JP6004423B2 - 遺伝子連結法およびそれを用いた単鎖抗体作製方法 - Google Patents
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Description
本発明は遺伝子連結法およびそれを用いた単鎖抗体作製方法に関する。
１．高機能性の単鎖抗体
１−１．単鎖抗体の有用性
１９７０年に発明されたモノクローナル抗体は、マウス抗体であったため当初に期待されたほどの臨床効果が得られなかったが、１９９０年代にヒト免疫グロブリン遺伝子をＣＨＯ細胞などで発現させる技術が開発されて以降、再び抗体医薬への期待が高まり研究開発が活発化した。直接ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスも開発される一方、ファージディスプレイによる膨大な量の抗原ライブラリーから最適抗体をスクリーニングする技術開発も進み、飛躍的に抗体産生技術が進展してきた。特に抗体医薬分野での成果はめざましく、次々と新規医薬の開発が進んでいる。検査薬、研究ツールとしての用途も含め、抗体の重要性は昨今益々高まってきている。
１−１．単鎖抗体の有用性
１９７０年に発明されたモノクローナル抗体は、マウス抗体であったため当初に期待されたほどの臨床効果が得られなかったが、１９９０年代にヒト免疫グロブリン遺伝子をＣＨＯ細胞などで発現させる技術が開発されて以降、再び抗体医薬への期待が高まり研究開発が活発化した。直接ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスも開発される一方、ファージディスプレイによる膨大な量の抗原ライブラリーから最適抗体をスクリーニングする技術開発も進み、飛躍的に抗体産生技術が進展してきた。特に抗体医薬分野での成果はめざましく、次々と新規医薬の開発が進んでいる。検査薬、研究ツールとしての用途も含め、抗体の重要性は昨今益々高まってきている。
特に、重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）の抗原認識部位のみを連結した単鎖抗体(single chain variable fragments：scFv)は、分子量がおよそ２５ｋＤａと、ＩｇＧ（分子量が１５０ｋＤａ）に比べて大変小さく、安定性が高く、組織への浸潤性が良く、きわめて有用である。大腸菌での発現が可能であり、大量生産も可能である。哺乳類細胞で発現させれば、細胞内で抗原機能を阻害することにより、細胞内での抗原の生理機能解明に用いることができる。また当該遺伝子に変異を導入することにより、結合活性や特異性を上昇させる事が可能である。他のタンパク質と融合させ機能させたり、マルチマーとして使用したり、細胞内で発現させたりと、多くの応用が期待されている。
１−２．単鎖抗体作製上の問題点
機能的な抗体をより有効かつ効率的に生産するためには、ファージディスプレイ法などの進化工学的な手法を利用して機能的な最適抗体を選択する技術が欠かせない。ファージディスプレイ法の場合は、最終的に選択された最適抗体をディスプレイしているファージをそのまま大腸菌内で組み換え抗体として大量発現させるか、または遺伝子を単離して適切なベクターに繋いで大腸菌やＣＨＯ細胞などから産生させる。ファージにディスプレイする抗体としては、Ｆａｂと単鎖抗体がある。
単鎖抗体はそのサイズ故に実用的にも大変有用な分子であり、抗原に対する結合性を持つ抗体を産生するハイブリドーマからＶＬおよびＶＨ抗体遺伝子を単離し、ＶＬおよびＶＨ抗体遺伝子を連結させファージミドに組み込み、単鎖抗体を作製する手法か、もしくは免疫した動物の脾臓・リンパ組織からＶＬおよびＶＨ抗体遺伝子を単離し、ＶＬおよびＶＨ抗体遺伝子を連結させファージミドに組み込み、ファージ上に発現させ、パニングにより結合活性を持つ単鎖抗体をディスプレイしているファージを単離し、結合活性を持つ単鎖抗体を取得する手法が用いられる。後者の場合、マウスなど実験動物の脾臓から得られたｃＤＮＡを用いることで、生体内の免疫細胞が有する抗体多様性を保持した膨大な配列バリエ―ションを持つ「単鎖抗体ライブラリー」を作製する。当該単鎖抗体ライブラリーを標的物質によるパニング工程を繰り返すことで、標的物質との結合性の高い単鎖抗体を濃縮することができるため、機能的単鎖抗体の作製にきわめて有効である。「単鎖抗体ライブラリー」の作製に当たっては、遺伝子の変異、欠失、シフトがないようにＶＨとＶＬを連結することが大事であることの上に、遺伝子中に大きな多様性（抗原認識部：ＣＤＲ部）を持っている部分があるので、これによって作製が阻害されないようにかつ、その多様性を維持しつつ、単鎖抗体を作製する必要がある。
機能的な抗体をより有効かつ効率的に生産するためには、ファージディスプレイ法などの進化工学的な手法を利用して機能的な最適抗体を選択する技術が欠かせない。ファージディスプレイ法の場合は、最終的に選択された最適抗体をディスプレイしているファージをそのまま大腸菌内で組み換え抗体として大量発現させるか、または遺伝子を単離して適切なベクターに繋いで大腸菌やＣＨＯ細胞などから産生させる。ファージにディスプレイする抗体としては、Ｆａｂと単鎖抗体がある。
単鎖抗体はそのサイズ故に実用的にも大変有用な分子であり、抗原に対する結合性を持つ抗体を産生するハイブリドーマからＶＬおよびＶＨ抗体遺伝子を単離し、ＶＬおよびＶＨ抗体遺伝子を連結させファージミドに組み込み、単鎖抗体を作製する手法か、もしくは免疫した動物の脾臓・リンパ組織からＶＬおよびＶＨ抗体遺伝子を単離し、ＶＬおよびＶＨ抗体遺伝子を連結させファージミドに組み込み、ファージ上に発現させ、パニングにより結合活性を持つ単鎖抗体をディスプレイしているファージを単離し、結合活性を持つ単鎖抗体を取得する手法が用いられる。後者の場合、マウスなど実験動物の脾臓から得られたｃＤＮＡを用いることで、生体内の免疫細胞が有する抗体多様性を保持した膨大な配列バリエ―ションを持つ「単鎖抗体ライブラリー」を作製する。当該単鎖抗体ライブラリーを標的物質によるパニング工程を繰り返すことで、標的物質との結合性の高い単鎖抗体を濃縮することができるため、機能的単鎖抗体の作製にきわめて有効である。「単鎖抗体ライブラリー」の作製に当たっては、遺伝子の変異、欠失、シフトがないようにＶＨとＶＬを連結することが大事であることの上に、遺伝子中に大きな多様性（抗原認識部：ＣＤＲ部）を持っている部分があるので、これによって作製が阻害されないようにかつ、その多様性を維持しつつ、単鎖抗体を作製する必要がある。
単鎖抗体又は単鎖抗体ライブラリーを作製するためには、もとになる抗体重鎖遺伝子由来ＶＨと、軽鎖遺伝子由来のＶＬを単離した後に、適当なリンカーを介して連結する必要があり、そのための手法としては、主に以下の２つの方法がある（図１参照）。
（１）２段階クローニング法：ＶＨとＶＬをそれぞれＰＣＲ法により増幅させ、ファージミドベクターに先ずＶＬを挿入して大腸菌で増やした後に、ＶＨをファージミドに挿入し大腸菌内でクローニングする方法（非特許文献１）。
（２）ＶＬ−ＶＨアッセンブリー法：ＶＨとＶＬをそれぞれＰＣＲ法により増幅させた後に連結し、その連結物をファージミドに組み込む方法（非特許文献２）。
しかし、（１）の方法は、ステップが多く、長時間を要する上、スタートの遺伝子が単一の抗体遺伝子ではなくて上述の抗体ライブラリーに適用する場合には、上記作業により、大腸菌内での各遺伝子の増幅効率の偏りに起因して、得られる抗体ライブラリーの大きさが縮小してしまうという欠点がある。
また（２）の方法はステップが少ないが、ＰＣＲによって連結するので、フレームシフトや欠失等が起こりやすく、機能する単鎖抗体を取得することが難しい。またスタートの遺伝子が単一の抗体遺伝子ではなく、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーに対して適用する場合、遺伝子中の抗体認識部位は非常に大きなバリエーションを持っているので、この多様性が均等なＰＣＲ反応を阻害し、特定の遺伝子のみが増幅され、結果的にライブラリーの大きさが著しく縮小してしまうという事がしばしば起こってしまう。
（２）のＶＬ及びＶＨ遺伝子の連結法としては、通常、ＶＬのＣ端側、およびＶＨのＮ端にリンカー領域を付加し、そのリンカー部分の重なり合いを利用して、オーバーラップＰＣＲ反応によりＶＨ，ＶＬを連結するオーバーラップＰＣＲ法が広く行われている（図２参照、注：ＶＨとＶＬの順番は逆にしても良い）。この方法は、簡便であるが、トップ鎖及びボトム鎖それぞれを完全に一本鎖の状態としてからＰＣＲ反応によって増幅するので、非特異的接着が起こりやすく、かつ遺伝子の欠失・挿入・置換・シフトが起こりやすいという欠点がある。また、ＶＨ及びＶＬライブラリーに適用しようとする場合、多様性配列中のうちでも特定の配列を持つクローンのみが選択的に増幅されてしまうという致命的な欠陥を持つ。
このように、従来の機能的な単鎖抗体の作製手法には以上のような問題点があり、高いアフィニティーで抗原を認識する高品質の単鎖抗体の作製は容易ではない。
（１）２段階クローニング法：ＶＨとＶＬをそれぞれＰＣＲ法により増幅させ、ファージミドベクターに先ずＶＬを挿入して大腸菌で増やした後に、ＶＨをファージミドに挿入し大腸菌内でクローニングする方法（非特許文献１）。
（２）ＶＬ−ＶＨアッセンブリー法：ＶＨとＶＬをそれぞれＰＣＲ法により増幅させた後に連結し、その連結物をファージミドに組み込む方法（非特許文献２）。
しかし、（１）の方法は、ステップが多く、長時間を要する上、スタートの遺伝子が単一の抗体遺伝子ではなくて上述の抗体ライブラリーに適用する場合には、上記作業により、大腸菌内での各遺伝子の増幅効率の偏りに起因して、得られる抗体ライブラリーの大きさが縮小してしまうという欠点がある。
また（２）の方法はステップが少ないが、ＰＣＲによって連結するので、フレームシフトや欠失等が起こりやすく、機能する単鎖抗体を取得することが難しい。またスタートの遺伝子が単一の抗体遺伝子ではなく、ＶＨライブラリーとＶＬライブラリーに対して適用する場合、遺伝子中の抗体認識部位は非常に大きなバリエーションを持っているので、この多様性が均等なＰＣＲ反応を阻害し、特定の遺伝子のみが増幅され、結果的にライブラリーの大きさが著しく縮小してしまうという事がしばしば起こってしまう。
（２）のＶＬ及びＶＨ遺伝子の連結法としては、通常、ＶＬのＣ端側、およびＶＨのＮ端にリンカー領域を付加し、そのリンカー部分の重なり合いを利用して、オーバーラップＰＣＲ反応によりＶＨ，ＶＬを連結するオーバーラップＰＣＲ法が広く行われている（図２参照、注：ＶＨとＶＬの順番は逆にしても良い）。この方法は、簡便であるが、トップ鎖及びボトム鎖それぞれを完全に一本鎖の状態としてからＰＣＲ反応によって増幅するので、非特異的接着が起こりやすく、かつ遺伝子の欠失・挿入・置換・シフトが起こりやすいという欠点がある。また、ＶＨ及びＶＬライブラリーに適用しようとする場合、多様性配列中のうちでも特定の配列を持つクローンのみが選択的に増幅されてしまうという致命的な欠陥を持つ。
このように、従来の機能的な単鎖抗体の作製手法には以上のような問題点があり、高いアフィニティーで抗原を認識する高品質の単鎖抗体の作製は容易ではない。
２．遺伝子連結法（ＤＮＡ分子連結法）
短いＤＮＡフラグメントを連結させて、二本鎖の遺伝子を合成する方法としては、種々の連結法が知られている。トップ鎖及びボトム鎖ともにすべての遺伝子配列をカバーする短い一本鎖ＤＮＡを合成し、アニーリングさせてライゲーションを行う反応（非特許文献３）や、トップ鎖及びボトム鎖を交互に１部がオーバーラップするように合成し、アニーリング後に１本鎖部分をポリメラーゼ反応で相補させ２本鎖遺伝子を作成する方法（非特許文献４）があるが、ともに効率が低く、遺伝子のミスも多いために実用的ではない。また核酸の一本鎖領域は相補性が完全でなくとも他の一本鎖領域とハイブリダイズしてしまう場合も多く、上記反応を特異性高く進めることは簡単ではない。
上記１−２．で述べたオーバーラップＰＣＲは、良く用いられている遺伝子連結法である。原理的には、連結したいフラグメント同士に重なり合う配列があれば、何十ものフラグメントを１回のＰＣＲ反応にて一気に連結可能であるが、遺伝子の欠失・挿入・置換・シフトが起こり、現実的ではない。また遺伝子ライブラリーのように、つなぎ合わせるＤＮＡフラグメント中の配列に多様性領域が存在する場合は、その多様性領域部分に結合領域と類似した配列が出現すれば本来のＰＣＲ反応を阻害するため、ある特定の配列を持つクローンのみが選択的に増幅されてしまうという欠陥がある。
短いＤＮＡフラグメントを連結させて、二本鎖の遺伝子を合成する方法としては、種々の連結法が知られている。トップ鎖及びボトム鎖ともにすべての遺伝子配列をカバーする短い一本鎖ＤＮＡを合成し、アニーリングさせてライゲーションを行う反応（非特許文献３）や、トップ鎖及びボトム鎖を交互に１部がオーバーラップするように合成し、アニーリング後に１本鎖部分をポリメラーゼ反応で相補させ２本鎖遺伝子を作成する方法（非特許文献４）があるが、ともに効率が低く、遺伝子のミスも多いために実用的ではない。また核酸の一本鎖領域は相補性が完全でなくとも他の一本鎖領域とハイブリダイズしてしまう場合も多く、上記反応を特異性高く進めることは簡単ではない。
上記１−２．で述べたオーバーラップＰＣＲは、良く用いられている遺伝子連結法である。原理的には、連結したいフラグメント同士に重なり合う配列があれば、何十ものフラグメントを１回のＰＣＲ反応にて一気に連結可能であるが、遺伝子の欠失・挿入・置換・シフトが起こり、現実的ではない。また遺伝子ライブラリーのように、つなぎ合わせるＤＮＡフラグメント中の配列に多様性領域が存在する場合は、その多様性領域部分に結合領域と類似した配列が出現すれば本来のＰＣＲ反応を阻害するため、ある特定の配列を持つクローンのみが選択的に増幅されてしまうという欠陥がある。
Gibsonらは、ＰＣＲで増幅させた２本鎖フラグメントを効率的に連結する方法を開発した（非特許文献５、特許文献１）。隣り合うフラグメントに約４０塩基ほどの共通配列を持たせ、Ｔ５エキソヌクレアーゼでフラグメントの５’末端を消化して、その共通部分を一本鎖化する。その後で、その部分をアニーリングさせる。ポリメラーゼを作用させて、アニーリングで残った１本鎖部分の相補鎖を合成し、Ｔａｑリガーゼ（ライゲーション酵素）で両フラグメントをつなぐことで、遺伝子の連結を行う方法である。通常の５’−３’エキソヌクレアーゼでは速やかに消化反応が行われるために途中で反応を止めることは難しく、２本鎖を完全に１本鎖に消化してから次のアニーリング工程に移行させる（特許文献２）ことになるが、Ｔ５エキソヌクレアーゼの場合には、数塩基程度消化するごとに消化効率が落ちる。Ｔ５エキソヌクレアーゼのこの性質を利用することで、消化効率の落ちた途中段階でアニーリング工程に移行させることが理論的には可能である。しかし、実際にはＴ５エキソヌクレアーゼの消化反応を正確に制御することは難しい。消化量が足りなければ、アニーリング工程で２つのフラグメントの特異的な会合が困難になり、消化量が多すぎれば一本鎖部分が長くなり、その露出による非特異的結合が起こって、予期しない精製物ができることとなってしまう。そのために、両ＤＮＡフラグメントの共通部分を４０塩基程度に長く設定する必要があり、プライマーが長くなる。あまりに長いプライマーを用いると、ＰＣＲ増幅の最初の段階が効率的に行われなくなる欠点もある。また、Ｔ５エキソヌクレアーゼによる連結工程で、２つのフラグメントの連結部分ではない側の５’末端も消化されてしまい一本鎖領域ができて粘着末端となるため、予期せぬフラグメント同士の結合が起きたり、ベクターに組み込む際、フラグメントの両端に直接制限酵素処理を施せないなど、その後の操作に大きな支障を来してしまう欠点がある。
以上のことから、単鎖抗体の作製にも適用可能な遺伝子連結法であって、不要なバックグランド反応を低く押さえ、ミスなく遺伝子を高効率に連結する手法の開発が望まれており、特に、単鎖抗体ライブラリーに適用した場合に、高いアフィニティーで抗原を認識する高品質の単鎖抗体を創出可能な方法が切望されていた。
2010scFv by Two-step Cloning Dafine Muller Antibody EngineeringVol.2 Ed. Roland Kontermann and Stefan Dubel Springer 2011
Construction of scFv Fragments from Hybridoma or Spleen Jonas V.Schaefer, Annemarie Honegger and Andreas Pluckthum, Antibody Engineering Vol.1Ed. Roland Kontermann and Stefan Dubel Springer
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Daniel G Gibson, Lei Young, Ray-Yuan Chuang, J Craig Venter, Clyde AHutchison III & Hamilton O Smith, NATURE METHODS VOL.6 NO.5 MAY2009 343Enzymatic assembly of DNA molecules up toseveral hundred kilobases
本発明の課題は、２種類のＤＮＡ又はＤＮＡライブラリーを正確にかつ高効率で連結する遺伝子連結法を提供することであり、また、当該連結法を利用した機能性タンパク質をコードする遺伝子のスクリーニング方法及び機能性タンパク質大量生産方法を提供することである。特に、高いアフィニティーで抗原を認識する高品質の単鎖抗体を創出する方法を提供しようとするものである。
本発明者らは、機能的な単鎖抗体の作製方法として、ステップ数が少ない点で、前記「ＶＬ−ＶＨアッセンブリー法」として示した、ＶＨとＶＬをそれぞれＰＣＲ法により増幅させた後に連結し、その連結物をファージミドに組み込む手法が適していると考えた。そして、その際の汎用の遺伝子連結方法として用いられる、「オーバーラップ・エクステンションＰＣＲ法」を改良することを目指し、当該連結法のバックグランド反応の高さと、ミスの多さの原因を追及してきた。その結果、特に、当該連結法を単鎖抗体ライブラリー作製に適用した場合のライブラリーサイズを縮小させる１番の原因が、連結のためにＰＣＲによる増幅を必須とする点にあり、またそのことで非特異結合の原因となる一本鎖ＤＮＡを形成させることであると思い至った。そこで、ＰＣＲ法を用いることなく、２つのＤＮＡフラグメントを結合させる方法であって、しかも一本鎖ＤＮＡとしてむき出しになる領域を少なくかつ一本鎖ＤＮＡが生じる時間をできるだけ短くする手法を鋭意検討し、試行錯誤の末にその解決法としての「遺伝子連結方法」を発見するに至った。
具体的には、ＶＬ遺伝子、ＶＨ遺伝子をＰＣＲにより増幅する際に片方のＣ端側及び他方のＮ端側のプライマーにリンカー配列を付加し、さらに５’端にリン酸を付加する。得られた２種類のＤＮＡ断片のそれぞれのリン酸化５’末端をλエキソヌクレアーゼで消化して、リンカー部分を一本鎖化させて、ＶＬとＶＨを連結させた後、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼにより３’方向に残っている相補鎖をはがしつつ、新たな相補鎖を合成させて（鎖置換合成）、リンカーで繋がれたＶＬとＶＨの完全な２本鎖を製造できた。
単一のＶＬ及びＶＨ遺伝子に適用した場合に、精製すれば高品質のＶＬ−ＶＨ連結断片が取得できるし、さらに大腸菌、動物細胞などを形質転換し大量生産が可能である。また、ＶＬ及びＶＨライブラリーに適用した場合には、ファージミドに挿入して大腸菌に形質転換した単鎖抗体ライブラリーを作製できるから、標的物質を用いたパニング工程を繰り返すことで目的とする機能的単鎖抗体を得ることができる。
具体的には、ＶＬ遺伝子、ＶＨ遺伝子をＰＣＲにより増幅する際に片方のＣ端側及び他方のＮ端側のプライマーにリンカー配列を付加し、さらに５’端にリン酸を付加する。得られた２種類のＤＮＡ断片のそれぞれのリン酸化５’末端をλエキソヌクレアーゼで消化して、リンカー部分を一本鎖化させて、ＶＬとＶＨを連結させた後、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼにより３’方向に残っている相補鎖をはがしつつ、新たな相補鎖を合成させて（鎖置換合成）、リンカーで繋がれたＶＬとＶＨの完全な２本鎖を製造できた。
単一のＶＬ及びＶＨ遺伝子に適用した場合に、精製すれば高品質のＶＬ−ＶＨ連結断片が取得できるし、さらに大腸菌、動物細胞などを形質転換し大量生産が可能である。また、ＶＬ及びＶＨライブラリーに適用した場合には、ファージミドに挿入して大腸菌に形質転換した単鎖抗体ライブラリーを作製できるから、標的物質を用いたパニング工程を繰り返すことで目的とする機能的単鎖抗体を得ることができる。
さらに、本発明において用いるλエキソヌクレアーゼがＳ化（Phosphorothioate）ＤＮＡを消化できないという性質を利用して、非リン酸化プライマーの５’端をＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼの非特異的な（非リン酸化５’末端）への反応を防止した。また、リン酸化プライマーの３’端に近いところをＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼが消化するＤＮＡの長さを制御できるようになり、多様性の大きいＣＤＲ領域が一本鎖化することを避けることができ、バックグラウンド反応を激減させた。
以上の知見が得られ、本発明を完成させることができた。
以上の知見が得られ、本発明を完成させることができた。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕 第１のＤＮＡと第２のＤＮＡとをリンカー部を介して連結するための遺伝子連結法において、
ここで、第１のＤＮＡと第２のＤＮＡは、同一もしくは異なるＤＮＡ分子であって、それぞれが単一のＤＮＡ分子又はＤＮＡライブラリー中の任意のＤＮＡ分子であり、
下記（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とする遺伝子連結方法；
（１）第１及び第２のＤＮＡ増幅用のプライマーセットを用意する工程であって、第１のＤＮＡ増幅用のリバースプライマーの５’側、及び第２のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーの５’側のそれぞれにリンカー配列を付加すると共に、その５’末端塩基をリン酸化する工程、
（２）第１及び第２のＤＮＡのそれぞれをＰＣＲで増幅し、片方の鎖がリン酸化されたリンカー領域を有する状態で増幅された第１’及び第２’のＤＮＡを得る工程、
（３）第１’及び第２’のＤＮＡに設けられたリンカー領域が１本鎖になるまでλエキソヌクレアーゼで消化する工程、
（４）両者をアニーリングする工程、
（５）ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを作用させて、３’方向に鎖置換反応を起こさせる工程。
〔２〕 前記工程（１）において、第１のＤＮＡ増幅用のリバースプライマー及び第２のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーにそれぞれ設けられたリンカー配列中の３’側から１〜６塩基のいずれかの塩基をＳ化することを特徴とする、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕 前記工程（１）において、第１のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーの５’側末端塩基、及び第２のＤＮＡ増幅用のリバースプライマーの５’側末端塩基をＳ化することを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 第１のＤＮＡが、抗体のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡもしくはＤＮＡライブラリー中のＤＮＡであり、かつ第２の核酸がＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡもしくはＤＮＡライブラリー中のＤＮＡであるか、又はその反対であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 前記〔１〕〜〔４〕のいずれか記載の方法において、第１及び第２のＤＮＡがＤＮＡライブラリー中のＤＮＡであるとき、前記工程（１）〜（５）の最終産物として得られることを特徴とする、第１及び第２のＤＮＡライブラリーのそれぞれから選択された任意のＤＮＡ分子同士がリンカーを介して連結されている融合ＤＮＡ分子群からなる融合ＤＮＡライブラリー。
〔６〕 前記〔５〕に記載の融合ＤＮＡライブラリーをファージミドに繋ぎ、大腸菌を形質転換して、ファージ表面の融合タンパク質と関連づけた融合タンパク質ライブラリー。
〔７〕 前記〔６〕に記載の融合タンパク質ライブラリーに対して、標的物質を固定化した基板表面に結合させるパニング工程を含む、標的物質との結合活性を有する融合タンパク質又はそれをコードする遺伝子のスクリーニング方法。
〔８〕 前記〔６〕に記載の融合タンパク質ライブラリーに対して、標的物質を固定化した基板表面に結合させるパニング工程，増殖工程、及び精製工程を繰り返すことによる、標的物質との結合活性の高い融合タンパク質の大量生産方法。
〔９〕 融合タンパク質が単鎖抗体である前記〔８〕に記載の方法。
〔１〕 第１のＤＮＡと第２のＤＮＡとをリンカー部を介して連結するための遺伝子連結法において、
ここで、第１のＤＮＡと第２のＤＮＡは、同一もしくは異なるＤＮＡ分子であって、それぞれが単一のＤＮＡ分子又はＤＮＡライブラリー中の任意のＤＮＡ分子であり、
下記（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とする遺伝子連結方法；
（１）第１及び第２のＤＮＡ増幅用のプライマーセットを用意する工程であって、第１のＤＮＡ増幅用のリバースプライマーの５’側、及び第２のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーの５’側のそれぞれにリンカー配列を付加すると共に、その５’末端塩基をリン酸化する工程、
（２）第１及び第２のＤＮＡのそれぞれをＰＣＲで増幅し、片方の鎖がリン酸化されたリンカー領域を有する状態で増幅された第１’及び第２’のＤＮＡを得る工程、
（３）第１’及び第２’のＤＮＡに設けられたリンカー領域が１本鎖になるまでλエキソヌクレアーゼで消化する工程、
（４）両者をアニーリングする工程、
（５）ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを作用させて、３’方向に鎖置換反応を起こさせる工程。
〔２〕 前記工程（１）において、第１のＤＮＡ増幅用のリバースプライマー及び第２のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーにそれぞれ設けられたリンカー配列中の３’側から１〜６塩基のいずれかの塩基をＳ化することを特徴とする、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕 前記工程（１）において、第１のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーの５’側末端塩基、及び第２のＤＮＡ増幅用のリバースプライマーの５’側末端塩基をＳ化することを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕 第１のＤＮＡが、抗体のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡもしくはＤＮＡライブラリー中のＤＮＡであり、かつ第２の核酸がＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡもしくはＤＮＡライブラリー中のＤＮＡであるか、又はその反対であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕 前記〔１〕〜〔４〕のいずれか記載の方法において、第１及び第２のＤＮＡがＤＮＡライブラリー中のＤＮＡであるとき、前記工程（１）〜（５）の最終産物として得られることを特徴とする、第１及び第２のＤＮＡライブラリーのそれぞれから選択された任意のＤＮＡ分子同士がリンカーを介して連結されている融合ＤＮＡ分子群からなる融合ＤＮＡライブラリー。
〔６〕 前記〔５〕に記載の融合ＤＮＡライブラリーをファージミドに繋ぎ、大腸菌を形質転換して、ファージ表面の融合タンパク質と関連づけた融合タンパク質ライブラリー。
〔７〕 前記〔６〕に記載の融合タンパク質ライブラリーに対して、標的物質を固定化した基板表面に結合させるパニング工程を含む、標的物質との結合活性を有する融合タンパク質又はそれをコードする遺伝子のスクリーニング方法。
〔８〕 前記〔６〕に記載の融合タンパク質ライブラリーに対して、標的物質を固定化した基板表面に結合させるパニング工程，増殖工程、及び精製工程を繰り返すことによる、標的物質との結合活性の高い融合タンパク質の大量生産方法。
〔９〕 融合タンパク質が単鎖抗体である前記〔８〕に記載の方法。
本発明の遺伝子連結法では、従来のオーバーラップ・エクステンションＰＣＲ連結法とは異なり、ＰＣＲ法を用いるのは最初のＶＨ及びＶＬ遺伝子（ＶＨ及びＶＬライブラリー）を作製する際のみであり、連結工程においては全くＰＣＲ法を用いないために、遺伝子の変異、欠失、シフトがなくＶＨとＶＬを連結することができる。また、ＶＨ及びＶＬライブラリーに適用した場合でも５’末端からのエキソヌクレアーゼによる消化が制御可能なために、多様性の高いＣＤＲ領域までが一本鎖化されることはなく、リンカー部分の結合以外の非特異的な結合を防ぐことができるので、ＣＤＲ本来の多様性を維持した単鎖抗体ライブラリーが製造できるから、簡便かつ確実に優れた機能性の単鎖抗体が創成できる。当該連結法により長鎖同士をつなぎ合わせることも可能となり、実用上広い分野での応用が期待される。また反応を一本のチューブの中で短時間で完結させることができ、コンタミや試料のロスを極力抑えることができることも大きな利点である。
さらに、ＶＬ，ＶＨ増幅時に非リン酸化プライマーの５’端をＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼの非特異的な（非リン酸化５’末端）への反応をゼロにすることができ、またリン酸化プライマーの３’端に近いところをＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼが消化するＤＮＡの長さを確実に制御できるようになる。つまりリン酸化５’末端から、Ｓ化部分までのＤＮＡが消化され、その部分のみが、一本鎖になる。これにより、ＶＬおよびＶＨの相補的部分のみ一本鎖化することができ、バックグラウンド反応を激減させることができる。
従来のＴ５エキソヌクレアーゼを用いる方法（非特許文献５、特許文献１）では、Ｔ５エキソヌクレアーゼの消化の制御が難しいために、用いるプライマーには少なくとも４０塩基程度の共通配列を付加する必要があったが、本発明でのλエキソヌクレアーゼによる消化は、反応温度を上げることで完全に制御できるので、プライマーの共通部分は２０塩基で十分高い反応が得られている。また連結が行われない端ではλエキソヌクレアーゼによる消化は全く起こらず、その後の遺伝子操作に全く支障をきたす心配はない。また本発明では、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼのみで、５’末端にリン酸が付加した方の鎖をはがしながら相補鎖を合成し２つのフラグメントの連結を行うことができるため、連結のためにリガーゼによるＤＮＡ接着工程も、ＰＣＲ増幅工程も不要である。工程数の増加は、遺伝子の欠失・挿入・置換・シフトの起こる確率が増えるため、ライブラリーの作製においては、致命的な欠点となるが、それを避けられる点も本発明のメリットである。また、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性が高いため高温（65℃）での遺伝子合成が可能であり、このため高温でのアニーリング、すなわちより厳しい条件でのアニーリングが可能となる。そのため、非特異的な結合が押さえられるメリットがある。一方、Ｔ５エキソヌクレアーゼを用いた方法では、アニーリング後の、ポリメラーゼ反応・ライゲーション反応を50℃で行うため、非特異的反応が起こりやすい。
さらに、ＶＬ，ＶＨ増幅時に非リン酸化プライマーの５’端をＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼの非特異的な（非リン酸化５’末端）への反応をゼロにすることができ、またリン酸化プライマーの３’端に近いところをＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼが消化するＤＮＡの長さを確実に制御できるようになる。つまりリン酸化５’末端から、Ｓ化部分までのＤＮＡが消化され、その部分のみが、一本鎖になる。これにより、ＶＬおよびＶＨの相補的部分のみ一本鎖化することができ、バックグラウンド反応を激減させることができる。
従来のＴ５エキソヌクレアーゼを用いる方法（非特許文献５、特許文献１）では、Ｔ５エキソヌクレアーゼの消化の制御が難しいために、用いるプライマーには少なくとも４０塩基程度の共通配列を付加する必要があったが、本発明でのλエキソヌクレアーゼによる消化は、反応温度を上げることで完全に制御できるので、プライマーの共通部分は２０塩基で十分高い反応が得られている。また連結が行われない端ではλエキソヌクレアーゼによる消化は全く起こらず、その後の遺伝子操作に全く支障をきたす心配はない。また本発明では、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼのみで、５’末端にリン酸が付加した方の鎖をはがしながら相補鎖を合成し２つのフラグメントの連結を行うことができるため、連結のためにリガーゼによるＤＮＡ接着工程も、ＰＣＲ増幅工程も不要である。工程数の増加は、遺伝子の欠失・挿入・置換・シフトの起こる確率が増えるため、ライブラリーの作製においては、致命的な欠点となるが、それを避けられる点も本発明のメリットである。また、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性が高いため高温（65℃）での遺伝子合成が可能であり、このため高温でのアニーリング、すなわちより厳しい条件でのアニーリングが可能となる。そのため、非特異的な結合が押さえられるメリットがある。一方、Ｔ５エキソヌクレアーゼを用いた方法では、アニーリング後の、ポリメラーゼ反応・ライゲーション反応を50℃で行うため、非特異的反応が起こりやすい。
１．本発明の遺伝子連結法
１−１．基本的な遺伝子連結法
本発明者らの「遺伝子連結方法」が連結の対象とする遺伝子は、基本的には２本鎖のＤＮＡ分子（フラグメント）同士の連結方法であり、どのような種類のＤＮＡフラグメントの結合にも、またＤＮＡライブラリーを含んでいる場合の結合にも用いることができる手法である。なお、本発明においてＤＮＡライブラリー、遺伝子ライブラリーなどというとき、完全にランダム化された領域を有するＤＮＡ分子群からなるＤＮＡライブラリーの場合はもちろんであるが、生体が本来有している多様性を保持したＤＮＡ遺伝子群もＤＮＡライブラリーという。例えば、脾臓由来のＶＨ及びＶＬ遺伝子群もＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーなどという。また、ＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーを連結する、というときは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーそれぞれを構成する任意の遺伝子同士の連結を意味する。
本発明の実施の態様としては、典型的な例としてＶＨ及びＶＬ遺伝子を連結する場合、及びＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリー中の遺伝子を連結して機能的な単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製する場合について詳細に述べるが、同様の手法でＴ細胞レセプター由来のＶα及びＶβ遺伝子を連結する機能的な単鎖ＴＣＲ（scTCR：International Immunology Volume 11, Issue 5 p.745-751. 1999）の製造などにも用いることができる。その他、各種のドメイン構造を有するレセプターにおけるドメイン遺伝子の結合などに適用可能である。
１−１．基本的な遺伝子連結法
本発明者らの「遺伝子連結方法」が連結の対象とする遺伝子は、基本的には２本鎖のＤＮＡ分子（フラグメント）同士の連結方法であり、どのような種類のＤＮＡフラグメントの結合にも、またＤＮＡライブラリーを含んでいる場合の結合にも用いることができる手法である。なお、本発明においてＤＮＡライブラリー、遺伝子ライブラリーなどというとき、完全にランダム化された領域を有するＤＮＡ分子群からなるＤＮＡライブラリーの場合はもちろんであるが、生体が本来有している多様性を保持したＤＮＡ遺伝子群もＤＮＡライブラリーという。例えば、脾臓由来のＶＨ及びＶＬ遺伝子群もＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーなどという。また、ＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーを連結する、というときは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーそれぞれを構成する任意の遺伝子同士の連結を意味する。
本発明の実施の態様としては、典型的な例としてＶＨ及びＶＬ遺伝子を連結する場合、及びＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリー中の遺伝子を連結して機能的な単鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作製する場合について詳細に述べるが、同様の手法でＴ細胞レセプター由来のＶα及びＶβ遺伝子を連結する機能的な単鎖ＴＣＲ（scTCR：International Immunology Volume 11, Issue 5 p.745-751. 1999）の製造などにも用いることができる。その他、各種のドメイン構造を有するレセプターにおけるドメイン遺伝子の結合などに適用可能である。
１−１−１．２本鎖ＤＮＡフラグメントの用意
結合する対象となる２種類の２本鎖ＤＮＡフラグメント（２種類の遺伝子）を用意する。２本鎖ＤＮＡフラグメントの長さは、ＰＣＲ法で増幅できる長さであればどのような長さでも可能であるが、通常１００〜３０００塩基長、好ましくは１５０〜２０００塩基長、より好ましくは２００〜１０００塩基長である。必要であれば、あらかじめそれぞれを増幅し、精製して用いる。なお、同一のｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ上の２箇所の領域を２本鎖フラグメントとして選択する場合は、同時に増幅することが可能である。その際の増幅法としては、一般的にはＰＣＲによる増幅法が好ましい。
ここで、完全なランダム化領域を有する２本鎖ＤＮＡフラグメントを得ようとする場合は、エラー導入ＰＣＲ法など周知のランダム化法（Proc. Natd. Acad. Sci. USA Vol. 89, pp. 3576-3580, April 1992）を用いてランダム化領域を有する２種類の２本鎖ＤＮＡフラグメントのライブラリーを形成させ、それぞれのフラグメント群を精製する。
結合する対象となる２種類の２本鎖ＤＮＡフラグメント（２種類の遺伝子）を用意する。２本鎖ＤＮＡフラグメントの長さは、ＰＣＲ法で増幅できる長さであればどのような長さでも可能であるが、通常１００〜３０００塩基長、好ましくは１５０〜２０００塩基長、より好ましくは２００〜１０００塩基長である。必要であれば、あらかじめそれぞれを増幅し、精製して用いる。なお、同一のｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ上の２箇所の領域を２本鎖フラグメントとして選択する場合は、同時に増幅することが可能である。その際の増幅法としては、一般的にはＰＣＲによる増幅法が好ましい。
ここで、完全なランダム化領域を有する２本鎖ＤＮＡフラグメントを得ようとする場合は、エラー導入ＰＣＲ法など周知のランダム化法（Proc. Natd. Acad. Sci. USA Vol. 89, pp. 3576-3580, April 1992）を用いてランダム化領域を有する２種類の２本鎖ＤＮＡフラグメントのライブラリーを形成させ、それぞれのフラグメント群を精製する。
１−１−２．リン酸化２本鎖ＤＮＡフラグメントの増幅
次いで、一方のフラグメント増幅用のリバースプライマーの５’側、及び他方のフォワードプライマーの５’側に、両者に共通配列を持たせるためのリンカー部を設け、さらにその５’側末端をリン酸化しておく。５’端にリン酸を付加する手法は周知手法であり、T4 Polynucleotide kinaseを用いて、溶媒中のＡＴＰからのリン酸を付加する手法が一般的である。
それぞれの２本鎖ＤＮＡフラグメントを、上記リン酸化プライマーも用いて増幅し、センス鎖もしくはアンチセンス鎖の５’側末端がリン酸化された、リンカー融合２本鎖ＤＮＡフラグメントを得、精製する。ライブラリーの場合は、各々のフラグメント群からなるライブラリーごとの精製を行う。
次いで、一方のフラグメント増幅用のリバースプライマーの５’側、及び他方のフォワードプライマーの５’側に、両者に共通配列を持たせるためのリンカー部を設け、さらにその５’側末端をリン酸化しておく。５’端にリン酸を付加する手法は周知手法であり、T4 Polynucleotide kinaseを用いて、溶媒中のＡＴＰからのリン酸を付加する手法が一般的である。
それぞれの２本鎖ＤＮＡフラグメントを、上記リン酸化プライマーも用いて増幅し、センス鎖もしくはアンチセンス鎖の５’側末端がリン酸化された、リンカー融合２本鎖ＤＮＡフラグメントを得、精製する。ライブラリーの場合は、各々のフラグメント群からなるライブラリーごとの精製を行う。
１−１−３．リン酸化リンカー融合２本鎖ＤＮＡフラグメントの一本鎖消化とアニーリング
２種類のリン酸化リンカー融合２本鎖ＤＮＡフラグメントを混合した緩衝液中に、λエキソヌクレアーゼ（EC 3.1.11.3）を作用させて（例えば、37℃、30秒）、５’末端がリン酸化された方の鎖を、リンカー部分を含め、少なくとも５’末端から１５〜２０塩基長程度消化する。ただし、２本鎖ＤＮＡフラグメントがランダム領域を有している場合は、ランダム領域が一本鎖の状態となると本来の多様性が損なわれかねないため、ランダム領域の前でλエキソヌクレアーゼ消化が止まるように調整する。λエキソヌクレアーゼ消化は温度を上げることで、λエキソヌクレアーゼが失活し、反応を停止させることができるので、シャープに調整可能となり、系の温度を、70℃〜75℃にまで温度を上げれば、λエキソヌクレアーゼ消化反応が終了する。一本鎖状態となっているリンカー部をアニーリングするために、温度を、65〜50℃に下げることにより２本鎖ＤＮＡフラグメントがリンカー部でアニーリングする。
２種類のリン酸化リンカー融合２本鎖ＤＮＡフラグメントを混合した緩衝液中に、λエキソヌクレアーゼ（EC 3.1.11.3）を作用させて（例えば、37℃、30秒）、５’末端がリン酸化された方の鎖を、リンカー部分を含め、少なくとも５’末端から１５〜２０塩基長程度消化する。ただし、２本鎖ＤＮＡフラグメントがランダム領域を有している場合は、ランダム領域が一本鎖の状態となると本来の多様性が損なわれかねないため、ランダム領域の前でλエキソヌクレアーゼ消化が止まるように調整する。λエキソヌクレアーゼ消化は温度を上げることで、λエキソヌクレアーゼが失活し、反応を停止させることができるので、シャープに調整可能となり、系の温度を、70℃〜75℃にまで温度を上げれば、λエキソヌクレアーゼ消化反応が終了する。一本鎖状態となっているリンカー部をアニーリングするために、温度を、65〜50℃に下げることにより２本鎖ＤＮＡフラグメントがリンカー部でアニーリングする。
１−１−４．リンカー融合２本鎖ＤＮＡフラグメントの連結
系にＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（DNA-directed DNA Polymerase EC 2.7.7.7）を添加し、リンカー部でアニーリングしている２本鎖ＤＮＡフラグメントのそれぞれに対して、３’方向に残っている相補鎖をはがしつつ、新たな相補鎖を合成させて、２種類の２本鎖ＤＮＡフラグメントがリンカーを介して連結された完全な２本鎖が製造できる。
系にＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（DNA-directed DNA Polymerase EC 2.7.7.7）を添加し、リンカー部でアニーリングしている２本鎖ＤＮＡフラグメントのそれぞれに対して、３’方向に残っている相補鎖をはがしつつ、新たな相補鎖を合成させて、２種類の２本鎖ＤＮＡフラグメントがリンカーを介して連結された完全な２本鎖が製造できる。
１−２．ＤＮＡフラグメントのＳ化（Phosphorothioate）
本発明において用いるλエキソヌクレアーゼには、Ｓ化（Phosphorothioate）ＤＮＡを消化できないという性質があるので、上記１−１−２．工程における２種類のＤＮＡフラグメント増幅用プライマーの１箇所にＳ化処理（１〜６塩基分のリン酸基の酸素の１つ以上をＳ化する。例えば、−ＰＯ4を−ＰＯ3Ｓにする。以下、単に「Ｓ化する。」ということもある。）を行う。
具体的には、非リン酸化プライマーについては、５’端をＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼの非特異的な（非リン酸化５’末端）への反応を防止する。
一方、リン酸化プライマーについては、３’端近傍（３’端から、２〜８塩基長部分）の１〜６塩基分のリン酸基の酸素の１つ以上をＳ化することにより、その位置でλエキソヌクレアーゼの消化が止まるため、一本鎖の状態で露出されるＤＮＡの長さを正確に制御できる。
そして、本発明では、鎖置換反応によってＤＮＡを合成していくＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを選択したことで、アニーリング後に２本鎖部分にＳ化ＤＮＡがあっても相補鎖合成反応の妨げにはならず、しかも最終的に得られる２本鎖ＤＮＡフラグメントにはＳ化ＤＮＡは残らない。
本発明において用いるλエキソヌクレアーゼには、Ｓ化（Phosphorothioate）ＤＮＡを消化できないという性質があるので、上記１−１−２．工程における２種類のＤＮＡフラグメント増幅用プライマーの１箇所にＳ化処理（１〜６塩基分のリン酸基の酸素の１つ以上をＳ化する。例えば、−ＰＯ4を−ＰＯ3Ｓにする。以下、単に「Ｓ化する。」ということもある。）を行う。
具体的には、非リン酸化プライマーについては、５’端をＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼの非特異的な（非リン酸化５’末端）への反応を防止する。
一方、リン酸化プライマーについては、３’端近傍（３’端から、２〜８塩基長部分）の１〜６塩基分のリン酸基の酸素の１つ以上をＳ化することにより、その位置でλエキソヌクレアーゼの消化が止まるため、一本鎖の状態で露出されるＤＮＡの長さを正確に制御できる。
そして、本発明では、鎖置換反応によってＤＮＡを合成していくＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを選択したことで、アニーリング後に２本鎖部分にＳ化ＤＮＡがあっても相補鎖合成反応の妨げにはならず、しかも最終的に得られる２本鎖ＤＮＡフラグメントにはＳ化ＤＮＡは残らない。
１−３．本発明の遺伝子連結法
したがって、本発明の遺伝子連結方法は、以下のように表現することができる。
第１のＤＮＡと第２のＤＮＡとをリンカー部を介して連結するための遺伝子連結法において、
ここで、第１のＤＮＡと第２のＤＮＡは、同一もしくは異なるＤＮＡ分子であって、それぞれが単一のＤＮＡ分子又はＤＮＡライブラリー中の任意のＤＮＡ分子であり、
下記（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とする遺伝子連結方法；
（１）第１及び第２のＤＮＡ増幅用のプライマーセットを用意する工程であって、第１のＤＮＡ増幅用のリバースプライマーの５’側、及び第２のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーの５’側のそれぞれにリンカー配列を付加すると共に、その５’末端塩基をリン酸化する工程、
ここで、第１のＤＮＡ増幅用のリバースプライマー及び第２のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーにそれぞれ設けられたリンカー配列中の３’側から１〜６塩基のいずれかの塩基をＳ化することが好ましい。同時に、第１のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーの５’側末端塩基、及び第２のＤＮＡ増幅用のリバースプライマーの５’側末端塩基をＳ化することがさらに好ましい。
（２）第１及び第２のＤＮＡのそれぞれをＰＣＲで増幅し、片方の鎖がリン酸化されたリンカー領域を有する状態で増幅された第１’及び第２’のＤＮＡを得る工程、
（３）第１’及び第２’のＤＮＡに設けられたリンカー領域が１本鎖になるまでλエキソヌクレアーゼで消化する工程、
（４）両者をアニーリングする工程、
（５）ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを作用させて、３’方向に鎖置換反応を起こさせる工程。
前記遺伝子連結方法を、第１及び第２のＤＮＡライブラリー中のＤＮＡ同士の連結方法として利用することで、工程（１）〜（５）の最終産物として、第１及び第２のＤＮＡライブラリーのそれぞれから選択された任意のＤＮＡ分子同士がリンカーを介して連結されている融合ＤＮＡ分子群からなる融合ＤＮＡライブラリーを作製することができる。
そして、当該融合ＤＮＡライブラリーは、種々のスクリーニング系で、機能性タンパク質及びそれをコードする遺伝子のスクリーニングに利用できる。
例えば、当該融合ＤＮＡライブラリーをファージミドに繋ぎ、大腸菌を形質転換して、ファージ表面の融合タンパク質と関連づけた融合タンパク質ライブラリーが作製できるので、以下、その融合タンパク質ライブラリーを用いたスクリーニング方法、及び得られた機能性タンパク質の大量生産方法について述べる。
したがって、本発明の遺伝子連結方法は、以下のように表現することができる。
第１のＤＮＡと第２のＤＮＡとをリンカー部を介して連結するための遺伝子連結法において、
ここで、第１のＤＮＡと第２のＤＮＡは、同一もしくは異なるＤＮＡ分子であって、それぞれが単一のＤＮＡ分子又はＤＮＡライブラリー中の任意のＤＮＡ分子であり、
下記（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とする遺伝子連結方法；
（１）第１及び第２のＤＮＡ増幅用のプライマーセットを用意する工程であって、第１のＤＮＡ増幅用のリバースプライマーの５’側、及び第２のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーの５’側のそれぞれにリンカー配列を付加すると共に、その５’末端塩基をリン酸化する工程、
ここで、第１のＤＮＡ増幅用のリバースプライマー及び第２のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーにそれぞれ設けられたリンカー配列中の３’側から１〜６塩基のいずれかの塩基をＳ化することが好ましい。同時に、第１のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーの５’側末端塩基、及び第２のＤＮＡ増幅用のリバースプライマーの５’側末端塩基をＳ化することがさらに好ましい。
（２）第１及び第２のＤＮＡのそれぞれをＰＣＲで増幅し、片方の鎖がリン酸化されたリンカー領域を有する状態で増幅された第１’及び第２’のＤＮＡを得る工程、
（３）第１’及び第２’のＤＮＡに設けられたリンカー領域が１本鎖になるまでλエキソヌクレアーゼで消化する工程、
（４）両者をアニーリングする工程、
（５）ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを作用させて、３’方向に鎖置換反応を起こさせる工程。
前記遺伝子連結方法を、第１及び第２のＤＮＡライブラリー中のＤＮＡ同士の連結方法として利用することで、工程（１）〜（５）の最終産物として、第１及び第２のＤＮＡライブラリーのそれぞれから選択された任意のＤＮＡ分子同士がリンカーを介して連結されている融合ＤＮＡ分子群からなる融合ＤＮＡライブラリーを作製することができる。
そして、当該融合ＤＮＡライブラリーは、種々のスクリーニング系で、機能性タンパク質及びそれをコードする遺伝子のスクリーニングに利用できる。
例えば、当該融合ＤＮＡライブラリーをファージミドに繋ぎ、大腸菌を形質転換して、ファージ表面の融合タンパク質と関連づけた融合タンパク質ライブラリーが作製できるので、以下、その融合タンパク質ライブラリーを用いたスクリーニング方法、及び得られた機能性タンパク質の大量生産方法について述べる。
２．目的とする機能性タンパク質のスクリーニング方法
上記工程で得られたリンカーで連結された２本鎖ＤＮＡフラグメントを適宜ベクターに繋ぎ、形質転換細胞内で、目的とする融合タンパク質を大量生産できる。
２本鎖ＤＮＡフラグメントのライブラリーに適用した場合は、リンカーで連結された２本鎖ＤＮＡフラグメントライブラリーが製造される。典型的には、これらをファージミドに繋いで、大腸菌を形質転換し、それぞれを大量生産した後、ファージ表面にディスプレイされたタンパク質を目的の機能を指標にスクリーニングする。例えば、特定の標的物質への親和性の強いタンパク質を取得する目的であれば、標的物質を固定化した基板表面にファージを結合させるスクリーニング工程によって、結合活性の強いクローンを取得できる。ファージディスプレイ法以外のリボソームアッセイ法なども無細胞系のディスプレイ法によりスクリーニングしてもよい。
上記工程で得られたリンカーで連結された２本鎖ＤＮＡフラグメントを適宜ベクターに繋ぎ、形質転換細胞内で、目的とする融合タンパク質を大量生産できる。
２本鎖ＤＮＡフラグメントのライブラリーに適用した場合は、リンカーで連結された２本鎖ＤＮＡフラグメントライブラリーが製造される。典型的には、これらをファージミドに繋いで、大腸菌を形質転換し、それぞれを大量生産した後、ファージ表面にディスプレイされたタンパク質を目的の機能を指標にスクリーニングする。例えば、特定の標的物質への親和性の強いタンパク質を取得する目的であれば、標的物質を固定化した基板表面にファージを結合させるスクリーニング工程によって、結合活性の強いクローンを取得できる。ファージディスプレイ法以外のリボソームアッセイ法なども無細胞系のディスプレイ法によりスクリーニングしてもよい。
典型的な融合タンパク質ライブラリーとして、上記１−３．で得られた融合ＤＮＡライブラリーをファージミドに繋ぎ、大腸菌を形質転換して、ファージ表面の融合タンパク質と関連づけた融合タンパク質ライブラリーを用いた、本発明の機能性タンパク質、特に標的物質との結合活性を有する融合タンパク質のスクリーニング方法については、以下のように表現できる。
上記１−３．で得られた融合ＤＮＡライブラリーをファージミドに繋ぎ、大腸菌を形質転換して、ファージ表面の融合タンパク質と関連づけた融合タンパク質ライブラリーに対して、標的物質を固定化した基板表面に結合させるパニング工程を含む、標的物質との結合活性を有する融合タンパク質又はそれをコードする遺伝子のスクリーニング方法。
また、標的物質との結合活性を有する融合タンパク質の大量生産方法については、以下のように表現できる。
上記１−３．で得られた融合ＤＮＡライブラリーをファージミドに繋ぎ、大腸菌を形質転換して、ファージ表面の融合タンパク質と関連づけた融合タンパク質ライブラリーに対して、標的物質を固定化した基板表面に結合させるパニング工程，増殖工程、及び精製工程を繰り返すことによる、標的物質との結合活性の高い融合タンパク質の大量生産方法。
上記１−３．で得られた融合ＤＮＡライブラリーをファージミドに繋ぎ、大腸菌を形質転換して、ファージ表面の融合タンパク質と関連づけた融合タンパク質ライブラリーに対して、標的物質を固定化した基板表面に結合させるパニング工程を含む、標的物質との結合活性を有する融合タンパク質又はそれをコードする遺伝子のスクリーニング方法。
また、標的物質との結合活性を有する融合タンパク質の大量生産方法については、以下のように表現できる。
上記１−３．で得られた融合ＤＮＡライブラリーをファージミドに繋ぎ、大腸菌を形質転換して、ファージ表面の融合タンパク質と関連づけた融合タンパク質ライブラリーに対して、標的物質を固定化した基板表面に結合させるパニング工程，増殖工程、及び精製工程を繰り返すことによる、標的物質との結合活性の高い融合タンパク質の大量生産方法。
３．ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子との連結
３−１．「ＶＬ−ＶＨアッセンブリー法」
本発明者らの開発した遺伝子連結法の典型的な例として、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子との２本鎖フラグメントに適用した場合（図３）について、以下具体的に説明する。ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子に適用した場合を、特に「ＶＬ−ＶＨアッセンブリー法」と呼ぶこともある。
（１）まず、ＶＬ遺伝子、ＶＨ遺伝子をそれぞれＰＣＲにより増幅する。この時、ＶＬのＣ端、ＶＨのＮ端側のプライマーに（ａ）（ｂ）の工夫を加える。
（ａ）プライマーにリンカー配列を付加する。
（ｂ）５’端にリン酸を付加する。
ここで、リンカー配列としては、通常９〜６０塩基、好ましくは２１〜５１塩基程度なので、プライマー全体の長さは、フォワード及びリバースプライマーそれぞれ通常２４〜７５塩基、好ましくは３６〜６６塩基である。５’端にリン酸を付加する手法は周知手法であり、本実施例では、T4 Polynucleotide kinaseのキットの仕様書に従って当該kinaseによりＡＴＰ由来のリン酸を５’端に付加した。
下記［表１］に示す、ＶＬとＶＨのフォワード及びリバースプライマー（配列番号１，３，５，７）を用いて、ハイブリドーマからのｃＤＮＡよりＶＬ及びＶＨ遺伝子をＰＣＲ反応により、増幅する。このＶＬ及びＶＨ遺伝子に対して以下の手法を適用すればよい。また実験動物の脾臓由来のｃＤＮＡライブラリーからＶＬ及びＶＨ遺伝子をＰＣＲ反応により増幅し、ＶＬ及びＶＨ遺伝子フラグメントを精製すれば、ＣＤＲ部分に抗体本来の多様性を保持したＶＬ及びＶＨライブラリーが作製できるので、当該ＶＬ及びＶＨライブラリーに対して、以下の手法を適用すればよい。
その際、実験動物をあらかじめ標的物質で免疫しておけば、より標的物質への結合活性の強い単鎖抗体を創出可能なＶＬ及びＶＨライブラリーが製造できる。
得られた５’端にリン酸が付加されたリンカー領域を有するＶＨ遺伝子及び相補鎖側の５’端にリン酸が付加されたリンカーのアンチセンス領域を有するＶＬ遺伝子（ＶＬ及びＶＨ遺伝子は反対でも良く、それぞれがライブラリーであっても良い。以下同様。）のそれぞれを精製する。
３−１．「ＶＬ−ＶＨアッセンブリー法」
本発明者らの開発した遺伝子連結法の典型的な例として、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子との２本鎖フラグメントに適用した場合（図３）について、以下具体的に説明する。ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子に適用した場合を、特に「ＶＬ−ＶＨアッセンブリー法」と呼ぶこともある。
（１）まず、ＶＬ遺伝子、ＶＨ遺伝子をそれぞれＰＣＲにより増幅する。この時、ＶＬのＣ端、ＶＨのＮ端側のプライマーに（ａ）（ｂ）の工夫を加える。
（ａ）プライマーにリンカー配列を付加する。
（ｂ）５’端にリン酸を付加する。
ここで、リンカー配列としては、通常９〜６０塩基、好ましくは２１〜５１塩基程度なので、プライマー全体の長さは、フォワード及びリバースプライマーそれぞれ通常２４〜７５塩基、好ましくは３６〜６６塩基である。５’端にリン酸を付加する手法は周知手法であり、本実施例では、T4 Polynucleotide kinaseのキットの仕様書に従って当該kinaseによりＡＴＰ由来のリン酸を５’端に付加した。
下記［表１］に示す、ＶＬとＶＨのフォワード及びリバースプライマー（配列番号１，３，５，７）を用いて、ハイブリドーマからのｃＤＮＡよりＶＬ及びＶＨ遺伝子をＰＣＲ反応により、増幅する。このＶＬ及びＶＨ遺伝子に対して以下の手法を適用すればよい。また実験動物の脾臓由来のｃＤＮＡライブラリーからＶＬ及びＶＨ遺伝子をＰＣＲ反応により増幅し、ＶＬ及びＶＨ遺伝子フラグメントを精製すれば、ＣＤＲ部分に抗体本来の多様性を保持したＶＬ及びＶＨライブラリーが作製できるので、当該ＶＬ及びＶＨライブラリーに対して、以下の手法を適用すればよい。
その際、実験動物をあらかじめ標的物質で免疫しておけば、より標的物質への結合活性の強い単鎖抗体を創出可能なＶＬ及びＶＨライブラリーが製造できる。
得られた５’端にリン酸が付加されたリンカー領域を有するＶＨ遺伝子及び相補鎖側の５’端にリン酸が付加されたリンカーのアンチセンス領域を有するＶＬ遺伝子（ＶＬ及びＶＨ遺伝子は反対でも良く、それぞれがライブラリーであっても良い。以下同様。）のそれぞれを精製する。
（２）ＶＬ及びＶＨ遺伝子フラグメントのセンス鎖及びアンチセンス鎖のリン酸化５’末端をλエキソヌクレアーゼで消化して、そのリンカー部分を一本鎖化し、λエキソヌクレアーゼを熱変性で失活させる。
（３）λエキソヌクレアーゼにより消化されて一本鎖となったリンカー部分は、ＶＬとＶＨで相補的な配列になっているので、λエキソヌクレアーゼを熱変性で失活させた後、適当な温度でアニーリングさせ、ＶＬとＶＨを連結させる。
（４）次いで、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素を作用させて、トップ鎖・ボトム鎖ともに３’方向に残っている相補鎖を置換しつつ、新たな相補鎖を合成させることにより、完全な２本鎖を形成する。
（５）反応終了後（30分程度の短い時間でこの反応は終了する）、精製物をアガロース電気泳動し、精製すれば、高品質のＶＬ−ＶＨ連結断片が取得できる。
（６）ＶＬライブラリー及びＶＨライブラリーに上記手法を適用した場合には、得られたＶＬ−ＶＨ連結断片群をファージミドに挿入して、大腸菌に形質転換して単鎖抗体ライブラリーを作製し、固定化した標的物質によるパニング工程を繰り返すことで目的とする機能的単鎖抗体を濃縮する。
（３）λエキソヌクレアーゼにより消化されて一本鎖となったリンカー部分は、ＶＬとＶＨで相補的な配列になっているので、λエキソヌクレアーゼを熱変性で失活させた後、適当な温度でアニーリングさせ、ＶＬとＶＨを連結させる。
（４）次いで、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ酵素を作用させて、トップ鎖・ボトム鎖ともに３’方向に残っている相補鎖を置換しつつ、新たな相補鎖を合成させることにより、完全な２本鎖を形成する。
（５）反応終了後（30分程度の短い時間でこの反応は終了する）、精製物をアガロース電気泳動し、精製すれば、高品質のＶＬ−ＶＨ連結断片が取得できる。
（６）ＶＬライブラリー及びＶＨライブラリーに上記手法を適用した場合には、得られたＶＬ−ＶＨ連結断片群をファージミドに挿入して、大腸菌に形質転換して単鎖抗体ライブラリーを作製し、固定化した標的物質によるパニング工程を繰り返すことで目的とする機能的単鎖抗体を濃縮する。
［表１］ プライマー
１）ＶＬフォワードプライマー：（配列番号１）
5’-GTGGCCCAGCCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC-3’
２）Ｓ化ＶＬフォワードプライマー：（配列番号２）
5’-gaTCGTGGCCCAGCCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC-3’
（小文字部gaをS化）
３）ＶＬリバースプライマー：（配列番号３）
5’-GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG-3’
４）Ｓ化ＶＬリバースプライマー：（配列番号４）
5’-GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCagG-3’
（小文字AGをS化）
５）ＶHフォワードプライマー：（配列番号５）
5’-GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG-3’
６）Ｓ化ＶHフォワードプライマー：（配列番号６）
5’-GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTtgGACGAG-3’
（小文字TGにS化）
７）ＶＨリバースプライマー：（配列番号７）
5’-CCTTTTGCGGCCGCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC-3’
８）Ｓ化ＶＨリバースプライマー：（配列番号８）
5’-ccTTTTGCGGCCGCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC-3’
（小文字部分CCをS化）
１）ＶＬフォワードプライマー：（配列番号１）
5’-GTGGCCCAGCCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC-3’
２）Ｓ化ＶＬフォワードプライマー：（配列番号２）
5’-gaTCGTGGCCCAGCCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC-3’
（小文字部gaをS化）
３）ＶＬリバースプライマー：（配列番号３）
5’-GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG-3’
４）Ｓ化ＶＬリバースプライマー：（配列番号４）
5’-GGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCagG-3’
（小文字AGをS化）
５）ＶHフォワードプライマー：（配列番号５）
5’-GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG-3’
６）Ｓ化ＶHフォワードプライマー：（配列番号６）
5’-GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTtgGACGAG-3’
（小文字TGにS化）
７）ＶＨリバースプライマー：（配列番号７）
5’-CCTTTTGCGGCCGCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC-3’
８）Ｓ化ＶＨリバースプライマー：（配列番号８）
5’-ccTTTTGCGGCCGCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC-3’
（小文字部分CCをS化）
３−２．単鎖抗体ライブラリーの作製方法
上述のように、脾臓由来のｃＤＮＡライブラリーに対して、上記［表１］のプライマーを用いて、ＶＬ及びＶＨ遺伝子領域をＰＣＲ反応により増幅し、ＶＬ及びＶＨ遺伝子フラグメントを精製すれば、ＣＤＲ部分に抗体本来の多様性を保持したＶＬ及びＶＨライブラリーが作製できる。
その際、既存のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をテンプレートとし、それぞれのＣＤＲ領域の少なくとも１つ以上を、縮退オリゴヌクレオチドを用いた方法などによりランダム化することで、ランダム化ＶＬ及びＶＨライブラリーが作製できる。また、脾臓由来のＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーをテンプレートとして、縮退オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲ領域をランダム化することでもよりランダム化度合いの高いＶＬ及びＶＨライブラリーが作製できる。
上述のように、脾臓由来のｃＤＮＡライブラリーに対して、上記［表１］のプライマーを用いて、ＶＬ及びＶＨ遺伝子領域をＰＣＲ反応により増幅し、ＶＬ及びＶＨ遺伝子フラグメントを精製すれば、ＣＤＲ部分に抗体本来の多様性を保持したＶＬ及びＶＨライブラリーが作製できる。
その際、既存のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をテンプレートとし、それぞれのＣＤＲ領域の少なくとも１つ以上を、縮退オリゴヌクレオチドを用いた方法などによりランダム化することで、ランダム化ＶＬ及びＶＨライブラリーが作製できる。また、脾臓由来のＶＨライブラリー及びＶＬライブラリーをテンプレートとして、縮退オリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲ領域をランダム化することでもよりランダム化度合いの高いＶＬ及びＶＨライブラリーが作製できる。
３−３．Ｓ化ＤＮＡを用いる方法
さらに、本発明では、λエキソヌクレアーゼがＳ化（Phosphorothioate）ＤＮＡは消化できないという性質を用いることにより、一層特異的に反応を行わせることが可能となる（図４）。ＶＬ，ＶＨ増幅時に非リン酸化プライマーの５’端をＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼの非特異的な（非リン酸化５’末端）への反応をゼロにすることができる。またリン酸化プライマーの３’端に近いところをＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼが消化するＤＮＡの長さを制御できるようになる。つまりリン酸化５‘末端から、Ｓ化部分までのＤＮＡが消化され、その部分のみが、一本鎖になる。これにより、ＶＬおよびＶＨの相補的部分のみ一本鎖化することができ、バックグラウンド反応を激減させることができる。
さらに、本発明では、λエキソヌクレアーゼがＳ化（Phosphorothioate）ＤＮＡは消化できないという性質を用いることにより、一層特異的に反応を行わせることが可能となる（図４）。ＶＬ，ＶＨ増幅時に非リン酸化プライマーの５’端をＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼの非特異的な（非リン酸化５’末端）への反応をゼロにすることができる。またリン酸化プライマーの３’端に近いところをＳ化することにより、λエキソヌクレアーゼが消化するＤＮＡの長さを制御できるようになる。つまりリン酸化５‘末端から、Ｓ化部分までのＤＮＡが消化され、その部分のみが、一本鎖になる。これにより、ＶＬおよびＶＨの相補的部分のみ一本鎖化することができ、バックグラウンド反応を激減させることができる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
（実施例１）ＶＨ，ＶＬの増幅
ナイーブ・ライブラリー作製のために、ニワトリより、脾臓を摘出し、ＲＮＡを精製、それをテンプレートにｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンプレートに、抗体遺伝子特異的なプライマー［表１］を用いてＶＨ，ＶＬ遺伝子を各々ＰＣＲ法により増幅した。
ＰＣＲ終了後、アガロースゲル電気泳動し、それぞれＶＬ，ＶＨ部を切り出し、精製する。精製後のＶＬ，ＶＨをＴＡクローニングにより、ｐＧＥＭベクター（Promega社製）に組み込み、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォーメーションした。トランスフォーメーション後、ＬＢプレート（Sigma Aldrich社製）に撒き込み、翌朝シングルクローンを採取した。これを培養し、プラスミドを精製した。ＶＬ，及びＶＨの遺伝子配列を解析し、ＶＬ及びＶＨ遺伝子であることを確認した。
ナイーブ・ライブラリー作製のために、ニワトリより、脾臓を摘出し、ＲＮＡを精製、それをテンプレートにｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンプレートに、抗体遺伝子特異的なプライマー［表１］を用いてＶＨ，ＶＬ遺伝子を各々ＰＣＲ法により増幅した。
ＰＣＲ終了後、アガロースゲル電気泳動し、それぞれＶＬ，ＶＨ部を切り出し、精製する。精製後のＶＬ，ＶＨをＴＡクローニングにより、ｐＧＥＭベクター（Promega社製）に組み込み、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォーメーションした。トランスフォーメーション後、ＬＢプレート（Sigma Aldrich社製）に撒き込み、翌朝シングルクローンを採取した。これを培養し、プラスミドを精製した。ＶＬ，及びＶＨの遺伝子配列を解析し、ＶＬ及びＶＨ遺伝子であることを確認した。
次いで、ＶＬのリバースプライマーの５’端、及びＶＨのフォワードプライマーの５’端を、下記の配合割合で、T4 Polynucleotide kinase（NEB社製）を用いて、使用説明書に従い、37℃30分間処理し、リン酸化した。
（プライマーリン酸化反応）
プライマー 10μｌ
T4 Polynucleotide kinase 2μｌ
10×バッファー 2μｌ
水 6μｌ
（プライマーリン酸化反応）
プライマー 10μｌ
T4 Polynucleotide kinase 2μｌ
10×バッファー 2μｌ
水 6μｌ
プライマー及びリン酸化プライマーを用いて、配列を確認した各クローンのプラスミドからＶＨ、ＶＬ遺伝子をそれぞれ下記条件でのＰＣＲ法にて増幅した。
（ＰＣＲ反応）
プラスミド 1μｌ
３’プライマー（配列番号１，５） 0.5μｌ
５’プライマー（配列番号３，７） 0.5μｌ
ＰＣＲ酵素（ＫＯＤ ＦＸ ＴＯＹＯＢＯ） 1μｌ
2×バッファー 25μｌ
ｄNTP 8μｌ
水 14μｌ
（反応条件）
・98℃１分×１回
・（98℃10秒、68℃30秒）×２５回
・68℃２分
・25℃
ＰＣＲ終了後、アガロースゲル電気泳動し、それぞれＶＬ，ＶＨ部を切り出し、ＶＬ及びＶＨ遺伝子を精製した。
（ＰＣＲ反応）
プラスミド 1μｌ
３’プライマー（配列番号１，５） 0.5μｌ
５’プライマー（配列番号３，７） 0.5μｌ
ＰＣＲ酵素（ＫＯＤ ＦＸ ＴＯＹＯＢＯ） 1μｌ
2×バッファー 25μｌ
ｄNTP 8μｌ
水 14μｌ
（反応条件）
・98℃１分×１回
・（98℃10秒、68℃30秒）×２５回
・68℃２分
・25℃
ＰＣＲ終了後、アガロースゲル電気泳動し、それぞれＶＬ，ＶＨ部を切り出し、ＶＬ及びＶＨ遺伝子を精製した。
（実施例２）遺伝子連結反応
精製したＶＬ，ＶＨ部遺伝子のリン酸化部分を下記の配合条件下でλエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ社製）にて37℃30秒消化し、ＶＬ，ＶＨの相補的な配列を露出させた。
（λエキソヌクレアーゼ反応）
ＶＬ 5μｌ
ＶＨ 5μｌ
λエキソヌクレアーゼ 0.5μｌ
10×バッファー 2μｌ
水 7.5μｌ
チューブを75℃30秒インキュべートし、λエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）を失活させたのち、Ｂｓｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）2μｌと10×バッファー3μｌを加えて、65℃にて20分インキュべートすることで、ＶＬ，ＶＨ遺伝子をアニーリングさせると同時に、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼによる連結、伸張反応を起こさせ、ＶＬ−ＶＨ、即ちｓｃＦＶの２本鎖遺伝子を作製した。作製したｓｃＦＶを、アガロースゲル電気泳動し、バンドを確認した結果を（図５）に示す。ＶＬとＶＨ遺伝子のバンドが消失し、両方を合わせた750bp付近にバンドがシフトしていた。
精製したＶＬ，ＶＨ部遺伝子のリン酸化部分を下記の配合条件下でλエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ社製）にて37℃30秒消化し、ＶＬ，ＶＨの相補的な配列を露出させた。
（λエキソヌクレアーゼ反応）
ＶＬ 5μｌ
ＶＨ 5μｌ
λエキソヌクレアーゼ 0.5μｌ
10×バッファー 2μｌ
水 7.5μｌ
チューブを75℃30秒インキュべートし、λエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）を失活させたのち、Ｂｓｔポリメラーゼ（ＮＥＢ）2μｌと10×バッファー3μｌを加えて、65℃にて20分インキュべートすることで、ＶＬ，ＶＨ遺伝子をアニーリングさせると同時に、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼによる連結、伸張反応を起こさせ、ＶＬ−ＶＨ、即ちｓｃＦＶの２本鎖遺伝子を作製した。作製したｓｃＦＶを、アガロースゲル電気泳動し、バンドを確認した結果を（図５）に示す。ＶＬとＶＨ遺伝子のバンドが消失し、両方を合わせた750bp付近にバンドがシフトしていた。
（実施例３）単一クローンｓｃＦＶのファージミドへの組み込み
作製したｓｃＦＶの２本鎖遺伝子を、アガロースゲル電気泳動後、切り出し、精製した。次いで、制限酵素SfiIとNotI（Promega社製）を用いて、同社の使用説明書に従い、処理し、同様の制限酵素で処理したｐＣＡＭＴＡＢ５Ｅベクターにライゲーションで組み込み、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅにトランスフォーメーションした。トランスフォーメーション後、ＬＢプレートに撒き込み、翌朝シングルクローンを採取した。これを培養し、プラスミドを精製した。ｓｃＦＶの遺伝子配列を解析し、ＶＬ，ＶＨ遺伝子及び連結部分であるリンカーの配列を確認する。確認されたｓｃＦＶの遺伝子配列を（図６）に示す。読み枠のずれ、遺伝子欠失、遺伝子挿入等は見られなかった。
作製したｓｃＦＶの２本鎖遺伝子を、アガロースゲル電気泳動後、切り出し、精製した。次いで、制限酵素SfiIとNotI（Promega社製）を用いて、同社の使用説明書に従い、処理し、同様の制限酵素で処理したｐＣＡＭＴＡＢ５Ｅベクターにライゲーションで組み込み、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅにトランスフォーメーションした。トランスフォーメーション後、ＬＢプレートに撒き込み、翌朝シングルクローンを採取した。これを培養し、プラスミドを精製した。ｓｃＦＶの遺伝子配列を解析し、ＶＬ，ＶＨ遺伝子及び連結部分であるリンカーの配列を確認する。確認されたｓｃＦＶの遺伝子配列を（図６）に示す。読み枠のずれ、遺伝子欠失、遺伝子挿入等は見られなかった。
（実施例４）ＶＨ及びＶＬライブラリーの増幅
ラビットＩｇＧで免疫したニワトリより脾臓を摘出し、ＲＮＡを精製、それをテンプレートにｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡをテンプレートに、抗体遺伝子特異的なプライマー（配列番号１，３，５，７）を用いてＶＨ，ＶＬ遺伝子をＰＣＲ法により各々増幅した。このとき、Ｓ化を含むプライマー（配列番号２，４，６，８、Sigma Aldrich社製）も使用した。
上記プライマーのうちＶＬの３’側プライマー（配列番号１，２，５，６）の５’端、及びＶＨの５’側プライマー（配列番号３，４，７，８）の５’端を下記の配合条件でリン酸化する。
（プライマーリン酸化反応）
ｃＤＮＡ 1μｌ
３’プライマー 0.5μｌ
５’プライマー 0.5μｌ
ＰＣＲ酵素（ＫＯＤＦＸ） 1μｌ
2×バッファー 25μｌ
ｄＮＴＰ 8μｌ
水 14μｌ
（ＰＣＲ反応条件）
・98℃１分×１回
・（98℃10秒、68℃30秒）×２５回
・68℃２分
・25℃
ＰＣＲ終了後、アガロースゲル電気泳動し、それぞれＶＬ，ＶＨ部を切り出し、精製する。
ラビットＩｇＧで免疫したニワトリより脾臓を摘出し、ＲＮＡを精製、それをテンプレートにｃＤＮＡを合成する。このｃＤＮＡをテンプレートに、抗体遺伝子特異的なプライマー（配列番号１，３，５，７）を用いてＶＨ，ＶＬ遺伝子をＰＣＲ法により各々増幅した。このとき、Ｓ化を含むプライマー（配列番号２，４，６，８、Sigma Aldrich社製）も使用した。
上記プライマーのうちＶＬの３’側プライマー（配列番号１，２，５，６）の５’端、及びＶＨの５’側プライマー（配列番号３，４，７，８）の５’端を下記の配合条件でリン酸化する。
（プライマーリン酸化反応）
ｃＤＮＡ 1μｌ
３’プライマー 0.5μｌ
５’プライマー 0.5μｌ
ＰＣＲ酵素（ＫＯＤＦＸ） 1μｌ
2×バッファー 25μｌ
ｄＮＴＰ 8μｌ
水 14μｌ
（ＰＣＲ反応条件）
・98℃１分×１回
・（98℃10秒、68℃30秒）×２５回
・68℃２分
・25℃
ＰＣＲ終了後、アガロースゲル電気泳動し、それぞれＶＬ，ＶＨ部を切り出し、精製する。
（実施例５）ライブラリー中のＶＨ、ＶＬ遺伝子連結反応
精製したＶＬ，ＶＨ部遺伝子のリン酸化部分をλエキソヌクレアーゼにて37℃30秒消化し、ＶＬ，ＶＨのリンカー配列を露出させた。
（λエキソヌクレアーゼ反応）
ＶＬ 20μｌ
ＶＨ 20μｌ
λエキソヌクレアーゼ 3μｌ
10×バッファー 5μｌ
水 2μｌ
チューブを75℃30秒インキュべートし、λエキソヌクレアーゼを失活させたのち、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ2μｌと10×バッファー3μｌを加えて、65℃にて20分インキュべートすることで、ＶＬ，ＶＨ遺伝子をアニーリングさせると同時に、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼによる連結、伸張反応を起こさせ、ｓｃＦＶの２本鎖遺伝子を作製する。作製したｓｃＦＶを、アガロースゲル電気泳動し、ｓｃＦＶを切り出しと共に、バンドを確認する。結果を（図７）に示す。単一クローンと同様に、ＶＬとＶＨ遺伝子のバンドが消失し、両方を合わせた750bp付近にバンドがシフトしていた。Ｓ化プライマーを用いた場合が、一番バンドのシフトが効率的に起こっていた。すなわち、ｓｃＦｖがより効率的に形成されていた。
精製したＶＬ，ＶＨ部遺伝子のリン酸化部分をλエキソヌクレアーゼにて37℃30秒消化し、ＶＬ，ＶＨのリンカー配列を露出させた。
（λエキソヌクレアーゼ反応）
ＶＬ 20μｌ
ＶＨ 20μｌ
λエキソヌクレアーゼ 3μｌ
10×バッファー 5μｌ
水 2μｌ
チューブを75℃30秒インキュべートし、λエキソヌクレアーゼを失活させたのち、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ2μｌと10×バッファー3μｌを加えて、65℃にて20分インキュべートすることで、ＶＬ，ＶＨ遺伝子をアニーリングさせると同時に、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼによる連結、伸張反応を起こさせ、ｓｃＦＶの２本鎖遺伝子を作製する。作製したｓｃＦＶを、アガロースゲル電気泳動し、ｓｃＦＶを切り出しと共に、バンドを確認する。結果を（図７）に示す。単一クローンと同様に、ＶＬとＶＨ遺伝子のバンドが消失し、両方を合わせた750bp付近にバンドがシフトしていた。Ｓ化プライマーを用いた場合が、一番バンドのシフトが効率的に起こっていた。すなわち、ｓｃＦｖがより効率的に形成されていた。
（実施例６）ｓｃＦＶ遺伝子ライブラリーのファージミドへの組み込み
ｓｃＦＶ遺伝子を精製し、制限酵素SfiIとNotI（Promega社製）を用いて同社の使用説明書に従い処理し、同様の制限酵素で処理したｐＣＡＭＴＡＢ５Ｅベクターにライゲーションで組み込み、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅにトランスフォーメーションした。トランスフォーメーション後、ＬＢプレートに撒き込み、翌朝シングルクローンを採取した。これを培養し、プラスミドを精製した。ｓｃＦＶの遺伝子配列を解析し、ＶＬ，ＶＨ遺伝子及び連結部分であるリンカーの配列を確認した。
ｓｃＦＶ遺伝子を精製し、制限酵素SfiIとNotI（Promega社製）を用いて同社の使用説明書に従い処理し、同様の制限酵素で処理したｐＣＡＭＴＡＢ５Ｅベクターにライゲーションで組み込み、大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅにトランスフォーメーションした。トランスフォーメーション後、ＬＢプレートに撒き込み、翌朝シングルクローンを採取した。これを培養し、プラスミドを精製した。ｓｃＦＶの遺伝子配列を解析し、ＶＬ，ＶＨ遺伝子及び連結部分であるリンカーの配列を確認した。
（実施例７）ライブラリーの遺伝子多様性
採取した４８クローンのコロニーを用いて、コロニーＰＣＲ法によりｓｃＦＶを増幅し、反応液をBstOI（Promega社製）を用いて、同社の使用説明書に従い処理した。その後処理溶液を、アガロースゲル電気泳動し、４８クローンのｓｃＦＶ遺伝子の切断パターンよりライブラリーの多様性を確認した。結果を（図８）に示す。制限酵素による切断パターンは４８クローン全て異なっており、充分な多様性が確保されたライブラリーを構築できたことが示されている。
採取した４８クローンのコロニーを用いて、コロニーＰＣＲ法によりｓｃＦＶを増幅し、反応液をBstOI（Promega社製）を用いて、同社の使用説明書に従い処理した。その後処理溶液を、アガロースゲル電気泳動し、４８クローンのｓｃＦＶ遺伝子の切断パターンよりライブラリーの多様性を確認した。結果を（図８）に示す。制限酵素による切断パターンは４８クローン全て異なっており、充分な多様性が確保されたライブラリーを構築できたことが示されている。
（実施例８）結合活性を持つｓｃＦＶの単離
ｓｃＦＶ遺伝子ライブラリーの、大腸菌ＸＬ−１ＢｌｕｅトランスフォーメーションコロニーをＬＢプレートから全て回収し、２×YT培地で37℃、OD（595nm）が0.6に達するまで培養し、M13KO7ヘルパーファージ（ＮＥＢ）を感染させた。その後、37℃一晩培養し、培養上清からポリエチレングリコール沈殿により、ｓｃＦＶファージライブラリーを精製する。精製したＶＬ―ＶＨファージライブラリーは抗原（ラビットＩｇＧ）をコートしたプレートを用いて１回目のパニングを行い、抗原（ラビットＩｇＧ）に結合したファージを溶出し、２×YT培地で37℃、OD（595nm）が0.6に達するまで培養した大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅに感染させた。続いて、M13KO7ヘルパーファージを感染させ、感染させたＸＬ−１ＢｌｕｅをＬＢプレートに巻き込み、翌朝大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅトランスフォーメーションコロニーを全て回収し、再び２回目のパニングを行った。パニングは３回行い、最後のパニング後の大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅトランスフォーメーションクローンより結合活性を持つｓｃＦＶを単離した。
ｓｃＦＶ遺伝子ライブラリーの、大腸菌ＸＬ−１ＢｌｕｅトランスフォーメーションコロニーをＬＢプレートから全て回収し、２×YT培地で37℃、OD（595nm）が0.6に達するまで培養し、M13KO7ヘルパーファージ（ＮＥＢ）を感染させた。その後、37℃一晩培養し、培養上清からポリエチレングリコール沈殿により、ｓｃＦＶファージライブラリーを精製する。精製したＶＬ―ＶＨファージライブラリーは抗原（ラビットＩｇＧ）をコートしたプレートを用いて１回目のパニングを行い、抗原（ラビットＩｇＧ）に結合したファージを溶出し、２×YT培地で37℃、OD（595nm）が0.6に達するまで培養した大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅに感染させた。続いて、M13KO7ヘルパーファージを感染させ、感染させたＸＬ−１ＢｌｕｅをＬＢプレートに巻き込み、翌朝大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅトランスフォーメーションコロニーを全て回収し、再び２回目のパニングを行った。パニングは３回行い、最後のパニング後の大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅトランスフォーメーションクローンより結合活性を持つｓｃＦＶを単離した。
（実施例９）単離したｓｃＦＶのELISAによる結合活性の確認
パニングを３回後のＬＢプレートから大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅトランスフォーメーションコロニーを１０個拾い、それぞれ２×YT培地で37℃、OD（595nm）が0.6に達するまで培養し、M13KO7ヘルパーファージを感染させた。その後、37℃１晩培養し、培養上清からポリエチレングリコール沈殿により、ｓｃＦＶファージを精製する。ｓｃＦＶファージの希釈系列を抗原（ラビットＩｇＧ）及びネガティブコントロールとしてＢＳＡ（WAKO）をコートした９６穴プレート（抗原コートの後、ＢＳＡでブロッキング）に分注し、37℃２時間反応させ、その後洗浄する。次いでHRP標識抗M13KO7抗体（GE Healthcare）を４０００倍希釈、分注し、37℃１時間反応させ、その後洗浄する。発色基質ＤＡＢ（SIGMA）を加え、室温で発色させた後、プレートリーダーで450nmの吸光を測定する。測定結果を（図９）に示す。１０クローン中、Ｎｏ.３，５，８，９に結合活性がみられた。
パニングを３回後のＬＢプレートから大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅトランスフォーメーションコロニーを１０個拾い、それぞれ２×YT培地で37℃、OD（595nm）が0.6に達するまで培養し、M13KO7ヘルパーファージを感染させた。その後、37℃１晩培養し、培養上清からポリエチレングリコール沈殿により、ｓｃＦＶファージを精製する。ｓｃＦＶファージの希釈系列を抗原（ラビットＩｇＧ）及びネガティブコントロールとしてＢＳＡ（WAKO）をコートした９６穴プレート（抗原コートの後、ＢＳＡでブロッキング）に分注し、37℃２時間反応させ、その後洗浄する。次いでHRP標識抗M13KO7抗体（GE Healthcare）を４０００倍希釈、分注し、37℃１時間反応させ、その後洗浄する。発色基質ＤＡＢ（SIGMA）を加え、室温で発色させた後、プレートリーダーで450nmの吸光を測定する。測定結果を（図９）に示す。１０クローン中、Ｎｏ.３，５，８，９に結合活性がみられた。
（実施例１０）結合活性を持つｓｃＦＶの配列確認
結合活性を確認したＮｏ.３，５，８，９のクローンを培養し、プラスミドを精製した。ｓｃＦＶの遺伝子配列を解析し、ＶＬ，ＶＨ遺伝子及び連結部分であるリンカーの配列を確認する。単一クローンと同様に読み枠のずれ、遺伝子欠失、遺伝子挿入等は見られなかった。Ｎｏ.５の配列解析の結果を（図１０）に示す。
結合活性を確認したＮｏ.３，５，８，９のクローンを培養し、プラスミドを精製した。ｓｃＦＶの遺伝子配列を解析し、ＶＬ，ＶＨ遺伝子及び連結部分であるリンカーの配列を確認する。単一クローンと同様に読み枠のずれ、遺伝子欠失、遺伝子挿入等は見られなかった。Ｎｏ.５の配列解析の結果を（図１０）に示す。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：VL forward primer
配列番号２：VL forward primer(S)
配列番号３：VL reverse primer
配列番号４：VL reverse primer(S)
配列番号５：VH forward primer
配列番号６：VH forward primer(S)
配列番号７：VH reverse primer
配列番号８：VH reverse primer(S)
配列番号９：DNA sequence of chicken scFv constructed with λ-exonulease method
配列番号１０：DNA sequence of chicken scFv spefific to rabbit IgG
配列番号１：VL forward primer
配列番号２：VL forward primer(S)
配列番号３：VL reverse primer
配列番号４：VL reverse primer(S)
配列番号５：VH forward primer
配列番号６：VH forward primer(S)
配列番号７：VH reverse primer
配列番号８：VH reverse primer(S)
配列番号９：DNA sequence of chicken scFv constructed with λ-exonulease method
配列番号１０：DNA sequence of chicken scFv spefific to rabbit IgG
Claims (9)
- 第１のＤＮＡと第２のＤＮＡとをリンカー部を介して連結するための遺伝子連結法において、
ここで、第１のＤＮＡと第２のＤＮＡは、同一もしくは異なるＤＮＡ分子であって、それぞれが単一のＤＮＡ分子又はＤＮＡライブラリー中の任意のＤＮＡ分子であり、
下記（１）〜（５）の工程を含むことを特徴とする遺伝子連結方法；
（１）第１及び第２のＤＮＡ増幅用のプライマーセットを用意する工程であって、第１のＤＮＡ増幅用のリバースプライマーの５’側、及び第２のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーの５’側のそれぞれにリンカー配列を付加すると共に、その５’末端塩基をリン酸化する工程、
（２）第１及び第２のＤＮＡのそれぞれをＰＣＲで増幅し、片方の鎖がリン酸化されたリンカー領域を有する状態で増幅された第１’及び第２’のＤＮＡを得る工程、
（３）第１’及び第２’のＤＮＡに設けられたリンカー領域が１本鎖になるまでλエキソヌクレアーゼで消化する工程、
（４）両者をアニーリングする工程、
（５）ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを作用させて、３’方向に鎖置換反応を起こさせる工程。 - 前記工程（１）において、第１のＤＮＡ増幅用のリバースプライマー及び第２のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーにそれぞれ設けられたリンカー配列中の３’側から１〜６塩基のいずれかの塩基をＳ化することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記工程（１）において、第１のＤＮＡ増幅用のフォワードプライマーの５’側末端塩基、及び第２のＤＮＡ増幅用のリバースプライマーの５’側末端塩基をＳ化することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
- 第１のＤＮＡが、抗体のＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡもしくはＤＮＡライブラリー中のＤＮＡであり、かつ第２の核酸がＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡもしくはＤＮＡライブラリー中のＤＮＡであるか、又はその反対であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 第１のＤＮＡライブラリー中のそれぞれの第１のＤＮＡ分子と第２のＤＮＡライブラリー中のそれぞれの第２のＤＮＡ分子に対し、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子連結方法を適用することにより、第１及び第２のＤＮＡライブラリーのそれぞれから選択された任意のＤＮＡ分子同士をリンカーを介して連結させることを特徴とする、第１及び第２のＤＮＡライブラリーのそれぞれから選択された任意のＤＮＡ分子同士がリンカーを介して連結されている融合ＤＮＡ分子群からなる融合ＤＮＡライブラリーの製造方法。
- 請求項５に記載の方法により融合ＤＮＡライブラリーを製造し、当該ライブラリーをファージミドに繋ぎ、大腸菌を形質転換して、ファージ表面の融合タンパク質と関連づけた融合タンパク質ライブラリーを製造することを特徴とする、融合タンパク質ライブラリーの製造方法。
- 請求項６に記載の方法により融合タンパク質ライブラリーを製造し、当該ライブラリーに対して、標的物質を固定化した基板表面に結合させるパニング工程を適用することを含む、標的物質との結合活性を有する融合タンパク質又はそれをコードする遺伝子のスクリーニング方法。
- 請求項６に記載の方法により融合タンパク質ライブラリーを製造し、当該ライブラリーに対して、標的物質を固定化した基板表面に結合させるパニング工程，増殖工程、及び精製工程を繰り返すことによる、標的物質との結合活性の高い融合タンパク質の大量生産方法。
- 融合タンパク質が単鎖抗体である請求項８に記載の方法。
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| JP2012106165A JP6004423B2 (ja) | 2012-05-07 | 2012-05-07 | 遺伝子連結法およびそれを用いた単鎖抗体作製方法 |
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-
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