JP4441113B2 - ママスタチンのヌクレオチドおよびタンパク質配列およびその使用法 - Google Patents
ママスタチンのヌクレオチドおよびタンパク質配列およびその使用法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4441113B2 JP4441113B2 JP2000525544A JP2000525544A JP4441113B2 JP 4441113 B2 JP4441113 B2 JP 4441113B2 JP 2000525544 A JP2000525544 A JP 2000525544A JP 2000525544 A JP2000525544 A JP 2000525544A JP 4441113 B2 JP4441113 B2 JP 4441113B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mamastatin
- cells
- protein
- breast
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/74—Inducing cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
(技術分野)
本発明は、乳癌の診断および治療用組成物および方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、乳癌の診断および治療に有用なタンパク質であるママスタチン(Mammastatin)をコードする核酸配列に関する。
【0002】
(背景技術)
乳癌は米国単独で毎年45,000人の女性を死亡させる疾患である。年間180,000件を超える乳癌の新症例が診断され、8人に1人の女性が乳癌になると推定されている。これらの数値は、乳癌が今日の女性が直面する最も危険な疾患のうちの1つであることを示している。癌の研究では、乳癌の原因を決定することができず、適当な癌療法または妨害法を見出さなかった。
【0003】
乳癌と診断された女性は、外科的療法、ホルモン療法、化学療法および放射線療法により治療されるであろう。患者が転移性乳癌を患っているならば、脳、骨および肝臓などの離れた領域における癌を除去するために、放射線および多用量の化学療法が必要でなる。
【0004】
乳癌の治療に利用可能な現在の療法は、有毒、危険、高価であり、その多くは特に、転移性乳癌の治療に無効である。下記の表はチャーチル・リビングストン(Churchill Livingston)、Clinical Oncology, 1995から抜粋したものであり、現在の治療方法および予期される生存率に関して利用可能であるデータをまとめている。
【0005】
【表1】
【0006】
現在、リンパ節または遠位部位に転移した乳癌の長期治療に有効である療法は全くない。局所疾患は、癌全部を除去することができるなら、外科的手術によって有効に治療され得る。乳癌および転移性癌に由来する細胞の増殖を停止できる乳癌の有効な新規の治療法が即急に必要である。そのような療法は局所の乳癌の治療、転移性疾患の長期にわたる治療に有用であり、および腫瘍の外科的切除の後の追跡治療として有用である。他の応用には、初期治療としておよび防御的使用としての増殖インヒビターを含む。
【0007】
***X線写真、身体検査、CAT−スキャン、および超音波などの乳癌の検出方法は、乳癌の初期検出を有意に改善した。しかしながら、これらの方法を用いて、疑わしい腫瘍はさらに、該腫瘍が良性または悪性であるかを決定するための、および組織型および悪性の程度の決定を試みるための病理学的検査ために、外科的切除をしなければならない。この病理学的診断は、以後の治療プロトコールに何を使用するかを決定するために役立つ。
【0008】
乳癌に関して、適当な乳癌腫瘍マーカーが利用できないので、これらの方法は一般的に決定的ではない。CA 15−3およびCA 27−29などの利用可能なマーカーは転移の指標として使用されるが、しかしながらそれらは特異的ではない。例えば、新規のかつ特異的な乳癌マーカーを使用して、乳癌の有効かつ信頼できる診断が可能である診断手段および方法の必要性が多大である。さらに、乳癌の早期発見および早期診断用の信頼でき、かつ簡単な方法が顕著に必要とされている。好ましくは、そのような早期発見方法は、乳癌の初期段階で乳癌を同定し、進行した転移疾患による乳癌の進行を追跡し、ついで乳癌または進行した疾患の罹患傾向を診断するであろう。より好ましくは、該診断方法は、例えば血液などの体液などの分析によって組織生検なしに使用することができる。
【0009】
ヒト***組織は月経の開始および各月経周期の間で、増殖活動の突発を被る。***組織および腫瘍へのエストロゲンの効果に関する研究は、エストロゲンが***組織の第1次増殖開始因子であることを示唆している。エストラジオール感受性増殖因子が特徴付けられた。さらに、本来ホルモンの影響を受けない***細胞増殖因子もまた記載される。
【0010】
***組織増殖に刺激的影響を及ぼすことが示されている特異的な増殖因子は、血小板由来増殖因子(PDGF)、インスリン様増殖因子(IGF−1)およびトランスフォーミング増殖因子(TGF)αが挙げられる。他方、TGF‐βは***組織の増殖を抑圧することを示している。
【0011】
***細胞増殖の調節は乳癌の診断および治療に非常に重要である。***組織の新生物的増殖は、調べなければ、年間何千人もの女性の死因である調節不可能に増殖する悪性腫瘍に進行する。***細胞増殖を特異的に抑圧することができる増殖阻害因子は、乳癌の診断および治療において使用するため、機能的手段を提供する。
【0012】
従って、特異的な***細胞増殖インヒビターを単離し、特徴付け、その核酸配列およびアミノ酸配列を同定し、ついで精製したタンパク質としてインヒビターを組換え的に発現させることは非常に有効である。該核酸配列および/または組換え的に製造したインヒビターを使用した診断および治療方法は乳癌の診断および治療において非常に利用性が高い。
【0013】
(発明の要約)
特異的な***細胞増殖インヒビターであるママスタチンを正常ヒト***細胞から単離し、ついで特徴付けた。現在ママスタチンは正常***細胞により製造されるが乳癌細胞では製造されないことがわかっている。さらに、現在、血液中のママスタチンの減少または不在が乳癌の存在と相関することもわかっている。活性化ママスタチンの投与により乳癌細胞の増殖が妨害される。
【0014】
ママスタチンをコードする核酸配列は、現在のところクローニングされ、シークエンシングされ、ついで宿主細胞中で組換え的に***細胞の増殖の活性インヒビターとして発現されている。単離し特徴付けられた核酸配列(配列番号:1)およびその推定アミノ酸配列(配列番号:2)は乳癌の診断および治療において使用するための独特かつ特異的な手段を提供する。
【0015】
本発明は***細胞増殖、特に乳癌細胞増殖の特異的なタンパク質インヒビターであるママスタチンをコードする単離し、精製した核酸配列を提供する。本発明はまた、ママスタチンの核酸配列、ママスタチンのアミノ酸配列および精製した***細胞増殖インヒビターを製造し、乳癌を診断および治療するためのママスタチン核酸またはアミノ酸配列を利用する方法、キットおよび組成物を含むプラスミドおよびベクターを含む。本発明組成物には、ママスタチン核酸配列およびそのRNA産物に特異的にハイブリダイズするプローブおよびプライマーを含む。
本発明はママスタチンを投与することによって乳癌を治療する方法をさらに含む。
【0016】
(好ましい態様の詳細な記載)
ママスタチン
ママスタチンは正常ヒト***上皮細胞によって製造され分泌されるタンパク質増殖インヒビターである。***細胞増殖インヒビターは正常ヒト***細胞の増殖によってならし培地中に存在する阻害性タンパク質活性として最初は記載された。阻害活性は正常ヒト***細胞からのならし培地中で同定されたが、ヒト乳癌細胞の増殖によってならし培地中では同定されなかった。阻害活性はバイオアッセイと約53、49および44kDa(アービン(Ervin, Paul R.)、ミシガン大学博士論文、1995)の分子量を有する3つのタンパク質に存在する抗体の作成によって決定した。
【0017】
現在、特異的な***細胞増殖インヒビターであるママスタチンが、49kDa〜53kDaへ分子量をリン酸化により増加させる44kDaのタンパク質として発現することが決定された。リン酸化されていない44kDaの形態(non-ph 44 kD form)は活性インヒビターではないが、リン酸化した49kDaおよび53kDaの形態は乳癌細胞の増殖を阻害する。活性53および/または49kDaリンタンパク質は正常ヒト***細胞によって発現されるが、一般的に乳癌細胞では製造されない。癌細胞の中にはリン酸化を欠如しており、不活性な44kDaタンパク質を製造するものもある。
【0018】
以下の表は正常なおよび癌性の細胞および組織中のママスタチンの発現および活性を示すデータをまとめたものである。
【表2】
【0019】
ヒト乳癌細胞での用量応答実験は、癌細胞増殖は10ng/mlのママスタチンで50〜70%阻害され、25〜50ng/mlで完全に停止されることを示している。MDA-MB-435およびMDA-MB-231などの高度に転移性の細胞は増殖を停止させるために50ng/mlを必要とする。イン・ビトロおよびイン・ビボ臨床データ実験は、該効果は可逆的であり、低濃度で癌細胞増殖を停止させるためには、インヒビターの反復投与が必要であることを示唆している。しかしながら、50ng/mlを超えた用量で、ママスタチンは細胞壊死などのような組織学によって示されるように、アポトーシスを誘発するようである。
【0020】
ママスタチンは乳癌細胞増殖を阻害する天然に存在する増殖インヒビターであり、活性化ママスタチンを製造する腫瘍は全くないので、ママスタチン置換療法は乳癌治療のための治療法として理想的である。以下の例で提供された臨床データはママスタチン置換療法の有効性を証明する。
【0021】
ママスタチンタンパク質をコードする核酸配列は、現在単離され、特徴付けられ、シークエンシングされ(配列番号:1)、全部で3つの(53、49、および44kDa)分子量のタンパク質をコードすると決定されており、「ママスタチン(Mammastatin)」と名づけられた。3形態の分子量における差異はタンパク質のリン酸化の範囲が原因であると決定された。培養中のヒト正常***細胞(NHMC)によって製造されたママスタチンおよび組換え的に発現されたママスタチンはヒト乳癌細胞の増殖を阻害し、乳癌の治療における治療剤として有用である。
【0022】
正常女性からのヒト血清および乳癌患者からのヒト血清の分析は、ママスタチンの減少した血液レベルは乳癌の進行と相関があることを示している。以下の実施例中に記載したようにこの活性インヒビターの存在のための血液血清のスクリーニングおよびモニタリングは特異的かつ有効な診断手段を提供する。
【0023】
核酸配列
ママスタチンDNAをコードする核酸(配列番号:1)およびそれから導かれるアミノ酸配列(配列番号:2)を表1に示す。この配列は、以下の実施例でさらに詳しく記載するように、ヒト正常***細胞cDNAライブラリーからのママスタチンcDNAのクローニングおよびシークエンシングによって同定した。クロマトグラフィーによって精製されたインヒビターは、以前にはアミノ酸分析を可能にするほど十分に単離されず、標準的技術によってタンパク質インヒビターをシークエンシングする初期の試みは失敗した。クロマトグラフィーによって精製されたインヒビタータンパク質に対して作成された抗体を使用するcDNAライブラリーのスクリーニングの試みにより、活性のあるクローンを製造できなかった。これらの問題を克服するために、ママスタチンをコードする遺伝子を、ペプチドシークエンシングおよびヒト正常***細胞cDNAライブラリーの縮重オリゴヌクレオチドスクリーニングにより同定した。
【0024】
ヒト正常***細胞によって製造された濃縮タンパク質は、クロマトグラフィーによって精製したインヒビターに対して作成された抗−ママスタチン抗体を用いてアフィニティー精製された。精製したタンパク質画分を、トレーサーとして少量(105cpm)の32P標識で補った。標識したトレーサータンパク質は、以下の実施例により詳しく記載するように32Pの存在下で増殖した細胞のならし培地から精製した。該タンパク質は臭化シアンで開裂し、ついで開裂した断片を32P標識したタンパク質のオートラジオグラフィー分析によってママスタチンとして同定した。開裂により製造された最も豊富な標識されたペプチドがシークエンシングされた。
【0025】
独特のアミノ酸配列(配列番号:3および4)を有する選択された2つのタンパク質は、縮重オリゴヌクレオチドを製造するために使用される。ついで、縮重オリゴヌクレオチドを、ヒト正常***細胞cDNAライブラリーをスクリーニングするのに使用した。
【0026】
標識されたpMammAである1つのクローンは、両方の選択されたペプチドからオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。このクローンは、さらに特徴付けられ、抗−ママスタチン抗体によって認識された発現のタンパク質を発現することが示された。該クローンは、ノーザンブロット分析、イン・ビトロ転写および翻訳アッセイおよび増殖阻害アッセイによってママスタチンをコードすると査定された。ママスタチンcDNAインサート(pMammB)を含むpcDNA3クローンをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection) に寄託し、受託番号第97541号を付与された。pMammB(配列番号:2)から発現した組換えタンパク質は、トランスフェクションした哺乳類細胞株のイムノブロットによって検出され、ついで乳癌細胞に対する増殖阻害活性を保有することを示した。cDNAクローンを完全にシークエンシングし(実施例3参照)、BLAST DNAデータベースに対して唯一のものであるとわかった。
【0027】
本発明の核酸配列(配列番号:1)はヒトママスタチンをコードし、それはヒト正常および癌性の***細胞の増殖を阻害する機能を果たす。「ヒト」なる語は、タンパク質の源を制限することを意図しているわけでなく、またヒト細胞および組織にのみ与える阻害効果を制限することを意図しているわけではない。個体のママスタチンの核酸配列およびアミノ酸配列は幾分、タンパク質の構造または機能を変えずに変化するかもしれない。さらに、生化学の分野の当業者であれば、核酸配列またはアミノ酸配列の修飾が分子の構造および/または機能を変更せずに起こるかもしれないことを認識するであろう。例えば,該核酸配列は修飾され、ある特定の細胞宿主の最適な既知のコドンを用いて所望のアミノ酸配列の最適発現を可能にする。
本発明の核酸配列は乳癌の治療における治療法および診断方法において使用するため、高度に精製されたママスタチンの大容量を製造するのに有用である。
【0028】
抗ママスタチン抗体:
いくつかの抗−ママスタチン抗体が製造され、特徴付けれられた。例えば、1989年11月30日に公開されたPCT出願公開公報WO89/11491号参照。これらの抗体は、クロマトグラフィーによって精製されたインヒビタータンパク質に対して作成され、***細胞増殖にママスタチンタンパク質の阻害効果を与えるのを妨げることが示されている。
【0029】
利用可能な抗−ママスタチン抗体は、ネオマーカーズ(Neomarkers)(フリーモント(Freemont)、カリフォルニア)より市販されて利用できる7G6および3C6および6B8を含む。6B8抗体を作成するハイブリドーマ細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC受託番号第HB10152号)から入手可能である。これらの各抗体はママスタチンの全部で3つの分子量形態のものに結合し、ドットブロットおよびウエスタンブロットを含む免疫学的アッセイにおいて有用である。該7G6抗体は縮重したタンパク質サンプルのウエスタンブロット分析またはELISA分析に好ましい。該抗体3G6および6B8はELISAアッセイ、例えば実施例に具体的に記載した条件下でのアッセイにおいて使用されるであろう。
【0030】
さらなる抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に関して知られる標準的方法を用いて製造され得る。抗体製造のために使用した抗原はNHMCの培養または組換え的に発現されたママスタチンから得られるかもしれない。
【0031】
診断方法
本発明はさらに、組織、細胞および液体を含む患者のサンプル中の活性ある阻害性ママスタチンを検出するためのイン・ビトロアッセイを提供する。乳癌および進行性転移性疾患は、患者のサンプル中のママスタチンタンパク質の存在および型とヒト正常***細胞または癌性***細胞のママスタチンタンパク質の存在および型との相関によって診断される。患者の血液または組織サンプルは、ママスタチンタンパク質、例えば豊富なママスタチンタンパク質および/またはママスタチンの分子量形態などに関して分析される。以下で議論するように、特に高分子量のママスタチンのリン酸化された形態であるママスタチンの存在または喪失は乳癌と相関があり、かつ進行した転移性の疾患の指標である。
【0032】
ママスタチンの分析は、好ましくは、抗−ママスタチン抗体を用い、患者の血液サンプルのELISAまたはウエスタンブロット分析を含むイムノアッセイにより行う。好ましくは、組換えママスタチンの標準は、信頼可能なインヒビターレベルの量に関する標準曲線を提供するように使用される。そのようなイムノアッセイは以下の実施例に示すドットブロットアッセイおよびウエスタンブロットアッセイによって例示される。本発明の別の好ましい態様において、腫瘍生検のような組織サンプルは免疫組織化学または患者の腫瘍細胞を培養することおよびママスタチンの発現のための培養物を試験することによって分析される。
【0033】
特に好ましい態様において、乳癌の診断用アッセイには少なくとも2つの特異的な抗体を含む:抗−サイトケラチン抗体などの上皮組織のサンプルとして採取された***組織を同定するための抗体および抗−ママスタチン抗体である。例えば、イムノブロット形式を用いて,乳癌細胞を含むと疑われる組織をホモジナイズし、SDS/PAGEゲルで分離し、膜にトランスファーし、抗−ケラチンおよび抗−ママスタチン抗体の両方で調べる。ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの適当なマーカーシステムにコンジュゲートさせたアイソタイプ特異的第2抗体を使用して、結合した抗体を検出する。ついで、結合した第1および第2抗体を含む膜を公知の比色または蛍光光度法技術を用いて発色させ、公知の方法によって定量する。
【0034】
最も好ましい態様において、抗−ママスタチン抗体を用いて該サンプルをウエスタンブロットなどによりママスタチンのリン酸化に関して分析する。高分子量(53/49kDa)ママスタチンの減少または不在が乳癌の進行と相関がある。
【0035】
組換え発現ベクターおよび形質転換した細胞
本発明の組換え発現ベクターは、精製ママスタチンタンパク質およびその部分の製造および増幅に、および診断法および治療法において使用されるママスタチンタンパク質およびその部分の簡易単離に有用である。
【0036】
2.434kbママスタチンcDNA(配列番号:1)の全部またはその一部などの標的配列は、COS細胞およびCHO細胞に関してはpUC18、pKC330、pBR322、pKK177−3、pET−3、pcDNA3(イン・ビトロゲン(In Vitrogen))などの適当な核酸配列発現ベクターにクローニングされ、および昆虫細胞における発現にはpAcD3Xバキュロウイルス発現ベクター(ファーミンギン(PharMingin)、サン・ディエゴ、カリフォルニア)にクローニングされ、標準的な方法によって公知のシステムにクローニングされる。市販されており利用可能な発現ベクターは、標的配列が転写および翻訳調節領域へ作動可能に結合するようなベクターの部位へのクローニングのため提供する。
【0037】
ついで、リン酸カルシウム法、リポソーム媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーションなどの公知の方法を用いて適当な宿主細胞に発現ベクターが導入される。適当な宿主細胞には、COS細胞およびCHO細胞、High 5およびSF9昆虫細胞、バキュロウイルスおよび酵母細胞を挙げられる。他の宿主細胞には、大腸菌(E.coli)DH5αなどの大腸菌株、およびサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella Typhimurium)などの無毒性同遺伝子型サルモネラ種のアデニル酸シクラーゼを欠乏した欠失変異体およびcAMP受容体タンパク質、異種遺伝子内のサルモネラ変異体およびBio/Tech, 6: 693 (1988)に記載されるような他のサルモネラワクチン株を挙げられる。
【0038】
好ましくは、該細胞宿主は真核細胞であり、適当な折り畳みおよびリン酸化した活性型インヒビターを製造するためのキナーゼ活性を持つタンパク質を発現することができる。宿主細胞は、ママスタチンをコードするcDNAでトランスフェクションすることによってスクリーニングされるであろう。形質転換した細胞によって製造されたタンパク質の分析は、例えば、イムノブロットにより、および以下の実施例に記載するように、例えばMCF7細胞増殖などの***細胞の増殖を阻害するためのタンパク質の能力によって潜在的に宿主細胞になり得るシステムをスクリーニングするのに使用することができる。
【0039】
標的核酸配列で形質転換された宿主細胞をコロニーハイブリダイゼーションまたはママスタチンタンパク質に特異的な抗体との応答性を含む多様な方法によってスクリーニングする。形質転換した細胞は、pcDNA3または他のプラスミドまたはママスタチンをコードする核酸配列を含む他のベクターを運搬する適当な宿主細胞である。そのような1つのプラスミドはpMammAからの2.4kbBamHI-XhoIインサートを運搬するpcDNAプラスミド(pMammB)であり、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに1996年2月22日に寄託し、受託番号第97451号を付与されている(実施例5参照)。
【0040】
特異的な標的DNA配列を含む発現ベクターは、ママスタチンタンパク質の全部または一部をタンパク質製造用細胞宿主に挿入することによるイン・ビトロ転写および翻訳よって製造するために使用される。発現ベクター系から製造されたタンパク質は正常および癌性の***細胞の増殖を阻害する(実施例7参照)。例えば、該ベクターでトランスフェクションされたCos7宿主細胞などの真核細胞は、ならし培地中で、ママスタチンを発現および分泌する。ならし培地は正常および癌性の***細胞の増殖を阻害する(実施例8参照)。
【0041】
アミノ酸配列
ママスタチンタンパク質(配列番号:2)は、核酸配列(配列番号:1)から推定される配列を有する約2400アミノ酸残基のポリペプチドであり、表1に示す。クローニングされたママスタチン核酸配列(配列番号:1)から発現されるタンパク質は乳癌細胞(MCF-7)の増殖を阻害する。
【0042】
組換えママスタチンタンパク質は、精製形態でかつ大量に有効に製造することができる。精製した組換えママスタチンは、患者のサンプル中でインヒビターの診断アッセイのための信頼できる標準として有用である。組換えママスタチンタンパク質はまた、乳癌細胞の増殖を阻害または妨害するための精製された治療剤として有用でもある。
【0043】
治療的使用
治療的使用のためのママスタチンタンパク質は、無血清条件下または組換え手段によるNHMC培養物から製造される。ママスタチンリンタンパク質は治療的に使用され、例えば乳癌の治療における***細胞の増殖を阻害する。好ましくは、ママスタチンは該タンパク質のリン酸化を達成するために高等真核細胞において製造される。組換えママスタチンタンパク質は宿主細胞または合成手段によって製造する。
【0044】
機能的なママスタチンを公知の方法によって患者に投与し、リンタンパク質の投与に関しては好ましくは注入によって投与し、血流におけるインヒビターのレベルを増加し、***細胞とインヒビターの相互作用を高める。
該タンパク質は、リン酸化タンパク質治療剤の送達に関する当該技術分野において公知の方法によって患者に送達されてよい。概して、該インヒビターはデリバリービヒクルと混合し、注入によって投与される。
【0045】
投与されるべきインヒビターの用量は当業者によって決定され、治療モダリティー(modality)の型および疾患の程度によって変化するであろう。ママスタチンは、10ng/mlの濃度で乳癌細胞の約50%を阻害し、イン・ビトロで約20−25ng/mlで増殖を停止し、有用な治療投与量範囲は1日用量約2.5μgから約250μgの投与である。好ましくは、約125μg/日の投与量である。投与の目的は、生理学的範囲からわずかに高い範囲(50〜75ng/ml)で最終的な身体用量となることである。インヒビターの高用量(>50ng/ml)により、処理細胞の組織化学にみられるようにアポトーシスが誘発される。臨床的使用に関して、好ましい用量の範囲は、転移性疾患の初期治療のために約500ng/mlであり、その後約50ng/mlの維持用量となる。以下の実施例において報告された最初の臨床研究は、約50ng/ml〜約750ng/mlの1日投与量がステージIVの乳癌患者における寛解を誘発するのに十分であることを示している。
【0046】
活性化ママスタチンがリン酸化タンパク質であるため、患者の血液中でママスタチンの増殖阻害レベルを維持するためにインヒビターの複数の投与が必要であろうことが予期される。また、ママスタチンは一般的に細胞殺傷剤よりは細胞増殖抑制性剤として機能するので、該インヒビターの最大効果は、乳癌患者におけるインヒビターレベルの一定の維持を必要とすると予期される。
【0047】
その好ましい使用において、ママスタチンは腫瘍の寛解を誘発するための(>50ng/ml、好ましくは50〜500ng/ml)高用量で投与される。癌細胞増殖を妨害するためには、より低い維持用量(>50ng/ml、好ましくは20〜50ng/ml)が使用される。
【0048】
ステージIVの乳癌患者において投与されたママスタチンでの臨床経験は、有用な用量とは血液中のママスタチンの生理学的レベルを維持するものであることを示す。投与は、毎日が好ましく、しかし例えば、持続的な注入、徐放性補給(depot)、または2−3日ごとに1回の注入などによってもよい。逸話としての証拠は、持続的な投与はフィードバック阻害を誘発し、従って好ましい投与計画は約25〜28日間毎日ママスタチンを投与した後、2〜5日投与をやめることを示唆する。
【0049】
診断的使用
ヒト組織および血清中の機能的なインヒビターの存在を検出するための本発明のアッセイは、乳癌の罹患の高い危険性を保有する集団のスクリーニング、乳癌発症の早期発見および治療期間中の患者のインヒビターレベルのモニターのため、乳癌患者のスクリーニングに有用である。例えば、患者の血液ママスタチンの分析は、正常のコントロールまたは該患者の以前のママスタチンのプロフィルに比較して、高分子量のリン酸化ママスタチンの量の減少を示すかもしれない。そのような変化は乳癌の危険の高まり、乳癌の早期発症、および転移性乳癌の進行と相関がある。リン酸化、活性化、49/53kDママスタチンに関する診断アッセイは、例えば、ウエスタン・ブロット、ELISAなどのイムノアッセイによるか、または特異的な抗−ママスタチン抗体を用いる。例えば血清中などのスクリーニングは、例えば、ドット・ブロット・アッセイなどのイムノアッセイによるのが好ましい。
【0050】
最良の結果のため、患者のサンプルはサンプリングから短期間内で(1週間以内で)アッセイされるべきであり、4℃で保存されるか(1年以内)、または凍結させて長期保存すべきである。サンプルはアッセイの時期まで凍結させているのが最も好ましい。
【0051】
アッセイキット
本発明の具体的な態様において、患者の液体および/または乳癌組織中のママスタチンの検出のためのアッセイキットが提供される。スクリーニングアッセイは、血清中のママスタチンを検出または定量するためのドット・ブロット・アッセイなどのイムノアッセイが好ましい。そのようなスクリーニングキットには、抗−ママスタチン抗体およびコントロール抗体を含む場合もあり、および/またはママスタチンコントロールまたは標準を含む。第2のスクリーニングアッセイは***組織のママスタチンを分析する。該アッセイキットには必須試薬および該組織が***上皮であることを特異的に決定するための抗体、例えば抗−サイトケラチン抗体および特異的な抗−ママスタチン抗体と該組織を反応させるための手段を含む。市販されており利用可能な抗体混合物であるパン−ケラチン(pan-keratin)(シグマ(Sigma))は好ましい抗−サイトケラチン抗体である。
【0052】
ママスタチンのネガティブアッセイは、乳癌腫瘍の存在または非上皮***組織によって引き起こされる。抗−サイトケラチン抗体の使用により、誤ったポジティブアッセイに対して警戒する。抗−ママスタチン抗体で染まらないか、または44kDママスタチンのみを発現する***上皮細胞は形質転換細胞である。従って、例えば***組織から単離され、および抗−サイトケラチン抗体で陽性となるような***上皮しての組織を最初に同定し、ついで抗−ママスタチン抗体との第2の陽性反応を同定することによって擬陽性が避けられる。
【0053】
乳癌細胞の約30%が非リン酸化の不活性な44kDママスタチンを発現することが実験により明らかだったので、分析の好ましい方法は、例えばウエスタン・ブロット分析などによって、53/49kDおよび44kD形態の間で区別することである。
本発明はさらに以下の実施例を参照して定義される:
【0054】
実施例1
ヒト***細胞cDNAライブラリー
cDNAライブラリーを整復***形成術(UM病院(UM Hospital))から得られるヒト***細胞から調製した。総RNAを塩化セシウム勾配により***細胞から単離した。総RNA調製物からmRNAを単離した。使用された方法はガーナー(Garner I.)「アイソレーション・オブ・トータル・アンド・ポリ・A+RNA・フロム・アニマル・セルズ(“Isolation of total and poly A+RNA from animal cells")」、Methods Mol. Biol.(1994)28:41−7に記載されている。
【0055】
単離されたmRNAの存在下での逆転写はcDNAを製造し、ついでEcoRIリンカーにライゲートされる。cDNAをEcoRI切断T4DNAリガーゼ処理したラムダZapに挿入し、ついでショート(Short JM.)ら(1988)Nucleic Acids Research 16:7583に記載される方法に従って大腸菌XL1-blue中で増幅した。
【0056】
実施例2
ママスタチンオリゴヌクレオチドの調製
実施例1で調製した正常ヒト***細胞cDNAを、縮重オリゴヌクレオチドを用いてママスタチンをコードする核酸の存在に関してスクリーニングした。その縮重オリゴヌクレオチドは以下のようにして得る:
【0057】
正常ヒト***細胞をミシガン大学病院形成外科より、または共同ヒト組織ネットワーク(Cooperative Human Tissue Network)より入手した。その組織をソウル(Soule)ら、In Vitro, 22:6(1986)に記載される手法に概して従い、コラゲナーゼ処理により還元した。
【0058】
***細胞を40μM CaCl2で調合したDMEM/F12低カルシウム培地中で、175cm2フラスコ中でコンフルエンスに達するまで増殖させ、ついでソウルら、In Vitro, 22:6(1986)に記載される手法に従い、5%CHELEX処理したウマ血清(シグマ)、0.1μg/mlのコレラ毒素(シグマ)、0.5μg/mlヒドロコルチゾン(シグマ)、10ng/ml上皮増殖因子(EGF、コラボラティブ・リサーチ(Collaborative Research)、ベッドフォード、マサチューセッツ)、10μg/mlインシュリンおよび1μg/mlペニシリン/ストレプトマイシンを補給した。ウマ血清をCHELEXレジンで室温で3時間処理して血清カルシウムを除去した。
【0059】
細胞溶解産物は、細胞をTBSですすぎ、テフロン製のスクレーパーでフラスコからこすりとることによって調製した。細胞を遠心分離によって回収し、8M 尿素、50mMトリスpH7.5、0.5%β−メルカプトエタノール、0.5%TRITON X-1000(溶解バッファー)で溶解させ、氷上で3分間超音波処理した。
【0060】
該細胞溶解産物を溶解バッファーで平衡化したDEAE−セファセル(Sephacel)陰イオン交換樹脂(シグマ)上で分画した。溶解産物を樹脂を充填したカラム(50mlの使い捨て、バイオ・ラド(Bio Rad)上に負荷し、ついでカラムの容量の10倍量の溶解バッファーで洗浄した。物質は、重力の供給によってのみカラムから流出した。画分は、最初に、塩の存在下で溶出バッファー(8Mの尿素250mlおよび50mMのトリスpH7.5)を最初に含む閉鎖混合チャンバーに5MのNaClを含む溶出バッファーを持続的に重力の供給によって流して製造された塩勾配で溶出した。
【0061】
溶出画分(2ml)をギブソン(Gibson)画分コレクターによって回収し、上記のように抗−ママスタチン抗体である7G6でドット・ブロットによって***細胞増殖インヒビターの存在に関して分析した。
【0062】
陽性の画分を保存し、50mMのNaClで溶解バッファーに透析し、再度同一のイオン交換カラム上で分離し、50mMのNaClを含む溶出バッファー中のpH勾配(pH8〜pH3)を持続的に減少させて溶出した(pH勾配をつくるために、pH3の緩衝尿素を持続的に最初のpH8のバッファーに混合した。)。画分(2ml)を回収し、上記のように7G6抗体で分析した。
【0063】
陽性の画分を再び保存し、ついで濾過遠心分離によってもともとの容積の1/10のに濃縮した(アミコン・セントリプレップ(Amicon Centriprep)、10kD切断)。濃縮した保存物を前もって染色した分子量標準(シグマ)とともに分取SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によってサイズ画分した。
【0064】
分子量40〜60kD間の分子中に含まれるタンパク質を0.5cmのストリップまたは画分でゲルから切り出した。各ゲルのストリップからのタンパク質の電気溶出を透析チューブ中でランニングバッファー(192mMのグリシン、25mMのトリス(pH8.3)、0.1%SDS)1ml中にそのゲルストリップを置くことによって行った。そのチューブをサブマリン電気泳動装置中に設置し、終夜25ボルトで電気溶出した。電流を2分間逆行させ、ランニングバッファー(現在は溶出したタンパク質を含む)を除去した。溶出したタンパク質の純度を、銀染色で分析SDS PAGEによって、またトウビン(Towbin)ら、J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 27:495〜501(1989)に記載されるような手法に従いチェックした。銀染色PAGEによって決定されるように少なくとも70%純度の画分を貯蔵し、濃縮し、ついで凍結乾燥して粉末形態とした。
【0065】
貯蔵されたタンパク質を500μlの70%ギ酸中に凍結乾燥した粉末を溶解し、20mg/mlの臭化シアン(シグマ)で室温で終夜(約20時間)インキュベートすることによって、臭化シアンで開裂させた。使用した方法はフリーモント(Freemont)ら、Arch. Biochem. Biophys. 228:342−352(1986)中に記載されている。臭化シアン開裂タンパク質のサンプルを2回蒸留し、脱イオン化した水に透析し、再び濃縮し、ついで凍結乾燥して粉末とした。
【0066】
臭化シアン開裂は、もともとのタンパク質サンプルから複数のペプチドを産生し、分取15%SDS PAGEおよび電気溶出によってPVDF膜上にトランスファーすることによって分離した。
【0067】
***細胞溶解産物から得たタンパク質に加えて、タンパク質はまた正常ヒト***細胞ならし培地から単離される。正常細胞をリン酸欠如した8mlのDMEMでインキュベートし、200μCi/mlの32P-オルトリン酸および1%の透析したウシ胎児血清を補った。細胞をならし培地を回収する前に、32P存在下で24時間増殖させることができた。
【0068】
回収したならし培地を10kDの排除制限でアミコン濾過により5倍の濃度にまで濃縮した。濃縮した培地を濾膜上でPBSで1回漱ぎ、取り込まれていない過剰なリン酸を除去し、ついでさらにPBSで溶出したS-200SEPHACRYL(ファルマシア(Pharmacia)、ウプサラ、スウェーデン)分子篩クロマトグラフィー(100cm×0.75cmカラムによって画分した。フィルターとカラムの両者によりサンプルから未取り込み32Pの除去を可能にする。1mlの画分をカラムから回収し、シンチレーションカウンティングにより標識した画分を同定した。放射活性化区分を保存し、ついで銀染色およびオートラジオグラフィーをともなってSDSPAGEによって分析した。保存されたタンパク質を濃縮し、凍結乾燥して粉末とし、ついで臭化シアン開裂の前に上記のように精製した未標識タンパク質の多量と結合させた。標識したタンパク質の添加はリン酸化ママスタチンペプチドを含む臭化シアン開裂断片のトレースの便利な方法を提供する。開裂したペプチドを上記のように分取PAGE上で分離した。
【0069】
放射活性タンパク質を臭化シアン開裂し、分離してPVDF膜にトランスファーし、X線フィルムに曝した後、2つの標識された約20kDおよび22kDのバンドが見ることができた。これら2つのペプチドを膜から切り出し、ウラー(Ullah Alt)らBiochem. Biophys. Res. Comm. 203:182−189(1994)に記載の方法を用いて、ユニバーシティ・オブ・ミシガン・バイオメディカル・リサーチ・コア・ファシリティー(University of Michigan Biomedical Research Core Facility)でエドマン法によってシークエンシングした。2つのペプチドの各々のアミノ酸配列をNIH「BLAST」サーバーを用いて公知のデータベースと比較した。その2つのペプチドは新規であることがわかった。
【0070】
各配列の特に独特の部分を使用して縮重オリゴヌクレオチドを製造し、ジェララ(Jerala)、Biotechniques13:564−567(1992)において記載される方法による標準的な第3の位置の縮重を用いた。20kDペプチドから該配列「gly-gln-leu-glu-tyr-gln-asp-leu-arg」(配列番号:3)を使用した。:22kDのペプチドから配列「tyr-glu-arg-asp-leu-lys-gly-arg-asp-pro-val-ala-ala」(配列番号:4)を使用してオリゴヌクレオチドの複数の種を製造した。縮重オリゴヌクレオチドを高圧液体クロマトグラフィーによって精製した。
【0071】
【表3】
【0072】
縮重オリゴヌクレオチドを32P−γATPおよびT4DNAポリヌクレオチドキナーゼ(BRL、ベテスダ(Bethesda)、メリーランド)で末端ラベルし、再度T4DNAキナーゼバッファー(60mMのトリス(pH 7.8)、10mM MgCl2、15mM β−メルカプトエタノール)を1.5mg/mlで再度懸濁させた。ついでオリゴヌクレオチド(250μM)を0.33μMのATP、25μキナーゼバッファー中の5単位のキナーゼと37℃で2時間インキュベートした。32P‐リン酸の取り込みをTCA沈殿(15%TCA、4℃、15分)によって決定した。典型的な取り込みは109cpm/mgDNAであった。
【0073】
実施例3
縮重オリゴヌクレオチドでの***細胞cDNAライブラリーのスクリーニング
正常***細胞cDNAインサートを含む実施例1で調製したファージに感染させた細菌を、トップアガー(感染細菌培養の1/10希釈から7%NZYMトップアガーの6ml)プレート15cmのNZCYM(10g、NZアミン(ベーリンガー・マンハイム)、5gのNaCl、5gの酵母抽出物、2gのMgSO4、1gのカザミノ酸)上にプレーティングした。プラーク含有プレートにファージの変性(denatureation)の前15分間ニトロセルロース膜をかけた。ファージを0.5M NaOH、1.5M NaCl飽和したワットマンペーパー上で5分間のブロッティングフィルター(DNAサイドアップ)により変性させた。フィルターをH2Oですすぎ、1Mトリス(pH7.0)、1.5M NaCl中で5分間インキュベートした後、20×SSCおよび2×SSCそれぞれ5分間インキュベートした。フィルターを乾燥させ、80℃で1時間焼くか、または紫外線光線下放置してDNAを固定した。燒結フィルターを1%SDSと2×SSC中で30分間洗浄し、ついで50%脱イオン化ホルムアミド、5×Denhart's溶液、1%SDS、5×SSCおよび100μg/ml変性サケ***DNAで37℃でプレハイブリダイズした。
【0074】
フィルターを、熱変性した(95℃で5分)標識縮重オリゴヌクレオチド107cpm/mlを加えた、実施例2で記載したようにして調製したプレハイブリダイゼーションバッファー中の標識縮重オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。フィルターを37℃で30分間2×SSCで洗浄した後、50℃で30分間2×SSCに1%SDSを加えた溶液中で3回洗浄した。フィルターを2×SSCで短くすすぎ、乾燥させて、ついで24〜48時間コダックAR‐5フィルムに露光して陽性プラークを同定した。
【0075】
陽性プラークを逆200μl無菌ペプチドチップを用いて切り出したアガープラグから単離し、4℃で終夜SMバッファー中に再懸濁した。第2および第3のプレート(10cm)をSMバッファーを含むファージの1/10,000希釈で細菌に感染したXL1−Bを用いてNZCYM(1mM MgSO4)中で作成した。プラークを上記のように8時間感染した細菌をインキュベートすることにより製造し、ついで標識した縮重オリゴヌクレオチドでスクリーニングする前にニトロセルロースにトランスファーした。スクリーニングは、本質的にはクロチェック(Kroczek, RA.)、J Chromatogr 618:133−45(1993)に記載されるのと同様に、107cpm/mlの標識したDNAおよび50℃で30分間2×SSCの最終的な洗浄ストリンジェンシーを用いて行われた。
さらなる分析に関して選択されたクローンは、両方の縮重オリゴヌクレオチドによって認識されるものであった。このクローンは「pMammA」と名づけられた。
【0076】
実施例4
ママスタチンcDNAのシークエンシング
実施例3で得られた陽性クローンであるpMammAをミシガン大学のバイオメディカル・リサーチ・コア・ファシリティーで自動化シークエンサーを用いてシークエンシングし、ついでまた15%DNAシークエンシングゲルを用いたジデオキシシークエンシングおよび35Sヌクレオチドを有する放射標識DNA断片によってシークエンシングした。使用した方法はラスケン(Lasken RS)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1301−5(1985)に記載されている。
【0077】
自動化配列の認識された誤りの割合は約5%である。従って、寄託されたクローンをヌクレオチド配列の確認のために再度シークエンシングし、特に記載されるように、潜在的な過誤の疑いのある部分には注意した。
最初に得られた配列情報は、すべての読み取り枠において多くの停止コドン、およびとりわけGCリッチな領域中に明らかな誤りを含んでいた。最初のクローン(pMammA)を注意深く再シークエンシングした。得られた核酸配列は内部の停止コドンを含んでおらず、表1(配列番号:1)に示すとおりである。
【0078】
実施例5
ママスタチンcDNAの発現ベクター中へのサブクローニング
ママスタチンcDNA挿入物であるpMammAを発現ベクターpcDNA3(イン・ビトロゲン(In Vitrogen)にサブクローニングした。ママスタチンcDNAを実施例4に記載されたようにして入手したpMammAをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化することによって単離した。制限酵素はプラスミドをママスタチンクローンインサートの末端で切断し、線形のプラスミド断片および線形挿入断片を作成した。消化したサンプルを電気泳動装置中に沈めた1.2%アガロースゲルのウェル中に静置し、50Vの電流を2時間流した。電気泳動はDNA断片をサイズに基づいて分離し、大きなプラスミドDNA断片はゲル上で一層遅い移動速度を有する。2.4kbを含むアガロースゲルの一部を臭化エチジウム染色によって可視化し、ついでゲルを紫外線ボックスの上に置いて観察した。2.4kbママスタチン断片をゲルから切り出し、ついで透析チューブに置き、ついで該DNAをホウ酸トリスバッファーTBE(0.089Mホウ酸トリス、0.089Mホウ酸、0.002M EDTA)に電気溶出し、回収し、エタノール沈殿した。
【0079】
pcDNA3プラスミドDNAを修飾して、ライゲーション間にママスタチンcDNA断片を受容するようにした。pcDNA3プラスミドをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化が完了した後、そのDNAを子牛腸ホスファターゼの存在下で1時間インキュベートして5'リン酸を除去する。pcDNA3サンプルをついでフェノール抽出し、エタノール沈殿する。
【0080】
pcDNA3およびママスタチン2.4kbcDNA断片を一緒にライゲーションする。その2.4kbママスタチン断片および線形のpcDNA3プラスミドを3:1の割合でT4DNAリガーゼの存在下で混合した。ライゲーション反応は1時間インキュベートした後、4℃で終夜保存した。ライゲーション反応が完了した後、そのDNAを使用して大腸菌コンピテント細胞を形質転換する。サブクローニングをアンピシリン選択コロニーからプラスミドDNAを精製することによって確認した。そのプラスミドをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化した。消化したDNAサンプルをアガロースゲル上に置き、ついで電気泳動で分離した。正しいサイズのママスタチンDNA断片を含むプラスミドをpMammBと命名し、ついでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection (ATCC))に1996年2月22日に寄託し、受領番号:ATCC97451号が付与された。
【0081】
実施例6
ママスタチンcDNA配列からのトランスフェクションおよびタンパク質発現
Cos7細胞はママスタチンタンパク質と一緒に移動する免疫応答タンパク質を発現しない。pMammBおよびPCDNA3を使用してLIPOFECTINョ(BRL、ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies)、ベテスダ、(Bethesda)、メリーランド)を用いて、製造者により示唆されたプロトコールを利用してCos-7サル繊維芽細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を回収前2日間増殖させた。トランスフェクションした細胞を標準プロトコールを用いて細胞をトリプシン処理することによってプレートから除去した(トリプシン2.5ml(0.25%シグマ)を37℃で5分間細胞のフラスコ内でインキュベートした。RPMI培地に10%FBS(ウシ胎児血清)を補給したものの7.5mlアリコートを加えて細胞を遠心によって回収する)。細胞を血球測定計によって数え、107細胞/mlでSDS PAGEサンプルローディングバッファー中で溶解した。細胞溶解産物を8〜15%のSDS-PAGE勾配ゲル(バイオラド)上で分離し、ついでトウビンらJ. Clin Chem Clin Biochem(1989年8月)27(8): 495-501中に記載される方法を用いてナイロン膜にトランスファーした。その膜を抗−ママスタチンモノクローナル抗体7G6でプロービングした。結合抗体をペルオキシダーゼコンジュゲートGAM−IgMで検出し、ECL(アマシャム)によって発色させた。
【0082】
図1に示すように、pMammB(レーンC、D)でトランスフェクションしたCos-7細胞はママスタチンタンパク質(レーンA)と同時に移動する免疫応答性のタンパク質を発現した。空のベクターPCDNA3単独でトランスフェクションしたCos-7細胞はイムノブロット実験を行った場合に免疫応答性のタンパク質を発現しなかった(レーンB)。
【0083】
【表4】
【0084】
イムノブロット分析は、pMammBクローンがママスタチンのサイズおよび免疫学的特徴を有するタンパク質を合成することができるcDNAインサートを含むことを説明している。さらに、44、49および53kDの免疫応答性のタンパク質が、pMammBでトランスフェクションしたCos-7細胞において発現された。これらのタンパク質は、以前に正常ヒト***細胞で同定したママスタチンタンパク質と同じ分子量で移動した。この免疫応答性タンパク質の群は、空のベクターpcDNA3でトランスフェクションしたCos-7細胞中では同定されなかった。
【0085】
図1に示す特定のアッセイにおいて、NHMCコントロールは異常に高量の44kDママスタチンを示す。これは4℃でNHMC標準を長期間(>1年)貯蔵することによって製造された人工産物であり、時間をかけて高分子量の形態の分解が引き起こされたものである。より新鮮なNHMCサンプル(<1年)または凍結サンプルを用いたときは、44kDタンパク質は常に高分子量形態より少ない。
【0086】
実施例7
GST融合
ママスタチンクローンは同様にバキュロウイルス発現系にサブクローニングすることができる。pMammAインサートをファーミンゲン(Pharmingen(サン・ディエゴ、カリフォルニア))から市販されており入手可能であるpAcG3Xにサブクローニングした。このベクターにより、コーディング領域のグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)遺伝子上流の一部を有するGSTとの融合タンパク質として、ママスタチンの製造が可能となる。
【0087】
pMammAインサートをBamHI(5')およびSmaI(3')制限酵素認識部位、小さい非特異的領域およびママスタチン配列の一部を含むPCRの調製セットによって、サブクローニングした。3組のプライマー(各々、リーディング・フレームにおいてシフト)を調製した。プライマーはpMammAクローンにハイブリダイズし、およびpMammA鋳型DNAと典型的なPCR反応において、pAcG3X中のGST遺伝子のリーディング・フレームに挿入することができるpMammAPCR産物を増幅した。ついでそのベクターを使用してHigh5(イン・ビトロゲン)宿主昆虫細胞をトランスフェクションしたところ、GST−ママスタチン融合タンパク質を発現するが、これはグルタチオン樹脂(グルタチオンアガロース、キアゲン(Qiagen)、チャッツワース(Chatsworth)、カリフォルニア)を用いて宿主昆虫細胞から容易に精製した。
【0088】
pAcG3X(ファーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア)のBamHI、SmaI制限部位に挿入するためのDNAを調製するため、プライマーのセットを3つのリーディングフレームを含むように、5'プライマーとしては、BamHI認識部位(GGATCC)、pMammA配列の一部およびpBluescriptベクターからのいくつかの5'配列を含むように調製した。該3'プライマーも同一で、SmaI認識部位(GGGCCC)、pMammA配列の一部およびpBluescriptのいくつかの配列を含むように調製した。
使用したプライマーのセットを以下の表に示す。
【0089】
【表5】
【0090】
1つのプライマーのセットのみ(配列番号:6および8)が活性化阻害ママスタチンをコードすることができるクローンを製造した。その活性化クローンは、High5を形質転換するために使用する場合、形質転換した細胞中で免疫学的に反応性のママスタチンを製造した(図2参照)。
他の公知の真核生物発現系を同様にママスタチンタンパクを製造するために使用してよい。
【0091】
実施例8
イン・ビトロ転写および翻訳によって製造したタンパク質による阻害アッセイ
pMammB、ママスタチンcDNAのイン・ビトロ転写をストラタジーンのExpress RNA転写キットを用いて行ってママスタチンRNAを製造した。製造されたRNAをストラタジーン・イン・ビトロ・エクスプレス・翻訳キット(Stratagene In Vitro Express translation kit)を用いてタンパク質に翻訳した。ママスタチンRNAの翻訳から製造されたママスタチンタンパク質は、培養中で***細胞増殖を阻害することを示した。
【0092】
MCF‐7細胞の培養を上記の翻訳アッセイにて製造したタンパク質産物で処理した。タンパク質産物(容積の5%、培養培地)を1ウェル当たり1mlの培地を含む12ウェルプレート中の細胞に添加した。平行実験の培養を翻訳産物および抗−ママスタチン抗体3C6の両方で最終濃度30μg/mlで処理した。
【0093】
陰性コントロールとして、培養物をママスタチンcDNAの不在下でインキュベートしたストラタジーン・イン・ビトロ・エクスプレス・翻訳キット(すなわちベクターとして採用)で翻訳したタンパク質産物で処理した。これらの溶解産物はママスタチンタンパク質を製造する適当な機構を持たない。
【0094】
すべての培養物をタンパク質産物で処理した後に6日間増殖させ、各サンプルの細胞数をコールターカウンター(Coulter counter)を用いて計算した。各サンプルの細胞数を平均できるように各培養条件には3つのサンプルを用い、阻害%を網状赤血球溶解液で処理したコントロール細胞と比較することによって決定した。
図3に示すように、pMammBのタンパク質翻訳産物はMCF-7細胞増殖を阻害した。この阻害は、抗−ママスタチン抗体3C6の存在下で大きく低減されるかまたは阻止された。
【0095】
実施例9
pMammB でトランスフェクションした増殖 Cos −7細胞から得られたならし培地内に存在するタンパク質による***細胞の阻害
***細胞の増殖阻害実験を、実施例6に記載するように、pMammBでトランスフェクションしたCos−7細胞から入手したならし培地を用いて行った。ならし培地によって引き起こされる増殖阻害は、抗−ママスタチン抗体の添加によって阻害された。
【0096】
MCF−7細胞を10%非必須アミノ酸およびFBS(シグマ)を補ったMEM培地中で104細胞/mlにてプレーティングした。細胞を終夜付着させ、ついで、(1)空のベクターpcDNAでトランスフェクションしたCos-7細胞(陰性コントロール)、(2)pMammBでトランスフェクションしたCos-7細胞(pMammB-Cos)、(3)MHMCならし培地、または(4)ならし培地ではない培地のいずれかからのならし培地(3日間培養)の10%の容量を補った。平行のMCF−7細胞の培養に30μg/mlの3C6阻害抗体を補った。処理したMCF−7細胞を6日間増殖させて、ついで血球測定計によってカウントした。
【0097】
ならし培地中でインキュベートしたMCF-7細胞の増殖を、コントロールの条件付けしていない培地中でインキュベートしたMCF-7細胞の増殖と比較することにより、細胞増殖の阻害を決定した。データを図4に示すが、pMammBで形質転換した細胞からのならし培地が正常なヒト***細胞のならし培地と同様に有効に乳癌細胞増殖を阻害したことを示している。この阻害は抗−ママスタチン抗体の存在下で阻止された。
【0098】
実施例10
3つの免疫学的に応答性の抗‐ママスタチンタンパク質
組織培養細胞中の全正常ヒト***細胞(NHMC)および乳癌部位を溶解し、細胞溶解タンパク質を、上記およびアービン(Ervin, Paul)1995、博士論文、ミシガン大学第2章に記載されるようにSDS/PAGEにより分離した。溶解した細胞サンプルをミニ−プロテイン(Mini-Protean)II装置で10%のSDS−PAGE(25μg/ サンプル)上で分離した。タンパク質をニトロセルロースへトランスファーし、抗−ママスタチンモノクローナル抗体7G6またはIgMコントロール抗体でプローブし、アルカリフォスファターゼコンジュゲート第二抗体であるヤギ抗−マウスIgMをNBT/BCIP基質系とともに利用して陽性の抗体の反応を比色分析により検出した。そのデータを図5に示す。
【0099】
【表6】
【0100】
図5に示すように、正常のヒト***細胞は、抗−ママスタチンモノクローナル抗体によって強く認識される49および53kDにて移動する二重線のタンパク質、および第3の弱い免疫応答性の44kDタンパク質を発現した。試験した4つの腫瘍細胞株は44kDの免疫応答性タンパク質のみを発現するか(レーン1、4)または免疫応答性のタンパク質は全く発現されなかった(レーン2、3)。
【0101】
上記のデータは数年の期間をかけて42名の異なる整腹***形成患者からの正常細胞で行った実験の代表例である。正常細胞および癌細胞株での44kDタンパク質の発現は各調製物で強度が変化した。
【0102】
実施例11
ママスタチンはリンタンパク質である
***細胞の細胞性のリン酸化タンパク質を、32P-オルトリン酸(200μCi/ml)を正常***細胞の培養中に24時間加えることにより32Pでラベリングした。ならし培地を30kDの分子量制限のアミコン遠心により5倍に濃縮した。濃縮した培地を濾過膜上でPBSにて1回すすいで過剰な未導入リン酸を除去し、PBS溶出バッファーを用いたS-200 SEPHACRYL(ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン)分子篩クロマトグラフィー(100cm×0.75cmカラム)によって分画した。イムノブロットを上記のように調製し、7G6抗体でプロービングした。
【0103】
放射線標識した53kDママスタチンタンパク質を免疫沈降によってならし培地中で同定した。この分析はママスタチンが分泌リンタンパク質であることを示していた。分泌されたリンタンパク質は一般に知られていないので、細胞のブレフェルディン(Brefeldin)A処理を利用して、ママスタチンが分泌あるいは細胞破砕または漏出によりならし培地中に存在するか否かを決定した。ブレフェルディンAは真核細胞からのタンパク質の分泌を阻止する真菌性化合物である。ブレフェルディンAは正常な小胞体およびゴルジ体の機能を阻害し、小胞形成を阻止する(アービン・ポール、1995、学位論文、第25頁)。たいていの分泌タンパク質は膜結合小胞からエクソサイトーシスのプロセスによって細胞から遊離され、小胞形成の阻止は多くのタンパク質の分泌を阻止する。NHMCがブレフェルディンAの存在下で増殖する場合、リン酸化ママスタチンはならし培地中で同定されない。
【0104】
ママスタチンタンパク質中でリン酸化されるアミノ酸残基を決定するため、放射性標識した53kDタンパク質をホスホアミノ酸分析にかけた。MHMC細胞を32P−オルトリン酸と24時間インキュベートした。ついで、細胞溶解産物を抗−ママスタチン抗体7G6で免疫沈降し、以下のように精製した。53kDタンパク質をトリプシンで消化し、ついで、酸で加水分解した。2次元の薄層クロマトグラフィーを使用してママスタチンのリン酸化アミノ酸を分析した。32P−アミノ酸をホスホ−ser/thr/tyrコントロールと混合し、2D TLCプレート(20cm)の起点に負荷した。サンプルを2次元で分離した:第1次元−pH1.9バッファー(50mlギ酸、156ml氷酢酸/2000ml(1794H2O))、20分@1.5Kボルト;時計回りに回転;第2次元−pH3.5バッファー(10mlピリジン、100ml氷酢酸:1890ml H2O))、16分@1.3Kボルト;時計回りに回転。
【0105】
TLCプレートをニンヒドリン染色し、フィルムに曝した。ホスホ−アミノ酸分析は、ニンヒドリン染色したホスホ−アミノ酸標準に対するオートラジオグラフィーと比較することにより、53kDママスタチンタンパク質が3つのタイプのリン酸化アミノ酸残基を含むことを示した。
【0106】
トレオニン(Th)は最も豊富なリン酸化アミノ酸であり、ついでセリン(S)およびチロシン(Ty)が続き、これらは最も少ないリン酸化種である。しかしながら、リン酸化アミノ酸残基の相対的な豊富さは天然タンパク質のものを表すものではない。というのは、酸加水分解がホスホチロシン残基からリン酸を遊離させ得るからである。
【0107】
実施例12
変化したリン酸化を有する1つのママスタチンタンパク質
タンパク質の細胞リン酸化はホスファターゼおよびキナーゼによって変調することができる。ママスタチンは、ママスタチンホスファターゼの異なる活性のために、正常および腫瘍細胞の溶解産物中で異なってリン酸化される。NHMC溶解産物中のママスタチンへ及ぼすホスファターゼの効果を調べた。
【0108】
NHMCを低カルシウム培地中でコンフルエンスに達するまで増殖させ、TBS中にこそぎとることによって回収した。細胞をTBSで洗浄し、2mg/mlのpH6.6の酢酸バッファーに0.5%のTritonX-100を加えて再懸濁した。5μg/mlのイェルシニアホスファターゼ(Yersinia phosphatase)(YOP)(スタッキー(Stuckey)ら、Nature 370: 571-5 (1994))または活性化部位を含むイェルシニアホスファターゼ変異体(MYOP)を使用して、37℃で6時間、細胞溶解産物を消化した(YOPおよびMYOPはザ・ユニバーシティー・オブ・ミシガン、生化学研究室のディクソン(S. Jack Dixon)博士より入手)。図6に示すように、正常ヒト***細胞溶解産物のイェルシニアホスファターゼ(YOP)での消化は、抗−ママスタチンイムノブロットによって同定される53kDママスタチンタンパク質が減少した量となる結果となった(レーンA)。対照的に、イェルシニアホスファターゼ変異体(MYOP、レーンB)での消化は53kDのママスタチンタンパク質の同定を変化させなかった。これら結果は、イムノブロットによる53kDママスタチンタンパク質の同定がママスタチンタンパク質のリン酸化の状態の都合のよい測定手段であることを示している。
【0109】
上記のようにイェルシニアホスファターゼ(YOP)の存在下でインキュベートしたならし培地を用いてMCF-7を処理した。以前の観察のように、NHMCならし培地はMCF-7細胞の増殖を阻害し、この阻害は抗−ママスタチン抗体によって阻止される。図7に示すように、YOPによるNHMCならし培地の処理はこの阻害活性を破棄させる。コントロールとして、ホスファターゼ活性を欠くYOP変異体(M.YOP)によるNHMCならし培地の処理を試験した。この変異体はNHMCならし培地の阻害活性に影響は全く及ぼさなかった。抗−ママスタチン抗体7G6を用いたならし培地の免疫沈降は阻害活性を除去した。
【0110】
TCA沈降は、YOPでのならし培地のインキュベートが約50%の導入リン酸を除去することを示した。上記に示すように、YOPはまたNHMC溶解産物から53kD種を除去した(図6)。
【0111】
実施例13
癌性***細胞ではなく正常***細胞により製造されたリン酸化ママスタチン
正常かつ形質転換した***細胞を32Pオルトリン酸で標識した。MCF−7細胞をMEM(セロックス(Cerox))(10%FBS、非必須アミノ酸およびインスリン(10mg/l)を補って)中で増殖させた他は、癌腫細胞株をATCCの示唆どおりに培地中で増殖させた。細胞タンパク質の32Pオルトリン酸標識を、2%の透析したFBSを含むリン酸不含DMEM(ICN)中で行った。細胞を200μCi:/mlの32P−リン酸とともに37℃で24時間インキュベートした。48時間後、ならし培地を細胞培養液から回収し、5倍に濃縮した。ならし培地をTBSで洗浄し、10kDの分子量のカットオフのアミコン・フィルターで濃縮した。細胞層を、溶解バッファー、細胞溶解産物からの1.5ml/フラスコ(0.5%Triton X-100、デオキシコール酸としてで2.01%SDS)およびならし培地中にこそぎとった(テフロン細胞スクレーパー使用)。
【0112】
ママスタチンタンパク質を、5倍濃縮培地または細胞溶解産物500μlあたり5μgの7G6抗−ママスタチン抗体を加えることによって免疫沈降し、室温で1.5時間インキュベートした。ヤギ抗‐マウスIgM第2抗体(5μg/0.5ml)を加え、ついで混合物をさらに1時間インキュベートした。プロテインG PLUS/AアガロースRスラリー(オンコジーン・サイエンス(Oncogene Science))を加え、ついで混合物を室温で1.5時間インキュベートして抗体複合体を固定した。
【0113】
複合体を溶解バッファーで6回洗浄し、各回の洗浄の後に3000×gで遠心した。SES-PAGEローディングバッファー(50μl)を加えた後、サンプルを100℃で3分間加熱した。上清をSDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロースにトランスファーし、さらにコダックX−ARフィルムに露光した。
【0114】
NHMCタンパク質のリン酸標識および続く免疫沈降は、NHMC中の49kDおよび53kDリンタンパク質を同定した。癌腫細胞株では49kDおよび53kDリンタンパク質は認められなかった。癌腫細胞株MHC−7、T47D、ZR−75−1およびMDA−MB−435は44kDの免疫応答性タンパク質を発現したが、このタンパク質は32P−オルトリン酸で標識されなかった。
【0115】
本実験は、ママスタチンの分子量の増加とともにより多くのリン酸が取りこまれることを示す。形質転換細胞株でのママスタチンのリン酸化の欠如は、そのタンパク質の高分子量形態の欠如およびママスタチン阻害活性の欠如と相関している。
【0116】
実施例14
ママスタチンキナーゼおよびホスファターゼ
正常細胞または癌腫細胞のフラスコを75%のコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞培養物をTBSで3回洗浄し、ついでテフロンスクレーパーを用いてTBS中にこそぎ入れた。細胞懸濁液を1000gの遠心でペレット化し、ついで少量のTBS中に再懸濁した。各タイプの細胞のアリコートをタンパク質定量のため取り出した。ついで、タンパク質濃度を溶解バッファー(0.5%TritonX−100および、各5μg/mlのアプロチニン、ロイペプチンおよびPMSFを加えたTBS)2mg/mlに等しくした。等質量の正常細胞タンパク質および腫瘍細胞タンパク質を混合し、37℃で3時間インキュベートした。正常細胞および癌腫細胞溶解産物の平行混合を10nMオルトバナジン塩(Orthovandate(NaVO4))、ホスファターゼインヒビターの存在下で行った。ついで混合物をSDS/PAGEにより分離し、7G6抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した。そのデータを図8に示す。
【0117】
【表7】
【0118】
図8に示すように癌細胞(ZR−75−1)(レーンA)はNHMC(レーンB)に比較して、53/49kDママスタチンを産生しなかった。正常細胞タンパク質および癌細胞タンパク質をプロテイナーゼの存在下で混合すると活性な53kDインヒビターの量が減少する(レーンD)。しかしながら、チロシン−ホスファターゼインヒビター(NaVO4)の存在下では、53kD種は混合物中に保持されている(レーンC)。これらの結果は、癌腫細胞がママスタチンのリン酸化形態を排除しうるホスファターゼ活性を発現することを示している。
【0119】
正常細胞株および形質転換株でのママスタチンの発現はウエスタンブロット分析により定量的に測定できる。抗−ママスタチンモノクローナル抗体を用い、乳癌細胞および正常***上皮からの細胞との間で該タンパク質の発現に一貫した差異が存在するが示された。ママスタチンは、ヒトの正常な女性***組織中では抗−ママスタチンモノクローナル抗体7G6を用いたウエスタンブロット分析によって44、49および53kD種として認められた。乳癌細胞では、44kD種が首尾一貫することなく認められたが、49または53kDの免疫応答性形態は決して認められなかった。49および53kD形態が正常細胞中で同定される場合、それらはリン酸化されている。44kD種はリン酸化されていない。従って、イムノブロット分析を用い、ママスタチンの44および49kD種、および53kD種の発現を観察することによってママスタチンがリン酸化されているか否かを決定することができる。
【0120】
実施例15
ヒト血清中でのママスタチンの同定
精製抗−ママスタチンモノクローナル抗体6B8および3C6を用い、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)をママスタチンの検出のために確立した。
抗体6B8を用い、10μg/mlまたは100μl/ウェルの濃度で、室温で3時間または4℃で終夜、イムロン 1(Immulon 1)96ウェルマイクロタイタープレート(イムロン社)をコーティングした。プレートをTBS(150mM NaCl、100mM トリスpH7.4)中の2%BSA(シグマ)で30分間ブロックし、ついで2%BSA溶液に50%に希釈した精製したママスタチンまたはサンプル血清とともに37℃で1.5時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを第二抗体を加える前に、300μl/ウェルのTBSプラス0.1%TritonX-100で5分間、3回洗浄した。
【0121】
第2抗体はビオチン化した3C6であった。抗体は、0.1MのNaHCO3中でビオチン、N−ヒドロキシコハク酸エステル(N-hydroxy succinimate ester)(シグマ)と室温で2時間または4℃で16時間インキュベートすることによってビオチン化する。抗体を使用の前または保存前に、1MのNaCl、50mMのトリス(pH7.4)、0.02%のアジ化物(NaN3、シグマ)に透析した。
【0122】
第二抗体はビオチン化した3C6であった。抗体のビオチン化は、ビオチン、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(シグマ)とともに0.1M NaHCO3中で室温にて2時間および4℃にて16時間インキュベートすることにより行った。抗体を使用前に1M NaCl、50mMトリスpH7.4、0.02%アジド(NaN3、シグマ)中に透析した。
【0123】
ビオチン化した抗−ママスタチン抗体を2%BSA/TBS溶液中にて1μg/mlおよび100μl/ウェルにて添加し、37℃で1.5時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを上記のようにTBSプラス0.1%Triton X-100で5分間で5回洗浄した。第二抗体をアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン(サザン・バイオテクノロジー(Southern Biotechnology))で同定し、すべてのサンプルについて2%BSA/TBS中、100μl/ウェルで1/1000の希釈にて1時間インキュベートした。
【0124】
ELISAアッセイをPNPP(パラニトロフェニルホスフェート、シグマ)をアルカリホスファターゼバッファー(10mMジエタノールアミンpH9.5(シグマ)、0.50mM MgCl2(シグマ))中で1mg/mlにて用いて比色的に発色させた。マイクロタイタープレートを15分および30分間隔で405nmでELISAリーダー上で読みとった。
【0125】
細胞溶解産物またはならし培地から単離したクロマトグラフィー精製したママスタチンを用い、低ナノグラム範囲でママスタチンのアッセイの感度を示すELISAのための標準曲線を確立した(図9参照)。正常ヒト志願者血清中のママスタチンレベルの定量を、志願者から1ヶ月間、2日間隔で採取した血清サンプルで行った。このアッセイにより正常ヒト女性血清中のママスタチンレベルが検出可能であり、約10〜50μg/mlの間でで変化した(図10)。
【0126】
ママスタチンレベルをまた、乳癌患者から採取した血清中でも測定した。ミシガン大学胸部ケアセンターで結節陰性(node negative)乳癌と診断された患者を、処理の全経過を通じて、血清中のママスタチン発現について検査した。そのデータを図11に示し、以下にまとめた。血清サンプルを、サイトトキシン、アドリアマイシン、メトトレキセート、および5Fuを用いたホルモンサイクリング(hormonal cycling)組み合わせモダリティープロトコールの全処置期間と通じて乳癌患者から回収した。凝血後、血清を遠心により全血から分離し、使用まで−20℃で保存した。0.5%NFDM中で50%の濃度の血清150μlを用いたELISAアッセイを、酵素結合した「サンドイッチ」アッセイにて6B8および3C6抗−ママスタチン抗体を用いて2回行った。クロマトグラフィー精製したママスタチンで標準曲線を作成し、図9に示す曲線に匹敵するものとした。
ママスタチンの発現は患者によって変わり、処理の経過の間で変動した。ママスタチンレベルは、転移性疾患への進行とともに検出不能になることが一貫して観察された。
【0127】
乳癌と診断された患者は、正常患者血清中のレベルと比較して診断時の血清中に低レベルのママスタチンを有していた。ママスタチンレベルは、一般に、ホルモンサイクリング、アジュバント化学療法プロトコールで上昇した。ママスタチンレベルは、このプロトコールでも変動した。ママスタチンレベルは死直前の進行疾患を患う患者では検出できなかった。患者のデータを以下の表に示すように4つの群に分類した。
【0128】
I. 血清ママスタチンレベルが治療期間中上昇し続けた患者の群
II. 血清ママスタチンレベルが治療の最初は上昇したが、ついで検出不可能になった患者の群
III. 血清ママスタチンレベルが治療期間に上昇したが、ついで大きく変動した患者の群
IV. 低レベルの血清ママスタチンを有していたが治療で検出不可能になった患者の群。
【0129】
【表8】
【0130】
実施例16
ママスタチンのイン・ビボでの効力
CD-1Nu/Nuホモザイゴートの雌の6週齢マウス(チャールズ・リバー(Charles River))に徐放性ペレットによりエストロゲンを0.72mg/ペレットにて、17βエストラジオール(イノベーティブ・リサーチ(Innovative Rsearch)#SE-121)の60日間放出を用いて補給した。エストロゲンを補給したマウスに3×106MCF-7を60%マトリゲル中に注入当たり100μl、注射した。2回の注射を、わき腹当たり1回、投与した。腫瘍細胞増殖の7日後、ママスタチンを投与した。被験マウスに6週間の間、2日間隔で産生培地中のママスタチンの1、2、または5μgを与えた。コントロールのマウスにはBSAを投与するか、または腫瘍を注射せずにインヒビター単独を注射した。
【0131】
腫瘍の大きさを1週間ごとに最大直径の点で測定し、処理群ごとに平均した。その結果を図13A−13Cに腫瘍の大きさを平均直径±標準偏差としてプロットして示した。
本動物実験を、MDA-231腫瘍細胞を用いて繰り返した。細胞をMCF-7細胞に関して上記で記載したように注射1回あたり2×106細胞で注射した。
【0132】
その結果を図14A〜14Cに示す。
示された結果は期待されるほどではなかった。動物は尾静脈に注射を受けたので、必要な血中投与量より少ない結果となった。その後の腹腔内注射を用いた実験では一層有効な処理となった。5μg/マウスの用量およびそれより多い用量で腫瘍増殖が廃棄される。
【0133】
実施齢17
ママスタチンのレトロウイルス発現
ママスタチンcDNA(2.4キロベース(kb)のインサート)をレトロウイルス発現ベクターにサブクローニングした。このベクターを用いて3T3繊維芽細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を回収し、溶解し、ついでその細胞溶解産物をウエスタンブロットで分析した。
図12に示すように、ママスタチン運搬レトロウイルスにてトランスフェクションされた3T3細胞はリン酸化したママスタチンを発現した。
【0134】
実施齢18
バキュロウイルスおよび Cos 7細胞におけるママスタチン発現
サル腎臓細胞であるCos−7をママスタチンをコードする核酸でトランスフェクションした。
【表9】
【0135】
図16に示すように、Cos−7細胞中の組換えママスタチン発現の誘発は、ママスタチン遺伝子pMammAおよびpMammBが真正のママスタチンをコードしていることを示していた。さらに、Cos−7細胞がタンパク質リン酸化を伴うママスタチンの異なる形態を発現するという観察は、ママスタチンがヒト***細胞以外の真核細胞にて製造される場合にリン酸化され活性であることを示唆している。安定したトランスフェクタントを選択して組換えママスタチンの永続的な合成を可能とした。
【0136】
実施例19
培養中の正常ヒト乳上皮細胞によるママスタチンの産生
健常な***組織を、整腹***形成術から、無菌にて手術室から直接入手した。その組織をIII型コラゲナーゼ(ライフ・サイエンスィズ、ベテスダ、メリーランド)を1g当たり4単位含む溶液中、ラミナーフローフード(Laminar Flow hood)中で滅菌状態で細かに切り刻んだ。この細かに切り刻んだ組織を終夜振盪水浴中で37℃にてインキュベートしてコラゲナーゼ消化させた。
【0137】
コラゲナーゼ消化した***組織である、多様な細胞型および脂肪細胞中から放出された脂質を含む粘性液体を、遠心にかけて脂質、水性溶液、および他の細胞型を分離した。コラゲナーゼ消化した物質を卓上遠心機で1000rpmにて室温で約5分間回転させた。脂肪細胞および遊離脂質は、遠心チューブの上部半分に分配され、吸引により抜き取り廃棄した。細胞ペレットの上に位置する水性上清もまた、吸引により抜き取り廃棄した。残りの細胞ペレットを哺乳動物増殖培地であるDMEM、pH7.4の滅菌溶液で洗浄した。洗浄は洗浄からの上清がもはや濁らなくなるまで(例えば、約4回の洗浄)続けた。その洗浄した細胞を増殖培地中に再浮遊させ、40℃で30分間重力によって沈降させた。赤血球は無核であり有核の上皮細胞よりも低密度であるため、この手順は、赤血球を含む上清を抜き取ることによって沈降した上皮細胞から赤血球を除去することができる。この沈降手順を細胞ペレットに赤色が残らなくなるまで、例えば約2回、繰り返した。残る細胞ペレットを、5%ウマ血清、10μg/mlの上皮増殖因子、100ng/mlのコレラ毒素、500ng/mlのヒドロコルチゾン、10μg/mlのインスリン、100単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、および1mM濃度の塩化カルシウムを含む富栄養DMEM/F12増殖培地中に再浮遊した。生理的濃度のカルシウムにより細胞接着および細胞培養中の増殖(outgrowth)が促進された。細胞浮遊液を5%CO2濃度で37℃にて滅菌組織培養フラスコ中でインキュベートした。
【0138】
正常***組織の初期の培養は混合細胞集団を含む。脂肪細胞、ニューロンおよび血管組織は上記の遠心分画工程によって有意に減少させられる。結合組織細胞は有意な量で存在する。上皮細胞でない細胞を除去するために、分別接着法を用いた。繊維芽細胞、ニューロンおよび***組織における他の細胞型はすべて上皮細胞より一層速やかに組織培養プラスチックに接着する。さらに、これらの細胞型はすべて、組織培養プラスチックから上皮細胞よりも速やかにトリプシンによって除去される。***上皮細胞のための培養を富ませるために、単層を形成し始めた培養液(最初のプレーティングの5〜7日後)をトリプシン:EDTA溶液(250:1(モル比))で処理する。細胞の大多数は、37℃でのインキュベーションで5分以内に除去された。残った接着細胞は90%以上が上皮***細胞であった。これらの細胞を採り、上記の増殖培地に40μMの塩化カルシウムとともに戻した。繊維芽細胞をトリプシン処理した培養フラスコから除去し、遠心により回収し、増殖培地に再浮遊させ、ついで組織培養プラスチックに37℃で30分間プレーティングした。接着した細胞は大部分が繊維芽細胞であった。接着しなかった細胞は有意に繊維芽細胞に富んでいた(50〜80%)。これら浮遊細胞を除去し、新鮮な組織培養フラスコ中で沈降させた。この工程を2回繰り返して、上皮細胞が優勢な細胞集団を得た。コレラ毒素は上皮細胞の増殖を促進させ繊維芽細胞の増殖は阻害するので、また繊維芽細胞は低減したカルシウムでは充分に増殖しないので、その培養物は、上記低カルシウム培地中で1週間以内に約100%の上皮細胞となった。これらの正常ヒト***細胞(NHMC)の培養物は、培地中にママスタチンを産生した。
【0139】
NHMCを増殖させるために使用した栄養培地には5%のウマ血清が含まれており、これはヒト注射には適さない。ウマ血清タンパク質は精製してママスタチンタンパク質から排除するか、または該血清を欠く培地中で細胞を増殖させなければならない。正常細胞は、血清の不在下では7〜10日間しか維持することができない。血清不含のママスタチンを有意な量で長期間にわたって製造するために、細胞を無血清培地および血清を含む培地で交代で増殖させた。
【0140】
NHMCを上記のように増殖培地中で完全なコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞は、細胞がフラスコの利用可能な表面を覆いつくしたとき、増殖するにつれて溶液中に伸び始めた。伸びつつある細胞を回収し、新しいフラスコに移した。コンフルエントに達したフラスコを滅菌食塩水で3回すすぎ、洗浄の間に5分間食塩水でインキュベートして血清タンパク質を除去した。ついで細胞に無血清の「産生培地」を与えたが、これは本質的に、血清、コレラ毒素およびヒドロコルチゾン欠く増殖培地であった。細胞を約4日(96時間)産生培地で維持し、培地の回収および細胞の増殖培地への返還を少なくとも4日間行った。このようにして製造されたママスタチンの典型的なバッチサイズは、1〜2リットルであった。
【0141】
ママスタチンはまた、バイオリアクター、バイオフロー・3000(Bioflow 3000)、ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック(New Brunswick Scientific)中でも製造されている。この潅流リアクターでは、細胞は組織培養処理した線維細胞(fibracell)ディスクに接着した。細胞の接着したディスクを反応容器中のバスケット中で維持し、培地で潅流した。NHMCをリアクターに導入したとき、それらは線維細胞ディスクに集まり、培地の潅流によって栄養を与えられる。ならし培地をリアクターから回収し、冷凍した。
【0142】
実施例20
ママスタチンのドット・ブロット血清アッセイ
25歳の健康な女性から血清を入手し、乳癌患者(ステージIV)からの血清、該患者の診断されていないきょうだいからの血清、および該患者の母からの血清と比較した(その家族は乳癌の家系である)。これら血清サンプルをママスタチンの存在についてイムノアッセイで比較した。診断の日に採取した複数の乳癌患者からの血液サンプルもまたイムノアッセイで分析した。正常なヒト***細胞(NHMC)ならし培地を標準コントロールとして用いた。標準的なNHMCママスタチンは、クロマトグラフィー精製したママスタチンタンパク質標準を用いてドット・ブロットアッセイで決定されるように約50ng/mlを含んでいた。
【0143】
個々の血液サンプルをバキュテーナー(vacutanier)チューブに回収し、全血から血清を分離した。血清サンプル(250または500μl容量)を希釈なしに96ウェル(S & S Dot-Blot manifold)を用いて吸引によってニトロセルロースに適用した。ならし培地を実施例19のように調製した。ニトロセルロースフィルター上のサンプルをTBS中のTriton X-100で洗浄し、脱脂粉乳(TBS中に5%)でブロックし、5%の脱脂粉乳中の第1抗−ママスタチン抗体(7G6マウスIgM)1μg/mlとともに室温で1.5時間インキュベートした後、5%の脱脂粉乳中の第2抗体(アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗−マウスIgM)1μg/mlとともに室温で1時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ発色反応は、ニトロブルー−テトラゾリウムおよびBCIPを用いて進行させた。
【0144】
図13に示すように、サンプル中のママスタチンの量を正常***細胞ならし培地から得た標準曲線に対して定量した。健康な女性から得た血清は暗く色付けたブロットによって示されるように、容易に検出可能な量のママスタチンを含んでいたのに対し、乳癌と診断された患者からの血清および診断されていない家族成員からの血清は、ほとんどまたは全くママスタチンを示さなかった。
【0145】
診断した日の乳癌患者から、乳癌患者の健康な家族から、および健康な女性および男性からさらなる血清を得た。血清を上記のように処理してママスタチンを分析した。ドット・ブロットは発色反応の強度を示すために「陰性または低い」または「陽性または高い」として評価した。データを以下の表に示す。
【0146】
【表10】
【0147】
実施例21
ヒト乳癌患者の治療
化学療法に失敗したかまたは失敗しつつある乳癌再発したステージIVの乳癌患者29名にママスタチンタンパク質を利用できるようにした。このタンパク質は上記実施例19の記載と同様にして製造したものであり、3mlの注射容量にて所要用量で産生培地中にて提供された。患者は処方された計画に従って、このタンパク質を静脈内投与された。一般に、1日用量を注射した。選択された投与量は、患者の血流内で生理学的な量のママスタチン(例えば、健康な女性で5〜50ng/ml)が提供されるものであった。各患者の投与量および頻度は以下の表に示すとおりである。
【0148】
【表11】
【0149】
【表12】
【0150】
29名の患者のグループのうち、後期ステージの肝臓疾患を有していた6名は生存できなかった。これらの6名の患者はママスタチンを投与される前に肝機能不全の臨床的所見を呈し、本治療によっては助からなかった。1名の患者は肝臓機能不全に陥る前に黄疸が低減する徴候を示したが、これら6名の患者は全員、進行した肝臓癌を有する患者に共通する窒素毒素により死亡したと思われた。
【0151】
残りの患者のうち、2名はその疾患により死亡した。1名はママスタチン治療の2ヶ月後には疾患のない状態であったと思われた。この患者は治療から外され、2ヶ月以内に再発した。この患者はコントロール状態に戻ることはなく、肝臓の疾患で死亡した。第二の患者は治療の4ヶ月後に死亡したが、本治療に対する応答の徴候を示すことは決してなかった。これら後者の2名の患者ではママスタチンの投与量を10倍に増加したが、これらの患者のいずれにおいても毒性の徴候は認められなかった。
【0152】
現在ママスタチン療法を受けている19名の患者のうち、大多数は陽性の利益の徴候を示し、有害応答の徴候はみられない。これらの患者のうちの3名は、ママスタチンの利益を受けているのか否かは明らかでない。他の16名の患者は、正常レベルまでの腫瘍マーカー(CA15−3およびCA27−29)レベルの低減、触診できる腫瘍の大きさの低減、MRI走査で認められるような疾患の減退および痛みの低減を含む利益の明確な臨床的徴候を示している。これらの患者のうちの数人は、疾患が無くなったと考えられる段階まで改善を示す。しかしながら、これらの患者にタンパク質を3日〜5日の期間与えないと、疾患の徴候を全く示さない患者においてさえも、痛みの増大によって示されるように疾患の活性の再開という結果となることが一貫して観察されている。タンパク質療法を再生すると2〜4時間以内で増大した痛みの徴候が低減または除去される。
【0153】
血中のママスタチンレベルが長期の治療の後に衰退することもまた観察されており、負のフィードバックシステムを示唆している。この一定の血中レベルにおける衰退は、約28日の期間、毎日ママスタチンを投与し、その後2〜3日タンパク質を投与しないことによってうまく回避できる。
【0154】
実施例22
ヒト治療のための組換えママスタチン
組換えママスタチンを、Cos-7サル腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、およびSf9昆虫細胞中を、ママスタチンcDNA配列を含むプラスミドでトランスフェクションすることによってこれら細胞中で製造した。ママスタチンcDNAはこれら産生細胞株のゲノム中に安定に組み込まれ、増殖阻害活性と免疫応答性のタンパク質を分泌する。
【0155】
これらの細胞からママスタチンを製造し、ヒトに使用するために該タンパク質を単離するため、これら細胞株を無血清培地中で約48〜72時間増殖させる。培地を取り除き、タンパク質をならし培地から精製し、約0.1M〜約0.5Mから塩化ナトリウム濃度勾配を用い、約0.2Mでママスタチン画分を回収する、トリスバッファー(pH7.5)中でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製する。ついで、タンパク質画分を生理食塩水に対して透析し、必要であれば透析し、ついで濾過滅菌する。
【0156】
別法において、ママスタチンをCos7またはSf9細胞中で融合タンパク質として産生させる。融合タンパク質はヒスチジンタグ(6つのヒスチジン残基)および第X因子プロテイナーゼ開裂部位を含む。ママスタチン発現細胞を好ましくは1%の血清含有培地中で培養し、ならし培地を回収し、ニッケルキレート樹脂に通す。His−融合タンパク質はカラムに付着し、50mMトリス(pH7.5)、0.1M NaClで洗浄し、ついで10単位/mlの第X因子プロテイナーゼを含むトリス−NaClでゆっくりと溶出する。これによりママスタチンはHis−融合から遊離される。ママスタチンを分子篩クロマトグラフィー、または上記のようにイオン交換クロマトグラフィーによって分離する。
上記明細書、実施例およびデータは、本発明の組成物の製造および使用の完全な記載を提供するものである。本発明の範囲から逸脱するこなく本発明の多くの態様を行うことが可能であるので、本発明は添付の特許請求の範囲に存在する。
【0157】
【表13−1】
【表13−2】
【表13−3】
【0158】
【図面の簡単な説明】
【図1】 真核細胞Cos-7細胞における組換えママスタチンの発現を示すウエスタンブロットである。
【図2】 昆虫細胞中のママスタチンの発現を示すイムノブロットである。
【図3】 イン・ビトロ転写および翻訳によって製造される組換えママスタチンによる***細胞増殖の阻害を示すイムノブロットである。
【図4】 ママスタチンcDNAでトランスフェクションしたCos-7細胞のならし培地での処置により、ヒト乳癌細胞増殖における増殖阻害を示すグラフである。
【図5】 ヒト正常***細胞および癌性***細胞における53、49、および44kDママスタチンの相対量を示すウエスタンブロットである。
【図6】 ママスタチンのホスファターゼ消化を示すイムノブロットである。
【図7】 ママスタチンの活性に及ぼすホスファターゼの影響を示すグラフである。
【図8】 ヒト正常***細胞および癌性***細胞からのママスタチンならびに正常細胞および癌性細胞の混合培養物中のママスタチンを示すウエスタンブロットである。
【図9】 ELISAによって分析された正常ヒト血清中のママスタチンを示すグラフである。
【図10】 ママスタチンのELISA標準曲線を示すグラフである。
【図11】 治療過程での乳癌患者におけるママスタチンレベルを示すグラフである。
【図12】 レトロウイルスによって誘発されたママスタチンの発現を示すウエスタンブロットである。
【図13】 ヌードマウスにおけるMCF7腫瘍細胞へのママスタチン治療の効果を示すグラフである。
【図14】 ヌードマウスにおける腫瘍細胞へのママスタチン治療の効果を示すグラフである。
【図15】 正常女性からの血液中のママスタチンと乳癌患者からの血液中のママスタチンの不在を示すドットブロットアッセイである。
【図16】 組換えママスタチンを発現する***細胞のイムノブロットである。
Claims (11)
- 配列番号:1の核酸配列のコーディング配列を含む、精製し単離した核酸組成物。
- 配列番号:2のアミノ酸配列を含む、精製し単離したタンパク質。
- 請求項1に記載の核酸組成物から製造される組換えタンパク質。
- 請求項1に記載の核酸組成物のコーディング配列を含むプラスミドまたはベクター。
- 請求項1に記載の組成物を含む、ママスタチンの核酸および/またはポリペプチドを検出するための癌診断キット。
- さらに抗−ママスタチン抗体を含む、請求項5に記載の診断キット。
- 請求項1に記載の組成物を含む医薬組成物。
- 配列番号:1の核酸配列または配列番号:2のアミノ酸配列を含む組成物。
- ***細胞癌腫の モニタリング方法であって、
配列番号:1の核酸配列または配列番号:2のアミノ酸配列の存在について患者の血液サンプルまたは組織サンプルを分析し、ついで
正常コントロールに比較してママスタチンの不在または低減を***細胞癌腫に相関させる
ことを含む方法。 - ヒト***細胞のインビトロでの増殖を抑制するための配列番号:1の核酸配列からなる核酸または配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質の使用。
- 乳癌の治療用医薬組成物の製造のための請求項1に記載の組成物または請求項2または3に記載のタンパク質の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/994,076 US6500937B1 (en) | 1996-10-03 | 1997-12-19 | Nucleotide sequence encoding a mammary cell growth inhibitor |
US08/994,076 | 1997-12-19 | ||
PCT/US1998/027147 WO1999032625A2 (en) | 1997-12-19 | 1998-12-18 | Nucleotide and protein sequence of mammastatin and methods of use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001526891A JP2001526891A (ja) | 2001-12-25 |
JP4441113B2 true JP4441113B2 (ja) | 2010-03-31 |
Family
ID=25540260
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000525544A Expired - Fee Related JP4441113B2 (ja) | 1997-12-19 | 1998-12-18 | ママスタチンのヌクレオチドおよびタンパク質配列およびその使用法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6500937B1 (ja) |
EP (1) | EP1037989B1 (ja) |
JP (1) | JP4441113B2 (ja) |
AT (1) | ATE364706T1 (ja) |
AU (1) | AU1935399A (ja) |
CA (1) | CA2315239C (ja) |
DE (1) | DE69837935T2 (ja) |
WO (1) | WO1999032625A2 (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6500937B1 (en) * | 1996-10-03 | 2002-12-31 | University Of Michigan | Nucleotide sequence encoding a mammary cell growth inhibitor |
CA2267095C (en) * | 1996-10-03 | 2010-08-10 | Biotherapies, Inc. | Nucleotide and protein sequence of mammastatin and methods of use |
BR0012301A (pt) * | 1999-06-18 | 2002-03-26 | Biotherapies Inc | Inibidores de crescimento de células epiteliais |
US6939714B2 (en) | 1999-06-18 | 2005-09-06 | Biotherapies, Inc. | Epithelial cell growth inhibitors |
AU6583700A (en) * | 1999-08-13 | 2001-03-13 | Oxford Glycosciences (Uk) Limited | Proteins, genes and their use for diagnosis and treatment of breast cancer |
AU2596901A (en) * | 1999-12-21 | 2001-07-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer |
WO2001071357A2 (en) * | 2000-03-20 | 2001-09-27 | Oxford Glycosciences (Uk) Limited | Diagnosis and treatment of breast cancer |
US20030212263A1 (en) * | 2000-06-19 | 2003-11-13 | The University Of Michigan | Mammastatin sequence variant C |
WO2002088750A2 (en) * | 2001-05-02 | 2002-11-07 | Oxford Glycosciences (Uk) Ltd | Proteins, genes and their use for diagnosis and treatment of breast cancer |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4379839A (en) | 1977-05-23 | 1983-04-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for detecting cancer |
US4753894A (en) | 1984-02-08 | 1988-06-28 | Cetus Corporation | Monoclonal anti-human breast cancer antibodies |
WO1989011492A1 (en) | 1988-05-20 | 1989-11-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Human mammary cell growth inhibitor and methods of production and use |
WO1989011491A1 (en) | 1988-05-20 | 1989-11-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Antibodies to human mammary cell growth inhibitor and methods of production and use |
US5878385A (en) * | 1996-09-16 | 1999-03-02 | Ergo Linguistic Technologies | Method and apparatus for universal parsing of language |
US6500937B1 (en) * | 1996-10-03 | 2002-12-31 | University Of Michigan | Nucleotide sequence encoding a mammary cell growth inhibitor |
CA2267095C (en) * | 1996-10-03 | 2010-08-10 | Biotherapies, Inc. | Nucleotide and protein sequence of mammastatin and methods of use |
BR0012301A (pt) | 1999-06-18 | 2002-03-26 | Biotherapies Inc | Inibidores de crescimento de células epiteliais |
-
1997
- 1997-12-19 US US08/994,076 patent/US6500937B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-18 AT AT98964170T patent/ATE364706T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-12-18 AU AU19353/99A patent/AU1935399A/en not_active Abandoned
- 1998-12-18 EP EP98964170A patent/EP1037989B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 JP JP2000525544A patent/JP4441113B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-18 DE DE69837935T patent/DE69837935T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 CA CA002315239A patent/CA2315239C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-18 WO PCT/US1998/027147 patent/WO1999032625A2/en active IP Right Grant
-
2000
- 2000-08-22 US US09/643,476 patent/US6599495B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-06-11 US US10/459,218 patent/US7256277B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-08-14 US US11/838,654 patent/US7816097B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-07-29 US US12/846,386 patent/US20110003318A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US7256277B2 (en) | 2007-08-14 |
JP2001526891A (ja) | 2001-12-25 |
EP1037989A2 (en) | 2000-09-27 |
AU1935399A (en) | 1999-07-12 |
US20080207506A1 (en) | 2008-08-28 |
US7816097B2 (en) | 2010-10-19 |
EP1037989B1 (en) | 2007-06-13 |
WO1999032625A3 (en) | 1999-09-16 |
WO1999032625A2 (en) | 1999-07-01 |
ATE364706T1 (de) | 2007-07-15 |
US6599495B1 (en) | 2003-07-29 |
US6500937B1 (en) | 2002-12-31 |
DE69837935T2 (de) | 2008-02-21 |
US20110003318A1 (en) | 2011-01-06 |
CA2315239A1 (en) | 1999-07-01 |
US20070082334A1 (en) | 2007-04-12 |
CA2315239C (en) | 2008-05-13 |
DE69837935D1 (de) | 2007-07-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7816097B2 (en) | Nucleotide and protein sequence of Mammastatin and methods of use | |
US20110039279A1 (en) | Methods and compositions for diagnosing breast cancer | |
JP2002525098A (ja) | ママグロビン、***特有の乳癌分泌タンパク質 | |
JP2002525098A5 (ja) | ||
WO1998014577A9 (en) | Nucleotide and protein sequence of mammastatin and methods of use | |
JPH10512158A (ja) | 膀胱の核マトリックスタンパク質ならびに細胞増殖性疾患の検出及び治療におけるその使用 | |
AU782473B2 (en) | Mammastatin diagnostics and therapeutics | |
MXPA99003100A (en) | Nucleotide and protein sequence of mammastatin and methods of use | |
US20050181418A1 (en) | Nuclear matrix proteins, polynucleotide sequences encoding them, and their use | |
EP0681480B1 (en) | Recognin vaccines | |
WO2000000503A1 (en) | Human az-1 gene, variants thereof and expressed gene products | |
Zhang et al. | Growth-factor stimulation reveals two mechanisms of retinoblastoma gene inactivation in human myelogenous leukemia cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051215 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070403 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070702 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070709 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070802 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070809 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070903 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070910 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070927 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070927 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090602 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091002 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20091130 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091222 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100108 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |