JP2001526891A - ママスタチンのヌクレオチドおよびタンパク質配列およびその使用法 - Google Patents
ママスタチンのヌクレオチドおよびタンパク質配列およびその使用法Info
- Publication number
- JP2001526891A JP2001526891A JP2000525544A JP2000525544A JP2001526891A JP 2001526891 A JP2001526891 A JP 2001526891A JP 2000525544 A JP2000525544 A JP 2000525544A JP 2000525544 A JP2000525544 A JP 2000525544A JP 2001526891 A JP2001526891 A JP 2001526891A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mamastatin
- cells
- kda
- protein
- breast
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/74—Inducing cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
特異的な***細胞インヒビターであるママスタチンをコードする核酸配列。ママスタチンは単一の核酸配列によってコードされ、自身は不活性でリン酸化されていない形態で約４４kDaの分子量を持つ。正常な***細胞は、約５３kDaおよび４９kDaの分子量を有する機能的なリン酸化した形態を発現する。転移性***細胞はママスタチンを発現しない、あるいは５３kDaまたは４９kDaのリン酸化形態を発現しない。乳癌細胞はリン酸化ママスタチンの投与によってその増殖を阻害される。
Description
【０００１】 （技術分野） 本発明は、乳癌の診断および治療用組成物および方法に関する。さらに詳しく
は、本発明は、乳癌の診断および治療に有用なタンパク質であるママスタチン（
Mammastatin）をコードする核酸配列に関する。
は、本発明は、乳癌の診断および治療に有用なタンパク質であるママスタチン（
Mammastatin）をコードする核酸配列に関する。
【０００２】 （背景技術） 乳癌は米国単独で毎年４５,０００人の女性を死亡させる疾患である。年間１ ８０,０００件を超える乳癌の新症例が診断され、８人に１人の女性が乳癌にな ると推定されている。これらの数値は、乳癌が今日の女性が直面する最も危険な
疾患のうちの１つであることを示している。癌の研究では、乳癌の原因を決定す
ることができず、適当な癌療法または妨害法を見出さなかった。
疾患のうちの１つであることを示している。癌の研究では、乳癌の原因を決定す
ることができず、適当な癌療法または妨害法を見出さなかった。
【０００３】 乳癌と診断された女性は、外科的療法、ホルモン療法、化学療法および放射線
療法により治療されるであろう。患者が転移性乳癌を患っているならば、脳、骨
および肝臓などの離れた領域における癌を除去するために、放射線および多用量
の化学療法が必要でなる。
療法により治療されるであろう。患者が転移性乳癌を患っているならば、脳、骨
および肝臓などの離れた領域における癌を除去するために、放射線および多用量
の化学療法が必要でなる。
【０００４】 乳癌の治療に利用可能な現在の療法は、有毒、危険、高価であり、その多くは
特に、転移性乳癌の治療に無効である。下記の表はチャーチル・リビングストン
（Churchill Livingston）、Clinical Oncology, 1995から抜粋したものであり 、現在の治療方法および予期される生存率に関して利用可能であるデータをまと
めている。
特に、転移性乳癌の治療に無効である。下記の表はチャーチル・リビングストン
（Churchill Livingston）、Clinical Oncology, 1995から抜粋したものであり 、現在の治療方法および予期される生存率に関して利用可能であるデータをまと
めている。
【０００５】
【表１】
【０００６】 現在、リンパ節または遠位部位に転移した乳癌の長期治療に有効である療法は
全くない。局所疾患は、癌全部を除去することができるなら、外科的手術によっ
て有効に治療され得る。乳癌および転移性癌に由来する細胞の増殖を停止できる
乳癌の有効な新規の治療法が即急に必要である。そのような療法は局所の乳癌の
治療、転移性疾患の長期にわたる治療に有用であり、および腫瘍の外科的切除の
後の追跡治療として有用である。他の応用には、初期治療としておよび防御的使
用としての増殖インヒビターを含む。
全くない。局所疾患は、癌全部を除去することができるなら、外科的手術によっ
て有効に治療され得る。乳癌および転移性癌に由来する細胞の増殖を停止できる
乳癌の有効な新規の治療法が即急に必要である。そのような療法は局所の乳癌の
治療、転移性疾患の長期にわたる治療に有用であり、および腫瘍の外科的切除の
後の追跡治療として有用である。他の応用には、初期治療としておよび防御的使
用としての増殖インヒビターを含む。
【０００７】 ***Ｘ線写真、身体検査、ＣＡＴ−スキャン、および超音波などの乳癌の検出
方法は、乳癌の初期検出を有意に改善した。しかしながら、これらの方法を用い
て、疑わしい腫瘍はさらに、該腫瘍が良性または悪性であるかを決定するための
、および組織型および悪性の程度の決定を試みるための病理学的検査ために、外
科的切除をしなければならない。この病理学的診断は、以後の治療プロトコール
に何を使用するかを決定するために役立つ。
方法は、乳癌の初期検出を有意に改善した。しかしながら、これらの方法を用い
て、疑わしい腫瘍はさらに、該腫瘍が良性または悪性であるかを決定するための
、および組織型および悪性の程度の決定を試みるための病理学的検査ために、外
科的切除をしなければならない。この病理学的診断は、以後の治療プロトコール
に何を使用するかを決定するために役立つ。
【０００８】 乳癌に関して、適当な乳癌腫瘍マーカーが利用できないので、これらの方法は
一般的に決定的ではない。ＣＡ １５−３およびＣＡ ２７−２９などの利用可能
なマーカーは転移の指標として使用されるが、しかしながらそれらは特異的では
ない。例えば、新規のかつ特異的な乳癌マーカーを使用して、乳癌の有効かつ信
頼できる診断が可能である診断手段および方法の必要性が多大である。さらに、
乳癌の早期発見および早期診断用の信頼でき、かつ簡単な方法が顕著に必要とさ
れている。好ましくは、そのような早期発見方法は、乳癌の初期段階で乳癌を同
定し、進行した転移疾患による乳癌の進行を追跡し、ついで乳癌または進行した
疾患の罹患傾向を診断するであろう。より好ましくは、該診断方法は、例えば血
液などの体液などの分析によって組織生検なしに使用することができる。
一般的に決定的ではない。ＣＡ １５−３およびＣＡ ２７−２９などの利用可能
なマーカーは転移の指標として使用されるが、しかしながらそれらは特異的では
ない。例えば、新規のかつ特異的な乳癌マーカーを使用して、乳癌の有効かつ信
頼できる診断が可能である診断手段および方法の必要性が多大である。さらに、
乳癌の早期発見および早期診断用の信頼でき、かつ簡単な方法が顕著に必要とさ
れている。好ましくは、そのような早期発見方法は、乳癌の初期段階で乳癌を同
定し、進行した転移疾患による乳癌の進行を追跡し、ついで乳癌または進行した
疾患の罹患傾向を診断するであろう。より好ましくは、該診断方法は、例えば血
液などの体液などの分析によって組織生検なしに使用することができる。
【０００９】 ヒト***組織は月経の開始および各月経周期の間で、増殖活動の突発を被る。
***組織および腫瘍へのエストロゲンの効果に関する研究は、エストロゲンが乳
房組織の第１次増殖開始因子であることを示唆している。エストラジオール感受
性増殖因子が特徴付けられた。さらに、本来ホルモンの影響を受けない***細胞
増殖因子もまた記載される。
***組織および腫瘍へのエストロゲンの効果に関する研究は、エストロゲンが乳
房組織の第１次増殖開始因子であることを示唆している。エストラジオール感受
性増殖因子が特徴付けられた。さらに、本来ホルモンの影響を受けない***細胞
増殖因子もまた記載される。
【００１０】 ***組織増殖に刺激的影響を及ぼすことが示されている特異的な増殖因子は、
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）および
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）αが挙げられる。他方、ＴＧＦ‐βは
***組織の増殖を抑圧することを示している。
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）および
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）αが挙げられる。他方、ＴＧＦ‐βは
***組織の増殖を抑圧することを示している。
【００１１】 ***細胞増殖の調節は乳癌の診断および治療に非常に重要である。***組織の
新生物的増殖は、調べなければ、年間何千人もの女性の死因である調節不可能に
増殖する悪性腫瘍に進行する。***細胞増殖を特異的に抑圧することができる増
殖阻害因子は、乳癌の診断および治療において使用するため、機能的手段を提供
する。
新生物的増殖は、調べなければ、年間何千人もの女性の死因である調節不可能に
増殖する悪性腫瘍に進行する。***細胞増殖を特異的に抑圧することができる増
殖阻害因子は、乳癌の診断および治療において使用するため、機能的手段を提供
する。
【００１２】 従って、特異的な***細胞増殖インヒビターを単離し、特徴付け、その核酸配
列およびアミノ酸配列を同定し、ついで精製したタンパク質としてインヒビター
を組換え的に発現させることは非常に有効である。該核酸配列および／または組
換え的に製造したインヒビターを使用した診断および治療方法は乳癌の診断およ
び治療において非常に利用性が高い。
列およびアミノ酸配列を同定し、ついで精製したタンパク質としてインヒビター
を組換え的に発現させることは非常に有効である。該核酸配列および／または組
換え的に製造したインヒビターを使用した診断および治療方法は乳癌の診断およ
び治療において非常に利用性が高い。
【００１３】 （発明の要約） 特異的な***細胞増殖インヒビターであるママスタチンを正常ヒト***細胞か
ら単離し、ついで特徴付けた。現在ママスタチンは正常***細胞により製造され
るが乳癌細胞では製造されないことがわかっている。さらに、現在、血液中のマ
マスタチンの減少または不在が乳癌の存在と相関することもわかっている。活性
化ママスタチンの投与により乳癌細胞の増殖が妨害される。
ら単離し、ついで特徴付けた。現在ママスタチンは正常***細胞により製造され
るが乳癌細胞では製造されないことがわかっている。さらに、現在、血液中のマ
マスタチンの減少または不在が乳癌の存在と相関することもわかっている。活性
化ママスタチンの投与により乳癌細胞の増殖が妨害される。
【００１４】 ママスタチンをコードする核酸配列は、現在のところクローニングされ、シー
クエンシングされ、ついで宿主細胞中で組換え的に***細胞の増殖の活性インヒ
ビターとして発現されている。単離し特徴付けられた核酸配列（配列番号：１）
およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２）は乳癌の診断および治療において
使用するための独特かつ特異的な手段を提供する。
クエンシングされ、ついで宿主細胞中で組換え的に***細胞の増殖の活性インヒ
ビターとして発現されている。単離し特徴付けられた核酸配列（配列番号：１）
およびその推定アミノ酸配列（配列番号：２）は乳癌の診断および治療において
使用するための独特かつ特異的な手段を提供する。
【００１５】 本発明は***細胞増殖、特に乳癌細胞増殖の特異的なタンパク質インヒビター
であるママスタチンをコードする単離し、精製した核酸配列を提供する。本発明
はまた、ママスタチンの核酸配列、ママスタチンのアミノ酸配列および精製した
***細胞増殖インヒビターを製造し、乳癌を診断および治療するためのママスタ
チン核酸またはアミノ酸配列を利用する方法、キットおよび組成物を含むプラス
ミドおよびベクターを含む。本発明組成物には、ママスタチン核酸配列およびそ
のＲＮＡ産物に特異的にハイブリダイズするプローブおよびプライマーを含む。 本発明はママスタチンを投与することによって乳癌を治療する方法をさらに含
む。
であるママスタチンをコードする単離し、精製した核酸配列を提供する。本発明
はまた、ママスタチンの核酸配列、ママスタチンのアミノ酸配列および精製した
***細胞増殖インヒビターを製造し、乳癌を診断および治療するためのママスタ
チン核酸またはアミノ酸配列を利用する方法、キットおよび組成物を含むプラス
ミドおよびベクターを含む。本発明組成物には、ママスタチン核酸配列およびそ
のＲＮＡ産物に特異的にハイブリダイズするプローブおよびプライマーを含む。 本発明はママスタチンを投与することによって乳癌を治療する方法をさらに含
む。
【００１６】 （好ましい態様の詳細な記載）ママスタチン ママスタチンは正常ヒト***上皮細胞によって製造され分泌されるタンパク質
増殖インヒビターである。***細胞増殖インヒビターは正常ヒト***細胞の増殖
によってならし培地中に存在する阻害性タンパク質活性として最初は記載された
。阻害活性は正常ヒト***細胞からのならし培地中で同定されたが、ヒト乳癌細
胞の増殖によってならし培地中では同定されなかった。阻害活性はバイオアッセ
イと約５３、４９および４４kDa（アービン（Ervin, Paul R.）、ミシガン大学 博士論文、１９９５）の分子量を有する３つのタンパク質に存在する抗体の作成
によって決定した。
増殖インヒビターである。***細胞増殖インヒビターは正常ヒト***細胞の増殖
によってならし培地中に存在する阻害性タンパク質活性として最初は記載された
。阻害活性は正常ヒト***細胞からのならし培地中で同定されたが、ヒト乳癌細
胞の増殖によってならし培地中では同定されなかった。阻害活性はバイオアッセ
イと約５３、４９および４４kDa（アービン（Ervin, Paul R.）、ミシガン大学 博士論文、１９９５）の分子量を有する３つのタンパク質に存在する抗体の作成
によって決定した。
【００１７】 現在、特異的な***細胞増殖インヒビターであるママスタチンが、４９kDa〜 ５３kDaへ分子量をリン酸化により増加させる４４kDaのタンパク質として発現す
ることが決定された。リン酸化されていない４４kDaの形態（non-ph 44 kD form
）は活性インヒビターではないが、リン酸化した４９kDaおよび５３kDaの形態は
乳癌細胞の増殖を阻害する。活性５３および／または４９kDaリンタンパク質は 正常ヒト***細胞によって発現されるが、一般的に乳癌細胞では製造されない。
癌細胞の中にはリン酸化を欠如しており、不活性な４４kDaタンパク質を製造す るものもある。
ることが決定された。リン酸化されていない４４kDaの形態（non-ph 44 kD form
）は活性インヒビターではないが、リン酸化した４９kDaおよび５３kDaの形態は
乳癌細胞の増殖を阻害する。活性５３および／または４９kDaリンタンパク質は 正常ヒト***細胞によって発現されるが、一般的に乳癌細胞では製造されない。
癌細胞の中にはリン酸化を欠如しており、不活性な４４kDaタンパク質を製造す るものもある。
【００１８】 以下の表は正常なおよび癌性の細胞および組織中のママスタチンの発現および
活性を示すデータをまとめたものである。
活性を示すデータをまとめたものである。
【表２】
【００１９】 ヒト乳癌細胞での用量応答実験は、癌細胞増殖は１０ng/mlのママスタチンで ５０〜７０％阻害され、２５〜５０ng/mlで完全に停止されることを示している 。MDA-MB-435およびMDA-MB-231などの高度に転移性の細胞は増殖を停止させるた
めに５０ng/mlを必要とする。イン・ビトロおよびイン・ビボ臨床データ実験は 、該効果は可逆的であり、低濃度で癌細胞増殖を停止させるためには、インヒビ
ターの反復投与が必要であることを示唆している。しかしながら、５０ng/mlを 超えた用量で、ママスタチンは細胞壊死などのような組織学によって示されるよ
うに、アポトーシスを誘発するようである。
めに５０ng/mlを必要とする。イン・ビトロおよびイン・ビボ臨床データ実験は 、該効果は可逆的であり、低濃度で癌細胞増殖を停止させるためには、インヒビ
ターの反復投与が必要であることを示唆している。しかしながら、５０ng/mlを 超えた用量で、ママスタチンは細胞壊死などのような組織学によって示されるよ
うに、アポトーシスを誘発するようである。
【００２０】 ママスタチンは乳癌細胞増殖を阻害する天然に存在する増殖インヒビターであ
り、活性化ママスタチンを製造する腫瘍は全くないので、ママスタチン置換療法
は乳癌治療のための治療法として理想的である。以下の例で提供された臨床デー
タはママスタチン置換療法の有効性を証明する。
り、活性化ママスタチンを製造する腫瘍は全くないので、ママスタチン置換療法
は乳癌治療のための治療法として理想的である。以下の例で提供された臨床デー
タはママスタチン置換療法の有効性を証明する。
【００２１】 ママスタチンタンパク質をコードする核酸配列は、現在単離され、特徴付けら
れ、シークエンシングされ（配列番号：１）、全部で３つの（５３、４９、およ
び４４kDa）分子量のタンパク質をコードすると決定されており、「ママスタチ ン（Mammastatin）」と名づけられた。３形態の分子量における差異はタンパク 質のリン酸化の範囲が原因であると決定された。培養中のヒト正常***細胞（Ｎ
ＨＭＣ）によって製造されたママスタチンおよび組換え的に発現されたママスタ
チンはヒト乳癌細胞の増殖を阻害し、乳癌の治療における治療剤として有用であ
る。
れ、シークエンシングされ（配列番号：１）、全部で３つの（５３、４９、およ
び４４kDa）分子量のタンパク質をコードすると決定されており、「ママスタチ ン（Mammastatin）」と名づけられた。３形態の分子量における差異はタンパク 質のリン酸化の範囲が原因であると決定された。培養中のヒト正常***細胞（Ｎ
ＨＭＣ）によって製造されたママスタチンおよび組換え的に発現されたママスタ
チンはヒト乳癌細胞の増殖を阻害し、乳癌の治療における治療剤として有用であ
る。
【００２２】 正常女性からのヒト血清および乳癌患者からのヒト血清の分析は、ママスタチ
ンの減少した血液レベルは乳癌の進行と相関があることを示している。以下の実
施例中に記載したようにこの活性インヒビターの存在のための血液血清のスクリ
ーニングおよびモニタリングは特異的かつ有効な診断手段を提供する。
ンの減少した血液レベルは乳癌の進行と相関があることを示している。以下の実
施例中に記載したようにこの活性インヒビターの存在のための血液血清のスクリ
ーニングおよびモニタリングは特異的かつ有効な診断手段を提供する。
【００２３】核酸配列 ママスタチンＤＮＡをコードする核酸（配列番号：１）およびそれから導かれ
るアミノ酸配列（配列番号：２）を表１に示す。この配列は、以下の実施例でさ
らに詳しく記載するように、ヒト正常***細胞ｃＤＮＡライブラリーからのママ
スタチンｃＤＮＡのクローニングおよびシークエンシングによって同定した。ク
ロマトグラフィーによって精製されたインヒビターは、以前にはアミノ酸分析を
可能にするほど十分に単離されず、標準的技術によってタンパク質インヒビター
をシークエンシングする初期の試みは失敗した。クロマトグラフィーによって精
製されたインヒビタータンパク質に対して作成された抗体を使用するｃＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングの試みにより、活性のあるクローンを製造できなか
った。これらの問題を克服するために、ママスタチンをコードする遺伝子を、ペ
プチドシークエンシングおよびヒト正常***細胞ｃＤＮＡライブラリーの縮重オ
リゴヌクレオチドスクリーニングにより同定した。
るアミノ酸配列（配列番号：２）を表１に示す。この配列は、以下の実施例でさ
らに詳しく記載するように、ヒト正常***細胞ｃＤＮＡライブラリーからのママ
スタチンｃＤＮＡのクローニングおよびシークエンシングによって同定した。ク
ロマトグラフィーによって精製されたインヒビターは、以前にはアミノ酸分析を
可能にするほど十分に単離されず、標準的技術によってタンパク質インヒビター
をシークエンシングする初期の試みは失敗した。クロマトグラフィーによって精
製されたインヒビタータンパク質に対して作成された抗体を使用するｃＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングの試みにより、活性のあるクローンを製造できなか
った。これらの問題を克服するために、ママスタチンをコードする遺伝子を、ペ
プチドシークエンシングおよびヒト正常***細胞ｃＤＮＡライブラリーの縮重オ
リゴヌクレオチドスクリーニングにより同定した。
【００２４】 ヒト正常***細胞によって製造された濃縮タンパク質は、クロマトグラフィー
によって精製したインヒビターに対して作成された抗−ママスタチン抗体を用い
てアフィニティー精製された。精製したタンパク質画分を、トレーサーとして少
量（１０5ｃｐｍ）の32Ｐ標識で補った。標識したトレーサータンパク質は、以 下の実施例により詳しく記載するように32Ｐの存在下で増殖した細胞のならし培
地から精製した。該タンパク質は臭化シアンで開裂し、ついで開裂した断片を32
Ｐ標識したタンパク質のオートラジオグラフィー分析によってママスタチンとし
て同定した。開裂により製造された最も豊富な標識されたペプチドがシークエン
シングされた。
によって精製したインヒビターに対して作成された抗−ママスタチン抗体を用い
てアフィニティー精製された。精製したタンパク質画分を、トレーサーとして少
量（１０5ｃｐｍ）の32Ｐ標識で補った。標識したトレーサータンパク質は、以 下の実施例により詳しく記載するように32Ｐの存在下で増殖した細胞のならし培
地から精製した。該タンパク質は臭化シアンで開裂し、ついで開裂した断片を32
Ｐ標識したタンパク質のオートラジオグラフィー分析によってママスタチンとし
て同定した。開裂により製造された最も豊富な標識されたペプチドがシークエン
シングされた。
【００２５】 独特のアミノ酸配列（配列番号：３および４）を有する選択された２つのタン
パク質は、縮重オリゴヌクレオチドを製造するために使用される。ついで、縮重
オリゴヌクレオチドを、ヒト正常***細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グするのに使用した。
パク質は、縮重オリゴヌクレオチドを製造するために使用される。ついで、縮重
オリゴヌクレオチドを、ヒト正常***細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グするのに使用した。
【００２６】 標識されたpMammAである１つのクローンは、両方の選択されたペプチドからオ
リゴヌクレオチドにハイブリダイズする。このクローンは、さらに特徴付けられ
、抗−ママスタチン抗体によって認識された発現のタンパク質を発現することが
示された。該クローンは、ノーザンブロット分析、イン・ビトロ転写および翻訳
アッセイおよび増殖阻害アッセイによってママスタチンをコードすると査定され
た。ママスタチンｃＤＮＡインサート（pMammB）を含むpcDNA3クローンをアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection
) に寄託し、受託番号第９７５４１号を付与された。pMammB（配列番号：２）か
ら発現した組換えタンパク質は、トランスフェクションした哺乳類細胞株のイム
ノブロットによって検出され、ついで乳癌細胞に対する増殖阻害活性を保有する
ことを示した。ｃＤＮＡクローンを完全にシークエンシングし（実施例３参照）
、BLAST DNAデータベースに対して唯一のものであるとわかった。
リゴヌクレオチドにハイブリダイズする。このクローンは、さらに特徴付けられ
、抗−ママスタチン抗体によって認識された発現のタンパク質を発現することが
示された。該クローンは、ノーザンブロット分析、イン・ビトロ転写および翻訳
アッセイおよび増殖阻害アッセイによってママスタチンをコードすると査定され
た。ママスタチンｃＤＮＡインサート（pMammB）を含むpcDNA3クローンをアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection
) に寄託し、受託番号第９７５４１号を付与された。pMammB（配列番号：２）か
ら発現した組換えタンパク質は、トランスフェクションした哺乳類細胞株のイム
ノブロットによって検出され、ついで乳癌細胞に対する増殖阻害活性を保有する
ことを示した。ｃＤＮＡクローンを完全にシークエンシングし（実施例３参照）
、BLAST DNAデータベースに対して唯一のものであるとわかった。
【００２７】 本発明の核酸配列（配列番号：１）はヒトママスタチンをコードし、それはヒ
ト正常および癌性の***細胞の増殖を阻害する機能を果たす。「ヒト」なる語は
、タンパク質の源を制限することを意図しているわけでなく、またヒト細胞およ
び組織にのみ与える阻害効果を制限することを意図しているわけではない。個体
のママスタチンの核酸配列およびアミノ酸配列は幾分、タンパク質の構造または
機能を変えずに変化するかもしれない。さらに、生化学の分野の当業者であれば
、核酸配列またはアミノ酸配列の修飾が分子の構造および／または機能を変更せ
ずに起こるかもしれないことを認識するであろう。例えば，該核酸配列は修飾さ
れ、ある特定の細胞宿主の最適な既知のコドンを用いて所望のアミノ酸配列の最
適発現を可能にする。 本発明の核酸配列は乳癌の治療における治療法および診断方法において使用す
るため、高度に精製されたママスタチンの大容量を製造するのに有用である。
ト正常および癌性の***細胞の増殖を阻害する機能を果たす。「ヒト」なる語は
、タンパク質の源を制限することを意図しているわけでなく、またヒト細胞およ
び組織にのみ与える阻害効果を制限することを意図しているわけではない。個体
のママスタチンの核酸配列およびアミノ酸配列は幾分、タンパク質の構造または
機能を変えずに変化するかもしれない。さらに、生化学の分野の当業者であれば
、核酸配列またはアミノ酸配列の修飾が分子の構造および／または機能を変更せ
ずに起こるかもしれないことを認識するであろう。例えば，該核酸配列は修飾さ
れ、ある特定の細胞宿主の最適な既知のコドンを用いて所望のアミノ酸配列の最
適発現を可能にする。 本発明の核酸配列は乳癌の治療における治療法および診断方法において使用す
るため、高度に精製されたママスタチンの大容量を製造するのに有用である。
【００２８】抗ママスタチン抗体 ： いくつかの抗−ママスタチン抗体が製造され、特徴付けれられた。例えば、１
９８９年１１月３０日に公開されたＰＣＴ出願公開公報ＷＯ８９／１１４９１号
参照。これらの抗体は、クロマトグラフィーによって精製されたインヒビタータ
ンパク質に対して作成され、***細胞増殖にママスタチンタンパク質の阻害効果
を与えるのを妨げることが示されている。
９８９年１１月３０日に公開されたＰＣＴ出願公開公報ＷＯ８９／１１４９１号
参照。これらの抗体は、クロマトグラフィーによって精製されたインヒビタータ
ンパク質に対して作成され、***細胞増殖にママスタチンタンパク質の阻害効果
を与えるのを妨げることが示されている。
【００２９】 利用可能な抗−ママスタチン抗体は、ネオマーカーズ（Neomarkers）（フリー
モント（Freemont）、カリフォルニア）より市販されて利用できる７Ｇ６および
３Ｃ６および６Ｂ８を含む。６Ｂ８抗体を作成するハイブリドーマ細胞はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ１０１５２
号）から入手可能である。これらの各抗体はママスタチンの全部で３つの分子量
形態のものに結合し、ドットブロットおよびウエスタンブロットを含む免疫学的
アッセイにおいて有用である。該７Ｇ６抗体は縮重したタンパク質サンプルのウ
エスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡ分析に好ましい。該抗体３Ｇ６および６
Ｂ８はＥＬＩＳＡアッセイ、例えば実施例に具体的に記載した条件下でのアッセ
イにおいて使用されるであろう。
モント（Freemont）、カリフォルニア）より市販されて利用できる７Ｇ６および
３Ｃ６および６Ｂ８を含む。６Ｂ８抗体を作成するハイブリドーマ細胞はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ受託番号第ＨＢ１０１５２
号）から入手可能である。これらの各抗体はママスタチンの全部で３つの分子量
形態のものに結合し、ドットブロットおよびウエスタンブロットを含む免疫学的
アッセイにおいて有用である。該７Ｇ６抗体は縮重したタンパク質サンプルのウ
エスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡ分析に好ましい。該抗体３Ｇ６および６
Ｂ８はＥＬＩＳＡアッセイ、例えば実施例に具体的に記載した条件下でのアッセ
イにおいて使用されるであろう。
【００３０】 さらなる抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に関して知られ
る標準的方法を用いて製造され得る。抗体製造のために使用した抗原はＮＨＭＣ
の培養または組換え的に発現されたママスタチンから得られるかもしれない。
る標準的方法を用いて製造され得る。抗体製造のために使用した抗原はＮＨＭＣ
の培養または組換え的に発現されたママスタチンから得られるかもしれない。
【００３１】診断方法 本発明はさらに、組織、細胞および液体を含む患者のサンプル中の活性ある阻
害性ママスタチンを検出するためのイン・ビトロアッセイを提供する。乳癌およ
び進行性転移性疾患は、患者のサンプル中のママスタチンタンパク質の存在およ
び型とヒト正常***細胞または癌性***細胞のママスタチンタンパク質の存在お
よび型との相関によって診断される。患者の血液または組織サンプルは、ママス
タチンタンパク質、例えば豊富なママスタチンタンパク質および／またはママス
タチンの分子量形態などに関して分析される。以下で議論するように、特に高分
子量のママスタチンのリン酸化された形態であるママスタチンの存在または喪失
は乳癌と相関があり、かつ進行した転移性の疾患の指標である。
害性ママスタチンを検出するためのイン・ビトロアッセイを提供する。乳癌およ
び進行性転移性疾患は、患者のサンプル中のママスタチンタンパク質の存在およ
び型とヒト正常***細胞または癌性***細胞のママスタチンタンパク質の存在お
よび型との相関によって診断される。患者の血液または組織サンプルは、ママス
タチンタンパク質、例えば豊富なママスタチンタンパク質および／またはママス
タチンの分子量形態などに関して分析される。以下で議論するように、特に高分
子量のママスタチンのリン酸化された形態であるママスタチンの存在または喪失
は乳癌と相関があり、かつ進行した転移性の疾患の指標である。
【００３２】 ママスタチンの分析は、好ましくは、抗−ママスタチン抗体を用い、患者の血
液サンプルのＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析を含むイムノアッセイに
より行う。好ましくは、組換えママスタチンの標準は、信頼可能なインヒビター
レベルの量に関する標準曲線を提供するように使用される。そのようなイムノア
ッセイは以下の実施例に示すドットブロットアッセイおよびウエスタンブロット
アッセイによって例示される。本発明の別の好ましい態様において、腫瘍生検の
ような組織サンプルは免疫組織化学または患者の腫瘍細胞を培養することおよび
ママスタチンの発現のための培養物を試験することによって分析される。
液サンプルのＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット分析を含むイムノアッセイに
より行う。好ましくは、組換えママスタチンの標準は、信頼可能なインヒビター
レベルの量に関する標準曲線を提供するように使用される。そのようなイムノア
ッセイは以下の実施例に示すドットブロットアッセイおよびウエスタンブロット
アッセイによって例示される。本発明の別の好ましい態様において、腫瘍生検の
ような組織サンプルは免疫組織化学または患者の腫瘍細胞を培養することおよび
ママスタチンの発現のための培養物を試験することによって分析される。
【００３３】 特に好ましい態様において、乳癌の診断用アッセイには少なくとも２つの特異
的な抗体を含む：抗−サイトケラチン抗体などの上皮組織のサンプルとして採取
された***組織を同定するための抗体および抗−ママスタチン抗体である。例え
ば、イムノブロット形式を用いて，乳癌細胞を含むと疑われる組織をホモジナイ
ズし、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、膜にトランスファーし、抗−ケラチンお
よび抗−ママスタチン抗体の両方で調べる。ペルオキシダーゼまたはアルカリホ
スファターゼなどの適当なマーカーシステムにコンジュゲートさせたアイソタイ
プ特異的第２抗体を使用して、結合した抗体を検出する。ついで、結合した第１
および第２抗体を含む膜を公知の比色または蛍光光度法技術を用いて発色させ、
公知の方法によって定量する。
的な抗体を含む：抗−サイトケラチン抗体などの上皮組織のサンプルとして採取
された***組織を同定するための抗体および抗−ママスタチン抗体である。例え
ば、イムノブロット形式を用いて，乳癌細胞を含むと疑われる組織をホモジナイ
ズし、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで分離し、膜にトランスファーし、抗−ケラチンお
よび抗−ママスタチン抗体の両方で調べる。ペルオキシダーゼまたはアルカリホ
スファターゼなどの適当なマーカーシステムにコンジュゲートさせたアイソタイ
プ特異的第２抗体を使用して、結合した抗体を検出する。ついで、結合した第１
および第２抗体を含む膜を公知の比色または蛍光光度法技術を用いて発色させ、
公知の方法によって定量する。
【００３４】 最も好ましい態様において、抗−ママスタチン抗体を用いて該サンプルをウエ
スタンブロットなどによりママスタチンのリン酸化に関して分析する。高分子量
（５３／４９kDa）ママスタチンの減少または不在が乳癌の進行と相関がある。
スタンブロットなどによりママスタチンのリン酸化に関して分析する。高分子量
（５３／４９kDa）ママスタチンの減少または不在が乳癌の進行と相関がある。
【００３５】組換え発現ベクターおよび形質転換した細胞 本発明の組換え発現ベクターは、精製ママスタチンタンパク質およびその部分
の製造および増幅に、および診断法および治療法において使用されるママスタチ
ンタンパク質およびその部分の簡易単離に有用である。
の製造および増幅に、および診断法および治療法において使用されるママスタチ
ンタンパク質およびその部分の簡易単離に有用である。
【００３６】 2.434kbママスタチンcDNA（配列番号：１）の全部またはその一部などの標的 配列は、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞に関してはpＵＣ１８、pKC３３０、pBR３ ２２、ｐKK１７７−３、ｐＥＴ−３、ｐｃＤＮＡ３（イン・ビトロゲン（In Vit
rogen））などの適当な核酸配列発現ベクターにクローニングされ、および昆虫 細胞における発現にはpＡｃＤ３Ｘバキュロウイルス発現ベクター（ファーミン ギン（PharMingin）、サン・ディエゴ、カリフォルニア）にクローニングされ、
標準的な方法によって公知のシステムにクローニングされる。市販されており利
用可能な発現ベクターは、標的配列が転写および翻訳調節領域へ作動可能に結合
するようなベクターの部位へのクローニングのため提供する。
rogen））などの適当な核酸配列発現ベクターにクローニングされ、および昆虫 細胞における発現にはpＡｃＤ３Ｘバキュロウイルス発現ベクター（ファーミン ギン（PharMingin）、サン・ディエゴ、カリフォルニア）にクローニングされ、
標準的な方法によって公知のシステムにクローニングされる。市販されており利
用可能な発現ベクターは、標的配列が転写および翻訳調節領域へ作動可能に結合
するようなベクターの部位へのクローニングのため提供する。
【００３７】 ついで、リン酸カルシウム法、リポソーム媒介形質転換、プロトプラスト形質
転換、エレクトロポレーションなどの公知の方法を用いて適当な宿主細胞に発現
ベクターが導入される。適当な宿主細胞には、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞、Hi
gh 5およびSF9昆虫細胞、バキュロウイルスおよび酵母細胞を挙げられる。他の 宿主細胞には、大腸菌（E.coli）DH5αなどの大腸菌株、およびサルモネラ・テ ィフィムリウム（Salmonella Typhimurium）などの無毒性同遺伝子型サルモネラ
種のアデニル酸シクラーゼを欠乏した欠失変異体およびcAMP受容体タンパク質、
異種遺伝子内のサルモネラ変異体およびBio/Tech, 6: 693 (1988)に記載される ような他のサルモネラワクチン株を挙げられる。
転換、エレクトロポレーションなどの公知の方法を用いて適当な宿主細胞に発現
ベクターが導入される。適当な宿主細胞には、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞、Hi
gh 5およびSF9昆虫細胞、バキュロウイルスおよび酵母細胞を挙げられる。他の 宿主細胞には、大腸菌（E.coli）DH5αなどの大腸菌株、およびサルモネラ・テ ィフィムリウム（Salmonella Typhimurium）などの無毒性同遺伝子型サルモネラ
種のアデニル酸シクラーゼを欠乏した欠失変異体およびcAMP受容体タンパク質、
異種遺伝子内のサルモネラ変異体およびBio/Tech, 6: 693 (1988)に記載される ような他のサルモネラワクチン株を挙げられる。
【００３８】 好ましくは、該細胞宿主は真核細胞であり、適当な折り畳みおよびリン酸化し
た活性型インヒビターを製造するためのキナーゼ活性を持つタンパク質を発現す
ることができる。宿主細胞は、ママスタチンをコードするｃＤＮＡでトランスフ
ェクションすることによってスクリーニングされるであろう。形質転換した細胞
によって製造されたタンパク質の分析は、例えば、イムノブロットにより、およ
び以下の実施例に記載するように、例えばＭＣＦ７細胞増殖などの***細胞の増
殖を阻害するためのタンパク質の能力によって潜在的に宿主細胞になり得るシス
テムをスクリーニングするのに使用することができる。
た活性型インヒビターを製造するためのキナーゼ活性を持つタンパク質を発現す
ることができる。宿主細胞は、ママスタチンをコードするｃＤＮＡでトランスフ
ェクションすることによってスクリーニングされるであろう。形質転換した細胞
によって製造されたタンパク質の分析は、例えば、イムノブロットにより、およ
び以下の実施例に記載するように、例えばＭＣＦ７細胞増殖などの***細胞の増
殖を阻害するためのタンパク質の能力によって潜在的に宿主細胞になり得るシス
テムをスクリーニングするのに使用することができる。
【００３９】 標的核酸配列で形質転換された宿主細胞をコロニーハイブリダイゼーションま
たはママスタチンタンパク質に特異的な抗体との応答性を含む多様な方法によっ
てスクリーニングする。形質転換した細胞は、pcＤＮＡ３または他のプラスミド
またはママスタチンをコードする核酸配列を含む他のベクターを運搬する適当な
宿主細胞である。そのような１つのプラスミドはpMammAからの２.４kbBamHI-Xho
Iインサートを運搬するpcＤＮＡプラスミド（pMammＢ）であり、メリーランド州
ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９６年２月
２２日に寄託し、受託番号第９７４５１号を付与されている（実施例５参照）。
たはママスタチンタンパク質に特異的な抗体との応答性を含む多様な方法によっ
てスクリーニングする。形質転換した細胞は、pcＤＮＡ３または他のプラスミド
またはママスタチンをコードする核酸配列を含む他のベクターを運搬する適当な
宿主細胞である。そのような１つのプラスミドはpMammAからの２.４kbBamHI-Xho
Iインサートを運搬するpcＤＮＡプラスミド（pMammＢ）であり、メリーランド州
ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９６年２月
２２日に寄託し、受託番号第９７４５１号を付与されている（実施例５参照）。
【００４０】 特異的な標的DNA配列を含む発現ベクターは、ママスタチンタンパク質の全部 または一部をタンパク質製造用細胞宿主に挿入することによるイン・ビトロ転写
および翻訳よって製造するために使用される。発現ベクター系から製造されたタ
ンパク質は正常および癌性の***細胞の増殖を阻害する（実施例７参照）。例え
ば、該ベクターでトランスフェクションされたCos7宿主細胞などの真核細胞は、
ならし培地中で、ママスタチンを発現および分泌する。ならし培地は正常および
癌性の***細胞の増殖を阻害する（実施例８参照）。
および翻訳よって製造するために使用される。発現ベクター系から製造されたタ
ンパク質は正常および癌性の***細胞の増殖を阻害する（実施例７参照）。例え
ば、該ベクターでトランスフェクションされたCos7宿主細胞などの真核細胞は、
ならし培地中で、ママスタチンを発現および分泌する。ならし培地は正常および
癌性の***細胞の増殖を阻害する（実施例８参照）。
【００４１】アミノ酸配列 ママスタチンタンパク質（配列番号：２）は、核酸配列（配列番号：１）から
推定される配列を有する約２４００アミノ酸残基のポリペプチドであり、表１に
示す。クローニングされたママスタチン核酸配列（配列番号：１）から発現され
るタンパク質は乳癌細胞（MCF-7)の増殖を阻害する。
推定される配列を有する約２４００アミノ酸残基のポリペプチドであり、表１に
示す。クローニングされたママスタチン核酸配列（配列番号：１）から発現され
るタンパク質は乳癌細胞（MCF-7)の増殖を阻害する。
【００４２】 組換えママスタチンタンパク質は、精製形態でかつ大量に有効に製造すること
ができる。精製した組換えママスタチンは、患者のサンプル中でインヒビターの
診断アッセイのための信頼できる標準として有用である。組換えママスタチンタ
ンパク質はまた、乳癌細胞の増殖を阻害または妨害するための精製された治療剤
として有用でもある。
ができる。精製した組換えママスタチンは、患者のサンプル中でインヒビターの
診断アッセイのための信頼できる標準として有用である。組換えママスタチンタ
ンパク質はまた、乳癌細胞の増殖を阻害または妨害するための精製された治療剤
として有用でもある。
【００４３】治療的使用 治療的使用のためのママスタチンタンパク質は、無血清条件下または組換え手
段によるＮＨＭＣ培養物から製造される。ママスタチンリンタンパク質は治療的
に使用され、例えば乳癌の治療における***細胞の増殖を阻害する。好ましくは
、ママスタチンは該タンパク質のリン酸化を達成するために高等真核細胞におい
て製造される。組換えママスタチンタンパク質は宿主細胞または合成手段によっ
て製造する。
段によるＮＨＭＣ培養物から製造される。ママスタチンリンタンパク質は治療的
に使用され、例えば乳癌の治療における***細胞の増殖を阻害する。好ましくは
、ママスタチンは該タンパク質のリン酸化を達成するために高等真核細胞におい
て製造される。組換えママスタチンタンパク質は宿主細胞または合成手段によっ
て製造する。
【００４４】 機能的なママスタチンを公知の方法によって患者に投与し、リンタンパク質の
投与に関しては好ましくは注入によって投与し、血流におけるインヒビターのレ
ベルを増加し、***細胞とインヒビターの相互作用を高める。 該タンパク質は、リン酸化タンパク質治療剤の送達に関する当該技術分野にお
いて公知の方法によって患者に送達されてよい。概して、該インヒビターはデリ
バリービヒクルと混合し、注入によって投与される。
投与に関しては好ましくは注入によって投与し、血流におけるインヒビターのレ
ベルを増加し、***細胞とインヒビターの相互作用を高める。 該タンパク質は、リン酸化タンパク質治療剤の送達に関する当該技術分野にお
いて公知の方法によって患者に送達されてよい。概して、該インヒビターはデリ
バリービヒクルと混合し、注入によって投与される。
【００４５】 投与されるべきインヒビターの用量は当業者によって決定され、治療モダリテ
ィー（modality）の型および疾患の程度によって変化するであろう。ママスタチ
ンは、１０ng／mlの濃度で乳癌細胞の約５０％を阻害し、イン・ビトロで約２０
−２５ng／mlで増殖を停止し、有用な治療投与量範囲は１日用量約２.５μｇか ら約２５０μｇの投与である。好ましくは、約１２５μｇ／日の投与量である。
投与の目的は、生理学的範囲からわずかに高い範囲（５０〜７５ng／ml）で最終
的な身体用量となることである。インヒビターの高用量（>５０ng／ml）により 、処理細胞の組織化学にみられるようにアポトーシスが誘発される。臨床的使用
に関して、好ましい用量の範囲は、転移性疾患の初期治療のために約５００ng／
mlであり、その後約５０ng／mlの維持用量となる。以下の実施例において報告さ
れた最初の臨床研究は、約５０ng／ml〜約７５０ng／mlの１日投与量がステージ
IVの乳癌患者における寛解を誘発するのに十分であることを示している。
ィー（modality）の型および疾患の程度によって変化するであろう。ママスタチ
ンは、１０ng／mlの濃度で乳癌細胞の約５０％を阻害し、イン・ビトロで約２０
−２５ng／mlで増殖を停止し、有用な治療投与量範囲は１日用量約２.５μｇか ら約２５０μｇの投与である。好ましくは、約１２５μｇ／日の投与量である。
投与の目的は、生理学的範囲からわずかに高い範囲（５０〜７５ng／ml）で最終
的な身体用量となることである。インヒビターの高用量（>５０ng／ml）により 、処理細胞の組織化学にみられるようにアポトーシスが誘発される。臨床的使用
に関して、好ましい用量の範囲は、転移性疾患の初期治療のために約５００ng／
mlであり、その後約５０ng／mlの維持用量となる。以下の実施例において報告さ
れた最初の臨床研究は、約５０ng／ml〜約７５０ng／mlの１日投与量がステージ
IVの乳癌患者における寛解を誘発するのに十分であることを示している。
【００４６】 活性化ママスタチンがリン酸化タンパク質であるため、患者の血液中でママス
タチンの増殖阻害レベルを維持するためにインヒビターの複数の投与が必要であ
ろうことが予期される。また、ママスタチンは一般的に細胞殺傷剤よりは細胞増
殖抑制性剤として機能するので、該インヒビターの最大効果は、乳癌患者におけ
るインヒビターレベルの一定の維持を必要とすると予期される。
タチンの増殖阻害レベルを維持するためにインヒビターの複数の投与が必要であ
ろうことが予期される。また、ママスタチンは一般的に細胞殺傷剤よりは細胞増
殖抑制性剤として機能するので、該インヒビターの最大効果は、乳癌患者におけ
るインヒビターレベルの一定の維持を必要とすると予期される。
【００４７】 その好ましい使用において、ママスタチンは腫瘍の寛解を誘発するための（> ５０ng／ml、好ましくは５０〜５００ng／ml）高用量で投与される。癌細胞増殖
を妨害するためには、より低い維持用量（>５０ng／ml、好ましくは２０〜５０n
g／ml）が使用される。
を妨害するためには、より低い維持用量（>５０ng／ml、好ましくは２０〜５０n
g／ml）が使用される。
【００４８】 ステージIVの乳癌患者において投与されたママスタチンでの臨床経験は、有用
な用量とは血液中のママスタチンの生理学的レベルを維持するものであることを
示す。投与は、毎日が好ましく、しかし例えば、持続的な注入、徐放性補給（de
pot）、または２−３日ごとに１回の注入などによってもよい。逸話としての証 拠は、持続的な投与はフィードバック阻害を誘発し、従って好ましい投与計画は
約２５〜２８日間毎日ママスタチンを投与した後、２〜５日投与をやめることを
示唆する。
な用量とは血液中のママスタチンの生理学的レベルを維持するものであることを
示す。投与は、毎日が好ましく、しかし例えば、持続的な注入、徐放性補給（de
pot）、または２−３日ごとに１回の注入などによってもよい。逸話としての証 拠は、持続的な投与はフィードバック阻害を誘発し、従って好ましい投与計画は
約２５〜２８日間毎日ママスタチンを投与した後、２〜５日投与をやめることを
示唆する。
【００４９】診断的使用 ヒト組織および血清中の機能的なインヒビターの存在を検出するための本発明
のアッセイは、乳癌の罹患の高い危険性を保有する集団のスクリーニング、乳癌
発症の早期発見および治療期間中の患者のインヒビターレベルのモニターのため
、乳癌患者のスクリーニングに有用である。例えば、患者の血液ママスタチンの
分析は、正常のコントロールまたは該患者の以前のママスタチンのプロフィルに
比較して、高分子量のリン酸化ママスタチンの量の減少を示すかもしれない。そ
のような変化は乳癌の危険の高まり、乳癌の早期発症、および転移性乳癌の進行
と相関がある。リン酸化、活性化、４９／５３ｋDママスタチンに関する診断ア ッセイは、例えば、ウエスタン・ブロット、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイに
よるか、または特異的な抗−ママスタチン抗体を用いる。例えば血清中などのス
クリーニングは、例えば、ドット・ブロット・アッセイなどのイムノアッセイに
よるのが好ましい。
のアッセイは、乳癌の罹患の高い危険性を保有する集団のスクリーニング、乳癌
発症の早期発見および治療期間中の患者のインヒビターレベルのモニターのため
、乳癌患者のスクリーニングに有用である。例えば、患者の血液ママスタチンの
分析は、正常のコントロールまたは該患者の以前のママスタチンのプロフィルに
比較して、高分子量のリン酸化ママスタチンの量の減少を示すかもしれない。そ
のような変化は乳癌の危険の高まり、乳癌の早期発症、および転移性乳癌の進行
と相関がある。リン酸化、活性化、４９／５３ｋDママスタチンに関する診断ア ッセイは、例えば、ウエスタン・ブロット、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイに
よるか、または特異的な抗−ママスタチン抗体を用いる。例えば血清中などのス
クリーニングは、例えば、ドット・ブロット・アッセイなどのイムノアッセイに
よるのが好ましい。
【００５０】 最良の結果のため、患者のサンプルはサンプリングから短期間内で（１週間以
内で）アッセイされるべきであり、４℃で保存されるか（１年以内）、または凍
結させて長期保存すべきである。サンプルはアッセイの時期まで凍結させている
のが最も好ましい。
内で）アッセイされるべきであり、４℃で保存されるか（１年以内）、または凍
結させて長期保存すべきである。サンプルはアッセイの時期まで凍結させている
のが最も好ましい。
【００５１】アッセイキット 本発明の具体的な態様において、患者の液体および／または乳癌組織中のママ
スタチンの検出のためのアッセイキットが提供される。スクリーニングアッセイ
は、血清中のママスタチンを検出または定量するためのドット・ブロット・アッ
セイなどのイムノアッセイが好ましい。そのようなスクリーニングキットには、
抗−ママスタチン抗体およびコントロール抗体を含む場合もあり、および／また
はママスタチンコントロールまたは標準を含む。第２のスクリーニングアッセイ
は***組織のママスタチンを分析する。該アッセイキットには必須試薬および該
組織が***上皮であることを特異的に決定するための抗体、例えば抗−サイトケ
ラチン抗体および特異的な抗−ママスタチン抗体と該組織を反応させるための手
段を含む。市販されており利用可能な抗体混合物であるパン−ケラチン（pan-ke
ratin）(シグマ(Sigma))は好ましい抗−サイトケラチン抗体である。
スタチンの検出のためのアッセイキットが提供される。スクリーニングアッセイ
は、血清中のママスタチンを検出または定量するためのドット・ブロット・アッ
セイなどのイムノアッセイが好ましい。そのようなスクリーニングキットには、
抗−ママスタチン抗体およびコントロール抗体を含む場合もあり、および／また
はママスタチンコントロールまたは標準を含む。第２のスクリーニングアッセイ
は***組織のママスタチンを分析する。該アッセイキットには必須試薬および該
組織が***上皮であることを特異的に決定するための抗体、例えば抗−サイトケ
ラチン抗体および特異的な抗−ママスタチン抗体と該組織を反応させるための手
段を含む。市販されており利用可能な抗体混合物であるパン−ケラチン（pan-ke
ratin）(シグマ(Sigma))は好ましい抗−サイトケラチン抗体である。
【００５２】 ママスタチンのネガティブアッセイは、乳癌腫瘍の存在または非上皮***組織
によって引き起こされる。抗−サイトケラチン抗体の使用により、誤ったポジテ
ィブアッセイに対して警戒する。抗−ママスタチン抗体で染まらないか、または
４４kDママスタチンのみを発現する***上皮細胞は形質転換細胞である。従って
、例えば***組織から単離され、および抗−サイトケラチン抗体で陽性となるよ
うな***上皮しての組織を最初に同定し、ついで抗−ママスタチン抗体との第２
の陽性反応を同定することによって擬陽性が避けられる。
によって引き起こされる。抗−サイトケラチン抗体の使用により、誤ったポジテ
ィブアッセイに対して警戒する。抗−ママスタチン抗体で染まらないか、または
４４kDママスタチンのみを発現する***上皮細胞は形質転換細胞である。従って
、例えば***組織から単離され、および抗−サイトケラチン抗体で陽性となるよ
うな***上皮しての組織を最初に同定し、ついで抗−ママスタチン抗体との第２
の陽性反応を同定することによって擬陽性が避けられる。
【００５３】 乳癌細胞の約３０％が非リン酸化の不活性な４４kDママスタチンを発現するこ
とが実験により明らかだったので、分析の好ましい方法は、例えばウエスタン・
ブロット分析などによって、５３／４９kDおよび４４kD形態の間で区別すること
である。 本発明はさらに以下の実施例を参照して定義される：
とが実験により明らかだったので、分析の好ましい方法は、例えばウエスタン・
ブロット分析などによって、５３／４９kDおよび４４kD形態の間で区別すること
である。 本発明はさらに以下の実施例を参照して定義される：
【００５４】実施例１ ヒト***細胞ｃＤＮＡライブラリー ｃＤＮＡライブラリーを整復***形成術（UM病院（UM Hospital））から得ら れるヒト***細胞から調製した。総ＲＮＡを塩化セシウム勾配により***細胞か
ら単離した。総ＲＮＡ調製物からｍＲＮＡを単離した。使用された方法はガーナ
ー（Garner I.）「アイソレーション・オブ・トータル・アンド・ポリ・Ａ＋Ｒ ＮＡ・フロム・アニマル・セルズ（“Isolation of total and poly A+RNA from
animal cells"）」、Methods Mol. Biol.（１９９４）２８：４１−７に記載さ
れている。
ら単離した。総ＲＮＡ調製物からｍＲＮＡを単離した。使用された方法はガーナ
ー（Garner I.）「アイソレーション・オブ・トータル・アンド・ポリ・Ａ＋Ｒ ＮＡ・フロム・アニマル・セルズ（“Isolation of total and poly A+RNA from
animal cells"）」、Methods Mol. Biol.（１９９４）２８：４１−７に記載さ
れている。
【００５５】 単離されたｍＲＮＡの存在下での逆転写はｃＤＮＡを製造し、ついでEcoRIリ ンカーにライゲートされる。ｃＤＮＡをEcoRI切断T4DNAリガーゼ処理したラムダ
Zapに挿入し、ついでショート（Short JM.）ら（１９８８）Nucleic Acids Rese
arch １６：７５８３に記載される方法に従って大腸菌XL1-blue中で増幅した。
Zapに挿入し、ついでショート（Short JM.）ら（１９８８）Nucleic Acids Rese
arch １６：７５８３に記載される方法に従って大腸菌XL1-blue中で増幅した。
【００５６】実施例２ ママスタチンオリゴヌクレオチドの調製 実施例１で調製した正常ヒト***細胞ｃＤＮＡを、縮重オリゴヌクレオチドを
用いてママスタチンをコードする核酸の存在に関してスクリーニングした。その
縮重オリゴヌクレオチドは以下のようにして得る：
用いてママスタチンをコードする核酸の存在に関してスクリーニングした。その
縮重オリゴヌクレオチドは以下のようにして得る：
【００５７】 正常ヒト***細胞をミシガン大学病院形成外科より、または共同ヒト組織ネッ
トワーク（Cooperative Human Tissue Network）より入手した。その組織をソウ
ル（Soule）ら、In Vitro, ２２：６（１９８６）に記載される手法に概して従 い、コラゲナーゼ処理により還元した。
トワーク（Cooperative Human Tissue Network）より入手した。その組織をソウ
ル（Soule）ら、In Vitro, ２２：６（１９８６）に記載される手法に概して従 い、コラゲナーゼ処理により還元した。
【００５８】 ***細胞を４０μM CaCl2で調合したＤＭＥＭ／Ｆ１２低カルシウム培地中で 、１７５cm2フラスコ中でコンフルエンスに達するまで増殖させ、ついでソウル ら、In Vitro, ２２：６（１９８６）に記載される手法に従い、５％ＣＨＥＬＥ
Ｘ処理したウマ血清（シグマ）、０.１μg／mlのコレラ毒素（シグマ）、０.５ μg／mlヒドロコルチゾン（シグマ）、１０ng／ml上皮増殖因子（ＥＧＦ、コラ ボラティブ・リサーチ（Collaborative Research）、ベッドフォード、マサチュ
ーセッツ）、１０μg／mlインシュリンおよび１μg／mlペニシリン／ストレプト
マイシンを補給した。ウマ血清をCHELEXレジンで室温で3時間処理して血清カル シウムを除去した。
Ｘ処理したウマ血清（シグマ）、０.１μg／mlのコレラ毒素（シグマ）、０.５ μg／mlヒドロコルチゾン（シグマ）、１０ng／ml上皮増殖因子（ＥＧＦ、コラ ボラティブ・リサーチ（Collaborative Research）、ベッドフォード、マサチュ
ーセッツ）、１０μg／mlインシュリンおよび１μg／mlペニシリン／ストレプト
マイシンを補給した。ウマ血清をCHELEXレジンで室温で3時間処理して血清カル シウムを除去した。
【００５９】 細胞溶解産物は、細胞をTBSですすぎ、テフロン製のスクレーパーでフラスコ からこすりとることによって調製した。細胞を遠心分離によって回収し、８M 尿
素、５０mMトリスpH7.5、０.５％β−メルカプトエタノール、０.５％TRITON X-
１０００（溶解バッファー）で溶解させ、氷上で3分間超音波処理した。
素、５０mMトリスpH7.5、０.５％β−メルカプトエタノール、０.５％TRITON X-
１０００（溶解バッファー）で溶解させ、氷上で3分間超音波処理した。
【００６０】 該細胞溶解産物を溶解バッファーで平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（Sephac
el）陰イオン交換樹脂（シグマ）上で分画した。溶解産物を樹脂を充填したカラ
ム（５０mlの使い捨て、バイオ・ラド（Bio Rad）上に負荷し、ついでカラムの 容量の10倍量の溶解バッファーで洗浄した。物質は、重力の供給によってのみカ
ラムから流出した。画分は、最初に、塩の存在下で溶出バッファー（８Ｍの尿素
２５０mlおよび５０mMのトリスｐH７.５）を最初に含む閉鎖混合チャンバーに５
ＭのNaClを含む溶出バッファーを持続的に重力の供給によって流して製造された
塩勾配で溶出した。
el）陰イオン交換樹脂（シグマ）上で分画した。溶解産物を樹脂を充填したカラ
ム（５０mlの使い捨て、バイオ・ラド（Bio Rad）上に負荷し、ついでカラムの 容量の10倍量の溶解バッファーで洗浄した。物質は、重力の供給によってのみカ
ラムから流出した。画分は、最初に、塩の存在下で溶出バッファー（８Ｍの尿素
２５０mlおよび５０mMのトリスｐH７.５）を最初に含む閉鎖混合チャンバーに５
ＭのNaClを含む溶出バッファーを持続的に重力の供給によって流して製造された
塩勾配で溶出した。
【００６１】 溶出画分（２ml）をギブソン（Gibson）画分コレクターによって回収し、上記
のように抗−ママスタチン抗体である７G6でドット・ブロットによって***細胞
増殖インヒビターの存在に関して分析した。
のように抗−ママスタチン抗体である７G6でドット・ブロットによって***細胞
増殖インヒビターの存在に関して分析した。
【００６２】 陽性の画分を保存し、５０mMのNaClで溶解バッファーに透析し、再度同一のイ
オン交換カラム上で分離し、５０mMのNaClを含む溶出バッファー中のｐH勾配（ ｐH8〜ｐH３）を持続的に減少させて溶出した（ｐH勾配をつくるために、pH３の
緩衝尿素を持続的に最初のｐH８のバッファーに混合した。）。画分（２ml）を 回収し、上記のように７G6抗体で分析した。
オン交換カラム上で分離し、５０mMのNaClを含む溶出バッファー中のｐH勾配（ ｐH8〜ｐH３）を持続的に減少させて溶出した（ｐH勾配をつくるために、pH３の
緩衝尿素を持続的に最初のｐH８のバッファーに混合した。）。画分（２ml）を 回収し、上記のように７G6抗体で分析した。
【００６３】 陽性の画分を再び保存し、ついで濾過遠心分離によってもともとの容積の１／
１０のに濃縮した（アミコン・セントリプレップ（Amicon Centriprep）、１０k
D切断）。濃縮した保存物を前もって染色した分子量標準（シグマ）とともに分 取SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)によってサイズ画分した。
１０のに濃縮した（アミコン・セントリプレップ（Amicon Centriprep）、１０k
D切断）。濃縮した保存物を前もって染色した分子量標準（シグマ）とともに分 取SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE)によってサイズ画分した。
【００６４】 分子量４０〜６０kD間の分子中に含まれるタンパク質を０.５cmのストリップ または画分でゲルから切り出した。各ゲルのストリップからのタンパク質の電気
溶出を透析チューブ中でランニングバッファー（１９２ｍMのグリシン、２５mM のトリス（ｐH8.3）、0.1％SDS）１ml中にそのゲルストリップを置くことによっ
て行った。そのチューブをサブマリン電気泳動装置中に設置し、終夜２５ボルト
で電気溶出した。電流を２分間逆行させ、ランニングバッファー（現在は溶出し
たタンパク質を含む）を除去した。溶出したタンパク質の純度を、銀染色で分析
SDS PAGEによって、またトウビン（Towbin）ら、J. Clin. Chem. Clin. Biochem
. 27：４９５〜５０１（１９８９）に記載されるような手法に従いチェックした
。銀染色PAGEによって決定されるように少なくとも７０％純度の画分を貯蔵し、
濃縮し、ついで凍結乾燥して粉末形態とした。
溶出を透析チューブ中でランニングバッファー（１９２ｍMのグリシン、２５mM のトリス（ｐH8.3）、0.1％SDS）１ml中にそのゲルストリップを置くことによっ
て行った。そのチューブをサブマリン電気泳動装置中に設置し、終夜２５ボルト
で電気溶出した。電流を２分間逆行させ、ランニングバッファー（現在は溶出し
たタンパク質を含む）を除去した。溶出したタンパク質の純度を、銀染色で分析
SDS PAGEによって、またトウビン（Towbin）ら、J. Clin. Chem. Clin. Biochem
. 27：４９５〜５０１（１９８９）に記載されるような手法に従いチェックした
。銀染色PAGEによって決定されるように少なくとも７０％純度の画分を貯蔵し、
濃縮し、ついで凍結乾燥して粉末形態とした。
【００６５】 貯蔵されたタンパク質を５００μlの７０％ギ酸中に凍結乾燥した粉末を溶解 し、２０mg／mlの臭化シアン（シグマ）で室温で終夜（約２０時間）インキュベ
ートすることによって、臭化シアンで開裂させた。使用した方法はフリーモント
（Freemont）ら、Arch. Biochem. Biophys. ２２８：３４２−３５２（１９８６
）中に記載されている。臭化シアン開裂タンパク質のサンプルを２回蒸留し、脱
イオン化した水に透析し、再び濃縮し、ついで凍結乾燥して粉末とした。
ートすることによって、臭化シアンで開裂させた。使用した方法はフリーモント
（Freemont）ら、Arch. Biochem. Biophys. ２２８：３４２−３５２（１９８６
）中に記載されている。臭化シアン開裂タンパク質のサンプルを２回蒸留し、脱
イオン化した水に透析し、再び濃縮し、ついで凍結乾燥して粉末とした。
【００６６】 臭化シアン開裂は、もともとのタンパク質サンプルから複数のペプチドを産生
し、分取１５％SDS PAGEおよび電気溶出によってPVDF膜上にトランスファーする
ことによって分離した。
し、分取１５％SDS PAGEおよび電気溶出によってPVDF膜上にトランスファーする
ことによって分離した。
【００６７】 ***細胞溶解産物から得たタンパク質に加えて、タンパク質はまた正常ヒト乳
房細胞ならし培地から単離される。正常細胞をリン酸欠如した８mlのDMEMでイン
キュベートし、２００μCi／mlの32P-オルトリン酸および１％の透析したウシ胎
児血清を補った。細胞をならし培地を回収する前に、32P存在下で２４時間増殖 させることができた。
房細胞ならし培地から単離される。正常細胞をリン酸欠如した８mlのDMEMでイン
キュベートし、２００μCi／mlの32P-オルトリン酸および１％の透析したウシ胎
児血清を補った。細胞をならし培地を回収する前に、32P存在下で２４時間増殖 させることができた。
【００６８】 回収したならし培地を１０ｋDの排除制限でアミコン濾過により５倍の濃度に まで濃縮した。濃縮した培地を濾膜上でPBSで１回漱ぎ、取り込まれていない過 剰なリン酸を除去し、ついでさらにPBSで溶出したS-200SEPHACRYL（ファルマシ ア（Pharmacia）、ウプサラ、スウェーデン）分子篩クロマトグラフィー（１０ ０cm×０.７５cmカラムによって画分した。フィルターとカラムの両者によりサ ンプルから未取り込み32Pの除去を可能にする。１mlの画分をカラムから回収し 、シンチレーションカウンティングにより標識した画分を同定した。放射活性化
区分を保存し、ついで銀染色およびオートラジオグラフィーをともなってSDSPAG
Eによって分析した。保存されたタンパク質を濃縮し、凍結乾燥して粉末とし、 ついで臭化シアン開裂の前に上記のように精製した未標識タンパク質の多量と結
合させた。標識したタンパク質の添加はリン酸化ママスタチンペプチドを含む臭
化シアン開裂断片のトレースの便利な方法を提供する。開裂したペプチドを上記
のように分取PAGE上で分離した。
区分を保存し、ついで銀染色およびオートラジオグラフィーをともなってSDSPAG
Eによって分析した。保存されたタンパク質を濃縮し、凍結乾燥して粉末とし、 ついで臭化シアン開裂の前に上記のように精製した未標識タンパク質の多量と結
合させた。標識したタンパク質の添加はリン酸化ママスタチンペプチドを含む臭
化シアン開裂断片のトレースの便利な方法を提供する。開裂したペプチドを上記
のように分取PAGE上で分離した。
【００６９】 放射活性タンパク質を臭化シアン開裂し、分離してPVDF膜にトランスファーし
、X線フィルムに曝した後、２つの標識された約２０kDおよび２２kDのバンドが 見ることができた。これら２つのペプチドを膜から切り出し、ウラー（Ullah Al
t）らBiochem. Biophys. Res. Comm. ２０３：１８２−１８９（１９９４）に記
載の方法を用いて、ユニバーシティ・オブ・ミシガン・バイオメディカル・リサ
ーチ・コア・ファシリティー（University of Michigan Biomedical Research C
ore Facility）でエドマン法によってシークエンシングした。２つのペプチドの
各々のアミノ酸配列をNIH「BLAST」サーバーを用いて公知のデータベースと比較
した。その２つのペプチドは新規であることがわかった。
、X線フィルムに曝した後、２つの標識された約２０kDおよび２２kDのバンドが 見ることができた。これら２つのペプチドを膜から切り出し、ウラー（Ullah Al
t）らBiochem. Biophys. Res. Comm. ２０３：１８２−１８９（１９９４）に記
載の方法を用いて、ユニバーシティ・オブ・ミシガン・バイオメディカル・リサ
ーチ・コア・ファシリティー（University of Michigan Biomedical Research C
ore Facility）でエドマン法によってシークエンシングした。２つのペプチドの
各々のアミノ酸配列をNIH「BLAST」サーバーを用いて公知のデータベースと比較
した。その２つのペプチドは新規であることがわかった。
【００７０】 各配列の特に独特の部分を使用して縮重オリゴヌクレオチドを製造し、ジェラ
ラ（Jerala）、Biotechniques１３：５６４−５６７（１９９２）において記載 される方法による標準的な第３の位置の縮重を用いた。２０kDペプチドから該配
列「gly-gln-leu-glu-tyr-gln-asp-leu-arg」（配列番号：３）を使用した。： ２２kDのペプチドから配列「tyr-glu-arg-asp-leu-lys-gly-arg-asp-pro-val-al
a-ala」（配列番号：４）を使用してオリゴヌクレオチドの複数の種を製造した 。縮重オリゴヌクレオチドを高圧液体クロマトグラフィーによって精製した。
ラ（Jerala）、Biotechniques１３：５６４−５６７（１９９２）において記載 される方法による標準的な第３の位置の縮重を用いた。２０kDペプチドから該配
列「gly-gln-leu-glu-tyr-gln-asp-leu-arg」（配列番号：３）を使用した。： ２２kDのペプチドから配列「tyr-glu-arg-asp-leu-lys-gly-arg-asp-pro-val-al
a-ala」（配列番号：４）を使用してオリゴヌクレオチドの複数の種を製造した 。縮重オリゴヌクレオチドを高圧液体クロマトグラフィーによって精製した。
【００７１】
【表３】
【００７２】 縮重オリゴヌクレオチドを32P−γATPおよびT4ＤＮＡポリヌクレオチドキナー
ゼ（ＢＲＬ、ベテスダ（Bethesda）、メリーランド）で末端ラベルし、再度Ｔ４
ＤＮＡキナーゼバッファー（６０mMのトリス（pH 7.8）、１０mM MgCl2、１５mM
β−メルカプトエタノール）を１.５mg/mlで再度懸濁させた。ついでオリゴヌ クレオチド（２５０μＭ）を０.３３μＭのＡＴＰ、２５μキナーゼバッファー 中の５単位のキナーゼと３７℃で２時間インキュベートした。32P‐リン酸の取 り込みをＴＣＡ沈殿（１５％ＴＣＡ、４℃、15分）によって決定した。典型的な
取り込みは１０9cpm／mgＤＮＡであった。
ゼ（ＢＲＬ、ベテスダ（Bethesda）、メリーランド）で末端ラベルし、再度Ｔ４
ＤＮＡキナーゼバッファー（６０mMのトリス（pH 7.8）、１０mM MgCl2、１５mM
β−メルカプトエタノール）を１.５mg/mlで再度懸濁させた。ついでオリゴヌ クレオチド（２５０μＭ）を０.３３μＭのＡＴＰ、２５μキナーゼバッファー 中の５単位のキナーゼと３７℃で２時間インキュベートした。32P‐リン酸の取 り込みをＴＣＡ沈殿（１５％ＴＣＡ、４℃、15分）によって決定した。典型的な
取り込みは１０9cpm／mgＤＮＡであった。
【００７３】実施例３ 縮重オリゴヌクレオチドでの***細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 正常***細胞ｃＤＮＡインサートを含む実施例１で調製したファージに感染さ
せた細菌を、トップアガー（感染細菌培養の１／１０希釈から７％NZYMトップア
ガーの６ml）プレート１５cmのNZCYM(１０ｇ、NZアミン（ベーリンガー・マンハ
イム）、５ｇのNaCl、５ｇの酵母抽出物、２ｇのMgSO4、１ｇのカザミノ酸）上 にプレーティングした。プラーク含有プレートにファージの変性（denatureatio
n）の前１５分間ニトロセルロース膜をかけた。ファージを０.５M NaOH、1.5M N
aCl飽和したワットマンペーパー上で５分間のブロッティングフィルター（ＤＮ Ａサイドアップ）により変性させた。フィルターをH2Oですすぎ、１Ｍトリス（p
H7.0）、１.５Ｍ NaCl中で５分間インキュベートした後、２０×SSCおよび２×S
SCそれぞれ５分間インキュベートした。フィルターを乾燥させ、８０℃で1時間 焼くか、または紫外線光線下放置してＤＮＡを固定した。燒結フィルターを１％
ＳＤＳと２×SSC中で３０分間洗浄し、ついで５０％脱イオン化ホルムアミド、 ５×Denhart's溶液、１％ＳＤＳ、５×SSCおよび１００μg／ml変性サケ***Ｄ ＮＡで３７℃でプレハイブリダイズした。
せた細菌を、トップアガー（感染細菌培養の１／１０希釈から７％NZYMトップア
ガーの６ml）プレート１５cmのNZCYM(１０ｇ、NZアミン（ベーリンガー・マンハ
イム）、５ｇのNaCl、５ｇの酵母抽出物、２ｇのMgSO4、１ｇのカザミノ酸）上 にプレーティングした。プラーク含有プレートにファージの変性（denatureatio
n）の前１５分間ニトロセルロース膜をかけた。ファージを０.５M NaOH、1.5M N
aCl飽和したワットマンペーパー上で５分間のブロッティングフィルター（ＤＮ Ａサイドアップ）により変性させた。フィルターをH2Oですすぎ、１Ｍトリス（p
H7.0）、１.５Ｍ NaCl中で５分間インキュベートした後、２０×SSCおよび２×S
SCそれぞれ５分間インキュベートした。フィルターを乾燥させ、８０℃で1時間 焼くか、または紫外線光線下放置してＤＮＡを固定した。燒結フィルターを１％
ＳＤＳと２×SSC中で３０分間洗浄し、ついで５０％脱イオン化ホルムアミド、 ５×Denhart's溶液、１％ＳＤＳ、５×SSCおよび１００μg／ml変性サケ***Ｄ ＮＡで３７℃でプレハイブリダイズした。
【００７４】 フィルターを、熱変性した（９５℃で５分）標識縮重オリゴヌクレオチド１０
7cpm／mlを加えた、実施例２で記載したようにして調製したプレハイブリダイゼ
ーションバッファー中の標識縮重オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。フ
ィルターを３７℃で３０分間２×SSCで洗浄した後、５０℃で３０分間２×SSCに
１％SDSを加えた溶液中で３回洗浄した。フィルターを２×SSCで短くすすぎ、乾
燥させて、ついで２４〜４８時間コダックＡＲ‐５フィルムに露光して陽性プラ
ークを同定した。
7cpm／mlを加えた、実施例２で記載したようにして調製したプレハイブリダイゼ
ーションバッファー中の標識縮重オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした。フ
ィルターを３７℃で３０分間２×SSCで洗浄した後、５０℃で３０分間２×SSCに
１％SDSを加えた溶液中で３回洗浄した。フィルターを２×SSCで短くすすぎ、乾
燥させて、ついで２４〜４８時間コダックＡＲ‐５フィルムに露光して陽性プラ
ークを同定した。
【００７５】 陽性プラークを逆２００μl無菌ペプチドチップを用いて切り出したアガープ ラグから単離し、４℃で終夜ＳＭバッファー中に再懸濁した。第２および第３の
プレート（１０cm）をＳＭバッファーを含むファージの１／１０,０００希釈で 細菌に感染したＸＬ１−Ｂを用いてNZCYM(１mM MgSO4）中で作成した。プラーク
を上記のように８時間感染した細菌をインキュベートすることにより製造し、つ
いで標識した縮重オリゴヌクレオチドでスクリーニングする前にニトロセルロー
スにトランスファーした。スクリーニングは、本質的にはクロチェック（Krocze
k, RA.）、J Chromatogr 618：１３３−４５（１９９３）に記載されるのと同様
に、１０7cpm／mlの標識したＤＮＡおよび５０℃で３０分間２×SSCの最終的な 洗浄ストリンジェンシーを用いて行われた。 さらなる分析に関して選択されたクローンは、両方の縮重オリゴヌクレオチド
によって認識されるものであった。このクローンは「pMammA」と名づけられた。
プレート（１０cm）をＳＭバッファーを含むファージの１／１０,０００希釈で 細菌に感染したＸＬ１−Ｂを用いてNZCYM(１mM MgSO4）中で作成した。プラーク
を上記のように８時間感染した細菌をインキュベートすることにより製造し、つ
いで標識した縮重オリゴヌクレオチドでスクリーニングする前にニトロセルロー
スにトランスファーした。スクリーニングは、本質的にはクロチェック（Krocze
k, RA.）、J Chromatogr 618：１３３−４５（１９９３）に記載されるのと同様
に、１０7cpm／mlの標識したＤＮＡおよび５０℃で３０分間２×SSCの最終的な 洗浄ストリンジェンシーを用いて行われた。 さらなる分析に関して選択されたクローンは、両方の縮重オリゴヌクレオチド
によって認識されるものであった。このクローンは「pMammA」と名づけられた。
【００７６】実施例４ ママスタチンｃＤＮＡのシークエンシング 実施例３で得られた陽性クローンであるpMammAをミシガン大学のバイオメディ
カル・リサーチ・コア・ファシリティーで自動化シークエンサーを用いてシーク
エンシングし、ついでまた１５％ＤＮＡシークエンシングゲルを用いたジデオキ
シシークエンシングおよび35Ｓヌクレオチドを有する放射標識ＤＮＡ断片によっ
てシークエンシングした。使用した方法はラスケン（Lasken RS）ら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA ８２：１３０１−５（１９８５）に記載されている。
カル・リサーチ・コア・ファシリティーで自動化シークエンサーを用いてシーク
エンシングし、ついでまた１５％ＤＮＡシークエンシングゲルを用いたジデオキ
シシークエンシングおよび35Ｓヌクレオチドを有する放射標識ＤＮＡ断片によっ
てシークエンシングした。使用した方法はラスケン（Lasken RS）ら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA ８２：１３０１−５（１９８５）に記載されている。
【００７７】 自動化配列の認識された誤りの割合は約５％である。従って、寄託されたクロ
ーンをヌクレオチド配列の確認のために再度シークエンシングし、特に記載され
るように、潜在的な過誤の疑いのある部分には注意した。 最初に得られた配列情報は、すべての読み取り枠において多くの停止コドン、
およびとりわけＧＣリッチな領域中に明らかな誤りを含んでいた。最初のクロー
ン（pMammA）を注意深く再シークエンシングした。得られた核酸配列は内部の停
止コドンを含んでおらず、表１（配列番号：１）に示すとおりである。
ーンをヌクレオチド配列の確認のために再度シークエンシングし、特に記載され
るように、潜在的な過誤の疑いのある部分には注意した。 最初に得られた配列情報は、すべての読み取り枠において多くの停止コドン、
およびとりわけＧＣリッチな領域中に明らかな誤りを含んでいた。最初のクロー
ン（pMammA）を注意深く再シークエンシングした。得られた核酸配列は内部の停
止コドンを含んでおらず、表１（配列番号：１）に示すとおりである。
【００７８】実施例５ ママスタチンｃＤＮＡの発現ベクター中へのサブクローニング ママスタチンｃＤＮＡ挿入物であるpMammAを発現ベクターｐｃＤＮＡ３（イン
・ビトロゲン（In Vitrogen）にサブクローニングした。ママスタチンｃＤＮＡ を実施例４に記載されたようにして入手したpMammAをBamHIおよびXhoI制限エン ドヌクレアーゼで消化することによって単離した。制限酵素はプラスミドをママ
スタチンクローンインサートの末端で切断し、線形のプラスミド断片および線形
挿入断片を作成した。消化したサンプルを電気泳動装置中に沈めた１.２％アガ ロースゲルのウェル中に静置し、５０Ｖの電流を２時間流した。電気泳動はＤＮ
Ａ断片をサイズに基づいて分離し、大きなプラスミドＤＮＡ断片はゲル上で一層
遅い移動速度を有する。２.４kbを含むアガロースゲルの一部を臭化エチジウム 染色によって可視化し、ついでゲルを紫外線ボックスの上に置いて観察した。２
.４kbママスタチン断片をゲルから切り出し、ついで透析チューブに置き、つい で該ＤＮＡをホウ酸トリスバッファーＴＢＥ（０.０８９Ｍホウ酸トリス、０.０
８９Ｍホウ酸、０.００２Ｍ ＥＤＴＡ）に電気溶出し、回収し、エタノール沈殿
した。
・ビトロゲン（In Vitrogen）にサブクローニングした。ママスタチンｃＤＮＡ を実施例４に記載されたようにして入手したpMammAをBamHIおよびXhoI制限エン ドヌクレアーゼで消化することによって単離した。制限酵素はプラスミドをママ
スタチンクローンインサートの末端で切断し、線形のプラスミド断片および線形
挿入断片を作成した。消化したサンプルを電気泳動装置中に沈めた１.２％アガ ロースゲルのウェル中に静置し、５０Ｖの電流を２時間流した。電気泳動はＤＮ
Ａ断片をサイズに基づいて分離し、大きなプラスミドＤＮＡ断片はゲル上で一層
遅い移動速度を有する。２.４kbを含むアガロースゲルの一部を臭化エチジウム 染色によって可視化し、ついでゲルを紫外線ボックスの上に置いて観察した。２
.４kbママスタチン断片をゲルから切り出し、ついで透析チューブに置き、つい で該ＤＮＡをホウ酸トリスバッファーＴＢＥ（０.０８９Ｍホウ酸トリス、０.０
８９Ｍホウ酸、０.００２Ｍ ＥＤＴＡ）に電気溶出し、回収し、エタノール沈殿
した。
【００７９】 pcＤＮＡ３プラスミドＤＮＡを修飾して、ライゲーション間にママスタチンｃ
ＤＮＡ断片を受容するようにした。pcＤＮＡ３プラスミドをBamHIおよびXhoI制 限エンドヌクレアーゼで消化し、消化が完了した後、そのＤＮＡを子牛腸ホスフ
ァターゼの存在下で１時間インキュベートして５'リン酸を除去する。pcＤＮＡ ３サンプルをついでフェノール抽出し、エタノール沈殿する。
ＤＮＡ断片を受容するようにした。pcＤＮＡ３プラスミドをBamHIおよびXhoI制 限エンドヌクレアーゼで消化し、消化が完了した後、そのＤＮＡを子牛腸ホスフ
ァターゼの存在下で１時間インキュベートして５'リン酸を除去する。pcＤＮＡ ３サンプルをついでフェノール抽出し、エタノール沈殿する。
【００８０】 pcＤＮＡ３およびママスタチン２.４kbｃＤＮＡ断片を一緒にライゲーション する。その２.４kbママスタチン断片および線形のpcＤＮＡ３プラスミドを３： １の割合でＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下で混合した。ライゲーション反応は１時
間インキュベートした後、４℃で終夜保存した。ライゲーション反応が完了した
後、そのＤＮＡを使用して大腸菌コンピテント細胞を形質転換する。サブクロー
ニングをアンピシリン選択コロニーからプラスミドＤＮＡを精製することによっ
て確認した。そのプラスミドをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化 した。消化したＤＮＡサンプルをアガロースゲル上に置き、ついで電気泳動で分
離した。正しいサイズのママスタチンＤＮＡ断片を含むプラスミドをpＭammＢと
命名し、ついでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Typ
e Culture Collection (ATCC)）に１９９６年２月２２日に寄託し、受領番号： ＡＴＣＣ９７４５１号が付与された。
間インキュベートした後、４℃で終夜保存した。ライゲーション反応が完了した
後、そのＤＮＡを使用して大腸菌コンピテント細胞を形質転換する。サブクロー
ニングをアンピシリン選択コロニーからプラスミドＤＮＡを精製することによっ
て確認した。そのプラスミドをBamHIおよびXhoI制限エンドヌクレアーゼで消化 した。消化したＤＮＡサンプルをアガロースゲル上に置き、ついで電気泳動で分
離した。正しいサイズのママスタチンＤＮＡ断片を含むプラスミドをpＭammＢと
命名し、ついでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Typ
e Culture Collection (ATCC)）に１９９６年２月２２日に寄託し、受領番号： ＡＴＣＣ９７４５１号が付与された。
【００８１】実施例６ ママスタチンｃＤＮＡ配列からのトランスフェクションおよびタンパク質発現 Cos７細胞はママスタチンタンパク質と一緒に移動する免疫応答タンパク質を 発現しない。pＭammＢおよびPCDNA３を使用してLIPOFECTINョ(BRL、ライフ・テク ノロジーズ（Life Technologies）、ベテスダ、（Bethesda)、メリーランド）を
用いて、製造者により示唆されたプロトコールを利用してCos-7サル繊維芽細胞 をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を回収前２日間増
殖させた。トランスフェクションした細胞を標準プロトコールを用いて細胞をト
リプシン処理することによってプレートから除去した（トリプシン２.５ml(０. ２５％シグマ）を３７℃で５分間細胞のフラスコ内でインキュベートした。RPMI
培地に１０％FBS（ウシ胎児血清）を補給したものの７.５mlアリコートを加えて
細胞を遠心によって回収する）。細胞を血球測定計によって数え、１０7細胞／m
lでSDS PAGEサンプルローディングバッファー中で溶解した。細胞溶解産物を８ 〜１５％のSDS-PAGE勾配ゲル（バイオラド）上で分離し、ついでトウビンらJ. C
lin Chem Clin Biochem(1989年8月）27(8): 495-501中に記載される方法を用い てナイロン膜にトランスファーした。その膜を抗−ママスタチンモノクローナル
抗体７G6でプロービングした。結合抗体をペルオキシダーゼコンジュゲートＧＡ
Ｍ−ＩｇＭで検出し、ＥＣＬ（アマシャム）によって発色させた。
用いて、製造者により示唆されたプロトコールを利用してCos-7サル繊維芽細胞 をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を回収前２日間増
殖させた。トランスフェクションした細胞を標準プロトコールを用いて細胞をト
リプシン処理することによってプレートから除去した（トリプシン２.５ml(０. ２５％シグマ）を３７℃で５分間細胞のフラスコ内でインキュベートした。RPMI
培地に１０％FBS（ウシ胎児血清）を補給したものの７.５mlアリコートを加えて
細胞を遠心によって回収する）。細胞を血球測定計によって数え、１０7細胞／m
lでSDS PAGEサンプルローディングバッファー中で溶解した。細胞溶解産物を８ 〜１５％のSDS-PAGE勾配ゲル（バイオラド）上で分離し、ついでトウビンらJ. C
lin Chem Clin Biochem(1989年8月）27(8): 495-501中に記載される方法を用い てナイロン膜にトランスファーした。その膜を抗−ママスタチンモノクローナル
抗体７G6でプロービングした。結合抗体をペルオキシダーゼコンジュゲートＧＡ
Ｍ−ＩｇＭで検出し、ＥＣＬ（アマシャム）によって発色させた。
【００８２】 図１に示すように、pMammB（レーンＣ、Ｄ）でトランスフェクションしたＣｏ
ｓ-７細胞はママスタチンタンパク質（レーンＡ）と同時に移動する免疫応答性 のタンパク質を発現した。空のベクターＰＣＤＮＡ３単独でトランスフェクショ
ンしたCos-７細胞はイムノブロット実験を行った場合に免疫応答性のタンパク質
を発現しなかった（レーンＢ）。
ｓ-７細胞はママスタチンタンパク質（レーンＡ）と同時に移動する免疫応答性 のタンパク質を発現した。空のベクターＰＣＤＮＡ３単独でトランスフェクショ
ンしたCos-７細胞はイムノブロット実験を行った場合に免疫応答性のタンパク質
を発現しなかった（レーンＢ）。
【００８３】
【表４】
【００８４】 イムノブロット分析は、pMammBクローンがママスタチンのサイズおよび免疫学
的特徴を有するタンパク質を合成することができるｃＤＮＡインサートを含むこ
とを説明している。さらに、４４、４９および５３kDの免疫応答性のタンパク質
が、pMammBでトランスフェクションしたCos-７細胞において発現された。これら
のタンパク質は、以前に正常ヒト***細胞で同定したママスタチンタンパク質と
同じ分子量で移動した。この免疫応答性タンパク質の群は、空のベクターpcＤＮ
Ａ３でトランスフェクションしたCos-７細胞中では同定されなかった。
的特徴を有するタンパク質を合成することができるｃＤＮＡインサートを含むこ
とを説明している。さらに、４４、４９および５３kDの免疫応答性のタンパク質
が、pMammBでトランスフェクションしたCos-７細胞において発現された。これら
のタンパク質は、以前に正常ヒト***細胞で同定したママスタチンタンパク質と
同じ分子量で移動した。この免疫応答性タンパク質の群は、空のベクターpcＤＮ
Ａ３でトランスフェクションしたCos-７細胞中では同定されなかった。
【００８５】 図１に示す特定のアッセイにおいて、ＮＨＭＣコントロールは異常に高量の４
４ｋＤママスタチンを示す。これは４℃でＮＨＭＣ標準を長期間（>1年）貯蔵す
ることによって製造された人工産物であり、時間をかけて高分子量の形態の分解
が引き起こされたものである。より新鮮なＮＨＭＣサンプル（<１年）または凍 結サンプルを用いたときは、４４kDタンパク質は常に高分子量形態より少ない。
４ｋＤママスタチンを示す。これは４℃でＮＨＭＣ標準を長期間（>1年）貯蔵す
ることによって製造された人工産物であり、時間をかけて高分子量の形態の分解
が引き起こされたものである。より新鮮なＮＨＭＣサンプル（<１年）または凍 結サンプルを用いたときは、４４kDタンパク質は常に高分子量形態より少ない。
【００８６】実施例７ ＧＳＴ融合 ママスタチンクローンは同様にバキュロウイルス発現系にサブクローニングす
ることができる。pMammAインサートをファーミンゲン（Pharmingen(サン・ディ エゴ、カリフォルニア））から市販されており入手可能であるpAcG3Xにサブクロ
ーニングした。このベクターにより、コーディング領域のグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子上流の一部を有するＧＳＴとの融合タンパク質
として、ママスタチンの製造が可能となる。
ることができる。pMammAインサートをファーミンゲン（Pharmingen(サン・ディ エゴ、カリフォルニア））から市販されており入手可能であるpAcG3Xにサブクロ
ーニングした。このベクターにより、コーディング領域のグルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子上流の一部を有するＧＳＴとの融合タンパク質
として、ママスタチンの製造が可能となる。
【００８７】 pMammAインサートをBamHI(5'）およびSmaI（３'）制限酵素認識部位、小さい 非特異的領域およびママスタチン配列の一部を含むPCRの調製セットによって、 サブクローニングした。３組のプライマー（各々、リーディング・フレームにお
いてシフト）を調製した。プライマーはpMammAクローンにハイブリダイズし、お
よびpMammA鋳型ＤＮＡと典型的なＰＣＲ反応において、ｐAcG3X中のGST遺伝子の
リーディング・フレームに挿入することができるpMammAＰＣＲ産物を増幅した。
ついでそのベクターを使用してＨigh５（イン・ビトロゲン）宿主昆虫細胞をト ランスフェクションしたところ、ＧＳＴ−ママスタチン融合タンパク質を発現す
るが、これはグルタチオン樹脂（グルタチオンアガロース、キアゲン（Qiagen) 、チャッツワース（Chatsworth）、カリフォルニア）を用いて宿主昆虫細胞から
容易に精製した。
いてシフト）を調製した。プライマーはpMammAクローンにハイブリダイズし、お
よびpMammA鋳型ＤＮＡと典型的なＰＣＲ反応において、ｐAcG3X中のGST遺伝子の
リーディング・フレームに挿入することができるpMammAＰＣＲ産物を増幅した。
ついでそのベクターを使用してＨigh５（イン・ビトロゲン）宿主昆虫細胞をト ランスフェクションしたところ、ＧＳＴ−ママスタチン融合タンパク質を発現す
るが、これはグルタチオン樹脂（グルタチオンアガロース、キアゲン（Qiagen) 、チャッツワース（Chatsworth）、カリフォルニア）を用いて宿主昆虫細胞から
容易に精製した。
【００８８】 pAcG3X（ファーミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）のBamHI、SmaI制 限部位に挿入するためのＤＮＡを調製するため、プライマーのセットを３つのリ
ーディングフレームを含むように、５'プライマーとしては、BamHI認識部位（GG
ATCC)、pMammA配列の一部およびｐBluescriptベクターからのいくつかの５'配列
を含むように調製した。該３'プライマーも同一で、SmaI認識部位（GGGCCC)、pM
ammA配列の一部およびｐBluescriptのいくつかの配列を含むように調製した。 使用したプライマーのセットを以下の表に示す。
ーディングフレームを含むように、５'プライマーとしては、BamHI認識部位（GG
ATCC)、pMammA配列の一部およびｐBluescriptベクターからのいくつかの５'配列
を含むように調製した。該３'プライマーも同一で、SmaI認識部位（GGGCCC)、pM
ammA配列の一部およびｐBluescriptのいくつかの配列を含むように調製した。 使用したプライマーのセットを以下の表に示す。
【００８９】
【表５】
【００９０】 １つのプライマーのセットのみ（配列番号：６および８）が活性化阻害ママス
タチンをコードすることができるクローンを製造した。その活性化クローンは、
High５を形質転換するために使用する場合、形質転換した細胞中で免疫学的に反
応性のママスタチンを製造した（図２参照）。 他の公知の真核生物発現系を同様にママスタチンタンパクを製造するために使
用してよい。
タチンをコードすることができるクローンを製造した。その活性化クローンは、
High５を形質転換するために使用する場合、形質転換した細胞中で免疫学的に反
応性のママスタチンを製造した（図２参照）。 他の公知の真核生物発現系を同様にママスタチンタンパクを製造するために使
用してよい。
【００９１】実施例８ イン・ビトロ転写および翻訳によって製造したタンパク質による阻害アッセイ pMammB、ママスタチンｃＤＮＡのイン・ビトロ転写をストラタジーンのExpres
s ＲＮＡ転写キットを用いて行ってママスタチンＲＮＡを製造した。製造された
ＲＮＡをストラタジーン・イン・ビトロ・エクスプレス・翻訳キット（Stratage
ne In Vitro Express translation kit）を用いてタンパク質に翻訳した。ママ スタチンＲＮＡの翻訳から製造されたママスタチンタンパク質は、培養中で***
細胞増殖を阻害することを示した。
s ＲＮＡ転写キットを用いて行ってママスタチンＲＮＡを製造した。製造された
ＲＮＡをストラタジーン・イン・ビトロ・エクスプレス・翻訳キット（Stratage
ne In Vitro Express translation kit）を用いてタンパク質に翻訳した。ママ スタチンＲＮＡの翻訳から製造されたママスタチンタンパク質は、培養中で***
細胞増殖を阻害することを示した。
【００９２】 MCF‐７細胞の培養を上記の翻訳アッセイにて製造したタンパク質産物で処理 した。タンパク質産物（容積の５％、培養培地）を１ウェル当たり１mlの培地を
含む１２ウェルプレート中の細胞に添加した。平行実験の培養を翻訳産物および
抗−ママスタチン抗体３C6の両方で最終濃度３０μg／mlで処理した。
含む１２ウェルプレート中の細胞に添加した。平行実験の培養を翻訳産物および
抗−ママスタチン抗体３C6の両方で最終濃度３０μg／mlで処理した。
【００９３】 陰性コントロールとして、培養物をママスタチンｃＤＮＡの不在下でインキュ
ベートしたストラタジーン・イン・ビトロ・エクスプレス・翻訳キット（すなわ
ちベクターとして採用）で翻訳したタンパク質産物で処理した。これらの溶解産
物はママスタチンタンパク質を製造する適当な機構を持たない。
ベートしたストラタジーン・イン・ビトロ・エクスプレス・翻訳キット（すなわ
ちベクターとして採用）で翻訳したタンパク質産物で処理した。これらの溶解産
物はママスタチンタンパク質を製造する適当な機構を持たない。
【００９４】 すべての培養物をタンパク質産物で処理した後に６日間増殖させ、各サンプル
の細胞数をコールターカウンター（Coulter counter）を用いて計算した。各サ ンプルの細胞数を平均できるように各培養条件には３つのサンプルを用い、阻害
％を網状赤血球溶解液で処理したコントロール細胞と比較することによって決定
した。 図３に示すように、pMammBのタンパク質翻訳産物はMCF-7細胞増殖を阻害した 。この阻害は、抗−ママスタチン抗体３C6の存在下で大きく低減されるかまたは
阻止された。
の細胞数をコールターカウンター（Coulter counter）を用いて計算した。各サ ンプルの細胞数を平均できるように各培養条件には３つのサンプルを用い、阻害
％を網状赤血球溶解液で処理したコントロール細胞と比較することによって決定
した。 図３に示すように、pMammBのタンパク質翻訳産物はMCF-7細胞増殖を阻害した 。この阻害は、抗−ママスタチン抗体３C6の存在下で大きく低減されるかまたは
阻止された。
【００９５】実施例９ pMammBでトランスフェクションした増殖Cos−７細胞から得られたならし培地内 に存在するタンパク質による***細胞の阻害 ***細胞の増殖阻害実験を、実施例６に記載するように、pMammBでトランスフ
ェクションしたCos−７細胞から入手したならし培地を用いて行った。ならし培 地によって引き起こされる増殖阻害は、抗−ママスタチン抗体の添加によって阻
害された。
ェクションしたCos−７細胞から入手したならし培地を用いて行った。ならし培 地によって引き起こされる増殖阻害は、抗−ママスタチン抗体の添加によって阻
害された。
【００９６】 MCF−７細胞を１０％非必須アミノ酸およびFBS(シグマ）を補ったMEM培地中で
１０4細胞／mlにてプレーティングした。細胞を終夜付着させ、ついで、（１） 空のベクターpcＤＮＡでトランスフェクションしたCos-７細胞（陰性コントロー
ル）、（２）pMammBでトランスフェクションしたCos-７細胞（pMammB-Cos）、（
３）ＭＨＭＣならし培地、または（４）ならし培地ではない培地のいずれかから
のならし培地（３日間培養）の１０％の容量を補った。平行のＭＣＦ−７細胞の
培養に３０μg／mlの３C６阻害抗体を補った。処理したMCF−７細胞を６日間増 殖させて、ついで血球測定計によってカウントした。
１０4細胞／mlにてプレーティングした。細胞を終夜付着させ、ついで、（１） 空のベクターpcＤＮＡでトランスフェクションしたCos-７細胞（陰性コントロー
ル）、（２）pMammBでトランスフェクションしたCos-７細胞（pMammB-Cos）、（
３）ＭＨＭＣならし培地、または（４）ならし培地ではない培地のいずれかから
のならし培地（３日間培養）の１０％の容量を補った。平行のＭＣＦ−７細胞の
培養に３０μg／mlの３C６阻害抗体を補った。処理したMCF−７細胞を６日間増 殖させて、ついで血球測定計によってカウントした。
【００９７】 ならし培地中でインキュベートしたMCF-７細胞の増殖を、コントロールの条件
付けしていない培地中でインキュベートしたMCF-７細胞の増殖と比較することに
より、細胞増殖の阻害を決定した。データを図４に示すが、pMammBで形質転換し
た細胞からのならし培地が正常なヒト***細胞のならし培地と同様に有効に乳癌
細胞増殖を阻害したことを示している。この阻害は抗−ママスタチン抗体の存在
下で阻止された。
付けしていない培地中でインキュベートしたMCF-７細胞の増殖と比較することに
より、細胞増殖の阻害を決定した。データを図４に示すが、pMammBで形質転換し
た細胞からのならし培地が正常なヒト***細胞のならし培地と同様に有効に乳癌
細胞増殖を阻害したことを示している。この阻害は抗−ママスタチン抗体の存在
下で阻止された。
【００９８】実施例１０ ３つの免疫学的に応答性の抗‐ママスタチンタンパク質 組織培養細胞中の全正常ヒト***細胞（NHMC)および乳癌部位を溶解し、細胞 溶解タンパク質を、上記およびアービン（Ervin, Paul）１９９５、博士論文、 ミシガン大学第２章に記載されるようにＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離した。溶解
した細胞サンプルをミニ−プロテイン(Mini-Protean）II装置で１０％のＳＤＳ −ＰＡＧＥ（２５μg／ サンプル）上で分離した。タンパク質をニトロセルロー
スへトランスファーし、抗−ママスタチンモノクローナル抗体７G6またはIgMコ ントロール抗体でプローブし、アルカリフォスファターゼコンジュゲート第二抗
体であるヤギ抗−マウスIgMをNBT／BCIP基質系とともに利用して陽性の抗体の反
応を比色分析により検出した。そのデータを図５に示す。
した細胞サンプルをミニ−プロテイン(Mini-Protean）II装置で１０％のＳＤＳ −ＰＡＧＥ（２５μg／ サンプル）上で分離した。タンパク質をニトロセルロー
スへトランスファーし、抗−ママスタチンモノクローナル抗体７G6またはIgMコ ントロール抗体でプローブし、アルカリフォスファターゼコンジュゲート第二抗
体であるヤギ抗−マウスIgMをNBT／BCIP基質系とともに利用して陽性の抗体の反
応を比色分析により検出した。そのデータを図５に示す。
【００９９】
【表６】
【０１００】 図５に示すように、正常のヒト***細胞は、抗−ママスタチンモノクローナル
抗体によって強く認識される４９および５３kDにて移動する二重線のタンパク質
、および第３の弱い免疫応答性の４４kDタンパク質を発現した。試験した４つの
腫瘍細胞株は４４kDの免疫応答性タンパク質のみを発現するか（レーン１、４）
または免疫応答性のタンパク質は全く発現されなかった（レーン２、３）。
抗体によって強く認識される４９および５３kDにて移動する二重線のタンパク質
、および第３の弱い免疫応答性の４４kDタンパク質を発現した。試験した４つの
腫瘍細胞株は４４kDの免疫応答性タンパク質のみを発現するか（レーン１、４）
または免疫応答性のタンパク質は全く発現されなかった（レーン２、３）。
【０１０１】 上記のデータは数年の期間をかけて４２名の異なる整腹***形成患者からの正
常細胞で行った実験の代表例である。正常細胞および癌細胞株での４４kDタンパ
ク質の発現は各調製物で強度が変化した。
常細胞で行った実験の代表例である。正常細胞および癌細胞株での４４kDタンパ
ク質の発現は各調製物で強度が変化した。
【０１０２】実施例１１ ママスタチンはリンタンパク質である ***細胞の細胞性のリン酸化タンパク質を、32P-オルトリン酸（２００μCi／
ml）を正常***細胞の培養中に２４時間加えることにより32Pでラベリングした 。ならし培地を３０kDの分子量制限のアミコン遠心により５倍に濃縮した。濃縮
した培地を濾過膜上でPBSにて１回すすいで過剰な未導入リン酸を除去し、PBS溶
出バッファーを用いたS-200 SEPHACRYL（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデ ン）分子篩クロマトグラフィー（１００cm×０.７５cmカラム）によって分画し た。イムノブロットを上記のように調製し、７G6抗体でプロービングした。
ml）を正常***細胞の培養中に２４時間加えることにより32Pでラベリングした 。ならし培地を３０kDの分子量制限のアミコン遠心により５倍に濃縮した。濃縮
した培地を濾過膜上でPBSにて１回すすいで過剰な未導入リン酸を除去し、PBS溶
出バッファーを用いたS-200 SEPHACRYL（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデ ン）分子篩クロマトグラフィー（１００cm×０.７５cmカラム）によって分画し た。イムノブロットを上記のように調製し、７G6抗体でプロービングした。
【０１０３】 放射線標識した５３kDママスタチンタンパク質を免疫沈降によってならし培地
中で同定した。この分析はママスタチンが分泌リンタンパク質であることを示し
ていた。分泌されたリンタンパク質は一般に知られていないので、細胞のブレフ
ェルディン（Brefeldin）Ａ処理を利用して、ママスタチンが分泌あるいは細胞 破砕または漏出によりならし培地中に存在するか否かを決定した。ブレフェルデ
ィンＡは真核細胞からのタンパク質の分泌を阻止する真菌性化合物である。ブレ
フェルディンＡは正常な小胞体およびゴルジ体の機能を阻害し、小胞形成を阻止
する（アービン・ポール、１９９５、学位論文、第２５頁）。たいていの分泌タ
ンパク質は膜結合小胞からエクソサイトーシスのプロセスによって細胞から遊離
され、小胞形成の阻止は多くのタンパク質の分泌を阻止する。NHMCがブレフェル
ディンＡの存在下で増殖する場合、リン酸化ママスタチンはならし培地中で同定
されない。
中で同定した。この分析はママスタチンが分泌リンタンパク質であることを示し
ていた。分泌されたリンタンパク質は一般に知られていないので、細胞のブレフ
ェルディン（Brefeldin）Ａ処理を利用して、ママスタチンが分泌あるいは細胞 破砕または漏出によりならし培地中に存在するか否かを決定した。ブレフェルデ
ィンＡは真核細胞からのタンパク質の分泌を阻止する真菌性化合物である。ブレ
フェルディンＡは正常な小胞体およびゴルジ体の機能を阻害し、小胞形成を阻止
する（アービン・ポール、１９９５、学位論文、第２５頁）。たいていの分泌タ
ンパク質は膜結合小胞からエクソサイトーシスのプロセスによって細胞から遊離
され、小胞形成の阻止は多くのタンパク質の分泌を阻止する。NHMCがブレフェル
ディンＡの存在下で増殖する場合、リン酸化ママスタチンはならし培地中で同定
されない。
【０１０４】 ママスタチンタンパク質中でリン酸化されるアミノ酸残基を決定するため、放
射性標識した５３kDタンパク質をホスホアミノ酸分析にかけた。MHMC細胞を32P −オルトリン酸と２４時間インキュベートした。ついで、細胞溶解産物を抗−マ
マスタチン抗体７G６で免疫沈降し、以下のように精製した。５３kDタンパク質 をトリプシンで消化し、ついで、酸で加水分解した。２次元の薄層クロマトグラ
フィーを使用してママスタチンのリン酸化アミノ酸を分析した。32P−アミノ酸 をホスホ−ser/thr/tyrコントロールと混合し、２D TLCプレート（２０cm）の起
点に負荷した。サンプルを２次元で分離した：第１次元−ｐH１.９バッファー（
５０mlギ酸、１５６ml氷酢酸／２０００ml（１７９４H2O)）、２０分＠１.５Ｋ ボルト；時計回りに回転；第２次元−ｐH３.５バッファー（１０mlピリジン、１
００ml氷酢酸：１８９０ml H2O)）、１６分＠１.３Ｋボルト；時計回りに回転。
射性標識した５３kDタンパク質をホスホアミノ酸分析にかけた。MHMC細胞を32P −オルトリン酸と２４時間インキュベートした。ついで、細胞溶解産物を抗−マ
マスタチン抗体７G６で免疫沈降し、以下のように精製した。５３kDタンパク質 をトリプシンで消化し、ついで、酸で加水分解した。２次元の薄層クロマトグラ
フィーを使用してママスタチンのリン酸化アミノ酸を分析した。32P−アミノ酸 をホスホ−ser/thr/tyrコントロールと混合し、２D TLCプレート（２０cm）の起
点に負荷した。サンプルを２次元で分離した：第１次元−ｐH１.９バッファー（
５０mlギ酸、１５６ml氷酢酸／２０００ml（１７９４H2O)）、２０分＠１.５Ｋ ボルト；時計回りに回転；第２次元−ｐH３.５バッファー（１０mlピリジン、１
００ml氷酢酸：１８９０ml H2O)）、１６分＠１.３Ｋボルト；時計回りに回転。
【０１０５】 TLCプレートをニンヒドリン染色し、フィルムに曝した。ホスホ−アミノ酸分 析は、ニンヒドリン染色したホスホ−アミノ酸標準に対するオートラジオグラフ
ィーと比較することにより、５３kDママスタチンタンパク質が３つのタイプのリ
ン酸化アミノ酸残基を含むことを示した。
ィーと比較することにより、５３kDママスタチンタンパク質が３つのタイプのリ
ン酸化アミノ酸残基を含むことを示した。
【０１０６】 トレオニン(Th)は最も豊富なリン酸化アミノ酸であり、ついでセリン（S)およ
びチロシン（Ty）が続き、これらは最も少ないリン酸化種である。しかしながら
、リン酸化アミノ酸残基の相対的な豊富さは天然タンパク質のものを表すもので
はない。というのは、酸加水分解がホスホチロシン残基からリン酸を遊離させ得
るからである。
びチロシン（Ty）が続き、これらは最も少ないリン酸化種である。しかしながら
、リン酸化アミノ酸残基の相対的な豊富さは天然タンパク質のものを表すもので
はない。というのは、酸加水分解がホスホチロシン残基からリン酸を遊離させ得
るからである。
【０１０７】実施例１２ 変化したリン酸化を有する１つのママスタチンタンパク質 タンパク質の細胞リン酸化はホスファターゼおよびキナーゼによって変調する
ことができる。ママスタチンは、ママスタチンホスファターゼの異なる活性のた
めに、正常および腫瘍細胞の溶解産物中で異なってリン酸化される。NHMC溶解産
物中のママスタチンへ及ぼすホスファターゼの効果を調べた。
ことができる。ママスタチンは、ママスタチンホスファターゼの異なる活性のた
めに、正常および腫瘍細胞の溶解産物中で異なってリン酸化される。NHMC溶解産
物中のママスタチンへ及ぼすホスファターゼの効果を調べた。
【０１０８】 NHMCを低カルシウム培地中でコンフルエンスに達するまで増殖させ、TBS中に こそぎとることによって回収した。細胞をTBSで洗浄し、２mg／mlのｐH６.６の 酢酸バッファーに０.５％のTritonX-100を加えて再懸濁した。５μg／mlのイェ ルシニアホスファターゼ（Yersinia phosphatase）（YOP)（スタッキー（Stucke
y）ら、Nature 370: 571-5 (1994））または活性化部位を含むイェルシニアホス
ファターゼ変異体（MYOP）を使用して、３７℃で６時間、細胞溶解産物を消化し
た（YOPおよびMYOPはザ・ユニバーシティー・オブ・ミシガン、生化学研究室の ディクソン（S. Jack Dixon）博士より入手）。図６に示すように、正常ヒト乳 房細胞溶解産物のイェルシニアホスファターゼ（YOP）での消化は、抗−ママス タチンイムノブロットによって同定される５３kDママスタチンタンパク質が減少
した量となる結果となった(レーンＡ)。対照的に、イェルシニアホスファターゼ
変異体（MYOP、レーンＢ）での消化は５３kDのママスタチンタンパク質の同定を
変化させなかった。これら結果は、イムノブロットによる５３kDママスタチンタ
ンパク質の同定がママスタチンタンパク質のリン酸化の状態の都合のよい測定手
段であることを示している。
y）ら、Nature 370: 571-5 (1994））または活性化部位を含むイェルシニアホス
ファターゼ変異体（MYOP）を使用して、３７℃で６時間、細胞溶解産物を消化し
た（YOPおよびMYOPはザ・ユニバーシティー・オブ・ミシガン、生化学研究室の ディクソン（S. Jack Dixon）博士より入手）。図６に示すように、正常ヒト乳 房細胞溶解産物のイェルシニアホスファターゼ（YOP）での消化は、抗−ママス タチンイムノブロットによって同定される５３kDママスタチンタンパク質が減少
した量となる結果となった(レーンＡ)。対照的に、イェルシニアホスファターゼ
変異体（MYOP、レーンＢ）での消化は５３kDのママスタチンタンパク質の同定を
変化させなかった。これら結果は、イムノブロットによる５３kDママスタチンタ
ンパク質の同定がママスタチンタンパク質のリン酸化の状態の都合のよい測定手
段であることを示している。
【０１０９】 上記のようにイェルシニアホスファターゼ（YOP）の存在下でインキュベート したならし培地を用いてMCF-7を処理した。以前の観察のように、NHMCならし培 地はMCF-7細胞の増殖を阻害し、この阻害は抗−ママスタチン抗体によって阻止 される。図７に示すように、YOPによるNHMCならし培地の処理はこの阻害活性を 破棄させる。コントロールとして、ホスファターゼ活性を欠くYOP変異体（M.YOP
）によるNHMCならし培地の処理を試験した。この変異体はNHMCならし培地の阻害
活性に影響は全く及ぼさなかった。抗−ママスタチン抗体７G６を用いたならし 培地の免疫沈降は阻害活性を除去した。
）によるNHMCならし培地の処理を試験した。この変異体はNHMCならし培地の阻害
活性に影響は全く及ぼさなかった。抗−ママスタチン抗体７G６を用いたならし 培地の免疫沈降は阻害活性を除去した。
【０１１０】 TCA沈降は、YOPでのならし培地のインキュベートが約５０％の導入リン酸を除
去することを示した。上記に示すように、YOPはまたNHMC溶解産物から５３kD種 を除去した（図６）。
去することを示した。上記に示すように、YOPはまたNHMC溶解産物から５３kD種 を除去した（図６）。
【０１１１】実施例１３ 癌性***細胞ではなく正常***細胞により製造されたリン酸化ママスタチン 正常かつ形質転換した***細胞を32Pオルトリン酸で標識した。ＭＣＦ−７細 胞をＭＥＭ（セロックス（Cerox))（１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸およびイン スリン（１０mg／l）を補って）中で増殖させた他は、癌腫細胞株をＡＴＣＣの 示唆どおりに培地中で増殖させた。細胞タンパク質の32Pオルトリン酸標識を、 ２％の透析したFBSを含むリン酸不含DMEM(ICN)中で行った。細胞を２００μCi：
／mlの32Ｐ−リン酸とともに３７℃で２４時間インキュベートした。４８時間後
、ならし培地を細胞培養液から回収し、５倍に濃縮した。ならし培地をTBSで洗 浄し、１０kDの分子量のカットオフのアミコン・フィルターで濃縮した。細胞層
を、溶解バッファー、細胞溶解産物からの１.５ml／フラスコ（０.５％Triton X
-100、デオキシコール酸としてで２.０１％SDS）およびならし培地中にこそぎと
った（テフロン細胞スクレーパー使用）。
／mlの32Ｐ−リン酸とともに３７℃で２４時間インキュベートした。４８時間後
、ならし培地を細胞培養液から回収し、５倍に濃縮した。ならし培地をTBSで洗 浄し、１０kDの分子量のカットオフのアミコン・フィルターで濃縮した。細胞層
を、溶解バッファー、細胞溶解産物からの１.５ml／フラスコ（０.５％Triton X
-100、デオキシコール酸としてで２.０１％SDS）およびならし培地中にこそぎと
った（テフロン細胞スクレーパー使用）。
【０１１２】 ママスタチンタンパク質を、５倍濃縮培地または細胞溶解産物５００μlあた り５μgの７G6抗−ママスタチン抗体を加えることによって免疫沈降し、室温で １.５時間インキュベートした。ヤギ抗‐マウスIgM第２抗体（５μg／0.5ml）を
加え、ついで混合物をさらに1時間インキュベートした。プロテインＧ ＰＬＵＳ
/ＡアガロースＲスラリー（オンコジーン・サイエンス（Oncogene Science）） を加え、ついで混合物を室温で1.5時間インキュベートして抗体複合体を固定し た。
加え、ついで混合物をさらに1時間インキュベートした。プロテインＧ ＰＬＵＳ
/ＡアガロースＲスラリー（オンコジーン・サイエンス（Oncogene Science）） を加え、ついで混合物を室温で1.5時間インキュベートして抗体複合体を固定し た。
【０１１３】 複合体を溶解バッファーで６回洗浄し、各回の洗浄の後に３０００×ｇで遠心
した。SES-PAGEローディングバッファー（５０μｌ）を加えた後、サンプルを１
００℃で3分間加熱した。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロ ースにトランスファーし、さらにコダックＸ−ＡＲフィルムに露光した。
した。SES-PAGEローディングバッファー（５０μｌ）を加えた後、サンプルを１
００℃で3分間加熱した。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロ ースにトランスファーし、さらにコダックＸ−ＡＲフィルムに露光した。
【０１１４】 ＮＨＭＣタンパク質のリン酸標識および続く免疫沈降は、ＮＨＭＣ中の４９ｋ
Ｄおよび５３ｋＤリンタンパク質を同定した。癌腫細胞株では４９ｋＤおよび５
３ｋＤリンタンパク質は認められなかった。癌腫細胞株ＭＨＣ−７、Ｔ４７Ｄ、
ＺＲ−７５−１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５は４４kDの免疫応答性タンパク質を
発現したが、このタンパク質は32P−オルトリン酸で標識されなかった。
Ｄおよび５３ｋＤリンタンパク質を同定した。癌腫細胞株では４９ｋＤおよび５
３ｋＤリンタンパク質は認められなかった。癌腫細胞株ＭＨＣ−７、Ｔ４７Ｄ、
ＺＲ−７５−１およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５は４４kDの免疫応答性タンパク質を
発現したが、このタンパク質は32P−オルトリン酸で標識されなかった。
【０１１５】 本実験は、ママスタチンの分子量の増加とともにより多くのリン酸が取りこま
れることを示す。形質転換細胞株でのママスタチンのリン酸化の欠如は、そのタ
ンパク質の高分子量形態の欠如およびママスタチン阻害活性の欠如と相関してい
る。
れることを示す。形質転換細胞株でのママスタチンのリン酸化の欠如は、そのタ
ンパク質の高分子量形態の欠如およびママスタチン阻害活性の欠如と相関してい
る。
【０１１６】実施例１４ ママスタチンキナーゼおよびホスファターゼ 正常細胞または癌腫細胞のフラスコを７５％のコンフルエンスに達するまで増
殖させた。細胞培養物をTBSで3回洗浄し、ついでテフロンスクレーパーを用いて
TBS中にこそぎ入れた。細胞懸濁液を１０００ｇの遠心でペレット化し、ついで 少量のTBS中に再懸濁した。各タイプの細胞のアリコートをタンパク質定量のた め取り出した。ついで、タンパク質濃度を溶解バッファー（０.５％TritonX−１
００および、各５μg／mlのアプロチニン、ロイペプチンおよびPMSFを加えたTBS
）２mg／mlに等しくした。等質量の正常細胞タンパク質および腫瘍細胞タンパク
質を混合し、３７℃で３時間インキュベートした。正常細胞および癌腫細胞溶解
産物の平行混合を１０ｎＭオルトバナジン塩（Orthovandate(NaVO4))、ホスファ
ターゼインヒビターの存在下で行った。ついで混合物をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより
分離し、７Ｇ６抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した。そのデータ
を図８に示す。
殖させた。細胞培養物をTBSで3回洗浄し、ついでテフロンスクレーパーを用いて
TBS中にこそぎ入れた。細胞懸濁液を１０００ｇの遠心でペレット化し、ついで 少量のTBS中に再懸濁した。各タイプの細胞のアリコートをタンパク質定量のた め取り出した。ついで、タンパク質濃度を溶解バッファー（０.５％TritonX−１
００および、各５μg／mlのアプロチニン、ロイペプチンおよびPMSFを加えたTBS
）２mg／mlに等しくした。等質量の正常細胞タンパク質および腫瘍細胞タンパク
質を混合し、３７℃で３時間インキュベートした。正常細胞および癌腫細胞溶解
産物の平行混合を１０ｎＭオルトバナジン塩（Orthovandate(NaVO4))、ホスファ
ターゼインヒビターの存在下で行った。ついで混合物をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより
分離し、７Ｇ６抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した。そのデータ
を図８に示す。
【０１１７】
【表７】
【０１１８】 図８に示すように癌細胞（ＺＲ−７５−１）（レーンＡ）はＮＨＭＣ(レーン Ｂ）に比較して、５３／４９kDママスタチンを産生しなかった。正常細胞タンパ
ク質および癌細胞タンパク質をプロテイナーゼの存在下で混合すると活性な５３
kDインヒビターの量が減少する（レーンD)。しかしながら、チロシン−ホスファ
ターゼインヒビター（NaVO4)の存在下では、５３kD種は混合物中に保持されてい
る(レーンC)。これらの結果は、癌腫細胞がママスタチンのリン酸化形態を排除 しうるホスファターゼ活性を発現することを示している。
ク質および癌細胞タンパク質をプロテイナーゼの存在下で混合すると活性な５３
kDインヒビターの量が減少する（レーンD)。しかしながら、チロシン−ホスファ
ターゼインヒビター（NaVO4)の存在下では、５３kD種は混合物中に保持されてい
る(レーンC)。これらの結果は、癌腫細胞がママスタチンのリン酸化形態を排除 しうるホスファターゼ活性を発現することを示している。
【０１１９】 正常細胞株および形質転換株でのママスタチンの発現はウエスタンブロット分
析により定量的に測定できる。抗−ママスタチンモノクローナル抗体を用い、乳
癌細胞および正常***上皮からの細胞との間で該タンパク質の発現に一貫した差
異が存在するが示された。ママスタチンは、ヒトの正常な女性***組織中では抗
−ママスタチンモノクローナル抗体７G6を用いたウエスタンブロット分析によっ
て４４、４９および５３kD種として認められた。乳癌細胞では、４４kD種が首尾
一貫することなく認められたが、４９または５３kDの免疫応答性形態は決して認
められなかった。４９および５３kD形態が正常細胞中で同定される場合、それら
はリン酸化されている。４４kD種はリン酸化されていない。従って、イムノブロ
ット分析を用い、ママスタチンの４４および４９kD種、および５３kD種の発現を
観察することによってママスタチンがリン酸化されているか否かを決定すること
ができる。
析により定量的に測定できる。抗−ママスタチンモノクローナル抗体を用い、乳
癌細胞および正常***上皮からの細胞との間で該タンパク質の発現に一貫した差
異が存在するが示された。ママスタチンは、ヒトの正常な女性***組織中では抗
−ママスタチンモノクローナル抗体７G6を用いたウエスタンブロット分析によっ
て４４、４９および５３kD種として認められた。乳癌細胞では、４４kD種が首尾
一貫することなく認められたが、４９または５３kDの免疫応答性形態は決して認
められなかった。４９および５３kD形態が正常細胞中で同定される場合、それら
はリン酸化されている。４４kD種はリン酸化されていない。従って、イムノブロ
ット分析を用い、ママスタチンの４４および４９kD種、および５３kD種の発現を
観察することによってママスタチンがリン酸化されているか否かを決定すること
ができる。
【０１２０】実施例１５ ヒト血清中でのママスタチンの同定 精製抗−ママスタチンモノクローナル抗体６B8および３C6を用い、酵素結合免
疫吸着アッセイ（ELISA)をママスタチンの検出のために確立した。 抗体６B8を用い、１０μg／mlまたは１００μl／ウェルの濃度で、室温で３時
間または４℃で終夜、イムロン １（Immulon 1）９６ウェルマイクロタイタープ
レート（イムロン社）をコーティングした。プレートをTBS（１５０mM NaCl、１
００ｍM トリスｐH7.4）中の２％BSA(シグマ）で３０分間ブロックし、ついで２
％BSA溶液に５０％に希釈した精製したママスタチンまたはサンプル血清ととも に３７℃で１.５時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを第二抗 体を加える前に、３００μl／ウェルのTBSプラス0.1％TritonX-１００で５分間 、３回洗浄した。
疫吸着アッセイ（ELISA)をママスタチンの検出のために確立した。 抗体６B8を用い、１０μg／mlまたは１００μl／ウェルの濃度で、室温で３時
間または４℃で終夜、イムロン １（Immulon 1）９６ウェルマイクロタイタープ
レート（イムロン社）をコーティングした。プレートをTBS（１５０mM NaCl、１
００ｍM トリスｐH7.4）中の２％BSA(シグマ）で３０分間ブロックし、ついで２
％BSA溶液に５０％に希釈した精製したママスタチンまたはサンプル血清ととも に３７℃で１.５時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを第二抗 体を加える前に、３００μl／ウェルのTBSプラス0.1％TritonX-１００で５分間 、３回洗浄した。
【０１２１】 第2抗体はビオチン化した３Ｃ６であった。抗体は、０.１ＭのNaHCO3中でビオ
チン、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル（N-hydroxy succinimate ester）（シ グマ）と室温で2時間または４℃で16時間インキュベートすることによってビオ チン化する。抗体を使用の前または保存前に、１MのNaCl、５０mMのトリス（ｐH
7.4）、０.０２％のアジ化物（NaN3、シグマ）に透析した。
チン、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル（N-hydroxy succinimate ester）（シ グマ）と室温で2時間または４℃で16時間インキュベートすることによってビオ チン化する。抗体を使用の前または保存前に、１MのNaCl、５０mMのトリス（ｐH
7.4）、０.０２％のアジ化物（NaN3、シグマ）に透析した。
【０１２２】 第二抗体はビオチン化した３Ｃ６であった。抗体のビオチン化は、ビオチン、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（シグマ）とともに０.１Ｍ ＮａＨＣＯ
3中で室温にて２時間および４℃にて１６時間インキュベートすることにより行 った。抗体を使用前に１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスｐＨ７.４、０.０２％ア ジド（ＮａＮ3、シグマ）中に透析した。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（シグマ）とともに０.１Ｍ ＮａＨＣＯ
3中で室温にて２時間および４℃にて１６時間インキュベートすることにより行 った。抗体を使用前に１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスｐＨ７.４、０.０２％ア ジド（ＮａＮ3、シグマ）中に透析した。
【０１２３】 ビオチン化した抗−ママスタチン抗体を２％BSA／TBS溶液中にて１μg/mlおよ
び１００μl／ウェルにて添加し、３７℃で１.５時間インキュベートした。マイ
クロタイタープレートを上記のようにTBSプラス0.1％Triton X-100で５分間で５
回洗浄した。第二抗体をアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（サザ
ン・バイオテクノロジー（Southern Biotechnology））で同定し、すべてのサン
プルについて２％BSA/TBS中、１００μl／ウェルで１／１０００の希釈にて1時 間インキュベートした。
び１００μl／ウェルにて添加し、３７℃で１.５時間インキュベートした。マイ
クロタイタープレートを上記のようにTBSプラス0.1％Triton X-100で５分間で５
回洗浄した。第二抗体をアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（サザ
ン・バイオテクノロジー（Southern Biotechnology））で同定し、すべてのサン
プルについて２％BSA/TBS中、１００μl／ウェルで１／１０００の希釈にて1時 間インキュベートした。
【０１２４】 ELISAアッセイをＰＮＰＰ（パラニトロフェニルホスフェート、シグマ）をア ルカリホスファターゼバッファー（１０mMジエタノールアミンｐH9.5（シグマ）
、０.５０mM MgCl2（シグマ））中で１mg／mlにて用いて比色的に発色させた。 マイクロタイタープレートを１５分および３０分間隔で４０５nmでＥＬＩＳＡリ
ーダー上で読みとった。
、０.５０mM MgCl2（シグマ））中で１mg／mlにて用いて比色的に発色させた。 マイクロタイタープレートを１５分および３０分間隔で４０５nmでＥＬＩＳＡリ
ーダー上で読みとった。
【０１２５】 細胞溶解産物またはならし培地から単離したクロマトグラフィー精製したママ
スタチンを用い、低ナノグラム範囲でママスタチンのアッセイの感度を示すＥＬ
ＩＳＡのための標準曲線を確立した（図９参照）。正常ヒト志願者血清中のママ
スタチンレベルの定量を、志願者から１ヶ月間、２日間隔で採取した血清サンプ
ルで行った。このアッセイにより正常ヒト女性血清中のママスタチンレベルが検
出可能であり、約１０〜５０μg/mlの間でで変化した（図１０）。
スタチンを用い、低ナノグラム範囲でママスタチンのアッセイの感度を示すＥＬ
ＩＳＡのための標準曲線を確立した（図９参照）。正常ヒト志願者血清中のママ
スタチンレベルの定量を、志願者から１ヶ月間、２日間隔で採取した血清サンプ
ルで行った。このアッセイにより正常ヒト女性血清中のママスタチンレベルが検
出可能であり、約１０〜５０μg/mlの間でで変化した（図１０）。
【０１２６】 ママスタチンレベルをまた、乳癌患者から採取した血清中でも測定した。ミシ
ガン大学胸部ケアセンターで結節陰性（node negative）乳癌と診断された患者 を、処理の全経過を通じて、血清中のママスタチン発現について検査した。その
データを図１１に示し、以下にまとめた。血清サンプルを、サイトトキシン、ア
ドリアマイシン、メトトレキセート、および５Fuを用いたホルモンサイクリング
（hormonal cycling）組み合わせモダリティープロトコールの全処置期間と通じ
て乳癌患者から回収した。凝血後、血清を遠心により全血から分離し、使用まで
−２０℃で保存した。０.５％NFDM中で５０％の濃度の血清１５０μlを用いたEL
ISAアッセイを、酵素結合した「サンドイッチ」アッセイにて６B8および３C6抗 −ママスタチン抗体を用いて２回行った。クロマトグラフィー精製したママスタ
チンで標準曲線を作成し、図９に示す曲線に匹敵するものとした。 ママスタチンの発現は患者によって変わり、処理の経過の間で変動した。ママ
スタチンレベルは、転移性疾患への進行とともに検出不能になることが一貫して
観察された。
ガン大学胸部ケアセンターで結節陰性（node negative）乳癌と診断された患者 を、処理の全経過を通じて、血清中のママスタチン発現について検査した。その
データを図１１に示し、以下にまとめた。血清サンプルを、サイトトキシン、ア
ドリアマイシン、メトトレキセート、および５Fuを用いたホルモンサイクリング
（hormonal cycling）組み合わせモダリティープロトコールの全処置期間と通じ
て乳癌患者から回収した。凝血後、血清を遠心により全血から分離し、使用まで
−２０℃で保存した。０.５％NFDM中で５０％の濃度の血清１５０μlを用いたEL
ISAアッセイを、酵素結合した「サンドイッチ」アッセイにて６B8および３C6抗 −ママスタチン抗体を用いて２回行った。クロマトグラフィー精製したママスタ
チンで標準曲線を作成し、図９に示す曲線に匹敵するものとした。 ママスタチンの発現は患者によって変わり、処理の経過の間で変動した。ママ
スタチンレベルは、転移性疾患への進行とともに検出不能になることが一貫して
観察された。
【０１２７】 乳癌と診断された患者は、正常患者血清中のレベルと比較して診断時の血清中
に低レベルのママスタチンを有していた。ママスタチンレベルは、一般に、ホル
モンサイクリング、アジュバント化学療法プロトコールで上昇した。ママスタチ
ンレベルは、このプロトコールでも変動した。ママスタチンレベルは死直前の進
行疾患を患う患者では検出できなかった。患者のデータを以下の表に示すように
４つの群に分類した。
に低レベルのママスタチンを有していた。ママスタチンレベルは、一般に、ホル
モンサイクリング、アジュバント化学療法プロトコールで上昇した。ママスタチ
ンレベルは、このプロトコールでも変動した。ママスタチンレベルは死直前の進
行疾患を患う患者では検出できなかった。患者のデータを以下の表に示すように
４つの群に分類した。
【０１２８】 I. 血清ママスタチンレベルが治療期間中上昇し続けた患者の群 II． 血清ママスタチンレベルが治療の最初は上昇したが、ついで検出不可能に
なった患者の群 III． 血清ママスタチンレベルが治療期間に上昇したが、ついで大きく変動し た患者の群 IV． 低レベルの血清ママスタチンを有していたが治療で検出不可能になった患
者の群。
なった患者の群 III． 血清ママスタチンレベルが治療期間に上昇したが、ついで大きく変動し た患者の群 IV． 低レベルの血清ママスタチンを有していたが治療で検出不可能になった患
者の群。
【０１２９】
【表８】
【０１３０】実施例１６ ママスタチンのイン・ビボでの効力 CD-1Nu／Nuホモザイゴートの雌の６週齢マウス（チャールズ・リバー(Charles
River））に徐放性ペレットによりエストロゲンを０.７２mg／ペレットにて、 １７βエストラジオール（イノベーティブ・リサーチ（Innovative Rsearch）＃
SE-121）の６０日間放出を用いて補給した。エストロゲンを補給したマウスに３
×１０6MCF-7を６０％マトリゲル中に注入当たり１００μl、注射した。２回の 注射を、わき腹当たり１回、投与した。腫瘍細胞増殖の７日後、ママスタチンを
投与した。被験マウスに６週間の間、２日間隔で産生培地中のママスタチンの１
、２、または５μgを与えた。コントロールのマウスにはBSAを投与するか、また
は腫瘍を注射せずにインヒビター単独を注射した。
River））に徐放性ペレットによりエストロゲンを０.７２mg／ペレットにて、 １７βエストラジオール（イノベーティブ・リサーチ（Innovative Rsearch）＃
SE-121）の６０日間放出を用いて補給した。エストロゲンを補給したマウスに３
×１０6MCF-7を６０％マトリゲル中に注入当たり１００μl、注射した。２回の 注射を、わき腹当たり１回、投与した。腫瘍細胞増殖の７日後、ママスタチンを
投与した。被験マウスに６週間の間、２日間隔で産生培地中のママスタチンの１
、２、または５μgを与えた。コントロールのマウスにはBSAを投与するか、また
は腫瘍を注射せずにインヒビター単独を注射した。
【０１３１】 腫瘍の大きさを１週間ごとに最大直径の点で測定し、処理群ごとに平均した。
その結果を図１３Ａ−１３Ｃに腫瘍の大きさを平均直径±標準偏差としてプロッ
トして示した。 本動物実験を、MDA-２３１腫瘍細胞を用いて繰り返した。細胞をMCF-7細胞に 関して上記で記載したように注射１回あたり２×１０6細胞で注射した。
その結果を図１３Ａ−１３Ｃに腫瘍の大きさを平均直径±標準偏差としてプロッ
トして示した。 本動物実験を、MDA-２３１腫瘍細胞を用いて繰り返した。細胞をMCF-7細胞に 関して上記で記載したように注射１回あたり２×１０6細胞で注射した。
【０１３２】 その結果を図１４Ａ〜１４Ｃに示す。 示された結果は期待されるほどではなかった。動物は尾静脈に注射を受けたの
で、必要な血中投与量より少ない結果となった。その後の腹腔内注射を用いた実
験では一層有効な処理となった。５μg/マウスの用量およびそれより多い用量で
腫瘍増殖が廃棄される。
で、必要な血中投与量より少ない結果となった。その後の腹腔内注射を用いた実
験では一層有効な処理となった。５μg/マウスの用量およびそれより多い用量で
腫瘍増殖が廃棄される。
【０１３３】実施齢１７ ママスタチンのレトロウイルス発現 ママスタチンｃＤＮＡ（2.4キロベース（ｋｂ）のインサート）をレトロウイ ルス発現ベクターにサブクローニングした。このベクターを用いて３Ｔ３繊維芽
細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を回収し、溶
解し、ついでその細胞溶解産物をウエスタンブロットで分析した。 図１２に示すように、ママスタチン運搬レトロウイルスにてトランスフェクシ
ョンされた３Ｔ３細胞はリン酸化したママスタチンを発現した。
細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を回収し、溶
解し、ついでその細胞溶解産物をウエスタンブロットで分析した。 図１２に示すように、ママスタチン運搬レトロウイルスにてトランスフェクシ
ョンされた３Ｔ３細胞はリン酸化したママスタチンを発現した。
【０１３４】実施齢１８ バキュロウイルスおよびCos７細胞におけるママスタチン発現 サル腎臓細胞であるCos−７をママスタチンをコードする核酸でトランスフェ クションした。
【表９】
【０１３５】 図１６に示すように、Ｃos−７細胞中の組換えママスタチン発現の誘発は、マ
マスタチン遺伝子pMammAおよびpMammBが真正のママスタチンをコードしているこ
とを示していた。さらに、Ｃos−７細胞がタンパク質リン酸化を伴うママスタチ
ンの異なる形態を発現するという観察は、ママスタチンがヒト***細胞以外の真
核細胞にて製造される場合にリン酸化され活性であることを示唆している。安定
したトランスフェクタントを選択して組換えママスタチンの永続的な合成を可能
とした。
マスタチン遺伝子pMammAおよびpMammBが真正のママスタチンをコードしているこ
とを示していた。さらに、Ｃos−７細胞がタンパク質リン酸化を伴うママスタチ
ンの異なる形態を発現するという観察は、ママスタチンがヒト***細胞以外の真
核細胞にて製造される場合にリン酸化され活性であることを示唆している。安定
したトランスフェクタントを選択して組換えママスタチンの永続的な合成を可能
とした。
【０１３６】実施例１９ 培養中の正常ヒト乳上皮細胞によるママスタチンの産生 健常な***組織を、整腹***形成術から、無菌にて手術室から直接入手した。
その組織をIII型コラゲナーゼ（ライフ・サイエンスィズ、ベテスダ、メリーラ ンド）を１ｇ当たり４単位含む溶液中、ラミナーフローフード（Laminar Flow h
ood）中で滅菌状態で細かに切り刻んだ。この細かに切り刻んだ組織を終夜振盪 水浴中で３７℃にてインキュベートしてコラゲナーゼ消化させた。
その組織をIII型コラゲナーゼ（ライフ・サイエンスィズ、ベテスダ、メリーラ ンド）を１ｇ当たり４単位含む溶液中、ラミナーフローフード（Laminar Flow h
ood）中で滅菌状態で細かに切り刻んだ。この細かに切り刻んだ組織を終夜振盪 水浴中で３７℃にてインキュベートしてコラゲナーゼ消化させた。
【０１３７】 コラゲナーゼ消化した***組織である、多様な細胞型および脂肪細胞中から放
出された脂質を含む粘性液体を、遠心にかけて脂質、水性溶液、および他の細胞
型を分離した。コラゲナーゼ消化した物質を卓上遠心機で１０００rpmにて室温 で約５分間回転させた。脂肪細胞および遊離脂質は、遠心チューブの上部半分に
分配され、吸引により抜き取り廃棄した。細胞ペレットの上に位置する水性上清
もまた、吸引により抜き取り廃棄した。残りの細胞ペレットを哺乳動物増殖培地
であるDMEM、ｐH７.４の滅菌溶液で洗浄した。洗浄は洗浄からの上清がもはや濁
らなくなるまで（例えば、約４回の洗浄）続けた。その洗浄した細胞を増殖培地
中に再浮遊させ、４０℃で３０分間重力によって沈降させた。赤血球は無核であ
り有核の上皮細胞よりも低密度であるため、この手順は、赤血球を含む上清を抜
き取ることによって沈降した上皮細胞から赤血球を除去することができる。この
沈降手順を細胞ペレットに赤色が残らなくなるまで、例えば約２回、繰り返した
。残る細胞ペレットを、５％ウマ血清、１０μg/mlの上皮増殖因子、１００ng／
mlのコレラ毒素、５００ng／mlのヒドロコルチゾン、１０μg/mlのインスリン、
１００単位／mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、および１mM濃度の塩化
カルシウムを含む富栄養DMEM／F12増殖培地中に再浮遊した。生理的濃度のカル シウムにより細胞接着および細胞培養中の増殖（outgrowth）が促進された。細 胞浮遊液を５％ＣＯ2濃度で３７℃にて滅菌組織培養フラスコ中でインキュベー トした。
出された脂質を含む粘性液体を、遠心にかけて脂質、水性溶液、および他の細胞
型を分離した。コラゲナーゼ消化した物質を卓上遠心機で１０００rpmにて室温 で約５分間回転させた。脂肪細胞および遊離脂質は、遠心チューブの上部半分に
分配され、吸引により抜き取り廃棄した。細胞ペレットの上に位置する水性上清
もまた、吸引により抜き取り廃棄した。残りの細胞ペレットを哺乳動物増殖培地
であるDMEM、ｐH７.４の滅菌溶液で洗浄した。洗浄は洗浄からの上清がもはや濁
らなくなるまで（例えば、約４回の洗浄）続けた。その洗浄した細胞を増殖培地
中に再浮遊させ、４０℃で３０分間重力によって沈降させた。赤血球は無核であ
り有核の上皮細胞よりも低密度であるため、この手順は、赤血球を含む上清を抜
き取ることによって沈降した上皮細胞から赤血球を除去することができる。この
沈降手順を細胞ペレットに赤色が残らなくなるまで、例えば約２回、繰り返した
。残る細胞ペレットを、５％ウマ血清、１０μg/mlの上皮増殖因子、１００ng／
mlのコレラ毒素、５００ng／mlのヒドロコルチゾン、１０μg/mlのインスリン、
１００単位／mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、および１mM濃度の塩化
カルシウムを含む富栄養DMEM／F12増殖培地中に再浮遊した。生理的濃度のカル シウムにより細胞接着および細胞培養中の増殖（outgrowth）が促進された。細 胞浮遊液を５％ＣＯ2濃度で３７℃にて滅菌組織培養フラスコ中でインキュベー トした。
【０１３８】 正常***組織の初期の培養は混合細胞集団を含む。脂肪細胞、ニューロンおよ
び血管組織は上記の遠心分画工程によって有意に減少させられる。結合組織細胞
は有意な量で存在する。上皮細胞でない細胞を除去するために、分別接着法を用
いた。繊維芽細胞、ニューロンおよび***組織における他の細胞型はすべて上皮
細胞より一層速やかに組織培養プラスチックに接着する。さらに、これらの細胞
型はすべて、組織培養プラスチックから上皮細胞よりも速やかにトリプシンによ
って除去される。***上皮細胞のための培養を富ませるために、単層を形成し始
めた培養液（最初のプレーティングの５〜７日後）をトリプシン：EDTA溶液（２
５０：１（モル比））で処理する。細胞の大多数は、３７℃でのインキュベーシ
ョンで５分以内に除去された。残った接着細胞は９０％以上が上皮***細胞であ
った。これらの細胞を採り、上記の増殖培地に４０μMの塩化カルシウムととも に戻した。繊維芽細胞をトリプシン処理した培養フラスコから除去し、遠心によ
り回収し、増殖培地に再浮遊させ、ついで組織培養プラスチックに３７℃で３０
分間プレーティングした。接着した細胞は大部分が繊維芽細胞であった。接着し
なかった細胞は有意に繊維芽細胞に富んでいた（５０〜８０％）。これら浮遊細
胞を除去し、新鮮な組織培養フラスコ中で沈降させた。この工程を２回繰り返し
て、上皮細胞が優勢な細胞集団を得た。コレラ毒素は上皮細胞の増殖を促進させ
繊維芽細胞の増殖は阻害するので、また繊維芽細胞は低減したカルシウムでは充
分に増殖しないので、その培養物は、上記低カルシウム培地中で１週間以内に約
１００％の上皮細胞となった。これらの正常ヒト***細胞（NHMC)の培養物は、 培地中にママスタチンを産生した。
び血管組織は上記の遠心分画工程によって有意に減少させられる。結合組織細胞
は有意な量で存在する。上皮細胞でない細胞を除去するために、分別接着法を用
いた。繊維芽細胞、ニューロンおよび***組織における他の細胞型はすべて上皮
細胞より一層速やかに組織培養プラスチックに接着する。さらに、これらの細胞
型はすべて、組織培養プラスチックから上皮細胞よりも速やかにトリプシンによ
って除去される。***上皮細胞のための培養を富ませるために、単層を形成し始
めた培養液（最初のプレーティングの５〜７日後）をトリプシン：EDTA溶液（２
５０：１（モル比））で処理する。細胞の大多数は、３７℃でのインキュベーシ
ョンで５分以内に除去された。残った接着細胞は９０％以上が上皮***細胞であ
った。これらの細胞を採り、上記の増殖培地に４０μMの塩化カルシウムととも に戻した。繊維芽細胞をトリプシン処理した培養フラスコから除去し、遠心によ
り回収し、増殖培地に再浮遊させ、ついで組織培養プラスチックに３７℃で３０
分間プレーティングした。接着した細胞は大部分が繊維芽細胞であった。接着し
なかった細胞は有意に繊維芽細胞に富んでいた（５０〜８０％）。これら浮遊細
胞を除去し、新鮮な組織培養フラスコ中で沈降させた。この工程を２回繰り返し
て、上皮細胞が優勢な細胞集団を得た。コレラ毒素は上皮細胞の増殖を促進させ
繊維芽細胞の増殖は阻害するので、また繊維芽細胞は低減したカルシウムでは充
分に増殖しないので、その培養物は、上記低カルシウム培地中で１週間以内に約
１００％の上皮細胞となった。これらの正常ヒト***細胞（NHMC)の培養物は、 培地中にママスタチンを産生した。
【０１３９】 NHMCを増殖させるために使用した栄養培地には５％のウマ血清が含まれており
、これはヒト注射には適さない。ウマ血清タンパク質は精製してママスタチンタ
ンパク質から排除するか、または該血清を欠く培地中で細胞を増殖させなければ
ならない。正常細胞は、血清の不在下では７〜１０日間しか維持することができ
ない。血清不含のママスタチンを有意な量で長期間にわたって製造するために、
細胞を無血清培地および血清を含む培地で交代で増殖させた。
、これはヒト注射には適さない。ウマ血清タンパク質は精製してママスタチンタ
ンパク質から排除するか、または該血清を欠く培地中で細胞を増殖させなければ
ならない。正常細胞は、血清の不在下では７〜１０日間しか維持することができ
ない。血清不含のママスタチンを有意な量で長期間にわたって製造するために、
細胞を無血清培地および血清を含む培地で交代で増殖させた。
【０１４０】 NHMCを上記のように増殖培地中で完全なコンフルエンスに達するまで増殖させ
た。細胞は、細胞がフラスコの利用可能な表面を覆いつくしたとき、増殖するに
つれて溶液中に伸び始めた。伸びつつある細胞を回収し、新しいフラスコに移し
た。コンフルエントに達したフラスコを滅菌食塩水で３回すすぎ、洗浄の間に５
分間食塩水でインキュベートして血清タンパク質を除去した。ついで細胞に無血
清の「産生培地」を与えたが、これは本質的に、血清、コレラ毒素およびヒドロ
コルチゾン欠く増殖培地であった。細胞を約４日（９６時間）産生培地で維持し
、培地の回収および細胞の増殖培地への返還を少なくとも４日間行った。このよ
うにして製造されたママスタチンの典型的なバッチサイズは、１〜２リットルで
あった。
た。細胞は、細胞がフラスコの利用可能な表面を覆いつくしたとき、増殖するに
つれて溶液中に伸び始めた。伸びつつある細胞を回収し、新しいフラスコに移し
た。コンフルエントに達したフラスコを滅菌食塩水で３回すすぎ、洗浄の間に５
分間食塩水でインキュベートして血清タンパク質を除去した。ついで細胞に無血
清の「産生培地」を与えたが、これは本質的に、血清、コレラ毒素およびヒドロ
コルチゾン欠く増殖培地であった。細胞を約４日（９６時間）産生培地で維持し
、培地の回収および細胞の増殖培地への返還を少なくとも４日間行った。このよ
うにして製造されたママスタチンの典型的なバッチサイズは、１〜２リットルで
あった。
【０１４１】 ママスタチンはまた、バイオリアクター、バイオフロー・３０００（Bioflow
3000）、ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（New Brunswick Sc
ientific）中でも製造されている。この潅流リアクターでは、細胞は組織培養処
理した線維細胞（fibracell）ディスクに接着した。細胞の接着したディスクを 反応容器中のバスケット中で維持し、培地で潅流した。NHMCをリアクターに導入
したとき、それらは線維細胞ディスクに集まり、培地の潅流によって栄養を与え
られる。ならし培地をリアクターから回収し、冷凍した。
3000）、ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（New Brunswick Sc
ientific）中でも製造されている。この潅流リアクターでは、細胞は組織培養処
理した線維細胞（fibracell）ディスクに接着した。細胞の接着したディスクを 反応容器中のバスケット中で維持し、培地で潅流した。NHMCをリアクターに導入
したとき、それらは線維細胞ディスクに集まり、培地の潅流によって栄養を与え
られる。ならし培地をリアクターから回収し、冷凍した。
【０１４２】実施例２０ ママスタチンのドット・ブロット血清アッセイ ２５歳の健康な女性から血清を入手し、乳癌患者（ステージIV）からの血清、
該患者の診断されていないきょうだいからの血清、および該患者の母からの血清
と比較した（その家族は乳癌の家系である）。これら血清サンプルをママスタチ
ンの存在についてイムノアッセイで比較した。診断の日に採取した複数の乳癌患
者からの血液サンプルもまたイムノアッセイで分析した。正常なヒト***細胞（
NHMC)ならし培地を標準コントロールとして用いた。標準的なNHMCママスタチン は、クロマトグラフィー精製したママスタチンタンパク質標準を用いてドット・
ブロットアッセイで決定されるように約５０ng／mlを含んでいた。
該患者の診断されていないきょうだいからの血清、および該患者の母からの血清
と比較した（その家族は乳癌の家系である）。これら血清サンプルをママスタチ
ンの存在についてイムノアッセイで比較した。診断の日に採取した複数の乳癌患
者からの血液サンプルもまたイムノアッセイで分析した。正常なヒト***細胞（
NHMC)ならし培地を標準コントロールとして用いた。標準的なNHMCママスタチン は、クロマトグラフィー精製したママスタチンタンパク質標準を用いてドット・
ブロットアッセイで決定されるように約５０ng／mlを含んでいた。
【０１４３】 個々の血液サンプルをバキュテーナー（vacutanier）チューブに回収し、全血
から血清を分離した。血清サンプル（２５０または５００μl容量）を希釈なし に９６ウェル（S & S Dot-Blot manifold）を用いて吸引によってニトロセルロ ースに適用した。ならし培地を実施例１９のように調製した。ニトロセルロース
フィルター上のサンプルをTBS中のTriton X-100で洗浄し、脱脂粉乳（TBS中に５
％）でブロックし、５％の脱脂粉乳中の第１抗−ママスタチン抗体（７G6マウス
IgM)１μg/mlとともに室温で１.５時間インキュベートした後、５％の脱脂粉乳 中の第２抗体（アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗−マウスIg
M)１μg/mlとともに室温で１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ
発色反応は、ニトロブルー−テトラゾリウムおよびBCIPを用いて進行させた。
から血清を分離した。血清サンプル（２５０または５００μl容量）を希釈なし に９６ウェル（S & S Dot-Blot manifold）を用いて吸引によってニトロセルロ ースに適用した。ならし培地を実施例１９のように調製した。ニトロセルロース
フィルター上のサンプルをTBS中のTriton X-100で洗浄し、脱脂粉乳（TBS中に５
％）でブロックし、５％の脱脂粉乳中の第１抗−ママスタチン抗体（７G6マウス
IgM)１μg/mlとともに室温で１.５時間インキュベートした後、５％の脱脂粉乳 中の第２抗体（アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたヤギ抗−マウスIg
M)１μg/mlとともに室温で１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ
発色反応は、ニトロブルー−テトラゾリウムおよびBCIPを用いて進行させた。
【０１４４】 図１３に示すように、サンプル中のママスタチンの量を正常***細胞ならし培
地から得た標準曲線に対して定量した。健康な女性から得た血清は暗く色付けた
ブロットによって示されるように、容易に検出可能な量のママスタチンを含んで
いたのに対し、乳癌と診断された患者からの血清および診断されていない家族成
員からの血清は、ほとんどまたは全くママスタチンを示さなかった。
地から得た標準曲線に対して定量した。健康な女性から得た血清は暗く色付けた
ブロットによって示されるように、容易に検出可能な量のママスタチンを含んで
いたのに対し、乳癌と診断された患者からの血清および診断されていない家族成
員からの血清は、ほとんどまたは全くママスタチンを示さなかった。
【０１４５】 診断した日の乳癌患者から、乳癌患者の健康な家族から、および健康な女性お
よび男性からさらなる血清を得た。血清を上記のように処理してママスタチンを
分析した。ドット・ブロットは発色反応の強度を示すために「陰性または低い」
または「陽性または高い」として評価した。データを以下の表に示す。
よび男性からさらなる血清を得た。血清を上記のように処理してママスタチンを
分析した。ドット・ブロットは発色反応の強度を示すために「陰性または低い」
または「陽性または高い」として評価した。データを以下の表に示す。
【０１４６】
【表１０】
【０１４７】実施例２１ ヒト乳癌患者の治療 化学療法に失敗したかまたは失敗しつつある乳癌再発したステージIVの乳癌患
者２９名にママスタチンタンパク質を利用できるようにした。このタンパク質は
上記実施例１９の記載と同様にして製造したものであり、３mlの注射容量にて所
要用量で産生培地中にて提供された。患者は処方された計画に従って、このタン
パク質を静脈内投与された。一般に、１日用量を注射した。選択された投与量は
、患者の血流内で生理学的な量のママスタチン（例えば、健康な女性で５〜５０
ng／ml)が提供されるものであった。各患者の投与量および頻度は以下の表に示 すとおりである。
者２９名にママスタチンタンパク質を利用できるようにした。このタンパク質は
上記実施例１９の記載と同様にして製造したものであり、３mlの注射容量にて所
要用量で産生培地中にて提供された。患者は処方された計画に従って、このタン
パク質を静脈内投与された。一般に、１日用量を注射した。選択された投与量は
、患者の血流内で生理学的な量のママスタチン（例えば、健康な女性で５〜５０
ng／ml)が提供されるものであった。各患者の投与量および頻度は以下の表に示 すとおりである。
【０１４８】
【表１１】
【０１４９】
【表１２】
【０１５０】 ２９名の患者のグループのうち、後期ステージの肝臓疾患を有していた６名は
生存できなかった。これらの６名の患者はママスタチンを投与される前に肝機能
不全の臨床的所見を呈し、本治療によっては助からなかった。１名の患者は肝臓
機能不全に陥る前に黄疸が低減する徴候を示したが、これら６名の患者は全員、
進行した肝臓癌を有する患者に共通する窒素毒素により死亡したと思われた。
生存できなかった。これらの６名の患者はママスタチンを投与される前に肝機能
不全の臨床的所見を呈し、本治療によっては助からなかった。１名の患者は肝臓
機能不全に陥る前に黄疸が低減する徴候を示したが、これら６名の患者は全員、
進行した肝臓癌を有する患者に共通する窒素毒素により死亡したと思われた。
【０１５１】 残りの患者のうち、２名はその疾患により死亡した。１名はママスタチン治療
の２ヶ月後には疾患のない状態であったと思われた。この患者は治療から外され
、２ヶ月以内に再発した。この患者はコントロール状態に戻ることはなく、肝臓
の疾患で死亡した。第二の患者は治療の４ヶ月後に死亡したが、本治療に対する
応答の徴候を示すことは決してなかった。これら後者の２名の患者ではママスタ
チンの投与量を１０倍に増加したが、これらの患者のいずれにおいても毒性の徴
候は認められなかった。
の２ヶ月後には疾患のない状態であったと思われた。この患者は治療から外され
、２ヶ月以内に再発した。この患者はコントロール状態に戻ることはなく、肝臓
の疾患で死亡した。第二の患者は治療の４ヶ月後に死亡したが、本治療に対する
応答の徴候を示すことは決してなかった。これら後者の２名の患者ではママスタ
チンの投与量を１０倍に増加したが、これらの患者のいずれにおいても毒性の徴
候は認められなかった。
【０１５２】 現在ママスタチン療法を受けている１９名の患者のうち、大多数は陽性の利益
の徴候を示し、有害応答の徴候はみられない。これらの患者のうちの３名は、マ
マスタチンの利益を受けているのか否かは明らかでない。他の１６名の患者は、
正常レベルまでの腫瘍マーカー（ＣＡ１５−３およびＣＡ２７−２９）レベルの
低減、触診できる腫瘍の大きさの低減、ＭＲＩ走査で認められるような疾患の減
退および痛みの低減を含む利益の明確な臨床的徴候を示している。これらの患者
のうちの数人は、疾患が無くなったと考えられる段階まで改善を示す。しかしな
がら、これらの患者にタンパク質を３日〜５日の期間与えないと、疾患の徴候を
全く示さない患者においてさえも、痛みの増大によって示されるように疾患の活
性の再開という結果となることが一貫して観察されている。タンパク質療法を再
生すると２〜４時間以内で増大した痛みの徴候が低減または除去される。
の徴候を示し、有害応答の徴候はみられない。これらの患者のうちの３名は、マ
マスタチンの利益を受けているのか否かは明らかでない。他の１６名の患者は、
正常レベルまでの腫瘍マーカー（ＣＡ１５−３およびＣＡ２７−２９）レベルの
低減、触診できる腫瘍の大きさの低減、ＭＲＩ走査で認められるような疾患の減
退および痛みの低減を含む利益の明確な臨床的徴候を示している。これらの患者
のうちの数人は、疾患が無くなったと考えられる段階まで改善を示す。しかしな
がら、これらの患者にタンパク質を３日〜５日の期間与えないと、疾患の徴候を
全く示さない患者においてさえも、痛みの増大によって示されるように疾患の活
性の再開という結果となることが一貫して観察されている。タンパク質療法を再
生すると２〜４時間以内で増大した痛みの徴候が低減または除去される。
【０１５３】 血中のママスタチンレベルが長期の治療の後に衰退することもまた観察されて
おり、負のフィードバックシステムを示唆している。この一定の血中レベルにお
ける衰退は、約２８日の期間、毎日ママスタチンを投与し、その後２〜３日タン
パク質を投与しないことによってうまく回避できる。
おり、負のフィードバックシステムを示唆している。この一定の血中レベルにお
ける衰退は、約２８日の期間、毎日ママスタチンを投与し、その後２〜３日タン
パク質を投与しないことによってうまく回避できる。
【０１５４】実施例２２ ヒト治療のための組換えママスタチン 組換えママスタチンを、Cos-7サル腎臓細胞、チャイニーズハムスター卵巣（C
HO)細胞、およびＳｆ９昆虫細胞中を、ママスタチンｃＤＮＡ配列を含むプラス ミドでトランスフェクションすることによってこれら細胞中で製造した。ママス
タチンｃＤＮＡはこれら産生細胞株のゲノム中に安定に組み込まれ、増殖阻害活
性と免疫応答性のタンパク質を分泌する。
HO)細胞、およびＳｆ９昆虫細胞中を、ママスタチンｃＤＮＡ配列を含むプラス ミドでトランスフェクションすることによってこれら細胞中で製造した。ママス
タチンｃＤＮＡはこれら産生細胞株のゲノム中に安定に組み込まれ、増殖阻害活
性と免疫応答性のタンパク質を分泌する。
【０１５５】 これらの細胞からママスタチンを製造し、ヒトに使用するために該タンパク質
を単離するため、これら細胞株を無血清培地中で約４８〜７２時間増殖させる。
培地を取り除き、タンパク質をならし培地から精製し、約０.１M〜約０.５Mから
塩化ナトリウム濃度勾配を用い、約０.２Ｍでママスタチン画分を回収する、ト リスバッファー（pH7.5）中でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製する 。ついで、タンパク質画分を生理食塩水に対して透析し、必要であれば透析し、
ついで濾過滅菌する。
を単離するため、これら細胞株を無血清培地中で約４８〜７２時間増殖させる。
培地を取り除き、タンパク質をならし培地から精製し、約０.１M〜約０.５Mから
塩化ナトリウム濃度勾配を用い、約０.２Ｍでママスタチン画分を回収する、ト リスバッファー（pH7.5）中でのイオン交換クロマトグラフィーにより精製する 。ついで、タンパク質画分を生理食塩水に対して透析し、必要であれば透析し、
ついで濾過滅菌する。
【０１５６】 別法において、ママスタチンをCos7またはSf9細胞中で融合タンパク質として 産生させる。融合タンパク質はヒスチジンタグ（６つのヒスチジン残基）および
第Ｘ因子プロテイナーゼ開裂部位を含む。ママスタチン発現細胞を好ましくは１
％の血清含有培地中で培養し、ならし培地を回収し、ニッケルキレート樹脂に通
す。His−融合タンパク質はカラムに付着し、５０mMトリス（pH7.5）、0.1M NaC
lで洗浄し、ついで１０単位／ｍｌの第Ｘ因子プロテイナーゼを含むトリス−Ｎ ａＣｌでゆっくりと溶出する。これによりママスタチンはHis−融合から遊離さ れる。ママスタチンを分子篩クロマトグラフィー、または上記のようにイオン交
換クロマトグラフィーによって分離する。 上記明細書、実施例およびデータは、本発明の組成物の製造および使用の完全
な記載を提供するものである。本発明の範囲から逸脱するこなく本発明の多くの
態様を行うことが可能であるので、本発明は添付の特許請求の範囲に存在する。
第Ｘ因子プロテイナーゼ開裂部位を含む。ママスタチン発現細胞を好ましくは１
％の血清含有培地中で培養し、ならし培地を回収し、ニッケルキレート樹脂に通
す。His−融合タンパク質はカラムに付着し、５０mMトリス（pH7.5）、0.1M NaC
lで洗浄し、ついで１０単位／ｍｌの第Ｘ因子プロテイナーゼを含むトリス−Ｎ ａＣｌでゆっくりと溶出する。これによりママスタチンはHis−融合から遊離さ れる。ママスタチンを分子篩クロマトグラフィー、または上記のようにイオン交
換クロマトグラフィーによって分離する。 上記明細書、実施例およびデータは、本発明の組成物の製造および使用の完全
な記載を提供するものである。本発明の範囲から逸脱するこなく本発明の多くの
態様を行うことが可能であるので、本発明は添付の特許請求の範囲に存在する。
【０１５７】
【表１３−１】
【表１３−２】
【表１３−３】
【０１５８】
【配列表】
【図１】 真核細胞Cos-7細胞における組換えママスタチンの発現を示すウ エスタンブロットである。
【図２】 昆虫細胞中のママスタチンの発現を示すイムノブロットである。
【図３】 イン・ビトロ転写および翻訳によって製造される組換えママスタ
チンによる***細胞増殖の阻害を示すイムノブロットである。
チンによる***細胞増殖の阻害を示すイムノブロットである。
【図４】 ママスタチンｃDNAでトランスフェクションしたCos-7細胞のなら
し培地での処置により、ヒト乳癌細胞増殖における増殖阻害を示すグラフである
。
し培地での処置により、ヒト乳癌細胞増殖における増殖阻害を示すグラフである
。
【図５】 ヒト正常***細胞および癌性***細胞における５３、４９、およ
び４４kDママスタチンの相対量を示すウエスタンブロットである。
び４４kDママスタチンの相対量を示すウエスタンブロットである。
【図６】 ママスタチンのホスファターゼ消化を示すイムノブロットである
。
。
【図７】 ママスタチンの活性に及ぼすホスファターゼの影響を示すグラフ
である。
である。
【図８】 ヒト正常***細胞および癌性***細胞からのママスタチンならび
に正常細胞および癌性細胞の混合培養物中のママスタチンを示すウエスタンブロ
ットである。
に正常細胞および癌性細胞の混合培養物中のママスタチンを示すウエスタンブロ
ットである。
【図９】 ＥＬＩＳＡによって分析された正常ヒト血清中のママスタチンを
示すグラフである。
示すグラフである。
【図１０】 ママスタチンのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフである。
【図１１】 治療過程での乳癌患者におけるママスタチンレベルを示すグラ
フである。
フである。
【図１２】 レトロウイルスによって誘発されたママスタチンの発現を示す
ウエスタンブロットである。
ウエスタンブロットである。
【図１３】 ヌードマウスにおけるＭＣＦ７腫瘍細胞へのママスタチン治療
の効果を示すグラフである。
の効果を示すグラフである。
【図１４】 ヌードマウスにおける腫瘍細胞へのママスタチン治療の効果を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図１５】 正常女性からの血液中のママスタチンと乳癌患者からの血液中
のママスタチンの不在を示すドットブロットアッセイである。
のママスタチンの不在を示すドットブロットアッセイである。
【図１６】 組換えママスタチンを発現する***細胞のイムノブロットであ
る。
る。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１月１３日（２０００．１．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/68 33/574 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
Claims (17)
- 【請求項１】 配列番号：１の核酸配列のコーディング配列を含む実質的に
精製し単離した核酸組成物。 - 【請求項２】 配列番号：２のアミノ酸配列を含む実質的に精製し単離した
タンパク質。 - 【請求項３】 請求項１に記載の核酸配列から製造される組換えタンパク質
。 - 【請求項４】 請求項１に記載の核酸配列のコーディング配列を含むプラス
ミドまたはベクター。 - 【請求項５】 請求項１に記載の組成物を含むママスタチンの決定用診断キ
ット。 - 【請求項６】 抗−ママスタチン抗体およびママスタチン標準を含むママス
タチンの決定用診断キット。 - 【請求項７】 請求項２に記載の組成物を含む医薬組成物。
- 【請求項８】 pMammB、ＡＴＣＣ受託番号第９７４５１号のヒト核酸配列イ
ンサートを含む組成物。 - 【請求項９】 ***細胞癌腫の診断またはモニタリング方法であって、 ママスタチンタンパク質の存在について患者の血液または組織を分析し、ついで
、 正常コントロールに比較してママスタチンの不在または低減を***細胞癌腫に相
関させる ことを含む方法。 - 【請求項１０】 該分析が患者サンプル中の５３kDa、４９kDa、および４４
kDaのママスタチンの存在または不在の決定であり、該相関が、正常コントロー ルに比較して５３kDaまたは４９kDaのママスタチンの不在または低減を***細胞
癌腫の存在と相関させることである、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 ヒト被験者における機能的なママスタチンのレベルをモニ
ターする法であって、工程： 約５３kDa、４９kDaおよび４４kDaのサイズを有するママスタチンの３つの分子 量形態の存在について被験者の体液または組織の生物学的サンプルを分析し、つ
いで 正常または前患者のサンプルコントロールと比較した約５３kDaまたは４９kDaま
たは４４kDaのママスタチンの量の減少を、機能的ママスタチンの量の減少と相 関させる を含む方法。 - 【請求項１２】 ***細胞増殖阻害量のママスタチンを患者に投与する工程
を含む、乳癌を患う患者の治療方法。 - 【請求項１３】 イン・ビボにおいてママスタチンの治療有効レベルを維持
するために該投与工程を繰り返す、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 該細胞に増殖阻害量のママスタチンを投与することを含む
、ヒト***細胞の増殖の阻害方法。 - 【請求項１５】 該ママスタチンが請求項１に記載の組成物によってコード
される請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１６】 該ママスタチンが請求項２に記載の組成物を含む請求項１
１に記載の方法。 - 【請求項１７】 該ママスタチンが請求項７に記載の組成物を含む請求項１
１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/994,076 US6500937B1 (en) | 1996-10-03 | 1997-12-19 | Nucleotide sequence encoding a mammary cell growth inhibitor |
| US08/994,076 | 1997-12-19 | ||
| PCT/US1998/027147 WO1999032625A2 (en) | 1997-12-19 | 1998-12-18 | Nucleotide and protein sequence of mammastatin and methods of use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001526891A true JP2001526891A (ja) | 2001-12-25 |
| JP4441113B2 JP4441113B2 (ja) | 2010-03-31 |
Family
ID=25540260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000525544A Expired - Fee Related JP4441113B2 (ja) | 1997-12-19 | 1998-12-18 | ママスタチンのヌクレオチドおよびタンパク質配列およびその使用法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6500937B1 (ja) |
| EP (1) | EP1037989B1 (ja) |
| JP (1) | JP4441113B2 (ja) |
| AT (1) | ATE364706T1 (ja) |
| AU (1) | AU1935399A (ja) |
| CA (1) | CA2315239C (ja) |
| DE (1) | DE69837935T2 (ja) |
| WO (1) | WO1999032625A2 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6500937B1 (en) * | 1996-10-03 | 2002-12-31 | University Of Michigan | Nucleotide sequence encoding a mammary cell growth inhibitor |
| CA2267095C (en) * | 1996-10-03 | 2010-08-10 | Biotherapies, Inc. | Nucleotide and protein sequence of mammastatin and methods of use |
| BR0012301A (pt) * | 1999-06-18 | 2002-03-26 | Biotherapies Inc | Inibidores de crescimento de células epiteliais |
| US6939714B2 (en) | 1999-06-18 | 2005-09-06 | Biotherapies, Inc. | Epithelial cell growth inhibitors |
| AU6583700A (en) * | 1999-08-13 | 2001-03-13 | Oxford Glycosciences (Uk) Limited | Proteins, genes and their use for diagnosis and treatment of breast cancer |
| AU2596901A (en) * | 1999-12-21 | 2001-07-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer |
| WO2001071357A2 (en) * | 2000-03-20 | 2001-09-27 | Oxford Glycosciences (Uk) Limited | Diagnosis and treatment of breast cancer |
| US20030212263A1 (en) * | 2000-06-19 | 2003-11-13 | The University Of Michigan | Mammastatin sequence variant C |
| WO2002088750A2 (en) * | 2001-05-02 | 2002-11-07 | Oxford Glycosciences (Uk) Ltd | Proteins, genes and their use for diagnosis and treatment of breast cancer |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4379839A (en) | 1977-05-23 | 1983-04-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for detecting cancer |
| US4753894A (en) | 1984-02-08 | 1988-06-28 | Cetus Corporation | Monoclonal anti-human breast cancer antibodies |
| WO1989011492A1 (en) | 1988-05-20 | 1989-11-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Human mammary cell growth inhibitor and methods of production and use |
| WO1989011491A1 (en) | 1988-05-20 | 1989-11-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Antibodies to human mammary cell growth inhibitor and methods of production and use |
| US5878385A (en) * | 1996-09-16 | 1999-03-02 | Ergo Linguistic Technologies | Method and apparatus for universal parsing of language |
| US6500937B1 (en) * | 1996-10-03 | 2002-12-31 | University Of Michigan | Nucleotide sequence encoding a mammary cell growth inhibitor |
| CA2267095C (en) * | 1996-10-03 | 2010-08-10 | Biotherapies, Inc. | Nucleotide and protein sequence of mammastatin and methods of use |
| BR0012301A (pt) | 1999-06-18 | 2002-03-26 | Biotherapies Inc | Inibidores de crescimento de células epiteliais |
-
1997
- 1997-12-19 US US08/994,076 patent/US6500937B1/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-18 AT AT98964170T patent/ATE364706T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-12-18 AU AU19353/99A patent/AU1935399A/en not_active Abandoned
- 1998-12-18 EP EP98964170A patent/EP1037989B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 JP JP2000525544A patent/JP4441113B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-18 DE DE69837935T patent/DE69837935T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-18 CA CA002315239A patent/CA2315239C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-18 WO PCT/US1998/027147 patent/WO1999032625A2/en active IP Right Grant
-
2000
- 2000-08-22 US US09/643,476 patent/US6599495B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-06-11 US US10/459,218 patent/US7256277B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-08-14 US US11/838,654 patent/US7816097B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-07-29 US US12/846,386 patent/US20110003318A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7256277B2 (en) | 2007-08-14 |
| EP1037989A2 (en) | 2000-09-27 |
| AU1935399A (en) | 1999-07-12 |
| US20080207506A1 (en) | 2008-08-28 |
| US7816097B2 (en) | 2010-10-19 |
| EP1037989B1 (en) | 2007-06-13 |
| WO1999032625A3 (en) | 1999-09-16 |
| WO1999032625A2 (en) | 1999-07-01 |
| JP4441113B2 (ja) | 2010-03-31 |
| ATE364706T1 (de) | 2007-07-15 |
| US6599495B1 (en) | 2003-07-29 |
| US6500937B1 (en) | 2002-12-31 |
| DE69837935T2 (de) | 2008-02-21 |
| US20110003318A1 (en) | 2011-01-06 |
| CA2315239A1 (en) | 1999-07-01 |
| US20070082334A1 (en) | 2007-04-12 |
| CA2315239C (en) | 2008-05-13 |
| DE69837935D1 (de) | 2007-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7816097B2 (en) | Nucleotide and protein sequence of Mammastatin and methods of use | |
| EP0948518B1 (en) | Isolated nucleic acid molecule encoding cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof | |
| JP2506340B2 (ja) | 医薬組成物 | |
| US20110039279A1 (en) | Methods and compositions for diagnosing breast cancer | |
| EP0362278A1 (en) | Autocrine motility factors in cancer diagnosis and management | |
| WO2001007917A1 (en) | Determining antibodies to ny-eso-1 in cancer patients | |
| JPH07224089A (ja) | ｎｅｕレセプターの刺激因子 | |
| JP2002525098A (ja) | ママグロビン、***特有の乳癌分泌タンパク質 | |
| WO1998014577A9 (en) | Nucleotide and protein sequence of mammastatin and methods of use | |
| AU782473B2 (en) | Mammastatin diagnostics and therapeutics | |
| Jaffey et al. | Retinoblastoma-like phenotype expressed in medulloblastomas | |
| Witte et al. | Growth factor production by a human megakaryocytic tumor cell line | |
| JP2003513615A (ja) | 上皮細胞増殖インヒビター | |
| MXPA99003100A (en) | Nucleotide and protein sequence of mammastatin and methods of use | |
| EP0681480B1 (en) | Recognin vaccines | |
| WO2000000503A1 (en) | Human az-1 gene, variants thereof and expressed gene products | |
| US5147798A (en) | Monophenotypic xenograft of megakaryocytic lineage and origin | |
| Zhang et al. | Growth-factor stimulation reveals two mechanisms of retinoblastoma gene inactivation in human myelogenous leukemia cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051215 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070403 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070702 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070709 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070802 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070809 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070903 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070910 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070927 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070927 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090602 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091002 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20091130 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091222 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100108 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130115 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |