JP4474655B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、生体組織等の蛍光観察などに使用される顕微鏡装置に関する。

分子生物学分野等において、生体組織や細胞内イオン、分子等の観察は必須の技術である。光学顕微鏡は、主に生体組織を観察するときに用いられる。また、共焦点顕微鏡は、光を生体細胞の一部に照射し、その照射位置を移動させ、細胞の一部を観察するときに用いられる。

光学顕微鏡の主な観察技術の一つに、生体組織の細胞内イオンに蛍光色素を付け、蛍光色素が発する蛍光を観察する蛍光顕微鏡による方法があるが、この顕微鏡を使用して動く細胞を観察していると、細胞が顕微鏡の視野外に出て観察が中断してしまう場合がある。

この問題の解決方法として、（１）対物レンズの倍率を下げ視野を広げる、（２）機械的又は化学的に細胞の動きを抑制する、（３）ステージを制御し細胞を追跡（トラッキング）することが挙げられる。しかし、（１）の方法は空間解像度が低下し、（２）の方法は細胞へ悪影響を及ぼす可能性がある。

特許文献１及び２には、微小な観察物を観察するために被観察物を追跡（トラッキング）する機構を備えた光学顕微鏡が開示されている。これらの光学顕微鏡は、透過光を用いた細胞位置制御と透過光記録を行うことができる。

特許文献３〜５には、蛍光を用いた細胞位置制御と蛍光記録とを行うことができる共焦点顕微鏡が開示されている。

特開平５−８０２５５号公報 特開平７−２５３５４８7号公報 特開平７−２６１０９７号公報 特開２００５−２１４９２４号公報 特開２００６−２９２４２０号公報 ＷＯ２００３／１０２６３６号公報 H. Oku, N. Ogawa, Ishikawa, K. Hashimoto, "Two-dimensional tracking of a motile micro-organism allowing high-resolution observation with various imaging techniques", Review of Scientific Instruments, Vol.76, No.3, 2005 H. Oku, M. Ishikawa, Theodorus, and K. Hashimoto, "High-speed autofocusing of a cell using diffraction patterns", Optics Express, Vol.14, No.9, pp.3952-3960, 2006 奥寛雅，石井抱，石川正俊：マイクロビジュアルフィードバックシステム，電子情報通信学会誌 D-II，Vol.J84-D-II，No.6，pp.994-1002, 2001 奥寛雅，石川正俊：キロヘルツオーダーで応答可能な高速ビジョンチップ用可変焦点レンズの構造，光学，Vol.31，No.10，pp.758-764, 2002

しかしながら、蛍光を細胞位置制御に用いると、蛍光は光の強度が弱いために細胞位置制御用の画像を得るための露光時間が長くなり、細胞位置制御にかかる時間が長くなってしまう。つまり、位置制御対象である細胞の最大速度が遅くなることになるため、このような顕微鏡は実際には、本来動かない細胞を長時間観察した際に起こるずれを補正することを主目的としていた。

従来の蛍光顕微鏡においても、励起光の種類や強度を自動的に制御することで細胞内の複数のイオンや分子の活性化状態を継時的に観察し、一回の実験中に起こった細胞内の複数のイオンや分子の相互作用を一括して可視化することが行われてきた。しかしながら、この自動制御は、予め決められた時間スケジュールに従ったものであるか、蛍光画像から得られる細胞情報と連動したものであった。このため、大量の蛍光記録データを解析するには長い時間が必要であった。

本発明は上記課題に鑑み、透過光を用いて、細胞などの被観察物の位置制御と蛍光記録ができる顕微鏡装置を提供することを目的としている。

本発明者等は、上記（３）の解決方法を実現するために、以前に開発した細胞追跡装置（非特許文献１参照）と蛍光観察装置を組み合わせた顕微鏡システムを構築した。また、このシステムを評価するために、自由に動くゾウリムシを追跡しながら体内のＣａ²⁺イオンを蛍光観察する実験を行った。その結果、追跡しながら蛍光観察を行うことに成功した。なお、本発明において、蛍光とは、被観察物自体又はその周辺、表面もしくは内部に含有された蛍光体から発生する光をいう。

上記目的を達成するため、本発明の顕微鏡装置は、被観察物を載置し、該被観察物の位置を制御するためのステージと、被観察物に光を照射する第１の光源と、被観察物に蛍光を生じさせる第２の光源と、被観察物へ上記第１及び第２の光源からの光を入射する入射光学系と、被観察物を透過した光を検出する第１検出光学系と、被観察物から生じた少なくとも１波長以上の蛍光を検出する第２検出光学系と、第２の光源からの光及び蛍光と同じ透過光の波長帯をカットする第１の光学フィルタと、透過光及び蛍光と干渉させないために第２の光源からの光の不必要な波長帯をカットする第２の光学フィルタと、第１検出光学系から入力された被観察物の画像情報により被観察物を追尾するようにステージの位置を制御すると共に、被観察物の蛍光情報の取得を制御する制御部と、を備え、制御部は、第１検出光学系から入力された被観察物の画像情報により第２の光源の点滅を制御するための第２光源制御部を備えたことを特徴とする。
上記構成において、好ましくは第２検出光学系の前に蛍光波長選択部を設ける。
ステージは、好ましくは、二次元または三次元ステージであり、前記画像情報による比例、積分、微分の何れか又はこれらの組み合わせにより制御される。
入射光学系は、好ましくは第１の光源の波長と被観察物から発生する蛍光の波長とを分離できるビームスプリッターを備えている。

本発明によれば、被観察物の透過光により被観察物の動きに応じて被観察物の位置が視野からはずれないようにステージが制御されるとともに、被観察物からの蛍光画像取得を制御することができる顕微鏡装置を提供することができる。

以下、この発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。各図において同一又は対応する部材には同一符号を用いる。
[第一実施形態]
図１は本発明の第１実施形態の顕微鏡装置１の構成を示す模式図である。
本発明の顕微鏡装置１は、被観察物２を載置し、被観察物２の位置を制御するためのステージ３と、光学系１０と、ステージの位置を制御する制御部２０と、備えている。
光学系１０は、被観察物の像や位置を検出するために被観察物に光を照射する第１の光源としての透過用光源４と、被観察物２に蛍光を生じさせるための第２の光源としての蛍光励起光源５と、上記光源からの光を被観察物２へ入射する入射光学系１５と、被観察物２を透過した光を検出する第１検出光学系１６と、被観察物２から生じた蛍光を検出する第２検出光学系１７と、を有する。

ステージ３には、被観察物２が載置され、後述する制御部２０により被観察物２の位置が制御される。このステージ３は、所謂電動ステージであり、被観察物２の載置される二次元の平面（Ｘ−Ｙ平面）、さらには、三次元で駆動制御されるＸＹＺステージであってもよい。三次元の駆動は、ロボットアーム型のマニュピレータで行ってもよい（非特許文献３参照）。ここで、Ｚ軸方向の位置制御は、対物レンズで行ってもよい（特許文献６、非特許文献２，４参照）。

入射光学系１５は、第１及び第２のビームスプリッター１８，１９と、対物レンズ６及び接眼レンズ７を含んで構成されている。図示の場合には、正立型の顕微鏡装置の一例を示している。

透過用光源４は、被観察物２を透過する波長を含む光を発するものであれば何でもよいが、透過光が蛍光励起光源５からの光や蛍光と干渉しないように、蛍光励起光源５からの光や蛍光と同じ波長帯は光学フィルタ８等でカットすることが望ましい。このような透過用光源４としては、ハロゲンランプ等の各種ランプ、発光ダイオード、各種レーザを使用することができる。

被観察物２からの蛍光を励起する蛍光励起光源５は、被観察物２又は被観察物２に含有させた蛍光体を励起できる光源であれば何でもよい。この蛍光励起光源５としては、キセノンランプ、水銀ランプ等のランプ、アルゴンレーザー等の各種レーザを励起光とすることができる。励起光を、透過光や蛍光と干渉させないためには、不必要な波長帯を光学フィルタ９等でカットすることが望ましい。蛍光励起光源５は、図示しない投光管を介して被観察物２に導入されてもよい。

上記第１及び第２のビームスプリッター１８，１９は、入射光学系１５に設けた図示しないポートに配置されてもよい。ビームスプリッター１８，１９は、透過用光源４の波長と被観察物２から発生する蛍光の波長とを分離できるダイクロイックミラーなどを使用することができる。以下の説明においては、ビームスプリッター１８，１９をダイクロイックミラーとして説明する。

第１のダイクロイックミラー１８は、短波長の光を反射し、長波長の光を透過させる作用を有しているので、蛍光励起光源５からの光は反射し、紙面下方の被観察物２へ入射する。一方、被観察物２からの透過光は、蛍光励起光源５の波長よりも長波長の光を用いることにより、第１のダイクロイックミラー１８を透過する。

第２のダイクロイックミラー１９は、第１のダイクロイックミラー１８の上方に配置されている。第１のダイクロイックミラー１８を透過した被観察物２からの透過光は、第２のダイクロイックミラー１９を透過して、透過光を検出する第１検出光学系としての透過光検知部１６に入射する。この場合、透過光が蛍光の励起光や蛍光と干渉しないように、図示しないフィルタを介して透過光検知部１６へ入射させてもよい。

第１のダイクロイックミラー１８を透過した被観察物２からの蛍光は、第２のダイクロイックミラー１９で反射されて、蛍光を検出する第２検出光学系としての蛍光検知部１７に入射する。この場合、蛍光が、蛍光の励起光や透過光と干渉しないように、図示しないフィルタを介して蛍光検知部１７へ入射させてもよい。

透過光検知部１６は、透過用光源４を通過した被観察物２の画像を取得できる検知器を備えている。この検知器には、撮像素子を用いることができ、ＣＣＤ型撮像素子やＣＭＯＳ型撮像素子を使用できる。さらに、これらの撮像素子は、Ｓ／Ｎ比（信号対雑音比）を向上させるために雑音を減らすように、例えば液体窒素やペルチェ素子を使用した冷却装置で冷却してもよい。検知器は、画像処理を行う計算機を備えていてもよい。

蛍光検知部１７は、被観察物２からの蛍光画像を取得できる検知器を備えている。この検知器は、目的に応じて銀塩カメラや撮像素子を用いることができる。また、目視観察用として接眼レンズを備えていてもよい。撮像素子には、透過光検知部１６と同様に、ＣＣＤ型撮像素子やＣＭＯＳ型撮像素子を使用できる。さらに、これらの撮像素子は、Ｓ／Ｎ比（信号対雑音比）を向上させるために雑音を減らすように、液体窒素やペルチェ素子を使用した冷却装置で冷却してもよい。

制御部２０は、透過光検知部１６からの画像情報が入力され、この画像情報の処理と画像情報の処理結果に基づいたステージ３の制御とを行う。制御部２０は、電子計算機から構成されている。このような電子計算機としては、パーソナルコンピュータ２１を用いることができる。パーソナルコンピュータ２１は、被観察物の画像などを表示するディスプレー装置２２を備えている。

上記制御部２０は、光学系１０により被観察物２の画像情報が入力され、この画像情報によりステージ３上の被観察物２を追尾するように制御される。被観察物２の追尾には、例えば以下のような手法を用いることができる。

先ず、被観察物２の画像を取得し、次に、画像情報から画像特徴量を抽出する。画像特徴量は、画像情報の二値化によって観察対象の存在する領域を抽出し、このとき、直前に観察対象が存在していた領域の近傍でのみ抽出を行うセルフウィンドウ法を用いることで、障害物に惑わされることなく観察対象のみを抽出することができる（非特許文献１参照）。

具体的には、画像特徴量として、上記の二値データから０，１，２次モーメントを計算する。この画像特徴量を、制御部２０のパーソナルコンピュータ２１で読み出し、被観察物２の重心と方向を求める。

次に、被観察物２の重心が視野中心に移動するように、ステージ３のモーター回転角の目標値を定め、このモーターをフィードバック制御する。例えば、ステージ３にはＸＹＺステージを使用することができる。このフィードバック制御には、比例、積分、微分の何れか、またはこれらの組み合わせによる制御手法を用いることができる。

画像特徴量は、上記セルフウィンドウ法以外を用いてもよく、例えば、被観察物２の回折像から抽出してもよい（非特許文献２参照）。

上記の被観察物２の軌跡を再構成、つまり、再現するためには、上記のＸＹＺステージ３の変位情報をパーソナルコンピュータ２１に記録しておく。これにより被観察物２の軌跡を得ることができる。さらに、画像特徴量は、被観察物２の回折像から抽出してもよい（非特許文献２参照）。

透過光を使用するのは追跡対象となる被観察物の２の全体像を高輝度で安定して写すためである。透過光以外には落斜照明を用いることもできる。

顕微鏡装置１によれば、従来、蛍光観察前に観察者が手動で行っていた被観察物２を顕微鏡装置１の視野中心に入れる作業を自動化することができる。このため観察者の負担を軽減することができる。

制御部２０は、さらに、蛍光観察の制御や蛍光画像の記録を行うことができる。図１に示すように、制御部２０はさらに、蛍光励起光源を制御するための第２光源制御部としての蛍光励起光源制御部２３を備えて構成されてもよい。蛍光励起光源制御部２３は、被観察物２の透過光による画像データに基づいて、蛍光励起光源５における点滅の制御、点灯時間の制御やその光強度を制御する機能を有している。また、蛍光励起光源５からの波長及び強度を選択して照射する機能を備えていてもよい。

蛍光画像の記録や画像処理を行なうために、蛍光検知部１７からの検知出力が制御部２０に入力される。

制御部２０によれば、蛍光と比べて光量が大きく、かつ、より高速に記録される透過光画像から得られる位置情報などの被観察物２からの情報と連動して、蛍光励起光源５の照射開始時刻の制御が可能になる。より具体的には、被観察物２が顕微鏡装置１の視野に入った時刻直後から蛍光励起光源５を照射することができる。

蛍光励起光源５による蛍光励起光は、細胞に有害な波長帯を含んでいる場合が多い。また、蛍光励起光を照射するにしたがい蛍光色素は退色する。このため、被観察物２が顕微鏡装置１の視野に入る時刻以前に蛍光励起光を照射しても、その後の解析には有効利用されない。

顕微鏡装置１においては、被観察物２が顕微鏡装置１の視野に入ると同時に蛍光励起光源５の蛍光励起光を照射することができるので、被観察物２の細胞などに含有されている蛍光色素への励起光露光時間を減らし、細胞への侵襲と蛍光色素への退色とを軽減できるという利点が生じる。

また、顕微鏡装置１によれば、励起光の種類や強度の制御が可能になる。つまり、複数の蛍光色素に対して、観測時間の自動割り振りなどが可能になる。一般に、細胞は、その運動状態や外部からの刺激により、活性化または不活性化する細胞内のイオンや分子が異なることが知られている。このため、透過光画像から得られる被観察物２の運動情報や、細胞形状、刺激の種類や強度等と連動させて、被観察物２へ励起する蛍光励起光源５の波長や強度の選択制御が可能となる。これにより、透過光画像から得られる被観察物２の情報に連動させて、被観察物２からの蛍光情報を効率よく取得することができる。

さらに、顕微鏡装置１によれば、透過光画像から得られる被観察物２の情報は、被観察物２からの蛍光に比較して光量が多く、かつ、高速に記録されている。したがって、蛍光と同時に取得した透過光画像を、蛍光画像の解析処理に用いることで解析結果の時空間精度が向上する。

顕微鏡装置１では、透過光画像から得られる位置などの細胞情報と連動させて、蛍光検知部１７の蛍光画像を記録することができる。つまり、蛍光が照射されている時間だけ蛍光画像を記録すればよい。したがって、被観察物２が顕微鏡装置１の視野に入っていない時間の蛍光画像記録が不要となる。このため、蛍光画像記録のための演算時間や記憶装置の容量を減らすことができ、パーソナルコンピュータ２２を有効利用することができる。無駄な蛍光画像記録をする必要がなくなるので、蛍光画像の解析時間も大幅に短縮することができる。

また顕微鏡装置１によれば、ステージ３に載置された被観察物２からの画像情報が透過光検知部１６で検知され、この透過光による画像信号の処理と画像信号の処理結果に基づいてステージ３が駆動される。ステージ３が被観察物の追跡を行うことで、被観察物２は常に顕微鏡装置１の視野に納めることができる。このステージのフィードバック制御は、画像情報による比例、積分、微分の何れか、またはこれらの組み合わせにより制御することができる。透過光は強度が強いために、細胞位置制御用の画像を得るための露光時間を少なくでき、細胞位置制御にかかる時間を短くできる。つまり、位置制御する細胞などの被観察物の最大速度を速くすることができる。さらに、本発明の顕微鏡装置１によれば、被観察物２からの蛍光も同時に観察することができ、上記透過光の画像情報と連動させて蛍光の観察を行うことができる。

さらに、顕微鏡装置１によれば、被観察物の観察ができると共に、蛍光記録ができる。このため、被観察物２となる細胞の内部のイオンや分子に関する情報を取得することができる。

[第二実施形態]
図２は本発明の第２実施形態の顕微鏡装置３０の構成を示す模式図である。
図２に示すように、本発明の顕微鏡装置３０が顕微鏡装置１と異なるのは、蛍光を検出する第２検出光学系１７の前に蛍光波長選択部２５を設けた点にある。蛍光波長選択部２５は、少なくとも２つ以上の蛍光波長を分離して検出できる構成を有している。蛍光波長選択部２５は、第３のダイクロイックミラー２６とミラー２７とプリズム２８とから構成されている。さらに、レンズ２９を設けてもよい。この構成によれば、２波長の蛍光を分離して検知することができる。他の構成は顕微鏡装置１と同じであるので、説明は省略する。

蛍光波長選択部２５は、２波長の分離を行う態様を示しているが、分光器を用いることで多波長の蛍光を検知してもよい。

[第三実施形態]
図３は本発明の第３実施形態の顕微鏡装置４０の構成を示す模式図である。
第３実施形態の顕微鏡装置４０が顕微鏡装置１と異なるのは、被観察物２の上方から透過光が照射される、所謂倒立型の光学系１０Ａを有している点である。他の構成は顕微鏡装置１と同じであるので、説明は省略する。

[蛍光観察方法]
次に、本発明の顕微鏡装置１，３０，４０を用いた蛍光観察方法について説明する。
被観察物２には、蛍光試薬を担持または注入する。微生物の場合には、Ｉｎｄｏ−１（ＡＭ体、同仁化学研究所）のような蛍光試薬を使用し、適度な濃度で所定時間負荷すればよい。Ｉｎｄｏ−１（ＡＭ体）は蛍光を発しないが、微生物の細胞膜を通過する。

細胞膜を通過したＩｎｄｏ−１（ＡＭ体）は、体内の酵素エステラーゼによって脱ＡＭ体になる。つまり、蛍光を発するが細胞膜を通過できないＩｎｄｏ−１に変化する。Ｉｎｄｏ−１はＣａ²⁺イオンと結合した場合と解離した場合で異なる波長の蛍光を発する。

結合と解離のそれぞれの状態にあるＩｎｄｏ−１は、Ｃａ²⁺濃度によって変化する。つまり、Ｃａ²⁺濃度の上昇に伴い、解離状態のＩｎｄｏ−１による蛍光は減少し、逆に、結合状態のＩｎｄｏ−１による蛍光は増える。この特性により、それぞれの波長の蛍光強度を比較することで、Ｃａ²⁺濃度を求めることができる。具体的には、図２に示した顕微鏡装置３０を用いた場合には、２波長蛍光観察像を波長ごとに分割し、各画素ごとに計算した蛍光強度比を、予め作成しておいた検量線に代入することで、Ｃａ²⁺濃度を求めることができる。

Ｃａ²⁺イオンのみならず、顕微鏡装置１，３０，４０の蛍光フィルタ９及びダイクロイックミラー１８，１９，２６を交換することで、他のイオンや分子を対象とした蛍光色素を利用することも可能である。

以下、本発明の実施例をより詳細に説明する。
図２に示す顕微鏡装置３０を製作した。光学系１０としては、正立顕微鏡（オリンパス株式会社製、ＢＸ５１）を使用し、透過用光源となる透過用光源４及び蛍光を励起する蛍光励起光源５は、それぞれ、ハロゲンランプとキセノンランプを使用した。対物レンズ６は２０倍のものを用いた。透過光検知部１６には、並列演算用回路が内蔵されたカメラシステム（浜松ホトニクス製、Ｉ−ＣＰＶ３、１２８×１２８画素）を用いた。Ｉ−ＣＰＶ３カメラ部での露光時間、つまり、サンプリング周期は１ｍｓとした。

被観察物２を載置する電動ステージ３は、ＸＹＺステージ（ヒーハイスト精工特注品、移動範囲２５ｍｍ、繰り返し位置精度±１μｍ、最大速度３０ｍｍ／ｓ）を用いた。制御部２０は、リアルタイム基本ソフトウェア（以下、適宜にリアルタイムＯＳと呼ぶ）として、ＲＴ−Ｌｉｎｕｘを搭載したパーソナルコンピュータ２１を用いた。

蛍光検知部１７の検知器は、冷却ＣＣＤカメラ（Ｑ−Ｉｍａｇｉｎｇ社製、Ｒｅｔｉｇａ２０００Ｒ、１６００×１２００画素）を用いた。蛍光は、光学系１０のデュアルポート内のダイクロイックミラー１９によって透過光と分離した。蛍光は、さらに、蛍光波長選択部２５（ジーオングストローム社製、ジーオングベース）内のダイクロイックミラー２６によって分離し、上記冷却ＣＣＤカメラ受光部の半面ずつで受光した。蛍光の励起光、蛍光および追跡用の透過光が干渉しないように、それぞれの波長帯が異なるようにフィルタを選んだ。冷却ＣＣＤカメラは、４×４画素を一まとめにするビニング処理を行い、解像度を４００×３００画素とした。露光時間は３３ｍｓとした。

図４は、実施例で用いた波長及びフィルタを示す図である。図４から明らかなように、透過光、励起光及び後述するＣａ²⁺イオンからの２波長の蛍光がそれぞれ分離される。

画像特徴量は以下のようにして取得した。Ｉ−ＣＰＶ３により細胞（微生物）の画像を取得した。次に、二値化によって被観察物２の存在する領域を抽出した。このとき、直前に被観察物２が存在していた領域の近傍でのみ抽出を行うセルフウィンドウ法を用いることで、障害物に惑わされることなく被観察物２だけを抽出できた。そして、０，１，２次モーメントからなる画像特徴量を計算した。

画像特徴量を、リアルタイムＯＳを搭載したパーソナルコンピュータ２２で読み出し、被観察物２の重心と方向を求めた。そして重心が視野中心に移動するようにＸＹＺステージ３のモーター回転角の目標値を定め、ＸＹＺステージ３をフィードバック制御した（図５参照）。また、被観察物２の軌跡を再構成するためにＸＹＺステージ３の変位情報をパーソナルコンピュータ２２に記録した。

被観察物２は、ゾウリムシ（P. multimicronucleotum）体内のＣａ²⁺イオンとした。ゾウリムシは黄な粉を溶かしたミネラルウォーターを用い、２３℃で３日間培養したものを使用した。

蛍光試薬はＩｎｄｏ−１（ＡＭ体、同仁化学研究所）を使用し、濃度１０μＭで１時間負荷した。

ゾウリムシ２が泳ぐプールは、スライドガラスの上に厚さ０．１ｍｍのシリコンゴムシートで１５ｍｍ四方の枠を作り、カバーガラスを被せてＸＹＺステージ３に固定した。プールに入れる測定液の組成は、ＣａＣｌ₂を１ｍＭ、ＫＣｌを２ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．２）を２ｍＭとした。プール作成に用いたシリコンゴムシートの厚さ０．１ｍｍは、ゾウリムシ２の厚さ０．０５ｍｍよりも厚いので、プールの深さは十分であり、ゾウリムシ２は自由に泳ぐことができていた。

また、同時に記録していたＸＹＺステージ３からの変位情報を元に再構成したゾウリムシ２のＸ座標及びＹ座標の時間変化を図６及び７に、軌跡を図８に示す。図６及び図７から明らかなように、ゾウリムシ２の移動速度を求めると、約０．７ｍｍ／ｓであることが分かる。また、図８から明らかなように、ゾウリムシ２は実験中に４ｍｍ×６ｍｍの範囲で動いたことが分かる。

図９は、実施例のサンプリング周期の分布を示す図である。図９から明らかなように、サンプリング周期を１±０．０５ｍｓの範囲に収めることができたことが分かる。

実施例では、ゾウリムシ２の追跡制御を行いながら蛍光観察したが、仮に追跡制御を行わなかった場合、どの程度の時間でゾウリムシ２が視野内から外れたかを見積もる。冷却ＣＣＤカメラの視野範囲は０．２ｍｍ×０．３ｍｍ、ゾウリムシ２の移動速度は０．７ｍｍ／ｓであることを考えると、細胞追跡制御を行わない場合は約０．５秒で視野内から外れていたと推測される。

自由に動くゾウリムシ２を追跡しながら、体内のＣａ²⁺イオンを蛍光観察した。図１０は、実施例のゾウリムシ２の蛍光測定結果を示す図である。これは３３ｍｓ毎に撮影した画像を、９枚おきに抜き出したものである。
図１０から明らかなように、回転しながら移動するゾウリムシ２を、視野内から外れることなく持続的に蛍光観察できたことが分かる。このとき、冷却ＣＣＤカメラの視野範囲は０．２ｍｍ×０．３ｍｍであった。

また、自由に動く被観察物２を観察する場合、蛍光画像では像のブレが問題となる。この問題は、露光時間の短縮により軽減することができる。このために、冷却ＣＣＤカメラの、４×４画素を一まとめにするビニング処理を行うことで、露光時間を３３ｍｓに短縮することができた。図１１は、実施例のゾウリムシ体内のＣａ²⁺イオンから解離しているＩｎｄｏ−１とＣａ²⁺イオンと結合しているＩｎｄｏ−１とが発する蛍光強度を示す図であり、蛍光を十分な輝度で観察できることが分かった。

図１２は実施例のゾウリムシ体内のＩｎｄｏ−１が発する２種類の蛍光強度比を示す図であり、図１３は実施例のゾウリムシ体内のＣａ²⁺イオン濃度を求めるための検量線を示す図である。
図２に示した顕微鏡装置３０を用いた場合には、２波長蛍光観察像を波長ごとに分割し（図１１参照）、各画素ごとに計算した蛍光強度比（図１２参照）を、あらかじめ作成しておいた検量線（図１３参照）に代入することで、Ｃａ²⁺濃度を求めることができる。

上記実施例によれば、透過用光源４の光量を増やすことで、透過光制御部で用いる追跡制御用カメラの露光時間を１ｍｓに抑えることができ、さらに、画像処理に適した並列演算回路を備えるＩ−ＣＰＶ３を用いたことで、画像の特徴量計算を高速化することができた。さらに、ＸＹＺステージ３を制御するパーソナルコンピュータ２２にリアルタイムＯＳを用いたことで、制御周期の分散を減らした。これは非リアルタイムＯＳでは回避できない不規則なバックグラウンドプロセスの影響を取り除けたことによる。これらの工夫により１ｍｓ周期の追跡制御を可能とした（図９参照）。

さらに、ゾウリムシ２は測定液からＣａ²⁺イオンを取り込むので、測定液のＣａ²⁺濃度を高めることで、体内のＣａ²⁺濃度の変化を容易に判別することができた。

本発明は、上記実施の形態に限定されることなく、特許請求の範囲に記載した発明の範囲内で種々の変形が可能であり、それらも本発明の範囲内に含まれることはいうまでもない。上述した実施形態においては、第１及び第２の検出光学系１６，１７に撮像素子を用いたが、撮像素子位置で目視の観察や写真撮影なども行うことができるように、検出光学系は必要に応じて複数の検出光学系とすることも可能である。また、蛍光を検知する検出光学系１７の構成などは、被観察物２に応じて最適な設計や使用部品を選定できることは勿論である。

第１実施形態の顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 第２実施形態の顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 第３実施形態の顕微鏡装置の構成を示す模式図である。 実施例で用いた波長及びフィルタを示す図である。 実施例で用いた追跡アルゴリズムを示すブロック図である。 実施例のゾウリムシによるＸ座標の時間変化を示す図である。 実施例のゾウリムシによるＹ座標の時間変化を示す図である。 実施例のゾウリムシによるＸＹ座標の軌跡を示す図である。 実施例のサンプリング周期の分布を示す図である。 実施例のゾウリムシの蛍光測定結果を示す図である。 実施例のゾウリムシ体内のＣａ²⁺イオンから解離しているＩｎｄｏ−１とＣａ²⁺イオンと結合しているＩｎｄｏ−１とが発する蛍光強度を示す図である。 実施例のゾウリムシ体内のＩｎｄｏ−１が発する２種類の蛍光強度比を示す図である。 実施例のゾウリムシ体内のＣａ²⁺イオン濃度を求めるための検量線を示す図である。

符号の説明

１，３０，４０：顕微鏡装置
２：被観察物（ゾウリムシ）
３：ステージ（ＸＹまたはＸＹＺステージ）
４：透過用光源（第１の光源）
５：蛍光励起光源（第２の光源）
６：対物レンズ
７：接眼レンズ
８，９：フィルタ
１０，１０Ａ：光学系
１５：入射光学系
１６：透過光検知部（透過光を検出する第１検出光学系）
１７：蛍光検知部（蛍光を検出する第２検出光学系）
１８，１９：第１及び第２のビームスプリッター（ダイクロイックミラー）
２０：制御部
２１：パーソナルコンピュータ
２２：ディスプレー装置
２３：蛍光励起光源制御部
２５：蛍光波長選択部
２６：第３のダイクロイックミラー
２７：ミラー
２８：プリズム
２９：レンズ

Claims (5)

1. 被観察物を載置し、該被観察物の位置を制御するためのステージと、
   上記被観察物に光を照射する第１の光源と、
   該被観察物に蛍光を生じさせる第２の光源と、
   上記被観察物へ上記第１及び第２の光源からの光を入射する入射光学系と、
   上記被観察物を透過した光を検出する第１検出光学系と、
   上記被観察物から生じた少なくとも１波長以上の蛍光を検出する第２検出光学系と、
   上記第２の光源からの光及び蛍光と同じ透過光の波長帯をカットする第１の光学フィルタと、
   前記透過光及び蛍光と干渉させないために上記第２の光源からの光の不必要な波長帯をカットする第２の光学フィルタと、
   上記第１検出光学系から入力された上記被観察物の画像情報により上記被観察物を追尾するように上記ステージの位置を制御すると共に、上記被観察物の蛍光情報の取得を制御する制御部と、を備え、
   上記制御部は、上記第１検出光学系から入力された上記被観察物の画像情報により上記第２の光源の点滅を制御するための第２光源制御部を備えたことを特徴とする、顕微鏡装置。
2. 前記第２検出光学系の前に蛍光波長選択部を設けたことを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記ステージは二次元または三次元ステージであることを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
4. 前記制御部は、前記画像情報による比例、積分、微分の何れか又はこれらの組み合わせにより前記ステージを制御することを特徴とする、請求項１に記載の顕微鏡装置。
5. 前記入射光学系は、前記第１の光源の波長と前記被観察物から発生する蛍光の波長とを分離できるビームスプリッターを備えていることを特徴とする、請求項１〜４の何れかに記載の顕微鏡装置。