割され、化合物の存在中で両種のレベルが劇的に減少したことが明らかになった(図５)。
図６および７は、ヒトAPP-Swedishトランスジーンを発現する35S標識したN2a細胞をそれぞれSTI-571または化合物１で丁度１時間処理した後、観測されたAβの用量依存的減少を説明している。
8. 実施例３：一次ニューロン細胞培養物におけるAβレベルのモジュレート
この実施例では、STI-571、化合物１および化合物２が正常ラット一次ニューロン細胞培養物中でAβペプチドの産生を阻害することを証明する。これらの結果は下記のin vivo結果とよく相関している(第９節参照)。
8.1. 材料および方法
標準的技法(Gaspariniら、2001, J.Neurosci.21(8):2561-2570)を使用して、妊娠18日目SDラットから、ラット胚皮質ニューロンの培養物を樹立した。数日間培養後、新たな培地を濃度 0、10-9、10-8、10-7、2 x 10-6および10-6 MのSTI-571、化合物１または化合物２とともに添加した。細胞を37℃で一晩培養した。
翌日、上記の化合物の存在中で、細胞を35S-メチオニンおよびシステインで4時間標識した。次に、培地および細胞を収穫し、抗体4G8による免疫沈降に供し、AβおよびAPPを検出した。分泌されたAβ、sAPPβおよびsAPPαの検出のため、培地を最初に抗体4G8で、その後抗体22C11で連続的に免疫沈降させた。免疫沈降物をPAGEにかけて、オートラジオグラフイーによって解析した。APP代謝物はデンシトメトリーによって比較した。
8.2. 結果
化合物１に曝露したラット皮質ニューロンについてのこれらの実験中、実施例２で得られたものと同様の結果が得られた。化合物１は培地(図8A)および細胞中の両方でAβのレベルを低下させた。ニューロンが産生する主要なAβペプチドはAβ11-40であり、これはラット一次ニューロンに特徴的である(図8B)。合計sAPPも合計細胞APPも有意には減少しなかった(図９)ので、化合物が細胞毒性でなく、また細胞の分泌を非特異的に阻害もしないことが示された。関連する化合物２に関しても同様の結果が得られた(図10)。
STI-571および化合物１に対する一次皮質ニューロン培養物の時間経過および用量応答を、上記のものと同様の第２次実験でさらに詳細に研究した。わずか６時間(図11および12)かつ5μM STI-571(図13)もしくは0.5μM 化合物１(図14)中で、Aβの有意な減少が観察された。
9. 実施例４：Aβ産生の動物モデル中でのAβレベルのモジュレート
本実施例に示す実験例から、Aβ産生の動物モデルの１つ、野生型モルモットでの脳Aβ40およびAβ42のレベルの有効な低下が証明される。野生型モルモットは正常Aβ産生について当分野で受容されているモデルであり、ヒトAβと免疫学的に同一のAβペプチドを産生することが知られている。したがって、野生型モルモットは薬物処置を伴うか伴わない場合のAPP代謝の摂動を試験するための動物モデルを提供し、それによって、アルツハイマー病の生理学的証明のための動物モデルとしての意味もある。
9.1. 材料および方法
化合物 STI-571 200μl(生理食塩水バッファー中 50 mM、最終濃度 15.4 mg/kg)を含有する浸透圧ミニポンプを 300-350 gのモルモットのくも膜下にインプラントした。100% DMSO中の化合物１ 200 μl(10 mM、最終 2.8 mg/kg)をミニポンプに付属する小さいカテーテルに入れた。
Aβレベルをモジュレートする能力について、化合物を試験した。特に、ファーマコフォアがフェニルアミノピリミジンクラスのメンバーである、STI-571を試験した。特定すると、STI-571のメシレート塩(GLEEVEC(商標), Novartis, としても知られている；図20参照)を試験した。STI-571は、BCR-Ab1 チロシンキナーゼ上のATP結合部位を標的とし、またAb1、c-キットおよび血小板由来成長因子受容体(PDGFR)を阻害することが知られている、ATP拮抗体である。STI-571変異体の１つ、WGB-BC-15(図20参照)も試験した。その上、ピリミジニルピリドンチロシンキナーゼ阻害剤クラスの分子のメンバーである、化合物１および２(図20参照)を試験した。
処置の７日後、動物を絶命させ、その脳を、25 mM Tris 7.5、50 mM NaCl、1 mM DTT、5 mM EDTA、1 mM EGTA、および1X プロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete(商標), Boehringer Biochemcals)中でホモジナイズした。AβペプチドについてサンドイッチELISAを製造元(Biosource International, Camarillo, CA)の推奨にしたがって使用し、またC99について標準的方法を使用する免疫沈降およびウエスタンブロット分析によって、脳ホモジネートのアリコートをアッセイした。
9.2. 結果
15.4 mg/kg STI-571で処置した動物中で、脳Aβ40およびAβ42レベル(図15Aおよび15B)は低下し、C99は増加した(図15Cおよび15D)。2.8 mg/kgの化合物１について、同様の変化が見られた(図16A-D)。これらの化合物の用量では、動物は健康で活動的であることがわかった。
これらのデータは、in vivoで、STI-571および化合物１がAβペプチドの産生を阻害することを証明している。さらに、C99の量は有意に増加したので、Aβレベルの低下はおそらくC99の特異的切断によるものと見られているところから、化合物が推定上、γ-セクレターゼ阻害剤であることが示される。
10. 実施例５：STI-571または化合物１の投与はNotchの切断を阻害しない
γ-セクレターゼ阻害剤に関係する主要な関心事は、Notch細胞表面受容体を介する細胞シグナリングの阻害能力である。Notch受容体は発生中の神経系での多様な細胞の運命の決定で機能し、また成体の免疫系で機能する。したがって、Aβ阻害はNotchの切断を有意に阻害しないことが、一般的には好ましい。この実験例では、Aβの形成を強力に阻害するレベルでの培養細胞へのSTI-571または化合物１の投与が、Notch切断に影響しないことが証明される。これらの化合物自体としては、γ-セクレターゼ活性の選択的阻害剤に相当する。
10.1. 材料および方法
N2a細胞を、構成的に活性な切断型Notchである、マウス「欠失-細胞外」Notch(mΔe-Notch)でトランスフェクトした。これはγ-セクレターゼの直接の基質を提供するものである(De Strooperら、1999, Nature 398:518-522)。
10.2. 結果
Aβの形成を強力に阻害するレベルののSTI-571(図17)または化合物１(図18)で、Notch細胞内ドメイン(NICD)を形成するm△e-Notchの切断は影響を受けなかった。
11. 実施例６：STI-571および化合物１はABLキナーゼではなくARGキナーゼの阻害によって、Aβの産生を阻害する
Ab1チロシンキナーゼはSTI-571の既知の標的である(Okudaら、2001, Blood 97(8):2440-2448)。Ab1キナーゼは化合物１の既知の標的である。Ab1キナーゼがAβの産生に必要とされるかどうか、またAβ産生に対する阻害剤STI-571および化合物１の効果がAb1キナーゼの阻害の結果であるかどうかを判定するため、本実施例に記載する実験を実施した。この実験例で示した結果は、Ab1キナーゼが存在してもしなくても、STI-571および化合物１がAβの産生を阻害することを証明している。
11.1. 材料および方法
Ab1ノックアウト(Ab1-/-)3T3マウス線維芽細胞および野生型3T3マウス線維芽細胞(Liuら、1996, Nature 384(6606):273-6参照)を、100 mm Corning組織培養プレートで密集するまで別々に増殖させた。これらの線維芽細胞系は永久増殖細胞系である。いくつかのプレートを、水に溶解した5μMもしくは10μM STI-571のいずれか、または無STI-571に曝露した。その他のいくつかのプレートを、5μMもしくは10μM 化合物１(DMSOに溶解)のいずれか、または化合物１を含まないDMSOに曝露した。
上記の細胞培養のため、薬物のそれぞれまたは対照溶媒を1:1000の希釈率で標準培地(DMEM＋10%FBS＋pen/strep)に添加し、次に培養物を37℃で２時間インキュベートした。上記の細胞培養物と阻害剤および溶媒との接触ならびにインキュベートを細胞の「予備処置」として設定した。
次に最初の培養培地を取り除き、細胞培養物を、メチオニン、システインおよびグルタミン酸を欠損している第２の培養培地で洗浄した。細胞培養物をこの培養培地とともに30分(その後のアミノ酸の取り込みを刺激するため)インキュベートした。次に、第２の培養培地を、35S-標識メチオニンおよびシステイン(NEN Express標識 50μl/ml)ならびに非標識グルタミン(最終濃度 2 mM)を含有し、そして上記の阻害剤を含む新しい第１の培地と交換し、37℃で４時間インキュベートした。
培地を回収し、4G8マウスモノクローナル抗体(Senetek, Napa, California)で免疫沈降させて、Aβペプチドを検出し、(上記のような)標準的方法にしたがって、PAGEおよびオートラジオグラフィーによって解析した。細胞を3% SDSに溶解し、1% Triton X-100を含有する免疫沈降バッファーで希釈し、369ウサギポリクローナル抗血清(標準的方法に従って製造)で免疫沈降させて、APPを検出し、PAGEおよびオートラジオグラフィーによって解析した。
11.2. 結果
野生型3T3線維芽細胞およびAb1-/-3T3線維芽細胞の両方が、各細胞系によって産生されるAPPの量に比較して、同程度の量のAβペプチドおよびp3ペプチド(両者ともγ-セクレターゼ活性の産物)を産生した(APPの量も両細胞系で同程度だった)。このことは、Ab1はAβ産生またはγ-セクレターゼ活性にとって必要でないことを証明している。
さらに、STI-571および化合物１の両方が3T3線維芽細胞およびAb1-/-3T3線維芽細胞系の両方中で同程度にAβ産生を阻害し、この阻害はN2a細胞中でのこの阻害剤によるAβ産生の阻害の程度と同程度でもあった。このことは、Aβ阻害に関係する阻害剤の標的が、Ab1キナーゼが存在するかどうかにかかわらず、無傷のままであったことを示している。
12. 実施例７：γ-セクレターゼ活性の作用の機構
Notch-I切断が阻害剤 STI-571および化合物１によって阻害されないことは以前に指摘した(図17および18中)。重要なのは、Notch切断はγ-セクレターゼ活性によって触媒されることが知られていることである。したがって、Aβ産生を阻害するがNotch切断は阻害しないγ-セクレターゼ阻害剤(すなわち、選択的γ-セクレターゼ阻害剤)を治療薬として使用することができる。なぜならば、これは免疫系、ならびにその他のNotch依存系を損傷するような副作用を少なくする可能性があるからである。
この実験例では、Notch-1切断がエネルギーもしくはATP依存性ではないか、あるいはATPの存在によって(不在の場合に対して)別様に影響されることを証明する。こうして、特定の何らかの理論に束縛されることは望まないが、タンパク質標的への結合についてATPと競合する阻害剤などのATPモジュレーターは、Notch切断を阻害せず、細胞毒性でないか、あるいはNotchタンパク質によって調節される細胞または発生過程に影響しないと見られる。
12.1. 材料および方法
実施例１に記載した方法(Xuら、1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3748-3752も参照)にしたがって、mΔe-Notch 1でトランスフェクトしたN2a細胞から誘導した無細胞系(Leemら、2002, Neurobiol Dis.11(1):64-82)を作製した。細胞を放射性物質でパルス標識し、トランスゴルジネットワーク(TGN)中の標識Notchの蓄積を、20℃で2時間追跡した。次に細胞を37℃で20-25分間インキュベートして、mΔe-Notch 1の細胞表面(Notch 1の切断の最初の部位と考えられる)への局在化をシンクロナイズさせた。次に細胞を透過性化し、GTPを含む標準的ATPエネルギー再生システムを含ませるか、または含ませないで、37℃でインキュベートした(Xuら、1997, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3748-3752)。サンプルを同一条件下で、標準的γ-セクレターゼ阻害剤(Calbiochem)を含ませるか含ませないで、インキュベートした。
mΔe-Notch-1およびNotch細胞内ドメイン(NCID、Notch切断の産物)を測定するため、透過性化した細胞を沈降させて、沈降した細胞および上清の両方を標準的方法にしたがって抗myc抗体で免疫沈降させて、NotchおよびNCID(両者ともmycタグで標識した)を検出した。
12.2 結果
細胞は透過性化されているため、NCIDは上清中に見られるので、そうでなければ細胞質ゾル中にあるはずのNCIDを、透過性化した細胞を沈降させ、次に上清から分離することによって回収することができた。さらに、標準的γ-セクレターゼ阻害剤は予想通りにNotch切断を阻害したので(図19)、この系ではNotch 切断のためにはγ-セクレターゼ活性が必要であることが示された。
第10節で、Aβの形成を強力に阻害するレベルのSTI-571(図17)または化合物１(図18)で、Notch細胞内ドメイン(NICD)を形成するm△e-Notchの切断は影響を受けないことがすでに示されている。本実施例では、標準的γ-セクレターゼの存在もしくは不在中、およびATPの存在もしくは不在中で、Notchが同程度に効果的に切断されることが証明された。したがって、Notch切断はATP依存性ではない。
本発明は本明細書に記載する特定の実施形態によってその範囲を限定されるものではない。実際、当業者にとっては、前記の説明から、本明細書に記載したものの他に、多様な本発明の改変が明らかになるであろう。こうした改変は添付する特許請求の範囲に入ることを想定している。
本明細書に引用した全参照文献は、その全文を、そしてあらゆる目的において、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願があらゆる目的のためにその全部を参照として特定的に、かつ個別に組み込まれるのと同程度に、参照として本明細書中に組み入れる。
どの刊行物の引用も、出願日以前の開示という点に関するものであって、本発明が先行発明として、こうした刊行物に先行する権利を与えられないことの承認として解釈されるべきでない。
ATP再生システムをＡβ生成のために無細胞アッセイ系に加えることの効果を定量する棒グラフである。その系はヒトAPPのスウェーデン変異体およびプレセニリン-1（PS1）突然変異の両方を発現するマウスN2a細胞に由来する。 β-セクレターゼ開裂生成物、C99（βCTFとしても知られている）がATP枯渇無細胞系中で蓄積することを示すオートラジオグラムである。 分離された膜中のＡβへのC99開裂の強いATP依存性を示す棒グラフである。 化合物１による分離された膜におけるＡβレベルの低下に関する用量-応答のグラフである。 化合物１の存在下の減少されたＡβ40（「Ａβ1-40」）およびＡβ42（「Ａβ1-42」）を示す、抗Ａβ抗体6E10（Senetek、Napa、カリフォルニア）による、ヒトAPPのスウェーデン変異体およびプレセニリン-1(PS1)突然変異の両方を発現する、N2a細胞の上澄みから免疫沈殿されたペプチドの質量スペクトル写真プロフィールである。Ｙ軸、化合物１の濃度(M)。 ヒトAPPのスウェーデン変異体を発現する無傷N2a細胞中のＡβ生成のSTI-571のメシレート塩（imatinibメシレート、GLEEVEC(商標)、Novartis Pharmaceuticals; Calbiochem）による用量依存性阻害のグラフである。そのグラフはまたAPPレベルがSTI-571投与に対する応答で変化しないことを実証する。 ヒトAPPのスウェーデン変異体を発現する無傷N2a細胞中のＡβ生成の化合物１による用量依存性阻害のグラフである。そのグラフはまたAPPレベルがSTI-571投与に対する応答で変化しないことを実証する。 図8Aは化合物１に応答してラット脳から培養された一次神経細胞から生成されたＡβの減少を示す棒グラフである。図8Bは生成されたAPPの量（上部パネル）および化合物１の異なる濃度で生成されたＡβの量（下部パネル）を示すオートラジオグラムである。 化合物１の存在下のラット脳から培養された一次神経細胞からの可溶性APP-α（「APPa」）の一貫した分泌を示すオートラジオグラムである。 化合物２の存在に応答してラット脳から培養された一次神経細胞から生成されたＡβの減少を示す棒グラフである。 ラット脳から培養された一次神経細胞からのＡβ生成に関するSTI-571（メシレート塩）の効果の時間経過（単位：時間）を示す棒グラフである。 ラット脳から培養された一次神経細胞からのＡβ生成に関する化合物１の効果の時間経過を示す棒グラフである。 ラット脳から培養された一次神経細胞からのＡβ生成に関するSTI-571に対する用量応答を示す棒グラフである。 ラット脳から培養された一次神経細胞からのＡβ生成に関する化合物１に対する用量応答を示す棒グラフである。Ｘ軸、DMSO対照および化合物１の濃度(M)。 モルモットでin vivoの、STI-571メシレート塩（「STI」）依存性のＡβ1-40（15A）、Ａβ1-42（15B）の減少およびC99（15Cおよび15D）の増加の定量を示す。図15Cはまた完全長βAPPレベルが治療に応答して変化しないことを実証する。**、p<0.01；*、0.01<p<0.05。 モルモットでin vivoの、化合物１（「CMPD1」）依存性のＡβ1-40（16A）、Ａβ1-42（16B）の減少およびC99（16Cおよび16D）の増加の定量を示す。図16Cはまた完全長βAPPレベルが治療に応答して変化しないことを実証する。**、p<0.01；*、0.01<p<0.05。 STI-571（メシレート塩）で治療された無傷細胞中のNotch開裂の安定なレベルを示すグラフおよびオートラジオグラムである。図はSTI-571投与が用量依存様式でＡβレベルを低下し、一方、NotchおよびNotch開裂生成物（Notch細胞内ドメイン、NICD）のレベルが安定に留まることを実証する結果を表す。 化合物１で治療された無傷細胞中のNotch開裂の安定なレベルを示すグラフである。 通常のγ-セクレターゼ阻害剤（「γ-セクレターゼ阻害剤」；Calbiochem）がmΔe-Notch１トランスフェクトされたN2a細胞に由来する無細胞系中でNotch開裂を阻害することおよびγ-セクレターゼ活性が、それ故、この系中のNotch開裂に必要であることを示すオートラジオグラムである。トランスフェクトされた細胞を透過し、GTPを含む通常のATPエネルギー再生システムとともに、又はその再生システムを用いずに、また通常のγ-セクレターゼ阻害剤（「γ-セクレターゼ阻害剤」、Calbiochem）の存在下又は不在下でインキュベートした。γ-sec、γ-セクレターゼ。ERS、エネルギー再生システム。NICD、Notch細胞内ドメイン。 STI-571、そのメシレート塩（GLEEVEC(商標)）、STI-571変異体（「WGB-BC-15」）、化合物１（PD173955、Moasserら, 1999, Cancer Research 59:6145-6152; Wisniewskiら, 2002, 62(15):4244-55）、化合物２（PD166326；Wisniewskiら, 2002, 62(15):4244-55）、化合物３（PD173956；Bauerら, 2001, Thromb. Haemost. 85(2):331-40; Maschbergerら, 2000, J. Biol. Chem. 275(25):19159-66）、化合物４（PD173952；Dorseyら, 2002, Leukemia 16(9):1589-95）、化合物５（PD-173958；Dorseyら, 2002, Leukemia 16(9):1589-95; Joseloffら, 2002, J. Biol. Chem. 277(14):12318-23）の化学構造のダイヤグラムである。
配列表
Figure 0004508645
Figure 0004508645

Claims (24)

  1. 細胞または組織の示すアミロイド−βペプチド（Ａβ）レベルをモジュレートする方法であって、該細胞または組織を、インビトロで、式Ｉ：
    Figure 0004508645
     の試験化合物またはその薬学上許容し得る塩と接触させて該Ａβレベルをモジュレートすることを含む、方法。
  2. Ａβレベルを低下させる、請求項１記載の方法。
  3. ＡβがＡβ４０である、請求項１記載の方法。
  4. ＡβがＡβ４２である、請求項１記載の方法。
  5. モジュレートの結果、Ａβ４０のＡβ４２に対する比率が増加する、請求項１記載の方法。
  6. モジュレートの結果、Ｃ９９が増加する、請求項１記載の方法。
  7. 化合物がβ-アミロイド前駆体産物（APP）の全細胞レベルに影響しない、請求項１記載の方法。
  8. 化合物が分泌されたAPP（sAPP）のレベルを低下させない、請求項１記載の方法。
  9. 化合物がsAPPαのレベルを上昇させる、請求項１記載の方法。
  10. 分泌Ａβのレベルがモジュレートされる、請求項１記載の方法。
  11. 化合物がNotch-1切断を阻害しない、請求項１記載の方法。
  12. 化合物が血液-脳関門を通過する、請求項１記載の方法。
  13. 細胞または組織の示すＡβレベルをモジュレートするための、
    式Ｉ
    Figure 0004508645
     の化合物またはその薬学上許容し得る塩を含む、製品。
  14. Ａβレベルを低下させる、請求項１３記載の製品。
  15. ＡβがＡβ４０である、請求項１３記載の製品。
  16. ＡβがＡβ４２である、請求項１３記載の製品。
  17. モジュレートの結果、Ａβ４０のＡβ４２に対する比率が増加する、請求項１３記載の使製品。
  18. モジュレートの結果、Ｃ９９が増加する、請求項１３記載の製品。
  19. 化合物がβ-アミロイド前駆体産物（APP）の全細胞レベルに影響しない、請求項１３記載の製品。
  20. 化合物が分泌されたAPP（sAPP）のレベルを低下させない、請求項１３記載の製品。
  21. 化合物がsAPPαのレベルを上昇させる、請求項１３記載の製品。
  22. 分泌Ａβのレベルがモジュレートされる、請求項１３記載の製品。
  23. 化合物がNotch-1切断を阻害しない、請求項１３記載の製品。
  24. 化合物が血液-脳関門を通過する、請求項１３記載の製品。
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