JP4478540B2 - リパーゼ粉末、その製造方法及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、各種エステル化反応、エステル交換反応などに好適に使用することができるリパーゼ粉末、その製造方法、該リパーゼ粉末を用いるエステル化方法及びエステル交換方法などに関するものである。

リパーゼは、脂肪酸などの各種カルボン酸とモノアルコールや多価アルコールなどのアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換反応などに幅広く使用されている。このうち、エステル交換反応は動植物油脂類の改質をはじめ、各種脂肪酸のエステル、糖エステルやステロイドの製造法として重要な技術である。これらの反応の触媒として、油脂加水分解酵素であるリパーゼを用いると、室温ないし約７０℃程度の温和な条件下でエステル交換反応を行うことができ、従来の化学反応に比べ、副反応の抑制やエネルギーコストが低減化されるだけでなく、触媒としてのリパーゼが天然物であることから安全性も高い。また、その基質特異性や位置特異性により目的物を効率良く生産することができる。ところが、リパーゼ粉末をそのままエステル交換反応に用いても活性が十分に発現しないばかりか、元来が水溶性のリパーゼを油性原料中に均一に分散させることは困難であり、その回収も困難である。このため、従来はリパーゼを何らかの担体、たとえば陰イオン交換樹脂（特許文献１）、フェノール吸着樹脂（特許文献２）、疎水性担体（特許文献３）、陽イオン交換樹脂（特許文献４）、キレート樹脂（特許文献５）等に固定化してエステル化やエステル交換反応などに用いることが一般的である。

このように、従来はリパーゼを固定化してエステル交換反応に用いていたが、かかる固定化リパーゼは固定化処理による本来のリパーゼ活性の損失を伴うだけでなく、多孔性担体を用いた場合は細孔に原料や生成物が詰まり、結果としてエステル交換率の低下を招いていた。さらに、従来の固定化リパーゼを用いたエステル交換反応においては、担体が保持する水分が反応系に持ち込まれるため、副反応、たとえば油脂類のエステル交換反応におけるジグリセリドやモノグリセリドの生成等を避けることは困難であった。
このような状況に鑑み、リパーゼ粉末を用いる各種技術が開発されている。例えば、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に分散リパーゼ粉末粒子の９０％以上を１〜１００μｍの範囲の粒径に保つように、エステルを含有する原料にリパーゼ粉末を分散させてエステル交換反応を行う方法が提案されている（特許文献６）。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を乾燥して得た酵素粉末を用いることが提案されている（特許文献７）。
しかしながら、さらにリパーゼ活性が向上したリパーゼ粉末が求められている。

特開昭６０−９８９８４号公報 特開昭６１−２０２６８８号公報 特開平２−１３８９８６号公報 特開平３−６１４８５号公報 特開平１−２６２７９５号公報 特許第２６６８１８７号公報 特開２０００−１０６８７３号公報

本発明は、リパーゼ活性が向上したリパーゼ粉末を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を用いるエステル化方法及びエステル交換方法を提供することを目的とする。
本発明のこれらの目的及び他の目的は、以下の記載から明らかとなるであろう。

本発明は、リパーゼを中鎖脂肪酸、そのアルコールエステル又はそれらの混合物を用いて造粒し、粉末状にすると、リパーゼ活性が各段に向上するとの知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は、リパーゼと、炭素数８〜１２の脂肪酸、そのアルコールエステル及びそれらの混合物から選ばれる少なくとも１種を含有する造粒物であることを特徴とするリパーゼ粉末を提供する。
本発明は、又、リパーゼ含有水溶液に、炭素数８〜１２の脂肪酸、そのアルコールエステル及びそれらの混合物から選ばれる少なくとも１種を添加し、スプレードライ又はフリーズドライすることを特徴とするリパーゼ粉末の製造方法を提供する。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を含有するエステル化用又はエステル交換用リパーゼを提供する。
本発明は、又、上記リパーゼを用いることを特徴とする脂肪酸とアルコールのエステル化方法又はエステル交換方法を提供する。

本発明で用いるリパーゼとしては、リポプロテインリパーゼ、モノアシルグリセロリパーゼ、ジアシルグリセロリパーゼ、トリアシルグリセロリパーゼ、ガラクトリパーゼ、フォスフォリパーゼ等が挙げられる。これらのうち、トリアシルグリセロリパーゼが好ましい。
これらのリパーゼを産生する微生物としては、細菌、酵母、糸状菌、放線菌等特に限定されるものではないが、シュードモナス属（Psudomonas sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）、アスロバクター属（Arthrobacter sp.）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus sp.）、トルロプシス属（Torulopsis sp.）、エスチエリシア属（Escherichia sp.）、マイコトルラ属（Micotorula sp.）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterum sp.）、クロモバクテリウム属（Chromobacterum sp.）、キサントモナス属（Xanthomonas sp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、クロストリデイウム属（Clostridium sp.）、キャンデイダ属（Candida sp.）、ジオトリカム属（Geotrichum sp.）、サッカロマイコプシス属（Sacchromycopsis sp.）、ノカルデイア属（Nocardia sp.）、フザリウム属（Fuzarium sp.）、アスペルギルス属（Aspergillus sp.）、ペニシリウム属（Penicillum sp.）、ムコール属（Mucor sp.）、リゾプス属（Rhizopus sp.）、フィコマイセス属（Phycomycese sp.）、プチニア属（Puccinia sp.）、バチルス属（Bacillus sp.）、ストレプトマイセス属（Streptmycese sp.）などが挙げられる。
本発明では、これらのうち、1,3-特異性リパーゼが好ましく、特に、ムコール属及びアルカリゲネス属由来の1,3-特異性リパーゼが好ましく、さらにムコール属のRhizomucor miehei及びアルカリゲネス属のAlcaligenes sp.由来の1,3-特異性リパーゼが好ましい。

本発明でリパーゼを造粒するのに用いる炭素数８〜１２の脂肪酸としては、飽和、不飽和、直鎖、分岐鎖脂肪酸のいずれをも用いることができる。このうち、飽和脂肪酸が好ましく、より好ましくは炭素数８〜１０の脂肪酸、特に、炭素数８又は１０の飽和脂肪酸が好ましい。これらは、１種でも、又２種以上併用することができる。尚、脂肪酸の一部がアルカリ金属やアルカリ土類金属と塩を形成していてもよい。これらのうち、ナトリウムやカリウムといったアルカリ金属と塩を形成しているのがよい。
そのアルコールエステルとしては、上記脂肪酸と各種アルコール、例えば、モノアルコール、多価アルコール、これらの混合物とのエステルがあげられる。これらのうち、アルコールとしては、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコールなどのグリコール類、グリセリン、エリスリトール、ペンタエリスリトール、トリメチロールプロパンなどがあげられる。これらのうち、アルコール性水酸基を少なくとも１つ有する部分エステルであるのが好ましい。なかでも、モノグリセリド、ジグリセリドが好ましく、特にモノグリセリドが好ましい。これらは、１種又は２種以上併用することができる。

本発明では、上記脂肪酸とそのアルコールエステルを併用することもできる。
リパーゼと脂肪酸など（炭素数８〜１２の脂肪酸、そのアルコールエステル及びそれらの混合物から選ばれる少なくとも１種を、“脂肪酸など”と略称することがある）の割合は、種々の割合とすることができるが、リパーゼ質量の０.１〜２０倍の量とするのが好ましく、１〜２０倍の量とするのがより好ましい。
本発明のリパーゼ粉末は、水分含量が１０質量％以下であるのが好ましく、特に、6.5〜8.5質量％であるのが好ましい。
本発明のリパーゼ粉末の粒径は任意とすることができるが、リパーゼ粉末の90質量％以上が粒径1〜100μｍであるのが好ましい。又、リパーゼ粉末の粒径は球状であるのが好ましい。
リパーゼ粉末の粒径は、例えば、HORIBA社の粒度分布測定装置（ＬＡ−５００）を用いて測定することができる。

本発明のリパーゼ粉末は、例えば、リパーゼ含有水溶液に脂肪酸などを添加し、スプレードライ又はフリーズドライすることにより得ることができる。
ここで、リパーゼ含有水溶液としては、菌体を除去したリパーゼ培養液、精製培養液、これらから得たリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販のリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販の液状リパーゼ等が挙げられる。さらに、リパーゼ活性をより高めるために塩類等の低分子成分を除去したものがより好ましく、また、粉末性状をより高めるために糖等の低分子成分を除去したものがより好ましい。
リパーゼ培養液としては、例えば、大豆粉、ペプトン、コーン・ステープ・リカー、Ｋ₂ＨＰＯ₄、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ等含有する水溶液があげられる。これらの濃度としては、大豆粉０．１〜２０質量％、好ましくは１．０〜１０質量％、ペプトン０．１〜３０質量％、好ましくは０．５〜１０質量％、コーン・ステープ・リカー０．１〜３０質量％、好ましくは０．５〜１０質量％、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜５質量％である。又、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄は０．０１〜２０質量％、好ましくは０．０５〜５質量％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏは０．０１〜２０質量％、好ましくは０．０５〜５質量％である。培養条件は、培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃、通気量は０．１〜２．０ＶＶＭ、好ましくは０．１〜１．５ＶＶＭ、攪拌回転数は１００〜８００rpm、好ましくは２００〜４００rpm、pHは３．０〜１０．０、好ましくは４．０〜９．５に制御するのがよい。

菌体の分離は、遠心分離、膜濾過などで行うのが好ましい。また、塩類や糖等の低分子成分の除去は、ＵＦ膜処理により行うことができる。具体的には、ＵＦ膜処理を行い、リパーゼを含有する水溶液を１／２量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のリン酸バッファーを添加するという操作を１〜５回繰り返すことにより、低分子成分を除去したリパーゼ含有水溶液を得ることができる。
遠心分離は２００〜２０，０００×ｇ、膜濾過はＭＦ膜、フィルタープレスなどで圧力を３．０kg/m2以下にコントロールするのが好ましい。菌体内酵素の場合は、ホモジナイザー、ワーリングブレンダー、超音波破砕、フレンチプレス、ボールミル等で細胞破砕し、遠心分離、膜濾過などで細胞残さを除去することが好ましい。ホモジナイザーの攪拌回転数は５００〜３０，０００rpm、好ましくは１，０００〜１５，０００rpm、ワーリングブレンダーの回転数は５００〜１０，０００rpm、好ましくは１，０００〜５，０００rpmである。攪拌時間は０．５〜１０分、好ましくは１〜５分がよい。超音波破砕は１〜５０KHz、好ましくは１０〜２０KHzの条件で行うのが良い。ボールミルは直径０．１〜０．５mm程度のガラス製小球を用いるのがよい。
本発明では、リパーゼ含有水溶液としては、固形分として5〜30質量％含むものを用いるのが好ましい。

添加する脂肪酸などは、リパーゼ含有水溶液の固形分質量の０.１〜２０倍の量であるのが好ましく、０．３〜１０倍の量であるのがより好ましく、０．３〜５倍の量が最も好ましい。
ここで、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度は、例えば、糖度計（（株）シー・アイ・エス社製 BRX-242）を用いてBrix.％として求めることができる。
上記脂肪酸などを添加した後、リパーゼ含有水溶液のｐＨを１０以下、好ましくは６〜１０に調整するのがよい。ｐＨ調整は、スプレードライなどの乾燥工程の直前に行うのが好ましいが、その前のいずれかの工程において行ってもよく、乾燥工程の直前のｐＨが上記範囲内となるように、予めリパーゼ含有水溶液のｐＨを調整しておいてもよい。
ｐＨ調整には、各種アルカリ剤や酸を用いることができるが、水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物を用いるのが好ましい。
又、乾燥工程前の途中の工程において、リパーゼ含有水溶液を濃縮してもよい。濃縮方法は、特に限定されるものではないが、エバポレーター、フラッシュエバポレーター、ＵＦ膜濃縮、ＭＦ膜濃縮、無機塩類による塩析、溶剤による沈殿法、イオン交換セルロース等による吸着法、吸水性ゲルによる吸水法等があげられる。好ましくはＵＦ膜濃縮、エバポレーターがよい。ＵＦ膜濃縮用モジュールとしては、分画分子量３，０００〜１００，０００、好ましくは６，０００〜５０，０００の平膜または中空糸膜、材質はポリアクリルニトリル系、ポリスルフォン系などが好ましい。

スプレードライは、例えば、ノズル向流式、デイスク向流式、ノズル並流式、デイスク並流式等の噴霧乾燥機を用いて行うのがよい。好ましくはデイスク並流式が良く、アトマイザー回転数は４，０００〜２０，０００rpm、加熱は入口温度１００〜２００℃、出口温度４０〜１００℃で制御してスプレードライするのが好ましい。
又、フリーズドライ（凍結乾燥）も好ましく、例えば、ラボサイズの少量用凍結乾燥機、棚段式凍結乾燥により行うのが好ましい。さらに、減圧乾燥により調製することもできる。
リパーゼが、1,3-特異性リパーゼである場合、特に、Rhizomucor miehei又はAlcaligenes sp.由来のリパーゼである場合には、本発明によると1,3-選択性が極めて高くなるので、該リパーゼ粉末をエステル交換用リパーゼとして好適に使用することができる。そして、このリパーゼ粉末を用い、常法により、油脂などのエステル交換反応を効率的に行うことができる。

又、本発明の粉末リパーゼ組成物を用いて、エステル化を行うこともできる。ここで、エステル化で対象とするアルコール性水酸基を分子内に少なくとも１つ有する化合物としては、各種モノアルコール、多価アルコール、アミノアルコールなど種々の化合物があげられる。具体的には、短鎖、中鎖、長鎖の飽和、不飽和、直鎖、分岐アルコール、グリコール類、グリセリン、エリスリトール類といった多価アルコールがあげられる。これらのうち、グリセリンが好ましい。
一方、カルボン酸としては、短鎖、中鎖、長鎖の飽和、不飽和、直鎖、分岐カルボン酸があげられる。これらのうち、炭素数６〜３０の脂肪酸、例えば、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸などがあげられる。これらは１種又は２種以上を併用して用いることができる。これらのうち、不飽和脂肪酸が好ましく、特に共役リノール酸を用いるのが好ましい。
エステル化の条件は、例えば、特開平13−169795号公報や特開平15−113396号公報などに記載の条件に準じて行うことができる。一例をあげると、基質の合計質量、すなわちアルコール性水酸基を有する化合物とカルボン酸の合計質量に対して、本発明の粉末リパーゼ組成物を０．１〜２質量％添加し、３０〜６０℃で２４〜７２時間反応させるのがよい。この際、反応系を減圧にしてエステル化により生じる水を除去しながら反応を行うのがよい。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１
水溶液にリパーゼが溶解・分散した形態にあるノボノルディスク社製のRhizomucor miehei由来の液状リパーゼ（商品名Palatase）を、UFモジュール（旭化成工業（株）社製SIP-0013）を用いて低分子成分を除去してリパーゼ含有水溶液１（固形分濃度２０．１質量％）を得た。詳しくは、液状リパーゼ（パラターゼ）を氷冷下でＵＦ膜処理を行い、１／２量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のｐＨ７の０．０１Ｍリン酸バッファーを添加した。
得られた溶液について、同じようにＵＦ膜処理後リン酸バッファーを添加する操作を２回繰り返した後、さらにＵＦ膜処理をし、得られたリパーゼ濃縮液をリパーゼ含有水溶液１とした。
このリパーゼ含有水溶液１、20ｍｌに対して、水20ｍｌ及び脂肪酸モノグリセリド水懸濁液（ｎ−デカン酸モノグリセリド（Ｃ10ＭＡＧ）の３質量％水懸濁液）40ｍｌを添加した。このようにして得られた溶液のｐＨを、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ９.１に調整した。
この液を、スプレードライヤー（SD-1000型：東京理化器械（株）社製）を用い、入口温度130℃、乾燥空気量0．7〜1．1ｍ³/min、噴霧圧力11〜12kpaの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。リパーゼ粉末粒子の形状は球状で、リパーゼ粉末の９０質量％以上が粒径１〜１００μｍの範囲内にあり、平均粒径は7．6μｍであった。粒径は、HORIBA社の粒度分布測定装置（ＬＡ−５００）を用いて測定した。
尚、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度は、糖度計（（株）シー・アイ・エス社製 BRX-242）を用いてBrix．％として求めた。

実施例２
脂肪酸モノグリセリド水懸濁液（ｎ−デカン酸の３質量％水懸濁液）の代わりに、脂肪酸水懸濁液（ｎ−デカン酸（Ｃ10ＦＡ）の５質量％水懸濁液）を用いた以外は、実施例１と同様にしてリパーゼ粉末を得た。
比較例１
リパーゼ濃縮液：ｐＨ７の０．０１Ｍリン酸バッファーを体積比で１：１で用いた以外は、実施例１と同様にしてリパーゼ粉末を得た。
このようにして得られたリパーゼ粉末のリパーゼ活性を以下の方法により測定した。結果を表−１に示す。

リパーゼ活性
トリオレインとトリカプリリンを1：1（ｗ）の割合で混合した油に、粉末リパーゼを添加し60℃で反応させた。経時的に10μｌをサンプリングし、ヘキサン１．５ｍｌで希釈後、粉末リパーゼをろ過した溶液をガスクロサンプルとした。ガスクロ（カラム：DB‐1ht）で分析し下式より反応率を求めた。ガスクロ条件は、カラム温度：初期150℃、昇温15℃/min.、最終370℃であり、これ以外の条件は、下記の1.3-選択性試験におけると同様である。
反応率（％）＝{C34 area/（C24 area＋C34 area）}×100
式中、C24はトリカプリリン、C34はトリカプリリンの１つの脂肪酸が18に置き換わったものを示し、areaはそれらのエリア面積である。
各時間における反応率に基づき解析ソフト（Orijin ver.6.1）により反応速度定数K値を求めた。リパーゼ活性は、比較例１のK値を１００とした時の相対活性で表した。

表−１
条件（体積比） 相対活性
比較例１リパーゼ濃縮液：bf（7）＝１：１ １００
実施例１リパーゼ濃縮液：水：Ｃ10ＭＡＧ＝0.5：0.5：１ ６５９
実施例２リパーゼ濃縮液：水：Ｃ10ＦＡ＝0.5：0.5：１ ９６４

実施例３
３種類の脂肪酸水懸濁液、懸濁液１（ｎ−オクタン酸（Ｃ8ＦＡ）の５質量％水懸濁液）、懸濁液２（ｎ−デカン酸（Ｃ10ＦＡ）の５質量％水懸濁液）又は懸濁液３（ｎ−ドデカン酸（Ｃ12ＦＡ）の５質量％水懸濁液）を用い、得られた水溶液について、これらの脂肪酸の半量をＮaOHで中和した以外は（ｐＨ６.８）、実施例２と同様にしてリパーゼ粉末を得た。
このようにして得られたリパーゼ粉末のリパーゼ活性を、上記の方法により測定した。比較例１の結果とともに、結果を表−２に示す。

表−２
条件（体積比） 相対活性
比較例１ １００
懸濁液１（Ｃ8ＦＡ） ４６３
懸濁液２（Ｃ10ＦＡ） ６６７
懸濁液３（Ｃ12ＦＡ） ３１０

Claims (13)

1. トリアシルグリセロリパーゼと、炭素数８〜１２の飽和脂肪酸、そのモノグリセリド及びそれらの混合物から選ばれる少なくとも１種を含有する造粒物であることを特徴とするリパーゼ粉末。
2. トリアシルグリセロリパーゼが1,3-特異性リパーゼである請求項１記載のリパーゼ粉末。
3. 1,3-特異性リパーゼが、ムコール属又はアルカリゲネス属由来のリパーゼである請求項２記載のリパーゼ粉末。
4. 飽和脂肪酸が炭素数８又は１０の飽和脂肪酸である請求項１〜３のいずれか１項記載のリパーゼ粉末。
5. トリアシルグリセロリパーゼ含有水溶液に、炭素数８〜１２の飽和脂肪酸、そのモノグリセリド及びそれらの混合物から選ばれる少なくとも１種を添加し、スプレードライ又はフリーズドライすることにより得られる請求項１〜４のいずれか１項記載のリパーゼ粉末。
6. 炭素数８〜１２の飽和脂肪酸、そのモノグリセリド及びそれらの混合物から選ばれる少なくとも１種を添加した後、トリアシルグリセロリパーゼ含有水溶液のｐＨが６〜１０に調整されている請求項５記載のリパーゼ粉末。
7. リパーゼ粉末の90質量％以上が粒径1〜100μｍである請求項１〜６のいずれか１項記載のリパーゼ粉末。
8. トリアシルグリセロリパーゼ含有水溶液に、炭素数８〜１２の飽和脂肪酸、そのモノグリセリド及びそれらの混合物から選ばれる少なくとも１種を添加し、スプレードライ又はフリーズドライすることを特徴とするリパーゼ粉末の製造方法。
9. 添加する炭素数８〜１２の飽和脂肪酸、そのモノグリセリド及びそれらの混合物から選ばれる少なくとも１種が、トリアシルグリセロリパーゼ含有水溶液の固形分質量の０.１〜２０倍量である請求項８記載の製造方法。
10. 炭素数８〜１２の飽和脂肪酸、そのモノグリセリド及びそれらの混合物から選ばれる少なくとも１種を添加した後、トリアシルグリセロリパーゼ含有水溶液のｐＨを６〜１０に調整する請求項８又は９記載の製造方法。
11. トリアシルグリセロリパーゼ含有水溶液が、菌体を除去したリパーゼ培養液、またはその精製培養液である請求項８〜１０のいずれか１項記載の製造方法。
12. 請求項１〜７のいずれか１項記載のリパーゼ粉末を含有するエステル化用又はエステル交換用リパーゼ。
13. 請求項１２記載のリパーゼを用いることを特徴とする脂肪酸とアルコールのエステル化方法又は油脂のエステル交換方法。