JP2004500105A

JP2004500105A - Apolipoprotein-A-1 regulation of T cell signaling

Info

Publication number: JP2004500105A
Application number: JP2001567336A
Authority: JP
Inventors: エドワード，カール・ケイ，ザ・サード; ブユルジエ，ダニエル; ダイエ，ジヤン−ミシエル; コウノ，タダヒコ
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド; ユニバーシテイ・オブ・ジユネーブ
Priority date: 2000-03-13
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2004-01-08
Also published as: AU2001245622A1; MXPA02008954A; CA2402772A1; WO2001068852A2; WO2001068852A3

Abstract

本発明は、ＡＦＴＩポリペプチド及びそれをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、ＡＦＴＩポリペプチドを生成するためのベクター、宿主細胞、選択結合物質、及び方法を提供する。また、ＡＦＴＩポリペプチドに関する疾患、特にＩＬ−１媒介の疾患、ＴＮＦ−α媒介の疾患、及び単球の活性化に関わる疾患の治療、診断、改善、又は予防のための方法を提供する。The present invention provides AFTI polypeptides and nucleic acid molecules encoding the same. The invention also provides vectors, host cells, selective binding agents, and methods for producing an AFTI polypeptide. The present invention also provides a method for treating, diagnosing, ameliorating, or preventing a disease relating to an AFTI polypeptide, particularly an IL-1-mediated disease, a TNF-α-mediated disease, and a disease relating to monocyte activation.

Description

【０００１】
本出願は、いずれもその全体があらゆる目的のために参照してここに組み込まれる、２０００年３月１３日出願の米国特許仮出願第６０／１８９，００８号及び２０００年３月３１日出願の米国特許仮出願第６０／１９３，５５１号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、アポリポタンパク質Ａ−１（アポ−Ａ−１）及びその断片と誘導体ならびにＴ細胞を介した単球の活性化を調節する上でのそれらの使用に関する。本発明はまた、そのようなアポ−Ａ−１関連分子を生成するためのベクター、宿主細胞、製薬組成物、選択結合物質及び方法に関する。また、Ｔ細胞を介した単球の活性化に関連する疾患の診断、治療、改善、及び／又は予防のための方法も提供する。
【０００３】
（発明の背景及び概要）
慢性炎症における腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン−１（ＩＬ−１）の重要性は広く確立されている。インビボでのこれらのプロ炎症性サイトカインの遮断又は阻害は、慢性関節リウマチ、クローン病、及び多発性硬化症のような疾患のヒト又は動物モデルの治療において良好な結果を示した（Ｆｅｌｄｍａｎら、１９９８、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３０：４１２６−４１２７；Ａｒｅｎｄら、１９９８、Ｃ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２７−５５；Ｂｒｅｓｎｉｈａｎ，Ｂ．，１９９９，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５８補遺１：１９６−１９８；Ｂａｄｏｖｉｎａｃら、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．８５：８７−９５；Ｗｉｅｍａｎｎら、１９９８、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４９：４５５−４６３）。慢性炎症性疾患の病因においてＴリンパ球が中心的役割を果たすという概念に基づき、刺激されたＴリンパ球との直接の細胞−細胞接着こそが、単球が大量のＴＮＦ−αとＩＬ−１βを産生する引き金となる主な刺激であることが明らかにされた（Ｂｕｒｇｅｒ　Ｄ．とＤａｙｅｒ　Ｊ．Ｍ．，Ｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　１１１−１２８（１９９８））。
【０００４】
植物性血球凝集素（ＰＨＡ）とホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の組合せのようなポリクローナルマイトジェン（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｌｓｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３；Ｌａｃｒａｚら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２０２７−２２０３３；Ｌｉら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８４：５７１−５７６）、共同刺激分子ＣＤ２８の架橋を伴う又は伴わない、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂによるＣＤ３の架橋（Ｍｉｌｔｅｎｂｕｒｇら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２６５５−２６６７；Ｃｈｉｚｚｏｌｉｎｉら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１７１−１７７）及び抗原特異的Ｔ細胞クローン上での抗原認識（Ｃｈｉｚｚｏｌｉｎｉら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１７１−１７７）を含めて、様々な刺激がＴ細胞における単球活性能を誘導することができる。
【０００５】
発明者は、Ｔ細胞を刺激すればＴ細胞上の膜関連リガンドが、単球上の対リガンドに結合することによって単球−マクロファージシグナル伝達の引き金になると考える。しかしながら、これらのリガンド及び対リガンドの同一性は、明らかではなかった。ヒトの系では、シグナル伝達の一部はβ２−インテグリン、ＣＤ６９、ＣＤ２３、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ及びリンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）に帰せられるであろう（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｌｓｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３；Ｌａｃｒａｚら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２０２７−２２０３３；Ｈｅｒｍａｎｎら、１９９９、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１４４：７６７−７７５；Ｓｔｏｕｔら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：８−１１；Ｓｕｔｔｌｅｓら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：５８３５−５８４２；Ａｖｉｃｅら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２７４８−２７５３；Ａｒｍａｎｔら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４８６８−４８７５；Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏら（２０００、印刷中）、Ｂｌｏｏｄ）。膜関連ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βは、ヒト線維芽細胞／滑膜細胞又は微小血管内皮細胞での刺激されたＴ細胞によって誘導される刺激プロセスにおける重要な役割とは異なって、この細胞相互作用では決定的な役割を果たさない（Ｂｕｒｇｅｒら、１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４１：１７４８−１７５９；Ｌｏｕら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３１０７−３１１３；Ｂｕｒｇｅｒら、１９９８、Ｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　１１１−１２８）。
【０００６】
単球又は単球性細胞（ＴＨＰ−１細胞）のＴ細胞シグナル伝達によって誘導されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１β産生へのヒト血清分画の阻害活性を評価する際に、発明者は、アポ−Ａ−１が血清阻害因子であることを認めた。この所見は、単球又は単球性細胞のＴ細胞シグナル伝達に関わる疾患及び状態の治療のための新しい組成物と方法の開発を促進する。
【０００７】
一部の実施形態に従えば、本発明は、Ｔ細胞を介した単球の活性化を調節するポリペプチド及びそれをコードする核酸分子を提供する。他の実施形態に従えば、本発明は、Ｔ細胞を介した単球の活性化に関わる疾患及び状態の治療と診断のための方法を提供する。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、アポ−Ａ−１（配列番号２）及びその断片と誘導体に関する組成物、工程及び使用方法、ならびにＴ細胞を介した単球の活性化を調節する上でのそれらの使用を提供する。一部の実施形態に従えば、本発明は、基本的に、
（ａ）配列番号１の残基７３から６０１に示すようなヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基２５から１９４に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１の残基７３から４５１に示すようなヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２の残基２５から１４４に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１の残基４８５から８２０に示すようなヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号２の残基２５から１１３に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号２の残基７３から１１３に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号２の残基１５６から２６７に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）中又は高ストリンジェンシー条件下で（ａ）から（ｆ）までの少なくとも１つの補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つヌクレオチド配列；及び
（ｊ）（ａ）から（ｈ）の少なくとも１つに相補的なヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列から成る単離核酸分子に関する。
【０００９】
他の一部の実施形態では、本発明は、基本的に、
（ａ）配列番号２の残基２５から１９４に示すようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の残基２５から１４４に示すようなアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２の残基１５６から２６７に示すようなアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２の残基２５から１１３に示すようなアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２の残基７５から１１３に示すようなアミノ酸配列；
（ｆ）コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、配列番号２のオーソローグについてのアミノ酸配列；
（ｇ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも約７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列；
（ｈ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも約２５個のアミノ酸残基を含む（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）の少なくとも１つに示すアミノ酸配列の断片；
（ｉ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、（ａ）から（ｆ）の少なくとも１つの対立遺伝子変異体又はスプライス変異体についてのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列から成る単離ポリペプチドに関する。
【００１０】
本発明は、一部の実施形態では、アポ−Ａ−１フラグメントＴ細胞活性化因子（「ＡＦＴＩ」）である、配列番号２の残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７に示すポリペプチドフラグメント及び関連ポリペプチドに関する。一部の実施形態では、本発明のＡＦＴＩは、配列番号２の残基番号２５から始まり、配列番号２に示すポリペプチドの１３キロダルトン（ｋＤａ）又は１８ｋＤａのフラグメントを含む、アポ−Ａ−１のＮ末端フラグメントを含むが、これに限定されない。他の一部の実施形態では、本発明のＡＦＴＩは、配列番号２の最後のアミノ酸残基で終わり、配列番号２に示すポリペプチドの１３ｋＤａのフラグメントを含む、アポ−Ａ−１のＣ末端フラグメントを含むが、これに限定されない。
【００１１】
一部の実施形態では、本発明はさらに、
（ａ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を備えた、配列番号２に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７；
（ｂ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個のアミノ酸挿入を備えた、配列番号２に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７；
（ｃ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個のアミノ酸欠失を備えた、配列番号２に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７；
（ｄ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、Ｃ及び／又はＮ末端トランケーションを有する、配列番号２、又は配列番号２の残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７に示すようなアミノ酸配列；及び
（ｅ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、及びＮ末端トランケーションから成る群より選択される少なくとも１つの修飾を備えた、配列番号２に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を備えた、配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個のアミノ酸挿入を備えた、配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個のアミノ酸欠失を備えた、配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、Ｃ及び／又はＮ末端トランケーションを有する、配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、及びＮ末端トランケーションから成る群より選択される少なくとも１つの修飾を備えた、配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）少なくとも約１６個のヌクレオチドの断片を含む、（ａ）から（ｆ）のヌクレオチド配列；
（ｈ）コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、中又は高ストリンジェンシー条件下で（ａ）−（ｇ）のいずれかの補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｉ）（ａ）から（ｆ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。
【００１３】
一部の実施形態では、本発明は、ここで述べるような単離核酸分子を含む発現ベクター、ここで述べるような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、及び宿主細胞を培養し、任意にそのようにして生成したポリペプチドを単離することを含む、ＡＦＴＩポリペプチドを生成する方法を提供する。
【００１４】
ＡＦＴＩポリペプチドをコードする構築された核酸分子を含むヒト以外のトランスジェニック動物が本発明の一部の実施形態によって提供される。一部の実施形態では、動物（例えば血流）における高いレベルのＡＦＴＩポリペプチドを含みうる、ＡＦＴＩポリペプチドの発現、好ましくは高いレベルの発現を可能にするように、ＡＦＴＩ核酸分子を動物に導入する。一部の実施形態に従えば、ヒト以外のトランスジェニック動物は、哺乳類、例えばげっ歯類、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、イヌ、ネコ、等々でありうる。
【００１５】
また一部の実施形態では、本発明のＡＦＴＩポリペプチドの誘導体が提供される。
【００１６】
さらに一部の実施形態では、本発明のＡＦＴＩポリペプチドに特異的に結合することができる抗体及びペプチドのような選択結合物質が提供される。そのような抗体及びペプチドはアゴニストまたは、アンタゴニストでありうる。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び／又は選択結合物質と、１又はそれ以上の製薬上許容される製剤物質を含む製薬組成物も、本発明の一部の実施形態に包含される。一部の実施形態では、製薬組成物を使用して、治療上又は診断上有効な量の本発明のヌクレオチド又はポリペプチドを提供する。本発明は、一部の実施形態に従えば、ポリペプチド、核酸分子、及び選択結合物質を使用する方法に関する。
【００１８】
一部の実施形態に従えば、本発明のＡＦＴＩポリペプチド及び核酸分子は、ここで列挙するものを含めた疾患及び障害を治療し、予防し、改善し、及び／又は検出するために使用しうる。
【００１９】
一部の実施形態に従えば、本発明は、ＡＦＴＩポリペプチドに結合する試験分子を同定するために試験分子を評価する方法を提供する。一部の実施形態に従えば、該方法は、試験分子にＡＦＴＩポリペプチドを接触させ、試験分子がポリペプチドに結合する度合を測定することを含む。一部の実施形態に従えば、該方法は、そのような試験分子がＡＦＴＩポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを測定することを含む。一部の実施形態に従えば、本発明はさらに、ＡＦＴＩポリペプチドの発現又はＡＦＴＩポリペプチドの活性への分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２０】
ＡＦＴＩポリペプチドの発現を調節し、レベルを変化させる（すなわち上昇又は低下させる）方法も、本発明の一部の実施形態に包含される。一部の方法は、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与することを含む。もう１つの方法では、ＡＦＴＩポリペプチドの発現を調節する又は変化させる要素を含む核酸分子を投与することができる。これらの方法の例は、ここでさらに述べるような遺伝子治療、細胞療法、及びアンチセンス療法を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明の一部の実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチドはＡＦＴＩレセプタを同定するために使用しうる。様々な形態の「発現クローニング」が、タンパク質リガンドについてのレセプタをクローニングするために広汎に使用されてきた。例えば、Ｈ．ＳｉｍｏｎｓｅｎとＨ．Ｆ．Ｌｏｄｉｓｈ，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５巻、４３７−４４１（１９９４）、及びＴａｒｔａｇｌｉａら、Ｃｅｌｌ，８３：１２６３−１２７１（１９９５）参照。一部の実施形態では、ＡＦＴＩレセプタの単離は、ＡＦＴＩポリペプチドシグナル伝達経路の新規アゴニスト及びアンタゴニストを同定する又は開発するために有用である。そのようなアゴニスト及びアンタゴニストは、可溶性ＡＦＴＩレセプタ、抗ＡＦＴＩレセプタ選択結合物質（抗体及びその誘導体など）、小分子、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されず、そのいずれもが、ここで列挙するものを含めた１又はそれ以上の疾患又は障害を治療するために使用できる。
【００２２】
（図面の簡単な説明）
図１：（Ａ）ヒトアポリポタンパク質Ａ−１のアミノ酸配列（配列番号２）とポリヌクレオチド配列（配列番号１）。アポ−Ａ−１ポリペプチドは、らせん脂質結合ドメイン（アミノ酸残基４４−６５及び２２０−２４１）、単球からのリポタンパク質媒介のコレステロール流出に関与するドメイン（アミノ酸残基７４−１１１）、レセプタ結合ドメイン（アミノ酸残基１４９−２１９）、主要抗原エピトープドメイン（アミノ酸残基９９−１２０）、ヒンジドメイン（アミノ酸残基９９−１４３）、系統発生的に保存されたドメイン（アミノ酸残基６６−１２０）、及びレクチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性に関与するドメイン（アミノ酸残基９０−１１１）を持つ。アポ−Ａ−１ポリペプチドは、８個の両親媒性らせん（アミノ酸残基４４−６５、６６−９８、９９−１２０、１２１−１４２、１４３−１６４、１６５−２０８、２０９−２１９、２２−２４１）、Ｎ末端ペプチド（アミノ酸残基１−４３）、及びＣ末端ペプチド（アミノ酸残基２４２−２４３）を備える。ＡＦＴＩのアミノ酸配列は、配列番号２のフラグメント、例えば（Ｂ）１８ｋＤａのＮ末端フラグメント（アミノ酸残基２５から１９４、ヌクレオチド９２−６０１）、（Ｃ）１３ｋＤａのＮ末端フラグメント（アミノ酸残基２５から１４４、ヌクレオチド９２−４５１）、及び（Ｄ）１３ｋＤａのＣ末端フラグメント（アミノ酸残基１５６から２６７、ヌクレオチド４８５−８２０）を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
図２：ヒト血清は、ＰＨＡで刺激したＰＢＭＣにおいてＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの産生を阻害する。ＰＢＭＣ（４×１０^５細胞／２００μｌ／穴）を、ＦＣＳ又はＨＳを含む培地中１μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激した。（Ａ）４８時間インキュベーションした後、上清中のＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した；（Ｂ）７２時間後に増殖（^３Ｈ−チミジンの組込み）を測定した。
【００２４】
図３：ＨＳによる単球及びＴＨＰ−１細胞のＴ細胞シグナル伝達の阻害。（Ａ）ＴＨＰ−１細胞を、漸増用量のＨＳ（ＨＳ、黒い記号）又はＦＣＳ（白い記号）の存在下に８Ｔリンパ球／ＴＨＰ−１細胞の細胞比で、固定して刺激したＴリンパ球によって４８時間活性化した。（Ｂ）ＴＨＰ−１細胞を、漸増用量のＨＳの存在下に８ＨＵＴ−７８細胞／ＴＨＰ−１細胞の細胞比で固定して刺激したＨＵＴ−７８細胞（黒い記号）又は１０μｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）と５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（白い記号）のいずれかによって４８時間活性化した。ＴＨＰ−１細胞（ＣとＤ）及び単球（ＥとＦ）を、１０％ＨＳの存在下又は不在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞から分離した漸増用量の膜によって４８時間活性化した。ＴＮＦ−α（ＣとＥ）及びＩＬ−１β（ＤとＦ）を培養上清で測定した。結果は平均±ＳＤで表しており、（Ｂ）を除いてｎ＝３であり、（Ｂ）ではｎ＝７である。ＡとＢでは、１００％は、阻害因子なしで４８時間培養した後のＩＬ−１βの産生を表わす。
【００２５】
図４：ＨＳの連続クロマトグラフィー分別のＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００溶出プロフィールとＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ａ）Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰから溶出した阻害性分画をプールし、濃縮して、ＰＢＳ中で平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００でのゲルろ過に供した。カラムはゲルろ過クロマトグラフィー用分子量マーカーキット（Ｓｉｇｍａ）で検定した。分画をタンパク質含量（ＯＤ_{２８０ｍｍ}、点線）及び阻害活性（黒丸）に関して試験した。（Ｂ）各段階後に阻害性分画をプールし、１０％ポリアクリルアミドゲル上のレーンごとに１０μｇのタンパク質アリコートを充填した；（ａ）ＨＳ；（ｂ）Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）の漏出点；（ｃ）Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）からの阻害性分画のプール；（ｄ）Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　ＨＰからの阻害性分画のプール；（ｅ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）　２００からの阻害性分画のプール；ゲルはクマシーブルーで染色した。
【００２６】
図５：ＨＤＬのタンパク質分画における阻害活性の存在。ＨＳを高密度遠心分離によって分別し、ＨＤＬと血清タンパク質分画の阻害活性を分析した。単離したＨＤＬをさらに脱脂（脱脂ＨＤＬ）又はプロテイナーゼＫによるタンパク質分解消化（プロテイナーゼＫ処理ＨＤＬ）に供した。分画の阻害活性をＨＳ（全血清）と比較した。全血清と血清タンパク質についての最終タンパク質濃度は７ｍｇ／ｍｌ（黒い柱）、３．５ｍｇ／ｍｌ（灰色の柱）、及び０．７ｍｇ／ｍｌ（白い柱）であった。ＨＤＬと脱脂ＨＤＬの最終タンパク質濃度は０．２ｍｇ／ｍｌ（黒い柱）、０．１ｍｇ／ｍｌ（灰色の柱）、及び０．０２ｍｇ／ｍｌ（白い柱）であった。プロテイナーゼＫ処理ＨＤＬの量はタンパク質分解前のタンパク質濃度に従って評価し、未処理ＨＤＬと同様であった。結果は、阻害因子なしでのＩＬ−１又はβＴＮＦ−α酸性のパーセンテージを表わす（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【００２７】
図６：細胞へのＨＤＬ結合の分析。（Ａ）刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜へのＨＤＬの結合によるＴ細胞シグナル伝達の阻害；刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜（白い柱）、ＴＨＰ−１細胞（斜線の柱）、又は両方（黒い柱）を、ＦＣＳ（１０％）、ＨＳ（１０％）又はＨＤＬ（０．３２ｍｇ／ｍｌタンパク質）の不在下（−）又は存在下に氷上で４５分間プレインキュベートした；洗浄後、処理（斜線の柱と黒い柱）及び未処理（白い柱）ＴＨＰ−１細胞を、処理した（白い柱と黒い柱）又は処理していない（斜線の柱）刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜の存在下で培養した；４８時間培養した培養上清においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を測定した。結果は、阻害因子なしで測定した産生を１００％としたパーセンテージで表しており、平均±ＳＤ、ｎ＝６である。（Ｂ−Ｆ）非複合ＦＩＴＣとＦＩＴＣ−ＨＤＬ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の結合を、ＴＨＰ−１細胞（Ｂ）、単離したヒト単球（Ｃ）、刺激していないＨＵＴ−７８細胞（Ｄ）及び刺激したＨＵＴ−７８細胞（Ｅ）に関してフローサイトメトリーによって評価した。ＦＩＴＣを陰性対照として使用した。（Ｆ）精製抗アポ−Ａ−１抗体（１００μｇ／ｍｌ）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ番号ＨＢ−９５７０）の存在下又は不在下でのＦＩＴＣ−ＨＤＬ（１０μｇ／ｍｌ）の刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜への結合。
【００２８】
図７：アポ−Ａ−１は、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化したＴＨＰ−１細胞においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を阻害する。（Ａ）ＴＨＰ−１細胞を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した漸増濃度のアポ−Ａ−１の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した；４８時間後、培養上清中でＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３を表している。（ＢとＣ）ＴＨＰ−１細胞を、脱脂ＨＤＬの分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥから電気溶出した漸増濃度のタンパク質の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した：（Ｂ）（Ｍ_ｒ＝２８，０００及び（Ｃ）（Ｍ_ｒ＝１８，０００。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　Ｓ７５でのゲルろ過によって分離した漸増濃度のアポ−Ａ−１（Ｍ_ｒ＝２８，０００）の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した。４８時間後、培養上清中でＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３を表し、１００％は阻害因子なしで産生されたサイトカインの量である。（Ｅ）阻害活性について試験した単離分画を、ウエスタンブロット法によってアポ−Ａ−１含量に関して分析した；（ａ）２８，０００の電気溶出したバンド、（ｂ）１８，０００の電気溶出バンド、及び（ｃ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）Ｓ７５ゲルろ過から回収された２８，０００タンパク質。
【００２９】
図８：アポ−Ａ−１はＴＮＦ−αとＩＬ−１β　ｍＲＮＡの定常状態レベルを低下させる。（ＡとＢ）ＲＮアーゼプロテクションアッセイのオートラジオグラム。（Ａ）未処理（ａ）又はＴＨＰ−１活性化の種々の時点で加えたアポ−Ａ−１（２００μｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下に（ｃ−ｅ）、３時間、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜（２００μｇタンパク質／ｍｌ）によって活性化した（ｂ−ｅ）、ＴＨＰ−１細胞（５×１０^６細胞／ｍｌ）：ｃ（０時間）；ｄ（１時間）；及びｅ（２時間）。（Ｂ）未処理（ａ）又はＴＨＰ−１活性化の種々の時点で加えたアポ−Ａ−１（２００μｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下に（ｃ−ｅ）、１時間、刺激Ｔリンパ球の膜（４０μｇタンパク質／ｍｌ）によって活性化した、（ｂ−ｅ）単球（１０×１０^６細胞／ｍｌ）：ｃ（０分）；ｄ（１５分）；及びｅ（３０分）。（ＣとＤ）ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ＝１のデンシトメトリーで基準化し、阻害因子なしでの活性化ＴＨＰ−１細胞（Ｂ）又は単球（Ｃ）のｍＲＮＡレベルを１００％としたパーセンテージで表した、それぞれオートラジオグラフィーＡとＢのデンシトメトリー分析。結果は３つの異なる実験を代表している。
【００３０】
図９：アポ−Ａ−１は、ＰＨＡ又は破傷風トキソイド（ＴＴ）によって刺激したＰＢＭＣ中のＴＮＦ−αとＩＬ−１βを阻害する。ＰＢＭＣ　４×１０^５細胞／２００μｇ／穴を、指示されている用量のアポ−Ａ−１とＨＤＬの存在下に１μｇ／ｍｌのＰＨＡ（ＡとＢ）又は１０μｇ／ｍｌのＴＴ（ＣとＤ）によって刺激した。
【００３１】
図１０：組換えヒトアポ−Ａ−１Ｍｉｌａｎｏは阻害作用を示す。ＴＨＰ−１細胞を、ヒト血清（ＨＳ）の連続希釈、Ｓｉｇｍａからのアポリポタンパク質Ａ−１（出発濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）、及び組換えアポリポタンパク質Ａ−１Ｍｉｌａｎｏ（出発濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）の存在下に、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜で刺激した。両アポリポタンパク質（精製及び組み換え）は、阻害作用を表示する。
【００３２】
図１１：アポ−Ａ−ＩＩ及びアポ−Ａ−１のフラグメントによるＴＨＰ−１細胞の接触媒介活性化の阻害。ＴＨＰ−１細胞を、指示されている阻害因子の存在下に、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜（ＨＵＴ）によって活性化した。アポ−Ａ−１、アポ−Ａ−ＩＩ及びアポ−Ａ−１のドメインＩＩ及びＩＩＩを含むフラグメントによってＩＬ−１βとＴＮＦ−αの両方の産生が阻害された。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
ここで使用する章の目次は単に構成上の目的だけのためであって、記述する主題を限定するものと解釈すべきではない。この出願の中で引用するすべての参考文献は、あらゆる目的のためにその全体が参照してここに明白に組み込まれるが、但しそのような組み込みがここで提供する意味とは異なる語を定義する場合を除く。
【００３４】
定義
「ＡＦＴＩ遺伝子」又は「ＡＦＴＩ核酸分子」又は「ＡＦＴＩポリヌクレオチド」の語は、配列番号１に示すようなヌクレオチド配列又はその何らかのセグメント、配列番号２に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はその何らかのフラグメントを指す。
【００３５】
「ＡＦＴＩポリペプチド」の語は、配列番号２のアミノ酸配列を持つポリペプチド、又はその何らかのフラグメント、及び関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドは、ＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体、ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ、ＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体、ＡＦＴＩポリペプチド変異体、及びＡＦＴＩポリペプチド誘導体を含む。ＡＦＴＩポリペプチドはここで定義するような成熟ポリペプチドであってもよく、また調製する方法に依存して、アミノ末端のメチオニン残基を有しているか又は有していなくてもよい。
【００３６】
「ＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体」の語は、生物又は生物個体群の染色体上の所与の座を占める遺伝子の、いくつかの又は多くの可能な天然に生じる代替形態の１つを指す。
【００３７】
「ＡＦＴＩポリペプチド誘導体」の語は、配列番号２に示すポリペプチドのポリペプチドフラグメント、ＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体、ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ、ＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体、又は化学修飾された、ここで定義するようなＡＦＴＩポリペプチド変異体を指す。
【００３８】
「ＡＦＴＩポリペプチドフラグメント」の語は、ここで述べるＡＦＴＩポリペプチドのアミノ末端（リーダー配列を含む又は含まない）にトランケーション及び／又はカルボキシ末端にトランケーションを有するポリペプチド、ＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体、ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ、ＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体及び／又はここで特定して述べるＡＦＴＩポリペプチドアミノ酸配列と比較して１又はそれ以上のアミノ酸付加又は置換又は内部欠失（生じるポリペプチドは少なくとも６個のアミノ酸の長さである）を有するＡＦＴＩポリペプチド変異体を指す。ＡＦＴＩポリペプチドフラグメントは、例えば代替的ＲＮＡスプライシングから又はインビボでのプロテアーゼ活性から生じうる。好ましい実施形態では、トランケーションは約１０個のアミノ酸、又は約２０個のアミノ酸、又は約５０個のアミノ酸、又は約７５個のアミノ酸、又は約１００個のアミノ酸、又は約１００個以上のアミノ酸を含む。そのようにして生成されるポリペプチドフラグメントは約２５個の隣接アミノ酸、又は約５０個のアミノ酸、又は約７５個のアミノ酸、又は約１００個のアミノ酸、又は約１５０個のアミノ酸、又は約２００個のアミノ酸を含むであろう。一部の実施形態では、本発明のＡＦＴＩポリペプチドフラグメントは、６個のアミノ酸の長さからここで述べるポリペプチドまで、又はそれらの大きさの間のいずれかの数のアミノ酸である。そのようなＡＦＴＩポリペプチドフラグメントは任意にアミノ末端のメチオニン残基を含みうる。そのようなフラグメントは、例えばＡＦＴＩポリペプチドに対する抗体を作製するために使用できることは認識されるであろう。
【００３９】
「ＡＦＴＩ融合ポリペプチド」の語は、ＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩポリペプチドフラグメントのアミノ又はカルボキシ末端での１又はそれ以上のアミノ酸の融合（非相同ペプチド又はポリペプチドのような）を指す。従って、この語はここで特定して述べるポリペプチド、ＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体、ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ、ＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体、又はここで特定して述べるＡＦＴＩポリペプチドアミノ酸配列と比較して１又はそれ以上のアミノ酸欠失又は置換又は内部付加を有するＡＦＴＩポリペプチド変異体のいずれかの配列を持つ融合タンパク質を含む。
【００４０】
「ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ」の語は、ここで特定して述べるＡＦＴＩポリペプチドアミノ酸配列に対応するもう１つ別の種からのポリペプチドを指す。例えば、マウスとヒトのＡＦＴＩポリペプチドは互いのオーソローグとみなされる。
【００４１】
「ＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体」の語は、ここで特定して述べるＡＦＴＩポリペプチドに対応するＲＮＡ転写産物においてイントロン及び／又はエクソン配列の代替的プロセシング（例えば代替的スプライシング）によって生成される核酸分子、通常はＲＮＡによってコードされるＡＦＴＩポリペプチドを指す。
【００４２】
「ＡＦＴＩポリペプチド変異体」の語は、ここで特定して述べるＡＦＴＩポリペプチドアミノ酸配列（リーダー配列を含む又は含まない）と比較して１又はそれ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば内部欠失及び／又はＡＦＴＩポリペプチドフラグメントのような）、及び／又は付加（例えば内部付加及び／又はＡＦＴＩ融合ポリペプチドのような）を有するアミノ酸配列を含むＡＦＴＩポリペプチドを指す。変異体は、天然に生じるか（例えばＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体、ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ及びＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体）又は人工的に構築されてもよい。そのようなＡＦＴＩポリペプチド変異体は、対象とするＡＦＴＩをコードする配列番号１に示すようなＤＮＡ配列から、それに応じて変化するＤＮＡ配列を備えた対応核酸分子から調製しうる。好ましい実施形態では、変異体は１から１０、又は１から１５、又は１から２０、又は１から２５、又は１から５０、又は１から７５、又は１から１００、又は１００個以上のアミノ酸の置換、挿入、付加及び／又は欠失を持ち、置換は保存的、又は非保存的、又はその何らかの組合せでありうる。
【００４３】
「抗原」の語は、抗体のような選択結合物質によって結合することができ、さらにその抗原のエピトープに結合することができる抗体を作製するために動物において使用できる分子又は分子の部分を指す。抗原は１又はそれ以上のエピトープを有しうる。
【００４４】
「生物学的に活性なＡＦＴＩポリペプチド」の語は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの特徴を示す少なくとも１つの活性を備えたＡＦＴＩポリペプチドを指す。
【００４５】
「有効量」及び「治療上有効な量」の語は、各々ここで述べるようなＡＦＴＩポリペプチドの１又はそれ以上の生物活性の著明なレベルを支持するために使用されるＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ核酸分子の量を指す。
【００４６】
「発現ベクター」の語は、宿主細胞での使用に適し、非相同核酸配列の発現を指令及び／又は制御する１又はそれ以上の核酸配列を含むベクターを指す。発現は、転写、翻訳、及びＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のような１又はそれ以上のプロセスを含むが、これらに限定されない。
【００４７】
「宿主細胞」の語は、トランスフェクションした又は形質転換した細胞、あるいは対象とする核酸配列でトランスフェクション又は形質転換することができ、対象とする核酸（又は対象とする核酸のセグメント）を発現することができる細胞を指す。かかる語は、子孫が形態又は遺伝的性質に関して元の親と同じであるかどうかに関わらず、対象とする核酸が存在する限り、親細胞の子孫を含む。
【００４８】
当該技術において既知であるような「同一性」の語は、配列を比較することによって決定したときの、２又はそれ以上のポリペプチド分子あるいは２又はそれ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当該技術では、「同一性」はまた、２又はそれ以上のヌクレオチド残基あるいは２又はそれ以上のアミノ酸残基のストリング間の対合の数によって決定したときの、場合に応じて核酸分子間又はポリペプチド間の配列関連性の度合を意味する。「同一性」は、特定の数理モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって取り上げたギャップ整列（存在する場合）による２又はそれ以上の配列の小さいほうの間の同一対合のパーセントを測定する。
【００４９】
「類似性」の語は関連する概念であるが、「同一性」と異なって、同一対合と保存的置換対合の両方を含む配列関係を指す。２個のポリペプチド配列が、例えば１０／２０の同一アミノ酸を持ち、残りがすべて非保存的置換である場合、パーセント同一性と類似性はいずれも５０％である。同じ例で、保存的置換が存在する位置がさらに５個ある場合には、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％となる（１５／２０）。それ故、保存的置換が存在する場合には、２個のポリペプチド間の類似性の度合はそれら２個のポリペプチド間のパーセント同一性よりも高くなる。
【００５０】
「単離核酸分子」の語は、（１）天然に結合しているタンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質（すなわち夾雑物）の少なくとも約５０％から分離されている、（２）「単離核酸分子」が天然の状態では共有結合しているポリヌクレオチドの全部又は一部に共有結合していない、（３）天然の状態では結合していないポリヌクレオチドに作動可能に共有結合している、又は（４）天然の状態では、より大きなポリヌクレオチド配列の部分としては生じない、本発明の核酸分子を指す。好ましくは、本発明の単離核酸分子は、ポリペプチドの生産又はその治療、診断、予防又は研究用途における使用に干渉する、その天然環境において認められる他の何らかの夾雑核酸分子又は他の夾雑物から実質的にフリーである。
【００５１】
「単離ポリペプチド」の語は、（１）天然に結合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物又は他の物質（すなわち夾雑物）の少なくとも約５０％から分離されている、（２）「単離ポリペプチド」が天然の状態で共有結合しているポリペプチドの全部又は一部に共有結合していない、（３）天然の状態出は結合していないポリペプチドに作動可能に共有結合している、又は（４）天然の状態出は生じない、本発明のポリペプチドを指す。好ましくは、単離ポリペプチドは、ポリペプチドの生産又はその治療、診断、予防又は研究用途に干渉する、その天然環境において認められる他の何らかの夾雑ポリペプチド又は他の夾雑物から実質的にフリーである。
【００５２】
「核酸配列」又は「核酸分子」の語は、少なくとも２個のヌクレオチドの重合体を指す。そのようなヌクレオチドは、天然に生じるすべてのヌクレオチド及びすべての合成ヌクレオチドを含む。そのようなヌクレオチドは、例えば、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかから形成されうる。
【００５３】
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞、等のような生物学的物質に関連して使用するとき「天然に生じる」又は「天然の」の語は、天然の状態で認められ、人間によって操作（すなわち設計又は構築）されていない物質を指す。同様に、ここで使用するとき「非天然に生じる」又は「非天然の」は、天然の状態では認められない、又は人間によって構造的に改変された又は合成された物質を指す。
【００５４】
「作動可能に連結された」の語は、ここでは、そのように記述されたフランキング配列がそれらの通常の機能を実施するように立体配置又は構築されているフランキング配列の配置を表わすために使用される。従って、コード配列に作動可能に連結されたフランキング配列は、コード配列の複製、転写及び／又は翻訳を生じさせることができる。例えば、プロモーターがコード配列の転写を指令することができるとき、コード配列はプロモーターに作動可能に連結されている。フランキング配列は、それが正しく機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。それ故、例えば、まだ転写されていない介在非翻訳配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在することが可能であり、それでもやはりプロモーター配列はコード配列に「作動可能に連結されている」とみなすことができる。
【００５５】
ここで使用するとき「製薬上許容される担体」又は「生理的に許容される担体」の語は、ＡＦＴＩポリペプチド、ＡＦＴＩ核酸分子又はＡＦＴＩ選択結合物質の製薬組成物としての供給送達を実現する又は促進するのに適した１又はそれ以上の製剤物質を指す。
【００５６】
「選択結合物質」の語は、ＡＦＴＩポリペプチドに特異性を持つ１又はそれ以上の分子を指す。ここで使用するとき、「特異的」及び「特異性」の語は、選択結合物質がヒトＡＦＴＩポリペプチドに結合し、ヒトの非ＡＦＴＩポリペプチドには結合しない能力を指す。しかし、選択結合物質はまた、配列番号２に示すようなポリペプチドのオーソローグ、すなわちマウスとラットのポリペプチドのような、その種間バージョンにも結合しうる。
【００５７】
「形質導入」の語は、通常はファージによる、１つの細菌から他の細菌への遺伝子の転移を指すために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得と転移も表わす。
【００５８】
「トランスフェクション」の語は、細胞による異種又は外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたときに細胞は「トランスフェクションされた」ことになる。多くのトランスフェクション手法が当該技術において既知であり、ここで開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、「分子生物学における基本的方法（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６；及びＣｈｕら、Ｇｅｎｅ、１３：１９７（１９８１）参照。そのような手法を使用して、１又はそれ以上の外来ＤＮＡ分子を適当な宿主細胞に導入することができる。
【００５９】
ここで使用するとき「形質転換」の語は細胞の遺伝的性質の変化を指し、細胞が新しいＤＮＡを含むように改変されたとき、その細胞は形質転換されたことになる。例えば、細胞がその天然の状態から遺伝的に修飾される場合、細胞は形質転換される。トランスフェクション又は形質導入後、形質転換ＤＮＡは、物理的に細胞の染色体に組み込むことによってその細胞のＤＮＡと組み換えるか、複製されることなくエピソーム要素として一過性に維持するか、又はプラスミドとして独立して複製することができる。ＤＮＡが細胞の***によって複製されるとき、細胞は安定に形質転換されたとみなされる。
【００６０】
「ベクター」の語は、コード情報を宿主細胞に転移するために使用される何らかの分子（例えば核酸、プラスミド、又はウイルス）を指すために使用される。
【００６１】
核酸分子及び／又はポリペプチドの関連性
関連核酸分子が配列番号１の核酸分子の対立遺伝子又はスプライス変異体又はその断片を含むこと、及び上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的な配列を含むことは明白である。関連核酸分子はまた、ここで述べるポリペプチド、例えば配列番号のポリペプチドと比較して１又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、修飾、付加及び／又は欠失を含む、又は基本的にそれから成る、又はそれから成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
フラグメントは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも約２５個のアミノ酸残基、又は約５０個、又は約７５個、又は約１００個、又は約１００個以上のアミノ酸残基のポリペプチドをコードする分子を含む。
【００６３】
さらに、関連ＡＦＴＩ核酸分子は、ここで定義するような中ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１の核酸分子、又は配列番号２に示すようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子、又はここで定義するような核酸フラグメント、又はここで定義するようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントに完全に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を包含する。ハイブリダイゼーションプローブは、関連配列に関してｃＤＮＡ、ゲノム又は合成ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、ここで提供するＡＦＴＩ配列に基づいて調製しうる。ここで述べるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて、既知の配列と有意の同一性を示すＡＦＴＩ　ＤＮＡの領域及び／又はＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列が容易に決定され、それらの領域はスクリーニングのためのプローブを設計するために使用しうる。
【００６４】
「高ストリンジェンシー条件」の語は、配列が高度に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、有意に不正対合ＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主として温度、イオン強度、及びホルムアミドのような変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションと精製のための「高ストリンジェンシー条件」は、６５から６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、又は４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、及び５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、「核酸ハイブリダイゼーション：実際的アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｃｈ．４，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）参照。
【００６５】
よりストリンジェントな条件（より高い温度、低いイオン強度、ホルムアミド又は他の変性剤の高い濃度）も使用しうるが、ハイブリダイゼーションの速度に影響する。非特異的及び／又はバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減するために、ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液中に他の物質を含めてもよい。その例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ_４又はＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、音波破砕サケ***ＤＮＡ（又は他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランであるが、他の適当な物質も使用できる。これらの添加物の濃度と種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響することなく変化させることができる。ハイブリダイゼーション実験は通常ｐＨ６．８から７．４で実施されるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度はｐＨとほとんど無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎｎら、「核酸ハイブリダイゼーション：実際的アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｃｈ．４，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）参照。
【００６６】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を及ぼす因子は、塩基組成物、長さ、及び塩基対の不正対合の度合を含む。これらの変数を適応させて、様々な配列関連性のＤＮＡにハイブリッドを形成させるために、当業者はハイブリダイゼーション条件を調節することができる。完全に適正なＤＮＡ二重鎖の融解温度は次の等式によって算定することができる：
Ｔ_ｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
［式中、Ｎは形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ^＋］はハイブリダイゼーション又は洗浄液中のナトリウムイオンの盛る濃度であり、％Ｇ＋Ｃはハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）のパーセンテージである。不完全な対合のハイブリッドについては、各々１％の不正対合について融解温度が約１℃低下する。
【００６７】
「中ストリンジェンシー条件」の語は、「高ストリンジェンシー条件」下で形成されうるＤＮＡ二重鎖よりも大きな度合の塩基対不正対合を持つＤＮＡ二重鎖が形成されうる条件を指す。典型的な「中ストリンジェンシー条件」の例は、５０から６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、又は３７から５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、及び２０％ホルムアミドである。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中５０℃の「中ストリンジェンシー」条件は、約２１％の不正対合を許容する。
【００６８】
「高」ストリンジェンシーと「中」ストリンジェンシー条件の間に絶対的な区別がないことは当業者に認識されるであろう。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオンでは（ホルムアミドなし）、完全に適正な長いＤＮＡの融解温度は約７１℃である。６５℃で洗浄すると（同じイオン強度で）、これは約６％の不正対合を許容することになる。より関連性の低い配列を捕獲するためには、当業者は単に温度を下げるか又はイオン強度を上げればよい。
【００６９】
次の式により、約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについて１Ｍ　ＮａＣｌ^＊中で融解温度の良好な算定が得られる：
Ｔ_ｍ＝Ａ−Ｔ塩基対につき２℃＋Ｇ−Ｃ塩基対につき４℃
６Ｘ塩類クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のナトリウムイオン濃度は１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら、「精製遺伝子を用いた発生生物学（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇ　ｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ）」ｐ．６８３、Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｆｏｘ（編集）（１９８１）参照。
【００７０】
オリゴヌクレオチドについての高ストリンジェンシー精製条件は、通常、６ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でオリゴヌクレオチドのＴｍより低い０−５℃の温度である。
【００７１】
もう１つの実施形態では、関連核酸分子は、配列番号１に示すようなヌクレオチド配列と約７０％同一であるヌクレオチド配列を含む、又は基本的にそれらから成る、又はそれらから成るか、若しくは配列番号２に示すようなポリペプチドと約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、又は基本的にそれから成る、又はそれから成る。一部の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示すようなヌクレオチド配列と約７５％、又は約８０％、又は約８５％、又は約９０％、又は約９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるか、若しくはヌクレオチド配列は、配列番号２に示すようなポリペプチド配列と約７５％、又は約８０％、又は約８５％、又は約９０％、又は約９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるポリペプチドをコードする。
【００７２】
核酸配列の相違は、配列番号２のアミノ酸配列に比べてアミノ酸配列の保存的及び／又は非保存的修飾を生じうる。
【００７３】
配列番号２のアミノ酸配列への保存的修飾（及びそのコードするヌクレオチドへの対応する修飾）は、天然に生じるＡＦＴＩポリペプチドのものに類似した機能的及び化学的特性を持つＡＦＴＩポリペプチドを生じる。これに対し、ＡＦＴＩポリペプチドの機能的及び／又は化学的特性における実質的修飾は、（ａ）例えばシート又はらせん構造のような、置換領域における分子バックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルクを維持することへの影響が有意に異なる、配列番号２のアミノ酸配列内の置換を選択することによって達成しうる。
【００７４】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷への影響がほとんどない若しくは全くないような、非天然残基による天然アミノ酸残基の置換を含みうる。さらに、ポリペプチド内のいずれかの天然残基はまた、「アラニン走査突然変異誘発」について以前に記述されたように（例えばアラニン走査突然変異誘発を論じている、ＭａｃＬｅｎｎａｎら、１９８８、Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉら、１９９８、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４参照）、アラニンで置換されうる。
【００７５】
所望するアミノ酸置換（保存的又は非保存的）は、そのような置換を所望する時点で当業者によって決定されうる。例えば、アミノ酸置換は、ＡＦＴＩポリペプチドの重要な残基を同定するため、又はここで述べるＡＦＴＩポリペプチドの親和性を高める又は低下させるために使用できる。例示的なアミノ酸置換を表Ｉに示す。
【００７６】
【表１】

【００７７】
一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換はまた、典型的には生物系における合成によってではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然に生じるアミノ酸残基を包含する。これらはペプチドミメティクス、及びアミノ酸部分の他の逆転（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）又は逆方向（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）形態を含む。
【００７８】
天然に生じる残基は、共通の側鎖特性に基づくクラスに分類することができる：
１）疎水性残基：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；　２）中性親水性残基：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性残基：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性残基：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
６）芳香族残基：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７９】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの１つの成員を別のクラスからの成員と交換することを含みうる。そのような置換された残基は、非ヒトＡＦＴＩポリペプチドオーソローグと相同なヒトＡＦＴＩポリペプチドの領域内又は分子の非相同領域内に導入することができる。
【００８０】
そのような交換を行う際には、アミノ酸の疎水親水指数を考慮しうる。各々のアミノ酸はそれらの疎水性と電荷特性に基づいて疎水親水指数が割り当てられており、それらは次の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００８１】
タンパク質に相互作用性の生物学的機能を付与する際のアミノ酸疎水親水指数の重要性は当該技術において理解されている。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。一部のアミノ酸が同様の疎水親水指数又はスコアを有する他のアミノ酸に置き換わって、それでもなお同様の生物活性を保持しうることが知られている。疎水親水指数に基づいて変更を行う際には、疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに一層好ましい。
【００８２】
また、同様のアミノ酸の置換は、特にそれによって創造される生物学的機能が等しいタンパク質又はペプチドが、本出願におけるように免疫学的実施形態における使用を意図されている場合は、親水性に基づいて有効に実施できることも当該技術において理解されている。タンパク質の最大局所平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるので、その免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
【００８３】
次のような親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づいて変更を行う際には、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに一層好ましい。親水性に基づく一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は「エピトープコア領域」という。
【００８４】
当業者は、既知の手法を用いて配列番号２に示すようなポリペプチドの適当な変異体を決定しうるであろう。活性を失わせずに変更しうる分子の適当な領域を同定するために、当業者は、活性にとって重要でないと考えられる領域を標的することができる。例えば、同じ種又は他の種からの同様の活性を持つ同様のポリペプチドが既知であるとき、当業者はＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をそのような同様のポリペプチドと比較することができる。そのような比較により、同様のポリペプチド間で保存される分子の残基及び部分を同定することができる。そのような同様のポリペプチドに比して保存されないＡＦＴＩポリペプチドの領域の変化は、ＡＦＴＩポリペプチドの生物活性及び／又は構造に有害な影響を及ぼす可能性が低いことは認識されるであろう。また、比較的保存された領域であっても、活性を保持しながら、天然に生じる残基を化学的に類似したアミノ酸に置換しうること（保存的アミノ酸残基置換）は当業者には既知であろう。それ故、生物活性又は構造にとって重要と考えられる領域であっても、生物活性を失わせずに、あるいはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼさずに、保存的アミノ酸置換に供しうると考えられる。
【００８５】
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要な同様のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能試験を検討することができる。そのように比較することで、同様のポリペプチド中の活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応する、ＡＦＴＩポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、ＡＦＴＩポリペプチドのそのような重要と予測されるアミノ酸残基の代わりに化学的に類似したアミノ酸置換基を選択することができる。
【００８６】
当業者はまた、同様のポリペプチドの構造について、三次元構造とアミノ酸配列を分析することができる。その情報により、当業者はその三次元構造に関するＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸残基の配列を予測しうる。当業者は、タンパク質の表面にあると予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与すると考えられるので、そのような残基に対してラジカルに変化させないものを選択するであろう。さらに、当業者は、各々の所望するアミノ酸残基における１個のアミノ酸置換を含む試験変異体を作製しうる。次に当業者に既知の活性アッセイを使用してかかる変異体をスクリーニングすることができる。そのような変異体は適当な変異体についての情報を収集するために使用できるであろう。例えば、活性の失活、活性の望ましくない低下、又は不適当な活性に起因する特定のアミノ酸残基の変化をもたらすことが発見された場合には、そのように変化した変異体は回避されるであろう。言い換えると、そのような常用実験から収集された情報に基づいて、当業者は、単独の又は他の突然変異と組み合わせたさらなる置換を回避するべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
【００８７】
多くの学術公表文献が二次構造の予測を対象としてきた。Ｍｏｕｌｔ　Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）参照。さらに、現在、二次構造を予測するのにコンピュータプログラムが使用できる。二次構造を予測する１つの方法はホモロジーモデリングに基づく。例えば、３０％以上の配列同一性又は４０％以上の類似性を有する２個のポリペプチド又はタンパク質は、しばしば類似した構造的トポロジーを持つ。最近、タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）が発達したことにより、ポリペプチド又はタンパク質構造内の折りたたみの潜在的な数を含めて、二次構造の予測可能性が高まっている。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）参照。所与のポリペプチド又はタンパク質内に限られた数の折りたたみが存在し、ひとたび重要な数の構造が解明されれば、構造予測の正確性が劇的に進歩するであろうと示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７（３）：３６９−３７６（１９９７）。
【００８８】
二次構造を予測するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−９（１９９６））、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、及び「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｍｅ、前出、及びＢｒｅｎｎｅｒ、前出参照）を含む。
【００８９】
関連核酸分子とポリペプチドの同一性及び類似性は既知の方法によって容易に算定できる。そのような方法は、「コンピュータ分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８８；「バイオコンピューティング：情報処理とゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９３；「配列データのコンピュータ解析、第一部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ　１）」、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９８７；「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ）」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．，４８：１９７３（１９８８）に述べられているものを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
同一性及び／又は類似性を決定するための好ましい方法は、検討する配列間で最大の対合を生じるように設計する。同一性及び類似性を決定する方法は公的に入手可能なコンピュータプログラムの中で述べられている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラムの方法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含めたＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ　Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ　２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）から公的に入手可能である。既知のＳｍｉｔｈ　Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用しうる。
【００９１】
２個のアミノ酸配列を整列するためのある種のアラインメントスキームは２個の配列の短い領域だけの対合を生じることがあり、この小さな整列領域は、２つの完全長配列間に有意の関係がない場合でも配列同一性が非常に高い場合がある。従って、好ましい実施形態では、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は標的ポリペプチドの少なくとも５０個の隣接アミノ酸配列に及ぶアラインメントを生じる。
【００９２】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、配列同一性パーセントを決定すべき２個のポリペプチドをそれらのそれぞれのアミノ酸の至適対合についてアラインメントする（アルゴリズムによって決定されるような対合スパン）。ギャップ開放ペナルティー（３Ｘ平均ダイアゴナル（ａｖｅｒａｇｅ　ｄｉａｇｏｎａｌ）として算定される；「平均ダイアゴナル」は使用する比較マトリックスの対角線の平均値である；「ダイアゴナル」は個々の比較マトリックスによって各々の完全なアミノ酸対合に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティー（通常はギャップ開放ペナルティーの１／１０）、ならびにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスをアルゴリズムと共に使用する。標準比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについてはＤａｙｈｏｆｆら、「タンパク質配列及び構造アトラス（Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、第５巻、補遺３（１９７８）参照；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）参照）もアルゴリズムによって使用される。
【００９３】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは次のものを含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性閾値：０
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータに関して有用である。上述したパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチド比較についてのデフォルトパラメータ（末端ギャップについてのペナルティーを伴わない）である。
【００９４】
核酸分子の配列比較のための好ましいパラメータは次のものを含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：対合＝＋１０、不正対＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータに関しても有用である。上述したパラメータは核酸分子比較についてのデフォルトパラメータである。
【００９５】
他の例示的なアルゴリズム、ギャップ開放ペナルティー、ギャップ伸長ペナルティー、比較マトリックス、類似性閾値、等々も、Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　９、１９９７年９月に示されているものを含めて、使用しうる。採用すべき個々の選択は当業者には明らかであり、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡなどの実施する特定の比較に依存し、またさらには、所与の配列対間での比較であるか（この場合は一般にＧＡＰ又はＢｅｓｔＦｉｔが好ましい）又は１個の配列と大きな配列データベースとの比較であるか（この場合はＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴＡが好ましい）にも依存するであろう。
【００９６】
好ましいＡＦＴＩポリペプチド変異体は、グリコシル化の数及び／又はタイプが配列番号２に示すアミノ酸配列に比べて変化しているグリコシル化変異体を含む。１つの実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチド変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列よりも多い又は少ない数のＮ−結合グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とし、式中、Ｘと称されるアミノ酸残基はプロリンを除くいずれのアミノ酸残基でもよい。この配列を創造するアミノ酸残基の置換は、Ｎ−結合糖鎖の付加のための潜在的な新しい部位を提供する。代替的に、この配列を除去する置換は存在するＮ−結合糖鎖を取り除くだろう。また、１又はそれ以上のＮ−結合グリコシル化部位（典型的には天然に生じるもの）が除去されて、１又はそれ以上の新しいＮ−結合部位が創造される、Ｎ−結合糖鎖の再配列も提供される。さらなる好ましいＡＦＴＩ変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列又はそのフラグメントと比較して１又はそれ以上のシステイン残基が欠失している又は別のアミノ酸（例えばセリン）に置き換わっている、システイン変異体を含む。システイン変異体は、不溶性封入体の単離後のようにＡＦＴＩポリペプチドを生物学的に活性なコンフォメーションに折りたたまなければならないときに有用である。システイン変異体は一般に天然タンパク質よりもシステイン残基の数が少なく、典型的には不対システインから生じる相互作用を最小限に抑えるため偶数の残基を持つ。
【００９７】
さらなるＡＦＴＩポリペプチド変異体は、ＡＦＴＩポリペプチド配列の修飾（例えば残基の挿入又は置換）によって脂質化部位が付加された脂質化変異体を含む。そのような分子については、配列番号２のタンパク質を、脂質化酵素によって認識されるアミノ酸又はモチーフ（例えばＣＡＡＸモチーフを含めて、ファルネシルトランスフェラーゼ及び／又はゲラニルゲラニルトランスフェラーゼによって認識されるモチーフ）を含むように突然変異させることができる。例えば、Ｆｕら、１９９９、Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．５４：３１５−３４２；Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３３：４９７−５０４；Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４３６３−２４３６８参照。当該技術において既知の他の脂質化手法も、本発明のＡＦＴＩポリペプチドを修飾するために使用できる。
【００９８】
さらに、配列番号２又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを相同なポリペプチドに融合してホモダイマーを形成する、又は非相同ポリペプチドに融合してヘテロダイマーを形成することができる。非相同ペプチド及びポリペプチドは次のものを含むが、これらに限定されない：ＡＦＴＩ融合ポリペプチドの検出及び／又は単離を可能にするエピトープ；細胞外ドメイン又は膜貫通及び細胞内ドメインのような、膜貫通レセプタタンパク質又はその部分；膜貫通レセプタタンパク質に結合するリガンド又はその部分；触媒的に活性な酵素又はその部分；ロイシンジッパードメインのようなオリゴマー化を促進するポリペプチド又はペプチド；免疫グロブリン定常領域のような安定性を高めるポリペプチド又はペプチド；及び配列番号２に示すようなアミノ酸配列又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとは異なる治療作用を持つポリペプチド。
【００９９】
融合は配列番号２に示すアミノ酸配列又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかで行うことができる。融合は、リンカー又はアダプター分子なしに直接であるか、若しくはリンカー又はアダプター分子を使用して間接的であってもよい。リンカー又はアダプター分子は１個又はそれ以上のアミノ酸残基、典型的には約２０個から約５０個のアミノ酸残基でありうる。リンカー又はアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼのための開裂部位又は融合部分を分離させるプロテアーゼのための開裂部位を含むように設計することもできる。ひとたび構築されれば、融合ポリペプチドがここで述べる方法に従って誘導体化できることは明白であろう。
【０１００】
本発明のさらなる実施形態では、配列番号２又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをヒトＩｇＧのＦｃ領域の１又はそれ以上のドメインに融合する。抗体は２個の機能的に独立した部分、すなわち抗原に結合する、「Ｆａｂ」として知られる可変ドメインと、補体の活性化や食細胞作用などのエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として知られる定常ドメインを含む。Ｆｃは長い血清半減期を持ち、一方Ｆａｂの半減期は短い。Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−３１（１９８９）。治療タンパク質と共に構築すると、Ｆｃドメインはより長い半減期を与える、又はＦｃレセプタ結合、プロテインＡ結合、補体の固定、そしておそらく胎盤輸送のような機能を組み込むことができる。表２は、当該技術で既知の特定のＦＣ融合の使用を要約する。
【０１０１】
【表２】

【０１０２】
１つの例では、ヒトＩｇＧヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の全部又は一部を、当業者に既知の方法を用いてＡＦＴＩポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに融合することができる。生じたＡＦＴＩ融合ポリペプチドはプロテインＡアフィニティーカラムを使用して精製しうる。Ｆｃ領域に融合したペプチド及びタンパク質は、インビボで融合していない対応物よりも実質的に長い半減期を示すことが認められた。また、Ｆｃ領域への融合は融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は天然に生じるＦｃ領域であるか、又は治療品質、循環時間、凝集低下、等々のようなある種の質を高めるように改変されていてもよい。
【０１０３】
合成
ここで述べる核酸及びポリペプチド分子が組換え及び他の方法によって産生しうることは当業者に認識されるであろう。
【０１０４】
核酸分子の合成
ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、限定されず、化学合成、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング及び／又はｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む様々な方法で容易に入手することができる。
【０１０５】
ここで使用する組換えＤＮＡ法は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、及び／又はＡｕｓｕｂｅｌら編集、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）に示されているものである。本発明は、ここで述べるような核酸分子とかかる分子を得るための方法を提供する。
【０１０６】
ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が１つの種から同定された場合、その遺伝子の全部又は一部がオーソローグ又は同じ種からの関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用できる。プローブ又はプライマーを使用して、ＡＦＴＩポリペプチドを発現すると考えられる様々な組織からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。さらに、ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定し、単離するために、配列番号１に示すような配列を持つ核酸分子の一部又は全部を使用してゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。典型的には、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小限に抑えるため、中又は高ストリンジェンシーの条件がスクリーニングに使用される。
【０１０７】
ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現されるタンパク質の特性に基づく陽性クローンの検出を用いた発現クローニングによっても同定しうる。典型的には、宿主細胞表面で発現され、ディスプレイされるクローン化タンパク質への抗体又は他の結合パートナー（例えばレセプタ又はリガンド）の結合によって核酸ライブラリーをスクリーニングする。抗体又は結合パートナーは、所望するクローンを発現する細胞を同定するために検出可能な標識で修飾する。
【０１０８】
下記に述べる説明に従って実施する組換え発現手法は、これらのポリヌクレオチドを作製し、コードされるポリペプチドを発現するために使用しうる。例えば、ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することにより、当業者は大量の所望するヌクレオチド配列を容易に生産することができる。次のその配列を使用して検出プローブ又は増幅プライマーを作製することができる。その代わりに、ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することもできる。発現ベクターを適切な宿主に挿入することにより、コードされるＡＦＴＩポリペプチドを大量に生産することができる。
【０１０９】
適当な核酸配列を得るためのもう１つの方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法では、逆転写酵素を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡ又は全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。次に、典型的にはＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の２つの別々の領域に相補的な、２個のプライマーを、Ｔａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼと共にｃＤＮＡに加えると、ポリメラーゼは２個のプライマー間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
【０１１０】
ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製するもう１つの手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−７３４（１９８９）に述べられているもののような当業者に既知の方法を用いた化学合成である。これらの方法は、中でも特に、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、及びＨ−ホスホネート法を含む。そのような化学合成のための好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を用いたポリマー支持合成である。
【０１１１】
典型的には、ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは数百ヌクレオチドの長さである。約１００ヌクレオチド以上の核酸は、これらの方法を用いていくつかのフラグメントとして合成することができる。その後フラグメントを一緒に連結して、ＡＦＴＩポリペプチドの完全長ヌクレオチド配列を形成することができる。通常、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ断片は、メチオニン残基をコードするＡＴＧを持つ。このメチオニンは、宿主細胞において産生されるポリペプチドがその細胞から分泌されるように設計されているか否かによって、ＡＦＴＩポリペプチドの成熟形態に存在しても、又は存在しなくてもよい。当業者には既知の他の方法が良く使用されうる。
【０１１２】
一部の実施形態では、核酸変異体は、所与の宿主細胞におけるＡＦＴＩポリペプチドの至適発現のために変化したコドンを含む。個々のコドン変化は発現のために選択されるＡＦＴＩポリペプチドと宿主細胞に依存する。そのような「コドンの至適化」は様々な方法によって、例えば所与の宿主細胞において高度に発現される遺伝子での使用のために好ましいコドンを選択することによって実施できる。高度に発現される細菌遺伝子のコドン選択性についての「Ｅｃｏｈｉｇｈ．ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込んだコンピュータアルゴリズムが使用でき、これはｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによって提供されている。他の有用なコドン頻度表は「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、及び「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」を含む。
【０１１３】
ベクターと宿主細胞
ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は標準的なライゲーション手法を用いて適切な発現ベクターに挿入することができる。ベクターは、典型的には使用する個々の宿主細胞において機能性であるように選択される（すなわち遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現が起こりうるようにベクターは宿主細胞機構と適合性である）。ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）、及び／又は真核生物宿主細胞において増幅／発現されうる。宿主細胞の選択は、一部にはＡＦＴＩポリペプチドが翻訳後修飾（例えばグリコシル化及び／又はリン酸化）であるかどうかに依存する。そうである場合には、酵母、昆虫、又は哺乳類宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖ．１８５，Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）参照。
【０１１４】
典型的には、いずれの宿主細胞で使用される発現ベクターも、プラスミドの維持のための配列及び外来ヌクレオチド配列のクローニングと発現のための配列を含む。一部の実施形態では集合的に「フランキング配列」と称されるそのような配列は、典型的には次のヌクレオチド配列の１個又はそれ以上を含む：プロモーター、１又はそれ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、スプライス供与部位と受容部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現すべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択可能なマーカー要素。これらの配列のそれぞれを下記で述べる。
【０１１５】
場合によっては、ベクターは「タグ」コード配列、すなわちＡＦＴＩポリペプチドの５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含みうる；オリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓのような）、あるいはＦＬＡＧ，ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）又は市販の抗体が存在するｍｙｃのような他の「タグ」をコードする。このタグは、典型的にはポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのＡＦＴＩポリペプチドのアフィニティー精製の手段として使用できる。アフィニティー精製は、例えばタグに対する抗体をアフィニティーマトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーによって実施できる。場合によっては、その後、開裂のためにある種のペプチダーゼを使用するなどの様々な手段によって精製ＡＦＴＩポリペプチドからタグを除去することができる。
【０１１６】
フランキング配列は相同（すなわち宿主細胞と同じ種及び／又は同じ系統から）、非相同（すなわち宿主細胞の種又は系統以外の種から）、ハイブリッド（すなわち２つ以上のソースからのフランキング配列の組合せ）又は合成であってもよく、あるいはフランキング配列はＡＦＴＩポリペプチド発現を調節するように正常に機能する天然配列であってもよい。それ自体で、フランキング配列のソースは、フランキング配列が宿主細胞機構において機能性であり、宿主細胞機構によって活性化されうることを条件として、いかなる原核又は真核生物、脊椎又は非脊椎生物、又は植物であってもよい。
【０１１７】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該技術において既知のいくつかの方法のいずれかによって入手しうる。典型的には、ＡＦＴＩ遺伝子フランキング配列以外のここで有用なフランキング配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によってこれまでに同定されており、従って適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な組織ソースから単離することができる。一部の霊ではフランキング配列の全ヌクレオチド配列は既知でありうる。ここでは、フランキング配列は、核酸合成又はクローニングについてここで述べる方法を用いて合成しうる。
【０１１８】
フランキング配列の全部又は一部だけが既知である場合、ＰＣＲ及び／又は適当なオリゴヌクレオチド及び／又は同じ又は別の種からのフランキング配列フラグメントでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによってフランキング配列を入手することができる。フランキング配列が不明である場合には、フランキング配列を含むＤＮＡのフラグメントを、例えばコード配列又はさらに別の１又はそれ以上の遺伝子を含みうるＤＮＡのより大きな断片から単離しうる。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生じる制限エンドヌクレアーゼで消化し、その後アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、又は当業者に既知の他の方法を用いて単離することによって実施しうる。この目的を達成するための適当な酵素の選択は当業者には容易に明らかであろう。
【０１１９】
複製起点は典型的には市販のものを購入した原核生物発現ベクターの一部であり、起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を助ける。一定のコピー数へのベクターの増幅は、一部の場合には、ＡＦＴＩポリペプチドの至適発現にとって重要でありうる。選択するベクターが複製起点部位を含まない場合は、既知の配列に基づいて化学合成し、ベクターに連結することができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（製品Ｎｏ．３０３−３ｓ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は大部分のグラム陰性細菌に適しており、また様々な起点（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）あるいはＨＰＶ又はＢＰＶのような乳頭腫ウイルス）が哺乳類細胞におけるクローニングベクターにとって有用である。一般に、哺乳類発現ベクターには複製起点成分は必要ない（例えば、ＳＶ４０起点は初期プロモーターを含むのでしばしば使用される）。
【０１２０】
転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、転写を終結する役割を果たす。通常、原核細胞における転写終結配列はＧ−Ｃに富むフラグメントで、ポリＴ配列がそれに続く。かかる配列はライブラリーから容易にクローン化され、あるいはベクターの一部として市販のものも購入されるが、ここで述べるような核酸合成のための方法を用いて容易に合成することもできる。
【０１２１】
選択可能マーカー遺伝子要素は、選択培地で成長する宿主細胞の生存と増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば原核宿主細胞についてはアンピシリン、テトラサイクリン、又はカナマイシンに対する耐性を付与する、（ｂ）細胞の栄養欠損を補足する、又は（ｃ）複合培地からは得られない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子も原核及び真核宿主細胞での選択のために使用しうる。
【０１２２】
他の選択遺伝子を使用して発現する遺伝子を増幅することもできる。増幅は、成長にとって必須のタンパク質を産生するためにより必要とされる遺伝子が、組換え細胞の連続する世代の染色体内でタンデムに反復される過程である。哺乳類細胞のための適当な選択可能マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びチミジンキナーゼを含む。哺乳類細胞の形質転換体を、形質転換体だけがベクター内に存在する選択遺伝子によって独自に生存に適応する選択圧下に置く。媒質中の選択剤の濃度を連続的に変化させ、それによって選択遺伝子とＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡの両方の増幅を導く条件下で形質転換細胞を培養することによって選択圧を課する。その結果、増幅されたＤＮＡから高い量のＡＦＴＩポリペプチドが合成される。
【０１２３】
ｍＲＮＡの翻訳開始には通常リボゾーム結合部位が必要であり、リボソーム結合部位はシャイン−ダルガーノ配列（原核細胞）又はコザック配列（真核細胞）によって特定される。かかる要素は典型的にはプロモーターの３’側、発現されるＡＦＴＩポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。シャイン−ダルガーノ配列は多様であるが、典型的にはポリプリンである（すなわち高いＡ−Ｇ含量を有する）。多くのシャイン−ダルガーノ配列が同定されており、それらの各々がここで述べる方法を用いて容易に合成でき、原核細胞ベクターにおいて使用できる。
【０１２４】
リーダー又はシグナル配列を使用して宿主細胞からのＡＦＴＩポリペプチドを指令することができる。典型的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をＡＦＴＩ核酸分子のコード領域に位置づけるか、又は直接ＡＦＴＩポリペプチドコード領域の５’末端に位置づける。多くのシグナル配列が同定されており、選択した宿主細胞において機能性であるいずれもがＡＦＴＩ核酸分子と共に使用できる。それ故、シグナル配列はＡＦＴＩ遺伝子又はｃＤＮＡに相同（天然に生じる）であるか又は非相同であってもよい。さらに、シグナル配列はここで述べる方法を用いて化学合成しうる。ほとんどの場合、シグナルペプチドの存在を通した宿主細胞からのＡＦＴＩポリペプチドの分泌は、分泌されたＡＦＴＩポリペプチドからのシグナルペプチドの除去をもたらす。シグナル配列はベクターの成分であるか、又はベクターに挿入されるＡＦＴＩ核酸分子の一部であってもよい。
【０１２５】
ＡＦＴＩポリペプチドコード領域に連結された天然ＡＦＴＩポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、又はＡＦＴＩポリペプチドコード領域に連結された非相同シグナル配列をコードするヌクレオチド配列の使用は本発明の範囲内に含まれる。選択される非相同シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる、すなわちシグナルペプチダーゼによって開裂されるものでなければならない。天然ＡＦＴＩポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核宿主細胞については、シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、又は熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核細胞シグナル配列に置き換える。酵母分泌については、天然ＡＦＴＩポリペプチドシグナル配列を酵母インベルターゼ、α因子、又は酸性ホスファターゼリーダーによって置き換えることができる。哺乳類細胞の発現においては、天然シグナル配列は満足しうるものであるが、他の哺乳類シグナル配列が適当であると考えられる。
【０１２６】
真核宿主細胞発現系においてグリコシル化を所望する場合のように、一部の場合には、グリコシル化又は収率を改善するために様々なプレ配列を操作しうる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ開裂部位を変化させる、又は同様にグリコシル化に影響を及ぼしうるプレ配列を付加することができる。最終的なタンパク質産物は、−１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に比べて）、完全には除去されなかったと考えられる、発現に付随する１又はそれ以上の付加アミノ酸を持ちうる。例えば、最終タンパク質産物は、Ｎ末端に結合した、ペプチダーゼ開裂部位に認められる１個又は２個のアミノ酸残基を持ちうる。その代わりに、一部の酵素開裂部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内の該当領域で切断する場合、所望するＡＦＴＩポリペプチドのわずかにトランケートされた形態を生じることがある。
【０１２７】
多くの場合、ベクター内に１個又はそれ以上のイントロンが存在することによって核酸分子の転写が高められる；これは特に、ポリペプチドが真核宿主細胞、中でも哺乳類宿主細胞において産生される場合に当てはまる。使用するイントロンは、特に使用する遺伝子が完全長ゲノム配列又はそのフラグメントである場合、ＡＦＴＩ遺伝子内に天然に生じるものでありうる。イントロンが天然では遺伝子内に生じない場合（ほとんどのｃＤＮＡに関して）、別のソースからイントロンを入手することができる。イントロンが有効であるように転写されねばならないので、フランキング配列及びＡＦＴＩ遺伝子に対するイントロンの位置は概して重要である。それ故、ＡＦＴＩｃＤＮＡ分子が転写されるとき、イントロンの好ましい位置は転写開始部位の３’側、ポリＡ転写終結配列の５’側である。好ましくは、１個又はそれ以上のイントロンがコード配列を中断しないようにｃＤＮＡの一方の側又は他方の側（すなわち５’又は３’側）に位置する。ウイルス、原核及び真核（植物又は動物）生物を含めたいかなるソースからのいかなるイントロンも、それが挿入される宿主細胞と適合性であることを条件として、本発明を実施するために使用しうる。合成イントロンもここに含まれる。場合によっては、２個以上のイントロンをベクターにおいて使用することができる。
【０１２８】
本発明の発現及びクローニングベクターは、各々典型的には、宿主生物によって認識され、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’側）（一般に約１００−１０００ｂｐ以内）に位置する非転写配列である。プロモーターは、誘導型プロモーターと構成型プロモーターの２つのクラスに好都合に分類される。誘導型プロモーターは、栄養素の存在又は不在あるいは温度変化のような培養条件の変化に応答して、その制御下でＤＮＡからの高いレベルの転写を開始させる。構造型プロモーターは、他方で、連続的な遺伝子産物の産生を開始させる；すなわち遺伝子発現に対してはほとんどあるいは全く制御しない。様々な宿主細胞によって認識される多くのプロモーターが広く知られている。制限酵素消化によってソースＤＮＡからプロモーターを取り除き、所望するプロモーター配列をベクター内に挿入することにより、適当なプロモーターがＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。天然ＡＦＴＩ遺伝子プロモーター配列を使用して、ＡＦＴＩ核酸分子の増幅及び／又は発現を指令することができる。しかしながら、天然プロモーターと比較してより高い転写と発現タンパク質のより高い収率を可能にし、且つ使用のために選択した宿主細胞系と適合性であれば、異種プロモーターが好ましい。
【０１２９】
原核細胞宿主での使用に適するプロモーターは、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。他の既知の細菌プロモーターも適する。それらの配列は公表されており、それによって当業者は、有用な制限部位を提供するため必要に応じてリンカー又はアダプターを使用して、所望するＤＮＡ配列にプロモーターをライゲートすることができる。
【０１３０】
酵母宿主に関する使用に適したプロモーターも当該技術において既知である。酵母エンハンサーが酵母プロモーターと共に好都合に使用される。哺乳類宿主細胞に関する使用に適したプロモーターは既知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そして最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるものを含むが、これらに限定されない。他の適当な哺乳類プロモーターは、異種哺乳類プロモーター、例えば熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターを含む。
【０１３１】
ＡＦＴＩ遺伝子の転写を制御する上で有用と考えられるさらなるプロモーターは次のものを含むが、これらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４−３１０、１９８１）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７，１９８０）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１４４−１４４５、１９８１）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２９６：３９−４２、１９８２）；原核細胞発現ベクタオーについては、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：３７２７−３７３１、１９７８）のようなプロモーター；あるいはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５、１９８３）。組織特異性を示し，トランスジェニック動物において使用されてきた、次のような動物転写制御領域も有用である：膵小胞体細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、Ｃｅｌｌ、３８：６３９−６４６，１９８４；Ｏｒｎｉｔｚら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，７：４２５−５１５，１９８７）；膵β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｒｅ，３１５：１１５−１２２，１９８５）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ，３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：１４３６−１４４４、１９８７）；精巣、***、リンパ系及び肥満細胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、Ｃｅｌｌ、４５：４８５−４９６，１９８６）；肝において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．、１：２６８−２７６，１９８７）；肝において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１６３９−１６４８、１９８５；Ｈａｍｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：５３−５８，１９８７）；肝において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．、１：１６１−１７１，１９８７）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３８−３４０，１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓら、Ｃｅｌｌ，４６：８９−９４，１９８６）；脳の希突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、Ｃｅｌｌ，４８：７０３−７１２，１９８７）；骨格金において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２８３−２８６，１９８５）；及び視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３７２−１３７８，１９８６）。
【０１３２】
高等真核生物による本発明のＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を高めるために、エンハンサー配列をベクターに挿入することができる。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を高める、通常約１０から３００ｂｐの長さの、ＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは比較的方向及び位置に依存しない。転写ユニットの５’側と３’側に認められている。哺乳類遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。典型的には、しかしながら、ウイルスからのエンハンサーが使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーは、真核細胞プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーはＡＦＴＩ核酸分子の５’側と３’側の位置でベクター内にスプライシングされうるが、典型的にはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０１３３】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような出発ベクターから構築されうる。そのようなベクターは所望するフランキング配列の全部を含んでいてもよく、又は含んでいなくてもよい。１又はそれ以上の所望するフランキング配列が既にベクター内に存在しなていない場合には、それらを個々に入手して、ベクターにライゲートすることができる。各々のフランキング配列を得るために使用される方法は当業者には既知である。
【０１３４】
本発明を実施するための好ましいベクターは、細菌、昆虫、酵母、及び哺乳類宿主細胞と適合性であるものである。そのようなベクターは、中でも特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４３６３号）及びｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含む。
【０１３５】
さらなる適当なベクターは、コスミド、プラスミド又は修飾ウイルスを含むがこれらに限定されず、但し、ベクター系が選択した宿主細胞と適合性でなければならないことは明白であろう。そのようなベクターは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高いコピー数のＣｏｌＥ１に基づくファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｔａｑ増幅したＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えばＴＯＰＯ（商標）　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）　Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、のようなプラスミド、及び哺乳類、酵母、昆虫、又はバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）のようなウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【０１３６】
ベクターが構築され、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後、完成したベクターを増幅及び／又はポリペプチドの発現のために適当な宿主細胞に挿入することができる。選択した宿主細胞へのＡＦＴＩポリペプチドの発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション又はＤＥＡＥ−デキストラン法のような方法を含めた既知の方法、あるいは他の既知の手法によって実施しうる。選択する方法は、一部には使用する宿主細胞の種類に依存するであろう。これらの方法や他の適当な方法は当業者に既知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出に述べられている。
【０１３７】
宿主細胞は原核宿主細胞（大腸菌など）又は真核宿主細胞（酵母細胞、昆虫細胞又は脊椎動物細胞など）でありうる。宿主細胞は、適切な条件下で培養したとき、ＡＦＴＩポリペプチドを合成し、その後それを培地から収集するか（宿主細胞がＡＦＴＩポリペプチドを培地中に分泌する場合）、又はそれを産生する宿主細胞から直接収集することができる。適切な宿主細胞の選択は、所望する発現レベル、グリコシル化又はリン酸化のような所望する又は活性に必要なポリペプチド修飾、及び生物活性分子への折りたたみの容易さのような様々な因子に依存するであろう。
【０１３８】
いくつもの適当な宿主細胞が当該技術において既知であり、多くはｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９から入手可能である。その例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ　ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：４２１６−４２２０（１９８０）、ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ１５７３）、あるいは３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ９２）のような哺乳類細胞を含むが、これらに限定されない。適当な哺乳類宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び生成物の生産と精製のための方法は当該技術において既知である。他の適当な哺乳類細胞系は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞系（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、及びＣＶ−１細胞系（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ７０）である。さらなる例示的な哺乳類宿主細胞は、形質転換細胞系を含めた、霊長類細胞系及びげっ歯類細胞系を含む。正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から誘導される細胞株、ならびに一次外植片も適する。候補細胞は、選択遺伝子に遺伝子型上の欠損があるか、又は優性に作用する選択遺伝子を含みうる。他の適当な哺乳類細胞系は、ＡＴＣＣから入手可能な、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ又はＮＩＨマウスから誘導される３Ｔ３系統、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞系を含むが、これらに限定されない。これらの細胞系の各々がタンパク質発現の当業者に既知であり、入手可能である。
【０１３９】
細菌細胞も、本発明に適する宿主細胞として同様に有用である。例えば、大腸菌の種々の菌株（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．３３６９４）ＤＨ５α、ＤＨ１０、及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．５３３３８））はバイオテクノロジーの分野において宿主細胞として既知である。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ．）、他のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ．）、等の種々の菌株もこの方法において使用しうる。
【０１４０】
当業者に既知の酵母細胞の多くの菌株も、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として使用しうる。好ましい酵母細胞は、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｉｖｉｓａｅ及びＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。
【０１４１】
さらに、所望する場合には、昆虫細胞系も本発明の方法において使用しうる。そのような系は、例えばＫｉｔｔｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：８１０−８１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４−５７２（１９９３）；及びＬｕｃｋｌｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５９（１９９３））に述べられている。好ましい昆虫細胞はＳｆ−９及びＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。
【０１４２】
また、グリコシル化ＡＦＴＩポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物を使用することができる。例えば、トランスジェニック乳産生動物（例えばウシ又はヤギ）を使用して、動物乳において本発明のグリコシル化ポリペプチドを得ることができる。また、ＡＦＴＩポリペプチドを生成するために植物も使用しうるが、一般に、植物で起こるグリコシル化は哺乳類細胞で生じるものとは異なり、ヒト治療用途には適さないグリコシル化産物が生じうる。
【０１４３】
ポリペプチド産生
ＡＦＴＩポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に既知の標準培地を使用して培養しうる。培地は通常、細胞の増殖と生存に必要なすべての栄養素を含む。大腸菌細胞を培養するための適当な培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）及び／又はＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）を含む。真核細胞を培養するための適当な培地は、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ　１６４０）、最小必須培地（ＭＥＭ）及び／又はダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含み、それらすべてに、培養する特定細胞系によって指示されるように血清及び／又は成長因子を補足しうる。昆虫培養のための適当な培地は、必要に応じてイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物及び／又はウシ胎児血清を補足したグレース培地である。
【０１４４】
典型的には、形質転換細胞の選択増殖のために有用な抗生物質又は他の化合物を補足物として培地に加える。使用すべき化合物は、宿主細胞が形質転換されたプラスミド上に存在する選択マーカーエレメントによって指定される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培地に加える化合物はカナマイシンである。選択増殖のための他の化合物は、アンピシリン、テトラサイクリン、及びネオマイシンを含む。
【０１４５】
宿主細胞によって産生されるＡＦＴＩポリペプチドの量は、当該技術において既知の標準的方法によって評価できる。そのような方法は、限定を伴わずに、ウエスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降法、及び／又はＤＮＡ結合ゲルシフト分析のような活性アッセイを含む。
【０１４６】
ＡＦＴＩポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計した場合、ポリペプチドの大部分は細胞培地中に存在すると考えられる。しかし、ＡＦＴＩポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合には、それは細胞質及び／又は核（真核宿主細胞の場合）あるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞の場合）内に存在する。
【０１４７】
宿主細胞の細胞質及び／又は核（真核宿主細胞の場合）あるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞の場合）内に位置するＡＦＴＩポリペプチドに関して、当業者に既知の何らかの標準的手法を用いて宿主細胞から細胞内物質（グラム陰性菌についての封入体を含む）を抽出することができる。例えば、宿主細胞を溶解し、フレンチプレス、均質化、及び／又は音波破砕とそれに続く遠心分離によってペリプラズム／細胞質の内容物を放出させることができる。
【０１４８】
ＡＦＴＩポリペプチドが細胞質ゾル内で封入体を形成した場合、封入体はしばしば内細胞膜及び／又は外細胞膜に結合しており、それ故遠心分離後は主としてペレット物質として認められる。その後ペレット物質を極端なｐＨで処理するか、あるいはアルカリ性ｐＨでのジチオトレイトール又は酸性ｐＨでのトリスカルボキシエチルホスフィンのような還元剤の存在下に界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、又は尿素誘導体のようなカオトロピック試薬で処理して、封入体を放出し、破壊し、可溶化することができる。次に、可溶性形態となったＡＦＴＩポリペプチドをゲル電気泳動、免疫沈降法、等を用いて分析することができる。ＡＦＴＩポリペプチドを単離することを所望する場合には、ここで述べる方法及びＭａｒｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：２６４−２７５（１９９０）の方法のような標準的方法を用いて単離を実施することができる。
【０１４９】
一部の場合、ＡＦＴＩポリペプチドが単離後は生物活性でないことがある。ポリペプチドをその三次構造に「リフォールディング」又は変換して、ジスルフィド結合を形成するための様々な方法が、生物活性を回復するために使用できる。そのような方法は、可溶化したポリペプチドを特定の濃度のカオトロピック試薬の存在下で、通常は７以上のｐＨに暴露することを含む。カオトロピック試薬の選択は封入体可溶化のために使用する選択と非常に類似するが、通常カオトロピック試薬はより低い濃度で使用され、必ずしも可溶化のために使用するカオトロピック試薬と同じではない。ほとんどの場合、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤、あるいはタンパク質のシステイン架橋の形成の際に起こるジスルフィドシャフリングを可能にする特定のレドックス電位を生じる特定比率での還元剤プラスその酸化形態を含む。一般的に使用されるレドックス対の一部は、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、及び２−２メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）を含む。リフォールディングの効率を高めるために共溶媒が使用でき、このために使用されるより一般的な試薬は、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、アルギニン、等を含む。
【０１５０】
ＡＦＴＩポリペプチドの発現時に有意の度合の封入体が形成されない場合には、細胞ホモジネートの遠心分離後、ポリペプチドは主として上清中に認められる。ここで述べるような方法を用いて上清からポリペプチドさらに単離することができる。
【０１５１】
溶液からのＡＦＴＩポリペプチドの精製は様々な手法を用いて実施できる。ポリペプチドがそのカルボキシ末端又はアミノ末端のいずれかにヘキサヒスチジン（ＡＦＴＩポリペプチド／ｈｅｘａＨｉｓ）、あるいはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）又はｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの他の小さなペプチドのようなタグを含むように合成された場合、カラムマトリックスがタグに高い親和性を持つアフィニティーカラムに溶液を通すことによって１段階で精製することができる。
【０１５２】
例えば、ポリヒスチジンは高い親和性と特異性でニッケルに結合し、それ故ニッケルのアフィニティーカラム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラムのような）がＡＦＴＩポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用できる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第１０．１１．８章、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９３）参照。
【０１５３】
さらに、ＡＦＴＩ様ポリペプチドは、ＡＦＴＩ様ポリペプチドを特異的に認識し、結合することができるモノクローナル抗体の使用を通して精製しうる。
【０１５４】
精製のための適当な手順は、それ故、限定を伴わずに、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動（未変性ゲル電気泳動を含む）とそれに続くゲル溶出、及び分取等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」装置／手法、Ｈｏｅｆｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を含むがこれらに限定されない。一部の場合には、高い純度を達成するために２又はそれ以上の精製手法を組み合わせてもよい。
【０１５５】
ＡＦＴＩポリペプチドはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：５１３２（１９８５）、及びＳｔｅｗａｒｄとＹｏｕｎｇ，「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）に述べられているような、当該技術において既知の手法を用いて化学合成法（固相ペプチド合成のような）によって調製することもできる。そのようなポリペプチドはアミノ末端にメチオニンを持つか又はメチオニンなしで合成しうる。化学合成したＡＦＴＩポリペプチドを、これらの参考文献に述べられている方法を用いて酸化し、ジスルフィド架橋を形成することができる。化学合成ＡＦＴＩポリペプチドは、組換え生産した又は天然ソースから精製した対応するＡＦＴＩポリペプチドと同等の生物活性を持つと予想され、それ故組換え又は天然ＡＦＴＩポリペプチドと交換可能に使用しうる。
【０１５６】
ＡＦＴＩポリペプチドを入手するもう１つの手段は、ＡＦＴＩポリペプチドが天然に存在するソース組織及び／又は液体のような生物学的サンプルからの精製によるものである。そのような精製は、ここで述べるようなタンパク質生成のための方法を用いて実施できる。精製の間ＡＦＴＩポリペプチドが存在することは、例えば組換え生産したＡＦＴＩポリペプチド又はそのペプチド断片に対して作製した抗体を用いてモニターしうる。
【０１５７】
核酸及びポリペプチドを生成するためのさらなるいくつかの方法が当該技術において知られており、ＡＦＴＩに特異性を持つポリペプチドを生成するために使用できる。例えば、ｍＲＮＡとそれがコードするペプチド間の融合タンパク質の産生を述べた、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２２９７−１２３０３（１９９７）参照。また、特定の生物学的機能を実施することができるオリゴヌクレオチドを得る方法を述べた米国特許第５，８２４，４６９号も参照のこと。その手順は、各々が５’ランダム配列、中央のあらかじめ選択された配列、及び３’ランダム配列を持つ、オリゴヌクレオチドの非相同プールを生成することを含む。生じた非相同プールを、所望する生物学的機能を示さない細胞個体群に導入する。次に細胞の小個体群をあらかじめ決定された生物学的機能を示すものに関してスクリーニングする。その小個体群から、所望する生物学的機能を実施することができるオリゴヌクレオチドを単離する。
【０１５８】
米国特許第５，７６３，１９２号、５，８１４，４７６号、５，７２３，３２３号、及び５，８１７，４８３号は、ペプチド又はポリペプチドを生成するための方法を述べている。これは、確率的遺伝子又はそのフラグメントを作製し、次に確率的遺伝子によってコードされる１又はそれ以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって実施される。その後宿主細胞をスクリーニングして、所望する活性を持つペプチド又はポリペプチドを産生するクローンを同定する。
【０１５９】
化学誘導体
ＡＦＴＩポリペプチドの化学修飾誘導体は、下記に述べる開示を考慮して、当業者によって調製されうる。ＡＦＴＩポリペプチド誘導体は、ポリペプチドに天然に結合している分子の種類又は位置を変化させるように修飾される。誘導体は１又はそれ以上の天然結合化学基の欠失によって形成される分子を含みうる。配列番号２又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１又はそれ以上のポリマーの共有結合によって修飾されうる。例えば、選択されるポリマーは典型的には水溶性であるので、それに結合するタンパク質は生理環境のような水性環境において沈殿しない。ポリマーの混合物も適当なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終産物の治療用途のために、ポリマーは製薬上許容されうるものである。
【０１６０】
各々のポリマーはいかなる分子量であってもよく、分枝又は非分枝のいずれでもよい。ポリマーは典型的には約２ｋＤａから約１００ｋＤａ（「約」の語は、水溶性ポリマーの製剤中、一部の分子は示されている分子量よりも大きく、一部の分子はそれより小さい分子量を持つことを意味する）の平均分子量を持つ。各ポリマーの平均分子量は好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、より好ましくは約１２ｋＤａから約４０ｋＤａ、最も好ましくは約２０ｋＤａから約３５ｋＤａの間である。
【０１６１】
適当な水溶性ポリマー又はその混合物は、Ｎ結合又はＯ結合炭水化物、糖類、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ（Ｃ_１−Ｃ_１０）アルコキシ又はアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含めて、タンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば約６ｋＤａの低分子量デキストランなど）、セルロース、又は他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル（例えばグリセロール）及びポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない。配列番号２又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドの共有結合多量体を調製するために使用しうる二官能性架橋分子も本発明に包含される。
【０１６２】
一般に、化学誘導体化は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される適当な条件下で実施しうる。ポリペプチドの化学誘導体を調製するための方法は、一般に（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はＡＦＴＩポリペプチド変異体が１又はそれ以上のポリマー分子に結合する条件下で、ポリペプチドを活性化ポリマー分子（ポリマー分子の反応性エステル又はアルデヒド誘導体など）と反応させ、そして（ｂ）反応産物を得る段階を含む。至適反応条件は既知のパラメータと所望する結果に基づいて決定されるであろう。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比が大きいほど、結合ポリマー分子のパーセンテージが高くなる。１つの実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチド誘導体はアミノ末端に１個のポリマー分子部分を持ちうる。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号参照。
【０１６３】
ポリペプチドのペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は特に、例えば次の参考文献に述べられているように、当該技術において既知のペギル化反応いずれかによって実施しうる：Ｆｒａｎｃｉｓら、「成長因子への注目（Ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ）」、３：４−１０（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６号；ＥＰ０４０１３８４号；米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペギル化はここで述べるような反応性ポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を通して実施しうる。アシル化反応については、選択するポリマーは１個の反応性エステル基を持たねばならない。還元的アルキル化については、選択するポリマーは１個の反応性アルデヒド基を持つべきである。反応性アルデヒドは、例えば水に安定なポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はそのモノＣ_１−Ｃ_１０アルコキシ又はアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号参照）。
【０１６４】
もう１つの実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチドをビオチンに化学結合し、次に複合したビオチン／ＡＦＴＩポリペプチド分子をアビジンに結合して、四価のアビジン／ビオチン／ＡＦＴＩポリペプチド分子を生成する。ＡＦＴＩポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）又はトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合し、生じた複合体を抗ＤＮＰ又は抗ＴＮＰ−ＩｇＭで沈殿させて、１０の原子価を持つデカマー複合体を形成することもできる。
【０１６５】
一般に、本発明のＡＦＴＩポリペプチド誘導体の投与によって軽減又は緩和しうる状態は、ＡＦＴＩポリペプチドに関してここで述べたものを含む。しかし、ここで開示するＡＦＴＩポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子に比べて付加的な活性、高い又は低い生物活性、あるいは長い又は短い半減期のような他の特性を持ちうる。
【０１６６】
化学誘導体のもう１つの形態は脂質化ＡＦＴＩポリペプチドである。そのような分子については、１又はそれ以上の脂質を何らかの手段によって、例えば化学的手段によってＡＦＴＩポリペプチド又は配列番号１のポリペプチド又はその変異体に共有結合することができる。
【０１６７】
遺伝的に構築したヒト以外の動物
さらに、天然ＡＦＴＩポリペプチドをコードする１又はそれ以上の遺伝子が、この遺伝子の発現レベルが有意に低下する又は完全に排除されるように分断された（「ノックアウトされた」）、例えばマウス、ラット、又は他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ウシ、ブタ、又はヒツジのようなヒト以外の動物が本発明の範囲内に含まれる。そのような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に述べられているような手法と方法を用いて作製しうる。
【０１６８】
本発明はさらに、その動物についての天然形態のＡＦＴＩ遺伝子又は異種ＡＦＴＩ遺伝子のいずれかが該動物によって過剰発現され、それによって「トランスジェニック」動物が作製される、マウス、ラット、又は他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又は他の家畜のようなヒト以外の動物を含む。そのようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号及びＰＣＴ特許願第ＷＯ９４／２８１２２号に述べられているもののような既知の方法を用いて作製しうる。
【０１６９】
本発明はさらに、本発明の１又はそれ以上のＡＦＴＩポリペプチドについてのプロモーターが活性化又は不活性化されて（例えば相同的組換え法を用いて）、１又はそれ以上の天然ＡＦＴＩポリペプチドの発現レベルを変化させるヒト以外の動物を含む。
【０１７０】
これらのヒト以外の動物は薬剤候補物質のスクリーニングに使用しうる。そのようなスクリーニングにおいては、薬剤候補物質の動物への影響を測定することができる。例えば、薬剤候補物質はＡＦＴＩ遺伝子の発現を低下又は上昇させうる。一部の実施形態では、薬剤候補物質に動物を暴露したあと、産生されるＡＦＴＩポリペプチドの量を測定することができる。さらに、一部の実施形態では、薬剤候補物質の動物への実際の影響を検出しうる。例えば、特定遺伝子の過剰発現は疾患又は病的状態をもたらす又はそれらに結びつくと考えられる。そのような場合、薬剤候補物質が該遺伝子の発現を低下させる能力、又は病的状態を予防又は阻害する能力を試験することができる。他の例では、ポリペプチドのフラグメントのような特定代謝産物の産生が疾患又は病的状態をもたらす又はそれらに結びつくと考えられる。そのような場合、薬剤候補物質がそのような代謝産物の産生を低下させる能力、又は病的状態を予防又は阻害する能力を試験することができる。
【０１７１】
マイクロアレイ
ＤＮＡマイクロアレイテクノロジーが本発明に従って利用できることは明白であろう。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラスのような保持体上に位置する核酸の微細で高密度のアレイである。アレイ内の各々の細胞又はエレメントは、そのコグネイトｍＲＮＡについてのハイブリダイゼーションの標的として働く単一種のＤＮＡの多数のコピーを持つ。一部の実施形態では、ＤＮＡマイクロアレイテクノロジーを用いた発現プロファイリングにおいて、最初にｍＲＮＡを細胞又は組織標本から抽出し、次に蛍光標識したｃＤＮＡに酵素的に変換する。この物質をマイクロアレイにハイブリダイズして、結合していないｃＤＮＡを洗浄によって除去する。その後、各々の標的ＤＮＡに特異的に結合した標識ｃＤＮＡの量を測定することによってアレイ上に存在する別々の遺伝子の発現を視覚化する。このようにして、生物学的物質の単一標本から数千の遺伝子の発現が高い流量で平行して定量できる。
【０１７２】
この高流量発現プロファイリングは、次のものを含むがそれらに限定されない、本発明のＡＦＴＩ様分子に関する幅広い適用を持つ：治療のための標的としてのＡＦＴＩ疾患関連遺伝子の同定と有効性確認；ＡＦＴＩ様分子及びその阻害因子の分子毒性学；臨床試験のための代理マーカーの個体群の層別と生成；ならびに高流量スクリーニング（ＨＴＳ）において選択化合物の同定を助けることによるＡＦＴＩ関連小分子薬剤送達の促進。
【０１７３】
選択結合物質
ここで、「選択結合物質」の語は、１又はそれ以上のＡＦＴＩポリペプチドに結合特異性を持つ分子を指す。適当な選択結合物質は、抗体及びその誘導体、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。適当な選択結合物質は当該技術において既知の方法を用いて調製しうる。本発明の例示的なＡＦＴＩポリペプチド選択結合物質はＡＦＴＩポリペプチドの特定の部分に結合することができ、それによってＡＦＴＩレセプタへのポリペプチドの結合を阻害する。
【０１７４】
ＡＦＴＩポリペプチドに結合する抗体及び抗体断片のような選択結合物質は本発明の範囲内である。抗体は、単一特異性ポリクローナルを含むポリクローナル、モノクローナル（ＭＡｂ）、組換え、キメラ、ＣＤＲ移植のようなヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、ヒト、一本鎖、及び／又は二重特異性、ならびにそれらのフラグメント、変異体又は誘導体でありうる。抗体フラグメントは、ＡＦＴＩポリペプチドのエピトープに結合する抗体の部分を含む。そのようなフラグメントの例は、完全長抗体の酵素的開裂によって精製されるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）フラグメントを含む。他の結合フラグメントは、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現のような、組換えＤＮＡ手法によって生成されるものを含む。
【０１７５】
ＡＦＴＩポリペプチドに対するポリクローナル抗体は一般に、ＡＦＴＩポリペプチドとアジュバントの多回皮下又は腹腔内注入により動物（例えばウサギ又はマウス）において産生される。キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子のような、免疫する種において免疫原性である担体タンパク質にＡＦＴＩポリペプチドを複合することは有用であると考えられる。また、免疫応答を高めるためにミョウバンのような凝集剤が使用される。免疫後、動物から採血し、血清を抗ＡＦＴＩポリペプチド抗体力価に関して検定する。
【０１７６】
ＡＦＴＩポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養において連続する細胞系統による抗体分子の産生を提供する何らかの方法を用いて作製される。モノクローナル抗体を作製するための適当な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法、及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「モノクローナル抗体作製の手法と応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８７）を含む。ＡＦＴＩポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も本発明によって提供される。
【０１７７】
本発明のモノクローナル抗体は治療薬として使用するために修飾しうる。１つの実施形態は、Ｈ及び／又はＬ鎖の一部が特定種から誘導される又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一又は相同であり、鎖の残りの部分がもう１つ別の種から誘導される又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体である。そのような抗体のフラグメントも、それらが所望する生物活性を示す限り、包含される。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５（１９８５）参照。
【０１７８】
もう１つの実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術において既知である。米国特許第５，５８５，０８９号及び５，６９３，７６２号参照。一般に、ヒト化抗体はヒト以外のソースから導入された１又はそれ以上のアミノ酸残基を持つ。ヒト化は、例えば、ヒト抗体の対応する領域をげっ歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部に置き換えることにより、当該技術において記述されている方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−１５３６（１９８８））を用いて実施できる。
【０１７９】
ＡＦＴＩポリペプチドに結合するヒト抗体も本発明に包含される。内因性免疫グロブリンの産生なしでヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を使用して、任意に担体に複合したＡＦＴＩ抗原（すなわち少なくとも６個の隣接アミノ酸を持つ）で免疫することによってそのような抗体が産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）参照。そのようなテクノロジーは、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．からのＨｕＭａｂ（商標）テクノロジー及びＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．からのＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）テクノロジーを含めて、市販のものが入手できる。１つの方法では、対象動物内の免疫グロブリンのＨ及びＬ鎖をコードする内因性遺伝子座を無効にし、ヒトＨ及びＬ鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノム内に挿入することにより、そのようなトランスジェニック動物を作製する。次に、部分改変された動物、すなわち完全でない改変を有する動物を交雑育種して、所望する免疫系修飾のすべてを有する動物を得る。免疫原を投与したとき、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に免疫特異的な可変領域を含む、ヒト（例えばマウスではなく）アミノ酸配列を備えた抗体を産生する。ＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号及びＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６号参照。さらなる方法が米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５号及びＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７号、及びＥＰ５４６　０７３Ｂ１号及びＥＰ５４６　０７３Ａ１号に述べられている。ヒト抗体はまた、ここで述べるように宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって又はハイブリドーマ細胞における発現によって作製することもできる。この項で述べるテクノロジーによって作製したヒト抗体を集合的に「完全ヒト抗体」と称する。
【０１８０】
代替的実施形態では、ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を生成することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。これらの方法は、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイと、その後の選択抗原への結合によってファージを選択することを通して免疫選択を模倣する。そのような手法の１つがＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４号に述べられており、そのようなアプローチを用いた、ＭＰＬ−及びｍｓｋ−レセプタに対して高い親和性を備え、且つ機能的に反発する抗体の単離を記述している。この項で述べる手法によって作製した抗体を「ファージディスプレイ抗体」と称する。
【０１８１】
キメラ、ＣＤＲ移植、及びヒト化抗体は典型的には組換え法によって作製される。抗体をコードする核酸を宿主細胞に導入し、ここで述べる材料と手順を用いて発現させる。好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞のような哺乳類宿主細胞において抗体を作製する。モノクローナル（例えばヒト）抗体はここで述べるような宿主細胞における組換えＤＮＡの発現又はハイブリドーマ細胞における発現によって生成されうる。
【０１８２】
本発明の抗ＡＦＴＩ抗体は、ＡＦＴＩポリペプチドの検出と定量のために、競合結合測定法、直接及び間接サンドイッチ測定法、ならびに免疫沈降法のようないかなる既知の検定法においても使用しうる（Ｓｏｌａ，「モノクローナル抗体：手法マニュアル（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、ｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）参照）。抗体は、使用する検定方法に適した親和性でＡＦＴＩポリペプチドに結合する。
【０１８３】
診断適用のために、一部の実施形態では、抗ＡＦＴＩ抗体を検出可能な成分で標識することができる。検出可能な成分は、直接又は間接的に、検出可能なシグナルを生成することができるものでありうる。例えば、検出可能成分は^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、又は^１２５Ｉのような放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、又はルシフェリンのような蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又は西洋わさびペルオキシダーゼのような酵素でありうる（Ｂａｙｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８４：１３８−１６３（１９９０））。
【０１８４】
競合結合測定法は、標識標準品（例えばＡＦＴＩポリペプチド、又はその免疫学的に活性な部分）が限られた量の抗ＡＦＴＩ抗体との結合に関して被験試料分析物（ＡＦＴＩポリペプチド）と競合する能力に基づく。被験試料中のＡＦＴＩポリペプチドの量は、抗体に結合する標準品の量に反比例する。結合している標準品の量の測定を容易にするため、典型的には競合の前又はあとに抗体を不溶化するので、抗体に結合している標準品と分析物を、結合しないままの標準品及び分析物から好都合に分離することができる。
【０１８５】
サンドイッチアッセイは典型的には２つの抗体の使用を含み、各々が、検出する及び／又は定量するタンパク質の異なる免疫原性部分、又はエピトープに結合することができる。サンドイッチアッセイでは、典型的には被験試料分析物は保持体に固定した第一抗体に結合され、その後第二抗体が分析物に結合して、不溶性の３つの部分から成る複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号参照。第二抗体自体が検出可能な成分で標識されているか（直接サンドイッチアッセイ）、又は検出可能成分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定することができる（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、１つのタイプのサンドイッチアッセイは酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合検出可能成分は酵素である。
【０１８６】
抗ＡＦＴＩ抗体を含めた選択結合物質はまた、インビボでの画像化にも有用である。検出可能成分で標識した抗体を動物に、好ましくは血流中に投与し、宿主における標識抗体の存在と位置を測定する。抗体は、核磁気共鳴、放射線、又は当該技術において既知の他の検出手段によって、動物において検出可能な何らかの成分で標識しうる。
【０１８７】
抗体を含めた本発明の選択結合物質は治療薬として使用しうる。これらの治療薬は一般に、それぞれＡＦＴＩポリペプチドの生物活性の少なくとも１つを高める又は低下させるという意味で、アゴニスト又はアンタゴニストである。１つの実施形態では、本発明のアンタゴニスト抗体は、インビボ又はインビトロで、ＡＦＴＩポリペプチドに特異的に結合することができ、且つＡＦＴＩポリペプチドの機能的活性を阻害する又は排除することができる抗体又はその結合フラグメントである。好ましい実施形態では、選択結合物質、例えばアンタゴニスト抗体は、ＡＦＴＩポリペプチドの機能的活性を少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも８０％阻害する。もう１つの実施形態では、選択結合物質は、ＡＦＴＩ結合パートナー（リガンド又はレセプタ）と相互作用することができ、それによってインビトロ又はインビボでＡＦＴＩ活性を阻害する又は排除することができる抗ＡＦＴＩポリペプチド抗体でありうる。アゴニスト及びアンタゴニスト抗ＡＦＴＩ抗体を含めた選択結合物質は、当該技術において既知のスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１８８】
本発明はまた、ＡＦＴＩ選択結合物質（抗体のような）及び生物学的試料においてＡＦＴＩポリペプチドレベルを検出するために有用な他の試薬を含むキットに関する。そのような試薬は、検出可能な標識、遮断血清、陽性及び陰性対照試料、ならびに検出試薬を含みうる。
【０１８９】
本発明のＡＦＴＩポリペプチドは、発現クローニング戦略を用いてＡＦＴＩレセプタをクローン化するために使用できる。放射標識（１２５−ヨウ素）ＡＦＴＩポリペプチド又は親和性／活性標識ＡＦＴＩポリペプチド（Ｆｃ融合又はアルカリホスファターゼ融合のような）を結合アッセイで使用して、ＡＦＴＩレセプタを発現する細胞型又は細胞系統又は組織を同定することができる。そのような細胞又は組織から単離したＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、哺乳類発現ベクターにクローン化し、哺乳類細胞（ＣＯＳ又は２９３細胞のような）にトランスフェクションして発現ライブラリーを作製することができる。次に放射標識又はラベルＡＦＴＩポリペプチドを親和性リガンドとして使用して、その表面上にＡＦＴＩレセプタを発現する細胞のサブセットをこのライブラリーから同定し、単離することができる。その後これらの細胞からＤＮＡを単離し、哺乳類細胞にトランスフェクションして、ＡＦＴＩレセプタを発現する細胞の分画が元のライブラリーにおけるよりも何倍も高い二次発現ライブラリーを作製することができる。ＡＦＴＩレセプタを含む単一組換えクローンが単離されるまで、この濃縮プロセスを繰り返し反復することができる。ＡＦＴＩレセプタの単離は、ＡＦＴＩポリペプチドシグナル伝達経路の新規アゴニスト及びアンタゴニストを同定する又は開発するために有用である。そのようなアゴニスト及びアンタゴニストは、ＡＦＴＩレセプタ、抗ＡＦＴＩレセプタ抗体、小分子、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、それらはここで述べるものを含めた１又はそれ以上の疾患又は障害を治療する、予防する、又は診断するために使用しうる。
【０１９０】
ＡＦＴＩポリペプチド活性の他の調節因子の測定法
一部の状況では、ＡＦＴＩポリペプチドの活性のモジュレーター、すなわちアゴニスト又はアンタゴニストである分子を同定することが望ましいと考えられる。ＡＦＴＩポリペプチドを調節する天然又は合成分子は、ここで述べるもののような１又はそれ以上のスクリーニングアッセイを使用して同定しうる。そのような分子はエクスビボで、あるいは注入又は経口送達、移植装置、等によってインビボで投与することができる。
【０１９１】
「被験分子」は、ＡＦＴＩポリペプチドの活性を調節する（すなわち高める又は低下させる）能力に関して評価されている分子を指す。最も一般的には、被験分子はＡＦＴＩポリペプチドと直接相互作用する。しかし、被験分子はまた、ＡＦＴＩ遺伝子の発現に影響を及ぼすことによる、又はＡＦＴＩの結合パートナー（例えばレセプタ又はリガンド）に結合することによるような、ＡＦＴＩポリペプチド活性を間接的に調節しうることも考慮されるであろう。１つの実施形態では、被験分子は少なくとも約１０^−６Ｍ、好ましくは約１０^−８Ｍ、より好ましくは約１０^−９Ｍ、さらに一層好ましくは約１０^−１０Ｍの一定な親和性でＡＦＴＩポリペプチドに結合する。
【０１９２】
ＡＦＴＩポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は本発明に包含される。一部の実施形態では、被験分子とＡＦＴＩポリペプチドの相互作用を可能にする条件下でＡＦＴＩポリペプチドを被験分子と共にインキュベートし、相互作用の度合を測定することができる。被験分子は実質的に精製された形態で又は粗混合物としてスクリーニングすることができる。
【０１９３】
一部の実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチドアゴニスト又はアンタゴニストは、ＡＦＴＩポリペプチドと相互作用してその活性を調節するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、又は低分子量分子でありうる。ＡＦＴＩポリペプチドの発現を調節する分子は、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする核酸に相補的であるか、又はＡＦＴＩポリペプチドの発現を指令する又は制御する核酸に相補的であって、発現のアンチセンス調節因子として働く核酸を含む。
【０１９４】
ひとたび一組の被験分子がＡＦＴＩポリペプチドと相互作用することが同定されれば、ＡＦＴＩポリペプチドの活性を高める又は低下させる能力に関して分子をさらに評価することができる。ＡＦＴＩポリペプチドと被験分子の相互作用の測定は、細胞ベースの結合測定法、膜結合測定法、溶液相測定法及び免疫測定法を含めて、いくつかの様式で実施しうる。一般に、被験分子を一定の期間ＡＦＴＩポリペプチドと共にインキュベートし、生物活性を測定するための１又はそれ以上のアッセイによってＡＦＴＩポリペプチド活性を測定する。
【０１９５】
被験分子とＡＦＴＩポリペプチドの相互作用はまた、免疫測定法においてポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用して直接測定することもできる。その代わりに、ここで述べるようなエピトープ標識を含む修飾形態のＡＦＴＩポリペプチドを免疫測定法で使用してもよい。
【０１９６】
ＡＦＴＩポリペプチドが結合パートナー（例えばレセプタ又はリガンド）との相互作用を通して生物活性を表示する場合、対応する結合パートナー（選択結合物質、レセプタ、又はリガンドのような）へのＡＦＴＩポリペプチドの結合を測定するために様々なインビトロアッセイが使用できる。これらのアッセイは、結合パートナーへのＡＦＴＩポリペプチドの結合の速度及び／又は度合を高める又は低下させる能力に関して被験分子をスクリーニングするために使用しうる。１つのアッセイでは、ＡＦＴＩポリペプチドをマイクロタイタープレートのウエルに固定する。次に放射標識ＡＦＴＩポリペプチド結合パートナー（例えばヨウ素化ＡＦＴＩ結合パートナー）と被験分子を一度に１つずつ（いずれかの順序で）又は同時にウエルに加える。インキュベーション後、ウエルを洗浄し、シンチレーションカウンターを使用して放射能を測定して、結合パートナーがＡＦＴＩポリペプチドに結合している度合を決定することができる。典型的には、一定範囲の濃度にわたって分子を試験し、結果の評価の正確さのために被験アッセイの１又はそれ以上の要素を欠く一連の対照ウエルを使用することができる。この方法の代替法は、タンパク質の「位置」を逆にする、すなわちＡＦＴＩ結合パートナーをマイクロタイタープレートのウエルに固定し、被験分子と放射標識ＡＦＴＩポリペプチドをインキュベートして、ＡＦＴＩポリペプチドの結合の度合を測定することを含む。例えば、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第１８章、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９５）参照。
【０１９７】
放射標識に代わるものとして、ＡＦＴＩポリペプチド又はその結合パートナーをビオチンに複合し、その後比色定量によって検出できる西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のような酵素に連結したストレプトアビジンを用いて、又はストレプトアビジンの蛍光標識によって、ビオチニル化タンパク質の存在を検出することができる。ビオチンに複合した、ＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ結合パートナーに対する抗体も使用でき、ＡＰ又はＨＲＰに連結した酵素結合ストレプトアビジンとのインキュベーション後に検出することができる。
【０１９８】
ＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ又は他の種類のそのような不活性固相基質に結合することによって固定できる。基質−タンパク質複合体を、相補的タンパク質と被験化合物を含む溶液中に入れる。インキュベーション後、ビーズを遠心分離によって沈殿させ、ＡＦＴＩポリペプチドとその結合パートナー間の結合の量をここで述べる方法によって評価することができる。その代わりに、基質−タンパク質複合体をカラムに固定し、被験分子と相補的タンパク質をカラムに通す。その後ＡＦＴＩポリペプチドとその結合パートナー間の複合体の形成をここで述べる手法のいずれか、すなわち放射標識、抗体結合、等を用いて評価することができる。
【０１９９】
ＡＦＴＩ結合タンパク質とＡＦＴＩ結合パートナー間の複合体の形成を上昇させる又は低下させる被験分子を同定するために有用なもう１つのインビトロアッセイは、ビアコアアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のような表面プラズモン共鳴検出システムである。ビアコアシステム（ＢＩＡ　ｃｏｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ）は製造者のプロトコールに従って実施しうる。このアッセイは基本的に、検出器内に位置するデキストラン被覆センサーチップへのＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ結合パートナーの共有結合を含む。被験化合物と他の相補的タンパク質をセンサーチップの入ったチェンバー内に同時に又は連続的に注入する。結合する相補的タンパク質の量を、センサーチップのデキストラン被覆側に物理的に関連する分子量の変化に基づいて評価することができる；分子量の変化は検出システムによって測定することができる。
【０２００】
一部の場合、２又はそれ以上の被験化合物を、ＡＦＴＩポリペプチドとＡＦＴＩ結合パートナー間の複合体の形成を上昇させる又は低下させる能力に関して一緒に評価することが望ましいと考えられる。これらの場合、そのような付加被験化合物を最初の被験化合物と同時に、又は最初の被験化合物に続いて加えることにより、ここで述べるアッセイを容易に修正することができる。本アッセイの工程の残りをここで述べる。
【０２０１】
ここで述べるようなインビトロアッセイは、ＡＦＴＩポリペプチドとＡＦＴＩ結合パートナーによる複合体形成への作用に関して多数の化合物をスクリーニングするために好都合に使用しうる。アッセイは、ファージディスプレイによって生成された化合物、合成ペプチド、及び化学合成ライブラリーをスクリーニングするために自動化することができる。
【０２０２】
ＡＦＴＩポリペプチドとＡＦＴＩ結合パートナー間の複合体の形成を上昇させる又は低下させる化合物はまた、ＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ結合パートナーのいずれかを発現する細胞と細胞系を使用して、細胞培養においてスクリーニングすることもできる。細胞及び細胞系はいかなる哺乳類からも入手しうるが、好ましくはヒト又は霊長類、イヌ、又はげっ歯類由来のものである。表面にＡＦＴＩ結合パートナーを発現する細胞へのＡＦＴＩポリペプチドの結合を被験分子の存在下又は不在下で評価し、例えばＡＦＴＩ結合パートナーに対するビオチニル化抗体を使用したフローサイトメトリーによって、結合の度合を測定することができる。細胞培養アッセイは、ここで述べるタンパク質結合アッセイにおいて陽性と認められた化合物をさらに評価するために好適に使用することができる。
【０２０３】
細胞培養はまた、薬剤候補物質の影響をスクリーニングするためにも使用できる。例えば、薬剤候補物質はＡＦＴＩ遺伝子の発現を低下又は上昇させうる。一部の実施形態では、細胞培養を薬剤候補物質に暴露した後、産生されるＡＦＴＩポリペプチドの量を測定する。一部の実施形態では、細胞培養への薬剤候補物質の実際の影響を検出することができる。例えば、特定遺伝子の過剰発現は細胞培養に特定の影響を及ぼすと考えられる。そのような場合、薬剤候補物質の遺伝子発現上昇能又は低下能、あるいは細胞培養への特定の影響を予防する又は阻害する能力を試験することができる。他の例では、ポリペプチドのフラグメントのような特定代謝産物の産生は疾患又は病的状態をもたらす、又はそれらに結びつくと考えられる。そのような場合、候補薬剤が細胞培養においてそのような代謝産物の産生を低下させる能力を試験することができる。
【０２０４】
インターナリゼーションタンパク質
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶからの）を使用して、タンパク質を細胞内にインターナリゼーションすることができる。Ｆａｌｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：６６４−６６８（１９９４）参照。例えば、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質の１１個のアミノ酸配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（「タンパク質形質導入ドメイン」又はＴＡＴ　ＰＤＴと称する）は、細胞質膜及び細胞の核膜を越えた送達を媒介すると記述されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−１５７２（１９９９）；及びＮａｇａｈａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：１４４９−１４５２（１９９８）参照。これらの手順においては、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって観察したとき細胞に結合するＦＩＴＣ−構築物（ＦＩＴＣ−ＧＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）を調製する。これらの構築物はｉ．ｐ．投与後組織に侵入する。次に、ｔａｔ−ｂｇａｌ融合タンパク質を構築する。この構築物で処理した細胞はｂ−ｇａｌ活性を示した。注入後、これらの手順を用いて肝、腎、肺、心臓、及び脳組織を含めた多くの組織が発現を示すことが認められた。これらの構築物は細胞に入り込むためにある程度変性を受けたと考えられる；そのために、細胞に入った後リフォールディングが必要であると考えられる。
【０２０５】
従って、所望するタンパク質又はポリペプチドを細胞にインターナリゼーションするためにｔａｔタンパク質配列を使用しうることは理解されるであろう。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＡＦＴＩアンタゴニスト（抗ＡＦＴＩ選択結合物質、小分子、可溶性レセプタ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなど）を細胞内に投与して、ＡＦＴＩ分子の活性を阻害することができる。ここで使用するとき、「ＡＦＴＩ分子」の語は、ここで定義されるようなＡＦＴＩ核酸分子とＡＦＴＩポリペプチドの両方を指す。所望する場合には、ＡＦＴＩタンパク質自体もこれらの手法を用いて細胞に内在的に投与しうる。Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｅ．，「体細胞へのタンパク質の導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　Ｂｏｄｙ’ｓ　Ｃｅｌｌｓ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１４６６−１４６７（１９９９）も参照のこと。
【０２０６】
ＡＦＴＩポリペプチドを用いた細胞ソースの同定
本発明の一部の実施形態に従えば、ＡＦＴＩポリペプチドに関連する特定細胞型のソースを決定することは有用であると考えられる。例えば、適切な治療を選択する助けとして、疾患又は病的状態の由来を決定することは有用であろう。一部の実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする核酸をプローブとして使用して、細胞の核酸をそのようなプローブでスクリーニングすることにより、ＡＦＴＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する又は含む細胞を同定することができる。他の実施形態では、細胞におけるＡＦＴＩポリペプチドの存在を調べる、従ってそのような細胞がＡＦＴＩポリペプチドを発現するかどうか、又はそれらがＡＦＴＩポリペプチドを発現することが知られている細胞に由来するかどうかを決定するために、抗ＡＦＴＩポリペプチド抗体を使用しうる。　【０２０７】
治療用途
本発明のポリペプチド及び核酸で治療できる、診断できる、改善できる、又は予防できる急性及び慢性疾患の非排他的なリストは、ＩＬ−１及び／又はＴＮＦ活性の阻害によって治療しうる疾患を含む。
【０２０８】
ＩＬ−１の阻害
これまでに発見された最も強力な炎症性サイトカインの１つはインターロイキン−１（ＩＬ−１）である。ＩＬ−１は多くの疾患や医学的状態において鍵となるメディエイターであると思われる。ＩＬ−１はマクロファージ／単球直系の細胞によって（独占的にではないが）製造され、２つの形態で産生されると考えられる：ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α及びＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）。
【０２０９】
自発的又は実験的疾患又は医学的状態が体液中又は組織中のＩＬ−１の高いレベルに結びつく場合、又は身体から採取した細胞又は組織が培養中でＩＬ−１の高いレベルを生じる場合、疾患又は医学的状態は「インターロイキン−１媒介疾患」であるとみなされる。多くの場合、そのようなインターロイキン−１媒介疾患はまた、次の付加的な２つの条件によっても認識される：（１）疾患又は医学的状態に関連する病理学的所見がＩＬ−１の投与又はＩＬ−１の発現の上方調節により動物において実験的に模倣できる；（２）疾患又は医学的状態の実験動物モデルにおいて誘導される病理が、ＩＬ−１の作用を阻害する物質での治療によって阻害又は排除することができる。大部分のインターロイキン−１媒介疾患では３つの条件のうち少なくとも２つに合致し、多くのインターロイキン−１媒介疾患では３つの条件すべてに合致する。
【０２１０】
急性及び慢性インターロイキン−１（ＩＬ−１）媒介疾患の非排他的なリストは次のものを含むが、これらに限定されない：急性膵炎；
ＡＬＳ；
アルツハイマー病、
ＡＩＤＳ誘発の悪液質を含めた悪液質／食欲不振；
喘息及び他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；
自己免疫性血管炎；
慢性疲労症候群；
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）関連の下痢を含めたクロストリジウム関連疾病；
うっ血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連する）、及び冠状動脈バイパス移植を含めた、冠状動脈の状態及び適応症；
多発性骨髄腫及び骨髄性（例えばＡＭＬ及びＣＭＬ）その他の白血病のような癌、ならびに腫瘍転移；
糖尿病（例えばインスリン性糖尿病）；
子宮内膜症；
熱；
線維筋痛；
糸球体腎炎；
移植片対宿主病／移植拒絶反応；
出血性ショック；
痛覚過敏；
炎症性腸疾患；
変形性関節症、乾癬性関節炎及び慢性関節リウマチ（ＲＡ）を含めた関節の炎症状態；
例えば角膜移植に関連すると考えられる炎症性眼疾患；
脳虚血（例えば、各々が神経変性を導く可能性がある、外傷、てんかん、出血又は発作の結果としての脳損傷）を含めた虚血；
川崎病；
学習障害；
肺疾患（例えばＡＲＤＳ）；
多発性硬化症；
ミオパシー（例えば、特に敗血症における筋タンパク質代謝）；
神経毒性（例えばＨＩＶによって誘発されるような）；
骨粗しょう症；
癌に関連する疼痛を含めた痛み；
パーキンソン病；
歯周病；
早産；
乾癬；
再灌流損傷；
敗血症性ショック；
放射線療法からの副作用；
側頭下顎関節疾患；
睡眠障害；
ブドウ膜炎；
又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又は他の疾患プロセスから生じる炎症状態。
【０２１１】
ＴＮＦ−αの阻害
多くの疾患や医学的状態がＴＮＦによって媒介され、通常は炎症性状態として分類される。「ＴＮＦ媒介疾患」は、体液中のＴＮＦの高いレベルに関連する自発的又は実験的疾患又は医学的状態である。多くの場合、そのようなＴＮＦ媒介疾患はまた、次の事柄によって特徴付けられる：（１）疾患又は医学的状態に関連する病理学的所見がＴＮＦの投与又は発現の上方調節により動物において実験的に模倣できる；（２）実験動物モデルにおいて疾病を誘発したとき、疾患又は医学的状態がＴＮＦの作用を阻害する物質での治療によって阻害又は排除されうる。
【０２１２】
急性及び慢性ＴＮＦ媒介疾患の非排他的なリストは次のものを含むが、これらに限定されない：
悪液質／食欲不振；
癌（例えば白血病）；
慢性疲労症候群；
うっ血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連する）、及び冠状動脈バイパス移植を含めた、冠状動脈の状態及び適応症；
うつ病；
若年発症１型糖尿病及びインスリン抵抗性（例えば肥満に関連する）を含めた糖尿病；
子宮内膜症、子宮内膜炎、及び関連状態；
線維筋痛又は痛覚消失；
移植片対宿主拒絶反応；
痛覚過敏；
クローン病及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連の下痢を含めた炎症性腸疾患；
脳虚血（各々が神経変性を導く可能性がある、外傷、てんかん、出血又は発作の結果としての脳損傷）を含めた虚血；
肺疾患（例えば成人呼吸促進症候群、喘息、及び肺線維症）；
多発性硬化症；
神経炎症性疾患；
角膜移植、眼変性及びブドウ膜炎を含めた眼疾患及び状態；
眼に関連する疼痛を含めた痛み；
膵炎；
歯周病；
毛孔性紅色ひこう疹（ＰＲＰ）；
前立腺炎（細菌性又は非細菌性）及び関連状態；
乾癬及び関連状態；
肺線維症；
再灌流損傷；
慢性関節リウマチ、変形性関節症、若年性関節炎（関節リウマチ）、セロネガティブ多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、腸疾患に基づく関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎（例えば川崎病）、脳脈管炎、ライム病、ブドウ球菌誘発性（敗血症性）関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛及び巨細胞動脈炎を含めたリウマチ病；
敗血症性ショック；
放射線療法からの副作用；
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；
側頭下顎関節疾患；
甲状腺炎；
組織移植又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染（例えばＨＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及び関連種）又は他の疾患プロセスから生じる炎症状態。
【０２１３】
ＡＦＴＩの阻害因子（例えば抗ＡＦＴＩ抗体）は、患者がＴＮＦ及び／又はＩＬ−１の上方調節から恩恵を受けるであろう治療適用において有用であると考えられる。そのような疾患及び適応症は、癌、移植片対宿主病を含むが、これらに限定されない。
【０２１４】
ＡＦＴＩ組成物及び投与
治療組成物は本発明の範囲内である。そのようなＡＦＴＩ製薬組成物は、投与様式との適合性によって選択される製薬上又は生理的に許容される製剤物質と混合して、治療上有効な量のＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ核酸分子を含みうる。製薬組成物は、投与様式との適合性によって選択される製薬上又は生理的に許容される製剤物質と混合して、治療上有効な量の１又はそれ以上のＡＦＴＩ選択結合物質を含みうる。
許容される製剤物質は、好ましくは使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒性である。
【０２１５】
製薬組成物は、例えば組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸着又は浸透を変化させる、維持する又は保存するための製剤物質を含みうる。適当な製剤物質は、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンなど）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）、充填剤（マンニトール又はグリシンなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、増量剤、単糖類、ニ糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）、着色料、着香料及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）、沈殿防止剤、界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０のようなポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなど）、安定化促進剤（スクロース又はソルビトール）、張度増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウム又はカリウム）、マンニトール、ソルビトールなど）、送達賦形剤、希釈剤、賦形剤及び／又は製薬佐剤（「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］）を含むが、これらに限定されない。
【０２１６】
至適製薬組成物は、例えば意図する投与経路、送達形式、及び所望する用量に依存して当業者によって決定される。例えば、「レミントンの製薬科学」、前出参照。そのような組成物は、ＡＦＴＩ分子の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼしうる。
【０２１７】
製薬組成物における主要賦形剤又は担体は、本来水性又は非水性のいずれかでありうる。例えば、適当な賦形剤又は担体は、おそらく非経口投与組成物において一般的な他の物質を補足した、注射用蒸留水、生理食塩水、又は人工脳脊髄液でありうる。中性緩衝食塩水又は血清アルブミンと混合した食塩水はさらなる例示的賦形剤である。他の例示的製薬組成物は、ソルビトール又はその適当な代用物をさらに含みうる、約ｐＨ７．０から８．５のトリス緩衝液、又は約ｐＨ４．０から５．５の酢酸緩衝液を含む。本発明の１つの実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチド組成物は、所望する純度を備えた選択組成物を至適製剤物質（「レミントンの製薬科学」、前出）と混合することにより、凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で保存用に調製することができる。さらに、ＡＦＴＩポリペプチド製品はスクロースのような適切な賦形剤を用いて凍結乾燥品として製剤しうる。
【０２１８】
ＡＦＴＩ製薬組成物は非経口送達用に選択することができる。代替的には、吸入用又は経口のような消化管を通しての送達用に選択することもできる。そのような製薬上許容される組成物の調製は当該技術の範囲内である。
【０２１９】
製剤成分は投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝液は組成物を生理的ｐＨ又はわずかに低いｐＨ、典型的には約５から約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。
【０２２０】
非経口投与を考慮するときには、本発明で使用するための治療組成物は、所望するＡＦＴＩ分子を製薬上許容される賦形剤中に含む、発熱物質不含の非経口的に許容される水溶液の形態をとりうる。非経口注入に特に適する賦形剤は、ＡＦＴＩ分子が無菌等張液として製剤され、適切に保存される無菌蒸留水である。さらにもう１つの製剤は、その後蓄積注射として送達されうる製品の制御又は持続放出を提供する、注射用ミクロスフェア、生物食用粒子、高分子化合物（ポリアクチン酸、ポリグリコール酸）、又はビーズ、又はリポソームのような物質と所望する分子との製剤を含みうる。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環中に存在する期間を延長する作用を持つと考えられる。所望する分子の導入のための他の適当な手段は、移植可能な薬剤送達装置を含む。
【０２２１】
１つの実施形態では、製薬組成物は吸入用に製剤することができる。例えば、ＡＦＴＩ分子は吸入用乾燥粉末として製剤しうる。ＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ核酸分子の吸入溶液も、エーロゾル送達のための推進薬と共に製剤しうる。さらにもう１つの実施形態では、溶液を噴霧することができる。肺投与はさらに、化学修飾したタンパク質の肺送達を述べたＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に詳述されている。
【０２２２】
また、一部の製剤は経口的に投与しうると想定される。本発明の１つの実施形態では、そのように投与されるＡＦＴＩ分子は、錠剤及びカプセルのような固形投与形態の配合剤において慣例的に使用される担体と共に又は担体なしで製剤することができる。例えば、バイオアベイラビリティーを最大化し、プレシステミック分解を最小限に抑えるときには、製剤の活性部分を胃腸管内の部位で放出するようにカプセルを設計することができる。ＡＦＴＩ分子の吸収を促進するために付加的なアゴニストを含めることができる。希釈剤、着香剤、低融点のろう、植物油、潤滑剤、沈殿防止剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も使用しうる。
【０２２３】
もう１つの製薬組成物は、錠剤の製造に適した無毒性賦形剤との混合物中に有効量のＡＦＴＩ分子を含みうる。錠剤を滅菌水又は他の適切な賦形剤に溶解することにより、溶液を単位投与形態として調製することができる。適当な賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸又は重炭酸ナトリウム、ラクトース、又はリン酸カルシウムのような不活性希釈剤；あるいはデンプン、ゼラチン、又はアカシアのような結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又は滑石のような潤滑剤を含むが、これらに限定されない。
【０２２４】
さらなるＡＦＴＩ製薬組成物は、持続又は制御送達製剤中にＡＦＴＩポリペプチドを含有する製剤を含めて、当業者には明らかであろう。リポソーム担体、生物食用微粒子又は多孔性ビーズ及び蓄積注射のような様々な他の持続又は制御送達手段を製剤するための手法も当業者には既知である。例えば、製薬組成物の送達のための多孔性高分子微粒子の制御放出を述べているＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号参照。持続放出性製剤のさらなる例は、成形品、例えば薄膜、又はマイクロカプセルの形態の半透性高分子基質を含む。持続放出性基質は、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及びＥＰ第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）及びＬｎａｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、前出）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ第１３３，９８８号）を含みうる。持続放出性組成物はまた、当該技術において既知のいくつかの方法のいずれかによって調製できるリポソームを含みうる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ第３６，６７６号；ＥＰ第８８，０４６号；ＥＰ第１４３，９４９号参照。
【０２２５】
インビボ投与に使用するＡＦＴＩ製薬組成物は典型的には無菌でなければならない。これは無菌ろ過膜を通してろ過することによって達成しうる。組成物を凍結乾燥する場合には、これらの方法を用いた滅菌は凍結乾燥及び還元の前又は後のいずれかに実施しうる。非経口投与用組成物は凍結乾燥形態又は溶液として保存することができる。さらに、非経口用組成物は一般に、無菌アクセスポートを持つ容器、例えば皮下注射針によって貫通しうる栓を備えた静脈内溶液バッグ又はバイアルに納められる。
【０２２６】
ひとたび製薬組成物が製剤されれば、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体、あるいは脱水又は凍結乾燥粉末として無菌バイアル中で保存できる。そのような製剤は、即時使用形態又は投与前に還元を必要とする形態（例えば凍結乾燥）のいずれかで保存しうる。
【０２２７】
特定実施形態では、本発明は単回投与単位を生成するためのキットを対象とする。キットは各々、乾燥タンパク質が入った第一容器と水性製剤が入った第二容器を含みうる。単一又は多チェンバー予備充填注射器（例えば液体注射器及びリオシリンジ）を含むキットも本発明の範囲内に包含される。
【０２２８】
治療的に使用されるＡＦＴＩ製薬組成物の有効量は、例えば治療の背景と目的に依存するであろう。当業者は、それ故治療のための適切な用量レベルが、一部には、送達される分子、ＡＦＴＩ分子が使用される適応症、投与経路、及び患者のサイズ（体重、体表面積又は器官のサイズ）と状態（年齢及び全身の健康状態）に依存して変化することを認識するであろう。従って、臨床医は最大の治療効果を得るために用量を調節し、投与経路を変更することができる。典型的な用量は、上述した因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで又はそれ以上の範囲をとりうる。他の実施形態では、用量は０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；又は１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；又は５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲をとりうる。
【０２２９】
投与頻度は、使用する製剤中のＡＦＴＩ分子の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は所望する効果を達成する用量に達するまで組成物を投与する。組成物は、それ故、単回用量として、あるいは経時的に投与される２回又はそれ以上の用量（同じ量の所望する分子を含む又は含まない）として、あるいは移植装置又はカテーテルを通しての持続注入として投与しうる。適切な用量のさらなる改善が当業者によって常套的に行われており、当業者が常套的に実施する作業の範囲内である。適切な用量は、適切な用量−反応データの使用を通して確認できる。
【０２３０】
製薬組成物の投与経路は既知の方法、例えば経口、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路による注入、あるいは持続放出システム又は移植装置に一致する。所望する場合には、ボーラス注射によって又は注入によって持続的に、又は移植装置によって組成物を投与することができる。
【０２３１】
代替的又は付加的に、組成物は、所望する分子が吸収された又は被包された膜、スポンジ、又は他の適切な材料の移植を通して局所投与しうる。移植装置を使用する場合には、適当な組織又は器官内に装置を移植し、拡散、時間指定放出ボーラス（ｔｉｍｅｄ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｂｏｌｕｓ）、又は持続的投与によって所望する分子の送達が達成されうる。
【０２３２】
一部の場合には、エクスビボでＡＦＴＩ製薬組成物を使用することが望ましいと考えられる。そのような場合には、患者から切除した細胞、組織、又は器官をＡＦＴＩ製薬組成物に接触させ、その後細胞、組織及び／又は器官を患者の体内に移植して戻す。
また一部の場合には、ここで述べるような方法を使用して、遺伝的に構築した特定細胞を移植することによってＡＦＴＩポリペプチドを送達することができる。そのような細胞は動物又はヒト細胞であってもよく、また自己由来、異種、又は外因性でありうる。場合によっては、細胞を不朽化してもよい。免疫応答の可能性を低下させるため、周辺組織への浸潤を避けるように細胞を被包することができる。被包材料は、典型的には、タンパク質産物の放出を許容するが、患者の免疫系による又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ、生体適合性の半透性高分子封入物（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅｓ）又は膜である。
【０２３３】
単離細胞個体群（Ｔ細胞など）を１又はそれ以上のＡＦＴＩポリペプチドで治療することは望ましいと考えられる。これは、ポリペプチドが細胞膜透過性の形態である場合には、直接単離細胞をポリペプチドに暴露することによって実施できる。
【０２３４】
本発明のさらなる実施形態は、治療用ポリペプチドのインビトロ生成のため、及び遺伝子治療又は細胞治療による治療用ポリペプチドの生成と送達のための細胞及び方法（例えば相同的組換え及び／又は他の組換え生産法）に関する。相同的及び他の組換え法を使用して、通常は転写サイレントのＡＦＴＩ遺伝子、又は過小発現遺伝子を含む細胞を修飾し、それによって治療上有効な量のＡＦＴＩポリペプチドを発現する細胞を産生することができる。
【０２３５】
相同的組換えはもともと、転写活性遺伝子における突然変異を誘発する又は矯正する遺伝子を標的するために開発された手法である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．＆　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６：３０１、１９８９）。基礎手法は、特定の突然変異を哺乳類ゲノムの特定領域に導入するため（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ，４４：４１９−４２８，１９８６；ＴｈｏｍａｓとＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：８５８３−８５８７，１９８８）あるいは欠陥遺伝子内の特定突然変異を矯正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８，１９８７）の方法として開発された。例示的な相同的組換え手法は米国特許第５，２７２，０７１号（ＥＰ第９１９３０５１号、ＥＰ公開第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２号、国際特許公開第ＷＯ９１／０９９５５号）に述べられている。
【０２３６】
相同的組換えを通して、ゲノム内に挿入するＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡに結合することによって対象とする遺伝子の特定領域に指令することができる。標的ＤＮＡはゲノムＤＮＡの領域の相補的な（相同な）ヌクレオチド配列である。ゲノムの特定領域に相補的な標的ＤＮＡの小さな部分をＤＮＡ複製過程の間に親の鎖に接触させる。共有する相同領域を通して内因性ＤＮＡの他の部分とハイブリダイズし、それ故組み換わることは、細胞内に挿入されたＤＮＡの一般的特性である。この相補鎖が、突然変異又は異なる配列を含むオリゴヌクレオチドあるいは付加的なヌクレオチドに結合した場合、それもやはり組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれる。校正機能の結果として、ＤＮＡの新しい配列は鋳型として働くことができる。従って、移入されたＤＮＡがゲノム内に組み込まれる。
【０２３７】
標的ＤＮＡのこれらの断片に結合するのは、ＡＦＴＩポリペプチドと相互作用しうる又はＡＦＴＩポリペプチドの発現を制御しうるＤＮＡの領域、例えばフランキング配列である。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサー、又は外因性転写調節エレメントを、所望するＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を及ぼすのに十分な近接度と方向性で、意図する宿主細胞のゲノム内に挿入する。制御エレメントは、宿主細胞ゲノム内に存在するＤＮＡの部分を制御する。それ故、所望するＡＦＴＩポリペプチドの発現は、ＡＦＴＩ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、内因性遺伝子配列にＡＦＴＩポリペプチドの転写のための認識可能なシグナルを与えるＤＮＡ調節セグメントと結合した標的ＤＮＡ（対象とする内因性遺伝子と相同性を持つ領域を含む）の使用によって達成されると考えられる。
【０２３８】
例示的な方法では、細胞における所望標的遺伝子（すなわち所望する内因性細胞遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エクソン及びスプライス供与部位を含むＤＮＡの導入による、あらかじめ選択した部位での細胞ゲノム内への相同的組換えを通して変化する。これらの成分は、これが実際に、新しい転写単位（ＤＮＡ構築物中に存在する調節配列、エクソン及びスプライス供与部位が内因性遺伝子に作動可能に連結されている）の生成をもたらすように染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される。染色体ＤＮＡへのこれらの成分の導入の結果として、所望する内因性遺伝子の発現が変化する。
【０２３９】
ここで述べるような変化した遺伝子発現は、得られる細胞において通常はサイレントである（発現されない）遺伝子を活性化すること（又は発現を生じさせること）、ならびに得られる細胞中で生理的に有意のレベルでは発現されない遺伝子の発現を上昇させることを包含する。かかる実施形態は、得られる細胞において起こる調節又は誘導のパターンとは異なるように調節又は誘導のパターンを変化させること、及び得られる細胞において発現される遺伝子の発現を低下させること（排除することを含む）をさらに包含する。
【０２４０】
相同的組換えを使用して細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子からのＡＦＴＩポリペプチド産生を生じさせる又は上昇させることができる１つの方法は、最初に、相同的組換えを使用して部位特異的組換え系からの組換え配列（例えばＣｒｅ／ＩｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５：５２１−５２７，１９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２５：８９０−９００，１９９３）を細胞の内因性ゲノムＡＦＴＩポリペプチドコード領域の上流（すなわち５’側）に置くことを含む。ゲノムＡＦＴＩポリペプチドコード領域のすぐ上流に置いた部位に相同な組換え部位を含むプラスミドを、適切なリコンビナーゼ酵素と共に修飾した細胞系に導入する。このリコンビナーゼは、プラスミドの組換え部位を通して、細胞系のゲノムＡＦＴＩポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位にプラスミドの組込みを生じさせる（ＢａｕｂｏｎｉｓとＳａｕｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２１：２０２５−２０２９，１９９３；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３５１−１３５５，１９９１）。転写を高めることが知られているフランキング配列（例えばエンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、もしこのプラスミド内に正しく位置していれば、細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子からの新規の又は高いＡＦＴＩポリペプチド産生をもたらす新しい又は改変された転写単位を創造するように組込みを行う。
【０２４１】
部位特異的組換え配列を細胞の内因性ゲノムＡＦＴＩポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置づけた細胞系統を使用するさらなる方法は、細胞系のゲノムのどこか別の場所に第二の組換え部位を導入するために相同的組換えを使用することである。その後適切なリコンビナーゼ酵素を２組換え部位の細胞系に導入して、細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子からの新規の又は高いＡＦＴＩポリペプチド産生をもたらす新しい又は改変された転写単位を創造する組換え事象（欠失、逆位、転位）（Ｓａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、前出、１９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，前出、１９９３）を生じさせる。
【０２４２】
細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子からＡＦＴＩポリペプチドの発現を、上昇させる又は生じさせるためのさらなるアプローチは、細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子からの新規の又は高いＡＦＴＩポリペプチド産生をもたらすように、１又はそれ以上の遺伝子（例えば転写因子）の発現を上昇させる又は生じさせる、及び／又は１又はそれ以上の遺伝子（例えば転写リプレッサー）の発現を低下させることを含む。この方法は、非天然に生じるポリペプチド（例えば転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子から新規の又は高いＡＦＴＩポリペプチド産生が生じるように細胞内に導入することを含む。
【０２４３】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。一部の実施形態では、例示的なＤＮＡ構築物は次のものを含む：（ａ）１又はそれ以上の標的配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エクソン；及び（ｄ）不対スプライス供与部位。ＤＮＡ構築物中の標的配列は、（ｂ）から（ｄ）のエレメントが内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結されるように、（ａ）から（ｄ）のエレメントを細胞内の標的遺伝子に組み込むことを指令する。もう１つの実施形態では、ＤＮＡ構築物は次のものを含み：（ａ）１又はそれ以上の標的配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エクソン；（ｄ）スプライス供与部位；（ｅ）イントロン；及び（ｆ）スプライス受容部位、標的配列は、（ｂ）から（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子に作動可能に連結されるように、（ａ）から（ｆ）のエレメントの組込みを指令する。標的配列は、相同的組換えが起こる細胞の染色体ＤＮＡ内のあらかじめ選択された部位と相同である。構築物においては、エクソンは一般に調節配列の３’側にあり、スプライス供与部位はエクソンの３’側にある。
【０２４４】
ここで提示するＡＦＴＩポリペプチドの核酸配列のような、特定遺伝子の配列が既知であれば、遺伝子の選択した領域に相補的であるＤＮＡの断片を合成する又は、対象領域と境界を接する特異的認識部位で天然ＤＮＡを適切に制限することなどによって入手することができる。この断片は細胞内への挿入の際の標的配列として使用でき、ゲノム内のその相同領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に起こる場合、このＤＮＡ断片及びそれに結合している付加的な配列は岡崎フラグメントして働き、新たに合成される娘鎖のＤＮＡに組み込まれる。本発明は、それ故、標的配列として使用しうる、ＡＦＴＩポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む。
【０２４５】
ＡＦＴＩポリペプチド細胞治療、例えば、ＡＦＴＩポリペプチドを産生する細胞の移植も考慮される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＡＦＴＩポリペプチドを合成し、分泌することができる細胞を移植することを含む。そのようなＡＦＴＩポリペプチド産生細胞は、ＡＦＴＩポリペプチドの天然プロデューサーであるか、若しくは所望するＡＦＴＩポリペプチドをコードする遺伝子又はＡＦＴＩポリペプチドの発現を高める遺伝子での形質転換によってＡＦＴＩポリペプチドを産生する能力が高められた組換え細胞でありうる。そのような改変は、遺伝子を送達し、さらにその発現と分泌を促進するのに適したベクターによって達成されうる。外来種のポリペプチドの投与によって起こりうるような、ＡＦＴＩポリペプチドを投与する患者における潜在的免疫反応を最小限に抑えるため、ＡＦＴＩポリペプチドを産生する天然細胞はヒト由来であり、ヒトＡＦＴＩポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＡＦＴＩポリペプチドを産生する組換え細胞は、ヒトＡＦＴＩポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換することが好ましい。
【０２４６】
移植細胞は、周辺組織の浸潤を避けるため被包してもよい。ＡＦＴＩポリペプチドの放出は許容するが、患者の免疫系による又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ、生体適合性の半透性高分子封入物（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅｓ）又は膜内で、ヒト又はヒト以外の動物細胞を患者に移植することができる。その代わりに、エクスビボでＡＦＴＩポリペプチドを産生するように形質転換した患者自身の細胞を、そのような被包を行わずに直接患者に移植してもよい。
【０２４７】
生存細胞の被包のための手法は当該技術において既知であり、被包細胞の調製及び患者への移植は常套的に実施されうる。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＷＯ９５／０５４５２号；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９号）は、生物活性分子の有効な送達のための遺伝的に構築した細胞を含む膜カプセルを記述している。カプセルは生体適合性であり、容易に回収されうる。カプセルは、哺乳類宿主への移植の際にインビボで下方調節を受けないプロモーターに作動可能に連結された、生物活性分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションされた細胞を被包する。かかる装置はレシピエント内の特異的部位に生存細胞からの分子を送達することを提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号、５，０１１，４７２号、及び５，１０６，６２７号参照。生存細胞を被包するためのシステムは、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ特許願ＰＣＴ／ＵＳ９１／００１５７号に述べられている。また、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ特許願ＰＣＴ／ＵＳ９１／００１５５号；Ｗｉｎｎら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１３：３２２−３２９（１９９１）、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１１：２６９−２７５（１９９１）；及びＴｒｅｓｃｏら、ＡＳＡＩＯ、３８：１７−２３（１９９２）も参照のこと。
【０２４８】
ＡＦＴＩポリペプチドのインビボ及びインビトロでの遺伝子治療送達も想定される。遺伝子治療手法の１つの例は、構成的又は誘導的プロモーターに作動可能に連結されうる、ＡＦＴＩポリペプチドをコードするＡＦＴＩ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／又は合成ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。プロモーターは、構築物を挿入する細胞又は組織型において活性であることを条件として、内因性ＡＦＴＩ遺伝子に相同又は非相同のいずれでもよい。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、場合によっては、部位特異的組込み用に設計されたＤＮＡ分子（例えば相同的組換えのために有用な内因性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサー又はサイレンサー、親細胞に比べて選択優位性を提供することができるＤＮＡ分子、形質転換細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、陰性選択システム、細胞特異的結合物質（例えば細胞ターゲティングのための）、細胞特異的インターナリゼーション因子、及びベクターによる発現を高める転写因子ならびにベクターの製造を可能にする因子を含みうる。
【０２４９】
次にウイルス又は非ウイルスベクターを使用して遺伝子治療ＤＮＡ構築物を細胞に導入することができる（エクスビボ又はインビボのいずれかで）。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、ここで述べるようなウイルスベクターによるものである。レトロウイルスベクターのような一部のベクターは、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、遺伝子を染色体ＤＮＡに組み込むことができる。他のベクターはエピソームとして機能し、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は細胞質内にとどまる。
【０２５０】
さらなる他の実施形態では、標的細胞におけるＡＦＴＩ遺伝子の制御された発現のために調節エレメントを含めることができる。そのようなエレメントは適切なエフェクターに応答して作動する。そのようにして、所望するときには治療的ポリペプチドを発現することができる。従来の制御手段の１つは、ＤＮＡ結合タンパク質又は転写活性化タンパク質のような、小分子結合ドメイン及び生物学的プロセスを開始させることができるドメインを含むキメラタンパク質を二量体化するために使用される、小分子ダイメライザー又はラパログ（ＷＯ９６４１８６５号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８６号）；ＷＯ９７３１８９８号（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３１３７号）及びＷＯ９７３１８９９号（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１５７号）に述べられているような）の使用を含む。タンパク質の二量体化を使用して、ＡＦＴＩ遺伝子の転写を開始することができる。
【０２５１】
他の適当な制御システム又は遺伝子スイッチは次のシステムを含むが、これらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）はプロゲステロンアンタゴニストとして使用される。プロゲステロンアンタゴニストへの修飾プロゲステロンレセプタリガンド結合ドメインの結合は、２つの転写因子の二量体を形成することによって転写を活性化し、つぎにそれが核内へと通過してＤＮＡに結合する。リガンド結合ドメインは、天然リガンドに結合するレセプタの能力を排除するように修飾される。修飾ステロイドホルモンレセプタ系はさらに米国特許第５，３６４，７９１号；ＷＯ９６４０９１１号；及びＷＯ９７１０３３７号に述べられている。
【０２５２】
さらにもう１つの制御システムは、エクジソンレセプタ（細胞質レセプタ）に結合してそれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。次にレセプタは核に転位して、特異的ＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子からのプロモーター）に結合する。エクジソンレセプタは、転写を開始させるトランス活性化ドメイン／ＤＮＡ結合ドメイン／リガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、さらに米国特許第５，５１４，５７８号；ＷＯ９７３８１１７号；ＷＯ８６３７６０９号；及びＷＯ９３０３１６２号において記述されている。
【０２５３】
もう１つの制御システムは、陽性テトラサイクリン制御可能トランス活性化因子を使用する。このシステムは、転写を活性化するポリペプチドに連結された突然変異ｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランス活性化因子タンパク質を生じる突然変異ｔｅｔＲ−４アミノ酸変化、すなわちテトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。そのような系は米国特許第５，４６４，７５８号；５，６５０，２９８号及び５，６５４，１６８号に述べられている。
【０２５４】
さらなる発現制御システム及び核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．への米国特許第５，７４１，６７９号及び５，８３４，１８６号に述べられている。
【０２５５】
インビボ遺伝子治療は、ＡＦＴＩ核酸分子の局所注入を通して、あるいは他の適切なウイルス又は非ウイルス送達ベクターにより、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする遺伝子を細胞に導入することによって実施されうる。Ｈｅｆｔｉ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２５：１４１８−１４３５（１９９４）。例えば、標的細胞への送達のためにＡＦＴＩポリペプチドをコードする核酸分子をアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに組み込むことができる（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，国際特許公開第ＷＯ９５／３４６７０号；国際特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８号）。組換えＡＡＶゲノムは、典型的には、機能的プロモーター及びポリアデニル化配列に作動可能に連結されたＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接する、ＡＡＶ逆方向末端反復配列を含む。
【０２５６】
代替的な適当なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、及びパピローマウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含む、インビボでのウイルスを介した遺伝子導入システムを述べている。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようにインビトロで処理したヒト細胞を送達することにより、患者に治療タンパク質を供給するための方法の例を提供している。遺伝子治療手法の実施のためのさらなる方法及び材料は、アデノウイルスベクターに関する米国特許第５，６３１，２３６号；レトロウイルスベクターに関する米国特許第５，６７２，５１０号；及びサイトカインを発現するレトロウイルスベクターに関する米国特許第５，６３５，３９９号に記述されている。
【０２５７】
ウイルス以外の送達方法は、リポソームを介した導入、裸のＤＮＡ送達（直接注入）、レセプタを介した導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、及び微粒子衝撃（例えば遺伝子ガン）を含むが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料及び方法はまた、誘導的プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組込みのための設計されたＤＮＡ配列、親細胞に比べて選択優位性を提供することができるＤＮＡ配列、形質転換細胞を同定するための標識、陰性選択システム及び発現制御システム（安全上の措置）、細胞特異的結合物質（細胞ターゲティングのため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、及びベクターによる発現を高める転写因子ならびにベクター製造の方法の使用を含みうる。遺伝子治療手法の実施のためのそのような付加的な方法及び材料は、エレクトロポレーション手法に関する米国特許第４，９７０，１５４号；核リガンドに関するＷＯ９６／４０９５８号；遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を述べる米国特許第５，６７９，５５９号；リポソーム担体に関する米国特許第５，６７６，９５４号；リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法に関する米国特許第５，５９３，８７５号；及び生物活性粒子が細胞の表面を貫通し、細胞の内部に組み込まれる速度で、粒子を細胞において推進する、米国特許第４，９４５，０５０号に記述されている。
【０２５８】
また、ＡＦＴＩ遺伝子治療又は細胞治療がさらに、同じか又は異なる細胞中の１又はそれ以上の付加的なポリペプチドの送達を含みうることも考慮される。そのような細胞は、患者に別々に導入するか、若しくは上述した被包膜のような単一の移植可能な装置に組み込むか、あるいはウイルスベクターによって別々に改変することができる。
【０２５９】
遺伝子治療を通して細胞における内因性ＡＦＴＩポリペプチドの発現を上昇させる１つの方法は、エンハンサーエレメントがＡＦＴＩ遺伝子の転写活性を高める働きをすることができる場合には、１又はそれ以上のエンハンサーエレメントをＡＦＴＩポリペプチドプロモーターに挿入することである。使用するエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することを所望する組織に基づいて選択し、その組織においてプロモーターの活性化をもたらすことが知られているエンハンサーエレメントを選択する。例えば、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする遺伝子をＴ細胞において「作動させる」場合には、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用できる。ここでは、付加する転写エレメント機能的部分を、標準的なクローニング手法を用いてＡＦＴＩポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに挿入することができる（そして場合によっては、ベクター及び／又は５’及び／又は３’フランキング配列、等々に挿入することができる）。「相同的組換え構築物」として知られるこの構築物を、次に、エクスビボ又はインビボのいずれかで所望する細胞に導入することができる。
【０２６０】
遺伝子治療はまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによってＡＦＴＩポリペプチドの発現を低下させるためにも使用できる。そのような改変は典型的には相同的組換え法によって実施される。例えば、不活性化のために選択したＡＦＴＩ遺伝子のプロモーターの全部又は一部を含むＤＮＡ分子を、転写を調節するプロモーターの断片を除去する及び／又は置換するように構築することができる。例えば、標準的な分子生物学手法を用いて、プロモーターの転写活性化因子のＴＡＴＡボックス及び／又は結合部位を欠失させることができる；そのような欠失はプロモーター活性を阻害することができ、それによって対応するＡＦＴＩ遺伝子の転写を抑制する。ＴＡＴＡボックス又はプロモーター内の転写活性化因子結合部位の欠失は、１又はそれ以上のＴＡＴＡボックス及び／又は転写活性化因子結合部位のヌクレオチドを１又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入によって突然変異させたＡＦＴＩポリペプチドプロモーター（調節するＡＦＴＩ遺伝子と同じか又は関連する種からの）の全部又は関連部分を含むＤＮＡ構築物を作製することによって達成されうる。その結果、ＴＡＴＡボックス及び／又は活性化因子結合部位は低い活性を持つか又は完全に不活性化される。構築物は典型的には、改変したプロモーターセグメントに隣接する天然の（内因性）５’及び３’ＤＮＡ配列に対応する、少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む。構築物は、ここで述べるように直接に又はウイルスベクターを通して適切な細胞に導入しうる（エクスビボ又はインビボのいずれかで）。典型的には、プロモーター構築物内の５’及び３’ＤＮＡ配列が、内因性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを通して改変プロモーター領域の組み込みを助ける役割を果たすことができる場合には、細胞のゲノムＤＮＡへの構築物の組み込みは相同的組換えを通して行われる。
【０２６１】
ＡＦＴＩ核酸及びポリペプチドの使用
ＡＦＴＩ核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしないものを含む）は、哺乳類組織又は体液標本中のＡＦＴＩ又はアポ−Ａ−１　ＤＮＡあるいは対応するＲＮＡの存在を定性的又は定量的に調べる診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であると考えられる。
【０２６２】
ＡＦＴＩポリペプチドは、治療する適応症にとって適切であるときには、１又はそれ以上のサイトカイン、成長因子、抗生物質、抗炎症薬、及び／又は化学療法剤と組み合わせて使用しうる。
【０２６３】
１又はそれ以上のＡＦＴＩポリペプチドの活性を阻害することを所望する場合、他の方法も使用しうる。発現制御配列（三重らせん形成）又はＡＦＴＩ　ｍＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズする核酸分子によってそのような阻害を生じさせることができる。例えば、選択したＡＦＴＩ遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を持つアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子を細胞に導入することができる。アンチセンスプローブは、ここで開示するＡＦＴＩポリペプチドをコードする配列を用いて、使用可能な手法によって設計しうる。典型的には、そのような各々のアンチセンス分子は選択した各ＡＦＴＩ遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。その後アンチセンス分子を対応するＡＦＴＩ　ｍＲＮＡにハイブリダイズすると、このｍＲＮＡの翻訳が妨げられる又は低下する。アンチセンス阻害因子は、細胞又は生物におけるＡＦＴＩポリペプチドの低下又は不在に関する情報を提供する。
【０２６４】
代替的に、遺伝子治療を用いて１又はそれ以上のＡＦＴＩポリペプチドのドミナントネガティブ阻害因子を創造することができる。この場合には、各選択ＡＦＴＩポリペプチドの突然変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、ここで述べるようなウイルス又は非ウイルス法を用いて患者の細胞に導入することができる。各々のそのような突然変異体は、典型的にはその生物学的役割に関して内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２６５】
さらに、ＡＦＴＩポリペプチドは、生物学的に活性であるか否かに関わらず、免疫原として使用しうる、すなわちポリペプチドは、それに対する抗体が惹起されうる少なくとも１個のエピトープを含む。ＡＦＴＩポリペプチド（ここで述べるような）に結合する選択結合物質は、体液又は細胞試料中のＡＦＴＩポリペプチドの存在を検出するための標識形態での使用を含むがこれに限定されない、インビボ及びインビトロでの診断目的に使用しうる。抗体はまた、ここで挙げるものを含めて、多くの疾患及び障害を予防する、治療する、又は診断するために使用しうる。抗体は、ＡＦＴＩポリペプチドの特徴的な少なくとも１つの活性を低下させる又は遮断するようにＡＦＴＩポリペプチドに結合しうる、又はＡＦＴＩポリペプチドの特徴的な少なくとも１つの活性を高めるようにポリペプチドに結合しうる（ＡＦＴＩポリペプチドの薬物動態を高めることによる場合を含めて）。
【０２６６】
単球によるＩＬ−１β及びＴＮＦ−α産生へのアポ−Ａ−１の作用
アポ−Ａ−１は、アポリポタンパク質と称される、脂質と種々の両親媒性ペプチドの高分子複合体であるＨＤＬの主要成分である。アポリポタンパク質は、ＨＤＬが種々の機能を果たすことを可能にする一連の活性を有しており（Ｂａｒｔｅｒら、１９９６、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　１２１：１−１２）、それらの機能は最初、血液の脂質代謝へのそれらの作用によるものと考えられた。最近になって、ＨＤＬが単球上のＣＤ−１４レセプタを下方調節することを示した（Ｐａｊｋｒｔら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１６０１−１６０８）、ヒト志願者において例示されたような抗炎症機能を含めて、ＨＤＬが一連の活性を持つことが明らかになった（Ｃａｌａｂｒｅｓｉら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．８：２１９−２２４；Ｍｉｙａｚａｋｉら、１９９５、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．２：３０−３６）。ＨＤＬはまた、リポ多糖類（ＬＰＳ）と競合することによって抗炎症機能を示し、それ故内毒素活性の低下に寄与する（Ｂａｕｍｂｅｒｇｅｒら、１９９１、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ　５９：３７８−３８３）。ＨＤＬの抗炎症機能の機序と生理的関連性は明らかにされていないが、下記の実施例１で述べる結果は、この活性の少なくとも一部はアポ−Ａ−１による単球のＴ細胞シグナル伝達の阻害に帰せられるであろうことを示唆している。
【０２６７】
データは、ＨＤＬがアポ−Ａ−１の結合を通して刺激Ｔ細胞と相互作用することを明らかにしている。そのような相互作用は、アポ−Ａ−１をリガンドとして認識するヒトリンパ球上の特異的ＨＤＬ結合部位の存在を明らかにした試験において記述された（Ｊｕｒｇｅｎｓら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８５４９−８５５６）。このＨＤＬレセプタは同定されなかったが、ＨＤＬを補足した無血清培地で培養したとき、Ｔリンパ球によるＨＤＬ脂質の利用がその責任を担うと主張された。より最近の試験に従えば（Ｈｉｄａｋａら、１９９９、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．４０：１１３１−１１３９）、下記の実施例１で述べる結果は、ＨＤＬが典型的には刺激されていないＴリンパ球には結合しないことを明らかにしている。これらの所見は、アポ−Ａ−１関連ＨＤＬが刺激されたＴ細胞と相互作用しうることを示している。この相互作用が単球のＴ細胞シグナル伝達の阻害に関与すると考えられる。さらに、フローサイトメトリー分析に従えば、ＨＤＬは単球に結合する。これは全ＰＢＭＣ中での単球へのＨＤＬ（ＨＤＬ３）の結合を示した公表データ（Ｈｉｄａｋａら、１９９９、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．４０：１１３１−１１３９）と一致する。それ故、ＨＤＬが、直接後者の細胞の活性化のレベルを調節することにより、単球の活性化にも影響を及ぼす可能性が非常に高い。これは図７に示す結果によって確認される。実際に、刺激後に加えたアポ−Ａ−１（刺激ＨＵＴ−７８細胞又はＴリンパ球の膜）がまだサイトカイン産生作用を阻害することができるという前提は、単球／ＴＨＰ−１細胞への阻害因子の直接作用を示唆する。休止ＴＨＰ−１細胞に関してはＨＤＬの結合又は機能活性は認められていないが、休止ＴＨＰ−１細胞は分化された（活性化された）ＨＤＬレセプタを発現しうる（Ｗｅｓｔｍａｎら、１９９５、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５５：２３−３３）。それ故、下記の実施例１で述べる結果は、ＨＤＬ関連のアポ−Ａ−１が、一部の実施形態に従えば、２つの異なる経路を通して刺激Ｔ細胞と接触することにより、単球の活性化の際のプロ炎症性サイトカインの産生を阻害することを明らかにしている：主要経路は、Ｔ細胞上の活性化因子の単球上レセプタへの結合の遮断であり、従ってＴＮＦ−αとＩＬ−１βの両方の発現を阻害する。もう１つの経路は、レセプタへの結合を通した単球へのアポ−Ａ−１関連ＨＤＬの直接作用であると考えられ、従って直接サイトカインの産生を阻害する。後者の作用はまだ証明されていないが、これらの二元的な作用は、ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−αとＩＬ−１β産生の阻害の程度の違いを説明すると考えられる。
【０２６８】
実施例１の結果は刺激Ｔ細胞表面のアポ−Ａ−１のリガンドを同定しなかったが、ＳＲ−Ｂ１又はＣＤ３６のようなＨＤＬレセプタタンパク質が関与する可能性は低い。これらのレセプタはＬＤＬと相互作用することができる特定のアポリポタンパク質に特異性を示さないからである（Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｍ．，１９９９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：５２３−５５８；Ｆｉｄｇｅ，Ｎ．Ｈ．，１９９９、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｄ．４０：１８７−２０１）。ＬＤＬは単球のＴ細胞シグナル伝達に対して検出可能な阻害活性を示さない（データは示していない）。他方で、ラット肝原形質膜及びヒト血液単球において発現される特異的ＨＤＬ結合タンパク質（ＨＢ_１及びＨＢ_２）が記述された（Ｈｉｄａｋａら、１９９９、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．４０：１１３１−１１３９）。ＨＢ_２は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞接着分子であるＡＬＣＡＭに相同である（Ｆｉｄｇｅ，Ｎ．Ｈ．，１９９９、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｄ．４０：１８７−２０１）。アポ−Ａ−１がＨＤＬのＨＢ_２への結合に関したことから、刺激Ｔ細胞上のＨＤＬレセプタはＨＢ_２タンパク質ファミリーと何らかの相同性を持つ可能性がある。最近、内性因子−ビタミンＢ１２複合体（すなわちキュビリン）の腸吸収のための高親和性レセプタとして知られるタンパク質が、ＨＤＬのエンドサイトーシス（Ｋｏｚｙｒａｋｉら、１９９９、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：６５６−６６１）を促進するアポ−Ａ−１に高い親和性を示すことが明らかにされた。後者の４６０ｋＤａタンパク質又はＨＢ_２が刺激Ｔリンパ球において発現されるか否かはまだ測定されていない。刺激Ｔ細胞上のアポ−Ａ−１／ＨＤＬレセプタの同定は、単球のＴ細胞シグナル伝達阻害因子の作用機序の解明を可能にするであろう。
【０２６９】
単球のＴ細胞シグナル伝達の阻害は血流中で低いレベルの単球活性化を維持する上で重要であると考えられるが、この試験で使用した静的条件は血流によって加えられるずれ応力を反映しないと思われる。最近、若年性ＲＡにおける炎症状態が低ＨＤＬ血症（Ｔｓｅｌｅｐｉｓら、１９９９、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４２：３７３−３８３）及びこの疾患を有する患者の血漿中のアポ−Ａ−１濃度の有意の低下に結びつくことが示された。ＲＡにおいては、アポ−Ａ−１（Ａｎａｎｔｈら、１９９３、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　４２：８０３−８０６；Ｌｏｒｂｅｒら、１９８５、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２４：２５０−２５５；Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９８、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　１９：３５５−３６３）又はＨＤＬコレステロール（Ａｎａｎｔｈら、１９９３、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　４２：８０３−８０６；Ｌｏｒｂｅｒら、１９８５、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２４：２５０−２５５；Ｊｏｖｅｎら、１９８４、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．２７：１１９９−１２００）の血漿レベルには変化がなかった又は低下したという議論の余地のある報告が為されている。しかしながら、アポ−Ａ−１の濃度は滑液中では血漿中よりも１０倍低いが、ＲＡ患者の滑液においてアポ−Ａ−１が増強されることは明らかである（Ａｎａｎｔｈら、１９９３、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　４２：８０３−８０６）。ＲＡ患者の滑液中でのアポ−Ａ−１の上昇はコレステロールの上昇を伴い、炎症部位へのＨＤＬ粒子の浸潤を示唆した。
【０２７０】
実際に、サイトカイン（ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α）及びメタロプロテイナーゼのような炎症性因子の活性が特異的阻害因子によって打ち消されることは炎症においては一般的である。慢性炎症では、調節機序が炎症性因子に打ち負かされると思われる。発明者が仮定するように、単球のＴリンパ球シグナル伝達が重要なプロ炎症機序である場合には、この活性を制御する阻害因子が存在するはずである。ＨＤＬ関連のアポ−Ａ−１はこれらの調節因子の１つであることが明らかにされた。ＲＡ患者の滑液中にアポ−Ａ−１が存在することは、炎症反応を抑制しようとする生物の応答であると考えられる。アポ−Ａ−１濃度の変化は、もう１つの自己免疫性病因の炎症性疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）においても認められ（Ｌａｈｉｔａら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．３６：１５６６−１５７４）、この場合にはアポ−Ａ−１の血漿濃度が低下した。この低下は３２％の患者において抗アポ−Ａ−１抗体の存在に結びついていた（Ｄｉｎｕら、１９９８、Ｇ，Ｌｕｐｕｓ　７：３５５−３６０）。これもやはりアポ−Ａ−１の抗炎症性機能を示唆している。
【０２７１】
ＨＤＬの濃度とアテローム性動脈硬化症の発生率には広く確立された逆相関が存在する。炎症応答はアテローム性動脈硬化症の不可欠の部分であるという主張（Ｒｏｓｓ，Ｒ．，１９９９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０−１１５−１２６）を強力に裏付ける証拠が増えつつある。実際に、単球−マクロファージ及びＴリンパ球は病変発現のすべての時期に存在し、最も初期の病変（脂肪線条）は主としてマクロファージとＴリンパ球から成る（Ｓｔａｒｙら、１９９４、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８９：２４６２−２４７８）。それ故、この疾患においては単球のＴリンパ球シグナル伝達が起こると考えられる。活性化単球−マクロファージによるメタロプロテイナーゼの放出はプラーク基質を弱め、プラークの破壊と血栓形成の急性期を早めると思われる（Ｌｅｅら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：１８５９−１８６７）ので、ＨＤＬは、Ｔリンパ球による単球活性化の低下を含めて、アテローム性動脈硬化症のいくつかのレベルで防護機能を及ぼすと考えられる。
【０２７２】
ここで述べる結果は、ＨＤＬ関連アポ−Ａ−１の抗炎症性機能を同定する。一部の実施形態に従えば、これは、血液循環中に刺激Ｔリンパ球が認められる炎症状態での単球−マクロファージの過剰活性化に対する一般的な防護機序ならびに血漿タンパク質が炎症組織内に漏洩したときの重要な対抗調節機序であると考えられる。今回の結果から生じた新しい概念は、アポ−Ａ−１のような「ネガティブな」急性期タンパク質の抗炎症性因子としての重要性である。
【０２７３】
下記の実施例は、例示目的だけを意図したものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【０２７４】
実施例１：Ｔリンパ球との接触を通して刺激したヒト単球においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を阻害するためのアポ−Ａ−１の使用
実験材料及び方法
実験材料及び試薬。Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ（尋常性インゲンマメ）ロイコフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（Ｅ−Ｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）；酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）、パラホルムアルデヒド、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、ヨードアセトアミド、硫酸ポリミクシンＢ、ノイラミニダーゼ、及びウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；ＲＰＭＩ−１６４０、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ−グルタミン（Ｇｉｂｓｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を指定供給業者から購入した。他の試薬はすべて分析グレード以上であった。
【０２７５】
ヒト血清。プールヒト血清（ＨＳ）をｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｖａから入手した。
【０２７６】
Ｔ細胞及びＴ細胞原形質膜の調製。ヒトＴ細胞系統（Ｇａｚｄａｒら、１９８０、Ｂｌｏｏｄ　５５：４０９−４１７）、ＨＵＴ−７８をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。細胞を、５％ＣＯ_２−空気加湿大気中３７℃で、１０％熱不活化ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ＩＵ／ｍｌペニシリン及び２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（完全ＲＰＭＩ培地）中に保持した。ＨＵＴ−７８細胞（１×１０^６細胞／ｍｌ）をＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）及びＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）によって６時間刺激した。刺激したＨＵＴ−７８細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定するか（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｓｌｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋａｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３）、若しくは以前に述べられているように（Ｂｕｒｇｅｒら、１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４１：１７４８−１７５９）それらの原形質膜を調製した。Ｔリンパ球を以前に述べられているように（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６）健常ドナーの軟膜から得た。Ｔリンパ球は、フローサイトメトリーによって評価したとき、９４から９８％ＣＤ２＋、８３から９４％ＣＤ３＋、及び≦２％ＣＤ１４^＋を含んだ。Ｔリンパ球をＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）及びＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）によって４８時間刺激し、十分に洗って、以前に述べられているように（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｓｌｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋａｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３）１％パラホルムアルデヒドで固定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）での密度遠心分離によって健常ドナーの軟膜から得た。
【０２７７】
単球及び単球性細胞。急性単球性白血病の患者に由来するヒト単球性細胞系統ＴＨＰ−１（Ｔｓｕｃｈｉｙａら、１９８０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　２６：１７１−１７６）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。末梢血単球を記述されているように入手した（Ａｒｍａｎｔら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４８６８−４８７５）。
【０２７８】
ＰＭＢＣ培養。ＰＭＢＣを９６穴培養プレートにおいて４×１０^５細胞／２００μｌ／穴の密度で、指示された刺激の存在下に４８時間（サイトカイン産生）又は７２時間（増殖）培養した。増殖アッセイについては、細胞を採集する２４時間前に^３Ｈ−チミジンを加えた。
【０２７９】
タンパク質濃度及びＮ末端マイクロシーケンス法。Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法によってタンパク質濃度を測定した。精製阻害分画を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に移して、クマシーブルー染色によって視覚化した。Ｍ_ｒ２８ｋＤａのバンドを切り出し、Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９４−ＨＴタンパク質シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でＮ末端配列分析を実施した。
ＴＨＰ−１細胞及び単球の活性化。ＴＨＰ−１細胞（５×１０^４細胞／穴）又は単球（８×１０^４細胞／穴）を９６穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＵＫ　Ｌｔｄ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）に分配し、指示された阻害因子の存在下又は不在下に総容量２００μｌの完全ＲＰＭＩ培地中で指示された刺激によって活性化した。４８時間後、培養上清を、以前に述べられているように（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｓｌｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋａｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３）ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの含量に関して分析した。
高密度超遠心分離による血清ＨＤＬの単離。Ｈａｖｅｌら、１９５５、Ｊ．Ｃｌｔｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４：１３４５−１３５３に従ってＨＳリポタンパク質を単離した。簡単に述べると、カイロミクロンを除去するため、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＪＡ　２０．１ローターを使用して２０，０００ｒｐｍで４５分間ＨＳを遠心分離した。次にカイロミクロン不含血清を５０，０００ｒｐｍで２４時間３７分間遠心分離した。超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を含む上部相を廃棄した。下部相を、固体ＮａＢｒを加えて１．０６３ｇ／ｍｌの密度に調整し、５０，０００ｒｐｍで２４時間３７分間遠心分離した。上部相で回収された低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を廃棄した。下部相を、固体ＮａＢｒを加えてｄ＝１．２３ｇ／ｍｌに調整し、４５，０００ｒｐｍで６０時間４７分間遠心分離した。上部相で高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）が回収され、下部層は残りの血清タンパク質を含んだ。超遠心分離はすべてＢｅｃｋｍａｎ　５０．２　Ｔｉローターを使用して４℃で実施した。
【０２８０】
回収したリポタンパク質とタンパク質分画をＰＢＳに透析し、それらの阻害活性を調べた。簡単に述べると、ＴＨＰ−１細胞（５×１０^４細胞／穴）又は単球（８×１０^４細胞／穴）を９６穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＵＫ　Ｌｔｄ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）に分配し、種々の希釈の分画の存在下に総容量２００μｌの完全ＲＰＭＩ培地中で刺激Ｔ細胞から単離した膜によって活性化した。４８時間後、培養上清を、以前に述べられているように（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｓｌｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋａｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３）ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの含量に関して分析した。
【０２８１】
フローサイトメトリー。ＨＤＬを、記述されているように（Ｈｉｄａｋａら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．４０：１１３１−１１３９）フルオレセインチオシアネート（ＦＩＴＣ−ＨＤＬ）で標識した。ＦＩＴＣ−ＨＤＬの細胞への結合を、基本的に以前に述べられているようにして（Ｄｅａｇｅら、１９９８、Ｍ．Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．９：６６３−６６８）フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ，Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）での直接フローサイトメトリーによって分析した。生存細胞のゲーティング時に平均蛍光強度を記録し、４×１０対数スケールの任意単位で表した。陽性細胞のパーセンテージは、非複合ＦＩＴＣ対照を越える蛍光事象のパーセンテージに基づいた。
【０２８２】
ＨＤＬの脱脂。記述されているように（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｃ．Ｊ．，１９８６、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８：２１３−２２２）ＨＤＬアポリポタンパク質の抽出を行った。簡単に述べると、超遠心分離によって単離した１容のＨＤＬを、絶えず攪拌しながら１２容の氷冷メタノールにゆっくりと加えた。次に２８容の氷冷ジエチルエーテルを溶液に加えた。氷上で１０分間攪拌した後、混合物を５００×ｇで５分間遠心分離した。タンパク質ペレットを４０容のジエチルエーテルに再懸濁した。氷上で１０分間攪拌した後、混合物を上記のように遠心分離した。ペレットを回収し、窒素フラックス下で乾燥した。凝集を最小限に抑えるため、脱脂したＨＤＬリポタンパク質を、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＮａＮ_３、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び２Ｍ塩化グアニジニウムを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中、２ｍｇタンパク質／ｍｌで可溶化し、その後ＰＢＳで透析した。
【０２８３】
プロテイナーゼＫによるＨＤＬの処理。最終容量２００μｌのＰＢＳ中３７℃で１時間、アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に結合した１単位のプロテイナーゼＫの存在下又は不在下でＨＤＬ（１００μｇタンパク質）をインキュベートした。タンパク質分解反応を遠心分離によって停止し、その効果をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【０２８４】
ＨＤＬタンパク質の電気溶出。基本的に以前に記述されているようにして（Ｂｕｒｇｅｒら、１９９０、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５４：１５６９−１５７５）、ＨＤＬタンパク質をゲル切片から電気溶出によって分離した。簡単に述べると、脱脂ＨＤＬタンパク質１ｍｇを非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを０．３Ｍ　ＣｕＣｌ_２で染色した（Ｌｅｅら、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：３０８−３１２）。検出されたバンド（Ｍ_ｒ＝５６，０００−６６，０００、５０，０００、２８，０００、及び１８，０００）を切り出し、脱染色して、５ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ及び３８４ｍＭグリシン（ｐＨ≡８．３）中で５時間電気溶出した。電気溶出したタンパク質をアセトン中で沈殿させることによってＳＤＳを除去した。タンパク質を凍結乾燥し、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＮａＮ_３、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び２Ｍ塩化グアニジニウムを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３中に再懸濁して、その後ＰＢＳで透析した。代替的には、脱脂したＨＤＬからのタンパク質を、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＮａＮ_３、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び２Ｍ塩化グアニジニウムを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中で可溶化し、同じ緩衝液中で平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ　Ｓ７５（７５×１．６ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのゲルろ過に供した。Ｍ_ｒ＝２８，０００に対応する分画をプールし、濃縮して、ＰＢＳ中で透析し、それらの阻害活性を調べた。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｏｒｐ．（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、カタログ番号１７８４７２からのマウスモノクローナル抗体を使用して、分画をウエスタンブロットによってそれらのアポ−Ａ−１含量に関して分析した。
【０２８５】
ｍＲＮＡの定量。ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者の手順に従って全ＲＮＡをＴＨＰ−１細胞及び単球から単離した。ＴＮＦ−α用のアンチセンスリボプローブを加えた市販のｈｃｋ２鋳型セット付き「ＲＮアーゼプロテクションアッセイシステム」キット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、単球とＴＨＰ−１細胞中のｍＲＮＡを定量するためにそれぞれ２μｇと１０μｇの全ＲＮＡを使用した。ＴＮＦ−αアンチセンスリボプローブは、Ｄｒ．Ｃ．Ｖ．Ｊｏｎｇｅｎｅｅｌ（Ｌｕｄｗｉｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より提供されたｐＳＰ６５／ｈＴＮＦプラスミドを線形化した後、ＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼで調製したＴＮＦ−α　ｃＤＮＡ鋳型から得た。
【０２８６】
実験結果。
【０２８７】
ヒト血清は単球とＴＨＰ−１細胞の両方のＴ細胞シグナル伝達を阻害した。
ヒト血清（ＨＳ）がサイトカインの産生を阻害することによって抗炎症作用を示すかどうかを調べるため、１０％ＦＣＳ又はＨＳのいずれかを補足した培地中で分離していないＰＢＭＣをＰＨＡによって刺激した。ＦＣＳで培養したＰＢＭＣに比べてＨＳで培養したＰＢＭＣではＴＮＦ−αとＩＬ−１βの両方の産生が阻害された（図２Ａ）が、細胞増殖はＨＳとＦＣＳで同様であった（図２Ｂ）。単球中では刺激Ｔ細胞との直接接触によってＰＢＭＣのサイトカイン産生が上昇したと考えられるので、固定して刺激したＴリンパ球又はＨＵＴ−７８細胞あるいはＨＵＴ−７８細胞からの原形質膜のいずれかをＰＢＭＣ又はＴＨＰ−１単球性細胞に加えたいくつかの培養系において、ＨＳの阻害作用を検討した。誘導されたＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を測定した（図３）。
【０２８８】
末梢血から分離したＴリンパ球をＰＨＡとＰＭＡで刺激し、固定して、ヒト血清（ＨＳ）又は胎児ウシ血清（ＦＣＳ）の存在下で、すなわち２０％の最終血清濃度でＴＨＰ−１細胞に加えた。これらの条件下で、ＴＨＰ−１細胞によるＩＬ−１βの産生はＨＳによって用量依存的に阻害されたが、ＦＣＳによっては阻害されなかった（図３Ａ）。これはＨＳにおける阻害活性の存在を明らかにしている。ヒト臍帯血清（ＣＢＳ）１０％濃度でごくわずかに阻害性であり（図２Ａ）、成人血清においてのみ阻害活性が存在することを示唆した。
【０２８９】
阻害が接触活性化された単球に特異的であることを確認するため、漸増濃度のＨＳの存在下でＴＨＰ−１細胞を固定して刺激したＨＵＴ−７８細胞又はＬＰＳとＰＭＡのいずれかによって刺激した。固定して刺激したＨＵＴ−７８細胞とＴＨＰ−１細胞の接触時に産生されるＩＬ−１βはＨＳによって用量依存的に阻害されたが、ＬＰＳとＰＭＡによって誘導されたＩＬ−１βは、ＨＳ濃度に依存して刺激されるか又は不変であった（図３Ｂ）。これは、ＨＳの阻害作用が、ＴＨＰ−１細胞及び新鮮単離したＴリンパ球のＴ細胞シグナル伝達を対象とすること、そしてＨＵＴ−７８細胞系統が刺激時に活性化因子を発現したことを明らかにしている（図３、Ａ及びＢ）。
【０２９０】
刺激したＴ細胞の原形質膜は、ＴＨＰ−１細胞及び新鮮単離した単球におけるＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を誘導した（図３、Ｃ−Ｆ）。しかし、単球はＴＨＰ−１細胞よりも刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜との接触活性化に対してより感受性であり、ＴＨＰ−１細胞は活性化のために１０倍高い量の膜を必要とした。実際に、ＩＬ−１βとＴＮＦ−αの産生は、刺激Ｔ細胞／単球の０．１という低い細胞比に等しい量の単離した膜によって開始されたが、一方ＴＨＰ−１細胞では２の比率の刺激Ｔ細胞／ＴＨＰ−１細胞でサイトカイン産生が認められた（図３、Ｃ−Ｆ）。両方の細胞型で同様のレベルのＩＬ−１βが誘導された（ず３、Ｄ及びＦ）が、ＴＮＦ−αのレベルは単球よりもＴＨＰ−１細胞において２０倍低かった。
【０２９１】
それ故、種々のサイトカインに関する阻害の程度は標的細胞型に依存した。実際に、単球ではＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生が同じ程度に阻害され、０．２５から１．０のＴ細胞当量／単球の範囲の膜用量でそれぞれ約８５％と約９１％の阻害に達した。ＴＨＰ−１細胞では、ＴＮＦ−α産生の阻害はＩＬ−１βの阻害を下回り、２．５から１０のＴ細胞当量／単球の範囲の膜用量でそれぞれ約６９％と約８９％であった。これは、ＴＮＦ−αとＩＬ−１βが同程度に阻害される単球に比べて、ＴＨＰ−１細胞ではＴＮＦ−α産生の阻害がＩＬ−１βの阻害よりも効率的でないことを示唆する。これらのデータは、単球によるＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生の引き金となる上で、刺激Ｔ細胞との直接接触が高い効力を持つことを確認し、ＨＳにおいて阻害機序あるいは阻害因子が存在するという仮説を裏付けた。さらにＨＳの阻害成分と阻害機序を同定するため、ＴＨＰ−１細胞と刺激ＨＵＴ−７８細胞からの膜を使用した。
【０２９２】
単球のＴ細胞シグナル伝達を阻害するＨＳ因子の分離。阻害因子を同定するため、Ｂｌｕｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ファーストフロー、Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ファーストフロー、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ファーストフロー、及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）での連続クロマトグラフィーによってＨＳを分別した。分画２３−２６において（図４Ａ）、すなわちＭ_ｒ＝１７９×１０^３±４６×１０^３（平均±ＳＤ、ｎ＝４阻害分画で阻害活性を回収した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析において、阻害活性は２８ｋＤａタンパク質バンドの濃縮と相関した（図４、表１）。Ｎ末端マイクロシーケンス法は、このバンドが高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要タンパク質成分であるアポリポタンパク質、（アポ）Ａ−１であることを証明した。これは、それぞれＨＤＬとアポ−Ａ−１を分離するゲルろ過とＳＤＳ−ＰＡＧＥのＭ_ｒ分析の違いを説明した（図４、Ａ及びＢ）。これらのデータは、ＨＤＬ粒子中に阻害因子が含まれることを明らかにした。
【０２９３】
ＨＤＬのタンパク質成分は単球のＴ細胞シグナル伝達を阻害した。いずれのＨＤＬ成分が阻害性であるかを調べるため、連続高密度遠心分離（Ｈａｖｅｌら、１９５５、Ｊ．Ｃｌｔｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４：１３４５−１３５３）によってＨＳを分別し、血清タンパク質からリポタンパク質を分離した。分離したリポタンパク質と血清タンパク質をＰＢＳで透析し、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化したＴＨＰ−１細胞におけるそれらの阻害作用を調べた。ＨＤＬ分画では阻害活性が回収されたが、ＨＤＬと同じ超遠心分離（ｄ＝１．２３）を用いて回収したＬＤＬと血清タンパク質は阻害性ではなかった（図５）。ＨＤＬ分画を脱脂又はプロテイナーゼＫによるタンパク質分解処理に供して、ＨＤＬのいずれの成分が、すなわちタンパク質又は脂質のいずれが阻害因子であるかを決定した。ジエチルエーテル／メタノール処理によって得たＨＤＬタンパク質は高い阻害活性を示したが、プロテイナーゼＫによるタンパク質分解消化後に得たＨＤＬ脂質はもはや阻害性ではなかった（図５）。ＴＮＦ−αとＩＬ−１βの両方の産生がＨＤＬタンパク質によって阻害された（図５、Ａ及びＢ）。これは、ＨＳの阻害因子がＨＤＬのタンパク質成分であったことを確認している。
【０２９４】
アポ−Ａ−１は単球のＴ細胞シグナル伝達のＨＳ阻害因子である。アポ−Ａ−１が阻害作用を示すかどうかを調べるため、市販の精製アポ−Ａ−１（Ｓｉｇｍａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を試験した。アポ−Ａ−１は、ＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化したＴＨＰ−１細胞においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの両方の産生を用量依存的に阻害した（図６Ａ）。図３から既に明らかなように、ＴＮＦ−αの産生はＩＬ−１β産生ほどには阻害されなかった。アポ−Ａ−１製剤は３％の同定されない夾雑物を含む（供給業者に従えば）ので、阻害が実際にアポ−Ａ−１によるものであることを確認しなければならなかった。脱脂したＨＤＬからのタンパク質を分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。銅ろ過した後、バンド（Ｍ_ｒ：５６，０００−６６，０００、５０，０００、２８，０００、及び１８，０００）を切り出して電気溶出した。Ｍ_ｒ＝２８，０００及びＭ_ｒ＝１８，０００のバンドにおいて阻害活性を回収した（図６、Ｂ及びＣ）。ウエスタンブロット分析によって評価したときアポ−Ａ−１凝集物を含んでいた、２倍のＭ_ｒ＝５６，０００−６６，０００のバンドは有意の阻害活性を示さなかった（データは示していない）。ＴＮＦ−αとＩＬ−１βの両方の産生が電気溶出したタンパク質によって阻害された。ＴＮＦ−αはＩＬ−１βよりも低い度合で阻害され、図２からの結果を確認した。ウエスタンブロット分析によって明らかにされたようにすべての阻害分画がアポ−Ａ−１を含み（図６Ｅ）、アポ−Ａ−１が単球のＴ細胞シグナル伝達の阻害因子であることを示した。実際に、もう１つ別のＨＤＬアポリポタンパク質が、タンパク質及びタンパク質溶解断片の大きさに関してアポ−Ａ−１と同じ挙動を示すという可能性は極めて低い（図６Ｅ、レーンａ及びｂ）。代替的に、脱脂ＨＤＬからのタンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ　Ｓ７５でのゲルろ過に供した。Ｍ_ｒ＝２８，０００±１０，０００に対応するプール分画は阻害活性を示した（図６Ｄ）。これらの分画はウエスタンブロット分析によって測定したときアポ−Ａ−１を含んでおり（図６Ｅ、レーンｃ）、アポ−Ａ−１が阻害因子であることをさらに確認した。
【０２９５】
ＨＤＬはアポ−Ａ−１結合を通して刺激Ｔ細胞と相互作用する。ＨＤＬの阻害作用が刺激したＴ細胞膜又はＴＨＰ−１細胞へのその潜在的な結合によるものであるかどうかを調べるため、ＴＨＰ−１細胞又は刺激したＨＵＴ−７８細胞から分離した膜のいずれかをＦＣＳ、ＨＳ、又は単離ＨＤＬの存在下又は不在下でプレインキュベートした。洗浄後、刺激ＨＵＴ−７８細胞からの膜又はＴＨＰ−１細胞の残存活性化能力を評価した。刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜をＨＳ又はＨＤＬと共にインキュベートしたときのみ、ＩＬ−１β産生の阻害が認められた（図７Ａ）。ＦＣＳ、ＨＳ、又はＨＤＬのいずれかとのＴＨＰ−１細胞のインキュベーションはＩＬ−１βの産生を阻害しないと思われた（図７Ａ）。これらの結果は、ＨＳ及びＨＤＬの阻害作用は主として刺激されたＴ細胞の表面で発現される活性化因子が対象であったことを明らかにしている。
【０２９６】
阻害因子が刺激されたＴ細胞上の表面因子と相互作用したことをさらに確認するため、単離したＨＤＬをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識し、種々の細胞型への結合をフローサイトメトリーによって評価した。ＴＨＰ−１細胞上ではＦＩＴＣ−ＨＤＬの結合は認められなかった（図７Ｂ）が、非複合ＦＩＴＣ対照と比較すると、ＦＩＴＣ−ＨＤＬと共にインキュベートしたときには単球の蛍光がわずかに増強された（図７Ｃ）。刺激していないＨＵＴ−７８細胞に対してはＦＩＴＣ−ＨＤＬの低いレベルの結合が認められたが、刺激したＨＵＴ−７８細胞はＦＩＴＣ−ＨＤＬに結合して、２つの蛍光ピークを示し、少なくとも２つの異なるＨＤＬ結合部位が存在することを示唆した（図７、Ｄ及びＥ）。より低いＦＩＴＣ−ＨＤＬ濃度では、１つの蛍光ピークだけが認められた。抗アポ−Ａ−１抗体の存在下では、より低い蛍光強度へのシフトが認められ、ＨＤＬがアポ−Ａ−１特異的結合を通して刺激Ｔ細胞と相互作用したことを明らかにした（図７Ｆ）。これらの結果は共に、ＨＤＬが刺激Ｔ細胞と選択的に相互作用することを示しており、アポ−Ａ−１に関わる阻害活性がＴ細胞上の表面因子を対象とすることを示唆している。
【０２９７】
定常状態のｍＲＮＡレベルの最大阻害は、刺激と同時に又は刺激直後にアポ−Ａ−１を加えた場合にだけ認められた。アポ−Ａ−１の機序をさらに解明するため、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β　ｍＲＮＡの定常状態レベルへの単離アポ−Ａ−１の阻害作用を評価した。種々の時点で加えたアポ−Ａ−１の存在下に、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜でＴＨＰ−１細胞を刺激した。アポ−Ａ−１は、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜で活性化したＴＨＰ−１細胞においてＴＮＦ−α及びＩＬ−１β　ｍＲＮＡの定常状態レベルを低下させた（図８、Ａ及びＣ）。ＴＮＦ−α　ｍＲＮＡの阻害はＩＬ−１β　ｍＲＮＡの阻害ほど顕著ではなく、タンパク質産生レベルに関して得たデータと相関する。ＴＮＦ−α　ｍＲＮＡの阻害は、０の時点又はその直後にアポ−Ａ−１が存在したときにのみ認められ、ＴＮＦ−α産生の阻害が刺激ＨＵＴ−７８細胞上の活性化因子とアポ−Ａ−１の相互作用によるものであることを示唆した。刺激Ｔリンパ球の膜によって活性化したＰＢＭＣに関しても同様の結果が得られ（図８、Ｂ及びＤ）、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β　ｍＲＮＡの両方の定常状態レベルがアポ−Ａ−１又はＨＳによって低下したが、ｍＲＮＡ誘導はＴＨＰ−１細胞よりも単球においてより速やかであった。単球では、定常状態のｍＲＮＡレベルの阻害は、やはり膜と一緒に又はその直後にアポ−Ａ−１を加えたときに最大であった（図８Ｄ）。活性化の３０分後にアポ−Ａ−１を加えた場合には阻害を認めなかった。後者の結果は、アポ−Ａ−１が細胞型に関わりなく接触を介した単球の活性化を阻害したことを示しており、図３のデータを確認している。
【０２９８】
アポ−Ａ−１は抗原活性化ＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−α及びＩＬ−１β産生を阻害する。アポ−Ａ−１が、ＰＨＡによって刺激したＰＢＭＣにおけるサイトカイン産生の阻害の原因となる因子であることを確認するため、アポ−Ａ−１及び脱脂ＨＤＬの存在下又は不在下でＰＢＭＣをＰＨＡ又は破傷風トキソイド（ＴＴ）のいずれかによって刺激した。ＴＴ刺激ＰＢＭＣではＰＨＡ刺激ＰＢＭＣにおけるよりもサイトカイン産生が低かったが、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β産生は刺激に関わりなくアポ−Ａ−１又は脱脂ＨＤＬによって阻害された（図９）。ＴＮＦ−α産生はＩＬ−１βよりも低い度合で阻害され、図２に示す結果を確認した。これは、（ｉ）図２に示す非分別ＨＳによるサイトカイン産生の阻害はアポ−Ａ−１によるものであったこと、そして（ｉｉ）アポ−Ａ−１はＴ細胞刺激に関わりなく単球の活性化を阻害することを明らかにしており、抗原特異的刺激及びマイトジェン刺激が、発現のレベルは異なるが、Ｔリンパ球上の同様の活性化因子を誘導することを示唆している。さらに、これらの結果は、単球が刺激されたＴ細胞と接触したときにのみＴＮＦ−α及びＩＬ−１βがＰＢＭＣにおいて誘導されたことを確認している。
【０２９９】
組換え突然変異体アポ−Ａ−１_{Ｍｉｌａｎｏ}は阻害活性を示す。アポ−Ａ−１と同様の物理化学特性を持つ少量の夾雑タンパク質が阻害因子でありうる可能性を排除するため、アポ−Ａ−１の組換え突然変異体（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ　Ｇ．Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙの好意により提供された）の活性についても接触アッセイで試験した。突然変異体タンパク質、アポ−Ａ−１_{Ｍｉｌａｎｏ}（アポ−Ａ−１_Ｍ）は１個のＡｒｇ／Ｃｙｓ置換によって野生型アポ−Ａ−１とは異なり、ジスルフィド結合二量体の形成を導く（Ｃａｌａｂｒｅｚｉら、１９９４）。一般に、アポ−Ａ−１_Ｍのインビトロ及びインビボ特性は野生型アポ−Ａ−１とごくわずかしか異ならない。Ａ−１_Ｍ／Ａ−１_Ｍを含むＨＤＬ粒子は、細胞からのコレステロール流出を促進する上ではアポ−Ａ−１を含むものよりも効率的であり、レシチンコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）酵素にとっては効率が低く、内皮細胞上の接着分子のサイトカイン誘導性発現を阻害する場合の効率は等しい（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら、１９９８）。図１０に示すように、組換え突然変異体アポ−Ａ−１は、精製された市販のアポ−Ａ−１と等しい効率で接触活性化された単球におけるＩＬ−１βの産生を阻害し、やはりアポ−Ａ−１が阻害因子であることを確認した。
【０３００】
アポ−Ａ−１のドメインＩＩ及びＩＩＩを含むフラグメントは阻害活性を示す。ＴＨＰ−１細胞は、１０％ヒト血清、１００μｇ／ｍｌのアポ−Ａ−１、１００μｇ／ｍｌのアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、又は５０μｇ／ｍｌのアポ−Ａ−１のドメインＩＩ及びＩＩＩを含むフラグメント（ＤＩＩ／ＤＩＩＩ）の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞（ＨＵＴｓ）の膜との接触によって活性化された。図１１に示すように、ＤＩＩ／ＤＩＩＩはＴＨＰ−１細胞によるＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの産生を阻害した。
【０３０１】
結果は、アポ−Ａ−１、すなわち「陰性」急性期タンパク質によって誘発される抗炎症作用を示している（Ｇａｂａｙら、１９９９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０：５６２−５６９）。典型的には他の刺激（すなわちＬＰＳ及びＰＭＡ）による単球の活性化はＨＳ阻害因子、すなわちアポ−Ａ−１によって影響されなかったので、この作用は特異的に単球のＴ細胞シグナル伝達を対象とすると思われる。さらに、ＨＳ又はＨＤＬで処理した刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜は処理していない膜よりも低いサイトカイン誘導能力を示し、一方ＴＨＰ−１細胞のＨＤＬ処理は認められる作用を示さなかった。これは、阻害作用が主として刺激されたＴ細胞の表面で発現される活性化因子に向けられたことを明らかにしている。アポ−Ａ−１の作用機序は十分には解明されておらず、本発明はいかなる特定機序にも限定されないが、今回の結果は、一部の実施形態に従えば、アポ−Ａ−１が、Ｔ細胞の膜活性化因子と単球上のそれぞれのレセプタとの間の相互作用を特異的に妨げることによってその作用を及ぼしうることを示唆している。
【０３０２】
実施例２：ＡＦＴＩポリペプチドの産生
Ａ．細菌発現
ＰＣＲを用いて、配列の５’及び３’末端に対応するプライマーを使用してＡＦＴＩポリペプチドをコードする鋳型ＤＮＡ配列を増幅する。増幅したＤＮＡ産物は、発現ベクターへの挿入を可能にする制限酵素部位を含むように修飾してもよい。ＰＣＲ産物をゲル精製し、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて発現ベクターに挿入する。ｌｕｘプロモーターとカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．９８１１３）のような例示的ベクターを、挿入したＤＮＡの方向指示クローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ）のためにＢａｍＨＩ及びＮｄｅｌで消化する。ライゲートした混合物をエレクトロポレーションによって大腸菌宿主菌株に形質転換し、形質転換体をカナマシン耐性に関して選択する。選択したコロニーからのプラスミドＤＮＡを分離し、ＤＮＡ塩基配列決定に供して、挿入物の存在を確認する。
【０３０３】
形質転換した宿主細胞を、誘導の前に３０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む２×ＹＴ培地中３０℃でインキュベートする。Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンを３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、その後３０℃又は３７℃で６時間インキュベーションして遺伝子発現を誘導した。培養の遠心分離、細菌ペレットの再懸濁と溶解、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によってＡＦＴＩポリペプチドの発現を評価する。
【０３０４】
ＡＦＴＩポリペプチドを含む封入体を次のように精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、水に再懸濁する。細胞懸濁液を音波破砕によって溶菌し、１９５，０００×ｇで５から１０分間遠心分離してペレット化する。上清を廃棄し、ペレットを洗ってホモジナイザーに移す。ペレットをＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）５ｍｌ中で均一に懸濁するまで均質化し、その後希釈して、２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配分画を回収し、プールする。単離した封入体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３０５】
大腸菌産生ＡＦＴＩポリペプチドに対応するＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドをゲルから切り出し、基本的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１０−３５（１９８７）が述べたようにしてＮ末端アミノ酸配列を決定する。
【０３０６】
Ｂ．哺乳類細胞の産生
ＰＣＲを用いて、配列の５’及び３’末端に対応するプライマーを使用してＡＦＴＩポリペプチドをコードする鋳型ＤＮＡ配列を増幅する。増幅したＤＮＡ産物は、発現ベクターへの挿入を可能にする制限酵素部位を含むように修飾してもよい。ＰＣＲ産物をゲル精製し、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて発現ベクターに挿入する。エプスタイン−バーウイルスの複製起点を含む例示的な発現ベクター、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が、２９３−ＥＢＮＡ−１（エプスタイン−バーウイルス核抗原）細胞におけるＡＦＴＩの発現のために使用しうる。増幅してゲル精製したＰＣＲ産物をｐＣＥＰ４ベクターにライゲートし、２９３−ＥＢＮＡ細胞にリポフェクションする。１００ｍｇ／ｍｌヒグロマイシン中でトランスフェクションした細胞を選択し、生じた薬剤耐性培養を集密まで増殖させる。次に細胞を無血清培地で７２時間培養する。順化培地を除去し、ＡＦＴＩポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３０７】
ＡＦＴＩポリペプチドの発現は銀染色によって検出しうる。代替的には、ＡＦＴＩポリペプチドをＩｇＧ定常ドメイン又はＦＬＡＧエピトープのようなエピトープ標識との融合タンパク質として生成し、それを、標識ペプチドに対する抗体を用いてウエスタンブロット分析によって検出することができる。
【０３０８】
ＡＦＴＩポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出すか、又はＡＦＴＩ融合タンパク質をエピトープ標識に対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、ここで述べるようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０３０９】
実施例３：抗ＡＦＴＩポリペプチド抗体の作製
ＡＦＴＩポリペプチドに対する抗体は、生物学的合成又は化学合成によって生成した精製タンパク質又はＡＦＴＩペプチドで免疫することによって入手しうる。抗体を作製するための適当な手順は、ＨｕｄｓｏｎとＨａｙ、「実用免疫学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｈｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８０）に述べられているものを含む。
【０３１０】
抗体作製のための１つの手順では、動物（典型的にはマウス又はウサギ）にＡＦＴＩ抗原（ＡＦＴＩポリペプチドのような）を注射し、ＥＬＩＳＡによって測定したとき十分な血清力価を持つものをハイブリドーマ産生のために選択する。免疫した動物の脾臓を採集し、単一細胞懸濁液として調製して、そこから脾細胞を回収する。脾細胞をマウス骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞のような；ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８１）に融合し、２００ＩＵ／ｍｌペニシリン、２００ｍｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び４ｍＭ　Ｌ−グルタミンと共にＤＭＥＭ中でインキュベートして、その後ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン；アミノプテリン；チミジン）中でインキュベートする。選択後、各々の融合ウエルから組織培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡによって抗ＡＦＴＩ抗体産生に関して試験する。
【０３１１】
ヒト抗体の産生のためにヒトＩｇ遺伝子座を内包するトランスジェニックマウスの免疫、及び抗体可変ドメインの突然変異誘発によって生成されるもののような合成抗体ライブラリーのスクリーニングなどの、抗ＡＦＴＩ抗体を得るための代替的な手順も使用できる。
【０３１２】
本発明を好ましい実施形態の見地から説明してきたが、変法及び修正が生じることは当業者には明白である。それ故、付属の特許請求の範囲は、特許請求される本発明の範囲内に含まれるそのようなすべての等価変法をカバーすることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ヒトアポリポタンパク質Ａ−１のアミノ酸配列（配列番号２）とポリヌクレオチド配列（配列番号１）。アポ−Ａ−１ポリペプチドは、らせん脂質結合ドメイン（アミノ酸残基４４−６５及び２２０−２４１）、単球からのリポタンパク質媒介のコレステロール流出に関与するドメイン（アミノ酸残基７４−１１１）、レセプタ結合ドメイン（アミノ酸残基１４９−２１９）、主要抗原エピトープドメイン（アミノ酸残基９９−１２０）、ヒンジドメイン（アミノ酸残基９９−１４３）、系統発生的に保存されたドメイン（アミノ酸残基６６−１２０）、及びレクチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性に関与するドメイン（アミノ酸残基９０−１１１）を持つ。アポ−Ａ−１ポリペプチドは、８個の両親媒性らせん（アミノ酸残基４４−６５、６６−９８、９９−１２０、１２１−１４２、１４３−１６４、１６５−２０８、２０９−２１９、２２−２４１）、Ｎ末端ペプチド（アミノ酸残基１−４３）、及びＣ末端ペプチド（アミノ酸残基２４２−２４３）を備える。
【図１Ｂ】ＡＦＴＩのアミノ酸配列である配列番号２のフラグメントである、１８ｋＤａのＮ末端フラグメント（アミノ酸残基２５から１９４、ヌクレオチド９２−６０１）。
【図１Ｃ】ＡＦＴＩのアミノ酸配列である配列番号２のフラグメントである、１３ｋＤａのＮ末端フラグメント（アミノ酸残基２５から１４４、ヌクレオチド９２−４５１）。
【図１Ｄ】ＡＦＴＩのアミノ酸配列である配列番号２のフラグメントである、１３ｋＤａのＣ末端フラグメント（アミノ酸残基１５６から２６７、ヌクレオチド４８５−８２０）。
【図２】ヒト血清は、ＰＨＡで刺激したＰＢＭＣにおいてＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの産生を阻害する。ＰＢＭＣ（４×１０^５細胞／２００μｌ／穴）を、ＦＣＳ又はＨＳを含む培地中１μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激した。（Ａ）４８時間インキュベーションした後、上清中のＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した；（Ｂ）７２時間後に増殖（^３Ｈ−チミジンの組込み）を測定した。
【図３】ＨＳによる単球及びＴＨＰ−１細胞のＴ細胞シグナル伝達の阻害。（Ａ）ＴＨＰ−１細胞を、漸増用量のＨＳ（ＨＳ、黒い記号）又はＦＣＳ（白い記号）の存在下に８Ｔリンパ球／ＴＨＰ−１細胞の細胞比で、固定して刺激したＴリンパ球によって４８時間活性化した。（Ｂ）ＴＨＰ−１細胞を、漸増用量のＨＳの存在下に８ＨＵＴ−７８細胞／ＴＨＰ−１細胞の細胞比で固定して刺激したＨＵＴ−７８細胞（黒い記号）又は１０μｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）と５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（白い記号）のいずれかによって４８時間活性化した。ＴＨＰ−１細胞（ＣとＤ）及び単球（ＥとＦ）を、１０％ＨＳの存在下又は不在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞から分離した漸増用量の膜によって４８時間活性化した。ＴＮＦ−α（ＣとＥ）及びＩＬ−１β（ＤとＦ）を培養上清で測定した。結果は平均±ＳＤで表しており、（Ｂ）を除いてｎ＝３であり、（Ｂ）ではｎ＝７である。ＡとＢでは、１００％は、阻害因子なしで４８時間培養した後のＩＬ−１βの産生を表わす。
【図４】ＨＳの連続クロマトグラフィー分別のＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００溶出プロフィールとＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ａ）Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰから溶出した阻害性分画をプールし、濃縮して、ＰＢＳ中で平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００でのゲルろ過に供した。カラムはゲルろ過クロマトグラフィー用分子量マーカーキット（Ｓｉｇｍａ）で検定した。分画をタンパク質含量（ＯＤ_{２８０ｍｍ}、点線）及び阻害活性（黒丸）に関して試験した。（Ｂ）各段階後に阻害性分画をプールし、１０％ポリアクリルアミドゲル上のレーンごとに１０μｇのタンパク質アリコートを充填した；（ａ）ＨＳ；（ｂ）Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）の漏出点；（ｃ）Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）からの阻害性分画のプール；（ｄ）Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　ＨＰからの阻害性分画のプール；（ｅ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）　２００からの阻害性分画のプール；ゲルはクマシーブルーで染色した。
【図５】ＨＤＬのタンパク質分画における阻害活性の存在。ＨＳを高密度遠心分離によって分別し、ＨＤＬと血清タンパク質分画の阻害活性を分析した。単離したＨＤＬをさらに脱脂（脱脂ＨＤＬ）又はプロテイナーゼＫによるタンパク質分解消化（プロテイナーゼＫ処理ＨＤＬ）に供した。分画の阻害活性をＨＳ（全血清）と比較した。全血清と血清タンパク質についての最終タンパク質濃度は７ｍｇ／ｍｌ（黒い柱）、３．５ｍｇ／ｍｌ（灰色の柱）、及び０．７ｍｇ／ｍｌ（白い柱）であった。ＨＤＬと脱脂ＨＤＬの最終タンパク質濃度は０．２ｍｇ／ｍｌ（黒い柱）、０．１ｍｇ／ｍｌ（灰色の柱）、及び０．０２ｍｇ／ｍｌ（白い柱）であった。プロテイナーゼＫ処理ＨＤＬの量はタンパク質分解前のタンパク質濃度に従って評価し、未処理ＨＤＬと同様であった。結果は、阻害因子なしでのＩＬ−１又はβＴＮＦ−α産生のパーセンテージを表わす（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図６】細胞へのＨＤＬ結合の分析。（Ａ）刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜へのＨＤＬの結合によるＴ細胞シグナル伝達の阻害；刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜（白い柱）、ＴＨＰ−１細胞（斜線の柱）、又は両方（黒い柱）を、ＦＣＳ（１０％）、ＨＳ（１０％）又はＨＤＬ（０．３２ｍｇ／ｍｌタンパク質）の不在下（−）又は存在下に氷上で４５分間プレインキュベートした；洗浄後、処理（斜線の柱と黒い柱）及び未処理（白い柱）ＴＨＰ−１細胞を、処理した（白い柱と黒い柱）又は処理していない（斜線の柱）刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜の存在下で培養した；４８時間培養した培養上清においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を測定した。結果は、阻害因子なしで測定した産生を１００％としたパーセンテージで表しており、平均±ＳＤ、ｎ＝６である。（Ｂ−Ｆ）非複合ＦＩＴＣとＦＩＴＣ−ＨＤＬ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の結合を、ＴＨＰ−１細胞（Ｂ）、単離したヒト単球（Ｃ）、刺激していないＨＵＴ−７８細胞（Ｄ）及び刺激したＨＵＴ−７８細胞（Ｅ）に関してフローサイトメトリーによって評価した。ＦＩＴＣを陰性対照として使用した。（Ｆ）精製抗アポ−Ａ−１抗体（１００μｇ／ｍｌ）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ番号ＨＢ−９５７０）の存在下又は不在下でのＦＩＴＣ−ＨＤＬ（１０μｇ／ｍｌ）の刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜への結合。
【図７】アポ−Ａ−１は、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化したＴＨＰ−１細胞においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を阻害する。（Ａ）ＴＨＰ−１細胞を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した漸増濃度のアポ−Ａ−１の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した；４８時間後、培養上清中でＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３を表している。（ＢとＣ）ＴＨＰ−１細胞を、脱脂ＨＤＬの分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥから電気溶出した漸増濃度のタンパク質の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した：（Ｂ）（Ｍ_ｒ＝２８，０００及び（Ｃ）（Ｍ_ｒ＝１８，０００。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　Ｓ７５でのゲルろ過によって分離した漸増濃度のアポ−Ａ−１（Ｍ_ｒ＝２８，０００）の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した。４８時間後、培養上清中でＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３を表し、１００％は阻害因子なしで産生されたサイトカインの量である。（Ｅ）阻害活性について試験した単離分画を、ウエスタンブロット法によってアポ−Ａ−１含量に関して分析した；（ａ）２８，０００の電気溶出したバンド、（ｂ）１８，０００の電気溶出バンド、及び（ｃ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）Ｓ７５ゲルろ過から回収された２８，０００タンパク質。
【図８】アポ−Ａ−１はＴＮＦ−αとＩＬ−１β　ｍＲＮＡの定常状態レベルを低下させる。（ＡとＢ）ＲＮアーゼプロテクションアッセイのオートラジオグラム。（Ａ）未処理（ａ）又はＴＨＰ−１活性化の種々の時点で加えたアポ−Ａ−１（２００μｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下に（ｃ−ｅ）、３時間、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜（２００μｇタンパク質／ｍｌ）によって活性化した（ｂ−ｅ）、ＴＨＰ−１細胞（５×１０^６細胞／ｍｌ）：ｃ（０時間）；ｄ（１時間）；及びｅ（２時間）。（Ｂ）未処理（ａ）又はＴＨＰ−１活性化の種々の時点で加えたアポ−Ａ−１（２００μｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下に（ｃ−ｅ）、１時間、刺激Ｔリンパ球の膜（４０μｇタンパク質／ｍｌ）によって活性化した、（ｂ−ｅ）単球（１０×１０^６細胞／ｍｌ）：ｃ（０分）；ｄ（１５分）；及びｅ（３０分）。（ＣとＤ）ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ＝１のデンシトメトリーで基準化し、阻害因子なしでの活性化ＴＨＰ−１細胞（Ｂ）又は単球（Ｃ）のｍＲＮＡレベルを１００％としたパーセンテージで表した、それぞれオートラジオグラフィーＡとＢのデンシトメトリー分析。結果は３つの異なる実験を代表している。
【図９】アポ−Ａ−１は、ＰＨＡ又は破傷風トキソイド（ＴＴ）によって刺激したＰＢＭＣ中のＴＮＦ−αとＩＬ−１βを阻害する。ＰＢＭＣ　４×１０^５細胞／２００μｇ／穴を、指示されている用量のアポ−Ａ−１とＨＤＬの存在下に１μｇ／ｍｌのＰＨＡ（ＡとＢ）又は１０μｇ／ｍｌのＴＴ（ＣとＤ）によって刺激した。
【図１０】組換えヒトアポ−Ａ−１Ｍｉｌａｎｏは阻害作用を示す。ＴＨＰ−１細胞を、ヒト血清（ＨＳ）の連続希釈、Ｓｉｇｍａからのアポリポタンパク質Ａ−１（出発濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）、及び組換えアポリポタンパク質Ａ−１Ｍｉｌａｎｏ（出発濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）の存在下に、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜で刺激した。両アポリポタンパク質（浄化及び組み換え）は、阻害作用を表示する。
【図１１】アポ−Ａ−ＩＩ及びアポ−Ａ−１のフラグメントによるＴＨＰ−１細胞の接触媒介活性化の阻害。ＴＨＰ−１細胞を、指示されている阻害因子の存在下に、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜（ＨＵＴ）によって活性化した。アポ−Ａ−１、アポ−Ａ−ＩＩ及びアポ−Ａ−１のドメインＩＩ及びＩＩＩを含むフラグメントによってＩＬ−１βとＴＮＦ−αの両方の産生が阻害された。[0001]
This application claims the benefit of US Provisional Patent Application No. 60 / 189,008, filed March 13, 2000, and US patent application Ser. Claim priority of US Provisional Patent Application No. 60 / 193,551.
[0002]
(Field of the Invention)
The present invention relates to apolipoprotein A-1 (apo-A-1) and fragments and derivatives thereof and their use in modulating T cell-mediated activation of monocytes. The invention also relates to vectors, host cells, pharmaceutical compositions, selective binding agents and methods for producing such apo-A-1 related molecules. Also provided are methods for diagnosing, treating, ameliorating, and / or preventing a disease associated with T cell-mediated activation of monocytes.
[0003]
(Background and Summary of the Invention)
The importance of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1 (IL-1) in chronic inflammation is widely established. Blocking or inhibiting these pro-inflammatory cytokines in vivo has shown good results in the treatment of human or animal models of diseases such as rheumatoid arthritis, Crohn's disease, and multiple sclerosis (Feldman et al., 1998). Arend et al., 1998, C. Annu. Rev. Immunol. 16: 27-55; Bresnihan, B., 1999, Ann. Rheum. Dis. 58, Supplement 1: 196-198, Transplant. Badovinac et al., 1998, J. Neuroimmunol. 85: 87-95; Wiemann et al., 1998, Exp. Neurol. 149: 455-463). Based on the concept that T lymphocytes play a central role in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, direct cell-cell adhesion with stimulated T lymphocytes is the only way for monocytes to contain large amounts of TNF-α and IL-1β (Burger D. and Dayer JM, T Cells in Arthritis 111-128 (1998)).
[0004]
Polyclonal mitogens such as a combination of phytohemagglutinin (PHA) and phorbol myristate acetate (PMA) (Vey et al., 1992, J. Immunol. 149: 2040-2046; Ilser et al., 1993, Eur. Cytokine Network. Lacraz et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 22027-22033; Li et al., 1995, Immunology 84: 571-576), immobilization with or without cross-linking of the costimulatory molecule CD28. Cross-linking of CD3 with anti-CD3 mAb (Miltenburg et al., 1995, J. Immunol. 154: 2655-2667; Chizzolini et al., 1997, Eur. J. Immunol. 27: 171-177) and antigen specificity. Antigen recognition on T cell clone (Chizzolini et al, 1997, Eur.J.Immunol.27: 171-177), including, it is possible that various stimuli induce single Tamakatsu performance in T cells.
[0005]
The inventor believes that stimulating a T cell causes the membrane associated ligand on the T cell to trigger monocyte-macrophage signaling by binding to a counter ligand on the monocyte. However, the identity of these ligands and counter-ligands was not clear. In the human system, some of the signaling would be attributable to β2-integrin, CD69, CD23, CD40-CD40L and lymphocyte activating gene-3 (LAG-3) (Vey et al., 1992, J. Immunol. 149: 2040-2046; Ilser et al., 1993, Eur. Cytokine Network. 4: 15-23; Lacraz et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 22027-22033; Hermann et al., 1999, J. Cell Biol. Stout et al., 1996, J. Immunol. 156: 8-11; Sttles et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 5835-5842; Avice et al., 1999, J. Immunol. 162: 2748. -275 3; Armant et al., 1995, J. Immunol. 155: 4868-4875; Rezonicon et al. (2000, in printing), Blood). Membrane-associated TNF-α and IL-1β differ from this cell interaction in an important role in the stimulation process induced by stimulated T cells in human fibroblast / synovium cells or microvascular endothelial cells Do not play a decisive role (Burger et al., 1998, Arthritis Rheum. 41: 1748-1759; Lou et al., 1996, Eur. J. Immunol. 26: 3107-3113; Burger et al., 1998, T Cells in Arthritis 111. -128).
[0006]
In assessing the inhibitory activity of human serum fractions on TNF-α and IL-1β production induced by T cell signaling of monocytes or monocyte cells (THP-1 cells), -A-1 was found to be a serum inhibitory factor. This finding facilitates the development of new compositions and methods for the treatment of diseases and conditions involving T cell signaling of monocytes or monocytic cells.
[0007]
According to some embodiments, the invention provides polypeptides that modulate monocyte activation through T cells and nucleic acid molecules encoding the same. According to another embodiment, the present invention provides a method for the treatment and diagnosis of diseases and conditions involving T cell-mediated activation of monocytes.
[0008]
(Summary of the Invention)
The present invention provides compositions, processes and methods of use for apo-A-1 (SEQ ID NO: 2) and fragments and derivatives thereof, and their use in modulating T cell-mediated activation of monocytes. I do. According to some embodiments, the invention basically comprises:
(A) a nucleotide sequence as set forth in residues 73 to 601 of SEQ ID NO: 1;
(B) a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in residues 25 to 194 of SEQ ID NO: 2;
(C) a nucleotide sequence as set forth in residues 73 to 451 of SEQ ID NO: 1;
(D) a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in residues 25 to 144 of SEQ ID NO: 2;
(E) a nucleotide sequence as set forth in residues 485 to 820 of SEQ ID NO: 1;
(F) a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in residues 25 to 113 of SEQ ID NO: 2;
(G) a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in residues 73 to 113 of SEQ ID NO: 2;
(H) a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in residues 156 to 267 of SEQ ID NO: 2;
(I) a nucleotide sequence that hybridizes under moderate or high stringency conditions to at least one complement from (a) to (f), wherein the encoded polypeptide is as set forth in SEQ ID NO: 2. A nucleotide sequence having the activity of a unique polypeptide; and
(J) a nucleotide sequence complementary to at least one of (a) to (h)
An isolated nucleic acid molecule consisting of a nucleotide sequence selected from:
[0009]
In some other embodiments, the present invention essentially comprises:
(A) an amino acid sequence as set forth in residues 25 to 194 of SEQ ID NO: 2;
(B) an amino acid sequence as set forth in residues 25 to 144 of SEQ ID NO: 2;
(C) an amino acid sequence as set forth in residues 156 to 267 of SEQ ID NO: 2;
(D) an amino acid sequence as set forth in residues 25 to 113 of SEQ ID NO: 2;
(E) an amino acid sequence as set forth in residues 75 to 113 of SEQ ID NO: 2;
(F) an amino acid sequence for an ortholog of SEQ ID NO: 2, wherein the encoded polypeptide has the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2;
(G) at least one amino acid sequence of (a), (b) or (c), wherein the polypeptide has the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2, and at least about 70, 80, 85, 90, 95 Amino acid sequences that are 96, 97, 98, or 99% identical;
(H) the polypeptide comprises at least about 25 amino acid residues having the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2, (a), (b), (c), (d), or (e). A fragment of the amino acid sequence of at least one of the following:
(I) from an amino acid sequence selected from the amino acid sequences of at least one allelic variant or splice variant of (a) to (f), wherein the polypeptide has the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2; Comprising an isolated polypeptide.
[0010]
The present invention provides that in some embodiments, residues 25-113, 73-113, 25-194, 25- of SEQ ID NO: 2, which are apo-A-1 fragment T cell activators ("AFTI"). 144 or 156-267 and related polypeptides. In some embodiments, the AFTI of the invention comprises an apo-A-1 that begins at residue number 25 of SEQ ID NO: 2 and comprises a 13 kilodalton (kDa) or 18 kDa fragment of the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2. Including but not limited to the N-terminal fragment of In some other embodiments, the AFTI of the invention comprises a C-terminal fragment of apo-A-1 ending with the last amino acid residue of SEQ ID NO: 2 and comprising a 13 kDa fragment of the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2. Including, but not limited to.
[0011]
In some embodiments, the invention further comprises:
(A) the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2, or the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide has at least one conservative amino acid substitution having the activity of the polypeptide as shown in SEQ ID NO: 2; Residues 25 to 113, 73-113, 25-194, 25-144, or 156-267;
(B) an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2, or a residue as shown in SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide has at least one amino acid insertion and has the activity of the polypeptide as shown in SEQ ID NO: 2; 25 to 113, 73-113, 25-194, 25-144, or 156-267;
(C) an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2, or a residue as set forth in SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide has at least one amino acid deletion and has the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2; Groups 25 to 113, 73-113, 25-194, 25-144, or 156-267;
(D) the polypeptide has the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2, has C and / or N-terminal truncation, SEQ ID NO: 2, or residues 25 to 113, 73-113, 25 of SEQ ID NO: 2 -194, 25-144, or 156-267; and
(E) at least one modification selected from the group consisting of amino acid substitution, amino acid insertion, amino acid deletion, C-terminal truncation, and N-terminal truncation, wherein the polypeptide has the activity of the polypeptide as shown in SEQ ID NO: 2. Provided is an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence selected from residues 25 to 113, 73-113, 25-194, 25-144, or 156-267 as shown in SEQ ID NO: 2. An isolated polypeptide is provided.
[0012]
In some embodiments, the invention provides:
(A) a polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2, or a nucleotide sequence encoding residues 25 to 113, 73-113, 25-194, 25-144, or 156-267 as set forth in SEQ ID NO: 2;
(B) a polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2, or as set forth in SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide has at least one conservative amino acid substitution, wherein the polypeptide has the activity of the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2 A nucleotide sequence encoding residues 25 to 113, 73-113, 25-194, 25-144, or 156-267;
(C) a polypeptide as shown in SEQ ID NO: 2 or a residue as shown in SEQ ID NO: 2 with at least one amino acid insertion, wherein the polypeptide has the activity of the polypeptide as shown in SEQ ID NO: 2 A nucleotide sequence encoding 25 to 113, 73-113, 25-194, 25-144, or 156-267;
(D) a polypeptide as shown in SEQ ID NO: 2, or a residue as shown in SEQ ID NO: 2, wherein the polypeptide has the activity of the polypeptide as shown in SEQ ID NO: 2 and has at least one amino acid deletion. A nucleotide sequence encoding a group 25 to 113, 73-113, 25-194, 25-144, or 156-267;
(E) the polypeptide has the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2, has a C and / or N-terminal truncation, the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2, or a residue as set forth in SEQ ID NO: 2 A nucleotide sequence encoding 25 to 113, 73-113, 25-194, 25-144, or 156-267;
(F) at least one modification selected from the group consisting of amino acid substitution, amino acid insertion, amino acid deletion, C-terminal truncation, and N-terminal truncation, wherein the polypeptide has the activity of the polypeptide as shown in SEQ ID NO: 2. A provided polypeptide as shown in SEQ ID NO: 2, or a nucleotide sequence encoding residues 25 to 113, 73-113, 25-194, 25-144, or 156-267 as shown in SEQ ID NO: 2;
(G) the nucleotide sequence of (a) to (f), comprising a fragment of at least about 16 nucleotides;
(H) hybridizing to any of the complements (a)-(g) under moderate or high stringency conditions, wherein the encoded polypeptide has the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2. A nucleotide sequence that:
(I) a nucleotide sequence complementary to any of (a) to (f)
Providing an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of:
[0013]
In some embodiments, the invention provides an expression vector comprising an isolated nucleic acid molecule as described herein, a recombinant host cell comprising a recombinant nucleic acid molecule as described herein, and optionally culturing the host cell. There is provided a method of producing an AFTI polypeptide, comprising isolating the polypeptide so produced.
[0014]
Transgenic non-human animals comprising a constructed nucleic acid molecule encoding an AFTI polypeptide are provided according to some embodiments of the invention. In some embodiments, an AFTI nucleic acid molecule is introduced into an animal to allow for expression, preferably high level, of the AFTI polypeptide, which may include high levels of the AFTI polypeptide in the animal (eg, the bloodstream). I do. According to some embodiments, the non-human transgenic animal can be a mammal, such as a rodent, rat, mouse, cow, sheep, goat, cow, dog, cat, and the like.
[0015]
Also, in some embodiments, derivatives of the AFTI polypeptides of the invention are provided.
[0016]
In some further embodiments, there are provided selective binding agents, such as antibodies and peptides, that can specifically bind to an AFTI polypeptide of the invention. Such antibodies and peptides can be agonists or antagonists.
[0017]
Pharmaceutical compositions comprising a polynucleotide, polypeptide, and / or selective binding agent of the invention and one or more pharmaceutically acceptable formulation agents are also encompassed in some embodiments of the invention. In some embodiments, the pharmaceutical composition is used to provide a therapeutically or diagnostically effective amount of a nucleotide or polypeptide of the invention. The invention, according to some embodiments, relates to polypeptides, nucleic acid molecules, and methods of using selective binding agents.
[0018]
According to some embodiments, the AFTI polypeptides and nucleic acid molecules of the invention are used to treat, prevent, ameliorate, and / or detect diseases and disorders, including those listed herein. sell.
[0019]
According to some embodiments, the invention provides a method of evaluating a test molecule to identify a test molecule that binds to an AFTI polypeptide. According to some embodiments, the method comprises contacting the test molecule with an AFTI polypeptide and determining the extent to which the test molecule binds to the polypeptide. According to some embodiments, the method comprises determining whether such a test molecule is an agonist or antagonist of the AFTI polypeptide. According to some embodiments, the invention further provides a method of testing the effect of a molecule on AFTI polypeptide expression or AFTI polypeptide activity.
[0020]
Methods of modulating the expression and altering (ie, increasing or decreasing) the level of AFTI polypeptide are also encompassed by some embodiments of the present invention. Some methods include administering a nucleic acid molecule encoding an AFTI polypeptide to an animal. In another method, a nucleic acid molecule that includes an element that modulates or alters expression of an AFTI polypeptide can be administered. Examples of these methods include, but are not limited to, gene therapy, cell therapy, and antisense therapy as described further herein.
[0021]
In some embodiments of the present invention, AFTI polypeptides may be used to identify AFTI receptors. Various forms of "expression cloning" have been used extensively to clone receptors for protein ligands. For example, H. Simonsen and H.S. F. See Lodish, Trends in Pharmacological Sciences, 15, 437-441 (1994), and Tartaglia et al., Cell, 83: 1263-1271 (1995). In some embodiments, isolation of AFTI receptors is useful for identifying or developing new agonists and antagonists of the AFTI polypeptide signaling pathway. Such agonists and antagonists include, but are not limited to, soluble AFTI receptors, anti-AFTI receptor selective binding agents (such as antibodies and derivatives thereof), small molecules, and antisense oligonucleotides, all of which are not disclosed herein. Can be used to treat one or more diseases or disorders, including those listed in.
[0022]
(Brief description of drawings)
FIG. 1: (A) Amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of human apolipoprotein A-1. The Apo-A-1 polypeptide has a helical lipid binding domain (amino acid residues 44-65 and 220-241), a domain involved in lipoprotein-mediated cholesterol efflux from monocytes (amino acid residues 74-111), a receptor. Binding domain (amino acid residues 149-219), major antigen epitope domain (amino acid residues 99-120), hinge domain (amino acid residues 99-143), phylogenetic conserved domain (amino acid residues 66-120) ), And a domain (amino acid residues 90-111) involved in lectin-cholesterol acyltransferase activity. Apo-A-1 polypeptide has eight amphipathic helices (amino acid residues 44-65, 66-98, 99-120, 121-142, 143-164, 165-208, 209-219, 22-). 241), an N-terminal peptide (amino acid residues 1-43), and a C-terminal peptide (amino acid residues 242-243). The amino acid sequence of AFTI comprises the fragment of SEQ ID NO: 2, for example, (B) an 18 kDa N-terminal fragment (amino acid residues 25 to 194, nucleotides 92-601), (C) a 13 kDa N-terminal fragment (amino acid residues 25 to 144). , Nucleotides 92-451), and (D) a 13 kDa C-terminal fragment (amino acid residues 156 to 267, nucleotides 485-820).
[0023]
FIG. 2: Human serum inhibits TNF-α and IL-1β production in PHA-stimulated PBMCs. PBMC (4 × 10 ⁵ Cells / 200 μl / well) were stimulated with 1 μg / ml PHA in media containing FCS or HS. (A) TNF-α and IL-1β in the supernatant were measured after incubation for 48 hours; (B) Proliferation after 72 hours ( ³ H-thymidine incorporation) was measured.
[0024]
FIG. 3: Inhibition of T cell signaling of monocytes and THP-1 cells by HS. (A) THP-1 cells were fixed and stimulated with T cells at a cell ratio of 8T lymphocytes / THP-1 cells in the presence of increasing doses of HS (HS, black symbols) or FCS (white symbols). For 48 hours. (B) THP-1 cells were fixed and stimulated with a cell ratio of 8HUT-78 cells / THP-1 cells in the presence of increasing doses of HS (black symbols) or lipoprotein at 10 μg / ml. Activation was performed for 48 hours with either saccharide (LPS) or 5 ng / ml PMA (open symbols). THP-1 cells (C and D) and monocytes (E and F) were activated for 48 hours by increasing doses of membrane isolated from stimulated HUT-78 cells in the presence or absence of 10% HS. TNF-α (C and E) and IL-1β (D and F) were measured in the culture supernatant. The results are expressed as mean ± SD, where n = 3 except for (B) and n = 7 in (B). In A and B, 100% represents IL-1β production after 48 hours of culture without inhibitors.
[0025]
FIG. 4: Superdex 200 elution profile and SDS-PAGE analysis of continuous chromatographic fractionation of HS. (A) The inhibitory fractions eluted from Phenyl Sepharose HP were pooled, concentrated and subjected to gel filtration on Superdex 200 equilibrated in PBS. The column was assayed using a molecular weight marker kit for gel filtration chromatography (Sigma). Fractionation is performed for protein content (OD _280mm , Dotted line) and inhibitory activity (filled circles). (B) After each step the inhibitory fractions were pooled and loaded with a 10 μg protein aliquot per lane on a 10% polyacrylamide gel; (a) HS; (b) Blue-Sepharose® leak point (C) a pool of inhibitory fractions from Q Sepharose®; (d) a pool of inhibitory fractions from Phenyl Sepharose® HP; (e) inhibition from Superdex® 200; Pool of sex fractions; gel stained with Coomassie blue.
[0026]
FIG. 5: Presence of inhibitory activity in protein fractionation of HDL. HS was fractionated by high-density centrifugation and the inhibitory activity of HDL and serum protein fraction was analyzed. The isolated HDL was further subjected to delipidation (defatted HDL) or proteolytic digestion with proteinase K (HDL treated with proteinase K). Fraction inhibition activity was compared to HS (whole serum). Final protein concentrations for total serum and serum proteins were 7 mg / ml (black columns), 3.5 mg / ml (grey columns), and 0.7 mg / ml (white columns). Final protein concentrations of HDL and defatted HDL were 0.2 mg / ml (black columns), 0.1 mg / ml (grey columns), and 0.02 mg / ml (white columns). The amount of proteinase K-treated HDL was evaluated according to the protein concentration before proteolysis and was similar to untreated HDL. The results represent the percentage of IL-1 or βTNF-α acid without inhibitor (mean ± SD, n = 3).
[0027]
FIG. 6: Analysis of HDL binding to cells. (A) Inhibition of T cell signaling by binding of HDL to the membranes of stimulated HUT-78 cells; membranes of stimulated HUT-78 cells (open columns), THP-1 cells (hatched columns), or both ( Black columns) were pre-incubated for 45 minutes on ice in the absence (-) or presence of FCS (10%), HS (10%) or HDL (0.32 mg / ml protein); after washing, treatment (hatched) Columns and black columns) and untreated (white columns) THP-1 cells were cultured in the presence of membranes of treated (white columns and black columns) or untreated (hatched columns) stimulated HUT-78 cells The production of TNF-α and IL-1β was measured in the culture supernatant cultured for 48 hours. Results are expressed as a percentage of the production measured without inhibitor as 100%, mean ± SD, n = 6. (BF) Binding of uncomplexed FITC to FITC-HDL (0.1 mg / ml) was determined by THP-1 cells (B), isolated human monocytes (C), unstimulated HUT-78 cells ( D) and stimulated HUT-78 cells (E) were evaluated by flow cytometry. FITC was used as a negative control. (F) Stimulation of FITC-HDL (10 μg / ml) HUT-78 in the presence or absence of purified anti-apo-A-1 antibody (100 μg / ml) (ATCC, Manassas, VA; catalog number HB-9570) Binding of cells to the membrane.
[0028]
FIG. 7: Apo-A-1 inhibits TNF-α and IL-1β production in THP-1 cells activated by the membrane of stimulated HUT-78 cells. (A) THP-1 cells were activated by the membrane of stimulated HUT-78 cells in the presence of increasing concentrations of apo-A-1 purchased from Sigma (St. Louis, MO); after 48 hours, TNF-α and IL-1β were measured in the culture supernatant. The results represent the mean ± SD, n = 3. (B and C) THP-1 cells were activated by the membrane of stimulated HUT-78 cells in the presence of increasing concentrations of protein electroeluted from preparative SDS-PAGE of defatted HDL: (B) (M _r = 28,000 and (C) (M _r = 18,000. (D) THP-1 cells were isolated at increasing concentrations of apo-A-1 (M) separated by gel filtration on Superdex S75. _r = 28,000) in the presence of stimulated HUT-78 cell membranes. 48 hours later, TNF-α and IL-1β were measured in the culture supernatant. The results represent the mean ± SD, n = 3, 100% is the amount of cytokine produced without inhibitor. (E) Isolated fractions tested for inhibitory activity were analyzed for apo-A-1 content by Western blot; (a) 28,000 electroeluted bands, (b) 18,000 electroeluted bands. And (c) 28,000 proteins recovered from Superdex® S75 gel filtration.
[0029]
FIG. 8: Apo-A-1 reduces steady-state levels of TNF-α and IL-1β mRNA. (A and B) Autoradiogram of RNase protection assay. (A) Untreated (a) or stimulated HUT- in the presence or absence (ce) of apo-A-1 (200 μg / ml) added at various time points of THP-1 activation (ce) for 3 hours. TBE-1 cells (5 × 10 6) activated (be) by 78 cell membranes (200 μg protein / ml) ⁶ Cells / ml): c (0 h); d (1 h); and e (2 h). (B) Untreated (a) or stimulated T lymphocytes in the presence or absence (ce) of apo-A-1 (200 μg / ml) added at various time points of THP-1 activation (ce) for 1 hour (Be) monocytes (10 × 10 4) activated by sphere membrane (40 μg protein / ml) ⁶ Cells / ml): c (0 min); d (15 min); and e (30 min). (C and D) mRNA levels of activated THP-1 cells (B) or monocytes (C) without inhibitors, normalized to GAPDH mRNA = 1 densitometry, expressed as a percentage of 100%, Densitometric analysis of autoradiography A and B respectively. The results are representative of three different experiments.
[0030]
FIG. 9: Apo-A-1 inhibits TNF-α and IL-1β in PBMC stimulated by PHA or tetanus toxoid (TT). PBMC 4 × 10 ⁵ Cells / 200 μg / well were stimulated with 1 μg / ml PHA (A and B) or 10 μg / ml TT (C and D) in the presence of the indicated doses of apo-A-1 and HDL.
[0031]
FIG. 10: Recombinant human Apo-A-1 Milano shows inhibitory effect. THP-1 cells were subjected to serial dilution of human serum (HS), the presence of apolipoprotein A-1 from Sigma (starting concentration = 2 mg / ml) and recombinant apolipoprotein A-1 Milano (starting concentration = 2 mg / ml) Underneath, the membrane was stimulated with stimulated HUT-78 cells. Both apolipoproteins (purified and recombinant) display an inhibitory effect.
[0032]
FIG. 11: Inhibition of contact-mediated activation of THP-1 cells by apo-A-II and fragments of apo-A-1. THP-1 cells were activated by stimulated HUT-78 cell membranes (HUT) in the presence of the indicated inhibitors. Apo-A-1, apo-A-II and fragments containing domains II and III of apo-A-1 inhibited the production of both IL-1β and TNF-α.
[0033]
(Detailed description of the invention)
The table of contents in the chapters used herein is for organizational purposes only and should not be construed as limiting the subject matter described. All references cited in this application are expressly incorporated herein by reference in their entirety for any purpose, provided that such incorporation defines terms different from the meaning provided herein Except in cases.
[0034]
Definition
The term "AFTI gene" or "AFTI nucleic acid molecule" or "AFTI polynucleotide" refers to a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 or any segment thereof, a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2, or Refers to some fragment thereof.
[0035]
The term "AFTI polypeptide" refers to a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or any fragment thereof, and related polypeptides. Related polypeptides include AFTI polypeptide allelic variants, AFTI polypeptide orthologs, AFTI polypeptide splice variants, AFTI polypeptide variants, and AFTI polypeptide derivatives. An AFTI polypeptide may be a mature polypeptide as defined herein, and may or may not have an amino-terminal methionine residue, depending on the method of preparation.
[0036]
The term "AFTI polypeptide allelic variant" refers to one of several or many possible naturally occurring alternative forms of a gene occupying a given locus on the chromosome of an organism or population of organisms.
[0037]
The term "AFTI polypeptide derivative" refers to a polypeptide fragment of the polypeptide set forth in SEQ ID NO: 2, an AFTI polypeptide allelic variant, an AFTI polypeptide ortholog, an AFTI polypeptide splice variant, or a chemically modified, Refer to AFTI polypeptide variants as defined in.
[0038]
The term "AFTI polypeptide fragment" refers to a polypeptide having a truncation at the amino terminus (with or without a leader sequence) and / or at the carboxy terminus of an AFTI polypeptide described herein, an AFTI polypeptide allelic variant, AFTI polypeptide orthologs, AFTI polypeptide splice variants and / or one or more amino acid additions or substitutions or internal deletions relative to the AFTI polypeptide amino acid sequences specified herein (where at least 6 polypeptides occur). AFTI polypeptide variant having a length of amino acids). AFTI polypeptide fragments can result, for example, from alternative RNA splicing or from protease activity in vivo. In preferred embodiments, the truncation comprises about 10 amino acids, or about 20 amino acids, or about 50 amino acids, or about 75 amino acids, or about 100 amino acids, or about 100 or more amino acids . The polypeptide fragment so generated may have about 25 contiguous amino acids, or about 50 amino acids, or about 75 amino acids, or about 100 amino acids, or about 150 amino acids, or about 200 amino acids. Amino acids. In some embodiments, the AFTI polypeptide fragments of the invention are any number of amino acids from six amino acids in length to the polypeptides described herein, or between their sizes. Such AFTI polypeptide fragments can optionally include an amino-terminal methionine residue. It will be appreciated that such fragments can be used, for example, to generate antibodies against the AFTI polypeptide.
[0039]
The term "AFTI fusion polypeptide" refers to a fusion of one or more amino acids (such as a heterologous peptide or polypeptide) at the amino or carboxy terminus of an AFTI polypeptide or AFTI polypeptide fragment. Thus, the term may be compared to the polypeptide, the AFTI polypeptide allelic variant, the AFTI polypeptide ortholog, the AFTI polypeptide splice variant, or the AFTI polypeptide amino acid sequence specifically described herein. Fusion proteins having any sequence of AFTI polypeptide variants having one or more amino acid deletions or substitutions or internal additions.
[0040]
The term "AFTI polypeptide ortholog" refers to a polypeptide from another species corresponding to the AFTI polypeptide amino acid sequence specifically set forth herein. For example, mouse and human AFTI polypeptides are considered orthologs of each other.
[0041]
The term “AFTI polypeptide splice variant” refers to a nucleic acid molecule produced by alternative processing of intron and / or exon sequences (eg, alternative splicing) in an RNA transcript corresponding to an AFTI polypeptide specifically identified herein. , Usually an AFTI polypeptide encoded by RNA.
[0042]
The term "AFTI polypeptide variant" refers to one or more amino acid sequence substitutions, deletions (e.g., internal, etc.) as compared to an AFTI polypeptide amino acid sequence (with or without a leader sequence) specifically described herein. An AFTI polypeptide comprising an amino acid sequence having deletions and / or AFTI polypeptide fragments (such as AFTI polypeptide fragments), and / or additions (such as internal additions and / or AFTI fusion polypeptides). The variants may be naturally occurring (eg, AFTI polypeptide allelic variants, AFTI polypeptide orthologs and AFTI polypeptide splice variants) or artificially constructed. Such AFTI polypeptide variants can be prepared from a DNA sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 encoding AFTI of interest, from a corresponding nucleic acid molecule with a DNA sequence that varies accordingly. In preferred embodiments, the variant is a substitution of 1 to 10, or 1 to 15, or 1 to 20, or 1 to 25, or 1 to 50, or 1 to 75, or 1 to 100, or 100 or more amino acids , Insertions, additions and / or deletions, and the substitutions can be conservative or non-conservative, or some combination thereof.
[0043]
The term "antigen" refers to a molecule or portion of a molecule that can be bound by a selective binding substance, such as an antibody, and that can be used in an animal to produce an antibody that can bind to an epitope of that antigen. An antigen may have one or more epitopes.
[0044]
The term "biologically active AFTI polypeptide" refers to an AFTI polypeptide that has at least one activity characteristic of a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
[0045]
The terms "effective amount" and "therapeutically effective amount" refer to an AFTI polypeptide or a AFTI polypeptide used to support a significant level of one or more biological activities of the AFTI polypeptide, respectively, as described herein. Refers to the amount of AFTI nucleic acid molecule.
[0046]
The term "expression vector" refers to a vector that is suitable for use in a host cell and contains one or more nucleic acid sequences that direct and / or control the expression of heterologous nucleic acid sequences. Expression includes, but is not limited to, one or more processes such as transcription, translation, and RNA splicing (if introns are present).
[0047]
The term "host cell" refers to a transfected or transformed cell, or a cell that can be transfected or transformed with a nucleic acid sequence of interest and expresses a nucleic acid of interest (or a segment of a nucleic acid of interest). Refers to cells that can The term includes the progeny of the parent cell, as long as the nucleic acid of interest is present, regardless of whether the progeny is the same in shape or genetics as the original parent.
[0048]
The term "identity" as known in the art, refers to a relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by comparing the sequences. . In the art, "identity" can also be used between nucleic acid molecules or, as the case may be, as determined by the number of pairs between two or more nucleotide residues or strings of two or more amino acid residues. It refers to the degree of sequence relatedness between polypeptides. "Identity" measures the percentage of identical matches between the smaller of two or more sequences due to gap alignment (if any) taken up by a particular mathematical model or computer program (ie, "algorithm"). .
[0049]
The term "similarity" is a related concept but, unlike "identity", refers to a sequence relationship that includes both identical and conservative substitutions. If two polypeptide sequences have, for example, 10/20 identical amino acids, and the remainder are all non-conservative substitutions, then both percent identity and similarity will be 50%. In the same example, if there are five more positions where a conservative substitution is present, the percent identity remains 50%, but the percent similarity is 75% (15/20). Thus, when conservative substitutions are present, the degree of similarity between the two polypeptides will be higher than the percent identity between the two polypeptides.
[0050]
The term "isolated nucleic acid molecule" refers to (1) separated from at least about 50% of the naturally associated protein, lipid, carbohydrate or other substance (i.e., contaminant); The "nucleic acid molecule" is not covalently linked to all or a portion of the polynucleotide that is covalently linked in its natural state; (3) is operably covalently linked to a polynucleotide that is not linked in its natural state; Or (4) refers to a nucleic acid molecule of the invention that does not occur in its natural state as part of a larger polynucleotide sequence. Preferably, an isolated nucleic acid molecule of the invention is derived from any other contaminating nucleic acid molecule or other contaminant found in its natural environment that interferes with the production of the polypeptide or its use in therapeutic, diagnostic, prophylactic or research applications. Substantially free.
[0051]
The term “isolated polypeptide” refers to (2) a “isolated polypeptide” that is separated from at least about 50% of a naturally associated polynucleotide, lipid, carbohydrate or other substance (ie, contaminant). The "isolated polypeptide" is not covalently linked to all or a portion of the polypeptide that is covalently linked in its natural state; (3) the native state is operably covalently linked to the unbound polypeptide. Or (4) does not occur in its native state. Preferably, the isolated polypeptide is substantially free of any other contaminating polypeptide or other contaminant found in its natural environment that interferes with the production of the polypeptide or its therapeutic, diagnostic, prophylactic or research uses. is there.
[0052]
The term "nucleic acid sequence" or "nucleic acid molecule" refers to a polymer of at least two nucleotides. Such nucleotides include all naturally occurring nucleotides and all synthetic nucleotides. Such nucleotides include, for example, 4-acetylcytosine, 8-hydroxy-N6-methyladenosine, aziridinyl-cytosine, pseudoisocytosine, 5- (carboxyhydroxylmethyl) uracil, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5 -Carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-carboxy-methylaminomethyluracil, dihydrouracil, inosine, N6-iso-pentenyladenine, 1-methyladenine, 1-methylpseudouracil, 1-methylguanine, 1- Methyl inosine, 2,2-dimethyl-guanine, 2-methyl adenine, 2-methyl guanine, 3-methyl cytosine, 5-methyl cytosine, N6-methyl adenine, 7-methyl guanine, 5-methyl amino methyl uracil, 5- Methoki Amino-methyl-2-thiouracil, β-D-mannosyl eosin, 5′-methoxycarbonyl-methyluracil, 5-methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, uracil -5-oxyacetic acid, oxybutoxocin, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil, N-uracil-5-oxyacetic acid methyl ester Uracil-5-oxyacetic acid, pseudouracil, queosin, 2-thiocytosine, and 2,6-diaminopurine, and can be formed from any of the known base analogs of DNA and RNA.
[0053]
The term "naturally occurring" or "naturally occurring" when used in connection with biological materials such as nucleic acid molecules, polypeptides, host cells, etc., is recognized in its natural state and is manipulated by humans (i.e., Refers to a material that has not been designed or constructed. Similarly, "non-naturally occurring" or "non-naturally occurring" as used herein refers to a substance that is not found in its natural state, or has been structurally modified or synthesized by humans.
[0054]
The term "operably linked" is used herein to refer to an arrangement of flanking sequences wherein the flanking sequences so described are configured or constructed to perform their normal functions. Used for Thus, a flanking sequence operably linked to a coding sequence can cause the replication, transcription and / or translation of the coding sequence. For example, a coding sequence is operably linked to a promoter when the promoter is capable of directing the transcription of the coding sequence. The flanking sequence need not be adjacent to the coding sequence as long as it works properly. Thus, for example, it is possible that intervening untranslated sequences that have not yet been transcribed may be present between the promoter sequence and the coding sequence, yet the promoter sequence is still considered "operably linked" to the coding sequence. be able to.
[0055]
As used herein, the term "pharmaceutically acceptable carrier" or "physiologically acceptable carrier" provides for the delivery of an AFTI polypeptide, AFTI nucleic acid molecule or AFTI selective binding agent as a pharmaceutical composition. Or refers to one or more pharmaceutical substances suitable for promoting.
[0056]
The term "selective binding agent" refers to one or more molecules that have specificity for an AFTI polypeptide. As used herein, the terms "specific" and "specificity" refer to the ability of a selective binding agent to bind to a human AFTI polypeptide and not to a human non-AFTI polypeptide. However, the selective binding agent may also bind to an ortholog of the polypeptide as shown in SEQ ID NO: 2, ie, an interspecies version thereof, such as a mouse and rat polypeptide.
[0057]
The term "transduction" is used to refer to the transfer of a gene from one bacterium to another, usually by phage. "Transduction" also refers to the acquisition and transfer of eukaryotic cell sequences by a retrovirus.
[0058]
The term "transfection" is used to refer to the uptake of heterologous or foreign DNA by a cell, and a cell has been "transfected" when the foreign DNA has been introduced inside the cell membrane. Many transfection techniques are known in the art and are disclosed herein. See, e.g., Graham et al., Virology, 52: 456 (1973); Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratories (Molecule in New York, 1989; New York). Basic Methods in Molecular Biology, "Elsevier, 1986; and Chu et al., Gene, 13: 197 (1981). Using such an approach, one or more foreign DNA molecules can be introduced into a suitable host cell.
[0059]
As used herein, the term "transformation" refers to a change in the genetic properties of a cell, and a cell has been transformed when it has been modified to contain new DNA. For example, a cell is transformed if it is genetically modified from its natural state. After transfection or transduction, the transforming DNA may be physically recombined with the cell's DNA by integrating into the chromosome of the cell, transiently maintained as an episomal element without being replicated, or as a plasmid. Can be replicated independently. A cell is considered to be stably transformed when the DNA is replicated by cell division.
[0060]
The term "vector" is used to refer to any molecule (eg, nucleic acid, plasmid, or virus) that is used to transfer coding information to a host cell.
[0061]
Relevance of nucleic acid molecules and / or polypeptides
It is evident that the relevant nucleic acid molecule comprises an allele or splice variant of the nucleic acid molecule of SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof, and that it comprises a sequence complementary to any of the above nucleotide sequences. Related nucleic acid molecules also include, or consist essentially of, one or more amino acid residue substitutions, modifications, additions and / or deletions as compared to a polypeptide described herein, eg, a polypeptide of SEQ ID NO: Or a nucleotide sequence encoding a polypeptide consisting thereof.
[0062]
A fragment is a molecule that encodes a polypeptide of at least about 25 amino acid residues, or about 50, or about 75, or about 100, or about 100 or more amino acid residues of the polypeptide of SEQ ID NO: 2. including.
[0063]
Further, a related AFTI nucleic acid molecule is a nucleic acid molecule of SEQ ID NO: 1 or a molecule that encodes a polypeptide comprising an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 2, under moderate or high stringency conditions as defined herein. Or a nucleic acid fragment as defined herein, or a molecule comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence that is completely complementary to a nucleic acid fragment that encodes a polypeptide as defined herein. Hybridization probes can be prepared based on the AFTI sequences provided herein to screen cDNA, genomic or synthetic DNA libraries for related sequences. Using sequence alignment algorithms as described herein, regions of AFTI DNA and / or amino acid sequences of AFTI polypeptides that exhibit significant identity to a known sequence are readily determined, and those regions can be used as probes for screening. Can be used to design
[0064]
The term "high stringency conditions" refers to conditions designed to allow hybridization of DNA strands whose sequences are highly complementary and to significantly eliminate hybridization of mismatched DNA. The stringency of hybridization is determined primarily by temperature, ionic strength, and concentration of denaturing agents such as formamide. “High stringency conditions” for hybridization and purification include: 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate at 65-68 ° C., or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M citric acid at 42 ° C. Sodium and 50% formamide. Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Nucleic Acid Harbor, N. A .; : Nucleic Acid Hybridization: a practical approach ", Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England).
[0065]
More stringent conditions (higher temperatures, lower ionic strength, higher concentrations of formamide or other denaturing agents) may also be used, but will affect the rate of hybridization. Other substances may be included in the hybridization and wash buffers to reduce non-specific and / or background hybridization. Examples include 0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinyl-pyrrolidone, 0.1% sodium pyrophosphate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (NaDodSO4). ₄ Or SDS), Ficoll, Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (or other non-complementary DNA), and dextran sulfate, but other suitable materials can also be used. The concentration and type of these additives can be varied without substantially affecting the stringency of the hybridization conditions. Hybridization experiments are usually performed at pH 6.8 to 7.4, but under typical ionic strength conditions, the rate of hybridization is almost independent of pH. See Anderson et al., "Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach", Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, England).
[0066]
Factors affecting the stability of a DNA duplex include base composition, length, and degree of base pair mismatch. One of skill in the art can adjust the hybridization conditions to adapt these variables to hybridize to various sequence related DNAs. The melting temperature of a perfectly correct DNA duplex can be calculated by the following equation:
T _m (° C.) = 81.5 + 16.6 (log [Na ⁺ ]) +0.41 (% G + C) -600 / n-0.72 (% formamide)
[Wherein N is the length of the duplex formed and [Na ⁺ ] Is the concentration of sodium ions in the hybridization or washing solution, and% G + C is the percentage of (guanine + cytosine) in the hybrid. For incompletely paired hybrids, the melting temperature is reduced by about 1 ° C. for each 1% mismatch.
[0067]
The term "medium stringency conditions" refers to conditions under which a DNA duplex having a greater degree of base pair mismatching than a DNA duplex capable of being formed under "high stringency conditions" may be formed. Examples of typical "moderate stringency conditions" are 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M sodium citrate at 50 to 65 C, or 0.015 M sodium chloride, 0.0015 M citric acid at 37 to 50 C Sodium and 20% formamide. As an example, "medium stringency" conditions at 50 ° C. in 0.015 M sodium ion allow about 21% mismatch.
[0068]
One skilled in the art will recognize that there is no absolute distinction between "high" stringency and "medium" stringency conditions. For example, at 0.015M sodium ion (without formamide), the melting temperature of a perfectly reasonable long DNA is about 71 ° C. Washing at 65 ° C. (with the same ionic strength) would allow about 6% mismatch. To capture less relevant sequences, one skilled in the art can simply lower the temperature or increase the ionic strength.
[0069]
The following equation gives 1M NaCl for oligonucleotide probes up to about 20 nt. ^* A good calculation of the melting temperature is obtained in:
T _m = 2 ° C for AT base pairs + 4 ° C for GC base pairs
The sodium ion concentration in the 6X salts sodium citrate (SSC) is 1M. Suggs et al., "Developmental Biology Using Purified Genes", p. 683, Brown and Fox (edited) (1981).
[0070]
High stringency purification conditions for oligonucleotides are usually at a temperature of 0-5 ° C. below the Tm of the oligonucleotide in 6 × SSC, 0.1% SDS.
[0071]
In another embodiment, the related nucleic acid molecule comprises, consists essentially of, consists of, or consists of a nucleotide sequence that is about 70% identical to the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 1. 2. Includes, consists essentially of, or consists of a nucleotide sequence that encodes a polypeptide that is about 70% identical to a polypeptide as shown in FIG. In some preferred embodiments, the nucleotide sequence is about 75%, or about 80%, or about 85%, or about 90%, or about 95, 96, 97, 98 with the nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 1. Or 99% identical or the nucleotide sequence is about 75%, or about 80%, or about 85%, or about 90%, or about 95, 96, Encodes a polypeptide that is 97, 98, or 99% identical.
[0072]
Nucleic acid sequence differences can result in conservative and / or non-conservative modifications of the amino acid sequence as compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[0073]
Conservative modifications to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (and corresponding modifications to the nucleotides it encodes) result in an AFTI polypeptide having functional and chemical properties similar to those of the naturally occurring AFTI polypeptide. In contrast, substantial modifications in the functional and / or chemical properties of the AFTI polypeptide can be attributed to (a) the structure of the molecular backbone in the replacement region, eg, a sheet or a helical structure; This can be achieved by selecting substitutions within the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 that have significantly different effects on charge or hydrophobicity, or (c) maintaining the bulk of the side chains.
[0074]
For example, a "conservative amino acid substitution" can include the replacement of a naturally occurring amino acid residue by a non-naturally occurring residue with little or no effect on the polarity or charge of the amino acid residue at that position. In addition, any natural residues in the polypeptide may also be as previously described for “alanine scanning mutagenesis” (eg, discussing alanine scanning mutagenesis, MacLennan et al., 1988, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 55-67; see Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24), alanine.
[0075]
Desired amino acid substitutions (conservative or non-conservative) can be determined by those skilled in the art at the time such substitutions are desired. For example, amino acid substitutions can be used to identify key residues in the AFTI polypeptide, or to increase or decrease the affinity of the AFTI polypeptides described herein. Exemplary amino acid substitutions are shown in Table I.
[0076]
[Table 1]

[0077]
In some embodiments, conservative amino acid substitutions also include non-naturally occurring amino acid residues, which are typically incorporated by chemical peptide synthesis rather than by synthesis in biological systems. These include peptidomimetics, and other reversed or inverted forms of the amino acid moiety.
[0078]
Naturally occurring residues can be classified into classes based on common side chain properties:
1) hydrophobic residues: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) neutral hydrophilic residues: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
3) acidic residues: Asp, Glu;
4) Basic residues: His, Lys, Arg;
5) Residues affecting chain direction: Gly, Pro; and
6) Aromatic residues: Trp, Tyr, Phe.
[0079]
For example, non-conservative substitutions could involve exchanging a member of one of these classes for a member from another class. Such substituted residues can be introduced within a region of the human AFTI polypeptide that is homologous to the non-human AFTI polypeptide ortholog or within a heterologous region of the molecule.
[0080]
In performing such exchanges, the hydropathic index of amino acids may be considered. Each amino acid has been assigned a hydropathic index based on its hydrophobicity and charge properties, which are as follows: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8). ); Phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.8); -0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
[0081]
The importance of the amino acid hydropathic index in conferring interactive biological functions on proteins is understood in the art. Kyte et al. Mol. Biol. 157: 105-131 (1982). It is known that some amino acids can be replaced by other amino acids having a similar hydropathic index or score and still retain the same biological activity. When making changes based on the hydropathic index, substitution of amino acids whose hydropathic index is within ± 2 is preferred, those with ± 1 are particularly preferred, and those with ± 0.5 are even more preferred.
[0082]
Also, similar amino acid substitutions may be based on hydrophilicity, particularly where proteins or peptides created by the same biological function are intended for use in immunological embodiments as in the present application. It is also understood in the art that it can be implemented effectively. The maximum local average hydrophilicity of a protein is governed by the hydrophilicity of its neighboring amino acids and thus correlates with its immunogenicity and antigenicity, ie, the biological properties of the protein.
[0083]
The following hydrophilicity values have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartate (+ 3.0 ± 1); glutamate (+ 3.0 ± 1). ); Serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (-0.4); proline (-0.5 ± 1); alanine (-0) Histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); Leucine (-1.8); Isoleucine (-1.8) ); Tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); tryptophan (-3.4). When making changes based on similar hydrophilicity values, substitution of amino acids whose hydrophilicity values are within ± 2 is preferred, those within ± 1 are particularly preferred, and those within ± 0.5 are even more preferred. . Epitopes can also be identified from primary amino acid sequences based on hydrophilicity. These regions are referred to as "epitope core regions."
[0084]
One of skill in the art would be able to determine suitable variants of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2 using known techniques. To identify appropriate regions of the molecule that can be altered without losing activity, one skilled in the art can target regions that are not believed to be important for activity. For example, when similar polypeptides with similar activity from the same species or other species are known, one of skill in the art can compare the amino acid sequence of an AFTI polypeptide to such similar polypeptides. Such comparisons can identify residues and portions of the molecule that are conserved between similar polypeptides. It will be appreciated that alterations in regions of the AFTI polypeptide that are not conserved relative to such similar polypeptides are less likely to have a deleterious effect on the biological activity and / or structure of the AFTI polypeptide. . Also, it is known to those skilled in the art that even in a relatively conserved region, a naturally occurring residue can be substituted with a chemically similar amino acid while retaining the activity (conservative amino acid residue substitution). Will. Therefore, it is believed that even regions thought to be important for biological activity or structure can be subjected to conservative amino acid substitutions without loss of biological activity or without adversely affecting the polypeptide structure.
[0085]
In addition, one of skill in the art can review structure-function studies identifying residues in similar polypeptides that are important for activity or structure. Such comparisons can predict the importance of amino acid residues in the AFTI polypeptide that correspond to amino acid residues that are important for activity or structure in similar polypeptides. One of skill in the art can select chemically similar amino acid substitutions for such predicted amino acid residues of the AFTI polypeptide.
[0086]
One skilled in the art can also analyze the three-dimensional structure and amino acid sequence for similar polypeptide structures. With that information, one skilled in the art can predict the sequence of amino acid residues of an AFTI polypeptide for its three-dimensional structure. One of skill in the art would select amino acid residues predicted to be on the surface of a protein that do not radically alter such residues, as they are believed to be involved in important interactions with other molecules. There will be. In addition, one of skill in the art can generate test variants that contain a single amino acid substitution at each desired amino acid residue. Such variants can then be screened using activity assays known to those skilled in the art. Such variants could be used to gather information about suitable variants. For example, if it is found that the mutation results in a loss of activity, an undesirable decrease in activity, or a change in a particular amino acid residue due to inappropriate activity, such altered variants are avoided. Will. In other words, based on information gathered from such routine experimentation, one skilled in the art can readily determine which amino acids should be avoided, alone or in combination with other mutations.
[0087]
Many academic publications have targeted secondary structure predictions. Moult J. et al. , Curr. Op. in Biotech. Chou et al., Biochemistry, 13 (2): 222-245 (1974); 113 (2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. , 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev .. Biochem. , 47: 251-276 and Chou et al., Biophys. J. , 26: 367-384 (1979). In addition, computer programs can now be used to predict secondary structure. One method for predicting secondary structure is based on homology modeling. For example, two polypeptides or proteins that have 30% or more sequence identity or 40% or more similar often have similar structural topologies. Recently, the development of the protein structure database (PDB) has increased the predictability of secondary structure, including the potential number of folds within a polypeptide or protein structure. Holm et al., Nucl. Acid. Res. , 27 (1): 244-247 (1999). It is suggested that there is a limited number of folds within a given polypeptide or protein, and that once a significant number of structures have been elucidated, the accuracy of structure predictions will dramatically improve ( Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7 (3): 369-376 (1997).
[0088]
Further methods of predicting secondary structure are described in "threading" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7 (3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4 ( 1): 15-9 (1996)), "Profile analysis" (Bowie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzymol., 183: 146-159 (1990); Gribskov et al. Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13): 4355-4358 (1987)), and "evolutionary linkage" (see Home, supra, and Brenner, supra).
[0089]
The identity and similarity between related nucleic acid molecules and polypeptides can be readily calculated by known methods. Such methods are described in "Computational Molecular Biology", Lesk, A .; M. Editing, Oxford University Press, New York, 1988; "Biocomputing: Information and Genome Projects", Smith, D .; W. Editing, Academic Press, New York, 1993; "Computer Analysis of Sequence Data, Part 1", Griffin, A .; M. And Griffin, H .; G. FIG. Editing, Humana Press, New Jersey, 1994; "Sequence Analysis in Molecular Biology", von Heinje, G .; , Academic Press, 1987; "Sequence Analysis Primer", Gribskov, M .; And Devereux, J .; Edit, M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Am. Applied Math. , 48: 1973 (1988), including, but not limited to.
[0090]
Preferred methods for determining identity and / or similarity are designed to give the largest match between the sequences considered. Methods for determining identity and similarity are described in publicly available computer programs. A preferred computer program method for determining identity and similarity between two sequences is GAP (Deverex et al., Nucl. Acid. Res., 12: 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.). ), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)). The BLASTX program is publicly available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and other sources (BLAST Manual, Altschul et al., NCB / NLM / NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., Supra). Known Smith Waterman algorithms can also be used to determine identity.
[0091]
Certain alignment schemes for aligning two amino acid sequences may result in the pairing of only a short region of the two sequences, where the small aligned region has a significant relationship between the two full-length sequences. In some cases, the sequence identity may be very high. Thus, in a preferred embodiment, the selected alignment method (GAP program) results in an alignment that spans at least 50 contiguous amino acid sequences of the target polypeptide.
[0092]
For example, using the computer algorithm GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), the two polypeptides whose percent sequence identity is to be determined are aligned for their optimal amino acid pairing ( Matching span as determined by the algorithm). Calculated as the gap opening penalty (3 × average diagonal); the “average diagonal” is the diagonal average of the comparison matrix used; the “diagonal” is each individual amino acid pairing by an individual comparison matrix. The assigned score or number) and gap extension penalty (usually 1/10 of the gap opening penalty), and a comparison matrix such as PAM250 or BLOSUM62 are used with the algorithm. For a PAM250 comparison matrix, see Dayhoff et al., "Atlas of Protein Sequence and Structure", Volume 5, Appendices 3 (1978); for a BLOSUM62 comparison matrix, see Henikoff et al., Proc. Nat. Acad.Sci.USA, 89: 10915-10919 (1992)).
[0093]
Preferred parameters for polypeptide sequence comparison include the following:
Algorithm: Needleman et al. Mol. Biol. , 48: 443-453 (1970);
Comparative matrix: Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992); BLOSUM62;
Gap penalty: 12
Gap length penalty: 4
Similarity threshold: 0
The GAP program is useful for the above parameters. The above parameters are default parameters (without penalty for end gaps) for polypeptide comparisons using the GAP algorithm.
[0094]
Preferred parameters for sequence comparison of nucleic acid molecules include:
Algorithm: Needleman et al. Mol. Biol. , 48: 443-453 (1970);
Comparison matrix: pairing = + 10, illegal pair = 0
Gap penalty: 50
Gap length penalty: 3
The GAP program is also useful for the above parameters. The above parameters are default parameters for nucleic acid molecule comparison.
[0095]
Other exemplary algorithms, gap opening penalties, gap extension penalties, comparison matrices, similarity thresholds, and the like, are also used, including those shown in Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, September 1997. sell. The particular choice to be taken will be apparent to those skilled in the art, and will depend on the particular comparison to be performed, such as DNA-to-DNA, protein-to-protein, protein-to-DNA, etc. (In this case, GAP or BestFit is generally preferred) or a comparison of a single sequence to a large sequence database (in this case, FASTA or BLASTA is preferred).
[0096]
Preferred AFTI polypeptide variants include glycosylation variants in which the number and / or type of glycosylation is altered relative to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. In one embodiment, the AFTI polypeptide variant comprises more or less N-linked glycosylation sites than the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The N-linked glycosylation site is characterized by the sequence: Asn-X-Ser or Asn-X-Thr, wherein the amino acid residue designated X can be any amino acid residue except proline. Substitution of amino acid residues that create this sequence provides a potential new site for the addition of N-linked carbohydrates. Alternatively, substitutions that remove this sequence will remove the N-linked sugar chains present. Also, one or more N-linked glycosylation sites (typically naturally occurring) are removed to create one or more new N-linked sites, and the N-linked sugar chain can be re-established. An array is also provided. Further preferred AFTI variants are cysteine variants wherein one or more cysteine residues are deleted or replaced by another amino acid (eg, serine) compared to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof. Including the body. Cysteine variants are useful when the AFTI polypeptide must fold into a biologically active conformation, such as after isolation of insoluble inclusion bodies. Cysteine variants generally have fewer cysteine residues than the native protein, and typically have an even number of residues to minimize interactions resulting from unpaired cysteines.
[0097]
Additional AFTI polypeptide variants include lipidation variants in which a lipidation site has been added by modification of the AFTI polypeptide sequence (eg, insertion or substitution of a residue). For such molecules, the protein of SEQ ID NO: 2 is suddenly modified to include an amino acid or motif recognized by a lipidating enzyme (eg, a motif recognized by farnesyltransferase and / or geranylgeranyltransferase, including the CAAX motif). Can be mutated. For example, Fu et al., 1999, Recent Prog. Horm. Res. 54: 315-342; Wilson et al., 1998, Biochem. J. 333: 497-504; Khosrabi-Far et al., 1992, J. Am. Biol. Chem. 267: 24363-24368. Other lipidation techniques known in the art can also be used to modify the AFTI polypeptides of the invention.
[0098]
Further, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an AFTI polypeptide variant can be fused to a homologous polypeptide to form a homodimer, or to a heterologous polypeptide to form a heterodimer. Heterologous peptides and polypeptides include, but are not limited to: epitopes that allow detection and / or isolation of AFTI fusion polypeptides; extracellular or transmembrane and intracellular domains, such as Transmembrane receptor proteins or portions thereof; ligands or portions thereof that bind transmembrane receptor proteins; catalytically active enzymes or portions thereof; polypeptides or peptides that promote oligomerization such as leucine zipper domains; immunoglobulin constant regions And a polypeptide having a therapeutic effect different from the polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of the AFTI polypeptide variant.
[0099]
The fusion can be made at either the amino or carboxy terminus of a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or the amino acid sequence of an AFTI polypeptide variant. The fusion may be direct without a linker or adapter molecule or indirect using a linker or adapter molecule. The linker or adapter molecule can be one or more amino acid residues, typically from about 20 to about 50 amino acid residues. The linker or adapter molecule can also be designed to include a cleavage site for a DNA restriction endonuclease or a protease that separates the fusion moiety. It will be apparent that, once constructed, the fusion polypeptide can be derivatized according to the methods described herein.
[0100]
In a further embodiment of the invention, a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an AFTI polypeptide variant is fused to one or more domains of the Fc region of human IgG. Antibodies are known as "Fabs," which bind to two functionally independent portions, an antigen, and "Fc," which are involved in effector functions such as complement activation and phagocytosis. Constant domains. Fc has a long serum half-life, whereas Fab has a short half-life. Capon et al., Nature, 337: 525-31 (1989). When assembled with therapeutic proteins, Fc domains can confer longer half-life or incorporate functions such as Fc receptor binding, protein A binding, complement fixation, and possibly placental transport. Table 2 summarizes the use of certain FC fusions known in the art.
[0101]
[Table 2]

[0102]
In one example, all or part of the human IgG hinge, CH2 and CH3 regions can be fused to either the N- or C-terminus of the AFTI polypeptide using methods known to those of skill in the art. The resulting AFTI fusion polypeptide can be purified using a protein A affinity column. Peptides and proteins fused to the Fc region were found to exhibit a substantially longer half-life than their unfused counterparts in vivo. Also, fusion to an Fc region allows for dimerization / multimerization of the fusion polypeptide. The Fc region may be a naturally occurring Fc region or may have been modified to enhance certain qualities such as therapeutic quality, circulation time, reduced aggregation, and the like.
[0103]
Synthesis
One skilled in the art will recognize that the nucleic acid and polypeptide molecules described herein can be produced recombinantly and by other methods.
[0104]
Synthesis of nucleic acid molecules
Nucleic acid molecules encoding polypeptides that include the amino acid sequence of an AFTI polypeptide are readily available in a variety of ways, including, but not limited to, chemical synthesis, cDNA or genomic library screening, expression library screening, and / or PCR amplification of cDNA. Can be obtained.
[0105]
The recombinant DNA methods used herein are generally described in Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) or Cold Spring Harbor, NY (Aus). Edited in "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishers Inc. And Wiley & Sons, NY (1994). The invention provides nucleic acid molecules as described herein and methods for obtaining such molecules.
[0106]
When a gene encoding the amino acid sequence of an AFTI polypeptide is identified from one species, all or part of that gene can be used as a probe to identify orthologs or related genes from the same species. Probes or primers can be used to screen cDNA libraries from various tissues that are likely to express the AFTI polypeptide. Further, screening a genomic library using part or all of the nucleic acid molecule having the sequence as set forth in SEQ ID NO: 1 to identify and isolate the gene encoding the amino acid sequence of the AFTI polypeptide. Can be. Typically, moderate or high stringency conditions are used for screening to minimize the number of false positives resulting from the screen.
[0107]
Nucleic acid molecules encoding the amino acid sequence of an AFTI polypeptide may also be identified by expression cloning using detection of positive clones based on the properties of the expressed protein. Typically, nucleic acid libraries are screened by binding of antibodies or other binding partners (eg, receptors or ligands) to the cloned protein expressed and displayed on the host cell surface. The antibody or binding partner is modified with a detectable label to identify cells expressing the desired clone.
[0108]
Recombinant expression techniques, performed according to the description set forth below, can be used to make these polynucleotides and express the encoded polypeptide. For example, by inserting a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of an AFTI polypeptide into a suitable vector, one skilled in the art can readily produce large amounts of the desired nucleotide sequence. The sequence can then be used to generate a detection probe or amplification primer. Alternatively, a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the AFTI polypeptide can be inserted into an expression vector. By inserting the expression vector into an appropriate host, the encoded AFTI polypeptide can be produced in large amounts.
[0109]
Another method for obtaining a suitable nucleic acid sequence is the polymerase chain reaction (PCR). In this method, cDNA is prepared from poly (A) + RNA or total RNA using reverse transcriptase. Next, two primers, typically complementary to two separate regions of the cDNA (oligonucleotide) encoding the amino acid sequence of the AFTI polypeptide, are added to the cDNA along with a polymerase such as Taq polymerase, The polymerase amplifies the cDNA region between the two primers.
[0110]
Another means of preparing nucleic acid molecules encoding the amino acid sequence of an AFTI polypeptide is described in Engels et al., Angew. Chem. Intl. Ed. Chem., 28: 716-734 (1989). These methods include, inter alia, the phosphotriester, phosphoramidite, and H-phosphonate methods for nucleic acid synthesis. A preferred method for such chemical synthesis is polymer-supported synthesis using standard phosphoramidite chemistry.
[0111]
Typically, the DNA encoding the amino acid sequence of the AFTI polypeptide is several hundred nucleotides in length. Nucleic acids of about 100 nucleotides or more can be synthesized as several fragments using these methods. The fragments can then be ligated together to form the full length nucleotide sequence of the AFTI polypeptide. Usually, a DNA fragment encoding the amino terminus of a polypeptide has an ATG encoding a methionine residue. The methionine may or may not be present in the mature form of the AFTI polypeptide, depending on whether the polypeptide produced in the host cell is designed to be secreted from that cell. Other methods known to those skilled in the art can be used well.
[0112]
In some embodiments, the nucleic acid variant comprises an altered codon for optimal expression of the AFTI polypeptide in a given host cell. Individual codon changes will depend on the AFTI polypeptide and host cell selected for expression. Such "codon optimization" can be performed in a variety of ways, for example, by selecting preferred codons for use with genes that are highly expressed in a given host cell. A computer algorithm incorporating a codon frequency table such as "Ecohigh.cod" for codon selectivity of highly expressed bacterial genes can be used, which is the University of Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison. , WI. Other useful codon frequency tables include “Celegans_high.cod”, “Celegans_low.cod”, “Drosophila_high.cod”, “Human_high.cod”, “Maize_high.cod”, and “Yeast.high.cod”.
[0113]
Vectors and host cells
A nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of an AFTI polypeptide can be inserted into an appropriate expression vector using standard ligation techniques. The vector is typically selected to be functional in the particular host cell used (ie, the vector is compatible with the host cell machinery so that gene amplification and / or expression can occur). . A nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of an AFTI polypeptide can be amplified / expressed in prokaryotic, yeast, insect (baculovirus-based), and / or eukaryotic host cells. The choice of host cell will depend, in part, on whether the AFTI polypeptide is post-translationally modified (eg, glycosylated and / or phosphorylated). If so, yeast, insect, or mammalian host cells are preferred. For a review of expression vectors, see Meth. Enzymol. , V. 185, D. V. Edited by Goeddel, Academic Press Inc. , San Diego, CA (1990).
[0114]
Typically, expression vectors used in any of the host cells include sequences for plasmid maintenance and sequences for cloning and expressing foreign nucleotide sequences. Such sequences, collectively referred to in some embodiments as "flanking sequences," typically include one or more of the following nucleotide sequences: a promoter, one or more enhancer sequences. , Origin of replication, transcription termination sequence, complete intron sequence including splice donor and acceptor sites, sequence encoding a leader sequence for polypeptide secretion, ribosome binding site, polyadenylation sequence, encoding the polypeptide to be expressed A polylinker region for inserting a nucleic acid, and a selectable marker element. Each of these sequences is described below.
[0115]
In some cases, the vector may include a "tag" coding sequence, ie, an oligonucleotide molecule located at the 5 'or 3' end of the AFTI polypeptide; the oligonucleotide sequence may be poly-His (such as hexa-His) or FLAG. , HA (hemagglutinin influenza virus) or other "tags" such as myc for which a commercially available antibody is present. This tag is typically fused to the polypeptide upon expression of the polypeptide and can be used as a means of affinity purification of the AFTI polypeptide from host cells. Affinity purification can be performed, for example, by column chromatography using an antibody against the tag as an affinity matrix. In some cases, the tag can then be removed from the purified AFTI polypeptide by various means, such as by using certain peptidases for cleavage.
[0116]
Flanking sequences may be homologous (ie, from the same species and / or strain as the host cell), heterologous (ie, from a species other than the host cell species or strain), hybrid (ie, flanking sequences from more than one source). Combinations) or synthetic, or the flanking sequences may be native sequences that function normally to regulate AFTI polypeptide expression. As such, the source of the flanking sequence may be any prokaryotic or eukaryotic, vertebrate or invertebrate, provided that the flanking sequence is functional in the host cell machinery and can be activated by the host cell machinery. Or it may be a plant.
[0117]
Flanking sequences useful in the vectors of the present invention may be obtained by any of several methods known in the art. Typically, flanking sequences useful herein other than the AFTI gene flanking sequence have been previously identified by mapping and / or restriction endonuclease digestion, and thus can be used in appropriate tissues with the appropriate restriction endonuclease. Can be isolated from the source. In some spirits, the entire nucleotide sequence of the flanking sequence may be known. Here, the flanking sequences may be synthesized using the methods described herein for nucleic acid synthesis or cloning.
[0118]
If all or only part of the flanking sequence is known, the flanking sequence can be determined by PCR and / or screening the genomic library with appropriate oligonucleotides and / or flanking sequence fragments from the same or another species. Can be obtained. If the flanking sequence is unknown, a fragment of the DNA containing the flanking sequence may be isolated, for example, from a larger fragment of DNA that may contain the coding sequence or yet another gene or genes. Isolation is accomplished by digestion with a restriction endonuclease that yields the appropriate DNA fragment, followed by agarose gel purification, Qiagen® column chromatography (Chatsworth, Calif.), Or other methods known to those skilled in the art. Can be implemented. The selection of an appropriate enzyme to achieve this end will be readily apparent to one skilled in the art.
[0119]
The origin of replication is typically part of a prokaryotic expression vector purchased commercially, and the origin aids in the amplification of the vector in host cells. Amplification of the vector to a constant copy number may be important in some cases for optimal expression of the AFTI polypeptide. When the vector to be selected does not contain an origin of replication, it can be chemically synthesized based on a known sequence and ligated to the vector. For example, the origin of replication from plasmid pBR322 (Product No. 303-3s, New England Biolabs, Beverly, MA) is suitable for most Gram-negative bacteria, and various origins (eg SV40, polyoma, adenovirus, blisters) Stomatitis virus (VSV) or papillomavirus such as HPV or BPV) are useful for cloning vectors in mammalian cells. Generally, mammalian expression vectors do not require an origin of replication component (eg, the SV40 origin is often used because it contains an early promoter).
[0120]
A transcription termination sequence is typically located 3 'to the end of the polypeptide coding region and serves to terminate transcription. Usually, transcription termination sequences in prokaryotes are GC-rich fragments, followed by a poly-T sequence. Such sequences are readily cloned from libraries or commercially available as part of a vector, but can also be readily synthesized using the methods for nucleic acid synthesis described herein.
[0121]
The selectable marker genetic element encodes a protein necessary for the survival and growth of the host cell growing on the selection medium. Typical selectable marker genes include (a) that confer resistance to antibiotics or other toxins, such as ampicillin, tetracycline, or kanamycin for prokaryotic host cells, (b) complement the cell's nutritional deficiency, or (c) ) Encodes proteins that supply essential nutrients not available from complex media. Preferred selectable markers are the kanamycin resistance gene, the ampicillin resistance gene, and the tetracycline resistance gene. The neomycin resistance gene may also be used for selection in prokaryotic and eukaryotic host cells.
[0122]
Genes to be expressed can also be amplified using other selection genes. Amplification is the process by which genes required more to produce proteins essential for growth are tandemly repeated in chromosomes of successive generations of recombinant cells. Examples of suitable selectable markers for mammalian cells include dihydrofolate reductase (DHFR) and thymidine kinase. The transformants of mammalian cells are placed under selection pressure so that only the transformants are uniquely adapted to survive by the selection gene present in the vector. The selection pressure is imposed by continually varying the concentration of the selection agent in the medium, thereby culturing the transformed cells under conditions that lead to the amplification of both the selection gene and the DNA encoding the AFTI polypeptide. As a result, a high amount of AFTI polypeptide is synthesized from the amplified DNA.
[0123]
Initiation of mRNA translation usually requires a ribosome binding site, which is specified by a Shine-Dalgarno sequence (prokaryotic cell) or a Kozak sequence (eukaryotic cell). Such elements are typically located 3 'to the promoter, 5' to the coding sequence of the AFTI polypeptide to be expressed. The Shine-Dalgarno sequence is varied but is typically a polypurine (ie, has a high AG content). A number of Shine-Dalgarno sequences have been identified, each of which can be readily synthesized using the methods described herein and used in prokaryotic vectors.
[0124]
A leader or signal sequence can be used to direct an AFTI polypeptide from a host cell. Typically, the nucleotide sequence encoding the signal sequence is located in the coding region of the AFTI nucleic acid molecule, or directly at the 5 'end of the AFTI polypeptide coding region. Many signal sequences have been identified and any that are functional in the selected host cell can be used with the AFTI nucleic acid molecule. Therefore, the signal sequence may be homologous (naturally occurring) or heterologous to the AFTI gene or cDNA. In addition, signal sequences can be chemically synthesized using the methods described herein. In most cases, secretion of the AFTI polypeptide from the host cell through the presence of the signal peptide will result in removal of the signal peptide from the secreted AFTI polypeptide. The signal sequence may be a component of the vector or may be part of an AFTI nucleic acid molecule inserted into the vector.
[0125]
Use of a nucleotide sequence encoding a native AFTI polypeptide signal sequence linked to an AFTI polypeptide coding region, or a nucleotide sequence encoding a heterologous signal sequence linked to an AFTI polypeptide coding region, is within the scope of the invention. It is. The heterologous signal sequence chosen must be one that is recognized and processed by the host cell, ie, cleaved by a signal peptidase. For prokaryotic host cells that do not recognize and process the native AFTI polypeptide signal sequence, replace the signal sequence with a prokaryotic signal sequence selected from the group of, for example, alkaline phosphatase, penicillinase, or a thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, the native AFTI polypeptide signal sequence can be replaced by a yeast invertase, α-factor, or acid phosphatase leader. For expression in mammalian cells, the native signal sequence may be satisfactory, but other mammalian signal sequences may be suitable.
[0126]
In some cases, such as when glycosylation is desired in a eukaryotic host cell expression system, various presequences may be manipulated to improve glycosylation or yield. For example, the peptidase cleavage site of a particular signal peptide can be altered, or a presequence can be added that can also affect glycosylation. The final protein product may have at position -1 (compared to the first amino acid of the mature protein) one or more additional amino acids associated with expression that would not have been completely removed. For example, the final protein product may have one or two amino acid residues found at the peptidase cleavage site attached to the N-terminus. Instead, the use of some enzyme cleavage sites can result in a slightly truncated form of the desired AFTI polypeptide if the enzyme cleaves at the relevant region in the mature polypeptide.
[0127]
Often, the presence of one or more introns in the vector enhances transcription of the nucleic acid molecule; this is especially true when the polypeptide is produced in a eukaryotic host cell, especially a mammalian host cell. . The introns used may be naturally occurring within the AFTI gene, especially if the gene used is a full-length genomic sequence or a fragment thereof. If the intron does not occur naturally in the gene (for most cDNAs), the intron can be obtained from another source. The location of the intron relative to the flanking sequence and the AFTI gene is generally important because the intron must be transcribed to be effective. Therefore, when the AFTI cDNA molecule is transcribed, the preferred position of the intron is 3 'to the transcription start site and 5' to the polyA transcription termination sequence. Preferably, one or more introns are located on one side or the other (ie, 5 'or 3') of the cDNA so as not to interrupt the coding sequence. Any intron from any source, including viral, prokaryotic and eukaryotic (plant or animal) organisms, can be used to practice the invention, provided that it is compatible with the host cell into which it will be inserted. . Synthetic introns are also included here. In some cases, more than one intron can be used in the vector.
[0128]
The expression and cloning vectors of the present invention each typically include a promoter that is recognized by the host organism and is operably linked to the molecule encoding the AFTI polypeptide. Promoters are non-transcribed sequences that control the transcription of a structural gene and are located upstream (5 ′) (generally within about 100-1000 bp) of the start codon of the structural gene. Promoters are conveniently classified into two classes: inducible promoters and constitutive promoters. An inducible promoter initiates high levels of transcription from DNA under its control in response to changes in culture conditions, such as the presence or absence of nutrients or changes in temperature. Structural promoters, on the other hand, initiate continuous gene product production; that is, they have little or no control over gene expression. Many promoters that are recognized by various host cells are widely known. By removing the promoter from the source DNA by restriction enzyme digestion and inserting the desired promoter sequence into the vector, an appropriate promoter is operably linked to the DNA encoding the AFTI polypeptide. The native AFTI gene promoter sequence can be used to direct amplification and / or expression of an AFTI nucleic acid molecule. However, heterologous promoters are preferred if they allow for higher transcription and higher yield of expressed protein as compared to the native promoter, and are compatible with the host cell system chosen for use.
[0129]
Promoters suitable for use in prokaryotic hosts include the β-lactamase and lactose promoter systems; alkaline phosphatase, tryptophan (trp) promoter systems; and hybrid promoters such as the tac promoter. Other known bacterial promoters are also suitable. Those sequences are published, so that one of skill in the art can ligate the promoter to the desired DNA sequence using linkers or adapters as needed to provide useful restriction sites.
[0130]
Suitable promoters for use with yeast hosts are also known in the art. Yeast enhancers are advantageously used with yeast promoters. Suitable promoters for use with mammalian host cells are known and include polyomavirus, fowlpox virus, adenovirus (such as adenovirus 2), bovine papillomavirus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus (CMV), retrovirus Virus, including but not limited to those obtained from the genome of a virus such as hepatitis B virus, and most preferably Simian virus 40 (SV40). Other suitable mammalian promoters include heterologous mammalian promoters, such as heat shock promoter and actin promoter.
[0131]
Additional promoters that may be useful in controlling the transcription of the AFTI gene include, but are not limited to, the SV40 early promoter region (Bernoist and Chambon, Nature, 290: 304-310, 1981); A promoter contained in the 3 'long terminal repeat of Rous sarcoma virus (Yamamoto et al., Cell, 22: 787-797, 1980); a herpes thymidine kinase promoter (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 144). Regulatory sequences of the metallothionein gene (Brinster et al., Nature, 296: 39-42, 1982); for prokaryotic expression vector o, β-lactamase Promoters such as promoters (Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 3727-3731, 1978); or the tac promoter (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21). -25, 1983). Also useful are animal transcription regulatory regions that exhibit tissue specificity and have been used in transgenic animals, such as the following: an elastase I gene regulatory region active in pancreatic endoplasmic reticulum cells (Swift et al., Cell, 38: 639-). Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50: 399-409 (1986); MacDonald, Hepatology, 7: 425-515, 1987); Hanahan, Nature, 315: 115-122, 1985); Immunoglobulin gene regulatory regions active in lymphoid cells (Grosschedl et al., Cell, 38: 647-658 (1984); Adames et al., Nat. re, 318: 533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell. Biol., 7: 1436-1444, 1987); mouse mammary adenocarcinoma virus control region active in testis, breast, lymphatic system and mast cells (Leder Cell, 45: 485-496, 1986); an albumin gene regulatory region active in the liver (Pinkert et al., Genes and Level., 1: 268-276, 1987); an alpha-fetoprotein gene regulatory region active in the liver ( Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol., 5: 1639-1648, 1985; Hammer et al., Science, 235: 53-58, 1987); a1-antitrypsin gene regulatory region active in liver (Kelsey et al., Genesa). d Devel., 1: 161-171, 1987); β-globin gene regulatory region active in myeloid cells (Mogram et al., Nature, 315: 338-340, 1985; Kollias et al., Cell, 46: 89-94, 1987). 1986); a myelin basic protein gene regulatory region active in oligodendrocytes of the brain (Readhead et al., Cell, 48: 703-712, 1987); a myosin light chain-2 gene regulatory region active in skeletal gold (Sani). , Nature, 314: 283-286, 1985); and a gonadotropin-releasing hormone gene regulatory region active in the hypothalamus (Mason et al., Science, 234: 1372-1378, 1986).
[0132]
To enhance the transcription of a DNA encoding the AFTI polypeptide of the invention by higher eukaryotes, an enhancer sequence can be inserted into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about 10 to 300 bp long, that act on a promoter to increase transcription. Enhancers are relatively direction and position independent. It is found on the 5 'and 3' sides of the transcription unit. Several enhancer sequences available from mammalian genes are known (eg, globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). Typically, however, an enhancer from a virus is used. The SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer, polyoma enhancer, and adenovirus enhancer are exemplary enhancing elements for activation of eukaryotic promoters. Enhancers can be spliced into the vector at positions 5 'and 3' to the AFTI nucleic acid molecule, but are typically located at a site 5 'from the promoter.
[0133]
The expression vector of the present invention can be constructed from a starting vector, such as a commercially available vector. Such vectors may or may not include all of the desired flanking sequences. If one or more desired flanking sequences are not already present in the vector, they can be obtained individually and ligated into the vector. The method used to obtain each flanking sequence is known to those skilled in the art.
[0134]
Preferred vectors for practicing the present invention are those that are compatible with bacterial, insect, yeast, and mammalian host cells. Such vectors include, among others, pCRII, pCR3, and pcDNA3.1 (Invitrogen Company, Carlsbad, Calif.), PBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), PET15b (Novagen, Madison, Wi.), And pGEXiA. , Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), PETL (BlueBacII; Invitrogen), pDSR-α (PCT Publication No. WO90 / 14363) and pFastBacDual (Gibco / BRL, GNL, GNL, GRL, NRL) Including.
[0135]
It will be apparent that further suitable vectors include, but are not limited to, cosmids, plasmids or modified viruses, provided that the vector system must be compatible with the chosen host cell. Such vectors include Bluescript® plasmid derivatives (high copy number ColE1-based phagemids, Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla, Calif.), PCR cloning designed to clone Taq amplified PCR products. Plasmids such as plasmids (e.g., TOPO (TM) TA Cloning (R) Kit, PCR2.1 (R) plasmid derivatives, Invitrogen, Carlsbad, CA), and mammalian, yeast, insect, or baculovirus expression systems ( pBacPAK plasmid derivatives, Clontech, Palo Alto, Calif.).
[0136]
After the vector has been constructed and the nucleic acid molecule encoding the AFTI polypeptide has been inserted at the appropriate site in the vector, the completed vector can be inserted into an appropriate host cell for amplification and / or expression of the polypeptide. . Transformation of an AFTI polypeptide expression vector into a selected host cell can be accomplished by known methods, including transfection, infection, calcium chloride, electroporation, microinjection, lipofection, or methods such as the DEAE-dextran method, or It can be implemented by other known techniques. The method selected will depend, in part, on the type of host cell used. These and other suitable methods are known to those skilled in the art and are described, for example, in Sambrook et al., Supra.
[0137]
The host cell can be a prokaryotic host cell (such as E. coli) or a eukaryotic host cell (such as a yeast cell, insect cell or vertebrate cell). The host cell, when cultured under appropriate conditions, synthesizes the AFTI polypeptide and then either harvests it from the medium (if the host cell secretes the AFTI polypeptide into the medium), or produces the host. Can be collected directly from cells. Selection of the appropriate host cell depends on various factors, such as the level of expression desired, the modification of the polypeptide desired or required for activity, such as glycosylation or phosphorylation, and the ease of folding into bioactive molecules. Will do.
[0138]
A number of suitable host cells are known in the art, many of which are available from the American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. Examples include Chinese hamster ovary cells (CHO) (ATCC No. CCL61), CHO DHFR cells (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220 (1980), human embryonic kidney (HEK) Including, but not limited to, mammalian cells such as 293 or 293T cells (ATCC No. CCL1573) or 3T3 cells (ATCC No. CCL92) Selection of suitable mammalian host cells and transformation, culture, amplification, screening Other suitable mammalian cell lines are monkey COS-1 (ATCC No. CRL1650) and COS-7 cell line (ATCC No. CRL1651). And CV-1 cell lines (ATCC No. Additional exemplary mammalian host cells include primate and rodent cell lines, including transformed cell lines, normal diploid cells, derived from in vitro culture of primary tissue. Cell lines, as well as primary explants, are also suitable.Candidate cells may have a genotypic deficiency in the selection gene or may contain a dominantly acting selection gene. Available but not limited to mouse neuroblastoma N2A cells, HeLa, mouse L-929 cells, 3T3 lines derived from Swiss, Balb-c or NIH mice, BHK or HaK hamster cell lines. Each of these cell lines is known and available to those of skill in the art of protein expression.
[0139]
Bacterial cells are also useful as suitable host cells for the present invention. For example, various strains of E. coli (eg, HB101, (ATCC No. 33694) DH5α, DH10, and MC1061 (ATCC No. 53338)) are known as host cells in the field of biotechnology. Various strains such as B. subtilis, Pseudomonas spp., Other Bacillus spp., Streptomyces spp., Etc. may also be used in this method.
[0140]
Many strains of yeast cells known to those of skill in the art may also be used as host cells for expression of a polypeptide of the invention. Preferred yeast cells include, for example, Saccharomyces cerevisae and Pichia pastoris.
[0141]
In addition, if desired, insect cell systems may also be used in the methods of the invention. Such systems are described, for example, in Kitts et al., Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol. , 4: 564-572 (1993); and Lucklow et al. (J. Virol., 67: 4566-59 (1993)). Preferred insect cells are Sf-9 and Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
[0142]
Also, transgenic animals can be used to express glycosylated AFTI polypeptides. For example, transgenic dairy animals (eg, cows or goats) can be used to obtain the glycosylated polypeptides of the invention in animal milk. Plants can also be used to produce AFTI polypeptides, but in general, glycosylation that occurs in plants differs from that which occurs in mammalian cells, and may result in glycosylation products that are not suitable for human therapeutic use.
[0143]
Polypeptide production
Host cells containing the AFTI polypeptide expression vector can be cultured using standard media known to those of skill in the art. The medium usually contains all nutrients necessary for cell growth and survival. Suitable media for culturing E. coli cells include, for example, Luria Broth (LB) and / or Terrific Broth (TB). Suitable media for culturing eukaryotic cells include Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 (RPMI 1640), Minimum Essential Medium (MEM) and / or Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), all of which are specific to the culture. Serum and / or growth factors may be supplemented as dictated by the cell line. A suitable medium for insect culture is Grace's medium, optionally supplemented with yeastolate, lactalbumin hydrolyzate and / or fetal calf serum.
[0144]
Typically, antibiotics or other compounds useful for selective growth of transformed cells are added to the medium as a supplement. The compound to be used is specified by the selectable marker element present on the plasmid into which the host cell has been transformed. For example, if the selectable marker element is kanamycin resistant, the compound added to the medium is kanamycin. Other compounds for selective growth include ampicillin, tetracycline, and neomycin.
[0145]
The amount of AFTI polypeptide produced by a host cell can be assessed by standard methods known in the art. Such methods include, without limitation, activity assays such as Western blot analysis, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, non-denaturing gel electrophoresis, HPLC separation, immunoprecipitation, and / or DNA binding gel shift analysis. Including.
[0146]
When an AFTI polypeptide is designed to be secreted from a host cell, the majority of the polypeptide will be present in the cell culture medium. However, if the AFTI polypeptide is not secreted from the host cell, it is present in the cytoplasm and / or nucleus (for eukaryotic host cells) or cytosol (for bacterial host cells).
[0147]
With respect to AFTI polypeptides located in the cytoplasm and / or nucleus of host cells (for eukaryotic host cells) or cytosol (for bacterial host cells), the host cells may be isolated using any standard technique known to those skilled in the art. Intracellular material (including inclusion bodies for Gram-negative bacteria) can be extracted. For example, host cells can be lysed and the periplasmic / cytoplasmic content released by French pressing, homogenization, and / or sonication followed by centrifugation.
[0148]
When the AFTI polypeptide forms an inclusion body in the cytosol, the inclusion body is often associated with the inner and / or outer cell membranes and is therefore, after centrifugation, primarily found as pellet material. The pellet material is then treated at an extreme pH or in the presence of a reducing agent such as dithiothreitol at alkaline pH or triscarboxyethylphosphine at acidic pH, a surfactant, guanidine, guanidine derivative, urea, or Treatment with a chaotropic reagent such as a urea derivative can release, disrupt, and solubilize the inclusion bodies. The soluble form of the AFTI polypeptide can then be analyzed using gel electrophoresis, immunoprecipitation, and the like. If it is desired to isolate the AFTI polypeptide, the methods described herein and Marston et al., Meth. Enzymol. 182: 264-275 (1990).
[0149]
In some cases, AFTI polypeptides may not be biologically active after isolation. Various methods for "refolding" or converting a polypeptide to its tertiary structure to form disulfide bonds can be used to restore biological activity. Such methods include exposing the solubilized polypeptide to a pH, usually greater than 7, in the presence of a particular concentration of chaotropic reagent. The choice of chaotropic reagent is very similar to the choice used for solubilizing inclusion bodies, but usually the chaotropic reagent is used at lower concentrations and is not necessarily the same as the chaotropic reagent used for solubilization. In most cases, the refolding / oxidation solution also contains a reducing agent, or a reducing agent plus its oxidized form at a specific ratio that produces a specific redox potential that allows disulfide shuffling to occur during the formation of cysteine bridges in the protein. Including. Some commonly used redox couples include cysteine / cystamine, glutathione (GSH) / dithiobis GSH, cupric chloride, dithiothreitol (DTT) / dithiane DTT, and 2-2 mercaptoethanol (bME) / Including dithio-b (ME). Co-solvents can be used to increase the efficiency of refolding, and more common reagents used for this include glycerol, polyethylene glycols of various molecular weights, arginine, and the like.
[0150]
If no significant degree of inclusion bodies is formed upon expression of the AFTI polypeptide, after centrifugation of the cell homogenate, the polypeptide is found primarily in the supernatant. The polypeptide can be further isolated from the supernatant using methods described herein.
[0151]
Purification of the AFTI polypeptide from solution can be performed using a variety of techniques. The polypeptide may have hexahistidine (AFTI polypeptide / hexaHis) at either its carboxy or amino terminus, or other small such as FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) or myc (Invitrogen, Carlsbad, CA). If synthesized to include a tag, such as a peptide, the column matrix can be purified in one step by passing the solution through an affinity column with high affinity for the tag.
[0152]
For example, polyhistidine binds nickel with high affinity and specificity, so that an affinity column of nickel (such as a Qiagen® nickel column) can be used for purification of AFTI polypeptide / polyHis. See, e.g., Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Chapter 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993).
[0153]
In addition, AFTI-like polypeptides can be purified through the use of monoclonal antibodies capable of specifically recognizing and binding to AFTI-like polypeptides.
[0154]
Suitable procedures for purification are therefore, without limitation, affinity chromatography, immunoaffinity chromatography, ion exchange chromatography, molecular sieving chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), electrophoresis (native (Including, but not limited to, gel electrophoresis) followed by gel elution, and preparative isoelectric focusing ("Isoprime" instrument / technique, Hoefer Scientific, San Francisco, CA). In some cases, two or more purification techniques may be combined to achieve high purity.
[0155]
AFTI polypeptides are also described in Merrifield et al. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963); Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5132 (1985), and Steward and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", Pierce Chemical Co. , Rockford, IL (1984), by chemical synthesis methods (such as solid phase peptide synthesis) using techniques known in the art. Such polypeptides can be synthesized with or without methionine at the amino terminus. Chemically synthesized AFTI polypeptides can be oxidized using methods described in these references to form disulfide bridges. A chemically synthesized AFTI polypeptide is expected to have equivalent biological activity to the corresponding AFTI polypeptide, produced recombinantly or purified from a natural source, and may therefore be used interchangeably with a recombinant or natural AFTI polypeptide.
[0156]
Another means of obtaining an AFTI polypeptide is by purification from a biological sample, such as a source tissue and / or fluid in which the AFTI polypeptide is naturally occurring. Such purification can be performed using the methods for protein production as described herein. The presence of the AFTI polypeptide during purification can be monitored, for example, using antibodies raised against the recombinantly produced AFTI polypeptide or a peptide fragment thereof.
[0157]
Several additional methods for producing nucleic acids and polypeptides are known in the art and can be used to produce polypeptides with specificity for AFTI. For example, Roberts et al., Proc., Who described the production of a fusion protein between mRNA and the peptide it encodes. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-12303 (1997). See also US Pat. No. 5,824,469 which describes how to obtain oligonucleotides capable of performing a particular biological function. The procedure involves generating a heterologous pool of oligonucleotides, each having a 5 'random sequence, a central preselected sequence, and a 3' random sequence. The resulting heterologous pool is introduced into a cell population that does not display the desired biological function. Next, a small population of cells is screened for those that exhibit a predetermined biological function. An oligonucleotide capable of performing the desired biological function is isolated from the small population.
[0158]
U.S. Patent Nos. 5,763,192, 5,814,476, 5,723,323, and 5,817,483 describe methods for producing peptides or polypeptides. This is accomplished by creating stochastic genes or fragments thereof, and then introducing these genes into host cells that produce one or more proteins encoded by the stochastic genes. The host cells are then screened to identify clones that produce a peptide or polypeptide having the desired activity.
[0159]
Chemical derivative
Chemically modified derivatives of AFTI polypeptides can be prepared by one of skill in the art in light of the disclosure set forth below. AFTI polypeptide derivatives are modified to alter the type or position of the molecule naturally associated with the polypeptide. Derivatives can include molecules formed by the deletion of one or more natural binding chemical groups. A polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an AFTI polypeptide variant may be modified by the covalent attachment of one or more polymers. For example, because the polymer selected is typically water soluble, the proteins that bind to it will not precipitate in an aqueous environment, such as a physiological environment. Mixtures of polymers are included within the scope of suitable polymers. Preferably, for therapeutic use of the end product, the polymer is pharmaceutically acceptable.
[0160]
Each polymer can be of any molecular weight and can be either branched or unbranched. Polymers typically have a molecular weight of about 2 kDa to about 100 kDa (the term “about” means that in a formulation of a water-soluble polymer, some molecules have a higher molecular weight than the indicated molecular weight and some molecules have a lower molecular weight). Has an average molecular weight of The average molecular weight of each polymer is preferably between about 5 kDa to about 50 kDa, more preferably between about 12 kDa to about 40 kDa, most preferably between about 20 kDa to about 35 kDa.
[0161]
Suitable water-soluble polymers or mixtures thereof include N-linked or O-linked carbohydrates, sugars, phosphates, polyethylene glycol (PEG) (mono (C ₁ -C ₁₀ ) Including the forms of PEG that have been used to derivatize proteins, including alkoxy or aryloxy-polyethylene glycols), monomethoxy-polyethylene glycols, dextrans (such as low molecular weight dextrans of about 6 kDa), cellulose, Or other carbohydrate-based polymers, including, but not limited to, poly- (N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer, polypropylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyols (eg, glycerol), and polyvinyl alcohol. . Bifunctional cross-linking molecules that can be used to prepare covalent multimers of a polypeptide comprising SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence of an AFTI polypeptide variant are also encompassed by the invention.
[0162]
Generally, chemical derivatization may be performed under the appropriate conditions used to react a protein with an activated polymer molecule. Methods for preparing chemical derivatives of a polypeptide generally include (a) under conditions in which a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an AFTI polypeptide variant binds to one or more polymer molecules; With an activated polymer molecule, such as a reactive ester or aldehyde derivative of the polymer molecule, and (b) obtaining a reaction product. Optimum reaction conditions will be determined based on known parameters and the desired result. For example, the higher the polymer molecule: protein ratio, the higher the percentage of bound polymer molecules. In one embodiment, the AFTI polypeptide derivative may have one polymer moiety at the amino terminus. See, for example, U.S. Patent No. 5,234,784.
[0163]
Pegylation of a polypeptide may be performed in particular by any of the pegylation reactions known in the art, for example, as described in the following references: Francis et al., "Focus on Growth Factors". on Growth Factors ", 3: 4-10 (1992); EP0154316; EP0401384; U.S. Patent No. 4,179,337. For example, pegylation can be performed through an acylation or alkylation reaction with a reactive polyethylene glycol molecule (or a similar reactive water-soluble polymer) as described herein. For the acylation reaction, the polymer chosen must have one reactive ester group. For reductive alkylation, the polymer chosen should have one reactive aldehyde group. Reactive aldehydes include, for example, water-stable polyethylene glycol propionaldehyde or its mono-C ₁ -C ₁₀ It is an alkoxy or aryloxy derivative (see US Pat. No. 5,252,714).
[0164]
In another embodiment, the AFTI polypeptide is chemically conjugated to biotin and then the conjugated biotin / AFTI polypeptide molecule is conjugated to avidin to produce a tetravalent avidin / biotin / AFTI polypeptide molecule. AFTI polypeptides also bind covalently to dinitrophenol (DNP) or trinitrophenol (TNP) and precipitate the resulting complex with anti-DNP or anti-TNP-IgM to form a decameric complex with a valency of 10. It can also be formed.
[0165]
In general, conditions that can be alleviated or alleviated by administration of an AFTI polypeptide derivative of the present invention include those described herein for AFTI polypeptides. However, the AFTI polypeptide derivatives disclosed herein may have additional properties, higher or lower biological activity, or other properties, such as a longer or shorter half-life, as compared to the underivatized molecule.
[0166]
Another form of a chemical derivative is a lipidated AFTI polypeptide. For such molecules, one or more lipids can be covalently linked to the AFTI polypeptide or the polypeptide of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof by any means, for example, by chemical means.
[0167]
Genetically constructed non-human animals
In addition, one or more genes encoding the native AFTI polypeptide have been disrupted ("knocked out") such that the level of expression of this gene is significantly reduced or completely eliminated, e.g., mouse, rat Or other non-human animals such as rodents, rabbits, goats, cows, pigs, or sheep are within the scope of the invention. Such animals can be produced using techniques and methods as described in US Pat. No. 5,557,032.
[0168]
The invention further relates to a mouse, rat, or other rodent in which either the native or heterologous AFTI gene for the animal is overexpressed by the animal, thereby creating a "transgenic" animal. Includes non-human animals such as animals, rabbits, goats, sheep, or other livestock. Such transgenic animals can be made using known methods, such as those described in US Patent No. 5,489,743 and PCT Patent Application No. WO 94/28122.
[0169]
The present invention further provides that the promoter for one or more AFTI polypeptides of the invention is activated or inactivated (eg, using homologous recombination) to obtain one or more native AFTI polypeptides. Includes non-human animals that alter expression levels.
[0170]
These non-human animals can be used for screening drug candidates. In such screening, the effect of a drug candidate substance on an animal can be measured. For example, a drug candidate may decrease or increase the expression of the AFTI gene. In some embodiments, after exposing the animal to the drug candidate, the amount of AFTI polypeptide produced can be measured. Further, in some embodiments, the actual effect of a drug candidate on an animal may be detected. For example, overexpression of a particular gene may result in or be linked to a disease or pathological condition. In such a case, the ability of the drug candidate to reduce the expression of the gene or to prevent or inhibit a pathological condition can be tested. In another example, the production of a specific metabolite, such as a fragment of a polypeptide, would result in or be linked to a disease or pathological condition. In such a case, the ability of the drug candidate to reduce the production of such metabolites, or to prevent or inhibit a pathological condition, can be tested.
[0171]
Microarray
It will be apparent that DNA microarray technology can be used in accordance with the present invention. DNA microarrays are fine, high-density arrays of nucleic acids located on a support such as glass. Each cell or element in the array has multiple copies of a single species of DNA that serves as a target for hybridization for its cognate mRNA. In some embodiments, in expression profiling using DNA microarray technology, mRNA is first extracted from a cell or tissue specimen and then enzymatically converted to fluorescently labeled cDNA. This material is hybridized to the microarray and unbound cDNA is removed by washing. Thereafter, the expression of discrete genes present on the array is visualized by measuring the amount of labeled cDNA specifically bound to each target DNA. In this way, the expression of thousands of genes from a single sample of biological material can be quantified in parallel at high flow rates.
[0172]
This high flux expression profiling has broad application for the AFTI-like molecules of the invention, including but not limited to: identification and validation of AFTI disease-related genes as targets for therapy; AFTI-like Molecular toxicology of molecules and their inhibitors; Stratification and generation of populations of surrogate markers for clinical trials; and enhancement of AFTI-related small molecule drug delivery by helping to identify selected compounds in high-flow screening (HTS) .
[0173]
Selective binding substance
As used herein, the term "selective binding agent" refers to a molecule that has binding specificity for one or more AFTI polypeptides. Suitable selective binding agents include, but are not limited to, antibodies and derivatives thereof, polypeptides, and small molecules. Suitable selective binding agents may be prepared using methods known in the art. Exemplary AFTI polypeptide selective binding agents of the invention can bind to a particular portion of an AFTI polypeptide, thereby inhibiting binding of the polypeptide to an AFTI receptor.
[0174]
Selective binding agents such as antibodies and antibody fragments that bind to AFTI polypeptides are within the scope of the invention. Antibodies can be polyclonal, including monospecific polyclonal, monoclonal (MAb), recombinant, chimeric, humanized, such as CDR grafted, human, single chain, and / or bispecific, and their It can be a fragment, variant or derivative. Antibody fragments include those portions of the antibody that bind to an epitope of the AFTI polypeptide. Examples of such fragments include Fab and F (ab ') fragments that are purified by enzymatic cleavage of a full-length antibody. Other binding fragments include those produced by recombinant DNA techniques, such as expression of a recombinant plasmid containing a nucleic acid sequence encoding an antibody variable region.
[0175]
Polyclonal antibodies to an AFTI polypeptide are generally produced in animals (eg, rabbits or mice) by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections of an AFTI polypeptide and an adjuvant. It may be useful to conjugate the AFTI polypeptide to a carrier protein that is immunogenic in the immunizing species, such as keyhole limpet hemocyanin, serum, albumin, bovine thyroglobulin, or soybean trypsin inhibitor. Also, aggregating agents such as alum are used to enhance the immune response. Following immunization, animals are bled and sera are assayed for anti-AFTI polypeptide antibody titers.
[0176]
Monoclonal antibodies to the AFTI polypeptides are made using any method that provides for the production of antibody molecules by continuous cell lines in culture. Examples of suitable methods for making monoclonal antibodies include the hybridoma method of Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975), and the human B cell hybridoma method, Kozbor, J. Mol. Immunol. , 133: 3001 (1984); Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Technologies and Applications", p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987). Hybridoma cell lines that produce monoclonal antibodies reactive with an AFTI polypeptide are also provided by the invention.
[0177]
The monoclonal antibodies of the invention can be modified for use as therapeutics. In one embodiment, a portion of the heavy and / or light chains is identical or homologous to the corresponding sequence in an antibody derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, and the remainder of the chains is A "chimeric" antibody that is identical or homologous to the corresponding sequence in an antibody derived from another species or belonging to another antibody class or subclass. Fragments of such antibodies are also included as long as they exhibit the desired biological activity. U.S. Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 81: 6851-6855 (1985).
[0178]
In another embodiment, the monoclonal antibodies of the invention are "humanized" antibodies. Methods for humanizing non-human antibodies are known in the art. See U.S. Patent Nos. 5,585,089 and 5,693,762. Generally, a humanized antibody has one or more amino acid residues introduced from a non-human source. Humanization is accomplished, for example, by replacing the corresponding region of a human antibody with at least a portion of a rodent complementarity determining region (CDR) by methods described in the art (Jones et al., Nature 321: 522-522). 525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)).
[0179]
Human antibodies that bind to an AFTI polypeptide are also included in the invention. Using transgenic animals (eg, mice) that can produce a repertoire of human antibodies without the production of endogenous immunoglobulins, optionally with an AFTI antigen (ie, having at least 6 contiguous amino acids) conjugated to a carrier Immunization produces such antibodies. See, for example, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 90: 2551-2555 (1993); , 7:33 (1993). Such technology is available from Medarex, Inc. HuMab ™ technology from Abgenix, Inc. Commercially available, including Xenomouse (TM) technology from Ricoh. In one method, the endogenous loci encoding the immunoglobulin heavy and light chains in the subject animal are abolished and the loci encoding the human heavy and light chain proteins are inserted into their genomes, thereby Transgenic animals. Next, the partially modified animal, ie, the animal with the incomplete modification, is cross-bred to obtain an animal with all of the desired immune system modifications. When administered an immunogen, these transgenic animals produce antibodies with human (eg, but not mouse) amino acid sequences that include variable regions immunospecific for these antigens. See PCT Patent Applications Nos. PCT / US96 / 05929 and PCT / US93 / 06926. Further methods are described in U.S. Pat. Nos. 5,545,807, PCT / US91 / 245 and PCT / GB89 / 01207, and EP 546 073B1 and EP 546 073A1. Human antibodies can also be made by expression of recombinant DNA in host cells as described herein or by expression in hybridoma cells. Human antibodies produced by the technologies described in this section are collectively referred to as "fully human antibodies."
[0180]
In an alternative embodiment, human antibodies can be generated from a phage display library (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 (1991). )). These methods mimic immunoselection through the display of an antibody repertoire on the surface of a filamentous bacteriophage and subsequent selection of phage by binding to a selected antigen. One such approach is described in PCT Patent Application No. PCT / US98 / 17364, which has a high affinity for MPL- and msk-receptors using such an approach, and is functionally functional. It describes the isolation of repelling antibodies. Antibodies produced by the technique described in this section are referred to as "phage display antibodies."
[0181]
Chimeric, CDR-grafted, and humanized antibodies are typically made by recombinant methods. The nucleic acid encoding the antibody is introduced into host cells and expressed using the materials and procedures described herein. In a preferred embodiment, the antibodies are produced in a mammalian host cell, such as a CHO cell. Monoclonal (eg, human) antibodies can be produced by expression of recombinant DNA in host cells or expression in hybridoma cells as described herein.
[0182]
The anti-AFTI antibodies of the present invention can be used in any known assay, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation for the detection and quantification of AFTI polypeptides (Sola). , "Monoclonal Antibodies: A Manual of Technologies", pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987). The antibodies bind to the AFTI polypeptide with an affinity appropriate for the assay method used.
[0183]
For diagnostic applications, in some embodiments, anti-AFTI antibodies can be labeled with a detectable moiety. The detectable component can be one that can directly or indirectly generate a detectable signal. For example, the detectable component is ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S, or ¹²⁵ A radioisotope such as I, a fluorescent or chemiluminescent compound such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or luciferin, or an enzyme such as alkaline phosphatase, β-galactosidase, or horseradish peroxidase (Bayer et al., Meth. Enzymol., 184: 138-163 (1990)).
[0184]
In competitive binding assays, labeled standards (eg, AFTI polypeptides, or immunologically active portions thereof) compete with a test sample analyte (AFTI polypeptide) for binding to a limited amount of anti-AFTI antibody. Based on ability. The amount of AFTI polypeptide in a test sample is inversely proportional to the amount of standard that binds to the antibody. To facilitate determination of the amount of bound standard, the antibody is typically insolubilized before or after competition, so that the standard bound to the antibody and the analyte can be left unbound. It can be conveniently separated from the product and the analyte.
[0185]
Sandwich assays typically involve the use of two antibodies, each of which can bind to a different immunogenic portion, or epitope, of the protein to be detected and / or quantified. In a sandwich assay, typically, a test sample analyte is bound to a first antibody immobilized on a support, followed by binding of a second antibody to the analyte to form an insoluble three-part complex. See, for example, U.S. Patent No. 4,376,110. The second antibody itself is labeled with a detectable component (direct sandwich assay) or can be measured using an anti-immunoglobulin antibody labeled with a detectable component (indirect sandwich assay). For example, one type of sandwich assay is an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), where the detectable component is an enzyme.
[0186]
Selective binding agents, including anti-AFTI antibodies, are also useful for in vivo imaging. The antibody labeled with the detectable component is administered to the animal, preferably in the bloodstream, and the presence and location of the labeled antibody in the host is determined. Antibodies can be labeled with any component that is detectable in an animal by nuclear magnetic resonance, radiation, or other detection means known in the art.
[0187]
The selective binding agents of the invention, including antibodies, can be used as therapeutics. These therapeutic agents are generally agonists or antagonists in the sense that they increase or decrease at least one of the biological activities of the AFTI polypeptide, respectively. In one embodiment, an antagonist antibody of the invention is capable of binding specifically to an AFTI polypeptide in vivo or in vitro and inhibiting or eliminating a functional activity of the AFTI polypeptide or The binding fragment. In a preferred embodiment, the selective binding agent, eg, an antagonist antibody, inhibits the functional activity of the AFTI polypeptide by at least about 50%, preferably at least 80%. In another embodiment, the selective binding agent is an anti-AFTI polypeptide antibody capable of interacting with an AFTI binding partner (ligand or receptor), thereby inhibiting or eliminating AFTI activity in vitro or in vivo. It can be. Selective binding agents, including agonist and antagonist anti-AFTI antibodies, are identified by screening assays known in the art.
[0188]
The invention also relates to a kit comprising an AFTI selective binding agent (such as an antibody) and other reagents useful for detecting AFTI polypeptide levels in a biological sample. Such reagents can include detectable labels, blocking serum, positive and negative control samples, and detection reagents.
[0189]
The AFTI polypeptides of the present invention can be used to clone AFTI receptors using an expression cloning strategy. Radiolabeled (125-iodine) AFTI polypeptides or affinity / actively labeled AFTI polypeptides (such as Fc fusions or alkaline phosphatase fusions) are used in binding assays to express AFTI receptors on cell types or cell lines or tissues. Can be identified. RNA isolated from such cells or tissues can be converted to cDNA, cloned into a mammalian expression vector, and transfected into mammalian cells (such as COS or 293 cells) to create an expression library. . A radiolabeled or labeled AFTI polypeptide can then be used as an affinity ligand to identify and isolate from this library a subset of cells expressing an AFTI receptor on its surface. DNA can then be isolated from these cells and transfected into mammalian cells to create a secondary expression library in which the fraction of cells expressing the AFTI receptor is many times higher than in the original library. . This enrichment process can be repeated iteratively until a single recombinant clone containing the AFTI receptor is isolated. Isolation of AFTI receptors is useful for identifying or developing new agonists and antagonists of the AFTI polypeptide signaling pathway. Such agonists and antagonists include AFTI receptors, anti-AFTI receptor antibodies, small molecules, or antisense oligonucleotides, which treat, prevent, or treat one or more diseases or disorders, including those described herein. Or to diagnose.
[0190]
Methods for measuring other modulators of AFTI polypeptide activity
In some situations, it may be desirable to identify molecules that are modulators, ie, agonists or antagonists, of the activity of the AFTI polypeptide. Natural or synthetic molecules that modulate AFTI polypeptides may be identified using one or more screening assays, such as those described herein. Such molecules can be administered ex vivo or in vivo by infusion or oral delivery, implanted devices, and the like.
[0191]
"Test molecule" refers to a molecule that has been evaluated for its ability to modulate (ie, increase or decrease) the activity of an AFTI polypeptide. Most commonly, the test molecule will interact directly with the AFTI polypeptide. However, test molecules can also modulate AFTI polypeptide activity indirectly, such as by affecting the expression of the AFTI gene or by binding to a binding partner of AFTI (eg, a receptor or ligand). Would be considered. In one embodiment, the test molecule has at least about 10 ^-6 M, preferably about 10 ^-8 M, more preferably about 10 ^-9 M, even more preferably about 10 ^-10 Binds AFTI polypeptide with a constant affinity of M.
[0192]
Methods for identifying compounds that interact with an AFTI polypeptide are encompassed by the present invention. In some embodiments, the AFTI polypeptide can be incubated with the test molecule under conditions that allow the interaction of the test molecule with the AFTI polypeptide, and the degree of interaction can be measured. Test molecules can be screened in substantially purified form or as a crude mixture.
[0193]
In some embodiments, an AFTI polypeptide agonist or antagonist can be a protein, peptide, carbohydrate, lipid, or small molecule that interacts with and modulates the activity of the AFTI polypeptide. A molecule that modulates expression of an AFTI polypeptide is complementary to a nucleic acid that encodes an AFTI polypeptide, or is complementary to a nucleic acid that directs or regulates expression of an AFTI polypeptide, and that is an antisense modulator of expression. Includes nucleic acids that act as factors.
[0194]
Once a set of test molecules has been identified as interacting with an AFTI polypeptide, the molecules can be further evaluated for their ability to increase or decrease the activity of the AFTI polypeptide. Measurement of the interaction of an AFTI polypeptide with a test molecule can be performed in several ways, including cell-based binding assays, membrane binding assays, solution phase assays, and immunoassays. Generally, the test molecule is incubated with the AFTI polypeptide for a period of time, and the activity of the AFTI polypeptide is measured by one or more assays for measuring biological activity.
[0195]
Interaction of the test molecule with the AFTI polypeptide can also be measured directly using polyclonal or monoclonal antibodies in an immunoassay. Alternatively, a modified form of the AFTI polypeptide comprising an epitope tag as described herein may be used in the immunoassay.
[0196]
If the AFTI polypeptide displays biological activity through interaction with a binding partner (eg, a receptor or ligand), measure the binding of the AFTI polypeptide to the corresponding binding partner (such as a selective binding agent, receptor, or ligand). Various in vitro assays can be used to accomplish this. These assays can be used to screen test molecules for the ability to increase or decrease the rate and / or extent of binding of an AFTI polypeptide to a binding partner. In one assay, an AFTI polypeptide is immobilized in a well of a microtiter plate. The radiolabeled AFTI polypeptide binding partner (eg, iodinated AFTI binding partner) and the test molecule are then added to the wells one at a time (in any order) or simultaneously. After incubation, the wells can be washed and the radioactivity measured using a scintillation counter to determine the extent to which the binding partner has bound to the AFTI polypeptide. Typically, a series of control wells that test the molecule over a range of concentrations and that lack one or more components of the test assay for the accuracy of the evaluation of the results can be used. An alternative to this method is to reverse the "position" of the protein, i.e., immobilize the AFTI binding partner in the wells of a microtiter plate and incubate the test molecule with the radiolabeled AFTI polypeptide to allow the binding of the AFTI polypeptide to bind. Including measuring the degree. See, for example, "Current Protocols in Molecular Biology", Chapter 18, edited by Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, NY (1995).
[0197]
As an alternative to radiolabeling, use is made of streptavidin, which conjugates the AFTI polypeptide or its binding partner to biotin and then is detected by colorimetry, such as horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase (AP). Alternatively, or by fluorescent labeling of streptavidin, the presence of biotinylated protein can be detected. Antibodies to AFTI polypeptides or AFTI binding partners conjugated to biotin can also be used and can be detected after incubation with enzyme-linked streptavidin linked to AP or HRP.
[0198]
AFTI polypeptides or AFTI binding partners can also be immobilized by binding to agarose beads, acrylic beads or other types of such inert solid phase substrates. The substrate-protein complex is placed in a solution containing the complementary protein and the test compound. After incubation, the beads are sedimented by centrifugation and the amount of binding between the AFTI polypeptide and its binding partner can be assessed by the methods described herein. Instead, the substrate-protein complex is immobilized on the column and the protein complementary to the test molecule is passed through the column. The formation of a complex between the AFTI polypeptide and its binding partner can then be assessed using any of the techniques described herein, ie, radiolabeling, antibody binding, and the like.
[0199]
Another in vitro assay useful for identifying test molecules that increase or decrease the formation of a complex between an AFTI binding protein and an AFTI binding partner is a surface plasmon such as a Biacore assay system (Pharmacia, Piscataway, NJ). It is a resonance detection system. The BIA core system can be implemented according to the manufacturer's protocol. This assay basically involves the covalent attachment of an AFTI polypeptide or AFTI binding partner to a dextran-coated sensor chip located within the detector. The test compound and other complementary proteins are injected simultaneously or sequentially into the chamber containing the sensor chip. The amount of complementary protein bound can be assessed based on the change in molecular weight physically associated with the dextran-coated side of the sensor chip; the change in molecular weight can be measured by a detection system.
[0200]
In some cases, it may be desirable to evaluate two or more test compounds together for their ability to increase or decrease the formation of a complex between an AFTI polypeptide and an AFTI binding partner. In these cases, the assays described herein can be readily modified by adding such additional test compounds at the same time as, or subsequent to, the first test compound. The rest of the steps of the assay are described here.
[0201]
In vitro assays, such as those described herein, may be advantageously used to screen a large number of compounds for the effect of an AFTI polypeptide and an AFTI binding partner on complex formation. Assays can be automated to screen compounds, synthetic peptides, and chemically synthesized libraries generated by phage display.
[0202]
Compounds that increase or decrease the formation of a complex between the AFTI polypeptide and the AFTI binding partner are also screened in cell culture using cells and cell lines that express either the AFTI polypeptide or the AFTI binding partner. You can also. The cells and cell lines can be obtained from any mammal, but are preferably from humans or primates, dogs, or rodents. The binding of the AFTI polypeptide to cells expressing the AFTI binding partner on the surface is assessed in the presence or absence of the test molecule, and the degree of binding is determined, for example, by flow cytometry using a biotinylated antibody to the AFTI binding partner. can do. Cell culture assays can be suitably used to further evaluate compounds found to be positive in the protein binding assays described herein.
[0203]
Cell culture can also be used to screen for the effects of drug candidates. For example, a drug candidate may decrease or increase the expression of the AFTI gene. In some embodiments, after exposing the cell culture to the drug candidate, the amount of AFTI polypeptide produced is measured. In some embodiments, the actual effect of a drug candidate on cell culture can be detected. For example, overexpression of a particular gene may have a particular effect on cell culture. In such cases, the ability of the drug candidate to increase or decrease gene expression, or to prevent or inhibit certain effects on cell culture, can be tested. In another example, the production of a specific metabolite, such as a fragment of a polypeptide, would result in or be linked to a disease or pathological condition. In such cases, the ability of the candidate agent to reduce the production of such metabolites in cell culture can be tested.
[0204]
Internalization protein
The tat protein sequence (from HIV) can be used to internalize the protein into cells. Falwell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 91: 664-668 (1994). For example, the 11 amino acid sequence of the HIV tat protein (YGRKKRRQRRR) (referred to as the "protein transduction domain" or TAT PDT) has been described to mediate delivery across the plasma membrane and the nuclear membrane of the cell. See Schwarze et al., Science, 285: 1569-1572 (1999); and Nagahara et al., Nature Medicine, 4: 1449-1452 (1998). In these procedures, a FITC-construct (FITC-GGGGYGRKKRRQRRR) is prepared that binds to the cells as observed by fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis. These constructs are i. p. Penetrates tissues after administration. Next, a tat-bgal fusion protein is constructed. Cells treated with this construct showed b-gal activity. Following injection, a number of tissues, including liver, kidney, lung, heart, and brain tissue, were found to show expression using these procedures. These constructs may have undergone some denaturation in order to enter the cell; that may require refolding after entry into the cell.
[0205]
Thus, it will be appreciated that the tat protein sequence may be used to internalize a desired protein or polypeptide into a cell. For example, using the tat protein sequence, an AFTI antagonist (such as an anti-AFTI selective binding agent, a small molecule, a soluble receptor, or an antisense oligonucleotide) can be administered intracellularly to inhibit the activity of the AFTI molecule. . As used herein, the term "AFTI molecule" refers to both an AFTI nucleic acid molecule and an AFTI polypeptide as defined herein. If desired, the AFTI protein itself can also be administered internally to cells using these techniques. Strauss, E .; , "Introducing Proteins into the Body's Cells", Science, 285: 1466-1467 (1999).
[0206]
Identification of cellular sources using AFTI polypeptides
According to some embodiments of the invention, it may be useful to determine the source of a particular cell type associated with the AFTI polypeptide. For example, it may be useful to determine the origin of the disease or pathological condition to help select an appropriate treatment. In some embodiments, cells expressing or containing a polynucleotide encoding an AFTI polypeptide are screened by using the nucleic acid encoding the AFTI polypeptide as a probe and screening the nucleic acid of the cell with such a probe. Can be identified. In other embodiments, the presence of an AFTI polypeptide in a cell is determined, thus determining whether such cells express an AFTI polypeptide or from cells known to express an AFTI polypeptide. To determine if, an anti-AFTI polypeptide antibody may be used. [0207]
Therapeutic applications
A non-exclusive list of acute and chronic diseases that can be treated, diagnosed, ameliorated, or prevented with the polypeptides and nucleic acids of the invention include those that can be treated by inhibition of IL-1 and / or TNF activity.
[0208]
Inhibition of IL-1
One of the most potent inflammatory cytokines discovered to date is interleukin-1 (IL-1). IL-1 appears to be a key mediator in many diseases and medical conditions. IL-1 is produced (though not exclusively) by cells of the macrophage / monocyte lineage and is thought to be produced in two forms: IL-1 alpha (IL-1α and IL-1 beta (IL- 1β).
[0209]
Diseases where a spontaneous or experimental disease or medical condition is associated with high levels of IL-1 in body fluids or tissues, or where cells or tissues taken from the body produce high levels of IL-1 in culture. Or the medical condition is considered to be an "interleukin-1 mediated disease". In many cases, such interleukin-1 mediated diseases are also recognized by two additional conditions: (1) the pathological findings associated with the disease or medical condition are IL-1 Can be experimentally mimicked in animals by administration or up-regulation of IL-1 expression; (2) treatment with substances that inhibit the action of IL-1 if the pathology induced in an experimental animal model of the disease or medical condition Can be inhibited or eliminated. Most interleukin-1 mediated diseases meet at least two of the three conditions, and many interleukin-1 mediated diseases meet all three conditions.
[0210]
A non-exclusive list of acute and chronic interleukin-1 (IL-1) mediated diseases includes, but is not limited to: acute pancreatitis;
ALS;
Alzheimer's disease,
Cachexia / anorexia, including AIDS-induced cachexia;
Asthma and other lung diseases; atherosclerosis;
Autoimmune vasculitis;
Chronic fatigue syndrome;
Clostridial-related diseases, including Clostridium-related diarrhea;
Coronary artery conditions and indications, including congestive heart failure, coronary restenosis, myocardial infarction, myocardial dysfunction (eg, associated with sepsis), and coronary artery bypass grafting;
Cancers such as multiple myeloma and myeloid (eg, AML and CML) and other leukemias, and tumor metastases;
Diabetes (eg, insulin-induced diabetes);
Endometriosis;
heat;
Fibromyalgia;
Glomerulonephritis;
Graft-versus-host disease / transplant rejection;
Hemorrhagic shock;
Hyperalgesia;
Inflammatory bowel disease;
Inflammatory conditions of the joints, including osteoarthritis, psoriatic arthritis and rheumatoid arthritis (RA);
Inflammatory eye diseases thought to be related to corneal transplants, for example;
Ischemia, including cerebral ischemia (eg, brain injury as a result of trauma, epilepsy, bleeding or stroke, each of which can lead to neurodegeneration);
Kawasaki disease;
Learning disability;
Lung disease (eg, ARDS);
Multiple sclerosis;
Myopathy (eg, muscle protein metabolism, especially in sepsis);
Neurotoxicity (eg, as induced by HIV);
Osteoporosis;
Pain, including pain associated with cancer;
Parkinson's disease;
Periodontal disease;
Premature birth;
psoriasis;
Reperfusion injury;
Septic shock;
Side effects from radiation therapy;
Temporomandibular joint disease;
Sleeping disorder;
Uveitis;
Or an inflammatory condition resulting from a bruise, sprain, cartilage damage, trauma, orthopedic surgery, infection or other disease process.
[0211]
Inhibition of TNF-α
Many diseases and medical conditions are mediated by TNF and are usually classified as inflammatory conditions. "TNF-mediated disease" is a spontaneous or experimental disease or medical condition associated with elevated levels of TNF in body fluids. Often, such TNF-mediated diseases are also characterized by the following: (1) pathological findings associated with the disease or medical condition may be experimental in animals due to up-regulation of TNF administration or expression. (2) When a disease is induced in an experimental animal model, the disease or medical condition can be inhibited or eliminated by treatment with a substance that inhibits the action of TNF.
[0212]
A non-exclusive list of acute and chronic TNF-mediated diseases includes, but is not limited to:
Cachexia / anorexia;
Cancer (eg, leukemia);
Chronic fatigue syndrome;
Coronary artery conditions and indications, including congestive heart failure, coronary restenosis, myocardial infarction, myocardial dysfunction (eg, associated with sepsis), and coronary artery bypass grafting;
depression;
Diabetes including juvenile-onset type 1 diabetes and insulin resistance (eg, associated with obesity);
Endometriosis, endometritis, and related conditions;
Fibromyalgia or analgesia;
Graft-versus-host rejection;
Hyperalgesia;
Inflammatory bowel disease, including Crohn's disease and Clostridium difficile-associated diarrhea;
Ischemia, including cerebral ischemia (brain injury as a result of trauma, epilepsy, hemorrhage or stroke, each of which can lead to neurodegeneration);
Lung disease (eg, adult respiratory distress syndrome, asthma, and pulmonary fibrosis);
Multiple sclerosis;
Neuroinflammatory disease;
Ocular diseases and conditions, including corneal transplants, ocular degeneration and uveitis;
Pain, including eye-related pain;
Pancreatitis;
Periodontal disease;
Crimson red rash (PRP);
Prostatitis (bacterial or non-bacterial) and related conditions;
Psoriasis and related conditions;
Pulmonary fibrosis;
Reperfusion injury;
Rheumatoid arthritis, osteoarthritis, juvenile arthritis (rheumatoid arthritis), seronegative polyarthritis, ankylosing spondylitis, Reiter's syndrome and reactive arthritis, Still's disease, psoriatic arthritis, arthritis based on bowel disease, multiple Myositis, dermatomyositis, scleroderma, systemic sclerosis, vasculitis (eg, Kawasaki disease), cerebral vasculitis, Lyme disease, staphylococcal induced (sepsisic) arthritis, Sjogren's syndrome, rheumatic fever, polychondritis And rheumatic diseases, including rheumatic polymyalgia and giant cell arteritis;
Septic shock;
Side effects from radiation therapy;
Systemic lupus erythematosus (SLE);
Temporomandibular joint disease;
Thyroiditis;
An inflammatory condition resulting from tissue transplantation or contusion, sprain, cartilage damage, trauma, orthopedic surgery, infection (eg, HIV, Clostridium difficile and related species) or other disease processes.
[0213]
Inhibitors of AFTI (eg, anti-AFTI antibodies) are believed to be useful in therapeutic applications where patients would benefit from up-regulation of TNF and / or IL-1. Such diseases and indications include, but are not limited to, cancer, graft-versus-host disease.
[0214]
AFTI compositions and administration
Therapeutic compositions are within the scope of the present invention. Such AFTI pharmaceutical compositions comprise a therapeutically effective amount of an AFTI polypeptide or AFTI nucleic acid molecule in admixture with a pharmaceutically or physiologically acceptable formulation material selected for compatibility with the mode of administration. sell. Pharmaceutical compositions may include a therapeutically effective amount of one or more AFTI selective binding agents in admixture with pharmaceutically or physiologically acceptable pharmaceutical agents selected for compatibility with the mode of administration.
Acceptable formulation materials are preferably non-toxic to recipients at the dosages and concentrations employed.
[0215]
Pharmaceutical compositions may alter, maintain or preserve, for example, the composition's pH, osmolality, viscosity, clarity, color, isotonicity, odor, sterility, stability, dissolution or release rate, adsorption or penetration. May be included. Suitable formulation substances include amino acids (such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine), antibacterials, antioxidants (such as ascorbic acid, sodium sulfite or sodium bisulfite), buffers (borate, bicarbonate, Tris-HCl, citrate, phosphate, other organic acids, etc., fillers (such as mannitol or glycine), chelating agents (such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)), complexing agents (caffeine, polyvinylpyrrolidone) , Β-cyclodextrin or hydroxypropyl-β-cyclodextrin), bulking agents, monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates (such as glucose, mannose, or dextrin), proteins (such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin). , Coloring, flavoring and diluent, emulsifier, hydrophilic poly (Eg, polyvinylpyrrolidone), low molecular weight polypeptides, salt-forming counterions (eg, sodium), preservatives (benzalkonium chloride, benzoic acid, salicylic acid, thimerosal, phenethyl alcohol, methylparaben, propylparaben, chlorhexidine, sorbic acid or Hydrogen oxide, etc., solvents (such as glycerin, propylene glycol or polyethylene glycol), sugar alcohols (such as mannitol or sorbitol), suspending agents, surfactants or wetting agents (pluronic, PEG, sorbitan esters, polysorbate 20, polysorbate 80) Polysorbate, triton, tromethamine, lecithin, cholesterol, tyloxapal, etc.), stabilizing agent (sucrose or sorbitol), tonicity enhancer (alkali metal halide) (Preferably sodium or potassium chloride), mannitol, sorbitol, etc., delivery vehicles, diluents, vehicles and / or pharmaceutical adjuvants ("Remington's Pharmaceutical Sciences", No. 18). Editions, edited by AR Gennaro, Mack Publishing Company [1990]).
[0216]
The optimal pharmaceutical composition will be determined by one skilled in the art depending upon, for example, the intended route of administration, mode of delivery, and desired dosage. See, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Such compositions can affect the physical state, stability, rate of in vivo release, and rate of in vivo clearance of the AFTI molecule.
[0219]
The primary excipient or carrier in a pharmaceutical composition can be either aqueous or non-aqueous in nature. For example, a suitable excipient or carrier may be distilled water for injection, saline, or artificial cerebrospinal fluid, possibly supplemented with other materials common in parenteral compositions. Neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin are further exemplary excipients. Other exemplary pharmaceutical compositions include Tris buffer at about pH 7.0 to 8.5, or acetate buffer at about pH 4.0 to 5.5, which may further include sorbitol or a suitable substitute thereof. In one embodiment of the present invention, the AFTI polypeptide composition is prepared by mixing the selected composition with the desired purity with the optimal formulation material ("Remington's Pharmaceutical Sciences", supra) by lyophilizing the cake. Alternatively, it can be prepared for storage in the form of an aqueous solution. In addition, AFTI polypeptide products may be formulated as a lyophilizate using suitable excipients such as sucrose.
[0218]
AFTI pharmaceutical compositions can be selected for parenteral delivery. Alternatively, it can be selected for inhalation or for delivery through the gastrointestinal tract, such as orally. Preparation of such pharmaceutically acceptable compositions is within the skill of the art.
[0219]
The formulation components are present in concentrations that are acceptable to the site of administration. For example, buffers are used to maintain the composition at physiological or slightly lower pH, typically within the pH range of about 5 to about 8.
[0220]
When considering parenteral administration, a therapeutic composition for use in the present invention is a pyrogen-free, parenterally acceptable aqueous solution comprising the desired AFTI molecule in a pharmaceutically acceptable excipient. It can take the form of A particularly suitable excipient for parenteral injection is sterile distilled water in which the AFTI molecule is formulated as a sterile isotonic solution and is suitably stored. Yet another formulation is injectable microspheres, bioedible particles, macromolecular compounds (polyactinic acid, polyglycolic acid), or beads, or liposomes that provide controlled or sustained release of the product, which can then be delivered as a depot injection And a formulation of the desired molecule with the desired molecule. Hyaluronic acid can also be used, which is thought to have a prolonged effect in the circulation. Other suitable means for introducing the desired molecule include an implantable drug delivery device.
[0221]
In one embodiment, the pharmaceutical composition can be formulated for inhalation. For example, AFTI molecules can be formulated as a dry powder for inhalation. Inhalation solutions of the AFTI polypeptide or AFTI nucleic acid molecule may also be formulated with a propellant for aerosol delivery. In yet another embodiment, the solution can be sprayed. Pulmonary administration is further described in PCT Patent Application No. PCT / US94 / 001875, which describes pulmonary delivery of chemically modified proteins.
[0222]
It is also envisioned that some formulations may be administered orally. In one embodiment of the invention, the AFTI molecules so administered can be formulated with or without carriers conventionally used in solid dosage form formulations such as tablets and capsules. For example, capsules can be designed to release the active portion of the formulation at a site in the gastrointestinal tract when maximizing bioavailability and minimizing pre-systemic degradation. Additional agonists can be included to enhance the absorption of AFTI molecules. Diluents, flavoring agents, low melting waxes, vegetable oils, lubricants, suspending agents, disintegrants, and binders may also be used.
[0223]
Another pharmaceutical composition may include an effective amount of the AFTI molecule in a mixture with non-toxic excipients that are suitable for the manufacture of tablets. By dissolving the tablets in sterile water, or other suitable excipient, solutions can be prepared as unit dosage forms. Suitable excipients are inert diluents, such as calcium carbonate, sodium or bicarbonate, lactose, or calcium phosphate; or binders, such as starch, gelatin, or acacia; or magnesium stearate, stearic acid, or Including but not limited to lubricants such as talc.
[0224]
Additional AFTI pharmaceutical compositions will be apparent to those skilled in the art, including formulations that include an AFTI polypeptide in a sustained or controlled delivery formulation. Techniques for formulating liposomal carriers, bioedible microparticles or porous beads and various other sustained or controlled delivery means, such as depot injection, are also known to those skilled in the art. See, for example, PCT Patent Application No. PCT / US93 / 00829, which describes controlled release of porous polymeric microparticles for delivery of pharmaceutical compositions. Further examples of sustained release formulations include semipermeable polymeric matrices in the form of shaped articles, eg, thin films, or microcapsules. Sustained-release matrices include polyesters, hydrogels, polyactides (U.S. Pat. Nos. 3,773,919 and EP 58,481), copolymers of L-glutamic acid and .gamma.-ethyl-L-glutamate (Sidman et al., Biopolymers, 22). : 547-556 (1983)), poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) and Lnager, Chem. Tech., 12:98). -105 (1982)), ethylene vinyl acetate (Langer et al., Supra) or poly-D (-)-3-hydroxybutyric acid (EP 133,988). Sustained-release compositions can also include liposomes that can be prepared by any of the several methods known in the art. See, for example, Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949.
[0225]
AFTI pharmaceutical compositions used for in vivo administration typically must be sterile. This can be accomplished by filtering through a sterile filtration membrane. If the composition is lyophilized, sterilization using these methods may be performed either before or after lyophilization and reduction. Compositions for parenteral administration can be stored in lyophilized form or as a solution. In addition, parenteral compositions generally are placed into a container having a sterile access port, for example, an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle.
[0226]
Once a pharmaceutical composition has been formulated, it can be stored in sterile vials as a solution, suspension, gel, emulsion, solid, or as a dehydrated or lyophilized powder. Such formulations may be stored either in a ready-to-use form or in a form requiring reduction prior to administration (eg, lyophilized).
[0227]
In certain embodiments, the present invention is directed to kits for producing a single dosage unit. The kits can each include a first container containing the dried protein and a second container containing the aqueous formulation. Kits containing single or multiple chamber prefilled syringes (eg, liquid syringes and lyo syringes) are also included within the scope of the invention.
[0228]
The effective amount of the AFTI pharmaceutical composition used therapeutically will depend, for example, on the context and purpose of the treatment. One of skill in the art will appreciate that the appropriate dosage level for treatment may, in part, depend on the molecule to be delivered, the indication for which the AFTI molecule is being used, the route of administration, and the size of the patient (body weight, body surface area or organ size). It will be appreciated that it varies depending on size) and condition (age and general health). Thus, the clinician can adjust the dosage and alter the route of administration for maximum therapeutic effect. A typical dose can range from about 0.1 μg / kg to about 100 mg / kg or more, depending on the factors mentioned above. In other embodiments, the dose may range from 0.1 μg / kg to about 100 mg / kg; or 1 μg / kg to about 100 mg / kg; or 5 μg / kg to about 100 mg / kg.
[0229]
The frequency of administration depends on the pharmacokinetic parameters of the AFTI molecule in the formulation used. Typically, the clinician will administer the composition until a dosage is reached that achieves the desired effect. The composition may therefore be administered as a single dose, or as two or more doses (with or without the same amount of the desired molecule) administered over time, or by continuous infusion through an implanted device or catheter. Can be administered as Further refinements of the appropriate dosage are routinely made by those skilled in the art and are within the ambit of tasks routinely performed by those skilled in the art. The appropriate dose can be ascertained through use of appropriate dose-response data.
[0230]
Routes of administration of the pharmaceutical compositions are known in the art, eg, injection by oral, intravenous, intraperitoneal, intracerebral (intraparenchymal), intraventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, or intralesional routes; Alternatively, it may correspond to a sustained release system or implant device. If desired, the composition can be administered continuously by bolus injection or by infusion, or by implantation device.
[0231]
Alternatively or additionally, the composition may be administered topically through implantation of a membrane, sponge, or other suitable material onto which the desired molecule has been absorbed or encapsulated. When using an implanted device, the desired molecule can be delivered by implanting the device in a suitable tissue or organ and diffusing, timed release bolus, or continuous administration.
[0232]
In some cases, it may be desirable to use AFTI pharmaceutical compositions ex vivo. In such cases, cells, tissues, or organs excised from the patient are contacted with the AFTI pharmaceutical composition, and the cells, tissues, and / or organs are then implanted back into the patient.
Also, in some cases, AFTI polypeptides can be delivered by transplanting specific cells that have been genetically constructed using methods as described herein. Such cells can be animal or human cells and can be autologous, xenogeneic, or exogenous. In some cases, the cells may be immortalized. To reduce the likelihood of an immune response, cells can be encapsulated to avoid infiltration of surrounding tissues. The encapsulating material typically includes a biocompatible, semi-permeable polymer encapsulation that allows the release of the protein product, but prevents cell destruction by the patient's immune system or by other deleterious factors from surrounding tissues. Enclosures or membranes.
[0233]
It may be desirable to treat an isolated cell population (such as T cells) with one or more AFTI polypeptides. This can be done by exposing the isolated cells directly to the polypeptide, if the polypeptide is in a cell membrane permeable form.
[0234]
Further embodiments of the present invention are directed to cells and methods (e.g., homologous recombination and / or other methods) for in vitro production of therapeutic polypeptides and for the production and delivery of therapeutic polypeptides by gene therapy or cell therapy. Recombinant production method). Using homologous and other recombination techniques, cells containing the normally transcriptionally silent AFTI gene or the under-expressed gene are modified, thereby producing cells expressing a therapeutically effective amount of the AFTI polypeptide. be able to.
[0235]
Homologous recombination is a technique originally developed to target genes that induce or correct mutations in transcriptionally active genes (Kucherlapati, Prog. In Nucl. Acid Res. & Mol. Biol., 36: 301, 1989). The basic approach is to introduce specific mutations into specific regions of the mammalian genome (Thomas et al., Cell, 44: 419-428, 1986; Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503-512, 1987; Doetschman et al., Proc. Natl.Acad.Sci., 85: 8583-8587, 1988) or to correct specific mutations in defective genes (Doetschman et al., Nature, 330: 576-578, 1987). Exemplary homologous recombination techniques are described in U.S. Patent No. 5,272,071 (EP 9193051, EP 505500; PCT / US90 / 07642, International Patent Publication WO 91/09955). I have.
[0236]
Through homologous recombination, the DNA sequence to be inserted into the genome can direct a particular region of the gene of interest by binding to the target DNA. Target DNA is the complementary (homologous) nucleotide sequence of a region of genomic DNA. A small portion of the target DNA that is complementary to a particular region of the genome is brought into contact with the parental strand during the DNA replication process. It is a general property of DNA inserted into cells to hybridize and thus recombine with other parts of the endogenous DNA through shared regions of homology. If this complementary strand is attached to an oligonucleotide or additional nucleotides containing a mutated or different sequence, it will also be incorporated into the newly synthesized strand as a result of recombination. As a result of the proofreading function, the new sequence of DNA can serve as a template. Thus, the transferred DNA is integrated into the genome.
[0237]
Binding to these fragments of the target DNA are regions of the DNA that can interact with or control the expression of the AFTI polypeptide, such as flanking sequences. For example, a promoter / enhancer element, suppressor, or exogenous transcriptional regulatory element is incorporated into the genome of the intended host cell with sufficient proximity and orientation to affect the transcription of the DNA encoding the desired AFTI polypeptide. Insert Control elements control the portion of DNA present in the host cell genome. Therefore, expression of the desired AFTI polypeptide is not by transfection of the DNA encoding the AFTI gene itself, but by binding to a DNA regulatory segment that provides the endogenous gene sequence with a recognizable signal for transcription of the AFTI polypeptide. It is believed that this is achieved by the use of target DNA (including regions having homology to the endogenous gene of interest).
[0238]
In an exemplary method, expression of a desired target gene (ie, a desired endogenous cellular gene) in a cell is achieved by introducing DNA containing at least regulatory sequences, exons and splice donor sites into the cell genome at a preselected site. Through homologous recombination. These components are such that this actually results in the production of new transcription units (the regulatory sequences, exons and splice donor sites present in the DNA construct are operably linked to endogenous genes). Introduced into DNA. As a result of introducing these components into the chromosomal DNA, the expression of the desired endogenous gene changes.
[0239]
Altered gene expression as described herein can activate (or cause expression of) a gene that is normally silent (not expressed) in the resulting cell, as well as physiologically significant in the resulting cell. Increasing expression of genes that are not expressed at the level. Such embodiments include altering the pattern of regulation or induction differently from the pattern of regulation or induction occurring in the resulting cell, and reducing (eliminating) the expression of a gene expressed in the resulting cell. Further included).
[0240]
One method by which homologous recombination can be used to produce or increase the production of an AFTI polypeptide from a cell's endogenous AFTI gene is to first use site-specific recombination using homologous recombination. Recombinant sequences (e.g., Cre / IoxP, FLP / FRT) from the system (Sauer et al., Current Opinion In Biotechnology, 5: 521-527, 1994; cells of Sauer, Methods In Enzymology, 225: 890-900, 1993). Including upstream (ie, 5 ′) of the endogenous genomic AFTI polypeptide coding region. A plasmid containing a recombination site homologous to the site immediately upstream of the genomic AFTI polypeptide coding region is introduced into a modified cell line with the appropriate recombinase enzyme. This recombinase results in integration of the plasmid through the recombination site of the plasmid and into a recombination site located immediately upstream of the genomic AFTI polypeptide coding region of the cell line (Baubonis and Sauer, Nucleic Acids Res., 21: 2025-). 20'29, 1993; O'Gorman et al., Science, 251: 1351-1355, 1991). Flanking sequences known to enhance transcription (eg, enhancers / promoters, introns, translation enhancers), if properly located in this plasmid, can provide new or enhanced AFTI from the cell's endogenous AFTI gene. Integration is performed to create new or modified transcription units that result in polypeptide production.
[0241]
A further method of using a cell line in which the site-specific recombination sequence is located immediately upstream of the cell's endogenous genomic AFTI polypeptide coding region is to place a second recombination site elsewhere in the genome of the cell line. The use of homologous recombination to introduce. A suitable recombinase enzyme is then introduced into the two recombination site cell line to create a new or modified transcription unit that results in new or enhanced AFTI polypeptide production from the cell's endogenous AFTI gene ( Deletion, inversion, transposition) (Sauer et al., Current Opinion In Biotechnology, supra, 1994; Sauer, Methods In Enzymology, supra, 1993).
[0242]
A further approach to increasing or producing expression of an AFTI polypeptide from a cell's endogenous AFTI gene is to increase the expression of one or more AFTI polypeptides from the cell's endogenous AFTI gene by producing one or more AFTI polypeptides from the cell's endogenous AFTI gene. Increasing or causing expression of a gene (eg, a transcription factor) and / or decreasing expression of one or more genes (eg, a transcription repressor). This method involves converting a non-naturally occurring polypeptide (e.g., a polypeptide comprising a site-specific DNA binding domain fused to a transcription factor domain) such that new or enhanced AFTI polypeptide production from the cell's endogenous AFTI gene occurs. Introducing into a cell.
[0243]
The invention further relates to a DNA construct useful in a method for altering the expression of a target gene. In some embodiments, exemplary DNA constructs include: (a) one or more target sequences; (b) regulatory sequences; (c) exons; and (d) unpaired splice donor sites. . The target sequence in the DNA construct may include the elements (a) to (d) linked to the target gene in the cell such that the elements (b) to (d) are operably linked to the sequence of the endogenous target gene. Directs the incorporation. In another embodiment, the DNA construct comprises: (a) one or more target sequences; (b) regulatory sequences; (c) exons; (d) splice donor sites; (e) introns; And (f) the splice acceptor site, the target sequence, directs the integration of the (a) to (f) element such that the (b) to (f) element is operably linked to the endogenous gene. The target sequence is homologous to a preselected site in the chromosomal DNA of the cell where homologous recombination occurs. In the construct, the exon is generally 3 'to the regulatory sequence and the splice donor site is 3' to the exon.
[0244]
If the sequence of the particular gene is known, such as the nucleic acid sequence of the AFTI polypeptide presented here, a DNA fragment complementary to the selected region of the gene is synthesized or a specific fragment that borders on the target region is synthesized. It can be obtained by appropriately restricting the natural DNA at the recognition site. This fragment can be used as a target sequence for insertion into the cell and hybridizes to its homologous region in the genome. If this hybridization occurs during DNA replication, the DNA fragment and any additional sequences attached thereto will act as Okazaki fragments and will be incorporated into the newly synthesized daughter strand DNA. The present invention therefore includes nucleotides that encode AFTI polypeptides that can be used as target sequences.
[0245]
AFTI polypeptide cell therapy, for example, transplantation of cells producing the AFTI polypeptide is also contemplated. This embodiment involves implanting cells capable of synthesizing and secreting a biologically active form of the AFTI polypeptide. Such AFTI polypeptide-producing cells produce an AFTI polypeptide by transformation with a gene encoding the desired AFTI polypeptide or a gene that enhances the expression of the AFTI polypeptide, which is a natural producer of the AFTI polypeptide. It may be a recombinant cell with enhanced capacity. Such modifications can be achieved by vectors suitable for delivering the gene and further promoting its expression and secretion. To minimize the potential immune response in a patient receiving an AFTI polypeptide, such as may occur with the administration of an exogenous polypeptide, the natural cells producing the AFTI polypeptide are of human origin, and the human AFTI polypeptide It is preferred to produce Similarly, a recombinant cell producing an AFTI polypeptide is preferably transformed with an expression vector containing a gene encoding a human AFTI polypeptide.
[0246]
The transplanted cells may be encapsulated to avoid infiltration of surrounding tissues. In a biocompatible semipermeable polymeric enclosure or membrane that permits release of the AFTI polypeptide but prevents cell destruction by the patient's immune system or by other deleterious factors from surrounding tissues, Human or non-human animal cells can be transplanted into a patient. Alternatively, the patient's own cells, transformed ex vivo to produce an AFTI polypeptide, may be transplanted directly into the patient without such encapsulation.
[0247]
Techniques for encapsulation of viable cells are known in the art, and the preparation of encapsulated cells and transplantation into a patient can be routinely performed. For example, Baetge et al. (WO 95/05452; PCT / US94 / 09299) describe membrane capsules containing genetically constructed cells for efficient delivery of bioactive molecules. Capsules are biocompatible and can be easily recovered. The capsule encapsulates a cell transfected with a recombinant DNA molecule comprising a DNA sequence encoding a bioactive molecule operably linked to a promoter that is not down-regulated in vivo upon implantation into a mammalian host. I do. Such devices provide for the delivery of molecules from living cells to specific sites within the recipient. See also U.S. Patent Nos. 4,892,538, 5,011,472, and 5,106,627. A system for encapsulating live cells is described in PCT patent application PCT / US91 / 00157 to Aebischer et al. Also, PCT Patent Application No. PCT / US91 / 00155 to Aebischer et al .; Winn et al., Exper. Neurol. , 113: 322-329 (1991), Aebischer et al., Exper. Neurol. , 111: 269-275 (1991); and also Tresco et al., ASAIO, 38: 17-23 (1992).
[0248]
In vivo and in vitro gene therapy delivery of AFTI polypeptides is also envisioned. One example of a gene therapy approach uses an AFTI gene (either genomic, cDNA, and / or synthetic DNA) encoding an AFTI polypeptide that can be operably linked to a constitutive or inducible promoter. , A "gene therapy DNA construct". The promoter may be homologous or heterologous to the endogenous AFTI gene, provided that it is active in the cell or tissue type into which the construct is inserted. Other components of the gene therapy DNA construct may include, optionally, DNA molecules designed for site-specific integration (eg, endogenous sequences useful for homologous recombination), tissue-specific promoters, enhancers or silencers, DNA molecules that can provide a selection advantage over parental cells, DNA molecules useful as labels to identify transformed cells, negative selection systems, cell-specific binding agents (eg, for cell targeting), It may include cell-specific internalization factors, and transcription factors that enhance expression by the vector, as well as factors that enable the production of the vector.
[0249]
The gene therapy DNA construct can then be introduced into cells using a viral or non-viral vector (either ex vivo or in vivo). One means for introducing a gene therapy DNA construct is by way of a viral vector as described herein. Some vectors, such as retroviral vectors, can deliver a DNA construct to the chromosomal DNA of a cell and integrate the gene into the chromosomal DNA. Other vectors function as episomes and the gene therapy DNA construct remains in the cytoplasm.
[0250]
In still other embodiments, regulatory elements can be included for controlled expression of the AFTI gene in target cells. Such an element operates in response to a suitable effector. In that way, a therapeutic polypeptide can be expressed when desired. One of the conventional control means is used to dimerize chimeric proteins containing small molecule binding domains and domains capable of initiating biological processes, such as DNA binding proteins or transcriptional activation proteins. Small molecule dimerizers or rapalogs (as described in WO9641865 (PCT / US96 / 099486); WO9731898 (PCT / US97 / 03137) and WO9731899 (PCT / US95 / 03157). Including the use of Protein dimerization can be used to initiate transcription of the AFTI gene.
[0251]
Other suitable control systems or gene switches include, but are not limited to, the following systems. Mifepristone (RU486) is used as a progesterone antagonist. Binding of the modified progesterone receptor ligand binding domain to a progesterone antagonist activates transcription by forming a dimer of two transcription factors, which then pass into the nucleus and bind to DNA. The ligand binding domain is modified to eliminate the receptor's ability to bind the natural ligand. Modified steroid hormone receptor systems are further described in U.S. Patent Nos. 5,364,791; WO96404011; and WO9710337.
[0252]
Yet another control system uses ecdysone (Drosophila steroid hormone), which binds to and activates the ecdysone receptor (cytoplasmic receptor). The receptor then translocates to the nucleus and binds to a specific DNA response element (a promoter from an ecdysone responsive gene). The ecdysone receptor contains a transactivation domain / DNA binding domain / ligand binding domain that initiates transcription. The ecdysone system is further described in U.S. Patent Nos. 5,514,578; WO9738117; WO8637609; and WO9303032.
[0253]
Another control system uses a positive tetracycline-controllable transactivator. This system comprises a mutant tet repressor protein DNA-binding domain linked to a polypeptide that activates transcription (a mutant tetR-4 amino acid change that results in a reverse tetracycline-regulated transactivator protein, ie, tet in the presence of tetracycline). Operator). Such systems are described in U.S. Patent Nos. 5,464,758; 5,650,298 and 5,654,168.
[0254]
Additional expression control systems and nucleic acid constructs are available from Innovir Laboratories Inc. Nos. 5,741,679 and 5,834,186.
[0255]
In vivo gene therapy can be performed by introducing a gene encoding an AFTI polypeptide into cells via local injection of an AFTI nucleic acid molecule or by other suitable viral or non-viral delivery vectors. Hefti, Neurology, 25: 1418-1435 (1994). For example, a nucleic acid molecule encoding an AFTI polypeptide can be incorporated into an adeno-associated virus (AAV) vector for delivery to target cells (eg, Johnson, International Patent Publication No. WO 95/34670; International Patent Application No. PCT). / US95 / 07178). Recombinant AAV genomes typically include an AAV inverted terminal repeat flanking a DNA sequence encoding an AFTI polypeptide operably linked to a functional promoter and polyadenylation sequence.
[0256]
Alternative suitable viral vectors include retrovirus, adenovirus, herpes simplex virus, lentivirus, hepatitis virus, parvovirus, papovavirus, poxvirus, alphavirus, coronavirus, rhabdovirus, paramyxovirus, and papillomavirus vectors. Including, but not limited to. U.S. Pat. No. 5,672,344 describes a virus-mediated gene transfer system in vivo, including a recombinant neurotrophic HSV-1 vector. US Patent No. 5,399,346 provides an example of a method for delivering a therapeutic protein to a patient by delivering human cells that have been treated in vitro to insert a DNA segment encoding the therapeutic protein. ing. Additional methods and materials for performing gene therapy approaches are described in US Pat. No. 5,631,236 for adenoviral vectors; US Pat. No. 5,672,510 for retroviral vectors; and retroviral vectors expressing cytokines No. 5,635,399.
[0257]
Delivery methods other than virus include transfer via liposomes, naked DNA delivery (direct injection), transfer via receptor (ligand-DNA complex), electroporation, calcium phosphate precipitation, and microparticle bombardment (eg, gene guns). ), But is not limited thereto. Gene therapy materials and methods also include inducible promoters, tissue-specific enhancer-promoters, DNA sequences designed for site-specific integration, DNA sequences that can provide a selection advantage over parental cells, Enhance expression with labels, negative selection and expression control systems (safety measures), cell-specific binding agents (for cell targeting), cell-specific internalization factors, and vectors to identify transformed cells It may include the use of transcription factors as well as methods of vector production. Such additional methods and materials for performing gene therapy approaches are described in US Pat. No. 4,970,154 for electroporation techniques; WO 96/40958 for nuclear ligands; lipoprotein-containing for gene delivery U.S. Patent No. 5,679,559 describing a system; U.S. Patent No. 5,676,954 for liposome carriers; U.S. Patent No. 5,593,875 for a method for calcium phosphate transfection; No. 4,945,050, which propelles particles into cells at a rate that penetrates the surface of the cell and is incorporated into the cells.
[0258]
It is also contemplated that AFTI gene therapy or cell therapy may further include the delivery of one or more additional polypeptides in the same or different cells. Such cells can be introduced separately into the patient, or incorporated into a single implantable device, such as the encapsulating membrane described above, or modified separately by a viral vector.
[0259]
One way to increase the expression of endogenous AFTI polypeptide in cells through gene therapy is to add one or more enhancer elements to the AFTI polypeptide if the enhancer element can serve to increase the transcriptional activity of the AFTI gene. Inserting into a peptide promoter. The enhancer element used is selected based on the tissue in which it is desired to activate the gene, and enhancer elements known to result in activation of the promoter in that tissue. For example, if the gene encoding the AFTI polypeptide is "turned on" in T cells, the lck promoter enhancer element can be used. Here, the functional part of the transcription element to be added can be inserted into a fragment of DNA containing the AFTI polypeptide promoter using standard cloning techniques (and in some cases, vectors and / or 5 ′ and / or 3 'flanking sequences, etc.). This construct, known as a "homologous recombination construct", can then be introduced into the desired cells, either ex vivo or in vivo.
[0260]
Gene therapy can also be used to reduce expression of the AFTI polypeptide by modifying the nucleotide sequence of the endogenous promoter. Such modifications are typically made by homologous recombination techniques. For example, a DNA molecule containing all or part of the promoter of the AFTI gene selected for inactivation can be constructed to remove and / or replace the promoter fragment that regulates transcription. For example, standard molecular biology techniques can be used to delete the TATA box and / or binding site of the transcriptional activator of the promoter; such deletions can inhibit promoter activity; Thereby, the transcription of the corresponding AFTI gene is suppressed. Deletion of a transcriptional activator binding site in a TATA box or promoter can be achieved by substituting, deleting, and / or replacing one or more nucleotides in the TATA box and / or transcriptional activator binding site. This can be accomplished by making a DNA construct that contains all or a related portion of the AFTI polypeptide promoter (from the same or related species as the controlling AFTI gene) mutated by insertion. As a result, the TATA box and / or the activator binding site have low activity or are completely inactivated. The construct typically contains at least about 500 bases of DNA, corresponding to the native (endogenous) 5 'and 3' DNA sequences flanking the modified promoter segment. The constructs can be introduced into appropriate cells either directly as described herein or through a viral vector (either ex vivo or in vivo). Typically, if the 5 'and 3' DNA sequences within the promoter construct can serve to assist in incorporating the altered promoter region through hybridization to endogenous chromosomal DNA, it will be incorporated into the genomic DNA of the cell. Integration of the construct takes place through homologous recombination.
[0261]
Uses of AFTI nucleic acids and polypeptides
AFTI nucleic acid molecules (including those that do not themselves encode biologically active polypeptides) are used to qualitatively or quantitatively determine the presence of AFTI or apo-A-1 DNA or corresponding RNA in mammalian tissue or body fluid samples. It is considered to be useful as a hybridization probe in diagnostic assays to be examined.
[0262]
AFTI polypeptides may be used in combination with one or more cytokines, growth factors, antibiotics, anti-inflammatory drugs, and / or chemotherapeutic agents when appropriate for the indication being treated.
[0263]
If it is desired to inhibit the activity of one or more AFTI polypeptides, other methods may be used. Such inhibition can be caused by nucleic acid molecules that are complementary to and hybridize to expression control sequences (triple helix formation) or AFTI mRNA. For example, an antisense DNA or RNA molecule having a sequence complementary to at least a portion of the selected AFTI gene can be introduced into cells. Antisense probes can be designed by available techniques using sequences encoding the AFTI polypeptides disclosed herein. Typically, each such antisense molecule is complementary to the start site (5 'end) of each selected AFTI gene. Subsequent hybridization of the antisense molecule to the corresponding AFTI mRNA prevents or reduces translation of this mRNA. Antisense inhibitors provide information regarding the reduction or absence of an AFTI polypeptide in a cell or organism.
[0264]
Alternatively, gene therapy can be used to create a dominant negative inhibitor of one or more AFTI polypeptides. In this case, DNA encoding a mutant polypeptide of each selected AFTI polypeptide can be prepared and introduced into patient cells using viral or non-viral methods as described herein. Each such mutant is typically designed to compete with the endogenous polypeptide for its biological role.
[0265]
In addition, AFTI polypeptides, whether biologically active or not, can be used as immunogens, ie, the polypeptide contains at least one epitope against which antibodies can be raised. Selective binding agents that bind AFTI polypeptides (as described herein) include in vivo and in vitro, including, but not limited to, use in labeled form to detect the presence of the AFTI polypeptide in a body fluid or cell sample. Can be used for diagnostic purposes. Antibodies can also be used to prevent, treat, or diagnose many diseases and disorders, including those listed herein. The antibody can bind to the AFTI polypeptide to reduce or block at least one characteristic activity of the AFTI polypeptide, or bind to the polypeptide to increase at least one characteristic activity of the AFTI polypeptide. (Including by increasing the pharmacokinetics of the AFTI polypeptide).
[0266]
Effect of Apo-A-1 on IL-1β and TNF-α production by monocytes
Apo-A-1 is a major component of HDL, a macromolecular complex of lipids and various amphipathic peptides, called apolipoprotein. Apolipoproteins have a range of activities that allow HDL to perform a variety of functions (Barter et al., 1996, Atherosclerosis 121: 1-12), and their function is primarily due to their role in blood lipid metabolism. It was thought to be due to their effects. Recently, HDL has been shown to downregulate the CD-14 receptor on monocytes (Pajkrt et al., 1996, J. Exp. Med. 184: 1601-1608), as exemplified in human volunteers. HDL has been shown to have a range of activities, including various anti-inflammatory functions (Calabresi et al., 1997, Curr. Opin. Lipidol. 8: 219-224; Miyazaki et al., 1995, J. Atheroscler. Thromb. 2: 30-36). HDL also exhibits an anti-inflammatory function by competing with lipopolysaccharide (LPS), and thus contributes to reduced endotoxin activity (Baumberger et al., 1991, Pathobiology 59: 378-383). Although the mechanism and physiological relevance of the anti-inflammatory function of HDL have not been elucidated, the results described in Example 1 below show that at least a portion of this activity is due to apo-A-1 monocyte T cell signaling. It could be attributed to inhibition of transmission.
[0267]
The data demonstrate that HDL interacts with stimulated T cells through apo-A-1 binding. Such an interaction was described in a study that demonstrated the presence of a specific HDL binding site on human lymphocytes that recognize apo-A-1 as a ligand (Jurgens et al., 1989, J. Biol. Chem. 264). : 8549-8556). Although this HDL receptor was not identified, it was claimed that the utilization of HDL lipids by T lymphocytes was responsible when cultured in serum-free medium supplemented with HDL. According to a more recent study (Hidaka et al., 1999, J. Lipid Res. 40: 1131-1139), the results set forth in Example 1 below show that HDL is typically not stimulated for T lymphocytes. Reveals that it does not combine. These findings indicate that apo-A-1 related HDL can interact with stimulated T cells. This interaction is thought to be involved in the inhibition of monocyte T cell signaling. Furthermore, HDL binds to monocytes according to flow cytometry analysis. This is consistent with published data showing the binding of HDL (HDL3) to monocytes in all PBMCs (Hidaka et al., 1999, J. Lipid Res. 40: 1131-1139). It is therefore very likely that HDL will also affect monocyte activation by directly modulating the level of activation of the latter cells. This is confirmed by the results shown in FIG. In fact, the premise that apo-A-1 (stimulated HUT-78 cells or the membrane of T lymphocytes) added after stimulation can still inhibit the cytokine production effect is based on the inhibition on monocytes / THP-1 cells. Suggests a direct effect of the factor. No binding or functional activity of HDL has been observed with resting THP-1 cells, but resting THP-1 cells can express differentiated (activated) HDL receptors (Westman et al., 1995, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 55: 23-33). Therefore, the results set forth in Example 1 below show that HDL-associated apo-A-1, according to some embodiments, contacts monocyte stimulatory T cells through two different pathways to activate monocytes. Have been shown to inhibit the production of pro-inflammatory cytokines upon activation: a major pathway is the blockade of the binding of activators on T cells to receptors on monocytes, and thus TNF-α and IL Inhibits both expression of -1β. Another pathway is thought to be the direct action of apo-A-1 related HDL on monocytes through binding to receptors, thus directly inhibiting cytokine production. Although the latter effect has not yet been proven, it is believed that these dual effects explain the difference in the degree of inhibition of TNF-α and IL-1β production in THP-1 cells.
[0268]
Although the results of Example 1 did not identify ligands for apo-A-1 on the surface of stimulated T cells, it is unlikely that HDL receptor proteins such as SR-B1 or CD36 are involved. Because these receptors show no specificity for certain apolipoproteins that can interact with LDL (Krieger, M., 1999, Annu. Rev. Biochem. 68: 523-558; Fidge, NH). , 1999, J. Lipid Red. 40: 187-201). LDL shows no detectable inhibitory activity on monocyte T cell signaling (data not shown). On the other hand, specific HDL binding proteins expressed in rat liver plasma membrane and human blood monocytes (HB ₁ And HB ₂ ) Were described (Hidaka et al., 1999, J. Lipid Res. 40: 1131-1139). HB ₂ Is homologous to ALCAM, a cell adhesion molecule belonging to the immunoglobulin superfamily (Fidge, NH, 1999, J. Lipid Red. 40: 187-201). Apo-A-1 is HDL of HDL ₂ HDL receptors on stimulated T cells are ₂ It may have some homology with the protein family. Recently, a protein known as a high-affinity receptor for intestinal absorption of endogenous factor-vitamin B12 complex (i.e., cubilin) has been described in the endocytosis of HDL (Kozyraki et al., 1999, Nat. Med. 5: 656-661). ) Was shown to exhibit high affinity for apo-A-1. The latter 460 kDa protein or HB ₂ Whether is expressed in stimulated T lymphocytes has not yet been determined. Identification of the apo-A-1 / HDL receptor on stimulated T cells will allow elucidation of the mechanism of action of monocyte T cell signaling inhibitors.
[0269]
Although inhibition of monocyte T-cell signaling is thought to be important in maintaining low levels of monocyte activation in the bloodstream, the static conditions used in this study were due to the shear stress applied by the bloodstream. Seems not to reflect. Recently, inflammatory conditions in juvenile RA have been linked to hypoHDLemia (Tselepis et al., 1999, Arthritis Rheum. 42: 373-383) and a significant decrease in plasma apo-A-1 levels in patients with this disease. It was shown. In RA, apo-A-1 (Ananth et al., 1993, Metabolism 42: 803-806; Lorber et al., 1985, Br. J. Rheumatol. 24: 250-255; Doherty et al., 1998, Electrophoresis 19: 355-363). Or HDL cholesterol (Ananth et al., 1993, Metabolism 42: 803-806; Lorber et al., 1985, Br. J. Rheumatol. 24: 250-255; Joben et al., 1984, Arthritis Rheum. 27: 1199-1200). There are controversial reports that levels have not changed or have declined. However, although the concentration of apo-A-1 is 10 times lower in synovial fluid than in plasma, it is clear that apo-A-1 is enhanced in synovial fluid of RA patients (Ananth et al., 1993, Metabolism). 42: 803-806). Elevation of apo-A-1 in synovial fluid of RA patients was accompanied by elevation of cholesterol, suggesting infiltration of HDL particles into inflammatory sites.
[0270]
Indeed, it is common in inflammation that the activity of inflammatory factors such as cytokines (IL-1β and TNF-α) and metalloproteinases is counteracted by specific inhibitors. In chronic inflammation, regulatory mechanisms appear to be overwhelmed by inflammatory factors. As the inventor hypothesizes, if monocyte T lymphocyte signaling is an important pro-inflammatory mechanism, there should be inhibitors to regulate this activity. HDL-associated apo-A-1 has been shown to be one of these regulators. The presence of apo-A-1 in the synovial fluid of RA patients is thought to be a response of the organism to suppress the inflammatory response. Changes in apo-A-1 concentrations have also been observed in another autoimmune inflammatory disease, systemic lupus erythematosus (SLE) (Lahita et al., Arthritis Rheum. 36: 1566-1574), in which case The plasma concentration of Apo-A-1 decreased. This reduction has been linked to the presence of anti-apo-A-1 antibodies in 32% of patients (Dinu et al., 1998, G, Lupus 7: 355-360). This also suggests the anti-inflammatory function of Apo-A-1.
[0271]
There is a well-established inverse correlation between HDL levels and the incidence of atherosclerosis. Increasing evidence strongly supports the claim that the inflammatory response is an integral part of atherosclerosis (Ross, R., 1999, N. Engl. J. Med. 340-115-126). Indeed, monocyte-macrophages and T lymphocytes are present at all stages of lesion development, with the earliest lesions (fatty streaks) consisting mainly of macrophages and T lymphocytes (Starry et al., 1994, Circulation 89: 2462). -2478). Therefore, T lymphocyte signaling of monocytes is thought to occur in this disease. Release of metalloproteinases by activated monocyte-macrophages appears to weaken plaque substrates and hasten the acute phase of plaque disruption and thrombus formation (Lee et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17: 1859-1868). It is believed that HDL exerts protective functions at several levels of atherosclerosis, including reduced monocyte activation by T lymphocytes.
[0272]
The results described herein identify the anti-inflammatory function of HDL-associated apo-A-1. According to some embodiments, this is a general mechanism of protection against monocyte-macrophage hyperactivation in inflammatory conditions where stimulated T lymphocytes are found in the blood circulation, as well as plasma proteins within the inflamed tissue. It is considered an important counter-regulatory mechanism in the event of a spill. A new concept resulting from the present results is the importance of "negative" acute phase proteins, such as apo-A-1, as anti-inflammatory factors.
[0273]
The following examples are intended for illustrative purposes only and should not be construed as limiting the scope of the invention in any way.
[0274]
Example 1 Use of Apo-A-1 to Inhibit TNF-α and IL-1β Production in Human Monocytes Stimulated Through Contact with T Lymphocytes
Experimental materials and methods
Experimental materials and reagents. Phaseolus vulgaris (Pink bean vulgaris) leukophytohemagglutinin (PHA) (EY Laboratories Inc., San Mateo, CA); phorbol myristate acetate (PMA), paraformaldehyde, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), pepstatin A, Leupeptin, iodoacetamide, polymyxin B sulfate, neuraminidase, and bovine serum albumin (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO); RPMI-1640, Ca ²⁺ And Mg ²⁺ Phosphate Buffered Saline (PBS), Fetal Bovine Serum (FCS), Penicillin, Streptomycin and L-Glutamine (Gibso, Paisley, Scotland) were purchased from designated suppliers. All other reagents were of analytical grade or better.
[0275]
Human serum. Pooled human serum (HS) was obtained from the Blood Transfusion Center of the University Hospital of Geneva.
[0276]
Preparation of T cells and T cell plasma membrane. The human T cell line (Gazdar et al., 1980, Blood 55: 409-417), HUT-78, was obtained from the ATCC (Manassas, VA). Cells are grown in 5% CO ₂ -Maintained in RPMI-1640 medium (complete RPMI medium) supplemented with 10% heat inactivated FCS, 50 μg / ml streptomycin, 50 IU / ml penicillin and 2 mM L-glutamine at 37 ° C. in an air-humidified atmosphere. HUT-78 cells (1 × 10 ⁶ Cells / ml) were stimulated with PHA (1 μg / ml) and PMA (5 ng / ml) for 6 hours. Stimulated HUT-78 cells are fixed with 1% paraformaldehyde (Vey et al., 1992, J. Immunol. 149: 2040-2046; Isler et al., 1993, Eur. Cytokine Network. 4: 15-23) or previously. (Burger et al., 1998, Arthritis Rheum. 41: 1748-1759) prepared their plasma membranes. T lymphocytes were obtained from buffy coats of healthy donors as previously described (Vey et al., 1992, J. Immunol. 149: 2040-2046). T lymphocytes were 94-98% CD2 +, 83-94% CD3 +, and ≦ 2% CD14 as assessed by flow cytometry. ⁺ Was included. T lymphocytes were stimulated with PHA (1 μg / ml) and PMA (5 ng / ml) for 48 hours, washed extensively, and as previously described (Vey et al., 1992, J. Immunol. 149: 2040-). 2046; Isler et al., 1993, Eur. Cytokine Network. 4: 15-23) fixed with 1% paraformaldehyde. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained from buffy coats of healthy donors by density centrifugation on Ficoll-Paque (Amersham-Pharmacia, Uppsala, Sweden).
[0277]
Monocytes and monocytic cells. A human monocytic cell line THP-1 (Tsuchiya et al., 1980, Int. J. Cancer 26: 171-176) from a patient with acute monocytic leukemia was obtained from the ATCC (Manassas, VA). Peripheral blood monocytes were obtained as described (Armant et al., 1995, J. Immunol. 155: 4868-4875).
[0278]
PMBC culture. PMBCs were placed in 96-well culture plates at 4 × 10 ⁵ The cells were cultured at a density of cells / 200 μl / well for 48 hours (cytokine production) or 72 hours (growth) in the presence of the indicated stimuli. For proliferation assays, 24 hours prior to harvesting cells ³ H-thymidine was added.
[0279]
Protein concentration and N-terminal microsequencing. Protein concentration was measured by the method of Bradford. The purified inhibition fraction was subjected to 10% SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane and visualized by Coomassie blue staining. M _r The 28 kDa band was excised and N-terminal sequence analysis was performed on a Procise 494-HT protein sequencer (Perkin-Elmer, Foster City, CA).
Activation of THP-1 cells and monocytes. THP-1 cells (5 × 10 ⁴ Cells / well) or monocytes (8 × 10 ⁴ Cells / well) were distributed into 96-well culture plates (Falcon, Becton Dickinson UK Ltd., Plymouth, UK) and indicated in a total volume of 200 μl complete RPMI medium in the presence or absence of the indicated inhibitors. Activated by stimulation. Forty-eight hours later, culture supernatants were washed with TNF as previously described (Vey et al., 1992, J. Immunol. 149: 2040-2046; Isler et al., 1993, Eur. Cytokine Netw. 4: 15-23). Analyzed for -α and IL-1β content.
Isolation of serum HDL by high density ultracentrifugation. Havel et al., 1955, J. Am. Cltn. Invest. 34: 1345-1353, isolated the HS lipoprotein. Briefly, HS was centrifuged at 20,000 rpm for 45 minutes using a Beckman JA 20.1 rotor to remove chylomicrons. The serum without chylomicron was then centrifuged at 50,000 rpm for 24 hours and 37 minutes. The upper phase containing the very low density lipoprotein (VLDL) was discarded. The lower phase was adjusted to a density of 1.063 g / ml by adding solid NaBr and centrifuged at 50,000 rpm for 24 hours 37 minutes. The low density lipoprotein (LDL) recovered in the upper phase was discarded. The lower phase was adjusted to d = 1.23 g / ml by adding solid NaBr and centrifuged at 45,000 rpm for 60 hours and 47 minutes. High density lipoprotein (HDL) was recovered in the upper phase and the lower layer contained residual serum proteins. All ultracentrifugations were performed at 4 ° C. using a Beckman 50.2 Ti rotor.
[0280]
The collected lipoprotein and protein fraction were dialyzed against PBS, and their inhibitory activities were examined. Briefly, THP-1 cells (5 × 10 ⁴ Cells / well) or monocytes (8 × 10 ⁴ Cells / well) were dispensed into 96-well culture plates (Falcon, Becton Dickinson UK Ltd., Plymouth, UK) and isolated from stimulated T cells in a total volume of 200 μl complete RPMI medium in the presence of various dilutions of fractions. Activated by detached membrane. Forty-eight hours later, culture supernatants were washed with TNF as previously described (Vey et al., 1992, J. Immunol. 149: 2040-2046; Isler et al., 1993, Eur. Cytokine Netw. 4: 15-23). Analyzed for -α and IL-1β content.
[0281]
Flow cytometry. HDL was labeled with fluorescein thiocyanate (FITC-HDL) as described (Hidaka et al., J. Lipid Res. 40: 1131-1139). Binding of FITC-HDL to cells was determined essentially as previously described (Deage et al., 1998, M. Eur. Cytokine Network. 9: 663-668) flow cytometer (EPICS, Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL). The mean fluorescence intensity was recorded during gating of surviving cells and expressed in arbitrary units on a 4 × 10 log scale. The percentage of positive cells was based on the percentage of fluorescent events over the uncomplexed FITC control.
[0282]
HDL degreasing. HDL apolipoprotein extraction was performed as described (Osborne, JCJ, 1986, Meth. Enzymol. 128: 213-222). Briefly, one volume of HDL isolated by ultracentrifugation was slowly added to 12 volumes of ice-cold methanol with constant stirring. Then 28 volumes of ice cold diethyl ether were added to the solution. After stirring on ice for 10 minutes, the mixture was centrifuged at 500 × g for 5 minutes. The protein pellet was resuspended in 40 volumes of diethyl ether. After stirring on ice for 10 minutes, the mixture was centrifuged as above. The pellet was collected and dried under a nitrogen flux. To minimize aggregation, defatted HDL lipoproteins were washed with 0.1 M NaCl, 1 mM NaN ₃ Solubilized at 2 mg protein / ml in 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4 containing 1 mM EDTA and 2 M guanidinium chloride, then dialyzed against PBS.
[0283]
Treatment of HDL with proteinase K. HDL (100 μg protein) was incubated in the presence or absence of 1 unit proteinase K bound to agarose beads (Sigma Fine Chemicals, St. Louis, MO) for 1 hour at 37 ° C. in a final volume of 200 μl PBS. The proteolytic reaction was stopped by centrifugation and the effect was evaluated by SDS-PAGE.
[0284]
Electroelution of HDL protein. HDL proteins were separated from gel sections by electroelution essentially as described previously (Burger et al., 1990, J. Neurochem. 54: 1569-1575). Briefly, 1 mg of defatted HDL protein was subjected to SDS-PAGE under non-reducing conditions. Gels are 0.3M CuCl ₂ (Lee et al., 1987, Anal. Biochem. 166: 308-312). The detected band (M _r = 56,000-66,000, 50,000, 28,000, and 18,000), destained, 50 mM Tris-HCl and 384 mM glycine (pH≡) containing 5 mM EDTA and 0.1% SDS. Electroeluted in 8.3) for 5 hours. The SDS was removed by precipitating the electroeluted protein in acetone. The protein was lyophilized, 0.1 M NaCl, 1 mM NaN ₃ Resuspended in 0.1 M Tris-HCl, pH 7.3, containing 1 mM EDTA, and 2 M guanidinium chloride, then dialyzed against PBS. Alternatively, the protein from defatted HDL is converted to 0.1 M NaCl, 1 mM NaN ₃ For gel filtration on Superdex S75 (75 × 1.6 cm, Pharmacia) solubilized in 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4 containing 1 mM EDTA, and 2 M guanidinium chloride, equilibrated in the same buffer. Provided. M _r The fractions corresponding to = 28,000 were pooled, concentrated, dialyzed in PBS and examined for their inhibitory activity. Calbiochem-Novabiochem Corp. Fractions were analyzed for their apo-A-1 content by Western blot using a mouse monoclonal antibody from (La Jolla, CA), catalog number 178472.
[0285]
mRNA quantification. Total RNA was isolated from THP-1 cells and monocytes using TRIzol ™ reagent (Life Technologies) according to the manufacturer's procedure. Quantification of mRNA in monocytes and THP-1 cells using a commercially available "RNase Protection Assay System" kit with hck2 template set (PharMingen, San Diego, CA) with antisense riboprobes for TNF-α For this purpose, 2 μg and 10 μg of total RNA were used, respectively. The TNF-α antisense riboprobe is available from Dr. C. V. The pSP65 / hTNF plasmid provided by Jongeneel (Ludwig Institute for Cancer Research, Lausanne, Switzerland) was linearized and then obtained from a TNF-α cDNA template prepared with SP6 RNA polymerase.
[0286]
Experimental result.
[0287]
Human serum inhibited T cell signaling in both monocytes and THP-1 cells.
To determine whether human serum (HS) exhibits an anti-inflammatory effect by inhibiting cytokine production, unseparated PBMCs were stimulated with PHA in media supplemented with either 10% FCS or HS. PBMCs cultured with HS inhibited the production of both TNF-α and IL-1β compared to PBMCs cultured with FCS (FIG. 2A), but cell proliferation was similar between HS and FCS (FIG. 2B). . In monocytes, direct contact with stimulated T cells is thought to increase cytokine production of PBMCs, so either fixed and stimulated T lymphocytes or either HUT-78 cells or plasma membranes from HUT-78 cells Was added to PBMC or THP-1 monocytic cells to examine the HS inhibitory effect. The induced TNF-α and IL-1β production was measured (FIG. 3).
[0288]
T lymphocytes isolated from peripheral blood are stimulated with PHA and PMA, fixed and transferred to THP-1 cells in the presence of human serum (HS) or fetal calf serum (FCS), ie, at a final serum concentration of 20%. added. Under these conditions, IL-1β production by THP-1 cells was inhibited by HS but not by FCS (FIG. 3A). This demonstrates the presence of inhibitory activity in HS. Human umbilical cord serum (CBS) was only slightly inhibitory at 10% concentration (FIG. 2A), suggesting that inhibitory activity was present only in adult serum.
[0289]
To confirm that the inhibition was specific to contact activated monocytes, either TUT-1 cells were fixed and stimulated in the presence of increasing concentrations of HS by stimulated HUT-78 cells or either LPS and PMA. Stimulated. IL-1β produced upon contact between fixedly stimulated HUT-78 cells and THP-1 cells was inhibited by HS in a dose-dependent manner, whereas IL-1β induced by LPS and PMA showed a decrease in HS concentration. It was stimulated dependently or unchanged (FIG. 3B). This demonstrates that the inhibitory effect of HS is directed at T cell signaling of THP-1 cells and freshly isolated T lymphocytes, and that the HUT-78 cell line expressed an activator upon stimulation. (FIGS. 3, A and B).
[0290]
The plasma membrane of stimulated T cells induced TNF-α and IL-1β production in THP-1 cells and freshly isolated monocytes (FIG. 3, CF). However, monocytes are more sensitive to contact activation with the membrane of stimulated HUT-78 cells than THP-1 cells, and THP-1 cells require a 10-fold higher amount of membrane for activation. did. Indeed, the production of IL-1β and TNF-α was initiated by an amount of isolated membrane equivalent to a cell ratio as low as 0.1 of stimulated T cells / monocytes, whereas in THP-1 cells 2 Cytokine production was observed in the ratio of stimulated T cells / THP-1 cells (FIG. 3, CF). Similar levels of IL-1β were induced in both cell types (3, D and F), but levels of TNF-α were 20-fold lower in THP-1 cells than monocytes.
[0291]
Therefore, the degree of inhibition for various cytokines was dependent on the target cell type. In fact, monocytes inhibit TNF-α and IL-1β production to the same extent, with membrane doses ranging from 0.25 to 1.0 T cell equivalent / monocyte at about 85% and about 91%, respectively. Reached the inhibition. In THP-1 cells, inhibition of TNF-α production was lower than that of IL-1β, with membrane doses ranging from 2.5 to 10 T cell equivalents / monocytes being about 69% and about 89%, respectively. . This suggests that inhibition of TNF-α production in THP-1 cells is less efficient than inhibition of IL-1β as compared to monocytes in which TNF-α and IL-1β are inhibited to a similar extent. These data confirm that direct contact with stimulated T cells has high efficacy in triggering the production of TNF-α and IL-1β by monocytes, and that the inhibitory mechanism or inhibitory factor in HS Supporting the hypothesis that it exists. To further identify the inhibitory components and mechanism of HS, membranes from THP-1 cells and stimulated HUT-78 cells were used.
[0292]
Isolation of HS factors that inhibit monocyte T cell signaling. To identify inhibitors, use Blue Sepharose® Fast Flow, Q Sepharose® Fast Flow, Phenyl Sepharose® 6 Fast Flow, and Superdex® 200 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). HS was fractionated by continuous chromatography. In fractions 23-26 (FIG. 4A), _r = 179 × 10 ³ ± 46 × 10 ³ (Inhibition activity was recovered in the mean ± SD, n = 4 inhibition fractions. Inhibition activity was correlated with the enrichment of the 28 kDa protein band in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis (FIG. 4, Table 1) .N-terminal microsequencing demonstrated that this band was the apolipoprotein, (Apo) A-1, which is the major protein component of high density lipoprotein (HDL), which were HDL and Apo, respectively. Of gel filtration and SDS-PAGE to separate A-1 _r The differences between the analyzes were explained (FIG. 4, A and B). These data revealed that the inhibitor was included in the HDL particles.
[0293]
The protein component of HDL inhibited monocyte T cell signaling. To determine which HDL components are inhibitory, HS was fractionated by continuous high-density centrifugation (Havel et al., 1955, J. Cltn. Invest. 34: 1345-1353) to separate lipoproteins from serum proteins. did. Separated lipoproteins and serum proteins were dialyzed against PBS and their inhibitory effects on THP-1 cells activated by the membrane of stimulated HUT-78 cells were examined. Although inhibitory activity was recovered in the HDL fraction, LDL and serum proteins recovered using the same ultracentrifugation (d = 1.23) as HDL were not inhibitory (FIG. 5). The HDL fraction was subjected to delipidation or proteolytic treatment with proteinase K to determine which component of HDL, ie, protein or lipid, was the inhibitor. The HDL protein obtained by diethyl ether / methanol treatment showed high inhibitory activity, whereas the HDL lipid obtained after proteolytic digestion with proteinase K was no longer inhibitory (FIG. 5). The production of both TNF-α and IL-1β was inhibited by the HDL protein (FIG. 5, A and B). This confirms that the inhibitor of HS was a protein component of HDL.
[0294]
Apo-A-1 is an HS inhibitor of monocyte T cell signaling. Commercially available purified apo-A-1 (Sigma Fine Chemicals, St. Louis, MO) was tested to determine whether apo-A-1 exhibited an inhibitory effect. Apo-A-1 dose-dependently inhibited the production of both TNF-α and IL-1β in THP-1 cells activated by the membrane of HUT-78 cells (FIG. 6A). As already apparent from FIG. 3, TNF-α production was not inhibited as much as IL-1β production. Since the Apo-A-1 formulation contained 3% of unidentified contaminants (according to the supplier), it had to be confirmed that the inhibition was indeed due to Apo-A-1. The protein from defatted HDL was subjected to preparative SDS-PAGE. After copper filtration, the band (M _r : 56,000-66,000, 50,000, 28,000, and 18,000) and electroeluted. M _r = 28,000 and M _r The inhibitory activity was recovered in the band of = 18,000 (Fig. 6, B and C). Two-fold M containing apo-A-1 aggregates as assessed by Western blot analysis _r = 56,000-66,000 did not show significant inhibitory activity (data not shown). The production of both TNF-α and IL-1β was inhibited by the electroeluted protein. TNF-α was inhibited to a lesser extent than IL-1β, confirming the results from FIG. All inhibitory fractions contained apo-A-1 as revealed by Western blot analysis (FIG. 6E), indicating that apo-A-1 is an inhibitor of monocyte T cell signaling. . Indeed, it is very unlikely that another HDL apolipoprotein behaves the same as apo-A-1 in terms of protein and protein lysis fragment size (FIG. 6E, lanes a and b). Alternatively, proteins from defatted HDL were subjected to gel filtration on Superdex S75. M _r = 28,000 ± 10,000 showed inhibitory activity (FIG. 6D). These fractions contained apo-A-1 as determined by Western blot analysis (FIG. 6E, lane c), further confirming that apo-A-1 was an inhibitor.
[0295]
HDL interacts with stimulated T cells through apo-A-1 binding. To determine whether the inhibitory effect of HDL was due to its potential binding to stimulated T cell membranes or THP-1 cells, either membranes isolated from THP-1 cells or stimulated HUT-78 cells were analyzed. Pre-incubated in the presence or absence of FCS, HS, or isolated HDL. After washing, the remaining activation ability of membranes or THP-1 cells from stimulated HUT-78 cells was evaluated. Only when the membranes of stimulated HUT-78 cells were incubated with HS or HDL, inhibition of IL-1β production was observed (FIG. 7A). Incubation of THP-1 cells with either FCS, HS, or HDL did not appear to inhibit IL-1β production (FIG. 7A). These results demonstrate that the inhibitory effects of HS and HDL were primarily on activators expressed on the surface of stimulated T cells.
[0296]
To further confirm that the inhibitor interacted with surface factors on stimulated T cells, isolated HDL was labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) and binding to various cell types was determined by flow cytometry. evaluated. No binding of FITC-HDL was observed on THP-1 cells (FIG. 7B), but there was a slight increase in monocyte fluorescence when incubated with FITC-HDL when compared to the unconjugated FITC control (FIG. 7C). ). Although low levels of FITC-HDL binding were observed for unstimulated HUT-78 cells, stimulated HUT-78 cells bound FITC-HDL and showed two fluorescent peaks, at least 2 This suggested that there were two different HDL binding sites (FIGS. 7, D and E). At lower FITC-HDL concentrations, only one fluorescence peak was observed. In the presence of anti-apo-A-1 antibody, a shift to lower fluorescence intensity was observed, demonstrating that HDL interacted with stimulated T cells through apo-A-1 specific binding (FIG. 7F). . Together, these results indicate that HDL selectively interacts with stimulated T cells, suggesting that the inhibitory activity associated with apo-A-1 targets surface factors on T cells. .
[0297]
Maximal inhibition of steady-state mRNA levels was observed only when apo-A-1 was added at the same time or immediately after stimulation. To further elucidate the mechanism of apo-A-1, the inhibitory effect of isolated apo-A-1 on steady-state levels of TNF-α and IL-1β mRNA was evaluated. THP-1 cells were stimulated with the membrane of stimulated HUT-78 cells in the presence of apo-A-1 added at various time points. Apo-A-1 reduced the steady state levels of TNF-α and IL-1β mRNA in THP-1 cells activated at the membrane of stimulated HUT-78 cells (FIG. 8, A and C). Inhibition of TNF-α mRNA is not as pronounced as inhibition of IL-1β mRNA and correlates with data obtained on protein production levels. Inhibition of TNF-α mRNA was only observed when apo-A-1 was present at or immediately after time 0, and inhibition of TNF-α production was not affected by activator and apo-A on stimulated HUT-78 cells. -1 was suggested. Similar results were obtained with PBMCs activated by the membranes of stimulated T lymphocytes (FIGS. 8, B and D), with steady-state levels of both TNF-α and IL-1β mRNA of apo-A-1 or HS. MRNA induction was faster in monocytes than in THP-1 cells. For monocytes, inhibition of steady-state mRNA levels was also greatest when apo-A-1 was added, either together with or shortly after the membrane (FIG. 8D). No inhibition was observed when Apo-A-1 was added 30 minutes after activation. The latter results indicate that apo-A-1 inhibited contact-mediated activation of monocytes regardless of cell type, confirming the data in FIG.
[0298]
Apo-A-1 inhibits TNF-α and IL-1β production in antigen-activated PBMC. To confirm that apo-A-1 is a factor responsible for the inhibition of cytokine production in PBMC stimulated by PHA, PBMC were isolated from PHA or tetanus in the presence or absence of apo-A-1 and defatted HDL. Stimulated with any of the toxoids (TT). Although TT-stimulated PBMC produced lower cytokine production than PHA-stimulated PBMC, TNF-α and IL-1β production was inhibited by apo-A-1 or defatted HDL regardless of stimulation (FIG. 9). TNF-α production was inhibited to a lesser extent than IL-1β, confirming the results shown in FIG. This is because (i) the inhibition of cytokine production by unfractionated HS shown in FIG. 2 was due to apo-A-1, and (ii) apo-A-1 Inhibition of activation has been shown, suggesting that antigen-specific and mitogen stimulation induce similar activators on T lymphocytes, albeit at different levels of expression. Furthermore, these results confirm that TNF-α and IL-1β were induced in PBMC only when monocytes were contacted with stimulated T cells.
[0299]
Recombinant mutant Apo-A-1 _Milano Indicates an inhibitory activity. To rule out the possibility that small amounts of contaminating proteins with similar physicochemical properties as Apo-A-1 may be inhibitors, recombinant mutants of Apo-A-1 (Professor G. Franceschini, Milano, Italy) (Kindly courtesy of the University of California) was also tested in the contact assay. Mutant protein, Apo-A-1 _Milano (Apo-A-1 _M ) Differs from wild-type apo-A-1 by a single Arg / Cys substitution, leading to the formation of disulfide-linked dimers (Calabrezi et al., 1994). Generally, Apo-A-1 _M In vitro and in vivo properties differ only slightly from wild type apo-A-1. A-1 _M / A-1 _M Particles are more efficient in promoting cholesterol efflux from cells than those containing apo-A-1, are less efficient for the lecithin cholesterol acetyltransferase (LCAT) enzyme, and adherence on endothelial cells. Efficiencies in inhibiting cytokine-induced expression of the molecule are equal (Franceschini et al., 1998). As shown in FIG. 10, the recombinant mutant apo-A-1 inhibits the production of IL-1β in contact activated monocytes with the same efficiency as purified commercial apo-A-1, Again, it was confirmed that apo-A-1 was an inhibitory factor.
[0300]
Fragments containing domains II and III of apo-A-1 show inhibitory activity. THP-I cells were obtained from 10% human serum, 100 [mu] g / ml apo-A-1, 100 [mu] g / ml apolipoprotein A-II, or a fragment containing 50 [mu] g / ml apo-A-1 domains II and III ( (DII / DIII) was activated by contact with the membrane of stimulated HUT-78 cells (HUTs). As shown in FIG. 11, DII / DIII inhibited the production of IL-1β and TNF-α by THP-1 cells.
[0301]
The results indicate an anti-inflammatory effect elicited by apo-A-1, a "negative" acute phase protein (Gabay et al., 1999, N. Engl. J. Med. 340: 562-569). Since monocyte activation by other stimuli (i.e., LPS and PMA) was typically not affected by the HS inhibitor, i.e., apo-A-1, this effect was specific for monocyte T cell signaling. It seems to be targeted. Furthermore, the membranes of stimulated HUT-78 cells treated with HS or HDL showed a lower ability to induce cytokines than untreated membranes, whereas HDL treatment of THP-1 cells had no noticeable effect. This demonstrates that the inhibitory effect was primarily directed to activators expressed on the surface of stimulated T cells. Although the mechanism of action of Apo-A-1 has not been fully elucidated and the present invention is not limited to any particular mechanism, the present results indicate that, according to some embodiments, Apo-A- 1 suggests that it may exert its effect by specifically preventing the interaction between the membrane activator of T cells and the respective receptor on monocytes.
[0302]
Example 2: Production of AFTI polypeptide
A. Bacterial expression
PCR is used to amplify a template DNA sequence encoding an AFTI polypeptide using primers corresponding to the 5 'and 3' ends of the sequence. The amplified DNA product may be modified to include a restriction enzyme site that allows for insertion into an expression vector. The PCR product is gel purified and inserted into an expression vector using standard recombinant DNA techniques. An exemplary vector, such as pAMG21 (ATCC No. 98113), containing the lux promoter and the gene encoding kanamycin resistance, is digested with BamHI and Ndel for directional cloning of the inserted DNA. The ligated mixture is transformed into an E. coli host strain by electroporation, and transformants are selected for kanamachine resistance. Plasmid DNA from the selected colonies is isolated and subjected to DNA sequencing to confirm the presence of the insert.
[0303]
The transformed host cells are incubated at 30 ° C. in 2 × YT medium containing 30 mg / ml kanamycin before induction. N- (3-oxohexanoyl) -dl-homoserine lactone was added to a final concentration of 30 ng / ml, followed by a 6 hour incubation at 30 ° C. or 37 ° C. to induce gene expression. AFTI polypeptide expression is assessed by centrifugation of the culture, resuspension and lysis of the bacterial pellet, and analysis of host cell proteins by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
[0304]
The inclusion bodies containing the AFTI polypeptide are purified as follows. Bacterial cells are pelleted by centrifugation and resuspended in water. The cell suspension is lysed by sonication and pelleted by centrifugation at 195,000 xg for 5-10 minutes. Discard the supernatant, wash the pellet and transfer to a homogenizer. The pellet is homogenized in 5 ml of Percoll solution (75% liquid Percoll, 0.15 M NaCl) until homogeneously suspended, then diluted and centrifuged at 21,600 × g for 30 minutes. The gradient fractions containing inclusion bodies are collected and pooled. The isolated inclusion bodies are analyzed by SDS-PAGE.
[0305]
A single band on an SDS polyacrylamide gel corresponding to the E. coli produced AFTI polypeptide was excised from the gel and essentially described by Matsudaira et al. Biol. Chem. , 262: 10-35 (1987).
[0306]
B. Production of mammalian cells
PCR is used to amplify a template DNA sequence encoding an AFTI polypeptide using primers corresponding to the 5 'and 3' ends of the sequence. The amplified DNA product may be modified to include a restriction enzyme site that allows for insertion into an expression vector. The PCR product is gel purified and inserted into an expression vector using standard recombinant DNA techniques. An exemplary expression vector containing the Epstein-Barr virus origin of replication, pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), may be used for expression of AFTI in 293-EBNA-1 (Epstein-Barr virus nuclear antigen) cells. The amplified and gel purified PCR product is ligated into the pCEP4 vector and lipofected into 293-EBNA cells. Transfected cells are selected in 100 mg / ml hygromycin and the resulting drug resistant culture is grown to confluence. The cells are then cultured for 72 hours in a serum-free medium. The conditioned medium is removed and AFTI polypeptide expression is analyzed by SDS-PAGE.
[0307]
AFTI polypeptide expression can be detected by silver staining. Alternatively, the AFTI polypeptide can be generated as a fusion protein with an epitope tag such as an IgG constant domain or a FLAG epitope, which can be detected by Western blot analysis using an antibody against the labeled peptide.
[0308]
AFTI polypeptides are excised from SDS-polyacrylamide gels, or AFTI fusion proteins are purified by affinity chromatography on epitope tags and subjected to N-terminal amino acid sequence analysis as described herein.
[0309]
Example 3: Generation of anti-AFTI polypeptide antibody
Antibodies to AFTI polypeptides can be obtained by immunizing with purified proteins or AFTI peptides produced by biological or chemical synthesis. Suitable procedures for making antibodies include those described in Hudson and Hay, "Practical Immunology," 2nd Edition, Blackwell Scientific Pulications (1980).
[0310]
In one procedure for the production of antibodies, an animal (typically a mouse or rabbit) is injected with an AFTI antigen (such as an AFTI polypeptide) and a hybridoma with sufficient serum titer as determined by ELISA is obtained. Select for production. The spleen of the immunized animal is collected and prepared as a single cell suspension from which splenocytes are collected. Splenocytes are fused to mouse myeloma cells (such as Sp2 / 0-Ag14 cells; ATCC No. CRL-1581) and incubated in DMEM with 200 IU / ml penicillin, 200 mg / ml streptomycin sulfate, and 4 mM L-glutamine. And then incubate in HAT selection medium (hypoxanthine; aminopterin; thymidine). After selection, tissue culture supernatant is harvested from each fusion well and tested for anti-AFTI antibody production by ELISA.
[0311]
To obtain anti-AFTI antibodies, such as immunizing transgenic mice harboring human Ig loci for the production of human antibodies, and screening synthetic antibody libraries such as those generated by mutagenesis of antibody variable domains An alternative procedure can be used.
[0312]
Although the present invention has been described in terms of a preferred embodiment, it is evident that variations and modifications will occur to those skilled in the art. It is therefore intended that the appended claims cover all such equivalent variations that fall within the scope of the invention as claimed.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1A: Amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) and polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of human apolipoprotein A-1. The Apo-A-1 polypeptide has a helical lipid binding domain (amino acid residues 44-65 and 220-241), a domain involved in lipoprotein-mediated cholesterol efflux from monocytes (amino acid residues 74-111), a receptor. Binding domain (amino acid residues 149-219), major antigen epitope domain (amino acid residues 99-120), hinge domain (amino acid residues 99-143), phylogenetic conserved domain (amino acid residues 66-120) ), And a domain (amino acid residues 90-111) involved in lectin-cholesterol acyltransferase activity. Apo-A-1 polypeptide has eight amphipathic helices (amino acid residues 44-65, 66-98, 99-120, 121-142, 143-164, 165-208, 209-219, 22-). 241), an N-terminal peptide (amino acid residues 1-43), and a C-terminal peptide (amino acid residues 242-243).
FIG. 1B: 18 kDa N-terminal fragment (amino acid residues 25 to 194, nucleotides 92-601), a fragment of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of AFTI.
FIG. 1C: A 13 kDa N-terminal fragment (amino acid residues 25 to 144, nucleotides 92-451), which is a fragment of the amino acid sequence of AFTI SEQ ID NO: 2.
FIG. 1D is a 13 kDa C-terminal fragment (amino acid residues 156-267, nucleotides 485-820), which is a fragment of the amino acid sequence of AFTI SEQ ID NO: 2.
FIG. 2. Human serum inhibits TNF-α and IL-1β production in PBMC stimulated with PHA. PBMC (4 × 10 ⁵ Cells / 200 μl / well) were stimulated with 1 μg / ml PHA in media containing FCS or HS. (A) TNF-α and IL-1β in the supernatant were measured after incubation for 48 hours; (B) Proliferation after 72 hours ( ³ H-thymidine incorporation) was measured.
FIG. 3. Inhibition of T cell signaling of monocytes and THP-1 cells by HS. (A) THP-1 cells were fixed and stimulated with T cells at a cell ratio of 8T lymphocytes / THP-1 cells in the presence of increasing doses of HS (HS, black symbols) or FCS (white symbols). For 48 hours. (B) THP-1 cells were fixed and stimulated with a cell ratio of 8HUT-78 cells / THP-1 cells in the presence of increasing doses of HS (black symbols) or lipoprotein at 10 μg / ml. Activation was performed for 48 hours with either saccharide (LPS) or 5 ng / ml PMA (open symbols). THP-1 cells (C and D) and monocytes (E and F) were activated for 48 hours by increasing doses of membrane isolated from stimulated HUT-78 cells in the presence or absence of 10% HS. TNF-α (C and E) and IL-1β (D and F) were measured in the culture supernatant. The results are expressed as mean ± SD, where n = 3 except for (B) and n = 7 in (B). In A and B, 100% represents IL-1β production after 48 hours of culture without inhibitors.
FIG. 4: Superdex 200 elution profile and SDS-PAGE analysis of continuous chromatographic fractionation of HS. (A) The inhibitory fractions eluted from Phenyl Sepharose HP were pooled, concentrated and subjected to gel filtration on Superdex 200 equilibrated in PBS. The column was assayed using a molecular weight marker kit for gel filtration chromatography (Sigma). Fractionation is performed for protein content (OD _280mm , Dotted line) and inhibitory activity (filled circles). (B) After each step the inhibitory fractions were pooled and loaded with a 10 μg protein aliquot per lane on a 10% polyacrylamide gel; (a) HS; (b) Blue-Sepharose® leak point (C) a pool of inhibitory fractions from Q Sepharose®; (d) a pool of inhibitory fractions from Phenyl Sepharose® HP; (e) inhibition from Superdex® 200; Pool of sex fractions; gel stained with Coomassie blue.
FIG. 5. Presence of inhibitory activity on protein fractionation of HDL. HS was fractionated by high-density centrifugation and the inhibitory activity of HDL and serum protein fraction was analyzed. The isolated HDL was further subjected to delipidation (defatted HDL) or proteolytic digestion with proteinase K (HDL treated with proteinase K). Fraction inhibition activity was compared to HS (whole serum). Final protein concentrations for total serum and serum proteins were 7 mg / ml (black columns), 3.5 mg / ml (grey columns), and 0.7 mg / ml (white columns). Final protein concentrations of HDL and defatted HDL were 0.2 mg / ml (black columns), 0.1 mg / ml (grey columns), and 0.02 mg / ml (white columns). The amount of proteinase K-treated HDL was evaluated according to the protein concentration before proteolysis and was similar to untreated HDL. The results represent the percentage of IL-1 or βTNF-α production without inhibitor (mean ± SD, n = 3).
FIG. 6. Analysis of HDL binding to cells. (A) Inhibition of T cell signaling by binding of HDL to the membranes of stimulated HUT-78 cells; membranes of stimulated HUT-78 cells (open columns), THP-1 cells (hatched columns), or both ( Black columns) were pre-incubated for 45 minutes on ice in the absence (-) or presence of FCS (10%), HS (10%) or HDL (0.32 mg / ml protein); after washing, treatment (hatched) Columns and black columns) and untreated (white columns) THP-1 cells were cultured in the presence of membranes of treated (white columns and black columns) or untreated (hatched columns) stimulated HUT-78 cells The production of TNF-α and IL-1β was measured in the culture supernatant cultured for 48 hours. Results are expressed as a percentage of the production measured without inhibitor as 100%, mean ± SD, n = 6. (BF) Binding of uncomplexed FITC to FITC-HDL (0.1 mg / ml) was determined by THP-1 cells (B), isolated human monocytes (C), unstimulated HUT-78 cells ( D) and stimulated HUT-78 cells (E) were evaluated by flow cytometry. FITC was used as a negative control. (F) Stimulation of FITC-HDL (10 μg / ml) HUT-78 in the presence or absence of purified anti-apo-A-1 antibody (100 μg / ml) (ATCC, Manassas, VA; catalog number HB-9570) Binding of cells to the membrane.
FIG. 7. Apo-A-1 inhibits TNF-α and IL-1β production in THP-1 cells activated by the membrane of stimulated HUT-78 cells. (A) THP-1 cells were activated by the membrane of stimulated HUT-78 cells in the presence of increasing concentrations of apo-A-1 purchased from Sigma (St. Louis, MO); after 48 hours, TNF-α and IL-1β were measured in the culture supernatant. The results represent the mean ± SD, n = 3. (B and C) THP-1 cells were activated by the membrane of stimulated HUT-78 cells in the presence of increasing concentrations of protein electroeluted from preparative SDS-PAGE of defatted HDL: (B) (M _r = 28,000 and (C) (M _r = 18,000. (D) THP-1 cells were isolated at increasing concentrations of apo-A-1 (M) separated by gel filtration on Superdex S75. _r = 28,000) in the presence of stimulated HUT-78 cell membranes. 48 hours later, TNF-α and IL-1β were measured in the culture supernatant. The results represent the mean ± SD, n = 3, 100% is the amount of cytokine produced without inhibitor. (E) Isolated fractions tested for inhibitory activity were analyzed for apo-A-1 content by Western blot; (a) 28,000 electroeluted bands, (b) 18,000 electroeluted bands. And (c) 28,000 proteins recovered from Superdex® S75 gel filtration.
FIG. 8. Apo-A-1 reduces steady state levels of TNF-α and IL-1β mRNA. (A and B) Autoradiogram of RNase protection assay. (A) Untreated (a) or stimulated HUT- in the presence or absence (ce) of apo-A-1 (200 μg / ml) added at various time points of THP-1 activation (ce) for 3 hours. TBE-1 cells (5 × 10 6) activated (be) by 78 cell membranes (200 μg protein / ml) ⁶ Cells / ml): c (0 h); d (1 h); and e (2 h). (B) Untreated (a) or stimulated T lymphocytes in the presence or absence (ce) of apo-A-1 (200 μg / ml) added at various time points of THP-1 activation (ce) for 1 hour (Be) monocytes (10 × 10 4) activated by sphere membrane (40 μg protein / ml) ⁶ Cells / ml): c (0 min); d (15 min); and e (30 min). (C and D) mRNA levels of activated THP-1 cells (B) or monocytes (C) without inhibitors, normalized to GAPDH mRNA = 1 densitometry, expressed as a percentage of 100%, Densitometric analysis of autoradiography A and B respectively. The results are representative of three different experiments.
FIG. 9. Apo-A-1 inhibits TNF-α and IL-1β in PBMC stimulated by PHA or tetanus toxoid (TT). PBMC 4 × 10 ⁵ Cells / 200 μg / well were stimulated with 1 μg / ml PHA (A and B) or 10 μg / ml TT (C and D) in the presence of the indicated doses of apo-A-1 and HDL.
FIG. 10 shows the inhibitory effect of recombinant human apo-A-1 Milano. THP-1 cells were subjected to serial dilution of human serum (HS), the presence of apolipoprotein A-1 from Sigma (starting concentration = 2 mg / ml) and recombinant apolipoprotein A-1 Milano (starting concentration = 2 mg / ml) Underneath, the membrane was stimulated with stimulated HUT-78 cells. Both apolipoproteins (purified and recombinant) display an inhibitory effect.
FIG. 11. Inhibition of contact-mediated activation of THP-1 cells by apo-A-II and fragments of apo-A-1. THP-1 cells were activated by stimulated HUT-78 cell membranes (HUT) in the presence of the indicated inhibitors. Apo-A-1, apo-A-II and fragments containing domains II and III of apo-A-1 inhibited the production of both IL-1β and TNF-α.

Claims

（ａ）配列番号１の残基７３から６０１に示すようなヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基２５から１９４に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１の残基７３から４５１に示すようなヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２の残基２５から１４４に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１の残基４８５から８２０に示すようなヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号２の残基２５から１１３に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号２の残基７３から１１３に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号２の残基１５６から２６７に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）中又は高ストリンジェンシー条件下で（ａ）から（ｆ）までの少なくとも１つの補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つヌクレオチド配列；及び
（ｊ）（ａ）から（ｈ）の少なくとも１つに相補的なヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列から本質的に成る単離核酸分子。(A) a nucleotide sequence as set forth in residues 73 to 601 of SEQ ID NO: 1;
(B) a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in residues 25 to 194 of SEQ ID NO: 2;
(C) a nucleotide sequence as set forth in residues 73 to 451 of SEQ ID NO: 1;
(D) a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in residues 25 to 144 of SEQ ID NO: 2;
(E) a nucleotide sequence as set forth in residues 485 to 820 of SEQ ID NO: 1;
(F) a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in residues 25 to 113 of SEQ ID NO: 2;
(G) a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in residues 73 to 113 of SEQ ID NO: 2;
(H) a nucleotide sequence encoding a polypeptide as set forth in residues 156 to 267 of SEQ ID NO: 2;
(I) a nucleotide sequence which hybridizes under moderate or high stringency conditions to at least one complement of (a) to (f), wherein the encoded polypeptide is as set forth in SEQ ID NO: 2 And (j) an isolated nucleic acid molecule consisting essentially of a nucleotide sequence selected from nucleotide sequences complementary to at least one of (a) to (h).

（ａ）基本的に、請求項１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配列であって、配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）請求項１に記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体又はスプライス変異体をコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５個のアミノ酸残基のポリペプチドをコードする（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つから選択されるヌクレオチド配列であって、ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つヌクレオチド配列；
（ｄ）少なくとも約１６個のヌクレオチドの断片を含む、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の少なくとも１つから選択されるヌクレオチド配列；及び
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列から本質的に成る単離核酸分子。(A) a nucleotide sequence consisting essentially of a nucleotide sequence that is at least about 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, or 99% identical to the nucleotide sequence of claim 1; A nucleotide sequence encoding a polypeptide having the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2;
(B) a nucleotide sequence encoding an allelic or splice variant of the nucleotide sequence of claim 1, wherein the encoded polypeptide has the activity of a polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2. ;
(C) a nucleotide sequence selected from at least one of (a) and (b), which encodes a polypeptide of at least about 25 amino acid residues, wherein the polypeptide is as set forth in SEQ ID NO: 2 A nucleotide sequence having the activity of
(D) a nucleotide sequence selected from at least one of (a), (b), and (c), comprising a fragment of at least about 16 nucleotides; and (e) (a), (b), or An isolated nucleic acid molecule consisting essentially of a nucleotide sequence selected from nucleotide sequences complementary to any of (c).

請求項１又は請求項２の核酸分子を含むベクター。A vector comprising the nucleic acid molecule according to claim 1 or 2.

請求項３のベクターを含む宿主細胞。A host cell comprising the vector of claim 3.

真核細胞である、請求項４の宿主細胞。5. The host cell of claim 4, which is a eukaryotic cell.

原核細胞である、請求項４の宿主細胞。5. The host cell of claim 4, which is a prokaryotic cell.

アポ−Ａ−１フラグメントＴ細胞活性化阻害因子様ポリペプチドを生成する方法であって、請求項５の宿主細胞を適当な条件下で培養してポリペプチドを発現させ、培養からポリペプチドを単離することを含む方法。A method for producing an apo-A-1 fragment T cell activation inhibitor-like polypeptide, comprising culturing the host cell of claim 5 under suitable conditions to express the polypeptide, and isolating the polypeptide from the culture. A method that includes releasing.

アポ−Ａ−１フラグメントＴ細胞活性化阻害因子様ポリペプチドを生成する方法であって、請求項６の宿主細胞を適当な条件下で培養してポリペプチドを発現させ、培養からポリペプチドを単離することを含む方法。A method for producing an apo-A-1 fragment T cell activation inhibitor-like polypeptide, comprising culturing the host cell of claim 6 under suitable conditions to express the polypeptide, and isolating the polypeptide from the culture. A method that includes releasing.

請求項７の方法によって生成されるポリペプチド。A polypeptide produced by the method of claim 7.

請求項８の方法によって生成されるポリペプチド。A polypeptide produced by the method of claim 8.

核酸分子が、ＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された天然アポＡ−１についてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、請求項７に記載の方法。8. The method of claim 7, wherein the nucleic acid molecule comprises a promoter DNA other than the promoter DNA for native apoA-1 operably linked to the DNA encoding the AFTI polypeptide.

核酸分子が、ＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された天然アポＡ−１についてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、請求項８に記載の方法。9. The method of claim 8, wherein the nucleic acid molecule comprises a promoter DNA other than the promoter DNA for native apoA-1 operably linked to DNA encoding the AFTI polypeptide.

ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムから成る群より選択されるコンピュータプログラムを用いてパーセント同一性を決定する、請求項２に記載の単離核酸分子。3. The isolated nucleic acid molecule of claim 2, wherein the percent identity is determined using a computer program selected from the group consisting of GAP, BLASTP, BLASTN, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit, and the Smith-Waterman algorithm.

化合物がＡＦＴＩポリペプチドの活性又は産生を阻害するかどうかを判定するための方法であって、請求項４に記載の細胞を化合物に暴露し、該細胞におけるＡＦＴＩ活性又は産生を測定することを含む方法。A method for determining whether a compound inhibits the activity or production of an AFTI polypeptide, comprising exposing the cells of claim 4 to a compound and measuring AFTI activity or production in said cells. Method.

基本的に、
（ａ）配列番号２の残基２５から１９４に示すようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の残基２５から１４４に示すようなアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２の残基１５６から２６７に示すようなアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２の残基２５から１１３に示すようなアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２の残基７５から１１３に示すようなアミノ酸配列；
（ｆ）コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、配列番号２のオーソローグ（直系遺伝子）についてのアミノ酸配列；
（ｇ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも約７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列；
（ｈ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも約２５個のアミノ酸残基を含む（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）の少なくとも１つに示すアミノ酸配列の断片；
（ｉ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、（ａ）から（ｆ）の少なくとも１つの対立遺伝子変異体又はスプライス変異体についてのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列から成る単離ポリペプチド。fundamentally,
(A) an amino acid sequence as set forth in residues 25 to 194 of SEQ ID NO: 2;
(B) an amino acid sequence as set forth in residues 25 to 144 of SEQ ID NO: 2;
(C) an amino acid sequence as set forth in residues 156 to 267 of SEQ ID NO: 2;
(D) an amino acid sequence as set forth in residues 25 to 113 of SEQ ID NO: 2;
(E) an amino acid sequence as set forth in residues 75 to 113 of SEQ ID NO: 2;
(F) an amino acid sequence of an ortholog of SEQ ID NO: 2 (a direct gene), wherein the encoded polypeptide has the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2;
(G) at least one amino acid sequence of (a), (b) or (c), wherein the polypeptide has the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2, and at least about 70, 80, 85, 90, 95 Amino acid sequences that are 96, 97, 98, or 99% identical;
(H) the polypeptide comprises at least about 25 amino acid residues having the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2, (a), (b), (c), (d), or (e). A fragment of the amino acid sequence of at least one of the following:
(I) from an amino acid sequence selected from the amino acid sequences of at least one allelic variant or splice variant of (a) to (f), wherein the polypeptide has the activity of the polypeptide as set forth in SEQ ID NO: 2; An isolated polypeptide comprising:

請求項２の核酸分子にコードされる単離ポリペプチド。An isolated polypeptide encoded by the nucleic acid molecule of claim 2.

ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムから成る群より選択されるコンピュータプログラムを用いてパーセント同一性を決定する、請求項１５に記載の単離ポリペプチド。16. The isolated polypeptide of claim 15, wherein the percent identity is determined using a computer program selected from the group consisting of GAP, BLASTP, BLASTN, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit, and the Smith-Waterman algorithm.

請求項１５に記載のポリペプチドで動物を免疫することによって産生される抗体。An antibody produced by immunizing an animal with the polypeptide of claim 15.

請求項１５に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片。An antibody or a fragment thereof that specifically binds to the polypeptide of claim 15.

モノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。19. The antibody according to claim 18, which is a monoclonal antibody.

請求項２０に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。A hybridoma that produces the monoclonal antibody according to claim 20.

ヒト化抗体である、請求項１８に記載の抗体。19. The antibody according to claim 18, which is a humanized antibody.

完全なヒト抗体又はその断片である、請求項１９に記載の抗体。20. The antibody of claim 19 which is a fully human antibody or a fragment thereof.

キメラ抗体又はその断片である、請求項１９に記載の抗体。The antibody according to claim 19, which is a chimeric antibody or a fragment thereof.

ＣＤＲ移植抗体又はその断片である、請求項１９に記載の抗体。20. The antibody of claim 19 which is a CDR-grafted antibody or a fragment thereof.

抗イディオタイプ抗体又はその断片である、請求項１９に記載の抗体。20. The antibody according to claim 19, which is an anti-idiotype antibody or a fragment thereof.

検出可能な標識に結合している、請求項１９に記載の抗体。20. The antibody of claim 19, wherein the antibody is conjugated to a detectable label.

ファージディスプレイ抗体又はその断片である、請求項１９に記載の抗体。20. The antibody of claim 19 which is a phage display antibody or a fragment thereof.

サンプル中のＡＦＴＩポリペプチドを検出する又はＡＦＴＩポリペプチドの量を測定する方法であって、サンプルを請求項１８に記載の抗体又は断片と接触させ、抗体−ポリペプチド相互作用を測定することを含む方法。A method for detecting an AFTI polypeptide or measuring the amount of an AFTI polypeptide in a sample, comprising contacting the sample with the antibody or fragment of claim 18 and measuring the antibody-polypeptide interaction. Method.

請求項１５に記載の少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する選択結合物質又はその断片。A selective binding substance or a fragment thereof that specifically binds to at least one polypeptide according to claim 15.

可変領域断片である、請求項３０に記載の選択結合物質。31. The selective binding agent of claim 30, which is a variable region fragment.

可変領域断片がＦａｂ又はＦａｂ’断片である、請求項３１に記載の選択結合物質。32. The selective binding agent according to claim 31, wherein the variable region fragment is a Fab or Fab 'fragment.

検出可能な標識に結合している、請求項３０に記載の選択結合物質。31. The selective binding agent of claim 30, wherein said selective binding agent is conjugated to a detectable label.

ＡＦＴＩポリペプチドの生物活性に拮抗する、請求項３０に記載の選択結合物質。31. The selective binding agent of claim 30, which antagonizes the biological activity of the AFTI polypeptide.

請求項３０に記載の選択結合物質の有効量を患者に投与することを含む、疾患、状態、又は障害を治療する、予防する、又は改善するための方法。31. A method for treating, preventing or ameliorating a disease, condition or disorder comprising administering to a patient an effective amount of a selective binding agent according to claim 30.

請求項１５に記載のポリペプチドと製薬上許容される製剤物質を含む組成物。A composition comprising the polypeptide of claim 15 and a pharmaceutically acceptable pharmaceutical substance.

請求項１６に記載のポリペプチドと製薬上許容される製剤物質を含む組成物。A composition comprising the polypeptide of claim 16 and a pharmaceutically acceptable pharmaceutical substance.

製薬上許容される製剤物質が、担体、アジュバント、溶解補助剤、安定剤、又は抗酸化薬の少なくとも１つを含む、請求項３６に記載の組成物。37. The composition of claim 36, wherein the pharmaceutically acceptable formulation substance comprises at least one of a carrier, adjuvant, solubilizer, stabilizer, or antioxidant.

製薬上許容される製剤物質が、担体、アジュバント、溶解補助剤、安定剤、又は抗酸化薬の少なくとも１つを含む、請求項３７に記載の組成物。38. The composition of claim 37, wherein the pharmaceutically acceptable formulation substance comprises at least one of a carrier, an adjuvant, a solubilizer, a stabilizer, or an antioxidant.

水溶性ポリマーで共有結合修飾された、請求項１５に記載のポリペプチド。The polypeptide according to claim 15, which is covalently modified with a water-soluble polymer.

水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル、及びポリビニルアルコールから選択される、請求項４０に記載のポリペプチド。The water-soluble polymer is selected from polyethylene glycol, monomethoxy-polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly- (N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer, polypropylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyol, and polyvinyl alcohol. 41. The polypeptide of claim 40, which is selected.

水溶性ポリマーで共有結合修飾された、請求項１６に記載のポリペプチド。17. The polypeptide of claim 16, covalently modified with a water-soluble polymer.

水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル、及びポリビニルアルコールから選択される、請求項４２に記載のポリペプチド。The water-soluble polymer is selected from polyethylene glycol, monomethoxy-polyethylene glycol, dextran, cellulose, poly- (N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, propylene glycol homopolymer, polypropylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyoxyethylated polyol, and polyvinyl alcohol. 43. The polypeptide of claim 42, which is selected.

請求項１に記載の核酸分子を含むウイルスベクター。A viral vector comprising the nucleic acid molecule according to claim 1.

請求項２に記載の核酸分子を含むウイルスベクター。A viral vector comprising the nucleic acid molecule according to claim 2.

請求項１５に記載のポリペプチドと非相同アミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。A fusion polypeptide comprising a heterologous amino acid sequence with the polypeptide of claim 15.

非相同アミノ酸配列がＩｇＧ定常ドメイン又はその断片である、請求項４６に記載の融合ポリペプチド。47. The fusion polypeptide of claim 46, wherein the heterologous amino acid sequence is an IgG constant domain or a fragment thereof.

請求項１６に記載のポリペプチドと非相同アミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。A fusion polypeptide comprising a heterologous amino acid sequence with the polypeptide of claim 16.

非相同アミノ酸配列がＩｇＧ定常ドメイン又はその断片である、請求項４８に記載の融合ポリペプチド。49. The fusion polypeptide of claim 48, wherein the heterologous amino acid sequence is an IgG constant domain or a fragment thereof.

対象者において炎症を軽減するための方法であって、請求項１５に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。17. A method for reducing inflammation in a subject, comprising administering to the subject the polypeptide of claim 15.

対象者において炎症を軽減するための方法であって、請求項１６に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。17. A method for reducing inflammation in a subject, comprising administering to the subject the polypeptide of claim 16.

対象者においてＩＬ−１βの分泌を低下させるための方法であって、請求項１５に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。17. A method for reducing IL-1β secretion in a subject, comprising administering to the subject the polypeptide of claim 15.

対象者においてＩＬ−１βの分泌を低下させるための方法であって、請求項１６に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。17. A method for reducing IL-1β secretion in a subject, comprising administering to the subject the polypeptide of claim 16.

対象者においてＴＮＦ−αの分泌を低下させるための方法であって、請求項１５に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。16. A method for reducing TNF- [alpha] secretion in a subject, comprising administering to the subject the polypeptide of claim 15.

対象者においてＴＮＦ−αの分泌を低下させるための方法であって、請求項１６に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。17. A method for reducing TNF- [alpha] secretion in a subject, comprising administering to the subject the polypeptide of claim 16.

ＩＬ−１が仲介する疾患を治療するための方法であって、請求項１５に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。17. A method for treating an IL-1 mediated disease, comprising administering to the subject a polypeptide according to claim 15.

ＩＬ−１が仲介する疾患を治療するための方法であって、請求項１６に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。17. A method for treating an IL-1 mediated disease comprising administering to the subject a polypeptide according to claim 16.

ＴＮＦ−αが仲介する疾患を治療するための方法であって、請求項１５に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。A method for treating a TNF-α-mediated disease, comprising administering to the subject the polypeptide of claim 15.

単球の活性化に関わる医学的状態を治療する、予防する、又は改善するための方法であって、（ａ）アポ−Ａ−１、（ｂ）アポ−Ａ−１フラグメントＴ細胞活性化阻害因子（ＡＦＴＩ）、及び（ｃ）配列番号２を含む融合タンパク質の少なくとも１つから選択される分子を対象者に投与することを含む方法。A method for treating, preventing or ameliorating a medical condition associated with monocyte activation, comprising: (a) apo-A-1, (b) inhibition of apo-A-1 fragment T cell activation. A method comprising administering to a subject a molecule selected from factor (AFTI) and (c) at least one of a fusion protein comprising SEQ ID NO: 2.

ＡＦＴＩが請求項１５に記載のポリペプチドである、請求項５９に記載の方法。60. The method of claim 59, wherein AFTI is the polypeptide of claim 15.

ＡＦＴＩが請求項１６に記載のポリペプチドである、請求項５９に記載の方法。60. The method of claim 59, wherein AFTI is the polypeptide of claim 16.