JP4426315B2 - OX40R binder - Google Patents

Description

本発明は、ＯＸ４０受容体とＯＸ４０リガンドとの相互作用を調節できる新しいペプチドに関する。   The present invention relates to a new peptide capable of modulating the interaction between OX40 receptor and OX40 ligand.

ＯＸ４０受容体（文献ではＯＸ４０Ｒ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０抗原、ＴＮＦＲＳＦ４、またはＣＤ１３４とも表示される）の膜タンパク質、およびＯＸ４０リガンド（文献ではＯＸ４０Ｌ、糖タンパク質ｇｐ３４、ＡＣＴ−４−Ｌ、ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ１３４リガンド、またはＣＤ１３４Ｌとも表示される）によって構成される細胞調節系は、腫瘍壊死因子リガンド／受容体スーパーファミリーに属するその他のタンパク質と同様、免疫反応の調節、並びに二次リンパ組織の形成において重要な役割を有する（グラベンスタイン（Ｇｒａｖｅｓｔｅｉｎ）Ｌおよびボルスト（Ｂｏｒｓｔ）Ｊ、１９９８；ワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）Ａ、２００２）。臨床観察、および例えば遺伝子ターゲティング実験などの動物モデルによって、これらの活動の多くの証拠が提供されている（チェン（Ｃｈｅｎ）Ａら、１９９９、コップ（Ｋｏｐｆ）Ｍら、１９９９；ムラタ（Ｍｕｒａｔａ）Ｋら、２０００）。   Membrane protein of OX40 receptor (also indicated in literature as OX40R, OX-40, OX-40 antigen, TNFRSF4, or CD134) and OX40 ligand (in literature, OX40L, glycoprotein gp34, ACT-4-L, TNFSF4, The cell regulatory system constituted by CD134 ligand, or CD134L), as well as other proteins belonging to the tumor necrosis factor ligand / receptor superfamily, is important in regulating immune responses and in the formation of secondary lymphoid tissues (Gravestein L and Borst J, 1998; Weinberg A, 2002). Much evidence of these activities has been provided by clinical observations and animal models such as gene targeting experiments (Chen A et al., 1999, Kopf M et al., 1999; Murata K Et al., 2000).

ＯＸ４０受容体（以下ＯＸ４０Ｒ）は、ＴＮＦＲファミリーのメンバーの細胞表面抗原であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）結合に続いて一過性に発現され、同時刺激の受容体として働く。これはＴ細胞のための高度に特異的なＣＤ４⁺またはＣＤ８⁺活性化マーカーと考えられ、多発性硬化症または関節リウマチなどにおけるような、免疫学的病理に関連した炎症部位、並びに腫瘍浸潤リンパ球、および移植片対宿主病の動物モデルの末梢血で過剰発現されることが多い。 The OX40 receptor (hereinafter referred to as OX40R) is a cell surface antigen of a member of the TNFR family, and is transiently expressed following T cell receptor (TCR) binding and serves as a costimulatory receptor. This is thought to be a highly specific CD4 ⁺ or CD8 ⁺ activation marker for T cells, sites of inflammation associated with immunological pathology, such as in multiple sclerosis or rheumatoid arthritis, and tumor infiltrating lymph Often overexpressed in the peripheral blood of spheres and animal models of graft-versus-host disease.

ＯＸ４０リガンド（以下、ＯＸ４０Ｌ）は、本来ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１感染症およびＣＤ４０活性化によって刺激されるタンパク質として同定された膜貫通タンパク質であり（ミウラ（Ｍｉｕｒａ）Ｓら、１９９１）、ＴＮＦと構造的類似性を有して細胞結合性または分泌性三量体を形成できる。これは、活性化された抗原提示ＢおよびＴ細胞、並びに樹状細胞、脈管内皮細胞およびその他の非造血性組織（例えば心臓、骨格筋、および膵臓）上に提示される。   OX40 ligand (hereinafter OX40L) is a transmembrane protein originally identified as a protein stimulated by human T cell lymphotropic virus 1 infection and CD40 activation (Miura S et al., 1991), It can form cell-bound or secretable trimers with structural similarity to TNF. It is presented on activated antigen presenting B and T cells, as well as dendritic cells, vascular endothelial cells and other non-hematopoietic tissues such as heart, skeletal muscle, and pancreas.

ＯＸ４０Ｌは、高親和性（Ｋｄ＝０．２〜０．４ｎＭ）を持つホモ三量体としてＯＸ４０Ｒと相互作用し、このシステムについて様々な結合アッセイが試験されている（テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｌら、２００２；テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｌおよびシュヴァルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）Ｈ、２００１；アル−シャムカニ（Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ）Ａら、１９９７）。しかしこれまでに立体構造は解明されておらず、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用の機構に関するさらに詳しい分子の詳細を提供するための詳細な構造−活性度の研究も実施されていない。   OX40L interacts with OX40R as a homotrimer with high affinity (Kd = 0.2-0.4 nM) and various binding assays have been tested for this system (Taylor L et al., 2002; Taylor L and Schwartz H, 2001; Al-Shamkhani A et al., 1997). However, the conformation has not been elucidated so far, and detailed structure-activity studies have not been conducted to provide more detailed molecular details on the mechanism of OX40L-OX40R interaction.

ＯＸ４０ＬとＯＸ４０Ｒの間の相互作用は、ＯＸ４０Ｒ発現エフェクターＴ細胞に対して同時刺激効果を有し、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１およびＴｈ２）によるサイトカイン生成の上方制御と、活性化誘導細胞死の阻害を通じたメモリーＴ細胞の増大した生存とによって、より強い細胞反応をもたらす。機能的ＯＸ４０Ｌ遺伝子が欠損した形質転換マウス、およびＯＸ４０ＲとＯＸ４０Ｌの相互作用のブロッキング、またはＯＸ４０ＲポジティブＴ細胞の枯渇により、自己免疫の臨床的徴候が減少することが実証された己免疫動物モデルにおいて、追認する証拠も得られた。   The interaction between OX40L and OX40R has a costimulatory effect on OX40R expressing effector T cells, through upregulation of cytokine production by T helper cells (Th1 and Th2) and inhibition of activation-induced cell death Increased survival of memory T cells results in a stronger cellular response. In transgenic mice deficient in functional OX40L gene, and autoimmune animal models where blocking OX40R and OX40L interaction or depletion of OX40R positive T cells has been demonstrated to reduce clinical signs of autoimmunity, There was also evidence to confirm.

さらにＯＸ４０ＬはＯＸ４０Ｒ結合時に、Ｃ−ＣケモカインＲＡＮＴＥＳをはじめとするいくつかの遺伝子の発現を誘発し、ＯＸ４０Ｒ-ＯＸ４０Ｌ系が活性化Ｔ細胞血管外遊走の調節に関与するように見える内皮モデルにおいて得られた結果が追認される（コタニ（Ｋｏｔａｎｉ）Ａら、２００２）。   Furthermore, OX40L induces the expression of several genes, including the C-C chemokine RANTES, upon binding to OX40R, and is obtained in an endothelial model where the OX40R-OX40L system appears to be involved in the regulation of activated T cell extravasation. Results confirmed (Kotani A et al., 2002).

累積的にこれらの発現および機能データは、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用によって制御されるシグナル伝達経路が、抗原特異的増殖性反応を延長する一助になる、さもなければエフェクター／メモリーＴ細胞集団の持続、分化、または再活性化に影響するかもしれない可能性を高める。   Cumulatively, these expression and functional data indicate that the signaling pathways controlled by the OX40L-OX40R interaction help prolong the antigen-specific proliferative response, otherwise the duration of the effector / memory T cell population, Increase the likelihood that differentiation, or reactivation may be affected.

ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ系に対する関心は、細胞内情報伝達機構が未だ完全に理解されていなくとも、ＯＸ４０Ｒの発現プロフィールによってこのタンパク質が、例えば自己反応性Ｔ細胞を除去することが必要な多発性硬化症のような臨床状況において、ＣＤ４⁺Ｔ細胞仲介疾患のための特有のターゲットになるという事実に関連している。仮説では、ＯＸ４０Ｒの活性度を調節する生成物は、全てのＴ細胞をターゲットとする、自己免疫疾患および移植拒絶反応に対する従来の免疫抑制療法の重篤な副作用を有さないかもしれないとされる。 Interest in the OX40R-OX40L system is of interest in multiple sclerosis, where the expression profile of OX40R requires the removal of, for example, autoreactive T cells, even though the intracellular signaling mechanism is not yet fully understood. In such clinical situations, it is related to the fact that it becomes a unique target for CD4 ⁺ T cell mediated diseases. The hypothesis is that products that modulate the activity of OX40R may not have the serious side effects of conventional immunosuppressive therapy for autoimmune disease and transplant rejection, targeting all T cells. The

ＯＸ４０ＬとＯＸ４０Ｒの間の相互作用を調節する治療上の可能性は、ＯＸ４０Ｌ標的免疫毒素（ワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）Ａら、１９９６）、抗ＯＸ４０Ｒ抗体（バンサル−パカラ（Ｂａｎｓａｌ−Ｐａｋａｌａ）Ｐら、２００１）、抗ＯＸ４０Ｌ抗体（ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、１９９６；ヨシオカ（Ｙｏｓｈｉｏｋａ）Ｙら、２０００；ツカダ（Ｔｓｕｋａｄａ）Ｎら、２０００）、およびＯＸ４０Ｌ−Ｉｇ融合タンパク質（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ＬＭら、１９９９；ワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）Ａら、１９９９）を用いて得られた、生体内で（ｉｎ ｖｉｖｏ）生じた結果によって認識された。これらの化合物は、（炎症部位での活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞の蓄積を防止するため）ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用に拮抗する、あるいは（癌などのその他のいくつかの病的病状におけるように）ＯＸ４０Ｒを活性化することのいずれかが意図される。 Therapeutic possibilities to modulate the interaction between OX40L and OX40R are OX40L target immunotoxins (Weinberg A et al., 1996), anti-OX40R antibodies (Bansal-Pakala P et al., 2001). ), Anti-OX40L antibody (Stuber E and Strober W, 1996; Yoshioka Y et al., 2000; Tsukada N et al., 2000), and OX40L-Ig fusion protein (Higgins) ) LM et al., 1999; Weinberg A et al., 1999), recognized by in vivo results. These compounds antagonize the OX40L-OX40R interaction (to prevent the accumulation of activated CD4 ⁺ T cells at the site of inflammation) or OX40R (as in some other pathological conditions such as cancer). Any of activating is intended.

ＯＸ４０Ｒの作用薬または拮抗剤のいずれかである様々なＯＸ４０Ｒ結合剤が、免疫付与および癌治療に対してポジティブな効果を有するものとして、先行技術で開示されている（国際公開第９５／２１９１５号パンフレット；国際公開第９５／２１２５１号パンフレット；欧州特許第９７８２８７号明細書；国際公開第９９／４２５８５号パンフレット；国際公開第０２／６６０４４号パンフレット；米国特許明細第６３１２７００号明細書）。しかし実際には、ＯＸ４０Ｌ全細胞外領域または抗体などの大型分子のみが、効果的なＯＸ４０Ｒ結合剤であるとして開示される。これはまた、この相互作用を特性決定するための実際の構造−活性度研究が実施されておらず、その他のＴＮＦ／ＴＮＦＲタンパク質構造分析から信頼できる情報を推論することもできないという事実に起因する（ボードマー（Ｂｏｄｍｅｒ）ＪＬら、２００２）。   Various OX40R binding agents, either agonists or antagonists of OX40R, have been disclosed in the prior art as having positive effects on immunization and cancer treatment (WO 95/21915). Pamphlet; WO 95/21251; European Patent No. 978287; WO 99/42585 pamphlet; WO 02/66044 pamphlet; US Pat. No. 6312700). In practice, however, only large molecules such as OX40L whole extracellular region or antibodies are disclosed as being effective OX40R binding agents. This is also due to the fact that no actual structure-activity studies have been performed to characterize this interaction and no reliable information can be inferred from other TNF / TNFR protein structure analyses. (Bodmer JL et al., 2002).

既知のＯＸ４０Ｒ結合剤は、治療上および診断上の作用物質として有用であることが立証されているので、上述の大型分子の結合およびＯＸ４０Ｌ競合特性を維持して、生成するのがより容易な化合物を同定し、ペプチドまたはその他の小型分子を開発することが望ましいであろう。   Since known OX40R binding agents have proven useful as therapeutic and diagnostic agents, compounds that are easier to produce while maintaining the binding and OX40L competitive properties of the large molecules described above It would be desirable to identify and develop peptides or other small molecules.

ＯＸ４０Ｌ細胞外領域に由来する特異的ペプチドが、ＯＸ４０Ｒ結合剤として使用できることが今や発見されている。より具体的には、２つの異なる信頼できるスクリーニング技術によって示されるように、ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸９４〜１２４に対応するペプチド、並びにヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸１０７〜１１６を含むこのペプチドの断片が、高い親和性でヒトＯＸ４０Ｒと相互作用することが見いだされた。このようなペプチド、それらの配列を含む異種のタンパク質、並びにそれらの配列に基づいてデザインされたペプチドおよびその他の分子は、異なる治療上の用途のために、天然ＯＸ４０Ｌと競合するＯＸ４０Ｒ結合剤として使用できる。本発明のその他の特徴と利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。   It has now been discovered that specific peptides derived from the OX40L extracellular region can be used as OX40R binding agents. More specifically, as shown by two different reliable screening techniques, a peptide corresponding to amino acids 94-124 of human OX40L, as well as fragments of this peptide comprising amino acids 107-116 of human OX40L, have high affinity. Was found to interact with human OX40R. Such peptides, heterologous proteins containing their sequences, and peptides and other molecules designed based on those sequences are used as OX40R binding agents that compete with natural OX40L for different therapeutic applications. it can. Other features and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description.

先行技術で開示された証拠に照らして、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用を阻害するためのＯＸ４０Ｒ結合剤として有用たり得る、ＯＸ４０Ｌ細胞外領域中への特異的ペプチド配列の指摘はない。   In light of the evidence disclosed in the prior art, there is no indication of specific peptide sequences into the OX40L extracellular region that may be useful as OX40R binding agents to inhibit OX40R-OX40L interactions.

ＯＸ４０Ｌ細胞外領域に由来する一連のペプチドをスクリーニングすることで、高い親和性でＯＸ４０Ｒと相互作用し、ＯＸ４０Ｌと競合する短いアミノ酸配列が意外にも同定され、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用の阻害剤として特性決定された。   By screening a series of peptides derived from the OX40L extracellular region, a short amino acid sequence that interacts with OX40R with high affinity and competes with OX40L is unexpectedly identified, and is characterized as an inhibitor of the OX40R-OX40L interaction. It has been determined.

したがって本発明は、ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸９４〜１２４（Ｐ５；配列番号：６）に対応するペプチド配列である新しいＯＸ４０Ｒ結合剤を開示する。   Accordingly, the present invention discloses a new OX40R binding agent that is a peptide sequence corresponding to amino acids 94-124 (P5; SEQ ID NO: 6) of human OX40L.

本発明は、１つ以上のアミノ酸が欠落し、ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸１０７〜１１１（ペプチドＰ５−１ａ；配列番号：１３）を含む、アミノ酸９４〜１２４（ペプチドＰ５；配列番号：６）に対応するペプチド配列からなるヒトＯＸ４０Ｌのペプチド配列であるＯＸ４０Ｒ結合剤を開示する。特にこれらのペプチドは５〜１０個のアミノ酸を有し、さらにヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸１０７〜１１６（ペプチドＰ５−１；配列番号：８）、または１０７〜１１１（ペプチドＰ５−１ａ；配列番号：１３）に対応する配列を有する。   The present invention corresponds to amino acids 94-124 (peptide P5; SEQ ID NO: 6), which lacks one or more amino acids and includes amino acids 107-111 (peptide P5-1a; SEQ ID NO: 13) of human OX40L. Disclosed is an OX40R binding agent that is a peptide sequence of human OX40L comprising a peptide sequence. In particular, these peptides have 5 to 10 amino acids, and further human OX40L amino acids 107 to 116 (peptide P5-1; SEQ ID NO: 8), or 107 to 111 (peptide P5-1a; SEQ ID NO: 13). Has a sequence corresponding to.

上で定義されたペプチドＰ５、並びにＰ５断片は、本願明細書の実施例において、ヒトＯＸ４０Ｒタンパク質に結合することが示され（または推論され）ている。この結合活性度は、組み換え型ＯＸ４０ＬおよびＯＸ４０Ｒを用いた生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイを使用して試験され、特許請求されるペプチド配列によってＯＸ４０Ｌが効果的に競合されることが実証されている。したがって本発明によって、ヒト疾患に関連した望ましくないＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用と細胞情報伝達を阻害するための新しい手段が提供される。   Peptide P5, as defined above, as well as P5 fragments have been shown (or inferred) to bind to the human OX40R protein in the examples herein. This binding activity has been tested using in vitro assays with recombinant OX40L and OX40R and has demonstrated that OX40L is effectively competed by the claimed peptide sequences. Thus, the present invention provides a new means for inhibiting undesirable OX40R-OX40L interactions and cell signaling associated with human disease.

ＯＸ４０Ｌの別称であるヒトＡＣＴ−４−Ｌの細胞外領域の断片が、ＯＸ４０Ｌ（国際公開第９５／２１９１５号パンフレット）の細胞外領域における、機能的または構造的領域に関連する可能なＯＸ４０Ｒ結合剤として開示されている。しかし文献では、ペプチドＰ５、またはペプチドＰ５−１およびＰ５−１ａなどのその断片に対応するヒトＯＸ４０Ｌの機能的または構造的領域が、ＯＸ４０Ｌに対して競合活性を有するという証拠は提供されていない。マウスＯＸ４０Ｌ細胞外領域配列に基づいてデザインされたペプチドは、抗ＯＸ４０Ｌ抗体を生成するための抗原として使用されている（ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、１９９６）が、この領域におけるマウスおよびヒトＯＸ４０Ｌの限定的保存に照らして（図５Ａおよび６Ａ）、これらのいずれかの配列がヒトＯＸ４０Ｒに対するヒトＯＸ４０Ｌの結合と効率的に競合できるとは推論できない。   A possible OX40R binding agent wherein a fragment of the extracellular region of human ACT-4-L, another term for OX40L, is associated with a functional or structural region in the extracellular region of OX40L (WO 95/21915) It is disclosed as. However, the literature does not provide evidence that functional or structural regions of human OX40L corresponding to peptide P5, or fragments thereof such as peptides P5-1 and P5-1a, have competitive activity against OX40L. Peptides designed based on the mouse OX40L extracellular region sequence have been used as antigens to generate anti-OX40L antibodies (Stuber E and Strober W, 1996), but in this region In light of the limited conservation of mouse and human OX40L (FIGS. 5A and 6A), it cannot be inferred that any of these sequences can efficiently compete with human OX40L binding to human OX40R.

本願明細書は、同一タンパク質ファミリーに属するその他のリガンド−受容体対を比較して（ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）ＪＬら、２００２）、またはＰＲＥＤＡＴＯＲ、ＰＨＤまたはＨＮＮ（例えばｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝／ＮＰＳＡ／ｎｐｓａ＿ｓｅｒｖｅｒ．ｈｔｍｌでアクセスできる）などのタンパク質構造予測に対する周知のアルゴリズムを使用して、機能的または構造的ドメインが明確に予測できなくても、このようなペプチドが意外にもＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用を阻害できるＯＸ４０Ｒ結合剤として効果的であることを成功裏に実証する。   The present specification compares other ligand-receptor pairs that belong to the same protein family (Bodmer JL et al., 2002), or PREDATOR, PHD or HNN (eg http: //npsa-pbil.ibcp. fr / cgi-bin / npsa_automat.pl? accessible at page = / NPSA / npsa_server.html), even if functional or structural domains cannot be clearly predicted using well-known algorithms for protein structure prediction Successfully demonstrate that such peptides are surprisingly effective as OX40R binders that can inhibit the OX40R-OX40L interaction.

「ペプチド」と言う用語は、普通は、通常４〜２０個の近接するアミノ酸である、４〜４０個以上の近接するアミノ酸を含有するポリペプチド鎖に適用される。このようなペプチドは、より大きなタンパク質の部分的タンパク分解性切断、化学合成、または遺伝子工学ををはじめとする、当業者に既知の方法によって生成できる。   The term “peptide” usually applies to polypeptide chains containing 4 to 40 or more contiguous amino acids, usually 4 to 20 contiguous amino acids. Such peptides can be generated by methods known to those skilled in the art, including partial proteolytic cleavage of larger proteins, chemical synthesis, or genetic engineering.

「活性の」と言う用語は、本発明のペプチドについて実証されるＯＸ４０Ｒ結合特性を示す化合物を定義する。   The term “active” defines a compound that exhibits the OX40R binding properties demonstrated for the peptides of the invention.

ペプチドＰ５、およびペプチドＰ５−１およびＰ５−１ａによって例証されるその特異的断片の特性は、それらの活性変異体中で維持でき、あるいは強化することすらできる。この分子カテゴリーは、１つ以上のアミノ酸残基が保存的に置換されているこれらの配列の類似体を含むが、ただしそれらは、技術分野で既知のまたは下の実施例で開示される手段により測定されるように、本発明で特性決定された同一生物学的活性度に匹敵するまたはより高いレベルで示す。   The properties of peptide P5 and its specific fragments exemplified by peptides P5-1 and P5-1a can be maintained or even enhanced in their active variants. This molecular category includes analogs of these sequences in which one or more amino acid residues are conservatively substituted, provided that they are known in the art or by means disclosed in the examples below. As measured, it is shown at a level comparable to or higher than the same biological activity characterized in the present invention.

本発明に従って、これらの活性変異体における好ましい変化は、一般に「保存的」または「安全」置換として知られる。保存的アミノ酸置換は、分子の構造および生物学的機能を保存するために、十分に類似した化学特性を有するアミノ酸を有するのもである。特に例えば１０個未満、好ましくは３個未満である少数のアミノ酸のみが挿入または欠落に関与し、あるいはタンパク質またはペプチドの機能的高次構造に重大な意味を持つアミノ酸を除去または置換しないならば、それらの機能を変更することなく、上で定義された配列中でアミノ酸の挿入および欠落があっても良いことが明らかである。   In accordance with the present invention, preferred changes in these active variants are generally known as “conservative” or “safe” substitutions. Conservative amino acid substitutions have amino acids with sufficiently similar chemical properties to preserve the structure and biological function of the molecule. Especially if only a few amino acids, for example less than 10, preferably less than 3, are involved in insertions or deletions or do not remove or replace amino acids that are critical to the functional conformation of the protein or peptide, It is clear that there may be amino acid insertions and deletions in the sequence defined above without changing their function.

文献は、天然タンパク質の配列および／または構造に関する統計学的および物理化学的な研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の選択が実施できる多くのモデルを提供する（ロゴブ（Ｒｏｇｏｖ）ＳＩおよびネクラソブ（Ｎｅｋｒａｓｏｖ）ＡＮ、２００１）。タンパク質デザイン実験は、アミノ酸の特異的サブセットの使用により、折りたためる活性タンパク質が生成できることを示し、タンパク質構造中により容易に収容できるアミノ酸の「同義」置換の分類の一助となる（マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ＬＲら、２０００）。同義のアミノ酸群、およびより好ましい同義の群は、表Ｉで定義されたものである。   The literature provides many models on which conservative amino acid substitution selections can be made based on statistical and physicochemical studies on the sequence and / or structure of natural proteins (Rogov SI and Nekrasov). ) AN, 2001). Protein design experiments show that the use of specific subsets of amino acids can produce active proteins that fold, helping classify “synonymous” substitutions of amino acids that can be more easily accommodated in protein structures (Murphy LR) Et al., 2000). Synonymous amino acid groups, and more preferred synonymous groups are those defined in Table I.

これらの代替えの化合物では、本願明細書で開示された基本的特性、特にＯＸ４０Ｒに結合して阻害するその能力に関して影響しないヒトＯＸ４０Ｌの選択配列の変化によって、分子を理解することが意図される。類似化合物は、従来のコード化ＤＮＡの特定部位の突然変異誘発技術から、コード化ＤＮＡ配列またはアミノ酸の組み合わせ技術（ＤＮＡ混合、ファージ・ディスプレイ／選択など）から、コンピューター利用のデザイン研究から、あるいは当業者により先行技術および本願明細書実施例に示される教示を使用して日常的に得られて試験される、実質的に対応する変異ペプチドの有限のセットを提供する、適切なあらゆるその他の既知の技術から得られても良い。   In these alternative compounds, it is intended that the molecule be understood by changes in the selected sequence of human OX40L that do not affect the basic properties disclosed herein, in particular its ability to bind and inhibit OX40R. Similar compounds can be derived from conventional site-directed mutagenesis techniques of the encoded DNA, from encoded DNA sequence or amino acid combinatorial techniques (DNA mixing, phage display / selection, etc.), from computer-based design studies, or from Any other known suitable that provides a finite set of substantially corresponding mutant peptides that are routinely obtained and tested by the vendor using the teachings presented in the prior art and examples herein. May be derived from technology.

本願明細書は、アミノ酸配列Ｐ５、Ｐ５−１、Ｐ５−１ａを含む融合ポリぺプチドまたはペプチド、あるいは上述のそれらのいずれかの活性変異体、およびヒトＯＸ４０Ｌ以外のタンパク質配列に属するアミノ酸配列である、新しいＯＸ４０結合剤を開示する。この異種の後者の配列は、ＯＸ４０Ｒ結合活性度を大幅に損なうことなしに追加的特性を提供すべきである。このような追加的特性の例は、より容易な精製手順、体液中でのより長く持続する半減期、または細胞外局在化である。この後者の特性は、本願明細書でＯＸ４０Ｒ結合剤として特性決定されたペプチドが、これらのペプチドの分離および精製が促進されるだけでなく、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０Ｒが自然に相互作用する空間に局在化できるようにするので、上の定義に含まれる融合またはキメラタンパク質の特異的な群を定義するのに、特に重要である。   The present specification is an amino acid sequence belonging to a protein sequence other than a fusion polypeptide or peptide containing the amino acid sequences P5, P5-1, P5-1a, or any of the above-described active variants, and human OX40L. Discloses a new OX40 binder. This heterologous latter sequence should provide additional properties without significantly compromising OX40R binding activity. Examples of such additional properties are easier purification procedures, longer lasting half-lives in body fluids, or extracellular localization. This latter property allows the peptides characterized herein as OX40R binders not only to facilitate the separation and purification of these peptides, but also to localize in the space where OX40L and OX40R naturally interact. It is particularly important to define a specific group of fusion or chimeric proteins that are included in the above definition as it allows.

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤をはじめとする融合タンパク質に含まれることができる追加的なタンパク質配列は、膜結合タンパク質、膜結合タンパク質の細胞外領域、免疫グロブリン定常部、多量体化領域、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、搬出シグナル含有タンパク質の中から選択できる。   Additional protein sequences that can be included in fusion proteins including the OX40R binding agent of the present invention include membrane bound proteins, extracellular regions of membrane bound proteins, immunoglobulin constant regions, multimerization regions, extracellular proteins , Signal peptide-containing protein, and export signal-containing protein.

ＯＸ４０結合剤に融合させるための１つ以上のこれらの配列の選択は、前記作用物質の特定用途の関数である。一般的手順としてこれらのタンパク質は、遺伝子副体または非／相同的組み込みベクター、並びに形質転換−、感染症−、または形質移入−ベースの技術を使用して、原核または真核宿主細胞を修飾するために使用されるウィルスまたはプラスミド起源の複製可能なベクター中で、一般的遺伝工学技術を使用してクローン化し、それらをコード化する核酸セグメントを作り出すことにより生成できる。これらのベクターは、前記細胞内で恒常的に活性または誘発性であるように選択されるそれら自身の転写開始／終了制御配列の調節の下で、ＯＸ４０Ｒ結合剤をはじめとする融合タンパク質が、原核または真核宿主細胞内で発現できるようにすべきである。次にこのような細胞内で実質的に富化される細胞系を分離して、安定細胞系が提供できる。特に修飾されて本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤を発現する細胞が直接的に使用または投与される場合は常に、好ましい細胞はＯＸ４０Ｌを通常発現するヒト細胞、特にヒトＢ細胞である。   The choice of one or more of these sequences for fusing to the OX40 binding agent is a function of the specific application of the agent. As a general procedure, these proteins modify prokaryotic or eukaryotic host cells using genetic sub-bodies or non / homologous integration vectors and transformation-, infection-, or transfection-based techniques. Can be produced in a replicable vector of viral or plasmid origin used by cloning using general genetic engineering techniques to create nucleic acid segments encoding them. These vectors, under the control of their own transcription initiation / termination control sequences that are selected to be constitutively active or inducible in the cell, are fused proteins, including OX40R binders, to prokaryotes. Or should be capable of expression in eukaryotic host cells. Such cell lines that are substantially enriched in cells can then be isolated to provide a stable cell line. Whenever a cell that is specifically modified and expresses the OX40R binding agent of the present invention is used or administered directly, the preferred cell is a human cell that normally expresses OX40L, particularly a human B cell.

細胞外、搬出シグナル、またはシグナル−ペプチド含有タンパク質の配列におけるように、追加的タンパク質配列によって、ＯＸ４ＯＲ結合ドメインが細胞外空間に分泌されるようになる場合、さらなる加工の観点から、作用物質が培養細胞からより容易に収集、精製でき、または代案として細胞は直接的に使用または投与できる。   If additional protein sequences cause the OX4OR binding domain to be secreted into the extracellular space, such as in the extracellular, export signal, or signal-peptide-containing protein sequences, the agent is cultured from a further processing point of view. It can be more easily collected and purified from the cells, or alternatively, the cells can be used or administered directly.

膜結合タンパク質の配列におけるように、追加的タンパク質によってＯＸ４０Ｒ結合剤が細胞表面に固定されるようになる場合、さらなる加工の観点から、作用物質を培養細胞から収集、精製するのはより困難になることができるが、細胞は直接的に使用または投与でき、天然ＯＸ４０Ｌの１つに対応する形態で作用物質が提供され、もしかするとその特性が改善されるかも知れない。   If the OX40R binding agent becomes immobilized on the cell surface by additional proteins, such as in the membrane-bound protein sequence, it will be more difficult to collect and purify the agent from cultured cells from a further processing perspective. Although the cells can be used or administered directly, the agent may be provided in a form corresponding to one of the native OX40L, possibly improving its properties.

最後にＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用に、タンパク質の多量体化、特に三量体化が関与することは既知である（アル−シャムカニ（Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ）Ａら、１９９７）。したがって融合タンパク質は、免疫グロブリン定常部、膜結合タンパク質の細胞外領域、または技術分野でＴＮＦＲ−様（国際公開第００／３９２９５号パンフレット）またはその他のタンパク質（国際公開第０１／４９８６６号パンフレット、国際公開第９９／１０５１０号パンフレット、国際公開第０１／９８５０７号パンフレット）中に存在することが既知の三量体化領域などの得られたタンパク質が多量体化できるようにする配列も含んでも良い。含めることができるその他の有用なタンパク質配列は、アフィニティークロマトグラフィーによる精製手段を提供するものである（コンスタンス（Ｃｏｎｓｔａｎｓ）Ａ、２００２；ロウ（Ｌｏｗｅ）ＣＲら、２００１）。   Finally, it is known that the OX40L-OX40R interaction involves protein multimerization, particularly trimerization (Al-Shamkhani A et al., 1997). Thus, the fusion protein can be an immunoglobulin constant region, the extracellular region of a membrane-bound protein, or TNFR-like (WO 00/39295) or other proteins (WO 01/49866, International) in the technical field. A sequence that allows multimerization of the obtained protein, such as a trimerization region known to exist in WO99 / 1051010 pamphlet and WO01 / 98507 pamphlet) may also be included. Other useful protein sequences that can be included are those that provide a means of purification by affinity chromatography (Constans A, 2002; Lowe CR et al., 2001).

本発明のポリぺプチドおよびペプチドは、所望の使用および／または生成方法に従って好ましくあることができる、例えば活性画分、前駆物質、塩、または誘導体などの代替の形態であることができる。   The polypeptides and peptides of the present invention may be in alternative forms, such as active fractions, precursors, salts, or derivatives, which may be preferred according to the desired use and / or production method.

「画分」と言う用語は、化合物それ自体のポリペプチド鎖の単独での、または例えば糖またはリン酸残基、あるいは元のポリぺプチドまたはペプチドの凝集塊などの結合した関連分子または残基との組み合せでの、あらゆる断片を指す。このような分子は、例えばペプチドの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）化学誘導体化（アセチル化またはカルボキシル化）、あるいはペプチドの合成および加工またはさらなる加工ステップにおいて、そのリン酸化（ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン残基の導入）またはグリコシル化（例えば哺乳類のグリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響する酵素にペプチドを曝露することによる）パターンの修飾によって作られるものなどの通常、一次配列を変更させないその他の修飾からも得ることができる。例えばＰ５およびＰ５−１は潜在的グリコシル化部位（ヒトＯＸ４０Ｌ中のアミノ酸１１４〜１１６）を含有し、これは宿主細胞内での組換え体発現中、または化学合成中に適宜修飾できる。   The term “fraction” refers to a related molecule or residue alone or in a polypeptide chain of the compound itself or linked, eg, a sugar or phosphate residue, or an aggregate of the original polypeptide or peptide. Any fragment in combination with. Such molecules can be converted to their phosphorylation (phosphotyrosine), for example in peptide in vivo or in vitro chemical derivatization (acetylation or carboxylation), or in peptide synthesis and processing or further processing steps. Phosphoserine, or phosphothreonine residues) or glycosylation (eg by exposing the peptide to an enzyme that affects glycosylation such as mammalian glycosylation or deglycosylation enzymes) It can also be obtained from other modifications that do not normally alter the primary sequence. For example, P5 and P5-1 contain potential glycosylation sites (amino acids 114-116 in human OX40L), which can be modified as appropriate during recombinant expression in host cells or during chemical synthesis.

「前駆物質」は、細胞または身体への投与の前後に、代謝的および酵素的処理によって本発明の化合物に変換できる化合物である。   A “precursor” is a compound that can be converted into a compound of the invention by metabolic and enzymatic treatment before and after administration to a cell or body.

「塩」と言う用語は、ここではカルボキシル基の塩、および本発明のペプチド、ポリぺプチド、またはそれらの類似体のアミノ基の酸付加塩の双方を指す。カルボキシル基の塩は技術分野で既知の手段によって形成しても良く、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄または亜鉛塩などの無機塩が挙げられ、有機塩基を持つ塩としては、例えばトリエタノールアミンなどのアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどを用いて形成するものなどのが挙げられる。例えば酸付加塩としては、例えば塩酸または硫酸などの鉱酸を有する塩と、例えば酢酸またはシュウ酸などの有機酸を有する塩とが挙げられる。このような塩のいずれもが、本発明のペプチドおよびポリぺプチドまたはそれらの類似体に実質的に類似した活性度を有するべきである。   The term “salt” herein refers to both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of peptides, polypeptides, or analogs thereof of the present invention. The salt of the carboxyl group may be formed by means known in the art, and examples thereof include inorganic salts such as sodium, calcium, ammonium, ferric or zinc salts. Examples of salts having an organic base include triethanol. Examples include those formed using amines such as amines, arginine or lysine, piperidine, procaine and the like. For example, acid addition salts include, for example, salts having a mineral acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts having an organic acid such as acetic acid or oxalic acid. Any such salts should have an activity substantially similar to the peptides and polypeptides of the invention or their analogs.

「誘導体」と言う用語は、ここでの用法では、既知の方法に従って、アミノ酸部分の側鎖上、あるいはＮ−またはＣ−末端基上に存在する官能基から調製できる誘導体を指す。このような誘導体としては、例えばカルボキシル基のエステルまたは脂肪族アミド、および遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または遊離水酸基のＯ−アシル誘導体が挙げられ、例えばアルカノイル−またはアロイル−基などのアシル基を用いて形成される。   The term “derivative” as used herein refers to a derivative that can be prepared from functional groups present on the side chain of the amino acid moiety or on the N- or C-terminal group, in accordance with known methods. Such derivatives include, for example, esters of carboxyl groups or aliphatic amides, and N-acyl derivatives of free amino groups or O-acyl derivatives of free hydroxyl groups, such as acyl groups such as alkanoyl- or aroyl-groups. Formed using.

本発明の別の目的は、ペプチドＰ５のペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）（ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）とも称される）、ペプチドＰ５−１およびｐ５−１ａによって例証されるその特異的断片、その中でペプチドまたはポリぺプチドの性質が、アミノ酸側鎖、アミノ酸掌性、および／またはペプチド主鎖のレベルで化学的に修飾されている、上で定義された対応する活性変異体からなる、新しいＯＸ４０Ｒ結合剤である。これらの修正は、（改善されていないとすれば）類似した治療上、診断上、および／または薬物動態学的特性を有するＯＸ４０Ｒ結合剤を提供することを意図する。   Another object of the present invention is to provide peptide mimetics of peptide P5 (also called peptidomimetics), specific fragments thereof, exemplified by peptides P5-1 and p5-1a, A new OX40R consisting of a corresponding active variant as defined above in which the nature of the peptide or polypeptide is chemically modified at the level of amino acid side chain, amino acid palmarity, and / or peptide backbone It is a binder. These modifications are intended to provide OX40R binding agents that have similar therapeutic, diagnostic, and / or pharmacokinetic properties (if not improved).

例えばペプチドが被験者への注射に続いてペプチダーゼによる切断を被りやすいことが問題である場合、特に感受性の高いペプチド結合を非切断性ペプチドミメティックで置換することで、より安定し、従って治療薬としてより有用なペプチドを提供できる。同様に、Ｌ−アミノ酸残基の置き換えは、ペプチドのタンパク質分解に対する感受性を低くし、最終的にはペプチド以外の有機化合物により類似させる標準法である。ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、テイル、スクシニル、メトキシスクシニル、スベリル、アジピル、アゼライル、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼライル、メトキシアジピル、メトキシスベリル、および２，４，−ジニトロフェニルなどのアミノ−末端ブロッキング基もまた有用である。増大した強度、長期にわたる活性、精製の容易さ、および／または増大した半減期を提供する多くのその他の修飾は、技術分野で既知である（国際公開第０２／１０１９５号パンフレット；ビラン（Ｖｉｌｌａｉｎ）Ｍら、２００１）。ペプチドミメティックをはじめとする好ましい代案、アミノ酸の「同義」群は、表ＩＩで定義されるものである。   For example, if the problem is that the peptide is susceptible to cleavage by the peptidase following injection into the subject, replacing the particularly sensitive peptide bond with a non-cleavable peptide mimetic will make it more stable and therefore as a therapeutic agent More useful peptides can be provided. Similarly, replacement of L-amino acid residues is a standard method that makes peptides less prone to proteolysis and ultimately resembles organic compounds other than peptides. t-butyloxycarbonyl, acetyl, tail, succinyl, methoxysuccinyl, suberyl, adipyl, azelayl, dansyl, benzyloxycarbonyl, fluorenylmethoxycarbonyl, methoxyazelayl, methoxyadipyl, methoxysuberyl, and 2,4, Amino-terminal blocking groups such as -dinitrophenyl are also useful. Many other modifications that provide increased strength, long-term activity, ease of purification, and / or increased half-life are known in the art (WO 02/10195; Villain). M et al., 2001). Preferred alternatives, including peptide mimetics, “synonymous” groups of amino acids are those defined in Table II.

ペプチドミメティック、並びに非ペプチドミメティックの合成および開発技術は、技術分野で周知である（ソーヤー（Ｓａｗｙｅｒ）ＴＫ、１９９７；フルビー（Ｈｒｕｂｙ）ＶＪおよびバルセ（Ｂａｌｓｅ）ＰＭ、２０００；ゴレビオウスキー（Ｇｏｌｅｂｉｏｗｓｋｉ）Ａら、２００１；キム（Ｋｉｍ）ＨＯおよびカーン（Ｋａｈｎ）Ｍ、２０００）。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）翻訳系の双方を使用して、非天然アミノ酸をタンパク質に組み込み、タンパク質の構造および機能を調べ、および／または改善する様々な方法論もまた文献で開示される（ドゥガーティ（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ）ＤＡ、２０００）。   Peptide mimetics, as well as non-peptidomimetic synthesis and development techniques are well known in the art (Sawyer TK, 1997; Hruby VJ and Balse PM, 2000; Gorebioski A). 2001; Kim HO and Kahn M, 2000). Various methodologies for incorporating unnatural amino acids into proteins, investigating and / or improving protein structure and function using both in vitro and in vivo translation systems are also in the literature. Disclosed (Dugherty DA, 2000).

新しいＯＸ４０Ｒ結合剤は、ペプチドＰ５と、ペプチドＰ５−１およびＰ５−１ａによって例証されるその特異的断片と、あるいは上で定義された対応する活性変異体の構造および／または配列を利用するコンピューター支援薬剤デザイン方法によって同定される、ペプチド、ペプチドミメティック、または非ペプチドミメティックであることができる。別々の分子または複合体としてのＯＸ４０ＬおよびＯＸ４０Ｒの立体構造は未だに解明されていないが、本願明細書で提供される開示により、ひとたびこの情報が利用できるようになれば、これらのそしてその他のシミュレーション技術を使用して、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０Ｒの間の相互作用の研究がより効率的にできるようになる（コクラン（Ｃｏｃｈｒａｎ）Ａら、２００１；クレーマー−ペコール（Ｋｒａｅｍｅｒ−Ｐｅｃｏｒｅ）ＣＭら、２００１）。このようなコンピューター支援分析を活用して、合成有機分子またはペプチド（例えば４〜２０個のアミノ酸を有する）の形態の改善されたペプチドまたは非ペプチドミメティック薬剤が開発できる。ひとたびこれらの化合物がスクリーニングされ、ＯＸ４０Ｒと結合しＯＸ４０Ｌと競合できることが分かると、次にそれは細胞または動物モデルを使用して、それらの有用性について評価される。   The new OX40R binding agent utilizes the structure and / or sequence of peptide P5, specific fragments thereof exemplified by peptides P5-1 and P5-1a, or the corresponding active variants defined above It can be a peptide, peptidomimetic, or non-peptidomimetic identified by drug design methods. Although the steric structures of OX40L and OX40R as separate molecules or complexes have not yet been elucidated, these and other simulation techniques once this information becomes available due to the disclosure provided herein. Can be used to more efficiently study the interaction between OX40L and OX40R (Cochran A et al., 2001; Kraemer-Pecore CM et al., 2001). Utilizing such computer-aided analysis, improved peptide or non-peptidomimetic drugs in the form of synthetic organic molecules or peptides (eg, having 4-20 amino acids) can be developed. Once these compounds are screened and found to bind OX40R and compete with OX40L, it is then evaluated for their utility using cell or animal models.

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤の有用な接合体または複合体は、（国際公開第９５／２１２５１号パンフレットで抗ＯＸ４０Ｒ抗体について示されるように）技術分野で既知の分子および方法を使用して生成され、（放射性または蛍光標識、ビオチンによって）それらの検出、（細胞毒性作用物質によって）それらの治療上の有効性、および／または（ポリエチレングリコールとその他の天然または合成ポリマーによって）それらのデリバリを改善できる（ピライ（Ｐｉｌｌａｉ）Ｏおよびパンチャングヌラ（Ｐａｎｃｈａｇｎｕｌａ）Ｒ、２００１）。   Useful conjugates or complexes of the OX40R binding agents of the invention are generated using molecules and methods known in the art (as shown for anti-OX40R antibodies in WO 95/21251), They can improve their detection (by radioactive or fluorescent labels, biotin), their therapeutic effectiveness (by cytotoxic agents), and / or their delivery (by polyethylene glycol and other natural or synthetic polymers) ( Pilla O and Panchangula R, 2001).

ペプチドＰ５、その特異的断片、ペプチドＰ５−１およびＰ５−１ａによって例証される対応する活性変異体、およびそれらを含有する融合タンパク質は、既知の化学合成によって、または組換えＤＮＡをベースとする技術によって調製できる。   Peptides P5, specific fragments thereof, corresponding active variants exemplified by peptides P5-1 and P5-1a, and fusion proteins containing them are known by chemical synthesis or based on recombinant DNA Can be prepared.

本発明の別の目的は、実質的に同一であるヌクレオチド配列を含む、本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤のための核酸コード化である。   Another object of the invention is a nucleic acid encoding for the OX40R binding agent of the invention comprising a nucleotide sequence that is substantially identical.

「実質的に同一であるヌクレオチド配列」は、遺伝子コードの縮重のおかげで特定のアミノ酸配列もコードする、あらゆるその他の核酸配列を含む。   A “substantially identical nucleotide sequence” includes any other nucleic acid sequence that also encodes a particular amino acid sequence due to the degeneracy of the genetic code.

本発明は、本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤をコードする核酸が発現できるようにするウィルスまたはプラスミド起源のベクター、およびこのようなベクターによって形質転換された原核または真核宿主細胞も含む。これらの形質転換細胞内で実質的に富化される安定細胞系は、例えばヒトＢ細胞などの細胞膜上で分泌または発現されることができるＯＸ４０Ｒ結合剤の発現特徴に基づいて分離できる。   The invention also includes vectors of viral or plasmid origin that allow expression of nucleic acids encoding the OX40R binding agents of the invention, and prokaryotic or eukaryotic host cells transformed with such vectors. Stable cell lines that are substantially enriched in these transformed cells can be isolated based on the expression characteristics of OX40R binding agents that can be secreted or expressed on cell membranes such as human B cells.

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤は、上で述べた宿主細胞を適切な培養液中で培養し、ＯＸ４０Ｒ結合剤を収集する方法によって生成できる。   The OX40R binding agent of the present invention can be produced by a method of culturing the above-described host cells in an appropriate culture medium and collecting the OX40R binding agent.

本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切なベクター中に挿入してライゲートできる。ひとたび形成すると、発現ベクターを適切な宿主細胞内に導入し、次にそれがベクターを発現して所望のタンパク質が生じる。   The DNA sequence encoding the protein of the present invention can be inserted into an appropriate vector and ligated. Once formed, the expression vector is introduced into a suitable host cell, which then expresses the vector to yield the desired protein.

ここで述べる本発明の組換えタンパク質のいずれかの発現は、適切な発現ベクターを使用して、真核細胞（例えば酵母、昆虫または哺乳類の細胞）または原核細胞内でもたらすことができる。技術分野で既知のあらゆる方法を用いることができる。   Expression of any of the recombinant proteins of the invention described herein can be effected in eukaryotic cells (eg, yeast, insect or mammalian cells) or prokaryotic cells using an appropriate expression vector. Any method known in the art can be used.

例えば上の方法のいずれかによって得られたタンパク質をコードするＤＮＡ分子は、技術分野で周知の技術によって、適切に構築された発現ベクターに挿入される。二重鎖のｃＤＮＡは、ホモポリマーテーリングによって、または合成ＤＮＡリンカー、または平滑末端ライゲーション技術の使用が関与する制限連結によって、プラスミドベクターに連結される。ＤＮＡリガーゼを使用してＤＮＡ分子を結合し、望ましくない連結は、アルカリホスファターゼでの処理によって回避される。   For example, a DNA molecule encoding a protein obtained by any of the above methods is inserted into an appropriately constructed expression vector by techniques well known in the art. Double stranded cDNA is ligated to the plasmid vector by homopolymer tailing or by restriction ligation involving the use of synthetic DNA linkers or blunt end ligation techniques. DNA ligase is used to bind DNA molecules and unwanted ligation is avoided by treatment with alkaline phosphatase.

所望のタンパク質を発現できるために、発現ベクターは、遺伝子発現およびタンパク質生成ができるように所望のタンパク質をコードするＤＮＡに連結された、転写および翻訳制御情報を含有する特異的ヌクレオチド配列も含まなくてはならない。まず遺伝子が転写されるために、それはＲＮＡポリメラーゼによって認識可能なプロモーターによって先行されなくてはならず、それにポリメラーゼが結合することによって、転写過程が開始する。種々のこのようなプロモーターが使用され、異なる効率で働く（強弱プロモーター）。   In order to be able to express the desired protein, the expression vector also does not contain specific nucleotide sequences containing transcriptional and translational control information linked to DNA encoding the desired protein so that gene expression and protein production are possible. Must not. First, in order for a gene to be transcribed, it must be preceded by a promoter that is recognizable by RNA polymerase, and the transcription process begins when the polymerase binds to it. A variety of such promoters are used and work with different efficiencies (strong and weak promoters).

真核ホストでは、ホストの性質次第で異なる転写および翻訳制御配列を用いても良い。それらは、制御シグナルが高レベルの発現を有する特定遺伝子に結びつく、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウイルスなどのウィルス起源に由来しても良い。例は、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどである。抑制および活性化ができるようにする転写開始制御シグナルを選択して、遺伝子発現を調節できるようにしても良い。   In eukaryotic hosts, different transcriptional and translational control sequences may be used depending on the nature of the host. They may be derived from viral sources such as adenovirus, bovine papilloma virus, simian virus, where the control signal is linked to a specific gene with a high level of expression. Examples are the herpes virus TK promoter, the SV40 early promoter, the yeast gal4 gene promoter, and the like. A transcription initiation control signal that allows repression and activation may be selected to allow regulation of gene expression.

所望の遺伝子配列を宿主細胞内に組み込める、作動可能に連結された転写性および翻訳制御シグナルを有するベクター内に、本発明のタンパク質のヌクレオチド配列コードを含むＤＮＡ分子を挿入する。   A DNA molecule containing the nucleotide sequence code of the protein of the invention is inserted into a vector having operably linked transcriptional and translational control signals that allow the desired gene sequence to be incorporated into the host cell.

導入されたＤＮＡによって安定に形質転換された細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞を選択できるようにする１つ以上のマーカーを導入することによっても選択できる。マーカーはまた、栄養要求株ホストに光合成能、例えば抗生物質、または銅などの重金属の殺生剤への抵抗性を提供しても良い。選択性マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接的に連結し、または同時形形質移入によって同一細胞に導入することができる。   Cells stably transformed with the introduced DNA can also be selected by introducing one or more markers that allow selection of host cells containing the expression vector. The marker may also provide the auxotrophic host with photosynthetic capacity, for example resistance to antibiotics or heavy metal biocides such as copper. Selectable marker genes can be directly linked to the expressed DNA gene sequence or introduced into the same cell by co-transfection.

ベクターの追加的要素もまた、本発明のタンパク質の最適な生成を得るのに有用であるかも知れず、特にベクターを含有する受容細胞をベクターを含有しない受容細胞から認識し選択する容易さ、特定ホストにおいて所望のベクターのコピー数、そしてベクターを異種の宿主細胞間で「シャトル」できることが望ましいかどうかなど、プラスミドまたはウィルスベクターを含有する特定細胞を選択するために有用であるかもしれない。   Additional elements of the vector may also be useful in obtaining optimal production of the proteins of the invention, particularly the ease and identification of recipient cells containing the vector from recipient cells that do not contain the vector. It may be useful to select specific cells containing a plasmid or viral vector, such as the desired vector copy number in the host and whether it is desirable to be able to “shuttle” the vector between heterologous host cells.

ひとたびコンストラクトを含有するベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために調製されると、形質転換、形質移入、接合、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リン酸カルシウム−沈殿、直接的ミクロ注入などの種々の適切な手段のいずれかによって、ＤＮＡコンストラクトを適切な宿主細胞に導入しても良い。   Once the vector or DNA sequence containing the construct has been prepared for expression, various suitable means such as transformation, transfection, conjugation, protoplast fusion, electroporation, calcium phosphate-precipitation, direct microinjection, etc. By either, the DNA construct may be introduced into an appropriate host cell.

宿主細胞は、原核または真核のどちらかであっても良い。好ましい真核ホストは、正確な折りたたみ、または正確な部位のグリコシル化をはじめとする翻訳後修飾をタンパク質分子に提供することから、例えばヒト、サル、マウス、およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳類の細胞である。また酵母細胞は、グリコシル化をはじめとする翻訳後ペプチド修飾をすることができる。強いプロモーター配列と高いコピー数のプラスミドを使用するいくつかの組換えＤＮＡストラテジーが存在し、それは酵母内で所望のタンパク質を生成するために使用できる。酵母はクローン化哺乳類の遺伝子生成物上でリーダー配列を認識し、リーダー配列を持つペプチドを分泌する（すなわちプレペプチド）。   The host cell may be either prokaryotic or eukaryotic. Preferred eukaryotic hosts provide protein molecules with post-translational modifications, including correct folding or correct site glycosylation, such as human, monkey, mouse, and Chinese hamster ovary (CHO) cells. It is a mammalian cell. Yeast cells can also undergo post-translational peptide modifications, including glycosylation. There are several recombinant DNA strategies that use strong promoter sequences and high copy number plasmids, which can be used to produce the desired protein in yeast. Yeast recognizes leader sequences on cloned mammalian gene products and secretes peptides with leader sequences (ie, pre-peptides).

ベクターの導入後に、ベクター含有細胞の生育について選択する選択培地中で宿主細胞を生育させる。クローン化遺伝子配列の発現からは、所望のタンパク質の生成が帰結する。   After the introduction of the vector, the host cells are grown in a selective medium that selects for the growth of the vector-containing cells. Expression of the cloned gene sequence results in the production of the desired protein.

本発明のこれらの目的は、本願明細書によって提供される組換えＯＸ４０Ｒ結合剤に関する開示を、一般的分子生物学技術の知識と組み合わせることによって達成できる。オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）発行のシリーズ中のいくつかのタイトル「実際的アプローチ（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」（「ＤＮＡクローン化２：発現のシステム（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」１９９５；「ＤＮＡクローン化４：哺乳類のシステム（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ４：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」１９９６；「タンパク質発現（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」１９９９；「タンパク質精製技術（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」２００１）などのように、多数のレビュー（マクライズ（Ｍａｋｒｉｄｅｓ）ＳＣ、１９９９）および書籍が、ベクターおよび原核または真核宿主細胞を使用して、組換えタンパク質をクローンおよび製造する方法に関する教示を提供する。   These objects of the present invention can be achieved by combining the disclosure relating to recombinant OX40R binding agents provided herein with knowledge of general molecular biology techniques. Several titles in a series published by Oxford University Press “A Practical Approach” (“DNA Cloning 2: Expression Systems” ”1995;“ DNA Cloning 4: Mammalian Systems "1996;" Protein Expression "1999;" Protein Purification Techniques "2001) and many other reviews (MacClaise). (Makrides) SC, 1999) and books Using the finely prokaryotic or eukaryotic host cells, the recombinant protein to provide a teaching on how to clone and production.

それらがペプチドまたはペプチドミメティックの形態である場合に、本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤を製造するために指示される化学合成技術の例は、固相合成および液相合成である。例えば固相合成として、合成するペプチドのＣ−末端に対応するアミノ酸が有機溶剤に不溶性の支持体に結合され、反応の交互の反復によって、それらのアミノ基および側鎖官能基が適した保護基で保護されるアミノ酸が、Ｃ−末端からＮ−末端の順で１つずつ縮合され、樹脂またはペプチドのアミノ基の保護基に結合したアミノ酸が放出され、かくしてペプチド鎖はこの様式で延長する。   Examples of chemical synthesis techniques directed to producing the OX40R binding agents of the invention when they are in the form of peptides or peptidomimetics are solid phase synthesis and liquid phase synthesis. For example, in solid phase synthesis, the amino acid corresponding to the C-terminus of the peptide to be synthesized is bound to a support insoluble in organic solvents, and by alternating repetition of the reaction, the amino group and the side chain functional group are suitable protecting groups. The amino acids protected by are condensed one at a time in the order from the C-terminus to the N-terminus, releasing the amino acid bound to the protecting group of the amino group of the resin or peptide, thus extending the peptide chain in this manner.

固相合成法は、使用される保護基のタイプに応じて、ｔＢｏｃ方およびＦｍｏｃ法によって大まかに分類される。典型的に使用される保護基としては、アミノ基のためのｔＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）、およびＣｌ２−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）、グアニジノ基のためのＮＯ２（ニトロ）およびＰｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）、そして水酸基のためのｔＢｕ（ｔ−ブチル）が挙げられる。所望のペプチドの合成後、それを脱保護反応させて固体支持体から切断する。このようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法のためにはフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸、Ｆｍｏｃ法のためにはＴＦＡを用いて実施しても良い。   Solid phase synthesis methods are roughly classified by the tBoc method and the Fmoc method, depending on the type of protecting group used. Typically used protecting groups include tBoc (t-butoxycarbonyl), Cl-Z (2-chlorobenzyloxycarbonyl), Br-Z (2-bromobenzyloxycarbonyl), Bzl ( Benzyl), Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl), Mbh (4,4′-dimethoxydibenzhydryl), Mtr (4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl), Trt (trityl), Tos (tosyl), Z (benzyloxycarbonyl), and Cl2-Bzl (2,6-dichlorobenzyl), NO2 (nitro) and Pmc (2,2,5,7,8-pentamethylchroman for guanidino groups -6-sulfonyl), and tBu (t-butyl) for the hydroxyl group. After synthesis of the desired peptide, it is deprotected and cleaved from the solid support. Such peptide cleavage reaction may be performed using hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfonic acid for the Boc method, and TFA for the Fmoc method.

組換えＤＮＡまたは化学合成技術によって得られるＯＸ４０Ｒ結合剤に、最終的に１つ以上の精製ステップを施す。精製は、この目的のために知られるあらゆる方法、すなわち抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動などを伴うあらゆる従来の手順によって実施できる。例えばＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）が使用できる。溶出は、一般にタンパク質精製のために用いられる水−アセトニトリルベースの溶剤を使用して実施できる。本発明は、本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤の精製品を含む。精製品とはここでの用法では、乾燥重量で本発明の化合物の少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％である製剤を指す。   OX40R binding agents obtained by recombinant DNA or chemical synthesis techniques are finally subjected to one or more purification steps. Purification can be carried out by any conventional procedure known for this purpose, ie extraction, precipitation, chromatography, electrophoresis and the like. For example, HPLC (high performance liquid chromatography) can be used. Elution can be performed using a water-acetonitrile-based solvent commonly used for protein purification. The present invention includes a purified product of the OX40R binding agent of the present invention. A purified product as used herein refers to a formulation that is at least 1%, preferably at least 5% of the compound of the present invention by dry weight.

上述の本発明の化合物（タンパク質、ペプチド、有機化合物）は、薬物としてヒトＯＸ４０Ｌの拮抗剤、ＯＸ４０Ｌの活性度に関する文献に照らしてＲＡＮＴＥＳ発現の誘発物質（コタニ（Ｋｏｔａｎｉ）Ａ．ら、２００２）、そしてヒトＲＡＮＴＥＳの拮抗剤であることができる。   The compound of the present invention (protein, peptide, organic compound) described above is an antagonist of human OX40L as a drug, an inducer of RANTES expression in the light of literature on the activity of OX40L (Kotani A. et al., 2002), And it can be an antagonist of human RANTES.

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤は、医薬組成物中で自己免疫疾患、炎症、または感染症の予防および／または治療のための活性成分として使用できる。   The OX40R binding agent of the present invention can be used as an active ingredient for the prevention and / or treatment of autoimmune disease, inflammation, or infection in a pharmaceutical composition.

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤はひとたびＯＸ４０Ｒに結合すると、ＯＸ４０Ｌの拮抗剤として作用し、このような分子の治療上の可能性は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞活性化の阻害が有利である、自己免疫疾患（例えば炎症腸疾患、関節リウマチ、および多発性硬化症）、炎症または感染症の予防および／または治療にある。この後者の効果はまた、ＯＸ４０Ｒを発現するＣＤ４⁺Ｔ細胞の集団を減少させるためにも使用できる。 The OX40R binding agents of the invention, once bound to OX40R, act as antagonists of OX40L, and the therapeutic potential of such molecules is an autoimmune disease where inhibition of CD4 ⁺ T cell activation is advantageous ( For example, prevention and / or treatment of inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, and multiple sclerosis), inflammation or infection. This latter effect can also be used to reduce the population of CD4 ⁺ T cells expressing OX40R.

本発明は、活性成分として本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤の１つを含む、ＣＤ４⁺Ｔ細胞に関係した疾患の予防および／または治療のための医薬組成物も提供する。これらの医薬組成物は、薬学上許容可能なキャリア、賦形剤、安定剤、または希釈剤と組み合わせて調剤できる。作用物質の特性次第で、医薬組成物は、自己免疫疾患、炎症、または感染症などのＣＤ４⁺Ｔ細胞に関係した疾患に対して有用であることができる。 The present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of diseases related to CD4 ⁺ T cells, comprising one of the OX40R binding agents of the present invention as an active ingredient. These pharmaceutical compositions can be formulated in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, stabilizer, or diluent. Depending on the properties of the agent, the pharmaceutical composition can be useful for diseases related to CD4 ⁺ T cells, such as autoimmune diseases, inflammation, or infections.

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤を含む医薬組成物としては、前記化合物を治療的有効量、すなわち処置した動物において医学的に望ましい結果を達成するのに効果的な量で含有するあらゆる組成物が挙げられる。医薬組成物は、適切な薬学上許容可能なキャリア、動物に投与するのに適切な生物学的に適合性のビヒクル（例えば生理食塩水）を含有しても良く、最終的に薬剤的に使用できる製剤への活性化合物の加工を促進する添加剤（賦形剤、安定剤または希釈剤など）を含む。   Pharmaceutical compositions comprising the OX40R binding agents of the present invention include any composition containing the compound in a therapeutically effective amount, ie, an amount effective to achieve a medically desirable result in the treated animal. . The pharmaceutical composition may contain a suitable pharmaceutically acceptable carrier, a biologically compatible vehicle suitable for administration to an animal (eg, saline) and is ultimately used pharmaceutically. Contains additives (such as excipients, stabilizers or diluents) that facilitate the processing of the active compound into possible formulations.

医薬組成物は、投与様式の要求を満たすいずれかの許容可能なやり方で調剤しても良い。薬剤デリバリーのための医用材料およびその他のポリマーの使用、並びに投与の特定の様式を確認するための異なる技術とモデルについては、文献で開示されている（ルオ（Ｌｕｏ）Ｂおよびプレストウィッチ（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ）ＧＤ、２００１；クレランド（Ｃｌｅｌａｎｄ）ＪＬら、２００１）。血液脳関門の貫通を改善するための本発明の化合物の修飾もまた有用であろう。経血管ドラッグデリバリー分野におけるバイオミメティック輸送および合理的なドラッグデリバリーのその他の方法については、技術分野で既知である（ラネー（Ｒａｎｎｅｙ）ＤＦ、２０００）。   The pharmaceutical composition may be formulated in any acceptable manner that meets the requirements for the mode of administration. The use of medical materials and other polymers for drug delivery, as well as different techniques and models for identifying specific modes of administration, are disclosed in the literature (Luo B and Prestwich). GD, 2001; Cleland JL et al., 2001). Modifications of the compounds of the invention to improve blood brain barrier penetration will also be useful. Other methods of biomimetic transport and rational drug delivery in the field of transvascular drug delivery are known in the art (Ranney DF, 2000).

投与のあらゆる許容された様式が使用でき、当業者によって決定される。例えば投与は、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、経皮、経口、または頬側径路などの様々な径路によって実施されても良い。非経口的投与は、大量瞬時投与、または長時間にわたるゆっくりとした灌流によっても良い。非経口的投与のための製剤としては、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられ、それらは技術分野で既知の補助的作用物質または賦形剤を含んでも良く、日常的な方法に従って調製できる。さらに適切な油性注射懸濁液として、活性化合物の懸濁液を投与しても良い。例えば適切な親油性の溶剤またはビヒクルとしては、脂肪油、例えばごま油、または合成脂肪酸エステル、例えばごま油、または例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルが挙げられる。懸濁液の粘度を増大させる物質を含有しても良い水性注射懸濁液としては、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランが挙げられる。任意に懸濁液は安定剤も含有しても良い。医薬組成物は、注射による投与のための適切な溶液を含み、賦形剤と共に約０．０１〜９９％、好ましくは約２０〜７５％の活性化合物を含有する。直腸投与できる組成物としては坐薬が挙げられる。   Any accepted mode of administration can be used and is determined by one skilled in the art. For example, administration may be performed by various routes such as subcutaneous, intravenous, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdermal, oral, or buccal routes. Parenteral administration may be by bolus injection or slow perfusion over time. Formulations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions, which may contain auxiliary agents or excipients known in the art and are Can be prepared according to standard methods. In addition, suspensions of the active compounds as appropriate oily injection suspensions may be administered. For example, suitable lipophilic solvents or vehicles include fatty oils such as sesame oil, or synthetic fatty acid esters such as sesame oil, or synthetic fatty acid esters such as, for example, ethyl oleate or triglycerides. Aqueous injection suspensions that may contain substances that increase the viscosity of the suspension include, for example, sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, and / or dextran. Optionally, the suspension may also contain a stabilizer. The pharmaceutical compositions contain a suitable solution for administration by injection and contain about 0.01-99%, preferably about 20-75%, of the active compound with excipients. Compositions that can be administered rectally include suppositories.

投与される投薬量は、受容者の年齢、性別、健康、および体重、あれば併用治療の種類、治療の頻度、および所望の効果の性質に左右されるものと理解されている。投薬量は、当業者によって理解され決定されるように個々の被験者のために調整される。各治療に要する総用量は、複数用量または単一用量によって投与されても良い。本発明の医薬組成物は、単独で、または病状を対象とする、または病状のその他の症状を対象とするその他の治療薬と併せて投与しても良い。通常、活性成分の一日の投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇからなる。   It is understood that the dosage administered will depend on the age, sex, health, and weight of the recipient, if any, the type of combination treatment, the frequency of treatment, and the nature of the desired effect. Dosages are adjusted for the individual subject as understood and determined by one skilled in the art. The total dose required for each treatment may be administered by multiple doses or a single dose. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents intended for the medical condition or for other symptoms of the medical condition. Usually, the daily dosage of active ingredient consists of 0.01-100 mg / kg body weight.

本発明の化合物は、生理食塩水などの薬学上許容可能なキャリア中で、患者に静脈内投与しても良い。例えばリポソーム経由のデリバリなどのペプチドの細胞内デリバリーの標準方法が使用できる。このような方法は、当業者には周知である。本発明の調合物は、静脈内、皮下、筋肉内、および腹腔内などの非経口的投与のために有用である。   The compounds of the present invention may be administered intravenously to a patient in a pharmaceutically acceptable carrier such as saline. For example, standard methods for intracellular delivery of peptides such as delivery via liposomes can be used. Such methods are well known to those skilled in the art. The formulations of the present invention are useful for parenteral administration, such as intravenous, subcutaneous, intramuscular, and intraperitoneal.

医学分野では周知のように、あらゆる一患者に対する投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定化合物、性別、投与の時間と径路、一般的健康、および併用して投与されるその他の薬剤をはじめとする多くの要因に左右される。   As is well known in the medical field, the dosage for any one patient is administered in combination with the patient's size, body surface area, age, specific compound being administered, sex, time and route of administration, general health, and combination. Depends on many other factors, including other drugs.

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤は、膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒタンパク質の細胞外領域の検出のために使用できる。明らかにこの利用法は、ＯＸ４０Ｒタンパク質を発現する活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞の検出に広げることができる。 The OX40R binding agents of the invention can be used for the detection of the extracellular region of OX40R protein as a membrane bound or soluble protein. Clearly this application can be extended to the detection of activated CD4 ⁺ T cells expressing the OX40R protein.

これらの利用法をベースとする検出方法は、サンプルを作用物質または細胞に接触させる第１のステップと、ＯＸ４０Ｒタンパク質の細胞外領域間の相互作用をこれらの要素の存在を示すために直接的に（既述したように、作用物質または細胞に関連したいずれかの標識の手段によって）、または間接的に（例えばＯＸ４０Ｒタンパク質またはＯＸ４０Ｒ−発現細胞上のこの結合の効果の手段によって）検出する第２のステップとを含む。   Detection methods based on these applications directly involve the first step of contacting the sample with an agent or cell and the interaction between the extracellular regions of the OX40R protein to indicate the presence of these elements. A second that is detected (by means of any label associated with the agent or cell, as described above) or indirectly (eg by means of this binding effect on OX40R protein or OX40R-expressing cells). Steps.

作用物質または細胞は、サンプルと接触させる前後に支持体上に固定化でき、これによって、膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒ細胞外領域、またはＯＸ４０Ｒ発現細胞の検出だけでなく、精製および／または濃縮ができるようになる。それ故これらの支持体は、サンプルを支持体、または本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤を発現する細胞に接触させることにより、前記サンプル中の膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒ細胞外領域、またはＯＸ４０Ｒ発現細胞の検出、精製、および／または濃縮方法で使用できる。この検出方法および既述の検出方法を使用して、減少したまたは増大したＣＤ４⁺Ｔ細胞または可溶性ＯＸ４０Ｒタンパク質の存在に関連した病状が診断できる。 Agents or cells can be immobilized on the support before and after contact with the sample, thereby purifying and / or enriching as well as detecting OX40R extracellular region as a membrane bound or soluble protein, or OX40R expressing cells. Will be able to. Therefore, these supports can be obtained by contacting the sample with a support, or a cell expressing an OX40R binding agent of the present invention, so that the OX40R extracellular region as a membrane-bound or soluble protein in the sample, or an OX40R-expressing cell. Detection, purification, and / or concentration methods. This detection method and the detection methods described above can be used to diagnose pathologies associated with the presence of reduced or increased CD4 ⁺ T cells or soluble OX40R protein.

本発明のＯＸ４０Ｒ結合剤、またはそれらを発現する細胞は、自己免疫疾患、炎症、または感染症の予防および／または治療方法で投与できる。   The OX40R binding agents of the present invention or cells expressing them can be administered in a method for preventing and / or treating autoimmune disease, inflammation, or infection.

本発明は、本願明細書の実施例で提供されるように、
ａ）ｉ）本発明で述べられた化合物、細胞、および支持体の中から選択されるＯＸ４０Ｒ結合剤を構成する要素、
ｉｉ）ＯＸ４０Ｒ細胞外領域を含むタンパク質、その表面にＯＸ４０Ｒ細胞外領域を発現する細胞系、およびＯＸ４０Ｒ細胞外領域を分泌する細胞系の中から選択されるＯＸ４０Ｒ部分を構成する要素、および
ｉｉｉ）ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用の阻害剤として試験される化合物の要素、を含むサンプルを形成するステップと、
ｂ）要素（ｉ）と（ｉｉ）との間の相互作用に対する化合物（ｉｉｉ）の効果を直接的または間接的に検出するステップと、
ｃ）（ｂ）において、（ａ）の要素の質および／または量の点で異なるサンプル間で検出された効果を比較するステップと
を含む、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用を阻害する化合物の性質および活性度の判定のためのスクリーニング検査も開示する。 The present invention, as provided in the examples herein,
a) i) an element comprising an OX40R binding agent selected from among the compounds, cells and supports mentioned in the present invention;
ii) a protein comprising the OX40R extracellular region, a cell line expressing the OX40R extracellular region on its surface, and a component constituting an OX40R portion selected from a cell line secreting the OX40R extracellular region, and iii) OX40R Forming a sample comprising an element of a compound to be tested as an inhibitor of OX40L interaction;
b) detecting directly or indirectly the effect of compound (iii) on the interaction between elements (i) and (ii);
c) the nature and activity of the compound that inhibits the OX40R-OX40L interaction in (b), comprising comparing the effect detected between different samples in terms of the quality and / or quantity of the elements of (a) A screening test for determining the degree is also disclosed.

プラスチックマイクロタイタープレートまたはビーズなどの支持体上に固定化された結合要素を使用することによる、これらの類のスクリーニングはより効率的で迅速であるため、上で開示された支持体は好ましい要素を表す。   Since these types of screening are more efficient and rapid by using binding elements immobilized on a support such as a plastic microtiter plate or beads, the supports disclosed above are preferred elements. To express.

本発明は、患者から得られたサンプル中の減少したまたは増大したＣＤ４⁺Ｔ細胞または可溶性ＯＸ４０Ｒタンパク質の存在に起因する病状の診断も可能にする、ＯＸ４０Ｒタンパク質の細胞外領域（膜結合または可溶性タンパク質として）、または活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞を検出するための）ＯＸ４０Ｒ結合剤、それらを発現する細胞、またはそれらを含む支持体を含む新しいキットも提供する。 The present invention also enables the extracellular region of OX40R protein (membrane bound or soluble protein) that also allows diagnosis of pathologies due to the presence of reduced or increased CD4 ⁺ T cells or soluble OX40R protein in a sample obtained from a patient. Also provided are new kits comprising OX40R binding agents (for detecting activated CD4 ⁺ T cells), cells expressing them, or supports comprising them.

最後に本発明は、異なるタグ配列を有する融合タンパク質として膜結合性タンパク質の細胞外部分とタンパク質リガンドとを含む、タンパク質リガンドと膜結合性タンパク質との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングするためのキットも提供する。   Finally, the present invention provides a kit for screening a compound that inhibits the interaction between a protein ligand and a membrane-bound protein, comprising an extracellular portion of the membrane-bound protein and a protein ligand as a fusion protein having different tag sequences. Also provide.

参照した文献は、あらゆるデータ、表、図、および引用文献に示されるテキストをはじめとして全てその内容全体を本願明細書に引用したものとする。さらに参照した文献中で引用される文献のあらゆる内容は、全てその内容全体を本願明細書に引用したものとする。既知の方法ステップ、従来の方法ステップ、既知の方法または従来の方法への言及は、本発明の態様、既述または実施態様が、関連技術で開示、教示または提案されたと認めるものでは決してない。   All references, including all data, tables, figures, and text shown in cited references, are incorporated herein by reference in their entirety. Further, all the contents of the documents cited in the referenced documents are all cited in the present specification. References to known method steps, conventional method steps, known methods or conventional methods in no way admit that aspects, statements or embodiments of the invention have been disclosed, taught or suggested in the related art.

ひとたび本願明細書で開示された方法および生成物の特徴が理解されれば、先行技術、並びに本発明の基本的詳細といくつかの応用について述べる制限を意図しない以下の図面と実施例をレビューすることで、追加的ステップの必要性および種類が容易に推論できる。   Once the features of the methods and products disclosed herein are understood, the following drawings and examples are not intended to limit the prior art as well as the basic details and some applications of the present invention. Thus, the need and type of additional steps can be easily inferred.

実施例１：アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMをベースとする競合アッセイを使用してＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用を検出するための実験デザイン
方法
タンパク質
ヒトＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁融合タンパク質については、以前に述べられている（ゴドフリー（Ｇｏｄｆｒｅｙ）ら、１９９４）。組換えタンパク質は、ｐＣＥＰ４（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をベースとする哺乳類の発現ベクターを構築して調製し、その中でヒトＯＸ４０Ｒの細胞外部分をコード化するｃＤＮＡ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃ．番号Ｐ４３４８９のアミノ酸１〜２０８）は、ヒトＩｇＧ₁の定常部をコード化するｃＤＮＡの５’末端にインフレーム融合される（ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３；ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃ．番号Ｐ０１８５７のアミノ酸９８〜３３０）。組換えＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁は、ＯＸ４０Ｒのシグナル配列のために分泌タンパク質として発現される。 Example 1: Experimental design method for detecting OX40L-OX40R interaction using a competition assay based on Alphascreen ^™ Human OX40R-IgG ₁ fusion protein has been described previously (Godfrey et al., 1994). A recombinant protein was prepared by constructing a mammalian expression vector based on pCEP4 (Invitrogen) in which a cDNA encoding the extracellular portion of human OX40R (SWISSPROT Acc. No. P43489 amino acid). 1-208) is fused in frame to the 5 'end of the cDNA encoding the constant region of human IgG ₁ (hinge region, CH2 and CH3;. SWISSPROT Acc amino acids No. P01857 ninety-eight to three hundred and thirty). Recombinant OX40R-IgG ₁ is expressed as a secreted protein for the signal sequence of OX40R.

ハイグロマイシンの選択性マーカー遺伝子を含有する発現コンストラクトと共に、リン酸カルシウム技術を使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を形質移入した。細胞を２×１０⁵細胞／ｍｌの密度で、増殖培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）１０％ウシ胎児血清および４ｍＭＬ−グルタミンを補充；シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））に播種した。翌日２％ウシ胎児血清および４ｍＭＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）で培地を置き換えた。１時間後、細胞を形質移入して、５％ＣＯ₂含有の加湿大気中３７℃で４時間インキュベートし、次に培地を変更して１０％ウシ胎児血清含有増殖培地に戻した。形質移入の２日後、選択作用物質（ハイグロマイシンＢ；３００μｇ／ｍｌ）を培地に添加した。選択された細胞中からＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁を正確に発現するクローンを分離した。 HEK293-EBNA cells were transfected using calcium phosphate technology with an expression construct containing a hygromycin selectable marker gene. Cells were seeded at a density of 2 × 10 ⁵ cells / ml in growth medium (DMEM / F-12 (1: 1) supplemented with 10% fetal calf serum and 4 mM L-glutamine; Sigma Chemicals). The next day, the medium was replaced with DMEM / F-12 (1: 1) supplemented with 2% fetal calf serum and 4 mM L-glutamine. After 1 hour, the cells were transfected and incubated for 4 hours at 37 ° C. in a humidified atmosphere containing 5% CO ₂ , then the medium was changed back to a growth medium containing 10% fetal calf serum. Two days after transfection, a selective agent (hygromycin B; 300 μg / ml) was added to the medium. It was isolated clones expressing correctly the OX40R-IgG ₁ from the selected cells.

分離クローンから生成される細胞培養上清から、組換えＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧを精製した。遠心分離（５００×ｇで１０分間）によって上清を清澄にし、引き続いて０．４５および０．２２μｍ孔径のＰＶＤＦ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を使用して濾過した。同時にバイオ・ロジック（Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ）ＦＰＬＣシステム（バイオラド（Ｂｉｏｒａｄ））を使用して、その上に組換えタンパク質Ｇ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））が固定される３８ｍｌの樹脂を含有する精製カラムを添加液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０）で平衡化した。２０カラム容積（ＣＶ）の添加液での平衡化の後、流速１ｍｌ／分でサンプルをカラムに適用した。１０ＣＶの添加液でカラムを洗浄し、樹脂に非特異的に結合したタンパク質を除去した。０．１グリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３．０）溶出緩衝液を使用してステップ傾斜法により、ＩｇＧ₁部分を通じてタンパク質Ｇ上に固定化されたＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁融合タンパク質を溶出した。得られた画分を１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）で直接的に中和し、酸性溶出緩衝液中でのタンパク質分解を防止した。最後にＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５カラム（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を使用して、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁融合タンパク質を含有する画分を脱塩し、アッセイに使用するまで−８０℃でアリコートで保存した。 Recombinant OX40R-IgG was purified from cell culture supernatants generated from isolated clones. The supernatant was clarified by centrifugation (500 × g for 10 minutes) and subsequently filtered using 0.45 and 0.22 μm pore size PVDF membranes (Millipore). At the same time, using a Bio-Logic FPLC system (Biorad), add a purification column containing 38 ml of resin on which recombinant protein G (Pharmacia) is immobilized Equilibrated with solution (0.1 M Tris, pH 7.0). After equilibration with 20 column volumes (CV) of additive, the sample was applied to the column at a flow rate of 1 ml / min. The column was washed with 10 CV addition solution to remove proteins that non-specifically bound to the resin. The 0.1 Glycine /HCl(pH3.0) Step decanted using an elution buffer, the OX40R-IgG ₁ fusion protein immobilized on a protein G was eluted through IgG ₁ portion. The resulting fraction was directly neutralized with 1M Tris (pH 7.6) to prevent proteolysis in acidic elution buffer. Finally, using PBS Sephadex equilibrated with (phosphate buffered saline) (Sephadex) G25 column (Pharmacia (Pharmacia)), desalted fractions containing the OX40R-IgG ₁ fusion protein, assays Stored in aliquots at −80 ° C. until used.

ヒトＯＸ４０Ｌ−マウスＣＤ８および抗マウスＣＤ８ビオチン化抗体は市販され（アンセル（Ａｎｃｅｌｌ））、並びにスラミン（シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））も市販される。プラスミド中でＧＳＴに融合したＯＸ４０Ｌの細胞外部分のクローン化によって、バキュロウイルス発現系（ゲートウェー（Ｇａｔｅｗａｙ）^TM、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））において、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）との融合タンパク質として組み換えヒト可溶性ＯＸ４０Ｌを調製し、次にそれを使用してＳＦ９細胞を形質移入した。発現および精製は、製造元の説明書に従って実施した。 Human OX40L-mouse CD8 and anti-mouse CD8 biotinylated antibodies are commercially available (Ancell), as well as suramin (Sigma Chemicals). Cloning of the extracellular portion of OX40L fused to GST in a plasmid allows fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) in baculovirus expression systems (Gateway ^™ , Invitrogen) Recombinant human soluble OX40L was prepared as and then used to transfect SF9 cells. Expression and purification were performed according to the manufacturer's instructions.

アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMアッセイ
アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TM修飾アクセプターおよび供与体ビーズを購入した（バイオシクンッルパッカード（Ｂｉｏｓｉｇｎａｌ Ｐａｃｋａｒｄ）。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁およびＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８融合タンパク質をタンパク質Ａ−接合アクセプタービーズ上に、ビオチン化抗ＣＤ８抗体の手段によってストレプトアビジン接合供与体ビーズ上に、それぞれ固定化した。 AlphaScreen (Alphascreen) ^TM assay AlphaScreen (Alphascreen) ^TM modified acceptor and donor beads were purchased (Bio shea Kun' Le Packard (Biosignal Packard) .OX40R-IgG ₁ and OX40L-CD8 fusion protein protein A- bonding acceptor On the beads, each was immobilized on streptavidin-conjugated donor beads by means of biotinylated anti-CD8 antibody.

コスター（Ｃｏｓｔａｒ）（登録商標）３８４ウェル白色ポリスチレンプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））を使用して、結合アッセイを実施した。３８４ウェルプレートの各ウェルは、２５μＬ容積の反応混合物を含有した。反応混合物の５つの各構成成分（ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ１、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８、ビオチン化抗ＣＤ８、ストレプトアビジン接合供与体ビーズ、およびタンパク質Ａ接合アクセプタービーズ）を５μＬ容積で添加した。あらゆる希釈は、ジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）あり、またはなしのアッセイ緩衝液（リン酸緩衝食塩水および０．１％ＢＳＡ）で行った。   The binding assay was performed using a Costar® 384 well white polystyrene plate (Corning). Each well of the 384 well plate contained a 25 μL volume of the reaction mixture. Five components of the reaction mixture (OX40R-IgG1, OX40L-CD8, biotinylated anti-CD8, streptavidin-conjugated donor beads, and protein A-conjugated acceptor beads) were added in a 5 μL volume. All dilutions were made in assay buffer (phosphate buffered saline and 0.1% BSA) with or without dimethyl sulfoxide (DMSO).

標準アッセイでは、ＯＸ４０−ＩｇＧ₁およびＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８を共に３０分間インキュベートし、次にビオチン化抗ＣＤ８抗体（１０ｎＭ）を添加した。さらに３０分間のインキュベーション時間に続いて、個々のウェルにストレプトアビジン供与体ビーズ（２０μｇ／ｍｌ）およびタンパク質Ａアクセプタービーズ（２０μｇ／ｍｌ）を添加した。１秒間／ウェルの読み取り時間に設定したパッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）フュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）^TMリーダー（バイオシグナルパッカード（Ｂｉｏｓｉｇｎａｌ Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、１時間後にプレートをカウントした。供与体およびアクセプタービーズの光感受性のために、実験は青色光の下で実施し、あらゆるインキュベーション時間は室温で実施した。より短い発光波長５２０〜６２０ｎｍと組み合わせた励起波長６８０ｎｍでプレートを読み取った。 In the standard assay, and incubated together for 30 minutes the OX40-IgG ₁ and OX40L-CD8, followed by the addition of biotinylated anti-CD8 antibody (10 nM). Following an additional 30 minute incubation period, streptavidin donor beads (20 μg / ml) and protein A acceptor beads (20 μg / ml) were added to individual wells. Plates were counted after 1 hour using a Packard Fusion ^™ reader (Biosignal Packard) set at 1 second / well read time. Photosensitivity of donor and acceptor beads For this, the experiments were performed under blue light and all incubation times were performed at room temperature The plates were read at an excitation wavelength of 680 nm combined with a shorter emission wavelength of 520-620 nm.

データ分析
Ｋ_D、ＩＣ₅₀、およびＥＣ₅₀値は全てプリズム（Ｐｒｉｓｍ）（登録商標）ソフトウェア（グラフパッドソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ））を使用して計算した。ＩＣ₅₀値のＫ_i値への転換は、チェング（Ｃｈｅｎｇ）−プルソフ（Ｐｒｕｓｏｆｆ）方程式（チェング（Ｃｈｅｎｇ）ＹＣおよびプルソフ（Ｐｒｕｓｏｆｆ）ＷＨ、１９７３）を使用して実施した。 Data Analysis K _D, IC _50, and The EC ₅₀ values were calculated using all prism (Prism) (R) software (GraphPad Software (Graphpad Software)). Conversion to K _i values IC ₅₀ values are Cheng (Cheng) - Prusoff (Prusoff) equation (Cheng (Cheng) YC and Prusoff (Prusoff) WH, 1973) was performed using.

結果
文献で既知のＯＸ４０Ｌ結合アッセイとしては、ＦＡＣＳベースの分析（テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｌら、２００２）、またはビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）^TMベースの分析（アル−シャムカニ（Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ）Ａら、１９９７）が挙げられる。これらの技術は高速大量処理スクリーニングには不適切であるので、ルミネッセンス酸素チャネリングイムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｏｘｙｇｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＬＯＣＩ；欧州特許第５１５１９４号明細書；ウルマン（Ｕｌｌｍａｎ）Ｅら、１９９４）をベースとする方法である、増幅ルミネッセンス近接均質アッセイスクリーン（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ Ｓｃｒｅｅｎ）（アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TM；パッカードバイオサイエンス（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））と称される市販の技術を利用して、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用に対するＯＸ４０Ｌ由来ペプチドの可能な阻害特性を確立するためのより効率的なシステムが創設された。 Results OX40L binding assays known in the literature include FACS-based analysis (Taylor L et al., 2002) or Biacore ^™ -based analysis (Al-Shamkani A et al., 1997). Can be mentioned. Since these techniques are unsuitable for high-throughput screening, a method based on the luminescent oxygen channeling immunoassay (LOCI; EP 515194; Ullman E et al., 1994) OX40R using a commercially available technology called Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay Screen (Alphascreen ^™ ; Packard Bioscience)-OX40R Of OX40L-derived peptides against A more efficient system for establishing inhibitory properties was created.

簡単に述べると、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TM技術は、特にタンパク質／タンパク質相互作用アッセイのために、生体分子の相互作用および活動に対する化合物の効果の容易で信頼できる判定を提供する。アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMは、特異的分子接合のための官能基を提供するヒドロゲル層でそれぞれが被覆された、「供与体」および「アクセプター」ポリスチレンビーズの使用に依存する。固定化した分子間の生物学的相互作用によってビーズが近づくと、化学反応のカスケードが開始して、大幅に増幅されたシグナルが生じる。６８０ｎｍでのレーザー励起時に、「供与体」ビーズ中の光増感剤は、周囲の酸素をさらに励起された一重項状態に変換する。励起された一重項状態酸素分子は、迅速に減衰する前に最大距離２００ｎｍにわたり拡散する。アクセプタービーズが近接している場合、これらの酸素分子は、アクセプタービーズに含有されるケミルミネッサー（チオキセン誘導体など）と反応して、化学ルミネセンスを生じる。引き続いて活性化蛍光体は、５２０〜６２０ｎｍで発光する。特異的生物学的相互作用の不在時、供与体ビーズによって生じる一重項状態酸素分子は、アクセプタービーズの近接状態なしでは検出されない。アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TM技術によって、サブナノモル／ミクロモル範囲の親和性の相互作用が検出できるようになる。 Briefly, Alphascreen ^™ technology provides an easy and reliable determination of the effect of a compound on biomolecular interactions and activities, especially for protein / protein interaction assays. Alphascreen ^™ relies on the use of “donor” and “acceptor” polystyrene beads, each coated with a hydrogel layer that provides functional groups for specific molecular conjugation. As the beads approach due to biological interactions between the immobilized molecules, a cascade of chemical reactions begins, resulting in a greatly amplified signal. Upon laser excitation at 680 nm, the photosensitizer in the “donor” beads converts the surrounding oxygen into a more excited singlet state. Excited singlet state oxygen molecules diffuse over a maximum distance of 200 nm before rapidly decaying. When the acceptor beads are in close proximity, these oxygen molecules react with a chemiluminescent (such as a thioxene derivative) contained in the acceptor beads to produce chemiluminescence. Subsequently, the activated phosphor emits at 520-620 nm. In the absence of specific biological interactions, singlet state oxygen molecules generated by the donor beads are not detected without the proximity of the acceptor beads. Alphascreen ^™ technology makes it possible to detect affinity interactions in the sub-nanomolar / micromolar range.

本例では、外来性の標識群の使用を避けた短い生物学的リンカーを有する異なる親和性タグを使用して、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMビーズ上に固定化した基本的結合パートナーのみを使用して、実験的設定を最初に試験した。シグナルは、ビオチン化抗ＣＤ８抗体ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８とＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁によって形成する複合体のお陰で、ストレプトアビジン供与体とタンパク質Ａアクセプタービーズとが、２００ｎｍ未満の距離で隔てられている場合にのみ検出されるべきである（図１）。可溶性ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８と共にＯＸ４０ＲのＩｇＧ₁標識細胞外領域をインキュベートして複合体を形成した。適切なタグのために、この複合体はタンパク質Ａアクセプタービーズと結合でき、ビオチン化抗ＣＤ８抗体の存在下でストレプトアビジン供与体ビーズと結合でき、検出できるアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMシグナルを生じる。ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用と競合する化合物の存在下では、供与体およびアクセプタービーズはもはや近接せず、シグナルはもはや検出されない。 In this example, only a basic binding partner immobilized on Alphascreen ^™ beads is used, using different affinity tags with short biological linkers avoiding the use of exogenous labeling groups. The experimental setup was first tested. Signal, thanks to the complex formed by biotinylated anti-CD8 antibody OX40L-CD8 and OX40R-IgG _1, only if the streptavidin donor and the protein A acceptor beads are separated by a distance of less than 200nm Should be detected (FIG. 1). The IgG ₁ labeled extracellular region of OX40R with soluble OX40L-CD8 and incubated to form a complex. For the appropriate tag, this complex can bind to protein A acceptor beads and can bind to streptavidin donor beads in the presence of a biotinylated anti-CD8 antibody, producing a detectable Alphascreen ^™ signal. In the presence of compounds that compete with the OX40L-OX40R interaction, the donor and acceptor beads are no longer in close proximity and the signal is no longer detected.

このアッセイの実施可能性を判定するために実施された最初の実験では、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMシグナルは、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁の添加に伴い用量依存的な様式で増大した（図２Ａ）。５または１０ｎＭのＯＸ４０−ＩｇＧ₁をそれぞれ使用して計算されたＥＣ₅₀値（−ｌｏｇＥＣ₅₀±ＳＥＭ、平均の標準誤差）は、７．７×１０^-9Ｍ（８．１１±０．０４）および７．９×１０^-9Ｍ（８．１０±０．０１）であった。次にこの結合アッセイで使用する最適濃度を求めるために、より幅広い受容体濃度（２．５〜８０ｎＭ）を使用して実験を繰り返した。全部で７種類の濃度を試験し、結果は、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（図２Ｂ）とのインキュベーションに続いて、各濃度で、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMシグナルにおいて、シグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比に用量依存性の増大が生じたことを実証した。あらゆる場合において、ナノモル範囲に留まった計算されたＥＣ₅₀値の間に顕著な差はなかった。 In the first experiment was conducted to determine the feasibility of this assay, AlphaScreen (Alphascreen) ^TM signal was increased in a dose-dependent manner with the addition of OX40R-IgG ₁ (Fig. 2A). EC ₅₀ values (−logEC ₅₀ ± SEM, standard error of the mean) calculated using 5 or 10 nM OX40-IgG ₁ respectively were 7.7 × 10 ⁻⁹ M (8.11 ± 0.04). And 7.9 × 10 ⁻⁹ M (8.10 ± 0.01). The experiment was then repeated using a wider receptor concentration (2.5-80 nM) to determine the optimal concentration to use in this binding assay. A total of 7 concentrations were tested and the results show that the signal / background (S / B) ratio in the Alphascreen ^™ signal at each concentration following incubation with OX40L-CD8 (FIG. 2B). Demonstrated that a dose-dependent increase occurred. In all cases, there was no significant difference between calculated EC ₅₀ values that remained in the nanomolar range.

これらの結果を考慮して、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（１０ｎＭ）およびＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（４０ｎＭ）の濃度でさらに実験を実施し、作業するための良好なＳ／Ｂウィンドウを可能にし、またこれらの融合タンパク質の最小濃度のみを使用することでアッセイの費用効率が高いことを裏付けた。 In view of these results, further experiments were performed at concentrations of OX40R-IgG ₁ (10 nM) and OX40L-CD8 (40 nM) to allow a good S / B window to work with, and these fusion proteins The use of only a minimal concentration of the assay confirmed the cost effectiveness of the assay.

次にＴＮＦ−様タンパク質とそれらの受容体との相互作用を阻害する小型分子であるスラミン（１ｍＭ）存在下で測定された、非特異的結合に起因するシグナルを差し引いてＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁のためのＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８のＫ_Dを計算した（アルザーニ（Ａｌｚａｎｉ）Ｒら、１９９５）。ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８の特異的結合は、可飽和で高親和性（図３）であり、Ｋ_D値は２０．７±５．２ｎＭと計算された。これはビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）センサーチップ方法を使用してＯＸ４０Ｒに対するＯＸ４０Ｌ−ＣＤ４の結合親和性を測定した際の文献値（アル−シャムカニ（Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ）Ａら、１９９７）と一致し、概してＴＮＦ受容体ファミリーのその他のメンバーについて、それらの各リガンドに対して得られたＫ_D値に類似する。 Then measured at suramin (1 mM) in the presence of small molecules that inhibit the interaction between TNF- like proteins and their receptors, for the OX40R-IgG ₁ by subtracting the signal caused by non-specific binding of was calculated K _D of OX40L-CD8 (Aruzani (Alzani) R et al., 1995). Specific binding of OX40L-CD8 is a high affinity saturable (Fig. 3), K _D value was calculated to be 20.7 ± 5.2 nM. This is consistent with literature values when measuring the binding affinity of OX40L-CD4 to OX40R using the Biacore sensor chip method (Al-Shamkhani A et al., 1997) and generally accept TNF. For the other members of the body family, it is similar to the _KD values obtained for their respective ligands.

このアッセイにおいてＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８不在下では、それ自身はアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMシグナルを生じることができない、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用に対する２つの既知の競合相手（未標識組み換えヒト可溶性ＯＸ４０Ｌおよびスラミン）が、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁からＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８を排除する能力を調べた。およそのＫ_D値を考慮して、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（１０ｎＭ）の４倍のＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（４０ｎＭ）濃度で、排除実験を実施した。ＯＸ４０−ＩｇＧ₁（１０ｎＭ）およびＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（４０ｎＭ）も含有する反応混合物に、増大する濃度のＯＸ４０Ｌ（３μＭ〜０．１ｐＭ）またはスラミン（１ｍＭ〜１ｎＭ）を添加した。双方の化合物は、用量依存的な様式でＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８結合について競合し、得られたＩＣ₅₀値（−ｌｏｇＩＣ₅₀±ＳＥＭ）は、それぞれ５．９×１０^-9Ｍ（８．２３±０．３５）および７．９×１０^-5Ｍ（４．１０±０．０６）であった（図４）。これらの値は、チェング（Ｃｈｅｎｇ）−プルソフ（Ｐｒｕｓｏｆｆ）方程式（チェング（Ｃｈｅｎｇ）ＹＣおよびプルソフ（Ｐｒｕｓｏｆｆ）ＷＨ、１９７３）によって、ＯＸ４０Ｌに対して２．０ｎＭ、スラミンに対して２６．３μＭのＫ_i値に転換できる。このスラミンに対する後者の値は、ＴＮＦ受容体に対するＴＮＦ−α結合の阻害について報告された値と類似する（グレイ（Ｇｒａｙ）ＰＷら、１９９０）。 In this assay, in the absence of OX40L-CD8, two known competitors to the OX40L-OX40R interaction (unlabeled recombinant human soluble OX40L and suramin), which themselves cannot produce an Alphascreen ^™ signal, from OX40R-IgG ₁ was tested for their ability to eliminate the OX40L-CD8. Taking into account the approximate K _D values, in OX40L-CD8 (40nM) concentration 4 times the OX40R-IgG ₁ (10nM), it was performed exclusion experiments. Increasing concentrations of OX40L (3 μM to 0.1 pM) or suramin (1 mM to 1 nM) were added to the reaction mixture that also contained OX40-IgG ₁ (10 nM) and OX40L-CD8 (40 nM). Both compounds compete for OX40L-CD8 binding in a dose-dependent manner and the resulting IC ₅₀ values (−log IC ₅₀ ± SEM) are each 5.9 × 10 ⁻⁹ M (8.23 ± 0. 35) and 7.9 × 10 ⁻⁵ M (4.10 ± 0.06) (FIG. 4). These values, Cheng (Cheng) - Prusoff (Prusoff) by equation (Cheng (Cheng) YC and Prusoff (Prusoff) WH, 1973), 26.3μM of K _i 2.0 nM, with respect to suramin against OX40L Can be converted to a value. This latter value for suramin is similar to the value reported for inhibition of TNF-α binding to the TNF receptor (Gray PW et al., 1990).

アッセイを実施するためアッセイのさらなる最適化を行って、病状をより良く定義した。アッセイはシグナルを失うことなく、濃度１％までのジメチル・スルホキシド（ＤＭＳＯ）に耐えられた。最初の添加ステップでＯＸ４０−ＩｇＧ₁、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８、およびビオチン化抗ＣＤ８抗体を組み合わせ、第２のステップでストレプトアビジン供与体およびタンパク質Ａアクセプタービーズを組み合わせ、総インキュベーション時間を６０分間に保つことで、アッセイは効率的に実施できた。双方の混合物は、プレートへの添加に先だって調製できる。 Further optimization of the assay was performed to perform the assay to better define the pathology. The assay tolerated dimethyl sulfoxide (DMSO) up to a concentration of 1% without loss of signal. Combine OX40-IgG ₁ , OX40L-CD8, and biotinylated anti-CD8 antibody in the first addition step, combine streptavidin donor and protein A acceptor beads in the second step, and keep total incubation time at 60 minutes Thus, the assay could be performed efficiently. Both mixtures can be prepared prior to addition to the plate.

最初、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用を競合的に阻害するＯＸ４０Ｌ由来ペプチドを検出するために開発された、上で述べたアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TM技術は、このような相互作用のあらゆるその他の選択的小型分子またはペプチド阻害剤をスクリーニングするのにも適切であろう。このアッセイは、均質で高感度、強力で３８４ウェルフォーマットでの自動化に適するので、同アプローチは、膜結合性タンパク質の細胞外部分とタンパク質リガンドを異なるタグ配列を持つ融合タンパク質（本例ではそれぞれＩｇＧ₁およびＣＤ８）として単に発現させることで、膜結合性タンパク質と相互作用する多くのその他のタンパク質リガンドの生化学スクリーニングの開発に潜在的に応用可能である。 Initially developed to detect OX40L-derived peptides that competitively inhibit the OX40L-OX40R interaction, the Alphascreen ^™ technology described above is capable of any other selective miniaturization of such interactions. It may also be appropriate to screen for molecular or peptide inhibitors. Because this assay is homogeneous, sensitive, powerful, and suitable for automation in a 384-well format, this approach can be applied to fusion proteins with different tag sequences for the extracellular portion of the membrane-bound protein and the protein ligand (in this example, IgG Simply expressed as ₁ and CD8) can potentially be applied to the development of biochemical screens for many other protein ligands that interact with membrane-bound proteins.

実施例２：ＯＸ４０Ｒに結合するＯＸ４０Ｌ由来ペプチドの同定
方法
ペプチド
エピトップ（Ｅｐｙｔｏｐ）（フランス）によって、８５〜９７％の範囲の純度でペプチド（１０〜３１アミノ酸）を合成し、−２０℃で凍結乾燥形態で保存した。使用前に、ＰＢＳ中０．１ｍＭのＮａＯＨでペプチドを可溶化した。各ペプチドの名称、配列、およびヒトＯＸ４０Ｌ中の対応するアミノ酸を表ＩＩＩに示す。 Example 2: Method for identifying OX40L-derived peptides that bind to OX40R Peptides (10-31 amino acids) were synthesized by peptides Epitop (France) with a purity ranging from 85-97% and frozen at -20 ° C. Stored in dry form. Prior to use, peptides were solubilized with 0.1 mM NaOH in PBS. The name, sequence and corresponding amino acid in human OX40L is shown in Table III.

アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMベースの競合アッセイ
最初の添加ステップ中に、５μＬ容積の様々な濃度の各ペプチドと共に、可溶性構成成分（ＯＸ４０−ＩｇＧ₁、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８、およびビオチン化抗ＣＤ８抗体）をＯＸ４０Ｌとスラミンの競合アッセイ（図４）について既述した濃度で混合した。ストレプトアビジン供与体およびタンパク質Ａアクセプタービーズを３０分後に添加した。実施例１で述べたようにより短い発光波長５２０〜６２０ｎｍと組み合わせた長い励起波長６８０ｎｍで読み取る前に、プレートを暗中、室温で振盪して２時間インキュベートした。 Alphascreen ^™ -based competition assay During the first addition step, soluble components (OX40-IgG ₁ , OX40L-CD8, and biotinylated anti-CD8 antibody) were added to OX40L along with 5 μL volumes of each peptide at various concentrations. And suramin competition assay (FIG. 4) were mixed at the concentrations previously described. Streptavidin donor and protein A acceptor beads were added after 30 minutes. Prior to reading at a long excitation wavelength of 680 nm combined with a shorter emission wavelength of 520-620 nm as described in Example 1, the plates were incubated in the dark at room temperature for 2 hours.

蛍光消光アッセイ
前述のようにして蛍光消光アッセイを実施した（ゴラベク（Ｇｏｌａｂｅｋ）Ａら、２０００）。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（３５μｇ）を５００μＬのＰＢＳ中に溶解し、スリットを５ｎｍに設定した分光蛍光計（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）ＬＳ５０Ｂ）を使用して、励起波長２９０ｎｍで蛍光スペクトルを２９５〜４２０ｎｍで記録した。次に１５分間の平衡化後に、ヒトＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁の蛍光スペクトルを増大する濃度（５〜１０００ｎＭ）のＰ５およびＰ５−１ペプチド存在下で記録した。３３６ｎｍでの蛍光変化をペプチド濃度に対してプロットし、得られた曲線をプリズム（Ｐｒｉｓｍ）（登録商標）ソフトウェア（グラフパッド（ＧｒａｐｈＰａｄ））で非線形回帰適合によって分析した。 Fluorescence Quenching Assay A fluorescence quenching assay was performed as previously described (Golabek A et al., 2000). Using a spectrofluorometer (Perkin Elmer LS50B) in which OX40R-IgG ₁ (35 μg) was dissolved in 500 μL of PBS and the slit was set at 5 nm, the fluorescence spectrum was 295-420 nm with an excitation wavelength of 290 nm. Recorded. Then after 15 minutes of equilibration, it was recorded at P5 and P5-1 peptide presence of concentrations (5 to 1000 nm) to increase the fluorescence spectrum of human OX40R-IgG _1. The fluorescence change at 336 nm was plotted against peptide concentration and the resulting curve was analyzed by non-linear regression fitting with Prism® software (GraphPad).

結果
タンパク質のアミノ酸５１〜１８３に対応するヒトＯＸ４０Ｌ細胞外領域の配列に基づいて、一連の部分的に重なるペプチドをデザインした（図５Ａ；表ＩＩＩ）。この領域では、抗ＯＸ４０Ｌ抗体を作るために、マウスＯＸ４０Ｌの配列に基づいて２つのぺプチドが以前デザインされている（ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、１９９６）。 Results A series of partially overlapping peptides were designed based on the sequence of the human OX40L extracellular region corresponding to amino acids 51-183 of the protein (FIG. 5A; Table III). In this region, two peptides were previously designed based on the sequence of mouse OX40L to make anti-OX40L antibodies (Stuber E and Strobe W, 1996).

実施例１で述べたアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMベースの競合アッセイにおいて、第１の一連のペプチドを使用して、薬理学的に妥当な親和性値であるミクロモル範囲で、ＯＸ４０Ｌに対するＯＸ４０Ｒの結合を阻害できるペプチド（Ｐ５）を定義することが可能であった（図５Ｂ）。 In the Alphascreen ^™ -based competition assay described in Example 1, the first series of peptides was used to bind OX40R to OX40L in the micromolar range of pharmacologically relevant affinity values. It was possible to define a peptide (P5) that could be inhibited (FIG. 5B).

Ｐ５ペプチドの配列に基づいて第２の一連の部分的に重なるペプチドを試験して、この阻害分子をさらに減少させた（図６Ａ；表ＩＩＩ）。この逐次スクリーニングの結果、ミクロモル範囲（それぞれＫｄ〜１０および６２ミクロモル）で、アミノ酸１０７〜１１６（Ｐ５−１）に対応するペプチドがＯＸ４０ＲのＯＸ４０Ｌへの結合をなおも阻害できるため、ヒトＯＸ４０Ｌ（Ｐ５）のアミノ酸９４〜１２４を含む領域は最小領域でなかった。その他の試験されたペプチドは、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用に対する効果を全くあるいはほとんど示さなかった（図６Ｂ）。   A second series of partially overlapping peptides based on the sequence of the P5 peptide was tested to further reduce this inhibitory molecule (FIG. 6A; Table III). As a result of this sequential screening, since the peptide corresponding to amino acids 107-116 (P5-1) can still inhibit the binding of OX40R to OX40L in the micromolar range (Kd-10 and 62 micromole, respectively), human OX40L (P5 The region containing amino acids 94 to 124 was not the minimum region. The other tested peptides showed no or little effect on the OX40R-OX40L interaction (FIG. 6B).

Ｐ５−１ペプチドのＣ−末端の６個のアミノ酸を含有するＰ４ペプチドは、ＯＸ４０Ｒと非常に不十分に結合することが立証されるので、例えば配列ＧＹＦＳＱ（ペプチドＰ５−１ａ；ヒトＯＸ４０Ｌ中のアミノ酸１０７〜１１１；配列番号：１３）などのＰ５−１ペプチドのＮ−末端アミノ酸が、ＯＸ４０Ｒ結合剤として機能的に活性の最小ペプチド配列を表すかも知れないことも推論される。マウスＯＸ４０Ｌ由来ペプチドＰ−ＯＸ−１（ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、１９９６）と比較すると、このペプチドは、２個の非保存的置換を含有する（図６Ａ）。   The P4 peptide containing the 6 amino acids at the C-terminal end of the P5-1 peptide proves to bind very poorly to OX40R, so for example the sequence GYFSQ (peptide P5-1a; amino acid in human OX40L It is also inferred that the N-terminal amino acid of the P5-1 peptide, such as 107-111; SEQ ID NO: 13) may represent a minimal peptide sequence that is functionally active as an OX40R binder. Compared to the mouse OX40L derived peptide P-OX-1 (Stuber E and Strobe W, 1996), this peptide contains two non-conservative substitutions (FIG. 6A).

この実施例で競合アッセイによって同定されるＰ５およびＰ５−１ペプチドの配列により、ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用において重要な役割を果たすＯＸ４０Ｌ中の構造が同定でき、ＯＸ４０Ｌが特異的ペプチド配列によって効果的に競合できることが実証される。これらのファミリーに属するタンパク質間の接触領域は、リガンド−受容体の対の中で非常に多様であるので、これらの知見は、これらのタンパク質の構造−活性度関係にかかわる現状技術、あるいはその他のＴＮＦ／ＴＮＦＲ−様タンパク質の分析からは予測可能でなかった（ボドマー（Ｂｏｄｍｅｒ）ＪＬら、２００２）。   The sequence of P5 and P5-1 peptides identified by the competition assay in this example can identify structures in OX40L that play an important role in the OX40L-OX40R interaction, and OX40L effectively competes with specific peptide sequences. It is demonstrated that it can be done. Since the contact regions between proteins belonging to these families are very diverse among the ligand-receptor pairs, these findings are based on state-of-the-art technology related to the structure-activity relationship of these proteins, or other It was not predictable from analysis of TNF / TNFR-like proteins (Bodmer JL et al., 2002).

実施例１でＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用の阻害剤として同定されるペプチドの親和性は、自然な状態でビーズまたはその他の支持体なしに、溶液中でこのような測定ができるようにする技術である、蛍光消光分光分析によって評価された。この方法は、別のタンパク質（Ｐ５またはＰ５−１）との結合時に、タンパク質（ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ１）の内部蛍光の変化をモニターすることに基づく。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁と、増大する濃度のＰ５またはＰ５−１ペプチドとのインキュベーションにより、ペプチドＰ５およびＰ５−１濃度に対してＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁の蛍光変化をプロットすると、その内部蛍光に双曲線の形状である変化が起きる（図７Ａおよび７Ｂ）。データの非線形回帰分析からは、それぞれ、ＯＸ４０ＲでＫＤ〜７．９ｎＭ、ペプチドＰ５およびＰ５−１でＫＤ〜２４．６ｎＭである見かけの解離定数が明らかになる。これらの値からは、ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁と選択されたペプチドの間の高親和性相互作用が実証されるので、それはＯＸ４０Ｌ拮抗剤として使用できる。 The affinity of the peptides identified as inhibitors of OX40L-OX40R interaction in Example 1 is a technique that allows such measurements in solution without beads or other supports in the natural state. Evaluated by fluorescence quenching spectroscopy. This method is based on monitoring changes in the internal fluorescence of the protein (OX40R-IgG1) upon binding to another protein (P5 or P5-1). Incubation of OX40R-IgG ₁ with increasing concentrations of P5 or P5-1 peptide plots the fluorescence change of OX40R-IgG ₁ against peptide P5 and P5-1 concentrations, and the internal fluorescence is hyperbolic in shape. A change occurs (Figures 7A and 7B). Non-linear regression analysis of the data reveals apparent dissociation constants of KD˜7.9 nM for OX40R and KD˜24.6 nM for peptides P5 and P5-1, respectively. From these values, the high affinity interaction between the peptide and the selected OX40R-IgG ₁ is demonstrated, which can be used as OX40L antagonists.

本実施例で提示した知見は、ＯＸ４０Ｒに効率的に結合する特異的ＯＸ４０Ｌ由来ペプチドを使用することで、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用が効果的に阻害できることを示し、ＯＸ４０Ｒ径路をターゲットととし、その調節下での異常なまたは望ましくない生理的事象を阻害する薬剤開発のための新しい機会が提供される。次にこれらのＯＸ４０Ｒ結合剤は、技術分野で既知の動物および細胞生物学アッセイを使用して、ＯＸ４０Ｒとの相互作用においてＯＸ４０Ｌの拮抗剤としてさらに詳しく特性決定され（国際公開第９９／４２５８５号パンフレット；イムラ（Ｉｍｕｒａ）Ａら、１９９７；ノハラ（Ｎｏｈａｒａ）Ｃら、２００１；ピッピグ（Ｐｉｐｐｉｇ）ＳＤら、１９９９；コタニ（Ｋｏｔａｎｉ）Ａ．ら、２００２）、妥当なモデルにおいて、その他の可能な使用制限的副作用を試験することで、さらに有効性確認できる（コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）ＲＡら、２００１）。   The knowledge presented in this example indicates that the use of a specific OX40L-derived peptide that efficiently binds to OX40R can effectively inhibit the OX40R-OX40L interaction, targeting the OX40R pathway and its regulation. New opportunities are provided for drug development that inhibits abnormal or undesirable physiological events below. These OX40R binding agents are then further characterized as antagonists of OX40L in interaction with OX40R using animal and cell biology assays known in the art (WO 99/42585). Imara A et al., 1997; Nohara C et al., 2001; Pippig SD et al., 1999; Kotani A. et al., 2002), other possible use restrictions in reasonable models; The effectiveness can be further confirmed by testing for side effects (Coleman RA et al., 2001).

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ＯＸ４０Ｌ−ＯＸ４０Ｒ相互作用の研究のためのこのアプローチの実施可能性を実証するために最初開発された、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMアッセイの実験デザイン。Experimental design of Alphascreen ^™ assay, originally developed to demonstrate the feasibility of this approach for studying OX40L-OX40R interactions. アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMアッセイを使用して検出されたＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁へのＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８の用量依存性結合。（Ａ）増大する濃度のＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８を濃度５ｎＭ（○）または１０ｎＭ（●）のＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁と共に３０分間インキュベートした。次にビオチン化抗ＣＤ８抗体（１０ｎＭ）を添加し、３０分後、ストレプトアビジン供与体（２０ｍｇ／ｍｌ）およびタンパク質Ａアクセプター（２０ｍｇ／ｍｌ）ビーズを添加した。これらの添加の１時間後、プレートをフュージョン（Ｆｕｓｉｏｎ）^TMリーダー上でカウントした。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（黒四角）不在下では、非常に弱いシグナルのみが検出された。（Ｂ）シグナル／バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比に対する増大するＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁濃度の効果。Ｓ／Ｂ比は、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（１００ｎＭ）存在下で得られたカウントをバックグラウンドカウント（ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８不在下）で除して計算された。データは平均±ＳＥＭ（平均の標準誤差）として表され、全ての実験は、三連で３回実施した。AlphaScreen (Alphascreen) dose-dependent binding of OX40L-CD8 to OX40R-IgG ₁ was detected using the ^TM assay. (A) Increasing concentrations of OX40L-CD8 were incubated with OX40R-IgG ₁ at a concentration of 5 nM (◯) or 10 nM (●) for 30 minutes. Biotinylated anti-CD8 antibody (10 nM) was then added, and after 30 minutes, streptavidin donor (20 mg / ml) and protein A acceptor (20 mg / ml) beads were added. One hour after these additions, the plates were counted on a Fusion ^™ reader. In the absence of OX40R-IgG ₁ (black square), only a very weak signal was detected. (B) signal / background (S / B) OX40R-IgG 1 concentration effect of increasing relative ratio. The S / B ratio was calculated by dividing the count obtained in the presence of OX40L-CD8 (100 nM) by the background count (in the absence of OX40L-CD8). Data are expressed as mean ± SEM (standard error of the mean) and all experiments were performed in triplicate in triplicate. ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁のためのＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８のＫ_D定量。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（１０ｎＭ）を増大する濃度のＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８存在下でインキュベートした。スラミン（１ｍＭ）存在下で求めた全結合（黒四角）と非特異的結合（●）の差として、特異的結合（□）を計算した。三連で実施した３回の実験からの平均±ＳＥＭとしてデータを表した。K _D Determination of OX40L-CD8 for OX40R-IgG _1. OX40R-IgG ₁ (10 nM) was incubated in the presence of increasing concentrations of OX40L-CD8. Specific binding (□) was calculated as the difference between total binding (black square) and non-specific binding (●) determined in the presence of suramin (1 mM). Data were expressed as mean ± SEM from three experiments performed in triplicate. ＯＸ４０ＬとスラミンによるＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８結合に対する競合作用。ビオチン化抗ＣＤ８抗体（１０ｎＭ）の添加に先だって、ＯＸ４０−ＩｇＧ（１０ｎＭ）、ＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８（４０ｎＭ）、および増大する濃度の可溶性ＯＸ４０Ｌ（●）またはスラミン（○）を３０分間インキュベートした。３０分後、ストレプトアビジン供与体およびタンパク質Ａアクセプタービーズを添加した。グラフは、（阻害剤の不在下で得られた）最大アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMシグナルの阻害率を表す。三連で実施した３回の実験からの平均±ＳＥＭとしてデータを表した。Competitive effect on OX40L-CD8 binding by OX40L and suramin. Prior to the addition of biotinylated anti-CD8 antibody (10 nM), OX40-IgG (10 nM), OX40L-CD8 (40 nM), and increasing concentrations of soluble OX40L (●) or suramin (◯) were incubated for 30 minutes. After 30 minutes, streptavidin donor and protein A acceptor beads were added. The graph represents the percent inhibition of the Alphascreen ^™ signal (obtained in the absence of inhibitor). Data were expressed as mean ± SEM from three experiments performed in triplicate. ＯＸ４０Ｌ断片のＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁への結合。（Ａ）アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMベースの競合アッセイによって試験されたペプチド、またはマウスＯＸ４０Ｌ由来Ｐ−ＯＸ−１およびＰ−ＯＸ−２ペプチド（配列の下；非同一アミノ酸を表示）に対応する配列と共に、主要タンパク質領域の位置（配列の上）が表示されるヒトＯＸ４０Ｌ（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ Ａｃｃ．番号Ｐ２３５１０）の配列。（Ｂ）ペプチドＰ４、Ｐ５によるＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁のＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８に対する結合の阻害、およびペプチドなしの対照。Binding to OX40R-IgG ₁ of OX40L fragment. (A) Peptides tested by Alphascreen ^™ -based competition assay, or sequences corresponding to mouse OX40L-derived P-OX-1 and P-OX-2 peptides (below sequence; non-identical amino acids are shown) A sequence of human OX40L (SWISSPROT Acc. No. P23510) in which the position of the main protein region (above the sequence) is displayed. (B) Inhibition of binding to OX40L-CD8 for OX40R-IgG ₁ by peptide P4, P5, and no peptide controls. マウスＯＸ４０Ｌ由来ペプチドＰ−ＯＸ−１（ストゥーバー（Ｓｔｕｂｅｒ）Ｅおよびストローバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）Ｗ、１９９６；表Ｉに示す§は非保存的置換を示し、そして・は保存的置換を示す）、およびアルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMベースの競合アッセイで試験したＰ５由来ペプチドの配列と並べた、ペプチドＰ５のＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁（Ａ）配列に対するＰ５由来ペプチドの結合。ペプチドＰ５−１ａは、Ｐ５−１で囲まれた配列である。（Ｂ）ペプチドＰ５のその他の断片によって提供される効果と比較した、アルファスクリーン（Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）^TMベースの競合アッセイにおける、ペプチドＰ５−１によるＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁のＯＸ４０Ｌ−ＣＤ８に対する結合の阻害。Mouse OX40L-derived peptide P-OX-1 (Stuber E and Strober W, 1996; § shown in Table I indicates non-conservative substitutions and indicates conservative substitutions), and alpha Binding of P5-derived peptides to the OX40R-IgG ₁ (A) sequence of peptide P5 aligned with the sequence of P5-derived peptides tested in the Alphascreen ^™ -based competition assay. Peptide P5-1a is a sequence surrounded by P5-1. (B) was compared to the effects provided by the other fragments of the peptide P5, inhibition of binding in AlphaScreen (Alphascreen) ^TM-based competition assay, against OX40L-CD8 for OX40R-IgG ₁ by peptide P5-1. 蛍光消光分光分析を使用して測定したペプチドＰ５（Ａ）およびＰ５−１（Ｂ）とのＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁相互作用。ＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁蛍光変化の非線形回帰分析からは、２個のペプチドのＫｄ値として示されるＯＸ４０Ｒ−ＩｇＧ₁−ペプチド複合体の解離定数と共に、可飽和結合が明らかになる。OX40R-IgG ₁ interaction with the peptide P5 was measured using a fluorescence quenching spectroscopy (A) and P5-1 (B). Non-linear regression analysis of OX40R-IgG ₁ fluorescence changes reveals saturable binding, with dissociation constants for OX40R-IgG ₁ -peptide complexes shown as Kd values for the two peptides.

Claims (29)

ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸９４〜１２４（配列番号：６）からなるＯＸ４０Ｒ結合ペプチド。  An OX40R-binding peptide consisting of amino acids 94 to 124 (SEQ ID NO: 6) of human OX40L. ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸９４〜１２４（配列番号：６）からなるペプチドのフラグメントであって、当該フラグメントがヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸１０７〜１１６（配列番号：８）を含む、ＯＸ４０Ｒ結合ペプチド。  OX40R binding peptide, which is a fragment of a peptide consisting of amino acids 94 to 124 (SEQ ID NO: 6) of human OX40L, wherein the fragment comprises amino acids 107 to 116 (SEQ ID NO: 8) of human OX40L. ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸１０７〜１１６（配列番号：８）からなる、請求項２に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチド。  The OX40R-binding peptide according to claim 2, consisting of amino acids 107 to 116 (SEQ ID NO: 8) of human OX40L. ヒトＯＸ４０Ｌ、マウスＯＸ４０Ｌ又はウサギＯＸ４０Ｌ以外のタンパク質と請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドとからなる融合ポリペプチドであるＯＸ４０Ｒ結合ペプチドであって、当該タンパク質が膜結合タンパク質、膜結合タンパク質の細胞外領域、免疫グロブリン定常部、多量体化領域、細胞外タンパク質、シグナルペプチド含有タンパク質、搬出シグナル含有タンパク質から選択される、ＯＸ４０Ｒ結合ペプチド。Human OX40L, an OX40R binding peptide is a fusion polypeptide comprising a peptide according to any one of claims with proteins other than mouse OX40L or rabbit OX40L claim 1-3, the protein is membrane bound proteins, membrane An OX40R binding peptide selected from an extracellular region of a binding protein, an immunoglobulin constant region, a multimerization region, an extracellular protein, a signal peptide-containing protein, and an export signal-containing protein. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドの塩であるＯＸ４０Ｒ結合ペプチド。The OX40R binding peptide which is a salt of the OX40R binding peptide according to any one of claims 1 to 4 . 放射性標識、ビオチン、蛍光標識、細胞毒性作用物質、およびドラッグデリバリー作用物質の中から選択される分子に接合又は複合された、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチド。The OX40R-binding peptide according to any one of claims 1 to 5 , which is conjugated or conjugated to a molecule selected from a radiolabel, biotin, a fluorescent label, a cytotoxic agent, and a drug delivery agent. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドをコードする核酸。A nucleic acid encoding the OX40R-binding peptide according to any one of claims 1 to 4 . 請求項７に記載の核酸を含む、ウィルスまたはプラスミド起源のベクター。A vector of viral or plasmid origin comprising the nucleic acid of claim 7 . 請求項８に記載の発現ベクターを含む、原核または真核宿主細胞。A prokaryotic or eukaryotic host cell comprising the expression vector of claim 8 . 請求項９に記載の細胞が富化され、単離された安定細胞系。A stable cell line enriched and isolated according to claim 9 . ＯＸ４０Ｒ結合ペプチドが細胞膜上で分泌または発現される、請求項１０に記載の細胞系。11. The cell line according to claim 10 , wherein the OX40R binding peptide is secreted or expressed on the cell membrane. 請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞を培養するステップと、前記結合ペプチドを収集するステップとを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドを製造する方法。The OX40R binding peptide according to any one of claims 1 to 4 , comprising a step of culturing the cell according to any one of claims 9 to 11 and a step of collecting the binding peptide. Method. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドの精製品。A purified product of the OX40R-binding peptide according to any one of claims 1 to 6 . 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドの薬物の製造のための使用。 Use for the manufacture of a medicament OX40R binding peptide according to any one of claims 1-6. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドを含むヒトＯＸ４０Ｌ拮抗剤。Human OX40L antagonists including OX40R binding peptide according to any one of claims 1-6. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドを含むヒトＲＡＮＴＥＳ拮抗剤。Human RANTES antagonists including OX40R binding peptide according to any one of claims 1-6. 自己免疫疾患、炎症、または感染症の予防および／または治療のための医薬組成物の製造における請求項１〜６のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドの使用。Use of the OX40R binding peptide according to any one of claims 1 to 6 in the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of an autoimmune disease, inflammation or infection. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドを活性成分として含む、ＣＤ４⁺Ｔ細胞に関する疾患の予防および／または治療のための医薬組成物。A pharmaceutical composition for preventing and / or treating a disease relating to CD4 ⁺ T cells, comprising the OX40R-binding peptide according to any one of claims 1 to 6 as an active ingredient. 薬学上許容可能なキャリア、賦形剤、安定剤、および／または希釈剤と組み合わせた、請求項１８に記載の医薬組成物。19. A pharmaceutical composition according to claim 18 in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, stabilizer and / or diluent. ＣＤ４⁺Ｔ細胞に関する疾患が、移植自己免疫疾患、炎症、または感染症である、請求項１８または１９に記載の医薬組成物。The pharmaceutical composition according to claim 18 or 19 , wherein the disease relating to CD4 ⁺ T cells is a transplant autoimmune disease, inflammation, or infection. 膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒタンパク質の細胞外領域の検出のための請求項１〜６のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチド、または請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞の使用。The OX40R-binding peptide according to any one of claims 1 to 6 or the cell according to any one of claims 9 to 11 for detection of an extracellular region of the OX40R protein as a membrane-bound or soluble protein. Use of. 活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞の検出のための請求項１〜６のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチド、または請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞の使用。Use of the OX40R binding peptide according to any one of claims 1 to 6 or the cell according to any one of claims 9 to 11 for the detection of activated CD4 ⁺ T cells. 膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒ細胞外領域の、または活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞の検出、精製、および／または濃縮のための支持体であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドを固定化形態で有する支持体。A support for the detection, purification and / or enrichment of OX40R extracellular region as a membrane-bound or soluble protein or of activated CD4 ⁺ T cells, according to any one of claims 1-4. A support having the OX40R-binding peptide in an immobilized form. サンプルを請求項２３に記載の支持体、または請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞に接触させるステップを含む、前記サンプル中の膜結合または可溶性タンパク質としてのＯＸ４０Ｒ細胞外領域の、または活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞の検出、精製、および／または濃縮方法。Contact of the sample with the support according to claim 23 or the cell according to any one of claims 9 to 11 , of the OX40R extracellular region as a membrane bound or soluble protein in the sample, Alternatively, a method for detecting, purifying and / or enriching activated CD4 ⁺ T cells. 減少したまたは増大したＣＤ４⁺Ｔ細胞または可溶性ＯＸ４０Ｒタンパク質の存在に関連した病状を診断するために使用される、請求項２３に記載の支持体、または請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞。Used decreased or increased CD4 ⁺ T cells or condition associated with the presence of soluble OX40R protein to diagnose, according to any one of the support or claim 9-11, according to claim 23 Cells. 自己免疫疾患、炎症、または感染症の予防および／または治療のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチドまたは請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞。The OX40R-binding peptide according to any one of claims 1 to 6 or the cell according to any one of claims 9 to 11 for the prevention and / or treatment of an autoimmune disease, inflammation or infection. . ａ）ｉ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチド、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞、および請求項２３に記載の支持体の中から選択されるＯＸ４０Ｒ結合ペプチドを構成する要素、
ｉｉ）ＯＸ４０Ｒの細胞外領域を含むタンパク質、その表面にＯＸ４０Ｒの細胞外領域を発現する細胞系、およびＯＸ４０Ｒの細胞外領域を分泌する細胞系の中から選択されるＯＸ４０Ｒ部分を構成する要素、および
ｉｉｉ）ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用モジュレーターとして試験される化合物
の要素を含むサンプルを形成するステップと、
ｂ）要素（ｉ）と（ｉｉ）との間の相互作用に対する化合物（ｉｉｉ）の効果を直接的または間接的に検出するステップと、
ｃ）（ｂ）において、（ａ）の要素の質および／または量の点で異なるサンプル間で検出された効果を比較するステップと
を含む、ＯＸ４０Ｒ−ＯＸ４０Ｌ相互作用を調節する化合物の性質および活性度の判定のためのスクリーニング方法。OX40R selected from a) i) the peptide according to any one of claims 1 to 6, the cell according to any one of claims 9 to 11 , and the support according to claim 23. Elements constituting the binding peptide,
ii) a protein comprising the extracellular region of OX40R, a cell line expressing the extracellular region of OX40R on its surface, and an element constituting the OX40R portion selected from among cell lines secreting the extracellular region of OX40R, and iii) forming a sample containing elements of the compound to be tested as OX40R-OX40L interaction modulators;
b) detecting directly or indirectly the effect of compound (iii) on the interaction between elements (i) and (ii);
c) the nature and activity of the compound that modulates the OX40R-OX40L interaction in (b), comprising comparing the effect detected between different samples in terms of the quality and / or quantity of the element of (a) Screening method for determining the degree. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のＯＸ４０Ｒ結合ペプチド、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞、または請求項２３に記載の支持体を含む、ＯＸ４０Ｒタンパク質の細胞外領域または活性化ＣＤ４⁺Ｔ細胞を検出するためのキット。The extracellular region of OX40R protein comprising the OX40R binding peptide according to any one of claims 1 to 6, the cell according to any one of claims 9 to 11 , or the support according to claim 23. Alternatively, a kit for detecting activated CD4 ⁺ T cells. 患者から得られたサンプル中の減少したまたは増大したＣＤ４⁺Ｔ細胞または可溶性ＯＸ４０Ｒタンパク質の存在による病状の診断のための請求項２８に記載のキット。29. Kit according to claim 28 for the diagnosis of disease states due to the presence of reduced or increased CD4 ⁺ T cells or soluble OX40R protein in a sample obtained from a patient.

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