JP2017165652A - Novel anti-human ox40 ligand antibody, and anti-influenza agent comprising the same - Google Patents

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an agent which can treat influenza by a new mechanism of inhibiting the intracellular attachment of influenza virus.SOLUTION: An anti-human OX40L antibody specifically binds to a region comprising 90-th asparagine of human OX40L.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、抗インフルエンザ薬、抗インフルエンザ薬に有用な抗体に関する。   The present invention relates to anti-influenza drugs and antibodies useful for anti-influenza drugs.

インフルエンザ感染症は毎冬流行する頻度の高い疾患である。その多くは自然に軽快するが、時に重症の肺炎を合併する事が知られている。しかし、現在抗インフルエンザの薬の治療効果は肺炎においては限定的であり、新規の治療薬が求められている。インフルエンザ感染症の重症化には気道上皮細胞へのウイルスの吸着が重要であり、これにはインフルエンザ受容体であるα-2,6-シアル酸が上皮細胞の糖タンパク質に糖付加される事が必要である。近年、重症化の一因として、 下気道の上皮細胞へのインフルエンザ受容体の発現・分布の重要性が報告された。しかし、細気管支領域においては、どの細胞がインフルエンザ受容体を有し、どの糖タンパク質が受容体として機能するのかに関して十分に分かっていない。   Influenza infection is a common disease that occurs every winter. Many of them relieve spontaneously, but are sometimes known to be associated with severe pneumonia. However, the therapeutic effects of anti-influenza drugs are currently limited in pneumonia, and new therapeutic drugs are being sought. Adsorption of viruses to airway epithelial cells is important for the severity of influenza infection, and this involves the addition of α-2,6-sialic acid, an influenza receptor, to glycoproteins of epithelial cells. is necessary. In recent years, the importance of the expression and distribution of influenza receptors in epithelial cells of the lower respiratory tract has been reported as a cause of the severity. However, in the bronchiole region, it is not fully known which cells have influenza receptors and which glycoproteins function as receptors.

Thompson WW, Shay DK, Weintraub E, et al. Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the United States. JAMA : the journal of the American Medical Association. 2003;289(2):179-86.Thompson WW, Shay DK, Weintraub E, et al. Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the United States.JAMA: the journal of the American Medical Association. 2003; 289 (2): 179-86. T Thompson WW, Shay DK, Weintraub E, et al. Influenza-associated hospitalizations in the United States. JAMA : the journal of the American Medical Association. 2004;292(11):1333-40.T Thompson WW, Shay DK, Weintraub E, et al. Influenza-associated hospitalizations in the United States.JAMA: the journal of the American Medical Association. 2004; 292 (11): 1333-40.

本発明が解決すべき課題は、インフルエンザウイルスの細胞内への付着を抑制するという新たな機構でインフルエンザを治療し得る薬剤を提供することである。   The problem to be solved by the present invention is to provide a drug capable of treating influenza by a new mechanism of suppressing attachment of influenza virus into cells.

かかる状況の下、本発明者らは、OX40リガンド(以下OX40L)の９０位のアスパラギンへのシアル酸の糖付加により、インフルエンザウイルスの細胞内感染を増加させることを見出した。   Under such circumstances, the present inventors have found that addition of sialic acid to asparagine at position 90 of OX40 ligand (hereinafter referred to as OX40L) increases intracellular infection of influenza virus.

具体的には、まず、OX40LはTNF super familyに含まれ、 23個のアミノ酸の細胞内ドメインと133個のアミノ酸の細胞外ドメインよりなる糖タンパク質である（参考文献１）。
OX40Lは以下の名称で呼ばれることもある：
tumor necrosis factor ligand superfamily member 4；
tax-transcriptionally activated glycoprotein 1 (34kD) ；
OX40 antigen ligand；
CD134 ligand；
OX40 ligand (OX40L) ；
glycoprotein Gp34；
TAX transcriptionally-activated glycoprotein 1。
OX40Lは恒常的にはほとんど発現していないが、外来抗原を認識した際に炎症性サイトカインに誘導され、樹状細胞・ランゲルハンス細胞・マクロファージ・Natural Killer細胞などの血球系細胞に発現が誘導される（参考文献１〜３）。また、近年、血管内皮細胞・平滑筋細胞などの非血球系の細胞でのOX40Lの発現が報告され、 生理的な側面において非血球系細胞と血球系細胞が関与している事が示唆されている（参考文献４〜６）。 Specifically, OX40L is a glycoprotein that is contained in the TNF super family and consists of an intracellular domain of 23 amino acids and an extracellular domain of 133 amino acids (Reference 1).
OX40L may also be called:
tumor necrosis factor ligand superfamily member 4;
tax-transcriptionally activated glycoprotein 1 (34kD);
OX40 antigen ligand;
CD134 ligand;
OX40 ligand (OX40L);
glycoprotein Gp34;
TAX transcriptionally-activated glycoprotein 1.
OX40L is hardly constitutively expressed, but is induced by inflammatory cytokines when foreign antigens are recognized, and expression is induced in blood cells such as dendritic cells, Langerhans cells, macrophages, and Natural Killer cells (References 1-3). In recent years, the expression of OX40L in non-hemocytic cells such as vascular endothelial cells and smooth muscle cells has been reported, suggesting that non-hemocytic cells and hematopoietic cells are involved in physiological aspects. (References 4-6).

一方、OX40Lの受容体であるOX40は、主に活性型T細胞に発現し、T細胞の増殖と生存に関与する事が知られている（参考文献１、２）。インフルエンザモデルにおいて、 OX40の抑制はOX40L-OX40機能を抑制し、T細胞の浸潤を抑制する事で肺の炎症を軽減すると共に、マウスのインフルエンザ肺炎の症状、体重減少を抑制したと報告されている（参考文献７、８）。   On the other hand, OX40, which is a receptor for OX40L, is mainly expressed on activated T cells and is known to be involved in T cell proliferation and survival (Reference Documents 1 and 2). In the influenza model, suppression of OX40 has been reported to suppress OX40L-OX40 function, reduce T-cell infiltration, reduce lung inflammation, and suppress influenza pneumonia symptoms and weight loss in mice. (References 7 and 8).

インフルエンザ肺炎の重症化の機序に関しては、インフルエンザウイルス・サイトカイン・プロテアーゼの3つの因子のサイクルに依存すると言われている（参考文献９）。インフルエンザウイルスの上皮細胞への感染は感染部位への炎症細胞の浸潤を誘導する一方で、過剰なサイトカインの産生を伴うプロテアーゼの過剰産生は、肺炎の重症化に関与する事が知られている（参考文献１０〜１２）。   It is said that the mechanism of the severity of influenza pneumonia depends on the cycle of three factors of influenza virus, cytokine and protease (Reference 9). While infection of epithelial cells with influenza virus induces infiltration of inflammatory cells at the site of infection, overproduction of proteases accompanied by production of excessive cytokines is known to contribute to the severity of pneumonia ( References 10-12).

従って、ＯＸ４０は、インフルエンザ肺炎の重症化の機序のうち、宿主の過剰免疫に関与する分子として報告されている（参考文献７、８）。一方OX40Lについては、インフルエンザ肺炎の重症化との関連性は報告されていない。上記のような状況の下、本発明者らは、OX40Lがインフルエンザ肺炎の重症化に対しＯＸ４０よりも強い影響をもたらすこと、及びＯＸ４０で報告された宿主の過剰免疫とは全く異なる機構で働くこと、すなわちインフルエンザウイルスの感染自体に関連することを見出した。さらに本発明者らは、上記新たな知見に基づき鋭意研究した結果、インフルエンザウイルスに寄与しているシアル酸の位置がOX40Lの９０位のアスパラギンであることを見出した。本発明はかかる新規の知見に基づくものである。   Therefore, OX40 has been reported as a molecule involved in host hyperimmunity among the mechanisms of the severity of influenza pneumonia (Reference Documents 7 and 8). On the other hand, OX40L has not been reported to be associated with the severity of influenza pneumonia. Under the circumstances described above, the present inventors have shown that OX40L has a stronger effect than OX40 on the severity of influenza pneumonia and that it works by a mechanism that is completely different from the host hyperimmunity reported in OX40. That is, it was found to be related to the influenza virus infection itself. Furthermore, as a result of intensive studies based on the above-mentioned new findings, the present inventors have found that the position of sialic acid contributing to influenza virus is asparagine at position 90 of OX40L. The present invention is based on such novel findings.

参考文献１：Croft M. Annual review of immunology. 2010;28:57-78.
参考文献２： Ishii N, Takahashi T, Soroosh P, et al. Advances in immunology. 2010;105:63-98.
参考文献３： Watts TH. Annual review of immunology. 2005;23:23-68.
参考文献４： Imura A, Hori T, Imada K, et al. The Journal of experimental medicine. 1996;183(5):2185-95.
参考文献５： Burgess JK, Carlin S, Pack RA, et al. The Journal of allergy and clinical immunology. 2004;113(4):683-9.
参考文献６： Siddiqui S, Mistry V, Doe C, et al. Chest. 2010;137(4):797-804.
参考文献７： Kopf M, Ruedl C, Schmitz N, et al. OX40-deficient mice are defective in Th cell proliferation but are competent in generating B cell and CTL Responses after virus infection. Immunity. 1999;11(6):699-708.
参考文献８： Humphreys IR, Walzl G, Edwards L, et al. A critical role for OX40 in T cell-mediated immunopathology during lung viral infection. The Journal of experimental medicine. 2003;198(8):1237-42.
参考文献９： Wang S, Le TQ, Kurihara N, et al. Influenza virus-cytokine-protease cycle in the pathogenesis of vascular hyperpermeability in severe influenza. The Journal of infectious diseases. 2010;202(7):991-1001.
参考文献１０： Braciale TJ, Sun J, Kim TS. Regulating the adaptive immune response to respiratory virus infection. Nature reviews Immunology. 2012;12(4):295-305.
参考文献１１： Kim TS, Sun J, Braciale TJ. T cell responses during influenza infection: getting and keeping control. Trends in immunology. 2011;32(5):225-31.
参考文献１２： Damjanovic D, Small CL, Jeyanathan M, et al. Immunopathology in influenza virus infection: uncoupling the friend from foe. Clinical immunology. 2012;144(1):57-69. Reference 1: Croft M. Annual review of immunology. 2010; 28: 57-78.
Reference 2: Ishii N, Takahashi T, Soroosh P, et al. Advances in immunology. 2010; 105: 63-98.
Reference 3: Watts TH. Annual review of immunology. 2005; 23: 23-68.
Reference 4: Imura A, Hori T, Imada K, et al. The Journal of experimental medicine. 1996; 183 (5): 2185-95.
Reference 5: Burgess JK, Carlin S, Pack RA, et al. The Journal of allergy and clinical immunology. 2004; 113 (4): 683-9.
Reference 6: Siddiqui S, Mistry V, Doe C, et al. Chest. 2010; 137 (4): 797-804.
Reference 7: Kopf M, Ruedl C, Schmitz N, et al. OX40-deficient mice are defective in Th cell proliferation but are competent in generating B cell and CTL Responses after virus infection. Immunity. 1999; 11 (6): 699 -708.
Reference 8: Humphreys IR, Walzl G, Edwards L, et al. A critical role for OX40 in T cell-mediated immunopathology during lung viral infection. The Journal of experimental medicine. 2003; 198 (8): 1237-42.
Reference 9: Wang S, Le TQ, Kurihara N, et al. Influenza virus-cytokine-protease cycle in the pathogenesis of vascular hyperpermeability in severe influenza. The Journal of infectious diseases. 2010; 202 (7): 991-1001.
Reference 10: Braciale TJ, Sun J, Kim TS. Regulating the adaptive immune response to respiratory virus infection. Nature reviews Immunology. 2012; 12 (4): 295-305.
Reference 11: Kim TS, Sun J, Braciale TJ. T cell responses during influenza infection: getting and keeping control. Trends in immunology. 2011; 32 (5): 225-31.
Reference 12: Damjanovic D, Small CL, Jeyanathan M, et al. Immunopathology in influenza virus infection: uncoupling the friend from foe. Clinical immunology. 2012; 144 (1): 57-69.

本発明によれば、インフルエンザウイルスの細胞内への付着を抑制するという新たな機構でインフルエンザを治療することができる。   According to the present invention, influenza can be treated by a new mechanism of suppressing attachment of influenza virus to cells.

参考例１の試験結果を示す。The test result of the reference example 1 is shown. 参考例２の試験結果を示す。The test result of the reference example 2 is shown. 参考例３の試験結果を示す。The test result of the reference example 3 is shown. 参考例４及び５の試験結果を示す。The test results of Reference Examples 4 and 5 are shown. 参考例６の試験結果を示す。The test result of the reference example 6 is shown. 参考例６の試験結果を示す。The test result of the reference example 6 is shown. 参考例７の試験結果を示す。The test result of the reference example 7 is shown. 参考例８の試験結果を示す。The test result of the reference example 8 is shown. 参考例９の試験結果を示す。The test result of the reference example 9 is shown. 参考例１０の試験結果を示す。The test result of the reference example 10 is shown. 参考例１１の試験結果を示す。The test result of the reference example 11 is shown. 実施例１の試験結果を示す。The test result of Example 1 is shown. 実施例２の試験結果を示す。The test result of Example 2 is shown. 参考例１２の試験結果を示す。The test result of the reference example 12 is shown. 実施例３の試験結果を示す。The test result of Example 3 is shown. 実施例４の試験結果を示す。The test result of Example 4 is shown. 実施例５の試験結果を示す。The test result of Example 5 is shown. 実施例６の試験結果を示す。The test result of Example 6 is shown. 実施例８の試験結果を示す。The test result of Example 8 is shown.

本発明において、「タンパク質」及び「ペプチド」は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含む意味で用いられる。また、本明細書において、「タンパク質」及び「ペプチド」は、特に言及しない限り、糖鎖などによって修飾されているタンパク質及び非修飾のタンパク質の両方を包含するものとする。このことは、タンパク質であることが明記されていないタンパク質についても同様である。   In the present invention, “protein” and “peptide” are used to include oligopeptides and polypeptides. In the present specification, “protein” and “peptide” include both a protein modified with a sugar chain and an unmodified protein unless otherwise specified. The same applies to proteins that are not specified as proteins.

抗体
本発明は、ヒトＯＸ４０Ｌのうち、９０番目のアスパラギンを含む領域に特異的に結合する抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体を提供する。 Antibody The present invention provides an anti-human OX40L antibody that specifically binds to a region containing 90th asparagine in human OX40L.

本発明において、ヒトＯＸ４０Ｌとは、前述した特徴を有するタンパク質であり、例えば、ＮＣＢＩデータベースにアクセス番号NP_003317.1で記載されているもの、より具体的には下記のアミノ酸配列（配列番号１）を有するものが挙げられる：
mervqpleen vgnaarprfe rnklllvasv iqglglllcf tyiclhfsal qvshrypriq
sikvqfteyk kekgfiltsq kedeimkvqn nsviincdgf ylislkgyfs qevnislhyq
kdeeplfqlk kvrsvnslmv asltykdkvy lnvttdntsl ddfhvnggel ilihqnpgef
cvl。 In the present invention, human OX40L is a protein having the characteristics described above. For example, the protein described in the NCBI database with access number NP_003317.1, more specifically, the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) What you have:
mervqpleen vgnaarprfe rnklllvasv iqglglllcf tyiclhfsal qvshrypriq
sikvqfteyk kekgfiltsq kedeimkvqn nsviincdgf ylislkgyfs qevnislhyq
kdeeplfqlk kvrsvnslmv asltykdkvy lnvttdntsl ddfhvnggel ilihqnpgef
cvl.

本発明に係る抗体は、ヒトＯＸ４０リガンドのアミノ酸配列のうち、９０位のアスパラギンを含む領域に特異的に結合する。   The antibody according to the present invention specifically binds to a region containing asparagine at position 90 in the amino acid sequence of human OX40 ligand.

本発明に係る抗体が上記に示すヒトＯＸ４０Ｌ由来のアミノ酸配列の領域に特異的に結合することは、公知の方法で可視化することができる。例えば、試験管内の試料を対象とするイムノアッセイ法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）、免疫電気泳動法（例えばウェスタンブロット法）、および組織または細胞を対象とする免疫組織化学などが例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。可視化にあたっては、本発明の抗体が蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチアネート）、放射性同位体（例えば、ヨウ素１２５）、酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシターゼ）、その他のタンパク質（例えば、アビジン）などの分子によって標識化されていてもよい。あるいは、本発明の抗体を特異的に認識する二次抗体を用いてもよい。    The specific binding of the antibody according to the present invention to the region of the amino acid sequence derived from human OX40L described above can be visualized by a known method. Examples include immunoassay methods (for example, ELISA method) for samples in vitro, immunoelectrophoresis methods (for example, Western blot method), and immunohistochemistry for tissues or cells. It is not limited to. For visualization, the antibody of the present invention is a fluorescent substance (for example, fluorescein isothiocyanate), a radioisotope (for example, iodine 125), an enzyme (for example, alkaline phosphatase, horseradish peroxidase), and other proteins (for example, avidin). It may be labeled with a molecule such as Alternatively, a secondary antibody that specifically recognizes the antibody of the present invention may be used.

本発明に係る抗体のうち、ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸配列のうち、５７〜１２０位の領域に特異的に結合するものが好ましく、５７〜１１３位の領域に特異的に結合するものが好ましい。   Of the amino acid sequences of human OX40L, among the antibodies according to the present invention, those that specifically bind to the region at positions 57 to 120 are preferred, and those that specifically bind to the region at positions 57 to 113 are preferred.

本発明の抗体としては、ヒトＯＸ４０Ｌの９０位のアスパラギンをアラニンに変換したペプチドに対し結合能が低下するものが好ましい。例えば、野生型のヒトＯＸ４０Ｌに対する結合能よりも９０位のアスパラギン→アラニンへの変換ペプチドに対する結合能の方が低い抗体が挙げられ、９０位のアスパラギン→アラニンへの変換ペプチドに対する結合能が、野生型のヒトＯＸ４０Ｌに対する結合能の７０％以下の抗体が好ましく、野生型のヒトＯＸ４０Ｌに対する結合能の５０％以下の抗体がより好ましい。ここで、ヒトＯＸ４０Ｌに対する結合能は、実施例３の方法で測定可能である。   As the antibody of the present invention, an antibody whose binding ability decreases with respect to a peptide obtained by converting asparagine at position 90 of human OX40L into alanine is preferable. For example, an antibody having a lower binding ability to the 90-position asparagine → alanine conversion peptide than the binding ability to wild-type human OX40L can be mentioned. An antibody having 70% or less of the binding ability to human OX40L of the type is preferred, and an antibody having 50% or less of the binding ability to wild-type human OX40L is more preferred. Here, the binding ability to human OX40L can be measured by the method of Example 3.

本発明にかかる抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体は、典型的には、軽鎖及び重鎖を含み、該軽鎖は、フレームワーク領域（ＦＲ）１、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含み、該重鎖が、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む構造を有する。   The anti-human OX40L antibody according to the present invention typically comprises a light chain and a heavy chain, and the light chain comprises a framework region (FR) 1, a complementarity determining region (CDR) 1, FR2, CDR2, FR3. , CDR3 and FR4, and the heavy chain has a structure including FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4.

本発明の抗体は、上記に示すヒトＯＸ４０Ｌ由来のアミノ酸配列の領域と特異的に結合できる限りその免疫グロブリンクラスについては限定されるものではなく、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹなどが挙げられる。さらに、そのサブクラスも制限されない。好ましくは、ＩｇＧである。   The antibody of the present invention is not limited in its immunoglobulin class as long as it can specifically bind to the above-mentioned amino acid sequence region derived from human OX40L. For example, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY, etc. Is mentioned. Furthermore, the subclass is not limited. Preferably, it is IgG.

本発明の抗体は、抗体を産生しうる哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ）または鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ）由来である。   The antibodies of the present invention are derived from mammals (eg, humans, mice, rats, rabbits, goats, sheep) or birds (eg, chickens, ostriches) that can produce antibodies.

本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。さらには、モノクローナル抗体のうち、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。ここで、キメラ抗体およびヒト化抗体とは、免疫グロブリンタンパク質のうち、抗原と結合可能な部位以外がヒト由来である抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト由来の抗体、または完全なヒト由来の免疫グロブリン遺伝子を有するヒト抗体産生マウス由来である抗体を指す。キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体は、ヒトにおける免疫原性が低く、抗体を医療製剤などに用いるに当たって有用である。従って、本発明の抗体を医療製剤などに用いる場合にあっては、モノクローナル抗体が好ましく、ヒト化抗体またはヒト抗体が特に好ましい。   The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Furthermore, among monoclonal antibodies, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a human antibody may be used. Here, the chimeric antibody and the humanized antibody refer to an antibody derived from a human other than a site capable of binding to an antigen among immunoglobulin proteins. A human antibody refers to a human-derived antibody or an antibody derived from a human antibody-producing mouse having a complete human-derived immunoglobulin gene. Chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies have low immunogenicity in humans and are useful in using antibodies in medical preparations and the like. Therefore, when the antibody of the present invention is used for medical preparations, monoclonal antibodies are preferable, and humanized antibodies or human antibodies are particularly preferable.

本発明の抗体は、免疫グロブリンタンパク質全長であっても、抗原と結合可能な部位を含むそれらの断片（フラグメント）であってもよい。また、抗体を含む組成物、例えば抗血清などであってもよい。   The antibody of the present invention may be a full-length immunoglobulin protein or a fragment thereof containing a site capable of binding to an antigen. It may also be a composition containing an antibody, such as antiserum.

本発明の抗体は、抗原を免疫動物に投与することで作製することができる。抗原としては、後述する本発明のヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープを用いることができる。抗原を免疫動物に投与する場合にあっては、ペプチドは分子量が小さく、免疫応答を十分に起こせない場合があるため、ペプチドを適当なタンパク質（例えば、アルブミン、サイログロブリンヘモシアニン等）に結合させて抗原として用いてもよい。   The antibody of the present invention can be prepared by administering an antigen to an immunized animal. As the antigen, the human OX40L peptide epitope of the present invention described later can be used. When an antigen is administered to an immunized animal, since the peptide has a small molecular weight and may not cause an immune response sufficiently, the peptide is bound to an appropriate protein (eg, albumin, thyroglobulin hemocyanin, etc.) It may be used as

あるいは、多様な抗体またはその断片を産出しうる細胞またはファージなどのライブラリから、抗原と結合する抗体またはその断片を産出するものを探索することで、本発明の抗体を入手することもできる。この場合、抗原としては、後述する本発明のヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープを用いることができる。   Alternatively, the antibody of the present invention can also be obtained by searching a library such as a cell or phage capable of producing various antibodies or fragments thereof for those that produce an antibody or fragment thereof that binds to an antigen. In this case, the human OX40L peptide epitope of the present invention described later can be used as the antigen.

抗原として用いるペプチドの入手方法は、特に制限されず公知の方法によることができ、例えば天然由来、化学合成、無細胞系合成、組換えペプチドであってもよい。   The method for obtaining a peptide used as an antigen is not particularly limited, and can be a known method. For example, it may be naturally derived, chemically synthesized, cell-free synthesized or recombinant peptide.

一般的な抗体の作製方法については、例えば、Harlowらの「Using Antibodies : A laboratory manual」(Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998))、岩崎らの「単クローン抗体 ハイブリドーマとELISA,講談社(1991)」などに記載されている。以下、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびヒト化抗体の各抗体の作製方法について簡単に説明する。   For general antibody production methods, for example, Harlow et al., `` Using Antibodies: A laboratory manual '' (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)), Iwasaki et al., `` Monoclonal antibody hybridomas and ELISA, Kodansha ( 1991) ". Hereinafter, a method for producing each of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a humanized antibody will be briefly described.

（１）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、免疫動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ）を通常の方法により免疫し、血清を調製し、抗血清から抗体を精製することにより得ることができる。免疫は、例えば、免原溶液を等量のフロイントの完全アジュバント又は不完全アジュバントと乳化混合したものを接種（初回免疫）し、以後２〜４週間の間隔で数回免疫することによって行うことができる。抗血清からのポリクローナル抗体の精製は、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー等により行うことができる。 (1) Polyclonal antibody A polyclonal antibody is obtained by immunizing an immunized animal (for example, mouse, rat, rabbit, chicken, goat, sheep) by a usual method, preparing serum, and purifying the antibody from antiserum. Can do. Immunization can be performed, for example, by inoculating an immunogen solution with an equal volume of Freund's complete or incomplete adjuvant in an emulsified mixture (primary immunization) and then immunizing several times at intervals of 2 to 4 weeks. it can. Purification of the polyclonal antibody from the antiserum can be performed by DEAE ion exchange chromatography or protein G affinity chromatography.

（２）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを調製し、当該ハイブリドーマが産生した抗体を精製することで作製できる。または、ファージディスプレイ法、すなわち、多様な抗体または抗体断片を発現するファージライブラリより、抗原に対して特異的に結合する抗体または抗体断片を探索する方法によって作製することもできる。 (2) Monoclonal antibody A monoclonal antibody can be prepared by preparing a hybridoma producing a monoclonal antibody and purifying the antibody produced by the hybridoma. Alternatively, it can also be prepared by a phage display method, that is, a method of searching for an antibody or antibody fragment that specifically binds to an antigen from a phage library that expresses various antibodies or antibody fragments.

ハイブリドーマを分離する方法は、自体公知であり（例えば、Kohlerら, Nature, 256: 495 (1975)など）、例えば、以下の方法により得ることができる。最終免疫して数日後の免疫動物（例えば、マウス）から脾臓を無菌的に摘出し、脾臓から脾臓細胞を調製する。脾臓細胞は、ミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とともに、細胞融合工程に用いる。ミエローマ細胞としては例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などを使用することができ、細胞融合の方法としては、例えばＰＥＧ等の融合促進剤を含む培地中で、脾臓細胞とミエローマ細胞とを、常法の混合比率（約１／５〜１／１０程度の割合）で混合することにより行うことができる。融合後、選択用培地（例えば、ＨＡＴ培地）を用いて、ハイブリドーマのみを増殖させる。それらの内、培養上清中に目的のモノクローナル抗体を分泌しているハイブリドーマは、例えば、培養上清とヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープとの反応性を酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）でスクリーニングすることによって確認し、選択することができる。   Methods for separating hybridomas are known per se (for example, Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)) and can be obtained, for example, by the following method. The spleen is aseptically removed from the immunized animal (eg, mouse) several days after the final immunization, and spleen cells are prepared from the spleen. Spleen cells are used in the cell fusion step together with myeloma cells (myeloma cells). For example, NS-1, P3U1, SP2 / 0, etc. can be used as myeloma cells. As a method of cell fusion, for example, spleen cells and myeloma cells are mixed in a medium containing a fusion promoter such as PEG. It can be carried out by mixing at a conventional mixing ratio (a ratio of about 1/5 to 1/10). After the fusion, only the hybridoma is grown using a selection medium (for example, HAT medium). Among them, hybridomas secreting the target monoclonal antibody in the culture supernatant are confirmed, for example, by screening the reactivity of the culture supernatant with human OX40L peptide epitope by enzyme-linked immunoassay (ELISA) And can choose.

ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体は、これを培養することにより、容易に調製することができる。培養は適切な培地中（例えば、１０％ウシ胎児血清を追加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ））で、あるいは生体内（例えば、マウスの腹腔中）で行うことができる。培養上清、あるいは腹水などを出発材料として、抗体を精製することもできる。抗体の精製には、タンパク質の精製に一般的な方法、例えば硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、プロテインＡもしくはプロテインＧ結合ポリマー等を用いるアフィニティークロマトグラフィー、または透析等の方法を適宜組み合わせて用いることができる。   The monoclonal antibody produced by the hybridoma can be easily prepared by culturing it. The culture can be performed in an appropriate medium (for example, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum) or in vivo (for example, in the peritoneal cavity of a mouse). The antibody can also be purified using the culture supernatant or ascites as a starting material. For antibody purification, a general method for protein purification, such as ammonium sulfate salting-out, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography using protein A or protein G binding polymer, or dialysis, is used. They can be used in appropriate combinations.

ファージディスプレイ法も自体公知であるが（例えば、Clacksonら, Nature 352:624-8(1991)等）、以下に簡単に説明する。あらかじめ作製した多様な抗体の抗原認識部位を提示するファージライブラリから、ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープと結合する抗原認識部位を提示するファージを選択する。選択されたファージが提示する抗原認識部位をそのまま用いても良いし、遺伝子工学的手法によって完全長の抗体を産出可能なＣＨＯ細胞などに組み込むことで、完全長の抗体を得ることもできる。   The phage display method is also known per se (for example, Clackson et al., Nature 352: 624-8 (1991)), and is briefly described below. A phage that displays an antigen recognition site that binds to a human OX40L peptide epitope is selected from a phage library that displays antigen recognition sites of various antibodies prepared in advance. The antigen recognition site displayed by the selected phage may be used as it is, or a full-length antibody can be obtained by incorporating the full-length antibody into a CHO cell capable of producing the full-length antibody by a genetic engineering technique.

（３）ヒト化抗体、ヒト抗体
ヒト化抗体とは、抗体タンパク質のうち、抗原認識のために必要最小限な領域（相補性決定領域、complementarity-determining region:ＣＤＲ）以外がヒト由来のものである。ヒト化抗体の製造方法は、例えば、ＥＰ０２３９４００、ＵＳ５５８５０８９号などに記載され公知である。 (3) Humanized antibody, human antibody A humanized antibody is an antibody protein whose origin is other than the minimum necessary region for antigen recognition (complementarity-determining region: CDR). is there. A method for producing a humanized antibody is described in, for example, EP0239400, US5585089, and the like.

ヒト抗体は、完全なヒト由来の免疫グロブリン遺伝子を有するヒト抗体産生マウスから得ることができる。ヒト抗体産生マウスについては、ＷＯ９７／０７６７１などに記載され公知である。   The human antibody can be obtained from a human antibody-producing mouse having a complete human-derived immunoglobulin gene. Human antibody-producing mice are known and described in WO 97/07671.

エピトープ
本発明は、ヒトＯＸ４０Ｌの９０番目のアスパラギンを含むアミノ酸配列からなる５〜５０アミノ酸残基のペプチドである、ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープを提供する。 Epitope The present invention provides a human OX40L peptide epitope which is a peptide of 5 to 50 amino acid residues consisting of an amino acid sequence containing the 90th asparagine of human OX40L.

当該ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープは、好ましくは、５０個以下のアミノ酸からなることが好ましく、３０個以下のアミノ酸からなることがより好ましく、２５個以下のアミノ酸からなることがさらに好ましい。当該ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープは、好ましくは、５個以上のアミノ酸からなることが好ましく、１５個以上のアミノ酸からなることがより好ましく、２０個以上のアミノ酸からなることがさらに好ましい。また、本発明のエピトープは、ヒトＯＸ４０Ｌの８０〜１００位の領域を含むことが好ましく、ヒトＯＸ４０Ｌの８５〜９５位の領域を含むことが好ましい。   The human OX40L peptide epitope is preferably composed of 50 amino acids or less, more preferably 30 amino acids or less, and even more preferably 25 amino acids or less. The human OX40L peptide epitope is preferably composed of 5 or more amino acids, more preferably 15 or more amino acids, and even more preferably 20 or more amino acids. In addition, the epitope of the present invention preferably includes a region at positions 80 to 100 of human OX40L, and preferably includes a region from positions 85 to 95 of human OX40L.

本発明のペプチドエピトープは、ヒトＯＸ４０Ｌ機能の阻害能を有する抗体を調製するために用いることができる。本発明のペプチドエピトープを抗原として用いる場合には、前述のように、適当なタンパク質に結合させて抗原として用いてもよい。   The peptide epitope of the present invention can be used to prepare an antibody having the ability to inhibit human OX40L function. When the peptide epitope of the present invention is used as an antigen, it may be bound to an appropriate protein and used as an antigen as described above.

ハイブリドーマ
本発明は、抗体を産生するハイブリドーマも提供する。ハイブリドーマの製造方法は、本願実施例の方法、抗体について前述した方法等、自体公知の方法に準じて行うことができる。 Hybridoma The present invention also provides a hybridoma that produces an antibody. The method for producing a hybridoma can be carried out according to a method known per se, such as the method of Examples of the present application and the method described above for antibodies.

抗インフルエンザ薬
本発明は、前述の抗体を含む、抗インフルエンザ薬を提供する。 Anti-influenza drug The present invention provides an anti-influenza drug comprising the aforementioned antibody.

本発明の抗インフルエンザ薬は、当該抗体に薬学的に許容される各種担体（ 賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤等が含まれる）と配合した製剤であってもよい。上記製剤は慣用の添加剤を含んでいてよい。    The anti-influenza drug of the present invention may be a preparation in which the antibody is blended with various pharmaceutically acceptable carriers (including excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc.). The formulation may contain conventional additives.

本発明の抗インフルエンザ薬は、インフルエンザウイルスの中和反応により治療効果を奏するのではなく、細胞膜に存在するＯＸ４０Ｌの特定の位置に特異的に結合することによりインフルエンザウイルスの当該細胞内への付着を抑制することにより、治療効果をもたらす。従って、本発明の抗インフルエンザ薬は、インフルエンザウイルスの型、インフルエンザウイルスの細胞表面抗原の種類によらず治療効果をもたらすことができる。従って、本発明の抗インフルエンザ薬が対象とするインフルエンザウイルスは特に限定されず、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス及びＣ型インフルエンザウイルスのいずれもが対象となり得る。本発明の抗インフルエンザ薬は、細胞表面抗原のパターンが多いＡ型インフルエンザウイルスに対する治療効果があるため非常に有用である。   The anti-influenza drug of the present invention does not exhibit a therapeutic effect by the neutralization reaction of influenza virus, but specifically binds to a specific position of OX40L present in the cell membrane, thereby causing the influenza virus to adhere to the cell. By suppressing, it has a therapeutic effect. Therefore, the anti-influenza drug of the present invention can provide a therapeutic effect regardless of the type of influenza virus and the type of cell surface antigen of influenza virus. Therefore, the influenza virus targeted by the anti-influenza drug of the present invention is not particularly limited, and any of influenza A virus, influenza B virus, and influenza C virus can be targeted. The anti-influenza drug of the present invention is very useful because it has a therapeutic effect against influenza A virus having many cell surface antigen patterns.

製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤； 注射剤（静脈注射、筋肉注射、局所注射等）、含嗽剤、点滴剤、外用剤、座剤等の非経口投与剤等などの各種製剤形態を挙げることができる。好ましい製剤形態としては、例えば、局所注射剤、歯肉粘膜への塗布剤、含嗽剤等が挙げられる。    The form of the preparation is not particularly limited. For example, tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups and the like orally administered; injections (intravenous injection, intramuscular injection, local injection, etc.), gargles, drops And various preparation forms such as external preparations and parenteral administration agents such as suppositories. Preferable pharmaceutical forms include, for example, topical injections, coating agents for gingival mucosa, gargles and the like.

製剤中の本発明の抗体の含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、ポリペプチドの１日投与量が通常10〜1000mg程度、より好ましくは100〜500mg程度になる量とすればよい。１日１回投与する場合は、1製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの3分の１量が含まれていればよい。   The content of the antibody of the present invention in the preparation varies depending on the administration route, patient age, body weight, symptoms, etc., and cannot be defined unconditionally, but the daily dose of the polypeptide is usually about 10 to 1000 mg, more preferably 100 to 100 mg. The amount may be about 500mg. When it is administered once a day, it is sufficient that this amount is contained in one preparation, and when it is administered three times a day, it is sufficient that this one-third amount is contained in one preparation.

本発明の治療又は予防剤は、哺乳動物等の患者に投与される。哺乳動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。   The therapeutic or prophylactic agent of the present invention is administered to a patient such as a mammal. Examples of mammals include humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cats, dogs, pigs, cows, horses, sheep and the like.

スクリーニング方法
本発明は、ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープを用いた、抗インフルエンザ薬のスクリーニング方法を提供する。 Screening Method The present invention provides a screening method for anti-influenza drugs using human OX40L peptide epitope.

本発明においてスクリーニングし得る抗インフルエンザ薬としては、抗体医薬、ペプチド医薬、低分子化合物等が挙げられる。例えば、本発明の方法としては、前述のヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープと候補物質とを接触させる工程、及び当該候補物質が当該ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープに特異的に結合するか否かを測定する工程を含むものが挙げられる。また、本発明の方法は、当該ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープに特異的に結合する候補物質を選択する工程を含んでいてもよい。本発明におけるヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープと候補物質とを接触させる工程には、当該ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープの蛋白質そのものを候補物質に接触させる方法だけでなく、当該ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープを含むペプチド（例えば、ヒトＯＸ４０Ｌ全長ペプチド）を候補物質に接触させる方法（すなわち、当該ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープがあるペプチドの一部として存在している状態で候補物質と接触させる方法）、ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープ又は当該エピトープを含むペプチドを高発現するよう形質転換した細胞を候補物質に接触させる方法も含まれる。   Examples of anti-influenza drugs that can be screened in the present invention include antibody drugs, peptide drugs, and low molecular compounds. For example, the method of the present invention includes a step of bringing the aforementioned human OX40L peptide epitope into contact with a candidate substance, and a step of measuring whether or not the candidate substance specifically binds to the human OX40L peptide epitope. Is mentioned. In addition, the method of the present invention may include a step of selecting a candidate substance that specifically binds to the human OX40L peptide epitope. In the step of contacting the human OX40L peptide epitope and the candidate substance in the present invention, not only a method of contacting the protein itself of the human OX40L peptide epitope with the candidate substance, but also a peptide containing the human OX40L peptide epitope (for example, human OX40L A full-length peptide) in contact with a candidate substance (that is, a method in which the human OX40L peptide epitope is in contact with the candidate substance in the presence of a certain peptide), a human OX40L peptide epitope or a peptide containing the epitope A method of contacting a cell transformed to a high level with a candidate substance is also included.

本発明の方法はまた、新規な薬剤を見出すことだけでなく、既存薬剤の投与順序や併用の組合せ等に関しても、最適な方法を見出すために、上記と同様のインビトロ又はインビボ実験を行うことができる。   In addition to finding new drugs, the method of the present invention can also carry out in vitro or in vivo experiments similar to those described above in order to find an optimal method regarding the order of administration of existing drugs, combinations of combinations, etc. it can.

以下に、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described in detail based on examples and the like, but the present invention is not limited thereto.

1 マウス
本研究プロトコールは東北大学動物実験委員会の承認の元、施行した。C57BL/6 マウス (H-2b)は日本チャールズリバーより購入した。OX40欠損マウス・OX40L欠損マウスは以前の論文に記載された方法にて作成されたものを使用し、これらのマウスはC57BL/6マウスに交差してある（Pippig SD, Pena-Rossi C, Long J, et al. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 1999;163(12):6520-9.； Murata K, Ishii N, Takano H, et al. The Journal of experimental medicine. 2000;191(2):365-74。マウスは全ての実験にて年齢を6-10週・性別をメスに統一し、特殊細菌の存在しない環境下にて飼育したものを使用した。 1 Mouse This protocol was implemented with the approval of the Animal Experiment Committee of Tohoku University. C57BL / 6 mice (H-2 b ) were purchased from Nippon Charles River. OX40-deficient mice and OX40L-deficient mice were prepared by the method described in the previous paper, and these mice crossed C57BL / 6 mice (Pippig SD, Pena-Rossi C, Long J , et al. Journal of immunology (Baltimore, Md: 1950). 1999; 163 (12): 6520-9 .; Murata K, Ishii N, Takano H, et al. The Journal of experimental medicine. 2000; 191 (2 ): 365-74 Mice used in all experiments were ages 6-10 weeks, gendered to female, and raised in an environment free of special bacteria.

2 骨髄キメラマウスの作成
骨髄キメラマウスはドナーに野生型・OX40L欠損マウスを使用し、どちらもレシピエントとして同様に野生型とOX40L欠損マウスに移植した計４種類のマウスを作製した。骨髄移植の方法は最初にレシピエントマウスに骨髄致死線量の10Gyのγ線を使用し、骨髄細胞を死滅させた後にドナーマウスの骨髄から採取した骨髄細胞を経血管性に3×106個移植して作成した（Asahara T, Masuda H, Takahashi T, et al. Circulation research. 1999;85(3):221-8.）。その後、キメリズム解析を行い CD4 T細胞: 73%、 CD8 T細胞: 67%、 B細胞: 99%、 NK 細胞: 99%、 NKT 細胞: 49%、 Myeloid、 DC細胞: 100%、 Lymphoid DC細胞: 99%、 好中球: 100%と骨髄移植が成功している事を確認した。マウスは20週、性別メスのマウスを使用した。 2 Preparation of Bone Marrow Chimeric Mice As bone marrow chimeric mice, wild type and OX40L-deficient mice were used as donors, both of which were similarly transplanted to wild type and OX40L-deficient mice. The bone marrow transplantation method uses a bone marrow lethal dose of 10 Gy gamma rays in the recipient mouse first, and transplants 3 × 10 6 bone marrow cells collected from the bone marrow of the donor mouse after killing the bone marrow cells. (Asahara T, Masuda H, Takahashi T, et al. Circulation research. 1999; 85 (3): 221-8.). Chimerism analysis was then performed and CD4 T cells: 73%, CD8 T cells: 67%, B cells: 99%, NK cells: 99%, NKT cells: 49%, Myeloid, DC cells: 100%, Lymphoid DC cells: 99%, neutrophils: 100%, confirming successful bone marrow transplantation. Mice were female sex mice for 20 weeks.

3 重症インフルエンザモデル（気道上皮壊死性モデル）
マウスにマウス感受性のある致死量のインフルエンザウイルス（H1N1 A/PR/8/34）を経気道的に投与した。インフルエンザウイルス量は徐々に増加し、野生型のマウスが死亡するMLD (mouse lethal dose)量を決定するとともに、このウイルス量が気道上皮細胞を減少させる量をフローサイトメトリーにて確認し、気道上皮壊死性モデルを作成した。この量は5MLDであった。マウスの生存期間の測定と体重に関しては、毎日同じ時間帯に施設にて目視にて生存を確認後、体重計を使用して安定時の体重を測定した。また、刺激により体動しないマウスに関しては倫理的な観点より安楽死させた。肺の炎症の評価は、以前の報告に基づき検討した（Kikuchi T, The Journal of clinical investigation. 2001;108(6):917-27.；Kikuchi T, Worgall S, Singh R, et al. Nature medicine. 2000;6(10):1154-9.）。具体的には、マウスにインフルエンザウイルス投与し、7日後に肺胞洗浄液と肺組織を採取した。肺胞洗浄液は気道よりサーフローを介してリン酸緩衝生理食塩水 (以下PBS)750 μlを投与・回収を2回施行した。回収後、2300 g、 5分にて遠心分離し、細胞塊と上清に分けた。細胞塊は再度1 mlのPBSにて撹拌しトリパンブルー (0.4%, life technology, Carlsbad, CA)を用いて総細胞数を測定した。また、上澄み液はBCL protein assy キット (Thermo scientific, Offenburg, Germany)にて蛋白濃度を計算し血管透過性を測定した。細胞数測定後、200 μlのPBSに2000個の細胞を調節し、その後、サイトスピンにてスライドグラスに落とし、Diff-Quick染色を施行した。最低200個/視野を3カ所で顕微鏡を介して目視にて細胞の形態からマクロファージ・好中球・リンパ球・好酸球数を計算した。採取した肺組織はホルマリン固定し、パラフィンにて封入後、ヘマトキシリンとエオジンにて染色した。 3 Severe influenza model (airway epithelial necrosis model)
Mice were administered a murine sensitive lethal dose of influenza virus (H1N1 A / PR / 8/34) via the respiratory tract. The amount of influenza virus gradually increases, the amount of MLD (mouse lethal dose) at which wild-type mice die is determined, and the amount by which this virus amount reduces airway epithelial cells is confirmed by flow cytometry. A necrotic model was created. This amount was 5 MLD. Regarding the measurement of the survival time and the body weight of the mice, the body weight at the time of stability was measured using a scale after visually confirming the survival at the facility at the same time every day. In addition, mice that did not move by stimulation were euthanized from an ethical point of view. Evaluation of lung inflammation was based on previous reports (Kikuchi T, The Journal of clinical investigation. 2001; 108 (6): 917-27 .; Kikuchi T, Worgall S, Singh R, et al. Nature medicine 2000; 6 (10): 1154-9.). Specifically, influenza virus was administered to mice, and alveolar lavage fluid and lung tissue were collected 7 days later. The alveolar lavage fluid was administered and collected twice by 750 μl of phosphate buffered saline (hereinafter referred to as PBS) via the airflow from the airway. After collection, the mixture was centrifuged at 2300 g for 5 minutes, and separated into cell mass and supernatant. The cell mass was stirred again with 1 ml of PBS and the total cell number was measured using trypan blue (0.4%, life technology, Carlsbad, CA). In addition, the supernatant liquid was measured for blood vessel permeability by calculating the protein concentration using the BCL protein assy kit (Thermo scientific, Offenburg, Germany). After measuring the number of cells, 2000 cells were adjusted in 200 μl of PBS, and then dropped on a slide glass with cytospin and subjected to Diff-Quick staining. The number of macrophages, neutrophils, lymphocytes, and eosinophils was calculated from the cell morphology by visual observation through a microscope at a minimum of 200 / field of view. The collected lung tissue was fixed in formalin, sealed with paraffin, and stained with hematoxylin and eosin.

4 RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)法
RNAはフローサイトメトリーにて選別・回収した細胞と、In vitroにてインフルエンザ感染したMDCK細胞を対象とした。対象とした細胞をRNeasy Plus kit (QIAGEN, Valencia, CA)を用いてRNAを抽出し、RNA量をNanoDrop 1000 (Termo scientific)を用いて定量した後、同量のRNAをHigh-capacity RNA to cDNA kit (life technology)を用いてcDNAを作成した。非定量PCRではPlatinum Taq DNA polymerase (life technology)を用いた。PCRサイクルは94度、２分後に94度/30 秒、 58度/30 秒、 68度/45 秒を1サイクルとして計30サイクル施行した後、2％アガロースゲル電気泳動にて解析した。定量PCRはSYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてDNA Engine Opticon 2 System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を使用して行った。全ての定量PCRのmRNA量はglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)量にて平均化し、比較量を決定した。プライマーは次のものを使用した。 4 RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) method
RNA was selected from cells that were selected and collected by flow cytometry, and MDCK cells infected with influenza in vitro. Extract RNA from target cells using RNeasy Plus kit (QIAGEN, Valencia, CA), quantify the amount of RNA using NanoDrop 1000 (Termo scientific), and then add the same amount of RNA to High-capacity RNA to cDNA cDNA was created using kit (life technology). For non-quantitative PCR, Platinum Taq DNA polymerase (life technology) was used. The PCR cycle was 94 °, 2 minutes later, 94 ° / 30 seconds, 58 ° / 30 seconds, 68 ° / 45 seconds, 30 cycles in total, and then analyzed by 2% agarose gel electrophoresis. Quantitative PCR was performed using the SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Invitrogen, Carlsbad, CA) using the DNA Engine Opticon 2 System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). The amount of mRNA of all quantitative PCR was averaged with the amount of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), and the comparison amount was determined. The following primers were used.

Influenza nuclear protein (Flu NP)
5’- ACTCACATGATGATCTGG -3’ （配列番号２）
5’- CTGCATTGTCTCCGAAGA-3’ （配列番号３）
Mouse OX40L
5’- CCCTCCAATCCAAAGACTCA -3’ （配列番号４）
5’- ATCCTTCGACCATCGTTCAG -3’ （配列番号５）
Mouse GAPDH
5’- TGTGTCCGTCGTGGATCTGA -3’ （配列番号６）
5’- CCTGCTTCACCACCTTCTTGA -3’; （配列番号７）
Canine GAPDH
5’- TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’ （配列番号８）
5’- CATGTGGGCCATGAGGTCCAC-3’ （配列番号９）。 Influenza nuclear protein (Flu NP)
5'-ACTCACATGATGATCTGG-3 '(SEQ ID NO: 2)
5'- CTGCATTGTCTCCGAAGA-3 '(SEQ ID NO: 3)
Mouse OX40L
5'- CCCTCCAATCCAAAGACTCA -3 '(SEQ ID NO: 4)
5'- ATCCTTCGACCATCGTTCAG -3 '(SEQ ID NO: 5)
Mouse GAPDH
5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 '(SEQ ID NO: 6)
5'- CCTGCTTCACCACCTTCTTGA -3 '; (SEQ ID NO: 7)
Canine GAPDH
5'- TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3 '(SEQ ID NO: 8)
5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 9).

5 ウエスタンブロッティング法
マウスを麻酔後、肋骨を切除し、肺を露出し、取り出した後に気管を除去した。マウス肺をミンチした後、プロテインインヒビター (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を加えたRIPAバッファー (Cell Signaling Technology, Danvers, MA)にて蛋白を抽出した。サンプルはプロテイン測定キット (Thermo Scientific)にて定量し、サンプルと同等量のNuPAGE (life technology)を加え、サンプルを準備した。50 μgの蛋白を12％のBis-Tris gel (life technology)を用いてSDS-PAGEにて蛋白を展開し、セミドライブロッティング法 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いてPolyvinylidene diflourideフィルター膜 (PVDF, Life Technology)に転写した。転写後、PDGF膜を25度にて1時間、PDGF blocking reagent (Toyobo, Oosaka、Japan)を使用しブロッキングした後、希釈液 (1:500, Toyobo)に溶解した1次抗体を加え、4度で一晩震盪した。翌日、Tris Buffered Saline (TBS)に0.15 mol/Lの塩酸と0.001％のTween20を加えた溶液 (PH 7.5, 以下TBS-T溶液)で5分3回洗浄した後、希釈液 (1:2000, Toyobo)にて溶解したhorseradish peroxidase (HRP) が付加された2次抗体を加え、1時間、25℃にて震盪した後、再度TBS-T溶液にて3回洗浄した。ブロットはECL detection system (GE Healthcare, Piscataway, NJ)を用いて可視化した （Kanehira M, Kikuchi T, Ohkouchi S, et al. PloS one. 2012;7(2):e32185.）。抗体は以下のものを使用した。
Anti- M2 protein (clone14C-2, Abcam, Cambridge, UK)
Anti-β-actin (clone AC-15, Sigma-Aldrich)。 5 Western blotting method After anesthetizing the mouse, the ribs were excised, the lungs were exposed, and the trachea was removed after removal. After mincing the mouse lung, the protein was extracted with RIPA buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) to which a protein inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) was added. The sample was quantified with a protein measurement kit (Thermo Scientific), and NuPAGE (life technology) in the same amount as the sample was added to prepare the sample. 50 μg of protein was developed on SDS-PAGE using 12% Bis-Tris gel (life technology), and polyvinylidene diflouride filter membrane (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) was used (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) Transferred to PVDF, Life Technology). After transfer, the PDGF membrane is blocked at 25 ° C for 1 hour using PDGF blocking reagent (Toyobo, Oosaka, Japan), then the primary antibody dissolved in diluent (1: 500, Toyobo) is added, and then 4 times. Shake overnight. The next day, after washing with Tris Buffered Saline (TBS) with 0.15 mol / L hydrochloric acid and 0.001% Tween20 (PH 7.5, hereinafter TBS-T solution) for 5 minutes 3 times, diluted solution (1: 2000, A secondary antibody added with horseradish peroxidase (HRP) dissolved in Toyobo) was added, shaken at 25 ° C. for 1 hour, and then washed again with TBS-T solution three times. Blots were visualized using the ECL detection system (GE Healthcare, Piscataway, NJ) (Kanehira M, Kikuchi T, Ohkouchi S, et al. PloS one. 2012; 7 (2): e32185.). The following antibodies were used.
Anti- M2 protein (clone14C-2, Abcam, Cambridge, UK)
Anti-β-actin (clone AC-15, Sigma-Aldrich).

6 免疫蛍光染色
細胞染色時は、2×104 個の細胞をスライドガラスに600 g、2分にてサイトスピンした後、10％ホルマリンにて15分間固定したものを使用した。肺組織染色時は5 mmにて切り出した切片を10%ホルマリンにて固定した後、パラフィンワックスで包理しておいたものを脱パラフィンとエタノール洗浄したものを使用した。最初にヒストファイン (pH9, Nichirei)を加え、121℃、15分間オートクレーブにて抗原賦活を施行した後、1滴のprotein block serum free (Dako, Santa Barbara, CA)を加え、15分間、25℃で静置しブロッキングを施行した。次に、PBSにて溶解した1次抗体 (1:500)を加え4℃で一晩静置した。翌日にPBSにて洗浄を3回施行した後、PBSにて溶解した二次抗体 (1:200)を25度にて1時間加え、再度PBSで3回洗浄を施行した。最後に、DAPIが加わったブロッキング剤 (1.5 μg/ml, Vector laboratories, Peterborough, UK )にて組織を封入し、蛍光画像をコンフォーカル顕微鏡 (Carl Zeiss LSM 780, jena, germany)を用いて画像を採取した。抗体は以下のものを使用した。陰性コントロールとしてコントロール抗体を使用した。 6 Immunofluorescence staining At the time of cell staining, 2 × 10 4 cells were cytospun onto a slide glass at 600 g for 2 minutes and then fixed with 10% formalin for 15 minutes. At the time of lung tissue staining, a section cut out at 5 mm was fixed with 10% formalin, and then embedded in paraffin wax and deparaffinized and washed with ethanol was used. First, add histofine (pH9, Nichirei), activate antigen by autoclaving for 15 minutes at 121 ° C, add 1 drop of protein block serum free (Dako, Santa Barbara, CA), and then for 15 minutes at 25 ° C And allowed to block. Next, a primary antibody (1: 500) dissolved in PBS was added and left overnight at 4 ° C. On the next day, washing was performed 3 times with PBS, and then a secondary antibody (1: 200) dissolved in PBS was added at 25 ° C. for 1 hour, and washing was performed again 3 times with PBS. Finally, the tissue was encapsulated with a blocking agent with DAPI added (1.5 μg / ml, Vector laboratories, Peterborough, UK), and fluorescence images were captured using a confocal microscope (Carl Zeiss LSM 780, jena, germany). Collected. The following antibodies were used. A control antibody was used as a negative control.

1次抗体
Goat anti-CCSP (clone T-18, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)
Rabbit anti SPC (cloneFL-197, Santa Cruz Biotechnology)
Mouse anti-influenza M2 protein (clone14C-2, Abcam)
Rat anti-OX40Ligand antibody (Clone RM134L, e-Bioscience，San Diego, CA)
蛍光付加２次抗体
488 Donkey anti rabbit antibody (life technology)
488 Goat anti mouse antibody (life technology)
594 Donkey anti goat antibody (life technology)
594 Goat anti rat antibody (life technology)。 Primary antibody
Goat anti-CCSP (clone T-18, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)
Rabbit anti SPC (cloneFL-197, Santa Cruz Biotechnology)
Mouse anti-influenza M2 protein (clone14C-2, Abcam)
Rat anti-OX40Ligand antibody (Clone RM134L, e-Bioscience, San Diego, CA)
Fluorescent secondary antibody
488 Donkey anti rabbit antibody (life technology)
488 Goat anti mouse antibody (life technology)
594 Donkey anti goat antibody (life technology)
594 Goat anti rat antibody (life technology).

7 細胞の分離
マウスを麻酔下に肋骨を除去し、肺を露出し、気管にカニューレを挿入した。カニューレを介して0.2 μM EGTAを加えたPBS溶液0.5 mlにて4回、肺をキレート洗浄した後、肺に0.5 mlのエラスターゼ (4 U/ml, Worthington biochemical corporation, New Jersey, CA)を注入し肺を分離した。肺を分離後、500 μlのエラスターゼを再度カニューレより注入し、37℃、5％二酸化炭素にて5分間静置した。これを3回繰り返した後、肺葉を分離・ミンチを施行し、1 mlのDNAase (25 μg/ml, Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を加え、37℃にて10分間静置した。分離された細胞を100 μlのセルソーターを通した後、5 mlのRBC lysing buffer (Life tecnology)にて赤血球を除去し、再度70 μlのセルソーターに通し70 μlの細胞保存液（10 mM HEPESと2% fetal bovine serum mediumを加えたHanks' balanced saline solution：以下細胞保存液）に保存した（Kim CF, Jackson EL, Woolfenden AE, et al. Cell. 2005;121(6):823-35.）。 7 Separation of cells Under anesthesia, the ribs were removed, the lungs were exposed, and the trachea was cannulated. After chelating lavage of the lung 4 times with 0.5 ml of PBS solution with 0.2 μM EGTA added via cannula, 0.5 ml of elastase (4 U / ml, Worthington biochemical corporation, New Jersey, CA) was injected into the lung. The lungs were isolated. After separation of the lungs, 500 μl of elastase was again injected through the cannula and allowed to stand at 37 ° C. and 5% carbon dioxide for 5 minutes. After repeating this three times, the lung lobe was separated and minced, 1 ml of DNAase (25 μg / ml, Roche Applied Science, Indianapolis, IN) was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes. After passing the separated cells through a 100 μl cell sorter, remove red blood cells with 5 ml of RBC lysing buffer (Life tecnology), and again pass through a 70 μl cell sorter. Then 70 μl of cell preservation solution (10 mM HEPES and 2 It was preserved in Hanks' balanced saline solution (hereinafter cell preservation solution) supplemented with% fetal bovine serum medium (Kim CF, Jackson EL, Woolfenden AE, et al. Cell. 2005; 121 (6): 823-35.).

8 フローサイトメトリー
フローサイトメトリーによる気道上皮前駆細胞の同定は以前に報告された方法を用いて行った（Kim CF, Jackson EL, Woolfenden AE, et al. Cell. 2005;121(6):823-35.）。具体的には、上記の方法にて分離した70 μl中の全肺細胞に次の１次抗体を2 μlずつ加え、暗所にて１時間静置した。抗体は次のものを使用した：(PE)-Cy7 anti-CD31 (clone 390, 1:40, e-Bioscience)、 PE-Cy7anti-CD45 ( clone 30F-11, 1:40, BD, PharMingen, San Diego, CA)、 Alexa Fluor 647 anti-CD34 (clone RAM34, 1:40, e-bioscience)、 and PE anti-Sca-1 (clone D7, 1:40, BD)。その後1 mlの細胞保存液にて2回細胞洗浄した後、500 μlの細胞保存液に混中し、フローサイトメトリー (BD FACSAriaTMII，BD)にて同定を行った。7-aminoactinomycin D (Beckman Coulter, miami,
FL)を死細胞の除去目的に使用した。また、OX40L 陽性細胞・インフルエンザ受容体を同定するときには各種抗体を更に加えた：FITC-conjugated Sambucus nigra agglutinin lectin (100 μg/ml, EY laboratory) or FITC-conjugated anti OX40L antibody (clone OX89, 1:40, e-Bioscience)。実細胞数はフローサイトメトリーにて測定した細胞割合に肺総細胞数をトリパンブルー （0.4％）にて測定したものを掛け合わせ計算した。陽性細胞割合は各種コントロール抗体を１％として評価した（Shibuya N, Goldstein IJ, Broekaert WF, et al. The Journal of biological chemistry. 1987;262(4):1596-601.）。 8 Flow cytometry The identification of airway epithelial progenitor cells by flow cytometry was performed using a previously reported method (Kim CF, Jackson EL, Woolfenden AE, et al. Cell. 2005; 121 (6): 823- 35.). Specifically, 2 μl of the next primary antibody was added to all the lung cells in 70 μl separated by the above method, and left for 1 hour in the dark. The following antibodies were used: (PE) -Cy7 anti-CD31 (clone 390, 1:40, e-Bioscience), PE-Cy7anti-CD45 (clone 30F-11, 1:40, BD, PharMingen, San Diego, CA), Alexa Fluor 647 anti-CD34 (clone RAM34, 1:40, e-bioscience), and PE anti-Sca-1 (clone D7, 1:40, BD). Thereafter, the cells were washed twice with 1 ml of cell preservation solution, mixed with 500 μl of cell preservation solution, and identified by flow cytometry (BD FACSAria ™ II, BD). 7-aminoactinomycin D (Beckman Coulter, miami,
FL) was used for dead cell removal purposes. Various antibodies were added to identify OX40L positive cells and influenza receptors: FITC-conjugated Sambucus nigra agglutinin lectin (100 μg / ml, EY laboratory) or FITC-conjugated anti OX40L antibody (clone OX89, 1:40 , e-Bioscience). The actual cell count was calculated by multiplying the cell ratio measured by flow cytometry by the total lung cell count measured with trypan blue (0.4%). The percentage of positive cells was evaluated with 1% of various control antibodies (Shibuya N, Goldstein IJ, Broekaert WF, et al. The Journal of biological chemistry. 1987; 262 (4): 1596-601.).

9 プラスミドの作製
ベクタープラスミドはpBluescript II vectors (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)を用いBamHI制限酵素にて切断し、使用した。マウスOX40L cDNAは以前作成したOX40Lベクターを用い、EcoRI制限酵素にて切除後、gel extraction法 (QIAGEN, Valencia, CA)によりcDNAを精製した。人OX40L cDNAはpSGP34-1をXbal制限酵素にて切除し、同様に精製した。次にマウス・人OX40L cDNAをプラスミドベクターにライゲーションする為、Blend Taq (Toyobo)を用いてlincker ligation法にてcDNAの両端にBamHI切断領域と同様の塩基配列 (5-GGATCC-3’, 5-GGATCC-3’)を挿入した。両端にBamHI領域を挿入後、BamHI制限酵素にてcDNAを切断し、gel extraction法により精製した。制限酵素にて準備したベクタープラスミドをAlkaline Phosphatase (Takara, Otsu, Japan)にてBap処理を施行した後にベクタープラスミドとcDNAをBamHIサイトにてライゲーションを施行し、DH5α (Takara)に形質転換した。形質転換したDH5α Escherichia coliをLB培地 (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD)にて培養した後にplasmid plus kit (QIAGEN, Valencia, CA)を用いてプラスミドDNAを精製した。精製したプラスミドDNAはダイターミネーター法 (life technology)を用いてシークエンスを行い、各種cDNAの導入が正確に行われた事をABI PRISM 3500XL (life technology)にて確認した。 9 Preparation of plasmid The vector plasmid was cleaved with BamHI restriction enzyme using pBluescript II vectors (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif.). Mouse OX40L cDNA was excised with EcoRI restriction enzyme using the previously prepared OX40L vector, and then cDNA was purified by gel extraction method (QIAGEN, Valencia, CA). Human OX40L cDNA was purified by excising pSGP34-1 with Xbal restriction enzyme. Next, in order to ligate mouse / human OX40L cDNA to a plasmid vector, the same nucleotide sequence as the BamHI cleavage region (5-GGATCC-3 ', 5-) was used at both ends of the cDNA by the linker ligation method using Blend Taq (Toyobo). GGATCC-3 ') was inserted. After inserting the BamHI region at both ends, the cDNA was cleaved with BamHI restriction enzyme and purified by gel extraction method. The vector plasmid prepared with restriction enzymes was subjected to Bap treatment with Alkaline Phosphatase (Takara, Otsu, Japan), and then the vector plasmid and cDNA were ligated at the BamHI site and transformed into DH5α (Takara). The transformed DH5α Escherichia coli was cultured in LB medium (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD), and then the plasmid DNA was purified using a plasmid plus kit (QIAGEN, Valencia, CA). The purified plasmid DNA was sequenced using the dye terminator method (life technology), and it was confirmed by ABI PRISM 3500XL (life technology) that various cDNAs were introduced correctly.

10 変異プラスミドの作製
ヒトOX40L変異プラスミドの作製はPrimers STAR mix DNA polymerase (Takara)を用いて高感度PCR法にて作製した。PCRサイクルは98℃/10秒、 55℃/15秒 （点変異では58℃）、 72℃/20秒を1サイクルとして計30サイクル施行後した。変異プラスミドは57Pro→中止コドン(以下57Pro)、121Lys→中止コドン(以下121Lys)、90Asn→Ala(以下90Asn)、114 Asn→Ala(以下114Asn)に変換したものを作成した。変異が正確に行われた事を上記の方法にてシークエンスを施行した。プライマーは以下のものを使用した（Liu D, Cramer CC, Scafidi J, et al, Infection and immunity. 2005;73(8):4478-87）。
57Pro:
5’-CGGTATTAGCGAATTCAAAGTATCAAAGT-3’ （配列番号１０）
5’-AATTCGCTAATACCGATGTGATACCTG-3’ （配列番号１１）
121Lys:
5’-TACCAGTAGGATGAGGAGCCCCTCTTCCAA-3’ （配列番号１２）
5’-CTCATCCTACTGGTAATGAAGGCTAAT-3’ （配列番号１３）
90Asn:
5’-GTGCAGGCAAACTCAGTCATCATCAAC-3’, （配列番号１４）
5’-TGAGTTTGCCTGCACCTTCATGATTTC-3’ （配列番号１５）
114Asn:
5’-GAAGTCGCAATTAGCCTTCATTACCAG-3’ （配列番号１６）
5’- GCTAATTGCGACTTCCTGGGAGAAGTA-3’ （配列番号１７）。 10 Preparation of mutant plasmid Human OX40L mutant plasmid was prepared by high-sensitivity PCR using Primers STAR mix DNA polymerase (Takara). PCR cycles were 98 ° C / 10 seconds, 55 ° C / 15 seconds (58 ° C for point mutation), and 72 ° C / 20 seconds as one cycle, for a total of 30 cycles. Mutant plasmids were prepared by converting 57Pro → stop codon (hereinafter 57 Pro), 121Lys → stop codon (hereinafter 121 Lys), 90Asn → Ala (hereinafter 90 Asn), 114 Asn → Ala (hereinafter 114 Asn). The sequence was performed by the above method to confirm that the mutation was correctly performed. The following primers were used (Liu D, Cramer CC, Scafidi J, et al, Infection and immunity. 2005; 73 (8): 4478-87).
57 Pro:
5'-CGGTATTAGCGAATTCAAAGTATCAAAGT-3 '(SEQ ID NO: 10)
5'-AATTCGCTAATACCGATGTGATACCTG-3 '(SEQ ID NO: 11)
121 Lys:
5'-TACCAGTAGGATGAGGAGCCCCTCTTCCAA-3 '(SEQ ID NO: 12)
5'-CTCATCCTACTGGTAATGAAGGCTAAT-3 '(SEQ ID NO: 13)
90 Asn:
5'-GTGCAGGCAAACTCAGTCATCATCAAC-3 ', (SEQ ID NO: 14)
5'-TGAGTTTGCCTGCACCTTCATGATTTC-3 '(SEQ ID NO: 15)
114 Asn:
5'-GAAGTCGCAATTAGCCTTCATTACCAG-3 '(SEQ ID NO: 16)
5′-GCTAATTGCGACTTCCTGGGAGAAGTA-3 ′ (SEQ ID NO: 17).

11 プラスミドの遺伝子導入とインフルエンザウイルスの細胞感染
犬の腎臓の細胞であるMDCK細胞はRIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japan)より獲得し、10％FCSと100 units/mlペニシリンを加えたDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis. MO)を用いて、37℃,5％二酸化炭素条件下にて維持した。7×104個のMDCK細胞を12ウエルプレートにて48時間培養後に、細胞が80-90％に増殖している事を確認し、プラスミドDNAをリポフェクタミン法にてMDCK細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入にはlipofectamin plus reagent (Invitrogen)を用い、1ウエル毎に50 μlのOpti-MEM溶液 （life technology）に1 μlのplus regmentと1 μgのプラスミドDNAを加え、5分間後に3 μlのlipofectaminを加えた後に30分間25℃で静置した。作製した50 μlの遺伝子導入用溶液と培養用溶液950 μlを１ウエルのMDCK細胞に加え、37℃、5％二酸化炭素にて維持した。48時間後、FCS無しの1 ml MEM 溶液で細胞を洗浄2度行い、インフルエンザウイルスを細胞に感染させた。インフルエンザウイルスは100 μlのMEM溶液にmultiplicity of infection (MOI) of 0.001 となるように溶解し、ウイルスを細胞に投与した。また、15分毎に細胞が乾燥しないように手動にて振盪を加えた。90分経過後にウイルス溶液を回収し、FCSフリーのMEMメディウムにて2度洗浄後し、ウイルス培養溶液（MEM溶液 (life technology)に2 mM L-glutamine (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan),25 mMの Hepes (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)、4% のbovine serum albumin (Wako, Tokyo, Japan),2 μg/mlのL-(tosylamido-2-phenyl) ethyl chloromethyl ketone (TPCK) treated trypsin (Takara)を混合した溶液）を加えた。その後、34℃、5％CO2にて24時間培養後、細胞をPBSにて洗浄後EDTAトリプシンにて細胞を回収した（Wu S, Patel KB, Booth LJ, et al. BMC complementary and alternative medicine. 2010;10:69.； Hashem AM, Flaman AS, Farnsworth A, et al. PloS one. 2009;4(12):e8350.）。遺伝子導入の確認は以下のプライマーを使用した。
Mouse OX40L
5’- CCCTCCAATCCAAAGACTCA -3’ （配列番号１８）
5’- ATCCTTCGACCATCGTTCAG -3’ （配列番号１９）
Human OX40L
5’- TTCCAGGGGTTGGACCCTTT-3’ （配列番号２０）
5’- CCTGGTGAATTCTGTGTCCT-3’ （配列番号２１）。 11 Plasmid gene transfer and influenza virus cell infection MDCK cells, which are canine kidney cells, were obtained from RIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japan) and Dulbecco's Modified Eagle Medium (10% FCS and 100 units / ml penicillin added) DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis. MO) and maintained at 37 ° C. and 5% carbon dioxide. After culturing 7 × 10 4 MDCK cells in a 12-well plate for 48 hours, it was confirmed that the cells had grown to 80-90%, and plasmid DNA was introduced into MDCK cells by the lipofectamine method. Use lipofectamin plus reagent (Invitrogen) for gene transfer, add 1 μl plus regment and 1 μg plasmid DNA to 50 μl Opti-MEM solution (life technology) per well, and then add 3 μl lipofectamin 5 minutes later. And then left at 25 ° C. for 30 minutes. The prepared 50 μl of gene introduction solution and 950 μl of culture solution were added to 1 well of MDCK cells and maintained at 37 ° C. and 5% carbon dioxide. After 48 hours, the cells were washed twice with 1 ml MEM solution without FCS to infect the cells with influenza virus. Influenza virus was dissolved in 100 μl of MEM solution to give a multiplicity of infection (MOI) of 0.001, and the virus was administered to the cells. In addition, shaking was manually added to prevent the cells from drying every 15 minutes. After 90 minutes, the virus solution was collected, washed twice with FCS-free MEM medium, and virus culture solution (MEM solution (life technology) in 2 mM L-glutamine (Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan), 25 mM) Hepes (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan), 4% bovine serum albumin (Wako, Tokyo, Japan), 2 μg / ml L- (tosylamido-2-phenyl) ethyl chloromethyl ketone (TPCK) treated trypsin (Takara) (Mixed solution) was added. Then, after culturing at 34 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours, the cells were washed with PBS and then recovered with EDTA trypsin (Wu S, Patel KB, Booth LJ, et al. BMC complementary and alternative medicine. 2010 ; 10: 69 .; Hashem AM, Flaman AS, Farnsworth A, et al. PloS one. 2009; 4 (12): e8350.). The following primers were used for confirmation of gene transfer.
Mouse OX40L
5'- CCCTCCAATCCAAAGACTCA -3 '(SEQ ID NO: 18)
5'- ATCCTTCGACCATCGTTCAG -3 '(SEQ ID NO: 19)
Human OX40L
5'- TTCCAGGGGTTGGACCCTTT-3 '(SEQ ID NO: 20)
5′-CCTGGTGAATTCTGTGTCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 21).

12 人臨床検体の免疫化学染色
人臨床検体は東北大学倫理委員会の承認の元、東北大学病院呼吸器内科、東北大学関連病院にて病理解剖を施行した患者の肺組織を使用した。インフルエンザ肺炎で死亡した患者は42歳の女性、インフルエンザ迅速キットにてインフルエンザAと診断された検体を使用した。誤嚥性肺炎にて死亡した患者の検体は79歳の男性のものを使用した。免疫化学染色は、免疫抗体染色と同様に抗原賦活、ブロッキングを施行した。その後に、2 mMの過酸化水素を含んだメタノールにて内因性ペルオキシダーゼ除去した後、PBSにて溶解した1次抗体であるMouse anti human OX40Ligand antigen (clone 11C3.1, Biolegend, 1:500)を加え、4℃にて1晩静置した。翌日、PBSにて3回洗浄後、2次抗体としてビオチンで付加された抗マウス抗体とストレプトアビジン標識ののペルオキシダーゼ (Nichirei bioscience, Tokyo, japan)を添加した。最後に、15分間Dab (3-3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride)にてペルオキシダーゼを染色し、ヘマトキシレンにて核染色を施行した後に、光学顕微鏡 (BX51, Olympus, Shinjuku, japan)にて観察・画像採取を施行した。陽性コントロールとして、脾臓組織を使用し、陰性コントロールとしてコントロール抗体を使用した。 Immunochemical staining of 12 human clinical specimens The human clinical specimens were obtained from the Tohoku University Ethical Committee, using the lung tissue of patients who underwent pathological dissection at Tohoku University Hospital Respiratory Medicine and Tohoku University Hospital. The patient who died of influenza pneumonia was a 42-year-old woman who used a specimen diagnosed with influenza A using the influenza rapid kit. The sample of a patient who died of aspiration pneumonia was a 79-year-old male. In immunochemical staining, antigen activation and blocking were performed in the same manner as immuno-antibody staining. Then, after removing endogenous peroxidase with methanol containing 2 mM hydrogen peroxide, the primary antibody Mouse anti human OX40 Ligand antigen (clone 11C3.1, Biolegend, 1: 500) dissolved in PBS was added. In addition, the mixture was allowed to stand overnight at 4 ° C. The next day, after washing three times with PBS, anti-mouse antibody added with biotin as a secondary antibody and streptavidin-labeled peroxidase (Nichirei bioscience, Tokyo, Japan) were added. Finally, peroxidase was stained with Dab (3-3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride) for 15 minutes, followed by nuclear staining with hematoxylene, followed by observation and image collection with an optical microscope (BX51, Olympus, Shinjuku, japan) Was enforced. Spleen tissue was used as a positive control, and a control antibody was used as a negative control.

13 統計処理
統計学的有意差は群間の比較ではstudent's t検定で求め、多群間の比較ではHSD検定 (Tukey's honestly significant difference test)を用いた。生存率はカプラン・マイヤー (Kaplan-Meier)法を用いて検討した。P値は0.05未満で統計学的有意差があるとした。 Statistical processing Statistical significance was determined by student's t-test for comparison between groups, and HSD test (Tukey's honestly significant difference test) was used for comparison between multiple groups. Survival was examined using the Kaplan-Meier method. P value was less than 0.05, and there was a statistically significant difference.

参考例１. OX40Lの欠損のインフルエンザ肺炎抵抗性に対する影響
最初にOX40Lの欠損がOX40の欠損と同様にインフルエンザ肺炎の抵抗性に関与するかを検討した
(1) 生存期間の検討
インフルエンザ致死性肺炎モデルを用い、野生型マウス・OX40L欠損マウス・OX40欠損マウスの生存期間を検討した (図１A)。陰性コントロールとして野生型マウスにPBS (Mock)のみの溶液を同様に投与した。野生型マウスでは7日目より徐々に生存割合が低下し12日目に全てのマウスの死亡を確認した。OX40欠損マウスは8日目より徐々に死亡が確認され、13日目にはほぼ全てのマウスの死亡が確認され、野生型マウスとの差は認めなかった (P > 0.05)。一方、OX40L欠損マウスは12日目より2匹のマウスが死亡したが、8割近くのマウスが生存した (P < 0.05)。 Reference Example 1. Effect of OX40L deficiency on influenza pneumonia resistance First, we examined whether OX40L deficiency is related to influenza pneumonia resistance as well as OX40 deficiency.
(1) Examination of survival period The survival period of wild-type mice, OX40L-deficient mice, and OX40-deficient mice was examined using an influenza lethal pneumonia model (FIG. 1A). As a negative control, a solution containing only PBS (Mock) was similarly administered to wild type mice. In wild-type mice, the survival rate gradually decreased from day 7, and all mice died on day 12. The OX40-deficient mice gradually died from the 8th day, and almost all mice died on the 13th day, with no difference from the wild-type mice (P> 0.05). On the other hand, 2 mice died from the OX40L-deficient mouse on the 12th day, but nearly 80% of mice survived (P <0.05).

(2) 肺の炎症の検討
インフルエンザ致死性肺炎モデルを用い、野生型マウス・OX40L欠損マウス・OX40欠損マウスの肺の炎症の評価として、肺胞洗浄中の細胞数・細胞の種類・血管の透過性・肺組織を検討した。また、陰性コントロールとして、野生型マウスにPBS (Mock)のみ投与した。 (2) Examination of lung inflammation Using the influenza lethal pneumonia model, as an assessment of lung inflammation in wild-type mice, OX40L-deficient mice, and OX40-deficient mice, the number of cells, cell types, and blood vessel penetration during alveolar lavage Sex and lung tissue were examined. As a negative control, only PBS (Mock) was administered to wild type mice.

最初に肺胞洗浄液中の炎症細胞を検討した (図1B)。肺胞洗浄液中の炎症細胞数は、 Mockに比べて致死性インフルエンザ肺炎は増加した。OX40欠損マウスは野生型マウスに比較して炎症細胞数が軽減した。OX40L欠損マウスではOX40欠損マウスに比較して、更に有意に炎症細胞数は軽減した (肺胞洗浄液中の炎症細胞数/ ml OX40L KO: 19±5 ×106個 OX40 KO: 37±1 ×106個, P < 0.05, N = 3)。次に、肺胞洗浄液中の細胞の種類を検討した (図１C)。炎症細胞の種類は、Mockに比較して致死性インフルエンザ肺炎モデルでは、好中球・リンパ球割合が増加した。OX40L・OX40欠損マウスは野生型マウスに比較して、リンパ球割合が低下していた (P < 0.05)。しかし、OX40L・OX40欠損マウス間では有意な差は認めなかった (肺胞洗浄液中のリンパ球割合 OX40L KO: 6.7±0.3%, OX40 KO： 6.6±0.9%, 野生型: 10±1.5%, N = 3)。 First, inflammatory cells in the alveolar lavage fluid were examined (Fig. 1B). The number of inflammatory cells in the alveolar lavage fluid increased in lethal influenza pneumonia compared to Mock. OX40-deficient mice had a reduced number of inflammatory cells compared to wild-type mice. OX40L-deficient mice had a significantly reduced number of inflammatory cells compared to OX40-deficient mice (number of inflammatory cells in alveolar lavage fluid / ml OX40L KO: 19 ± 5 × 10 6 OX40 KO: 37 ± 1 × 10 6 pieces, P <0.05, N = 3). Next, the types of cells in the alveolar lavage fluid were examined (FIG. 1C). In the inflammatory cell type, the neutrophil / lymphocyte ratio increased in the lethal influenza pneumonia model compared to Mock. OX40L / OX40-deficient mice had a reduced lymphocyte ratio compared to wild-type mice (P <0.05). However, there was no significant difference between OX40L and OX40-deficient mice (the proportion of lymphocytes in the alveolar lavage fluid OX40L KO: 6.7 ± 0.3%, OX40 KO: 6.6 ± 0.9%, wild type: 10 ± 1.5%, N = 3).

血管透過性の評価として肺胞洗浄液中のタンパク量を検討した (図１D)。血管透過性は、致死性インフルエンザ肺炎ではMockに比較して増加していた。OX40欠損マウスは野生型マウスに比較し血管透過性の増加が軽減した (P < 0.05)。OX40L欠損マウスは OX40欠損マウスに比較して更に血管透過性の増加が更に軽減した (肺胞洗浄液中のタンパク量/ 25μl OX40L KO: 1624±57 μg, OX40 KO: 1955±156 μg, P < 0.05, N = 3)。   As an evaluation of vascular permeability, the amount of protein in the alveolar lavage fluid was examined (FIG. 1D). Vascular permeability was increased in lethal influenza pneumonia compared to Mock. In OX40-deficient mice, the increase in vascular permeability was reduced compared to wild-type mice (P <0.05). OX40L-deficient mice further reduced the increase in vascular permeability compared to OX40-deficient mice (protein content in alveolar lavage fluid / 25μl OX40L KO: 1624 ± 57 μg, OX40 KO: 1955 ± 156 μg, P <0.05 , N = 3).

次に肺への炎症細胞の浸潤を肺組織のHE染色にて評価した (図1E)。野生型マウスでは気道周囲、肺胞への炎症細胞の浸潤に伴い、非常に強い炎症所見に加え、気道の拡張や肺の間質の繊維化など肺の線維化の所見を認めた。OX40欠損マウスでは、野生型マウスに比較して気道周囲、肺胞への細胞の浸潤の低下を認め、線維化の所見はほとんど認めなかった。OX40L欠損マウスでは、炎症細胞数などの結果と同様にOX40欠損マウスより細胞の浸潤が、特に気道周囲にて低下していた。   Next, infiltration of inflammatory cells into the lung was evaluated by HE staining of lung tissue (FIG. 1E). In wild-type mice, along with the infiltration of inflammatory cells around the airways and alveoli, in addition to very strong inflammatory findings, findings of pulmonary fibrosis such as dilatation of the airway and fibrosis of the lung stroma were observed. In OX40-deficient mice, the infiltration of cells into the airways and alveoli was reduced compared to wild-type mice, and there was little evidence of fibrosis. In the OX40L-deficient mice, the infiltration of cells was lower than that in the OX40-deficient mice, especially in the vicinity of the respiratory tract, as was the case with the number of inflammatory cells.

図1A-図1EよりOX40L欠損するとOX40欠損よりも更にインフルエンザ肺炎に抵抗性を示した。   From FIG. 1A to FIG. 1E, OX40L deficiency was more resistant to influenza pneumonia than OX40 deficiency.

参考例2. 非骨髄由来細胞のOX40Lがインフルエンザ肺炎の抵抗性に重要である
次にインフルエンザ肺炎の抵抗性に関与するOX40Lが骨髄細胞由来か、非骨髄由来細胞由来かを骨髄キメラマウスを用いて検討した。
(1) 体重の評価
インフルエンザ致死性肺炎モデルにおける各種骨髄キメラマウスの体重減少率を検討した (図2A)。レシピエントが野生型マウスでは、骨髄ドナーがOX40L欠損マウス (以下： BMOX40LKO→WT)は野生型マウス (以下：BMWT→WT)と有意な差を認めなかった (P > 0.05)。一方、レシピエントがOX40L欠損マウスでは、骨髄ドナーがOX40L欠損マウス (以下： BMOX40LKO→OX40LKO)と野生型マウス(以下： BMWT→OX40LKO)は、BMWT→WTマウスよりも体重減少率が低下した (P < 0.05)。この結果から、レシピエントのOX40Lがインフルエンザ肺炎の体重減少に重要である事が示唆された (７日目体重減少率 BMWT→OX40LKO: 24.3±2.2%, BMOX40LKO→WT： 28.7±0.7%, P < 0.05, N = 3 )。
(2) 肺の炎症の検討
次にインフルエンザ致死性肺炎モデルにおける骨髄キメラマウスの肺の炎症を検討した。(図2B)。レシピエントが野生型マウスでは,骨髄ドナーが野生型マウス (以下： BMWT→WT)よりもOX40L欠損マウス (以下： BMOX40LKO→WT)で炎症が少なかった (P < 0.05)。レシピエントがOX40L欠損マウスではドナーが野生型 マウス(以下： BMWT→OX40LKO)とOX40L欠損マウス (以下： BMOX40LKO→OX40LKO)はBMWT→WTマウスに比較して炎症が少なかった (P < 0.05)。体重減少と同様に,BMWT→OX40LKOマウスはBMOX40LKO→WTマウスよりも,肺の炎症が少なかった (肺胞洗浄液炎症細胞数/ ml BMWT→OX40LKO: 82±1 ×106個, BMOX40LKO→WT： 90±8 ×106個, P < 0.05, N = 4)。 Reference Example 2. Non-bone marrow derived cell OX40L is important for influenza pneumonia resistance Next, using bone marrow chimera mice to determine whether OX40L involved in influenza pneumonia resistance is derived from bone marrow cells or non-bone marrow derived cells investigated.
(1) Evaluation of body weight The weight loss rate of various bone marrow chimeric mice in an influenza lethal pneumonia model was examined (FIG. 2A). When the recipient was a wild type mouse, the bone marrow donor was an OX40L-deficient mouse (hereinafter: BM OX40LKO → WT) was not significantly different from the wild type mouse (hereinafter: BM WT → WT) (P> 0.05). On the other hand, when the recipient is an OX40L-deficient mouse, the bone marrow donor is an OX40L-deficient mouse (hereinafter: BM OX40LKO → OX40LKO) and a wild type mouse (hereinafter: BM WT → OX40LKO) have a lower weight loss rate than BM WT → WT mice. (P <0.05). These results suggest that recipient OX40L is important for weight loss of influenza pneumonia (Day 7 weight loss rate BM WT → OX40LKO: 24.3 ± 2.2%, BM OX40LKO → WT: 28.7 ± 0.7%, P <0.05, N = 3).
(2) Examination of lung inflammation Next, the inflammation of the lungs of bone marrow chimeric mice in an influenza lethal pneumonia model was examined. (Figure 2B). When recipients were wild-type mice, bone marrow donors were less inflammatory in OX40L-deficient mice (hereinafter BM OX40LKO → WT) than in wild-type mice (hereinafter BM WT → WT) (P <0.05). Recipients with OX40L-deficient mice had less inflammation in donors than wild-type mice (hereinafter: BM WT → OX40LKO) and OX40L-deficient mice (hereinafter: BM OX40LKO → OX40LKO) compared to BM WT → WT mice (P <0.05) ). Similar to weight loss, BM WT → OX40LKO mice had less lung inflammation than BM OX40LKO → WT mice (alveolar lavage fluid inflammatory cells / ml BM WT → OX40LKO: 82 ± 1 × 10 6 cells, BM OX40LKO → WT: 90 ± 8 × 10 6 pieces, P <0.05, N = 4).

血管透過性の評価として肺胞洗浄液中のタンパク量を検討した (図2C)。BMWT→WTマウスに比較して、その他 (BMOX40LKO→WT, BMWT→OX40LKO, BMOX40LKO→OX40LKO)のマウスでは血管透過性が低下していた (P < 0.05)。BMOX40LKO→WTマウスとBMWT→OX40LKOマウスでの有意な差は認められなかった (肺胞洗浄液蛋白量/25 μl BMWT→WT: 6660±779 μg, BMWT→OX40LKO: 4116±408 μg, BMOX40LKO→WT: 5095±384 μg, BMOX40LKO→OX40LKO: 4908±509 μg, N = ４)。   As an evaluation of vascular permeability, the amount of protein in the alveolar lavage fluid was examined (Fig. 2C). Compared with BMWT → WT mice, vascular permeability was decreased in other mice (BMOX40LKO → WT, BMWT → OX40LKO, BMOX40LKO → OX40LKO) (P <0.05). There was no significant difference between BMOX40LKO → WT mice and BMWT → OX40LKO mice (alveolar lavage protein / 25 μl BMWT → WT: 6660 ± 779 μg, BMWT → OX40LKO: 4116 ± 408 μg, BMOX40LKO → WT: 5095 ± 384 μg, BMOX40LKO → OX40LKO: 4908 ± 509 μg, N = 4).

次に肺の炎症を肺組織のHE染色にて検討した (図2E)。BMWT→WTマウスでは、気道周囲の炎症に伴い肺胞への細胞浸潤と肺の繊維化所見を広範囲に認めた。BMOX40LKO→WTマウスは、 BMWT→WTマウスに比較して肺の炎症細胞の浸潤が低下傾向であった。肺の炎症評価と同様に、BMWT→OX40LKO、BMOX40LKO→OX40LKOマウスは、 BMOX40LKO→WTよりも、更に気管支周囲と肺の炎症が低下していた。 Next, lung inflammation was examined by HE staining of lung tissue (Fig. 2E). In BM WT → WT mice, cell infiltration into the alveoli and pulmonary fibrosis were observed extensively with inflammation around the airways. BM OX40LKO → WT mice tended to have lower infiltration of lung inflammatory cells than BM WT → WT mice. Similar to the pulmonary inflammation assessment, the BM WT → OX40LKO and BM OX40LKO → OX40LKO mice had further reduced peribronchial and lung inflammation than BM OX40LKO → WT.

上記結果から、非骨髄細胞由来のOX40Lがインフルエンザ肺炎肺に重要である事が示唆された。
(3) インフルエンザウイルス量の検討
次に非骨髄性由来細胞のOX40Lがインフルエンザウイルスの細胞内感染の増加に関与すると仮定し、骨髄キメラマウスの肺内のインフルエンザウイルス感染量を検討した。 From the above results, it was suggested that OX40L derived from non-myeloid cells is important for lungs of influenza pneumonia.
(3) Examination of the amount of influenza virus Next, assuming that OX40L, a non-myeloid-derived cell, is involved in the increase in intracellular infection of influenza virus, the amount of influenza virus infection in the lungs of bone marrow chimeric mice was examined.

インフルエンザウイルス投与７日目にインフルエンザM2蛋白を用いて免疫蛍光染色にて検討した (図2E)。レシピエントが野生型のマウス (BMWT→WT, BMOX40LKO→WT)では、細気管支領域を中心にインフルエンザM2蛋白の発現を認めた。一方、レシピエントがOX40L欠損のマウス (BMWT→OX40LKO,BMOX40LKO→OX40LKO)では、この細気管支領域におけるM2蛋白の発現が低下していた。   On the 7th day after the influenza virus administration, it was examined by immunofluorescence staining using influenza M2 protein (FIG. 2E). In mice with wild recipients (BMWT → WT, BMOX40LKO → WT), expression of influenza M2 protein was observed mainly in the bronchiole region. On the other hand, the expression of M2 protein in the bronchiole region was reduced in mice with OX40L deficiency (BMWT → OX40LKO, BMOX40LKO → OX40LKO).

次に、インフルエンザウイルス投与７日目に肺内のインフルエンザM2蛋白をウエスタンブロット法にて検討した (図2D)。肺内インフルエンザM2蛋白は蛍光染色と同様に、レシピエントが野生型マウスでは、気道上皮細胞と肺胞にM2蛋白を多く認めたのに対して、レシピエントがOX40L欠損マウスでは肺内でのM2蛋白が軽減していた。   Next, on day 7 after influenza virus administration, influenza M2 protein in the lung was examined by Western blotting (FIG. 2D). Similar to fluorescent staining, intrapulmonary influenza M2 protein was found in the recipient mice in the wild-type mice, and M2 protein was found in airway epithelial cells and alveoli. Protein was reduced.

上記の結果より、非骨髄細胞由来のOX40Lがインフルエンザウイルスの細胞内感染に重要である事が示唆された。   From the above results, it was suggested that OX40L derived from non-myeloid cells is important for intracellular infection of influenza virus.

参考例３ インフルエンザ肺炎で肺のOX40L陽性細胞数が増加する。また、 OX40L陽性細胞の約25%は気道上皮前駆細胞群と一致する
(1) インフルエンザ致死性肺炎におけるOX40Lの発現の検討
最初にインフルエンザ致死性肺炎モデルにおける全肺のOX40L陽性細胞数の増加を検討した (図3A)。対照としてPBS (Mock)のみを投与したマウスを使用した。OX40Lの発現はMockに比較してインフルエンザ投与後ではOX40L発現細胞割合 (OX40L陽性割合/肺 インフルエンザ肺炎: 8.8±0.6%, Mock: 1.7%±0.9%, P < 0.05, N = 3)、 OX40L陽性細胞数が増加していた (OX40L陽性細胞数/肺 インフルエンザ肺炎: 776700±33974個, Mock: 109800±43312個, P < 0.05, N = 3)。
(2) OX40L陽性細胞追跡
次に、インフルエンザ致死性肺炎モデルにおける非骨髄細胞のOX40L発現細胞の割合を検討した (図3B)。インフルエンザ肺炎における全肺のOX40L陽性細胞の約75%は血球・内皮マーカーであるCD31/45陽性細胞 (血球細胞,内皮細胞)であったが、約25%はCD31/45陰性細胞 (上皮細胞)であった (CD31/45陰性細胞割合/肺のOX40L陽性細胞: 24.6±1%, CD31/45陽性細胞割合/肺のOX40L陽性細胞: 75.6±1.1%, N = 3)。 Reference Example 3 Influenza pneumonia increases the number of OX40L positive cells in the lung. In addition, about 25% of OX40L positive cells are consistent with the airway epithelial progenitor cell group
(1) Examination of expression of OX40L in influenza lethal pneumonia First, an increase in the number of OX40L positive cells in all lungs in an influenza lethal pneumonia model was examined (FIG. 3A). As a control, mice administered with only PBS (Mock) were used. OX40L expression after flu administration compared to Mock OX40L-expressing cells ratio (OX40L positive ratio / pulmonary influenza pneumonia: 8.8 ± 0.6%, Mock: 1.7% ± 0.9%, P <0.05, N = 3), OX40L positive The number of cells was increased (OX40L positive cells / lung influenza pneumonia: 776700 ± 33974, Mock: 109800 ± 43312, P <0.05, N = 3).
(2) OX40L-positive cell tracking Next, the ratio of non-myeloid cells expressing OX40L in an influenza lethal pneumonia model was examined (FIG. 3B). Approximately 75% of all lung OX40L positive cells in influenza pneumonia were CD31 / 45 positive cells (blood cells, endothelial cells), which are blood cells / endothelial markers, but approximately 25% were CD31 / 45 negative cells (epithelial cells) (CD31 / 45 negative cell ratio / lung OX40L positive cells: 24.6 ± 1%, CD31 / 45 positive cell ratio / lung OX40L positive cells: 75.6 ± 1.1%, N = 3).

次にCD31/45陰性・OX40L陽性細胞を更に細分化する為に以前に報告されたフローサイトメトリーでの上皮細胞の細分化の分類を使用し、検討した (図3C)（Kim CF, Jackson EL, Woolfenden AE, et al. Cell. 2005;121(6):823-35.）。CD31/45陰性・OX40L陽性細胞のうち98%は間葉系マーカーであるCD34陰性で、幹細胞マーカーであるSca1弱陽性の細胞群であった。また、この細胞群のうち約88％は、 気道上皮前駆細胞の細胞群である自己蛍光が弱い細胞群と一致した。   Next, we used the previously reported flow cytometry classification of epithelial cell subdivision to further subdivide CD31 / 45 negative and OX40L positive cells (Fig. 3C) (Kim CF, Jackson EL Woolfenden AE, et al. Cell. 2005; 121 (6): 823-35.). Of the CD31 / 45 negative and OX40L positive cells, 98% were CD34 negative, a mesenchymal marker, and a weak group of Sca1, a stem cell marker. In addition, about 88% of these cell groups coincided with the cell group with weak autofluorescence, which is a group of airway epithelial progenitor cells.

参考例４ 気道上皮前駆細胞はインフルエンザ肺炎にてOX40Lの発現が増強した
次に気道上皮前駆細胞のOX40Lの発現割合を検討した (図6A)。Mockでは、気道上皮前駆細胞のOX40L発現は軽度であるのに対して、インフルエンザ致死性肺炎では、気道上皮前駆細胞のOX40Lの発現が増強された (OX40L 発現細胞割合 インフルエンザ:41%, Mock 9%)。 Reference Example 4 The expression rate of OX40L in airway epithelial progenitor cells was examined after the increase of OX40L expression in influenza pneumonia (FIG. 6A). In Mock, the expression of OX40L in airway epithelial progenitor cells was mild, while in flu lethal pneumonia, the expression of OX40L in airway epithelial progenitor cells was enhanced. ).

次に気道上皮前駆細胞のOX40LのmRNAの発現量を検討した (図6B)。インフルエンザ致死性肺炎では気道上皮前駆細胞のOX40LのmRNA量はMockに比べて増強していた (気道上皮前駆細胞のOX40L mRNA発現比 インフルエンザ肺炎: 11.5±3.7, Mock:1±0.3, P < 0.05, N = 3)。インフルエンザ肺炎7日後のクララ細胞は激減しているため、RNAを作製するのに十分な量が確保できず、測定できなかった。   Next, the expression level of OX40L mRNA in airway epithelial progenitor cells was examined (FIG. 6B). In influenza lethal pneumonia, the amount of OX40L mRNA in airway epithelial progenitor cells was increased compared to that of Mock (influenza pneumonia: 11.5 ± 3.7, Mock: 1 ± 0.3, P <0.05, N = 3). Since the Clara cells 7 days after influenza pneumonia decreased dramatically, it was not possible to obtain a sufficient amount for RNA production and measurement.

最後に気道上皮前駆細胞のOX40L蛋白の発現を免疫蛍光染色にて検討した (図6C)。インフルエンザウイルス投与7日目に気道上皮前駆細胞とクララ細胞をフローサイトメトリーにて選別・回収し、 OX40L蛋白の発現とDAPIにて核染色した。気道上皮前駆細胞ではOX40Lを発現しているのに対して、クララ細胞ではOX40Lの発現を認めなかった。   Finally, the expression of OX40L protein in airway epithelial progenitor cells was examined by immunofluorescence staining (FIG. 6C). On day 7 after influenza virus administration, airway epithelial progenitor cells and Clara cells were selected and collected by flow cytometry, and OX40L protein expression and nuclear staining with DAPI were performed. Airway epithelial progenitor cells expressed OX40L, whereas Clara cells did not express OX40L.

インフルエンザ感染にて気道上皮前駆細胞はOX40Lの発現を増強した(図6A-図6C)。   Respiratory epithelial progenitor cells enhanced OX40L expression in influenza infection (FIGS. 6A-6C).

参考例５ インフルエンザ肺炎にて気道上皮前駆細胞数は増加する
次に致死性インフルエンザ肺炎モデルにおける気道上皮前駆細胞数の変化を検討した。Stript等はフローサイトメトリーにて、CD31かつ45陰性の上皮細胞群の中で、間葉系マーカーであるCD34が陰性・幹細胞マーカーであるSca1が弱陽性の細胞群の内、自己蛍光が弱い細胞を気道上皮前駆細胞、自己蛍光が強い細胞群がクララ細胞と報告した 25)。最初に、実際に行ったフローサイトメトリーでの気道上皮前駆細胞の同定を図4Aに挿入する。 Reference Example 5 The number of airway epithelial progenitor cells increases in influenza pneumonia Next, the change in the number of airway epithelial progenitor cells in a lethal influenza pneumonia model was examined. Stript et al. Show that cells of CD31 and 45 negative epithelial cells are negative for mesenchymal marker CD34 and stem cell marker Sca1 is weakly positive among cells that have weak autofluorescence. Airway epithelial progenitor cells and a group of cells with strong autofluorescence were reported as Clara cells 25) First, the actual identification of airway epithelial progenitor cells by flow cytometry is inserted in FIG. 4A.

次にインフルエンザ致死性肺炎モデルにおける気道上皮前駆細胞数とクララ細胞数をフローサイトメトリーにて検討した (図4B,図4C)。気道上皮前駆細胞数はインフルエンザ致死性肺炎にて共に増加していた (気道上皮前駆細胞数/肺 インフルエンザ致死性肺炎： 46.1±4.6 ×104個, Mock14.7±4.1 ×104個, P < 0.05, N = 3)。一方、クララ細胞数は有意に減少した (クララ細胞数/肺 インフルエンザ致死性肺炎: 2.7±0.2 ×104個, Mock 24.5±3.9 ×104個, P < 0.05, N = 3)。 Next, the number of airway epithelial progenitor cells and Clara cells in the influenza lethal pneumonia model was examined by flow cytometry (FIGS. 4B and 4C). The number of airway epithelial progenitor cells was increased in both cases of influenza lethal pneumonia (Airway epithelial progenitor cells / lung influenza lethal pneumonia: 46.1 ± 4.6 × 10 4 cells, Mock14.7 ± 4.1 × 10 4 cells, P < 0.05, N = 3). On the other hand, the number of Clara cells decreased significantly (Clara cell number / pulmonary influenza lethal pneumonia: 2.7 ± 0.2 × 10 4 cells, Mock 24.5 ± 3.9 × 10 4 cells, P <0.05, N = 3).

参考例６ インフルエンザ肺炎での気道上皮前駆細胞数の増加を他のマーカー(CCSP/SPC)を用いて確認した
気道上皮前駆細胞は細胞内蛋白であるクララ細胞のマーカーであるCCSP と2型肺胞上皮細胞のマーカーであるSPCが共陽性である事が報告されている 30)。次にインフルエンザ致死性肺炎での気道上皮前駆細胞数の変化を、細胞内マーカーであるCCSPとSPCを用いて免疫蛍光染色にて検討した。最初に気道上皮前駆細胞とクララ細胞をフローサイトメトリーにて選別・回収し、個々の細胞のCCSPとSPCの発現を検討した (図5A)。以前の報告の様に気道上皮前駆細胞はCCSPとSPCが陽性であった、一方、クララ細胞はCCSPのみ陽性であった。 Reference Example 6 An increase in the number of airway epithelial progenitor cells in influenza pneumonia was confirmed using other markers (CCSP / SPC). The airway epithelial progenitor cells are CCSP and type 2 alveoli, markers of Clara cells, which are intracellular proteins. It has been reported that SPC, a marker for epithelial cells, is co-positive 30). Next, changes in the number of airway epithelial progenitor cells in influenza lethal pneumonia were examined by immunofluorescent staining using intracellular markers CCSP and SPC. First, airway epithelial progenitor cells and Clara cells were selected and collected by flow cytometry, and the expression of CCSP and SPC in individual cells was examined (FIG. 5A). As previously reported, airway epithelial progenitor cells were positive for CCSP and SPC, whereas Clara cells were positive only for CCSP.

次にインフルエンザ致死性肺炎モデルにおける肺組織にてCCSP・SPC共陽性細胞数を検討した (図5B)。コントロールとして、PBS (Mock)のみを投与したマウスの肺組織を使用した。CCSP・SPC共陽性細胞はMockでは細気管支領域に数個存在しているのに対し、インフルエンザ致死性肺炎では気道上皮前駆細胞は炎症部分において増加していた。   Next, the number of CCSP / SPC co-positive cells was examined in lung tissue in an influenza lethal pneumonia model (FIG. 5B). As a control, lung tissue of a mouse administered with PBS (Mock) alone was used. CCSP / SPC co-positive cells were present in several bronchioles in Mock, whereas airway epithelial progenitor cells increased in the inflamed part in influenza lethal pneumonia.

次にCCSP・SPC陽性細胞 (気道上皮前駆細胞)数を定量する為にTissue FACSを用いて定量した (図5C)。MockではCCSP・SPC陽性細胞は2％であったのに対して、インフルエンザ肺炎では4％と増加していた。   Next, in order to quantify the number of CCSP / SPC-positive cells (airway epithelial progenitor cells), it was quantified using Tissue FACS (FIG. 5C). In Mock, the number of CCSP / SPC positive cells was 2%, while that in influenza pneumonia increased to 4%.

上記２つの異なる実験 (図4、 5)から、 インフルエンザ肺炎にて気道上皮前駆細胞数が増加している事を示した。また、炎症部にて増加している事から、炎症の修復に関与している事が示唆された。   The two different experiments (Figs. 4 and 5) showed that the number of airway epithelial progenitor cells was increased in influenza pneumonia. Moreover, since it increased in the inflamed part, it was suggested that it is concerned in the repair of inflammation.

参考例７ 気道上皮前駆細胞はインフルエンザウイルスに易感染性であり、また、気道上皮前駆細胞のOX40Lはインフルエンザウイルスとの局在が一致する
(1) 気道上皮前駆細胞はインフルエンザウイルスに易感染性である
次に、気道上皮前駆細胞のインフルエンザウイルスへの感受性に関して検討した。インフルエンザウイルスを投与３日後に、気道上皮前駆細胞とクララ細胞内のインフルエンザヌクレオプロテイン(Nucleoprotein:以下 Flu NP)を用いてRT-PCRにて比較・検討した (図7A)。気道上皮前駆細胞はクララ細胞に比べて細胞内の感染ウイルス量が増加していた (定量Flu NP発現比 気道上皮前駆細胞： 31.2±1.6, クララ細胞:1±0.5, P < 0.05, N = 3)。
(2) 気道上皮前駆細胞のOX40Lはインフルエンザウイルスと局在が一致した。 Reference Example 7 Airway epithelial progenitor cells are susceptible to influenza virus, and airway epithelial progenitor cells OX40L have the same localization as influenza virus
(1) Airway epithelial progenitor cells are susceptible to influenza virus Next, we examined the sensitivity of airway epithelial progenitor cells to influenza virus. Three days after administration of influenza virus, RT-PCR was used for comparison and examination using airway epithelial progenitor cells and influenza nucleoprotein (hereinafter referred to as Flu NP) in Clara cells (FIG. 7A). Airway epithelial progenitor cells had an increased amount of intracellular infectious virus compared to Clara cells (quantitative Flu NP expression ratio Airway epithelial progenitor cells: 31.2 ± 1.6, Clara cells: 1 ± 0.5, P <0.05, N = 3 ).
(2) OX40L of airway epithelial progenitor cells was localized with influenza virus.

以上の結果より、インフルエンザ致死性肺炎モデルにて、気道上皮前駆細胞はOX40Lの発現を増強すると共に、インフルエンザウイルス感染量が同様に増加していた。この事から、気道上皮前駆細胞のOX40Lがインフルエンザウイルスの細胞内感染に関与すると仮定し、インフルエンザ致死性肺炎における気道上皮前駆細胞のOX40Lの機能を検討した。   From the above results, in the influenza lethal pneumonia model, airway epithelial progenitor cells enhanced the expression of OX40L, and the amount of influenza virus infection increased similarly. Based on this, we hypothesized that OX40L, an airway epithelial progenitor cell, was involved in intracellular infection of influenza virus, and examined the function of OX40L, an airway epithelial progenitor cell in influenza lethal pneumonia.

インフルエンザウイルス投与３日後に、気道上皮前駆細胞とクララ細胞をフローサイトメトリーにて選別・回収し、インフルエンザM2蛋白とOX40L蛋白の発現と両蛋白の局在を免疫蛍光染色にて検討した (図7B)。気道上皮前駆細胞ではOX40L蛋白の発現が増強すると共に、インフルエンザM2蛋白の発現も認めた。一方、クララ細胞は、OX40Lの発現は認めず、インフルエンザM2蛋白発現も軽度であった。また、気道上皮前駆細胞のOX40L蛋白とインフルエンザM2蛋白の局在は一致していた。
(3) OX40L陽性細胞はインフルエンザウイルスに易感染性である
次にOX40L陽性細胞のインフルエンザウイルス感受性をRT-PCR法にて検討した (図7C)。OX40L陽性細胞は陰性細胞に比べて易感染性であった (定量Flu NP/肺 OX40L陽性細胞： 6.8±1.88, OX40L陰性細胞: 1±0.2, P < 0.05, N = 3)。 Three days after influenza virus administration, airway epithelial progenitor cells and Clara cells were selected and collected by flow cytometry, and the expression of influenza M2 protein and OX40L protein and the localization of both proteins were examined by immunofluorescence staining (Fig. 7B). ). In airway epithelial progenitor cells, expression of OX40L protein was enhanced and influenza M2 protein was also expressed. On the other hand, Clara cells showed no expression of OX40L and mild expression of influenza M2 protein. The localization of OX40L protein and influenza M2 protein in airway epithelial progenitor cells was consistent.
(3) OX40L-positive cells are easily infectious to influenza virus Next, susceptibility of OX40L-positive cells to influenza virus was examined by RT-PCR (FIG. 7C). OX40L positive cells were more susceptible than negative cells (quantitative Flu NP / lung OX40L positive cells: 6.8 ± 1.88, OX40L negative cells: 1 ± 0.2, P <0.05, N = 3).

次にインフルエンザウイルスの感染量を蛋白レベルにて検討する為、OX40L陽性細胞と陰性細胞をフローサイトメトリーにて選別・回収し、インフルエンザM2蛋白とDAPIにて蛍光染色で比較・検討した (図7D)。OX40L陽性細胞は、インフルエンザM2蛋白陽性細胞が多いのに対して、OX40L陰性細胞では少数であった。   Next, to examine the amount of influenza virus infection at the protein level, OX40L positive and negative cells were selected and collected by flow cytometry, and compared and examined by fluorescent staining with influenza M2 protein and DAPI (Fig. 7D). ). The number of OX40L positive cells was large in influenza M2 protein positive cells, whereas the number of OX40L negative cells was small.

OX40L陽性細胞はインフルエンザウイルスに易感染性であり、また、気道上皮前駆細胞のOX40Lとインフルエンザウイルスの局在が一致した(図7A-図7D)。   OX40L positive cells were susceptible to influenza virus, and OX40L in airway epithelial progenitor cells coincided with the localization of influenza virus (FIGS. 7A-7D).

参考例８ OX40Lの欠損は気道上皮前駆細胞のインフルエンザウイルス感染性を低下した
(1) OX40L欠損マウスではインフルエンザウイルス感染量が低下する
次に野生型・OX40L欠損マウスを用いてインフルエンザウイルスの細胞内感染量を比較・検討した。 Reference Example 8 Deficiency of OX40L decreased influenza virus infectivity of airway epithelial progenitor cells
(1) Influenza virus infection amount decreases in OX40L-deficient mice Next, the intracellular infection amount of influenza virus was compared and examined using wild-type and OX40L-deficient mice.

インフルエンザ肺炎モデルにおける野生型マウスとOX40L欠損マウスのインフルエンザウイルス量を、1・3・5・7日目にウエスタンブロッティング法にて検討した (図8A)。野生型マウスでは３日目をピークに5・7日目と徐々にインフルエンザタンパク量が減少した。一方、OX40L欠損マウスでは、野生型に比較して3日目での肺内のウイルス蛋白量が低下していた。また、同様に5・7日目でも肺内のインフルエンザ蛋白量は更に低下していた。   The amount of influenza virus in wild type mice and OX40L-deficient mice in the influenza pneumonia model was examined by Western blotting on days 1, 3, 5 and 7 (FIG. 8A). In wild-type mice, the amount of influenza protein gradually decreased from the third day to the fifth and seventh days. On the other hand, in the OX40L-deficient mice, the amount of viral protein in the lung decreased on the third day compared to the wild type. Similarly, the amount of influenza protein in the lungs further decreased on the 5th and 7th days.

次にインフルエンザモデルにおけるインフルエンザ蛋白の発現量を免疫蛍光染色にて検討した (図8B)。野生型マウスでは細気管支領域にてインフルエンザM2蛋白の発現を多く認めたが、OX40L欠損マウスでは同部位のM２蛋白の発現が低下していた。
(2) OX40L欠損でのインフルエンザウイルス量の低下は、気道上皮前駆細胞に依存した。 Next, the expression level of influenza protein in the influenza model was examined by immunofluorescent staining (FIG. 8B). In wild-type mice, a large amount of influenza M2 protein was observed in the bronchiole region, while in OX40L-deficient mice, the expression of M2 protein at the same site was decreased.
(2) Decrease in the amount of influenza virus due to OX40L deficiency depended on airway epithelial progenitor cells.

次に、野生型マウスとOX40L欠損マウスでの気道上皮前駆細胞のインフルエンザ感染量を比較・検討した。インフルエンザウイルス投与３日後に、気道上皮前駆細胞の細胞内ウイルス感染量をRT-PCR法にて検討した (図8C)。OX40L欠損マウスは野生型マウスに比較して気道上皮前駆細胞内のインフルエンザウイルスmRNAが低下した (定量Flu NP発現比 野生型マウスの気道上皮前駆細胞： 6.84±1.3, OX40L欠損マウスの気道上皮前駆細胞 : 1±0.5, P < 0.05, N = 3)。   Next, we compared and examined the amount of influenza infection of airway epithelial progenitor cells in wild-type mice and OX40L-deficient mice. Three days after influenza virus administration, the amount of intracellular virus infection of airway epithelial progenitor cells was examined by RT-PCR (FIG. 8C). Influenza virus mRNA in airway epithelial progenitor cells decreased in OX40L-deficient mice compared to wild-type mice (quantitative Flu NP expression ratio airway epithelial progenitor cells in wild-type mice: 6.84 ± 1.3, airway epithelial progenitor cells in OX40L-deficient mice : 1 ± 0.5, P <0.05, N = 3).

図8A-図8Cより、気道上皮前駆細胞のOX40Lはインフルエンザウイルスの細胞内感染に重要である事が示された。   8A-8C show that OX40L, an airway epithelial progenitor cell, is important for intracellular infection with influenza virus.

参考例９ 気道上皮前駆細胞はインフルエンザ受容体を有する
次に、気道上皮前駆細胞のインフルエンザ易感染性がインフルエンザ受容体に依存するのかを検討した。 Reference Example 9 Airway epithelial progenitor cells have influenza receptors Next, it was examined whether the influenza susceptibility of airway epithelial progenitor cells depends on influenza receptors.

気道上皮前駆細胞とクララ細胞のインフルエンザ受容体の発現をフローサイトメトリーにて検討した (図9A)。気道上皮前駆細胞はクララ細胞よりα-2,6-シアル酸の陽性細胞が多かった (α-2,6-シアル酸陽性細胞割合/肺 気道上皮前駆細胞： 54％, クララ細胞： 34％)。   The expression of influenza receptors in airway epithelial progenitor cells and Clara cells was examined by flow cytometry (FIG. 9A). Airway epithelial progenitor cells had more α-2,6-sialic acid positive cells than Clara cells (ratio of α-2,6-sialic acid positive cells / lung airway epithelial progenitor cells: 54%, Clara cells: 34%) .

次に気道上皮前駆細胞とクララ細胞をフロサイトメトリーにて選別・回収し、免疫蛍光染色にてα-2,6-シアル酸の発現を検討した (図9B)。気道上皮前駆細胞はα-2,6-シアル酸の発現を認めたが、クララ細胞ではα-2,6-シアル酸の発現を認めなかった。   Next, airway epithelial progenitor cells and Clara cells were selected and collected by flow cytometry, and expression of α-2,6-sialic acid was examined by immunofluorescence staining (FIG. 9B). Airway epithelial progenitor cells expressed α-2,6-sialic acid, whereas Clara cells did not express α-2,6-sialic acid.

最後にα-2,6-シアル酸産生に関与するα-2,6-シアル酸転移酵素であるST6Galの発現量をmicroarrayにて検討した (図9C)。しかし、ST6galの発現量はクララ細胞の方が気道上皮前駆細胞より多かった (ST6galマイクロアレイ値 気道上皮前駆細胞：1126±292 クララ細胞：2085±101, P < 0.05, N = 図9A-図9Cの結果より、気道上皮前駆細胞がインフルエンザ受容体であるα-2,6-シアル酸を発現している事を示し、これはST6Gal1に関連しなかった。   Finally, the expression level of ST6Gal, an α-2,6-sialyltransferase involved in α-2,6-sialic acid production, was examined using a microarray (FIG. 9C). However, the expression level of ST6gal was higher in Clara cells than in airway epithelial progenitor cells (ST6gal microarray value: Airway epithelial progenitor cells: 1126 ± 292 Clara cells: 2085 ± 101, P <0.05, N = Figure 9A-Figure 9C The results showed that airway epithelial progenitor cells expressed α-2,6-sialic acid, an influenza receptor, which was not related to ST6Gal1.

参考例１０マウスOX40Lの強発現はインフルエンザ受容体の付加を増強し、インフルエンザの細胞内感染量を増加させる
(1) マウスOX40Lの強発現はインフルエンザウイルスの細胞内感染を増加する
上記の結果より気道上皮前駆細胞に発現する糖タンパクであるOX40Lがインフルエンザ受容体であるα-2,6-シアル酸を付加される事により、インフルエンザウイルスの細胞内感染を増悪すると仮定した。これを検討する為にマウスOX40Lの発現系を作製・検討した。まず、OX40Lの遺伝子導入が成功している事を確認する為にRT-PCR法にて細胞のマウスOX40L発現を確認した。陰性コントロールとして逆転写酵素を加えないものを使用した (図10A)。 Reference Example 10 Strong expression of mouse OX40L enhances influenza receptor addition and increases influenza intracellular infection
(1) Strong expression of mouse OX40L increases intracellular infection of influenza virus From the above results, OX40L, a glycoprotein expressed in airway epithelial progenitor cells, adds α-2,6-sialic acid, an influenza receptor. As a result, it was assumed that the intracellular infection of influenza virus was exacerbated. In order to examine this, a mouse OX40L expression system was prepared and examined. First, in order to confirm that OX40L gene transfer was successful, the expression of mouse OX40L in cells was confirmed by RT-PCR. A negative control without reverse transcriptase was used (FIG. 10A).

次にOX40Lの遺伝子発現系を用いて、インフルエンザウイルスの細胞への感染量をRT-PCR法にて比較した (図10B)。マウスOX40LプラスミドはNullプラスミドに比較してインフルエンザウイルスの細胞内感染量が増加した (定量Flu NP OX40Lプラスミド： 15.9±0.4, Nullプラスミド: 10.3±0.1, P < 0.05, N = 3)。   Next, using the OX40L gene expression system, the amount of influenza virus infecting cells was compared by RT-PCR (FIG. 10B). Mouse OX40L plasmid increased the amount of influenza virus intracellular infection compared to Null plasmid (quantitative Flu NP OX40L plasmid: 15.9 ± 0.4, Null plasmid: 10.3 ± 0.1, P <0.05, N = 3).

次にマウスOX40Lの発現とインフルエンザウイルス吸着の関連を検討するため、 免疫蛍光染色にて両蛋白の発現と局在を比較した (図10C)。遺伝子導入したMDCK細胞とコントロールMDCK細胞にインフルエンザウイルスを感染した後、細胞をOX40L蛋白とインフルエンザM2蛋白にて染色した。マウスOX40L発現MDCK細胞では、コントロールMDCK細胞に比べ、インフルエンザM2蛋白の発現が増加した。また、マウスOX40L蛋白とインフルエンザM2蛋白の局在は一致した。
(2) マウスOX40Lの発現はα-2,6-シアル酸の付加を増強する
次に、OX40Lとインフルエンザ受容体であるα-2,6-シアル酸との関連を検討するため、α-2,6-シアル酸の付加される量をフローサイトメトリーにて検討した (図10C)。 Next, in order to investigate the relationship between mouse OX40L expression and influenza virus adsorption, the expression and localization of both proteins were compared by immunofluorescence staining (FIG. 10C). After the gene-transferred MDCK cells and control MDCK cells were infected with influenza virus, the cells were stained with OX40L protein and influenza M2 protein. In mouse OX40L-expressing MDCK cells, influenza M2 protein expression increased compared to control MDCK cells. The localization of mouse OX40L protein and influenza M2 protein was consistent.
(2) Expression of mouse OX40L enhances the addition of α-2,6-sialic acid Next, in order to investigate the relationship between OX40L and influenza receptor α-2,6-sialic acid, α-2 The amount of 6,6-sialic acid added was examined by flow cytometry (FIG. 10C).

マウスOX40L発現MDCK細胞はコントロールベクターに比較してα-2,6-シアル酸の付加量が増加していた (α-2,6-シアル酸付加量 (平均蛍光強度) OX40Lプラスミド： 27750, Nullプラスミド： 9211)。   Mouse OX40L-expressing MDCK cells had increased α-2,6-sialic acid addition compared to control vector (α-2,6-sialic acid addition (average fluorescence intensity) OX40L plasmid: 27750, Null Plasmid: 9211).

参考例１１ ヒトOX40Lの強発現はインフルエンザ受容体発現量の付加量を増加し、インフルエンザ細胞内感染を増加させる
(1) ヒトOX40Lはインフルエンザ細胞内感染を増加する
次にヒトのOX40LがマウスOX40Lと同様の機能を有するかを検討した。同様にヒトOX40LをMDCK細胞に遺伝子導入した発現系を作製した。最初に、遺伝子導入が成功している事を確認するため、RT-PCR法とフローサイトメトリーにてOX40Lの発現を確認した (図11A)。 Reference Example 11 Strong expression of human OX40L increases the amount of influenza receptor expression and increases influenza intracellular infection
(1) Human OX40L increases influenza intracellular infection Next, we examined whether human OX40L has the same function as mouse OX40L. Similarly, an expression system in which human OX40L was introduced into MDCK cells was prepared. First, in order to confirm that the gene transfer was successful, the expression of OX40L was confirmed by RT-PCR and flow cytometry (FIG. 11A).

次にインフルエンザウイルスの細胞内感染量をRT-PCR法にて比較した (図11C)。ヒトOX40L発現MDCK細胞は、コントロールに比較してインフルエンザウイルスの細胞内感染量が増加した (定量Flu NP OX40Lプラスミド： 11.4±1.1, Nullプラスミド: 1±0.4, P < 0.05, N = 3)。
(2) ヒトOX40Lの発現はα-2,6-シアル酸の糖付加を増加する
次にヒトOX40Lとα-2,6-シアル酸との関連を検討した (図11D)。ヒトOX40L発現MDCK細胞ははコントロールに比べ、α-2,6-シアル酸の付加量が多かった (α-2,6-シアル酸付加量 (平均蛍光強度) OX40Lプラスミド： 26312±1578, Nullプラスミド： 14309±2070, P < 0.05, N = 3)
以上よりヒトOX40Lの強発現はインフルエンザ受容体であるα-2,6-シアル酸付加を増強し、インフルエンザウイルスの細胞内感染を増加させることを示唆した。 Next, the intracellular infection amount of influenza virus was compared by RT-PCR (FIG. 11C). In human OX40L-expressing MDCK cells, the intracellular infection amount of influenza virus increased compared to the control (quantitative Flu NP OX40L plasmid: 11.4 ± 1.1, Null plasmid: 1 ± 0.4, P <0.05, N = 3).
(2) Expression of human OX40L increases α-2,6-sialic acid glycosylation Next, the relationship between human OX40L and α-2,6-sialic acid was examined (FIG. 11D). Human OX40L-expressing MDCK cells had more α-2,6-sialic acid added than controls (α-2,6-sialic acid added (average fluorescence intensity) OX40L plasmid: 26312 ± 1578, Null plasmid : 14309 ± 2070, P <0.05, N = 3)
These results suggest that the strong expression of human OX40L enhances the addition of α-2,6-sialic acid, an influenza receptor, and increases influenza virus intracellular infection.

実施例１ ヒトOX40Lの90番アスパラギン (Asn)がインフルエンザ細胞内感染に重要である
(1) ヒトOX40Lの90番アスパラギンがインフルエンザ感染を増悪に重要である
インフルエンザウイルスの受容体であるα-2,6-シアル酸はN結合型の糖鎖であり、Asn-X-Ser/ Ttrの特異的なアミノ酸配列のアスパラギン (Asn)に糖付加される事が知られている（Petrescu AJ、 Milac AL, Petrescu SM, et al. Glycobiology. 2004;14(2):103-14.）。人OX40Lでは183個のアミノ酸より構成されており、この特異的なアミノ酸配列は90・114・152・157番に４カ所存在する。インフルエンザウイルスの細胞内感染にどのアミノ酸が重要であるのかを種々の変異プラスミドを用い、検討した。OX40Lの糖付加部位と作製したプラスミドを図12Aに挿入した。 Example 1 Human OX40L No. 90 asparagine (Asn) is important for influenza intracellular infection
(1) Human OX40L 90th asparagine is important for exacerbating influenza infection Influenza virus receptor α-2,6-sialic acid is an N-linked sugar chain, Asn-X-Ser / Ttr It is known that a sugar is added to asparagine (Asn) having a specific amino acid sequence (Petrescu AJ, Milac AL, Petrescu SM, et al. Glycobiology. 2004; 14 (2): 103-14.). Human OX40L is composed of 183 amino acids, and there are four specific amino acid sequences at 90, 114, 152, and 157. We examined which amino acids are important for intracellular infection of influenza virus using various mutant plasmids. The sugar addition site of OX40L and the prepared plasmid were inserted into FIG. 12A.

種々の変異プラスミドをMDCK細胞に遺伝子導入し、インフルエンザウイルスの感染量をRT-PCR法にて比較した (図12B)。121-183番のアミノ酸を欠損したプラスミド (以下：121Lys)と、114番のAsnをAlaに変異したプラスミド (以下：114Asn)では、全長OX40Lプラスミドに比べ、インフルエンザウイルス量に変化を認めなかった。一方、57-183番のアミノ酸を欠損したプラスミド (以下: 57Pro)、90番AsnをAlaに変異したプラスミド (以下: 90Asn)では、全長OX40Lに比べ、インフルエンザ感染量が増加していた (Flu NP 発現比 (対全長OX40Lプラスミド): OX40L Full: 18.6 ±6.5, 121Lys: 17.0±4.0 , 57Pro: 2.9±0.1, P < 0.05 114Asn: 16.1±0.7, 90Asn: 0.9±0.3, P < 0.05 pNull: 1±0.2, P < 0.05, N = 3)。
(2) ヒトOX40Lの90番アスパラギンにα-2,6-シアル酸が付加に重要である
次に種々の変異プラスミドをMDCK細胞に遺伝子導入し、α-2,6-シアル酸の付加量をフローサイトメトリーにて比較した (図12C)。インフルエンザ感染量と同様に、121Lysと114Asnでは全長OX40Lプラスミドに比べ、α-2,6-シアル酸付加量に変化を認めなかった。一方、57Proと90Asnでは全長OX40Lに比べ、α-2,6-シアル酸付加量が増加していた (％シアル酸付加細胞MFI値 ;対全長OX40Lプラスミド 全長OX40L: 185 ±18.4%, 121Lys: 167±7.1%, 57Pro: 114±6.8%, P < 0.05, 114Asn: 158±3.2%, 90Asn: 122±3.0%, P < 0.05, pNull: 100±6.9%, P < 0.05, N = 3)。 Various mutant plasmids were introduced into MDCK cells, and the amount of influenza virus infection was compared by RT-PCR (FIG. 12B). In the plasmid lacking amino acids 121-183 (hereinafter: 121 Lys) and the plasmid in which Asn at position 114 was mutated to Ala (hereinafter: 114 Asn), there was no change in the amount of influenza virus compared to the full-length OX40L plasmid. It was. On the other hand, in the plasmid lacking amino acids 57-183 (hereinafter: 57 Pro) and the plasmid in which 90th Asn was mutated to Ala (hereinafter: 90 Asn), the amount of influenza infection increased compared to the full-length OX40L ( Flu NP expression ratio (vs. full length OX40L plasmid): OX40L Full: 18.6 ± 6.5, 121 Lys: 17.0 ± 4.0, 57 Pro: 2.9 ± 0.1, P <0.05 114 Asn: 16.1 ± 0.7, 90 Asn: 0.9 ± 0.3, P <0.05 pNull: 1 ± 0.2, P <0.05, N = 3).
(2) α-2,6-sialic acid is important for addition to human OX40L 90 asparagine Next, various mutated plasmids are introduced into MDCK cells to determine the amount of α-2,6-sialic acid added. Comparison was made by flow cytometry (FIG. 12C). Similar to the amount of influenza infection, 121 Lys and 114 Asn showed no change in the amount of α-2,6-sialic acid added compared to the full-length OX40L plasmid. On the other hand, in 57 Pro and 90 Asn, α-2,6-sialic acid addition amount increased compared to full-length OX40L (% sialic acid-added cell MFI value; full-length OX40L plasmid full-length OX40L: 185 ± 18.4%, 121 Lys: 167 ± 7.1%, 57 Pro: 114 ± 6.8%, P <0.05, 114 Asn: 158 ± 3.2%, 90 Asn: 122 ± 3.0%, P <0.05, pNull: 100 ± 6.9%, P <0.05, N = 3).

以上の結果より、ヒトOX40Lの90番アスパラギンにインフルエンザ受容体を付加され、インフルエンザの細胞内感染に重要であった。   From the above results, influenza receptor was added to human OX40L 90th asparagine, which was important for intracellular infection of influenza.

実施例２ 抗OX40L中和抗体はインフルエンザ肺炎を抵抗性を示す
次に、抗OX40L中和抗体のインフルエンザ致死性肺炎モデルでの効果を検討した。0日目に野生型マウスにインフルエンザウイルスを投与、翌日に抗OX40L中和抗体を経鼻投与し、 生存期間を確認し体重を測定した (図13A)。陰性コントロールには非特異的抗体を投与した。非特異的抗体は全てのマウスが6日目より死亡数が増加し、10日目に全て死亡した。一方、抗OX40L中和抗体を投与したマウスは4割が生存した (P < 0.05, N = 10)。次に体重の減少率について検討した (図13A)。非特異的抗体投与のマウスは徐々に全身状態が悪化し、7日目には30%近く体重が減少し、死亡した。一方、抗OX40L中和抗体では2日目、4日目までは徐々に体重が減少するが、コントロールと比較して体重減少が軽度であった。また、6日目に体重減少のピークを迎え、体重が徐々に回復した (P < 0.05, N = 4)
参考例１２ ヒト臨床検体においても、気道上皮にOX40Lの発現が認められる
次にインフルエンザ肺炎のヒト臨床検体を用い、実際のヒト症例において、OX40Lが上皮細胞に発現しているのかを免疫化学染色にて検討した (図１４)。陽性コントロールとして脾臓組織を使用し、陰性コントロールとして、非特異的抗体を使用した。 Example 2 Anti-OX40L Neutralizing Antibody Shows Resistance to Influenza Pneumonia Next, the effect of the anti-OX40L neutralizing antibody in an influenza lethal pneumonia model was examined. On day 0, influenza virus was administered to wild-type mice, and on the next day, anti-OX40L neutralizing antibody was administered intranasally, and the survival period was confirmed and body weight was measured (FIG. 13A). A non-specific antibody was administered as a negative control. Non-specific antibodies increased in all mice from day 6 and all died on day 10. On the other hand, 40% of mice administered with anti-OX40L neutralizing antibody survived (P <0.05, N = 10). Next, the weight loss rate was examined (FIG. 13A). Mice treated with non-specific antibodies gradually deteriorated in general condition and lost approximately 30% of body weight and died on the 7th day. On the other hand, with the anti-OX40L neutralizing antibody, the body weight gradually decreased until the 2nd and 4th days, but the body weight loss was milder than that of the control. Also, on the 6th day, the body reached a peak of weight loss and gradually recovered (P <0.05, N = 4)
Reference Example 12 In human clinical specimens, the expression of OX40L is observed in the respiratory epithelium. Next, human clinical specimens of influenza pneumonia were used, and in actual human cases, OX40L was expressed in epithelial cells for immunochemical staining. (Fig. 14). Spleen tissue was used as a positive control and non-specific antibody was used as a negative control.

インフルエンザ肺炎のヒト検体においても気道上皮にOX40Lの発現が増強された。しかし、誤嚥性肺炎ではOX40Lの発現は軽度であった。両症例とも平滑筋細胞はOX40Lの発現を認めなかった。また、気道の腺細胞において弱いOX40Lの発現を認めた。   In human specimens of influenza pneumonia, OX40L expression was enhanced in the respiratory epithelium. However, OX40L was mildly expressed in aspiration pneumonia. In both cases, smooth muscle cells did not express OX40L. We also observed weak OX40L expression in airway gland cells.

上記の結果より、ヒト臨床検体でも上皮細胞のOX40Lの発現する事を示した。   From the above results, it was shown that OX40L is expressed in epithelial cells in human clinical specimens.

実施例３
ヒトOX40Lおよびその各種変異体に対するW66抗ヒトOX40L抗体の結合能を比較した（図15A）。ヒトOX40Lおよびその各種変異体を発現するプラスミドを犬腎臓由来のMDCK細胞へ遺伝子導入し、その細胞表面へ発現させた後に、W66抗ヒトOX40L抗体との結合量をフローサイトメトリーで測定した。121番目のアミノ酸以降を欠損させた変異体や114番目のアミノ酸を変異させた変異体は、野生型OX40Lと同様の結合能を示したが、57番目のアミノ酸以降を欠損させた変異体や90番目のアミノ酸を変異させた変異体は、野生型OX40Lに比し、有意にW66抗ヒトOX40L抗体との結合能が低下した。
W66抗ヒトOX40L抗体のインフルエンザ感染防御能を検討した（図15Bと図15C）。ヒトOX40Lを発現するプラスミドを犬腎臓由来のMDCK細胞へ遺伝子導入し、W66抗ヒトOX40L抗体あるいは対照抗体で処理した後に、A型インフルエンザウイルスH1N1を感染させた。インフルエンザの核蛋白質をコードするmRNA量をRT-PCR法で測定したところ、W66抗ヒトOX40L抗体で処理したMDCK細胞のウイルス感染は抑制され、対照抗体で処理したMDCK細胞に比し、核蛋白質をコードするmRNA量が有意に低下していた（図15B）。インフルエンザウイルス由来のM2蛋白質量をウエスタンブロット法で確認しても同様の結果であった（図15C）。 Example 3
The binding ability of the W66 anti-human OX40L antibody to human OX40L and its various mutants was compared (FIG. 15A). Plasmids expressing human OX40L and its various mutants were introduced into MDCK cells derived from canine kidney and expressed on the cell surface, and then the amount of binding to the W66 anti-human OX40L antibody was measured by flow cytometry. Mutants lacking the amino acid after the 121st amino acid and mutants obtained by mutating the 114th amino acid showed the same binding ability as the wild type OX40L. The mutant in which the second amino acid was mutated significantly decreased the ability to bind to the W66 anti-human OX40L antibody compared to wild-type OX40L.
The ability of W66 anti-human OX40L antibody to protect against influenza infection was examined (FIGS. 15B and 15C). A plasmid expressing human OX40L was introduced into MDCK cells derived from canine kidney, treated with W66 anti-human OX40L antibody or control antibody, and then infected with influenza A virus H1N1. When the amount of mRNA encoding influenza nucleoprotein was measured by RT-PCR, viral infection of MDCK cells treated with W66 anti-human OX40L antibody was suppressed, and nucleoprotein was compared to MDCK cells treated with control antibody. The amount of encoded mRNA was significantly reduced (FIG. 15B). Similar results were obtained when the amount of M2 protein derived from influenza virus was confirmed by Western blotting (FIG. 15C).

実施例４
A型インフルエンザウイルスH3N2を用いて、参考例５（図4C）、参考例４（図6A）、参考例１１（図11C）、実施例３（図15B）と同様の実験を行った。その結果、A型インフルエンザウイルスH1N1と同様の結果が得られた（図16A-D）。 Example 4
Experiments similar to Reference Example 5 (FIG. 4C), Reference Example 4 (FIG. 6A), Reference Example 11 (FIG. 11C), and Example 3 (FIG. 15B) were performed using influenza A virus H3N2. As a result, results similar to those of influenza A virus H1N1 were obtained (FIGS. 16A-D).

実施例５
抗マウスOX40L抗体のインフルエンザ感染防御能を検討した（図17D）。マウスOX40Lを発現するプラスミドを犬腎臓由来のMDCK細胞へ遺伝子導入し、抗マウスOX40L抗体あるいは対照抗体で処理した後に、A型インフルエンザウイルスH1N1を感染させた。インフルエンザの核蛋白質をコードするmRNA量をRT-PCR法で測定したところ、抗マウスOX40L抗体で処理したMDCK細胞のウイルス感染は抑制され、対照抗体で処理したMDCK細胞に比し、核蛋白質をコードするmRNA量が有意に低下していた（図17D）。 Example 5
The ability of anti-mouse OX40L antibody to protect against influenza infection was examined (FIG. 17D). A plasmid expressing mouse OX40L was introduced into MDCK cells derived from canine kidney, treated with anti-mouse OX40L antibody or control antibody, and then infected with influenza A virus H1N1. When the amount of mRNA encoding influenza nucleoprotein was measured by RT-PCR, viral infection of MDCK cells treated with anti-mouse OX40L antibody was suppressed, and compared to MDCK cells treated with control antibody, nucleoprotein was encoded. The amount of mRNA to be significantly decreased (FIG. 17D).

実施例６
まず、抗ヒトOX40L抗体を下記の方法により製造した：
まず、WKAラットの腎臓上皮細胞をSV40で株化した細胞株W7KSVにヒトOX40L遺伝子を導入した。これを同系のラットの腹空に複数回免疫し（2000万個/回/匹）、得られた免疫脾臓細胞とSP2/0細胞をポリエチレングリコールで融合させ、常法にしたがってHAT選択後、増殖したハイブリドーマの上清について抗OX40L抗体の有無をスクリーニングし、陽性細胞を限界希釈法で２回クローニングした。各ハイブリドーマクローンをヌードマウス腹空に移植し、得られた腹水からIgGをSuperdex200カラムを用いたゲルろ過法で精製した。 Example 6
First, an anti-human OX40L antibody was produced by the following method:
First, the human OX40L gene was introduced into the cell line W7KSV in which kidney epithelial cells of WKA rats were established as SV40. This was immunized multiple times in the ascites of syngeneic rats (20 million cells / mouse / mouse), and the resulting immune spleen cells and SP2 / 0 cells were fused with polyethylene glycol. The hybridoma supernatant was screened for anti-OX40L antibody and positive cells were cloned twice by limiting dilution. Each hybridoma clone was transplanted into the ascites of nude mice, and IgG was purified from the obtained ascites by gel filtration using a Superdex200 column.

得られた抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体を用いて、ヒトOX40Lおよびその90番目のアミノ酸をアラニンに変異させた変異体と、各種抗ヒトOX40L抗体の結合能を比較した（図18）。ヒトOX40Lおよびその90番目のアミノ酸をアラニンに変異させた変異体を発現するプラスミドを犬腎臓由来のMDCK細胞へ遺伝子導入し、その細胞表面へ発現させた後に、各種抗ヒトOX40L抗体との結合量をフローサイトメトリーで測定した。W66抗ヒトOX40L抗体のみが、野生型ヒトOX40Lに比し、90番目のアミノ酸をアラニンに変異させた変異体に対する結合能を著明に低下させていた。   Using the obtained anti-human OX40L antibody, the binding ability of human OX40L and mutants obtained by mutating the 90th amino acid thereof to alanine and various anti-human OX40L antibodies were compared (FIG. 18). A plasmid that expresses human OX40L and a variant obtained by mutating its 90th amino acid to alanine is introduced into MDCK cells derived from canine kidney and expressed on the cell surface, and then the amount of binding to various anti-human OX40L antibodies Was measured by flow cytometry. Only the W66 anti-human OX40L antibody markedly reduced the ability to bind to a mutant in which the 90th amino acid was mutated to alanine, compared to wild-type human OX40L.

実施例７
W66抗ヒトOX40L抗体のインフルエンザ感染防御能を、他の抗ヒトOX40L抗体と比較した（図19）。ヒトOX40Lを発現するプラスミドを犬腎臓由来のMDCK細胞へ遺伝子導入し、W66抗ヒトOX40L抗体、他の抗ヒトOX40L抗体、あるいは対照抗体で処理した後に、A型インフルエンザウイルスH1N1を感染させた。インフルエンザの核蛋白質をコードするmRNA量をRT-PCR法で測定したところ、W66抗ヒトOX40L抗体で処理したMDCK細胞のウイルス感染は抑制され、他の抗ヒトOX40L抗体や対照抗体で処理したMDCK細胞に比し、核蛋白質をコードするmRNA量が有意に低下していた（図19）。 Example 7
The ability of W66 anti-human OX40L antibody to protect against influenza infection was compared with other anti-human OX40L antibodies (FIG. 19). A plasmid expressing human OX40L was introduced into MDCK cells derived from canine kidney, treated with W66 anti-human OX40L antibody, other anti-human OX40L antibody, or control antibody, and then infected with influenza A virus H1N1. When the amount of mRNA encoding influenza nucleoprotein was measured by RT-PCR, viral infection of MDCK cells treated with W66 anti-human OX40L antibody was suppressed, and MDCK cells treated with other anti-human OX40L antibodies and control antibodies Compared with, the amount of mRNA encoding nucleoprotein was significantly reduced (FIG. 19).

Claims (7)

ヒトＯＸ４０Ｌのうち、９０番目のアスパラギンを含む領域に特異的に結合する抗ヒトＯＸ４０Ｌ抗体。 An anti-human OX40L antibody that specifically binds to a region containing 90th asparagine in human OX40L. ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸配列のうち、５７〜１２０位の領域に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。   The antibody according to claim 1, which specifically binds to a region of positions 57 to 120 in the amino acid sequence of human OX40L. 野生型のヒトＯＸ４０Ｌに対する結合能よりも９０位のアスパラギンをアラニンに変換した変異ペプチドに対する結合能のほうが低い、請求項１又は２に記載の抗体。 The antibody according to claim 1 or 2, wherein the binding ability to a mutant peptide obtained by converting asparagine at position 90 to alanine is lower than the binding ability to wild-type human OX40L. モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。   The antibody according to any one of claims 1 to 3, which is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. ヒトＯＸ４０Ｌの９０番目のアスパラギンを含むアミノ酸配列からなる５〜５０アミノ酸残基のペプチドである、ヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープ。   The human OX40L peptide epitope which is a peptide of 5-50 amino acid residues which consists of an amino acid sequence containing the 90th asparagine of human OX40L. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体を含む抗インフルエンザ薬。   The anti-influenza drug containing the antibody of any one of Claims 1-3. 請求項４又は５に記載のヒトＯＸ４０Ｌペプチドエピトープを用いた、抗インフルエンザ薬のスクリーニング方法。   A method for screening an anti-influenza drug using the human OX40L peptide epitope according to claim 4 or 5.
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