JP4420564B2 - 核酸分析物における蛍光偏光 - Google Patents
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Description
(発明の技術分野)
本発明は、テンプレート指向性プライマー伸長および蛍光偏光による高度に感度のよいな検出を使用するDNAの分析のための、新規な診断方法および診断キットに関する。本発明はさらに、1ヌクレオチド多型(SNP)および他のDNA配列変異を同定する方法に関する。また、本発明は、生物工学、分子遺伝学および生物医学の分野に広範に関する。
【0002】
(発明の背景)
DNA分析は、遺伝性疾患の診断、感染性病原因子の検出、組織適合性についての組織分類、法医学的および起源の試験における個体の同定、ならびに農学研究における植物および動物の遺伝子構造のモニターにおいて、ますます重要になっている(Alford,R.L.ら、Curr Opn.Biotechnol(1994)5:29−33)。さらに、DNA分析は、複数の遺伝的因子および環境因子に関与する一般的疾患に関連する感受性対立遺伝子を同定するための大規模な遺伝学的研究において重要である(Risch,Nら、Science(1996)273:1516−1517)。最近、1ヌクレオチド多型(SNP)(哺乳動物ゲノムに見いだされる最も一般的なDNA配列変異)に注目が集められる(Cooper,D.N.ら、Hum Genet(1985)69:201−205)。ほとんどのSNPは、検出可能な表現型を生じないが、これらのかなりの部分は、遺伝性疾患の原因となる疾患誘発性の変異である。ヒトゲノムのDNA配列は完全に解明されると、大規模なDNA分析は、遺伝子型(DNA配列)と表現型(疾患および健康)との間の関係を決定する重要な役割を果たすであろう(Copper,D.N.ら、Hum Genet(1988)78:299−312)。いくつかのアッセイは、高スループットに対するかなりの期待を有するが、以下を含む、最近開発されたDNA診断方法は全て、特別な試薬および高価な検出装置を必要とする:対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション分析のための高密度チップアレイ(Pease,A.C.ら、Proc.Natl Acad Sci USA(1994)91:5022−5026;Yershov,G.ら、Proc Natl Acad Sci USA(1996)93:4913−4918)、Wang,D.G.ら、Science(1998)280:1077−1081、均質5’−ヌクレアーゼ対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド切断アッセイ(TaqMan ASO,Livak、K.L.ら、Nat Genet(1995)9:341−342)、Whitcombe,D.ら、Clin Chem(1998)44:918−923)、PCR増幅のための均質蛍光アッセイ:リアルタイムへのその適用、単一のチューブでの表現型決定、均質テンプレート指向性色素−ターミネーター組み込み(TDI)アッセイ(Chen,X.ら、Nucleic Acids Res(1997)25:347−353;Chen,X.ら、Proc Natl Acad Sci USA(1997)94:10756−10761)、均質色素標識化オリゴヌクレオチド連結(DOL)アッセイ(Chen,X.ら、Genome Research(1998)8:549−556)、および均質分子ビーコンASOアッセイ(Tyagi.S.ら、Nature Biotechnology(1998)16:49−53)。
【0003】
上記に列挙した全てのDNA診断方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または他の類似の増幅技術を介するアッセイの感受性および特異性を増加するための標的配列の増幅を含む。例えば、最も公知の増幅方法の1つは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCRと呼ばれる)であり、これは、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,800,159号に詳細に記載される。手短に言えば、PCRにおいては、標的配列の向かい合う相補的な鎖上の領域に相補的である2つのプライマー配列が、調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸が、耐熱性DNAポリメラーゼ(例えば、Taqポリメラーゼ)と共に反応混合物に添加される。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーは、その標的に結合し、そしてポリメラーゼは、プライマーを、ヌクレオチド上に付加することによって標的配列に沿って伸長させる。反応混合物の温度を上昇および低下させることによって、この伸長されたプライマー反応産物は、標的から解離して、新たな標的となる。過剰なプライマーは、標的および反応産物に結合し、そしてこのプロセスを繰り返す。他の技術は、鎖置換によって標的配列の増幅を生じる。これらの技術は、二本鎖DNA認識部位に存在する2つのうちの鎖の1つの酵素的「ニック形成(nicking)」または優先的切断、およびその標的部位を含む増幅産物の分離または検出(米国特許第5,270,184号および同第5,455,166号に示され、そしてこれらの各々は、本明細書中に参考として援用される)を含む。
【0004】
なお他の技術は、プライマーが標的領域にハイブリダイズした後、蛍光的に標識したこのプライマーの使用を利用し、そして蛍光または蛍光偏光を検出する。これは、米国特許第5,593,867号に提示される。米国特許第5,641,633号において、二本鎖DNA結合タンパク質もまた用いられ、蛍光的に標識したプライマーの標的部位へのハイブリダイゼーションをさらに保存する。これらの方法は、蛍光的に標識したプライマーの使用および標的部位にハイブリダイズしている間のそれらの検出を必要とする。
【0005】
テンプレート指向性のプライマー伸長は、多型性部位のすぐ上流の標的DNAにアニーリングする配列決定プライマーのすぐ3’の1塩基の性質を確認するように設計されたジデオキシ連鎖終止DNA配列決定プロトコールである。DNAポリメラーゼおよび適切なジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)の存在において、プライマーは、多型性部位の標的DNA配列により指図されるとおり1塩基ずつ特異的に伸長される。どのddNTPが取り込まれるかを決定することにより、標的DNAに存在する対立遺伝子が推測され得る。この遺伝形質決定方法は多数の異なる形式で広範に用いられており、高度に感受性でかつ特異的であることが証明されている(Syvanen,A.−Cら、Genomics(1990)8:684〜692;Syvanen,A.−CおよびLandegren,U.Human Mutation(1994)3:172〜179)。
【0006】
蛍光偏光(FP)は、蛍光分子が平面偏光により励起される場合、もしその分子が励起と発光の間で静止したままであれば、それが偏光した蛍光を固定面に放射するという観察に基づく(図1)。しかし、蛍光減衰時間の間、空間における分子回転および転倒(tumble)のせいで、FPは、外部検出器では完全に観察されない。蛍光種の観察されたFPは、Perrinの式により記載され、そして回転性減衰時間および蛍光存続時間の比に関する。温度および粘性が一定に保たれていれば、回転減衰時間は蛍光種の分子体積に比例する。蛍光物質の局所回転運動が最小限である場合、FPは分子量に直接比例する。言い換えれば、蛍光分子およびその結合体が大きい(高分子量を有する)場合、それは、蛍光存続期間に比べて溶液中で緩徐に回転および転倒し、そしてFPは保存される。分子が小さい(低分子量を有する)場合、それは、より速く回転、そして転倒し、そしてFPはより多く失われる(脱偏光する)。FP現象は、タンパク質−DNAおよびタンパク質−タンパク質相互作用(Dunkak,K.S.ら、Anal.Biochem.(1996)243:234〜244;Heyduk,Tら、Methods Enzymol.(1996)274:492〜503;Wu,Pら、Anal.Biochem.(1997)249:29〜36)、鎖置換増幅によるDNA検出(Walker,G.T.ら、Nucleic Acids Res.(1996)24:348〜353)、ならびにハイブリダイゼーションによる遺伝子型決定(Gibson,N.J.ら、Clin.Chem.(1997)43:1336〜1341)を研究するために用いられてきた。50より多い蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA)が、現在市販されている。これらの多くは、生物学的液体中の、治療剤、代謝物および濫用薬物の測定のために臨床的実験室において日常的に用いられている(Cheocovich,W.J.ら、Nature(1995)375:254〜256)。
【0007】
FPは、垂直軸および水平軸において検出される蛍光の比として表現され、従って、総蛍光強度とは独立している。これは、蛍光が用いられる検出限界以上である限り、FPが信頼できる指標であるという点で、他の蛍光検出方法を上回る明確な利点である。完全に結合した蛍光種と完全に結合してない蛍光種との間のFPの差異は、このシステムについて可能な総ダイナミックレンジを示す。低分子量種およびその複合体に付着された蛍光物の相互作用または高分子量種への取り込みにより、統計的有意差が、実験的に誘導され得る限り、FPは、溶液中で生じる化学についての適切な検出スキームを表す。これは、適切なプローブを理論的に予測することを困難にする、蛍光的に標的される種において局所運動として通常、経験的に誘導される。
【0008】
総偏光は、その波長で発出する溶液中のすべての種からのFPの合計を反映する。発蛍光団(fluorophore)が低偏光を生成する低分子量ヌクレオチドに付着し、次いで対立遺伝子部位でプローブオリゴマー中に取り込まれる系については、観察される偏光は、以下の等式によって記載される:
P=Pmax[ddNTP]b+Pmin([ddNTP]i−[ddNTP]b)
ここで、Pmaxは、TDIプローブ上に取り込まれた色素標識ddNTPについての偏光であり、Pminは、取り込まれなかった色素標識ddNTPの偏光であり、[ddNTP]iは、色素標識ddNTPの初期濃度であり、そして[ddNTP]bは、取り込まれた色素標識ddNTPの濃度である。シグナル中の最大変化は、ddNTPの100%取り込みで生じる。従って、実験デザインにおける重要な局面は、反応に用いられる色素標識ddNTPの初期濃度が最小に保たれることを確実にすることである。
【0009】
蛍光偏光とTDI技術の別々の使用が報告されているが、本明細書に開示されるようなこれら技術が一緒の有効使用は、多くの理由のため実現されていない。蛍光偏光の正確な観察を可能にする計測の感度は、過去数年に亘って有意に増加した。さらに、本発明者らは、この技術を洗練するための実験と開発を実施し、そして他者によって観察され得て、彼らを本発明から遠ざけた、初期の否定的な観察を克服した。本発明は、当該分野において先行する教示に対し、明らかに新規および非自明である。何故なら、本開示が明瞭にするように、ヌクレオチドに連結された発蛍光団を含む蛍光により標識されたオリゴヌクレオチドを標的部位で合成し、次いで宿主中で蛍光により標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光偏光を検出する本発明の能力のためである。
【0010】
引用されるすべての刊行物は、それらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【0011】
(発明の要旨)
本発明者らは、本発明者らが開発したTDIアッセイのための検出戦略における改変が、SNPおよび特有の挿入/欠失を含むDNA配列変動の迅速分析を、非改変オリゴヌクレオチドプローブを用いる均一アッセイ中で可能にし、これが、特殊な試薬または高価な装置の必要性をなくすることを決定した。本発明のアプローチは、テンプレート特異的プライマー伸長反応において、DNA配列変動である2つの対立遺伝子間の酵素的識別の特異性と、蛍光偏光の高い程度の感度とを組み合わせる。
【0012】
本発明の方法は、FP検出によるテンプレート特異的色素ターミネーター取り込みアッセイと称され(図2に提示されるような;「FP−TDI」アッセイ)、配列決定プライマーが、多型部位または変異部位のすぐ上流のその3’末端が改変されていないプライマーであることを提供する。対立遺伝子特異的色素標識ddNTPは、任意の発蛍光団で標識されたddNTPの存在下でインキュベートされたとき、DNAポリメラーゼおよび標的DNAの存在下で、TDIプライマー上に取り込まれる。多くの発蛍光団が、当業者に容易に利用可能であり、そして、例えば、FAM(5−カルボキシ−フレオレセイン)、ROX(6−カルボキシ−X−ローダミン)、TMR(N、N、N’、N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン)、およびBODIPY色素を含む。標的DNA分子の遺伝子型は、配列決定プライマー上の色素を励起すること、およびFPを観察することにより、簡単に決定され得る(図2を参照のこと)。
【0013】
本明細書でさらに開示されるように、本発明者らは、FPが、均一プライマー伸長遺伝子型決定アッセイにおいて用いられ得る、簡単な、高度に感受性で、そして特異的な検出方法であることを示した。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR、Saiki、R.K.ら、Science(1988)239:487−491)による増幅物を含む、一本鎖合成DNAオリゴマーおよび二本鎖DNAフラグメントの両方が、このアッセイ中でテンプレートとして用いられ得る。すべての場合に、このFP−TDIアッセイは、高度に感受性かつ特異的であることがわかる。
【0014】
(発明の詳細な説明)
1つの実施態様において、本発明は、核酸において少なくとも1つのヌクレオチドの標的部位の存在を検出するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する:(a)この標的部位に結合されるオリゴヌクレオチドを形成させる工程であって、ここでこのオリゴヌクレオチドが、そのオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドに結合した発蛍光団を含む、工程;および(b)蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光偏光を検出する工程、より好ましくは、この蛍光偏光の増加を検出する工程。より好ましい実施態様において、本発明は、上記の工程(a)および(b)の標的部位を検出するための方法を提供し、ここで、このオリゴヌクレオチドは、この標的部位に対するこのテンプレート上の直ぐ3’側のポリヌクレオチドおよび発蛍光団に共有結合したジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)から形成され、、そしてここで、少なくとも1つのddNTP結合した発蛍光団は、この標的部位に結合し、そしてこのポリヌクレオチドと反応して、このポリヌクレオチドの3’伸張物を生成する。本発明はさらに、1つより多いddNTP結合した発蛍光団の使用を意図し、ここでは各発蛍光団は唯一であり、そして蛍光偏光を使用して独自に観察され得る。
【0015】
本発明の別の実施態様は、遺伝的多型(1ヌクレオチド多型および唯一の挿入/欠失を含む)を診断する方法を含む。この診断方法は、被験体由来の生物学的材料のサンプルから単離された、ゲノムDNAまたはRNAから調製されたDNAをアッセイする。このアッセイは、以下の本発明の方法を利用する:(a)遺伝的多型について試験するための被験体から生物学的材料のサンプルを選択する方法;(b)この生物学的材料からゲノムDNAまたはRNAを単離する方法であって、ここでこのゲノムDNAまたはこのRNAから調製されたDNAは1つ以上の標的部位を含む、そしてここで、各々の標的部位は、遺伝的多型を含む、方法;(c)この標的部位に結合されるオリゴヌクレオチドを形成させる方法であって、ここでこのオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドに結合した発蛍光団を含む、方法;(d)蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光偏光を検出する方法;ならびに(e)この蛍光偏光によってこの遺伝的多型を同定する方法。この遺伝的多型は、1ヌクレオチド多型および唯一の挿入/欠失を含み得る。さらに、本発明の方法のこの実施態様は、標的部位に対するこのテンプレート上の直ぐ3’側のポリヌクレオチドおよび発蛍光団に共有結合したddNTPからのオリゴヌクレオチドの形成を含み、そしてここで、少なくとも1つのddNTP結合した発蛍光団はこの標的部位に結合し、そしてこのポリヌクレオチドと反応して、このポリヌクレオチドの3’伸張物を生成する。より好ましい実施態様としては、蛍光偏光の増加による蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの検出が挙げられる。本発明のこの実施態様は、1つより多いddNTP結合した発蛍光団の使用をさらに意図し、ここでは、各々の発蛍光団は唯一であり、そして蛍光偏光を使用して独自に観察され得る。
【0016】
本発明のなお別の実施態様としては、核酸における少なくとも1つのヌクレオチドの標的部位の存在を検出するための診断用キットが挙げられ、このキットは、以下を含む:(a)標的部位に対してDNAテンプレート上の直ぐ3’側のこのテンプレートにハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマー;(b)発蛍光団に共有結合された少なくとも1つの対立遺伝子特異的ddNTP;および(c)このオリゴヌクレオチドプライマーおよびこのddNTPと反応して、ポリヌクレオチドの3’伸張物を生成するDNAポリメラーゼ。本発明の好ましい実施態様は、このオリゴヌクレオチドプライマーが約5〜100ヌクレオチドを含むことを意図する。本発明のより好ましい実施態様は、このオリゴヌクレオチドプライマーが約10〜50ヌクレオチドを含むことを意図する。本発明のさらに好ましい実施態様としては、1つより多い対立遺伝子特異的ddNTPが挙げられ、そして各々の対立遺伝子特異的ddNTPが、唯一の発蛍光団に共有結合されることが挙げられる。
【0017】
本発明の別の実施態様は、前述で議論された方法のいずれか1つにより検出される標的部位の遺伝子配列を含む。
【0018】
本発明のなおさらなる実施態様は、核酸中の少なくとも1つのヌクレオチドの標的部位の存在を検出するための方法を包含し、この方法は、以下の工程:(a)標的部位で、ヌクレオチドに連結された蛍光団を含む蛍光標識オリゴヌクレオチドを合成する工程;および(b)蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光の偏光を検出する工程。好ましい実施態様は、この蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光の偏光が、一本鎖DNA結合(SSB)タンパク質の非存在および存在下で検出される、この方法の実施を含む。別の好ましい実施態様は、この蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光の偏光が、有機溶媒の非存在および存在下で検出される、この方法の実施を提供する。
【0019】
当然、本発明は、この蛍光標識オリゴヌクレオチドの蛍光の偏光が、一本鎖DNA結合(SSB)タンパク質ならびに有機溶媒の非存在および存在下で検出される、この方法の実施をさらに意図する。
【0020】
特定の蛍光団の選択は、当業者に容易に公知の選択を含む。用いられる蛍光団がddNTPに共有結合され、そして蛍光の偏光により検出可能なシグナルを生じる場合に、他の蛍光団が、引き続いて、開発および選択され得る。本発明に意図されるこのような蛍光団としては、5−カルボキシフルオレセイン(FAM−ddNTP);6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX−ddNTP);N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TMR−ddNTP);およびBODIPY−Texas Red(BTR−ddNTP)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0021】
本発明の方法に使用され得るテンプレートおよびプライマーの選択は、十分に、当業者の範囲内である。本明細書中に提示される合成テンプレートは、単に例示のためであり、そしてCF508−48A;CF508−48C;CF508−48G;およびCF508−48Tが挙げられる。任意のテンプレート、合成またはそれ以外の選択は、このテンプレートとプライマーとの間のハイブリダイゼーションの優先的な程度およびこのテンプレート上での標的部位の存在に基づき得る。
【0022】
被検体から採取した生物学的材料のサンプルから単離された、ゲノムDNAおよびRNAから調製されたDNAに対するこの方法の適用は、限定されない。ゲノムDNAの単離に用いられ得る技術および単離されたRNAからDNAを調製する技術もまた、周知である。例えば、米国特許第5,270,184号(これは、これによってその全体が本明細書中で参考として援用される)は、DNAの単離のためのいくつかの技術を提示する。サンプルは、標的核酸配列を含むと疑われる任意の物質から単離され得る。動物、好ましくは哺乳動物、およびより好ましくはヒトについては、このような材料の供給源は、血液、骨髄、リンパ、硬組織(例えば、肝臓、脾臓、腎臓、肺、卵巣など)、痰、糞および尿を含み得る。物質の他の供給源は、植物、土壌、および生物学的生物を含むと疑われる他の材料に由来し得る。これらの材料からの核酸の単離は、多くの方法で実行され得る。このような方法は、界面活性剤での溶解物、超音波破砕、ガラスビーズおよびフレンチプレスを用いる攪拌の使用を含む。いくつかの例において、単離された核酸を精製することが有利であり得る(例えば、内因性ヌクレアーゼが存在する場合)。これらの例では、核酸の精製は、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度依存性遠心分離によって達成され得る。一旦、この核酸が単離されると、ゲノム核酸がDNAであり、かつ二本鎖であることのみが、本明細書中で例示の目的のために想定される。
【0023】
本明細書中で使用される用語は、それらの技術分野で認識される意味に基づき、そして当業者によって明確に理解されるはずである。例えば、標的部位は、本発明の方法を使用して検出され得るDNAの任意の領域を含むことが意味される。遺伝的多型は、同じ種の全ての個々の被検体における同じ遺伝子座または対立遺伝子遺伝子にマッピングされる異なる遺伝子配列または遺伝子の存在を含む。このような遺伝的バリエーションは、異なる表現型発現を生じないかもしれないが、個々の被検体間で遺伝的差異として現れる。
【0024】
(一般的な方法論)
(簡単な説明)
FP−TDIアッセイは、4工程を包含する(図2)。第1に、DNA標的は、PCRによって熱安定性DNAポリメラーゼを使用する供給源DNAから増幅される。第2に、過剰のPCRプライマーおよびデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)が、一本鎖DNAを分解する熱不安定性酵素(例えば、E.coliエキソヌクレアーゼIまたはリョクトウヌクレアーゼ)およびdNTPを分解する熱不安定性酵素(エビアルカリホスファターゼまたはHK熱不安定性ホスファターゼ)によってそれぞれ分解される。第3に、2つの酵素は、熱不活性化される。第4に、TDIプライマー、対立遺伝子特異的色素−標識化ddNTP、および色素−標識化ターミネーター(例えば、AmpliTaq、FS DNAポリメラーゼ、またはThermo Sequence)を取り込みことについて改善された効果を有する変異体熱安定性DNAポリメラーゼを、熱サイクルによるTDI反応に添加した。
【0025】
反応の終りに、希釈緩衝液を反応混合物に添加した後、これを、蛍光偏光プレートリーダーでの蛍光偏光の測定のためにマイクロタイタープレートに移す。例えば、疎水性色素が用いられる場合、有機溶媒(例えば、メタノール)を用いて、非特異的なバックグラウンド偏光を低下させ得る。
【0026】
(酵素)
AmpliTaq(登録商標)およびTaq−FS DNAポリメラーゼを、Perkin−Elmer Applied Biosystems Division(Foster City,CA)から入手した。エビアルカリホスファターゼ、一本鎖DNA結合タンパク質(SSB)およびE.coliエキソヌクレアーゼIを、Amersham(Arlington,Heights,IL)から購入した。
【0027】
(オリゴヌクレオチド)
用いたオリゴヌクレオチドを表1に列挙する。PCRおよびTDIプライマーおよび合成テンプレートオリゴヌクレオチドは市販されている(Life Technologies,Grand Island,New York)。
【0028】
(表1.FP−TDI研究に用いた合成テンプレートおよび合成プライマー)
【0029】
【表1】
(ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸)
5−カルボキシ−フルオレセインで標識したジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(FAM−ddNTP)、6−カルボキシ−X−ローダミンで標識したジデオキシヌクレオシド三リン酸(ROX−ddNTP)、N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミンで標識したジデオキシヌクレオシド三リン酸(TMR−ddNTP)、およびBODIPY−テキサスレッド(BTR−ddNTP)で標識したジデオキシヌクレオシド三リン酸を、NEN Life Science Products,Inc.(Boston,MA)から入手した。非標識化ddNTPをPharmacia Biotech(Piscataway,NJ)から購入した。
【0030】
(蛍光偏光測定)
プライマー伸長反応後、125μLのTDI緩衝液を、各チューブに添加した後、これらをFluorolite FPM2機器(Jolley Consulting and Research,Grayslake,IL)でのFP測定のためにマイクロタイタープレートに移した。蛍光偏光値を以下の式を用いて算出した:
P=[Ivv−Ivh]/[Ivv+Ivh]
ここで、Ivvは、励起偏光器と発光偏光器とが平行である場合に測定された発光強度であり、そしてIvhは、励起偏光器と発光偏光器とをお互いを直角に方向付ける場合に測定された発光強度である。
【0031】
(遺伝子型帰属)
平均FP値および4連の陰性コントロールサンプルの標準偏差を、実験の各セットについて決定した。次いで、4連の試験サンプル反応の平均FP値を、コントロールサンプルの平均FP値と比較した。正味の変化が、コントロールの標準偏差の5倍を超える場合、この試験サンプルを対立遺伝子について陽性として記録する。
【0032】
(実施例)
以下の実施例は、FPが、一塩基対変化のための同種プライマー伸長反応において、簡便、高感度、かつ特異的な検出法であることを示す。
【0033】
ここでは、本発明を一般的に記載してきた。本発明は、例示の目的で提供され、そして明記されない限り本発明の限定を意図しない以下の実施例を参照することを通じてより容易に理解される。
【0034】
(実施例1)
(合成テンプレートを用いるFP−TDIアッセイによるDNAの分類分け)
23位を除いて同じ配列を有する4つの合成48マー(ここで、4つの可能な塩基の各々は、4つの異なる合成テンプレート(CF−508−48、表1中で太字の文字として示される)の各々で示された)を、調製した。各合成48マーを、4つの別々の反応におけるテンプレートとして付与し、ここで、これを、AmpliTaq DNAポリメラーゼ(FS)の存在下で、25マーのFP−TDIプライマー(CF508−25)、および4つのFAM標識したターミネーターのうちの1つとともにインキュベートした。この反応を、250nM テンプレート、500nM FP−TDIプローブCF508−25、250nM FAM−ddNTP、1.0ユニットのAmpliTaq−FS、50mM Tris−HCl(pH9.0)、50mM KCl、5mM MgCl2、8% グリセロール、0.1% Triron X−100を含有する20μLの反応容量で実施した。反応混合物を、95℃で30秒と45℃で30秒との間で25回熱サイクル化した。TDI反応の最後に、この反応混合物を、125μLの反応緩衝液(50mM Tris−HCl(pH9.0)、50mM KCl、5mM MgCl2、8% グリセロール、0.1% Triron X−100)で希釈し、そして蛍光偏光を、Flourolite FPM2(Jolley Consulting and Research,Inc.,Grayslake,IL)で測定した。
【0035】
表2は、これらの実験の結果を示す。全ての場合において、多型性塩基に相補的なターミネーターのみが組込まれ、そして少なくとも50mPのFPの正味の取得(コントロールの標準偏差の9倍より大きい)を伴う有意なFP変化を示した。この実施例は、蛍光偏光が、TDIプロトコルを使用して遺伝子型を検出するための手段として使用され得るという原理を実証する。
【0036】
【表2】
(実施例2)
(異なる色素を用いて標識した異なるターミネーターを用いるFP−TDIアッセイ)
同じ反応における複数色検出に適切な異なる色素を同定するための試みにおいて、多くの異なる色素を、FP−TDIアッセイにおけるこれらのFP特性について研究した。色素標識したddNTPの異なるセットを各試験色素について使用したことを除いて、実施例1に提供されるような実験的プロトコルに従った。
【0037】
色素ターミネーターの組合せの各々を試験し、そしてターミネーターの最適なセットを、コントロールサンプルにおける最小標準偏差および陽性サンプルにおける大きな正味の変化に基づいて決定し、そして選択した。色素ターミネーターのこれらの組合せは、FAM−ddA、TMR−ddC、ROX−ddG、およびBTR−ddUであることを見出した(表3を参照のこと)。これらの場合の全てにおいて、FPにおける正味の上昇は、コントロールサンプルの平均の標準偏差の15倍を超えた。さらに、ROX−ddA、BTR−ddC、TMR−ddU、および全てのFAMターミネーターもまた、十分に働くことを見出した。
【0038】
【表3】
(実施例3)
(増幅したゲノムDNAに対する単色FP−TDIアッセイ)
この実施態様では、A/G多型性を有する遺伝マーカーDXS17(Kornreich,R.ら、Genomics(1992)13:70−74)を使用して、PCR増幅したゲノムDNAフラグメントについてFP−TDI遺伝子型決定(genotyping)を試験した。
【0039】
(PCR増幅)
少なくとも8人の関連のない個体に由来するヒトゲノムDNA(20ng)を、10mMのTris−HCl(pH8.3)、50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、0.2mMのdNTP、1μMの各プライマー(dxs17−p1およびdxs17‐p2)、およびAmpliTaq DNAポリメラーゼ(1U)を含有する20μLの反応混合物において増幅した。反応混合物を、94℃で2分間保持し、次いで、94℃で10秒間、90秒間にわたる60℃への傾斜(ramping)、60℃で30秒間の保持の10サイクル、次いで、94℃で10秒間、および53℃で30秒間の30サイクルをした。反応の終了時に、さらなる操作に待機させるために、この反応混合物を4℃まで冷却した。
【0040】
(プライマーおよびdNTPの分解)
PCRアッセイの終了時に、エビアルカリホスファターゼ緩衝液(20mMのTris−HCl(pH8.0)、10mMのMgCl2)中にエビアルカリホスファターゼ(2U)、E.coliエキソヌクレアーゼI(1U)を含有する酵素反応混液10μLを、このPCR産物に添加した。酵素を、95℃にて15分間の熱失活させる前に、この混合物を37℃で30分間インキュベートした。DNA混合物を4℃で維持し、そしてこれを、さらなる定量または特徴付けをすることなく、FP−TDIアッセイに使用した。
【0041】
(FP−TDIアッセイによる遺伝子型決定)
PCRプライマーおよびdNTPの分解後、PCR混合物(10μL)のアリコートを、TDIプライマーであるdxs17−Aを用いた対立遺伝子1および対立遺伝子2の並行アッセイのために、2つの新たな反応チューブ内に分配した。TDI緩衝液(50mMのTris−HCl(pH9.0)、50mMのKCl、5mMのMgCl2、8%グリセロール、0.1% Triton X−100)、1.25μMのTDIプライマー、25nMの色素標識ddATP(対立遺伝子1)またはddGTP(対立遺伝子2)、および1ユニットのAmpliTaq−FS DNAポリメラーゼを含有する10μLのTDI反応混合物を、これらの2セットの各反応に添加した。次いで、反応混合物を、93℃で1分間、次いで、93℃で10秒間、および50℃で30秒間の35サイクルでインキュベートした。反応の終了時に、サンプルを4℃に保持した。
【0042】
表4に示されるように、FAM−ddAおよびFAM−ddGと共にインキュベートされた場合のサンプルのFP値は、別個のカテゴリーに分類された。サンプル1〜4および7〜8は、FAM−ddA反応においてコントロール値の平均を超える40mPより高い(コントロールの標準偏差の20倍より高い)FP値を有した。同様に、サンプル1、3〜6、および8は、FAM−ddG反応において、コントロール値の平均を超える40mPより高い(コントロールの標準偏差の8倍より高い)FP値を有した。単純に、40mPを超える正味のFP変化を用いて陽性反応としてスコア付けすることによって、遺伝子型を得た。この遺伝子型は、他の手段を使用して決定された遺伝子型と全面的に一致した。
【0043】
【表4】
(実施例4)
(合成テンプレートについての二色FP−TDIアッセイ)
当業者が単一の反応においてマーカーの両方の対立遺伝子について試験し得ることを示すために、「A」対立遺伝子および「G」対立遺伝子を保有する合成テンプレートCF508−48を試験モデルとして、BTR−ddUターミネーターおよびTMR−ddCターミネーターとともに使用した。この実験は、実施例1に提供される研究プロトコルに従ったが、以下の差異を伴う:(1)模擬的ヘテロ接合体反応のために、テンプレートCF508−48AおよびCF508−48Gの両方を使用した;(2)各反応に、BTR−ddUおよびTMR−ddCの両方を使用した。
【0044】
4組の反応を実行した:「A」テンプレートのみを含むサンプル、「G」テンプレートのみを含むサンプル、「A」テンプレートおよび「G」テンプレートの両方を半分の濃度で含むサンプル、そしてテンプレートなし。すべての反応を4連で実施し、そして2つのFP測定を各反応混合物について行って、BTRおよびTMRについてのそのFP値を決定した。表5は、これらの実験の結果を示す。予期される通り、BTRについての有意なFP変化を、BTR−ddU、および「A」対立遺伝子を含むテンプレートをともにインキュベートした反応(「ホモ接合A」および「ヘテロ接合A/G」)においてのみ、見出した。同様に、TMRについての有意なFP変化を、TMR−ddC、および「G」対立遺伝子を含むテンプレートをともにインキュベートした反応(「ホモ接合G」および「ヘテロ接合A/G」)においてのみ、見出した。色素ターミネーターがテンプレートに相補的でない反応において、FPの有意な変化は観察されなかった(例えば、「ホモ接合A」反応におけるTMR−ddCおよび「ホモ接合G」反応におけるBTR−ddU)。
【0045】
表5.合成テンプレートを用いる二色FP−TDIアッセイa
【0046】
【表5】
a使用した励起波長および発光波長については、表3の脚注を参照のこと。
bコントロールの平均に対する正味の変化
(実施例5)
(増幅されたゲノムDNAについての二色FP−TDIアッセイ)
マーカーDXS17を、同じ反応において両方の対立遺伝子について試験するために設定されたFP−TDIアッセイにおいて使用した。ゲノムDNAのPCR増幅、過剰なdNTPおよびPCRプライマーの酵素分解を、実施例3に提供されるように実行した。酵素的除去の後、以下を含む10μLのTDI混合物を各チューブに添加した:TDI緩衝液(50mM Tris−HCl(pH9.0)、50mM KCl、5mM MgCl2、8%グリセロール、0.1% Triton X−100)、1.25μM DXS17−B、25nM TMR−ddC(対立遺伝子1)およびBTR−ddU(対立遺伝子2)、ならびに1単位のAmpliTaq−FS DNAポリメラーゼ。反応混合物を93℃で1分間インキュベートした後、93℃で10秒および50℃で30秒の35サイクルを実施した。この反応の最後に、このサンプルを4℃で保持した。
【0047】
TMRおよびBTRの両方についての蛍光強度を、TMRの発光波長およびBTRの発光波長で別々に測定した。TMRについてのFp値およびBTRについてのFP値を、それぞれ算出した。これらの結果を、表6に示す。このTMR反応における陽性サンプルは、コントロールより80mPを超えて大きいFP値を生じたが、一方このBTR反応における陽性サンプルは、コントロールより25mPを超えて大きいFP値を生じた(これらのコントロールの標準偏差の7倍より大きい)。これらのサンプルの遺伝子型を容易に決定し、そしてこの表に列挙した。これらの結果は、他の遺伝子型決定(genotyping)法により得られる結果と完全に一致した。
【0048】
表6.遺伝子型マーカーDXS17に対する、PCR産物をテンプレートとして用いる二色FP−TDIアッセイ
【0049】
【表6】
a使用した励起波長および発光波長について、表3の脚注を参照のこと。
【0050】
(実施例6)
(SSBタンパク質により増大されるFP−TDI遺伝子型分類)
この実施例においては、遺伝マーカーDXS17を使用して、1本鎖DNA結合(SSB)タンパク質が蛍光偏光の変化を増大させることを実証した。この増大は、このアッセイの感度および効率を増加させることがわかった。
【0051】
ゲノムDNAのPCR増幅、エビアルカリホスファターゼおよびエキソヌクレアーゼI消化を、実施例3に与えるように実施した。この遺伝子型分類反応は、FAM−ddAを使用して、1つの対立遺伝子のみを試験した。この反応の後に、この反応混合物を、前述のようにTDI反応緩衝液で希釈した。その蛍光強度を測定し、そして蛍光偏光値を算出した。次いで、1μLの3.3μM SSBタンパク質を、マイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。このプレートを、30分間静置した。再度、蛍光強度を測定し、そしてFP値を算出した。これらの結果を表7に与える。
【0052】
1本鎖DNA結合タンパク質が、この陽性反応を特異的に増大させ、このとき陰性反応には、非常に小さな変化のみが注目された。これらの結果は、TDI反応の伸長生成物が、1本鎖のままであることを示唆する。
【0053】
(表7.FP−TDIのSSB増大の結果)
【0054】
【表7】
(実施例7)
(メタノール含有緩衝液での希釈により増大するFP−TDI)
いくつかの蛍光色素は高度に疎水性であり、そして水溶液中では、実証可能に十分な発光スペクトルを提供しないと考えられる。従って、これらの色素のこのような水溶液は、蛍光偏光の受容不可能な高いバックグラウンドを生じ得る。この実施例は、メタノールなどの有機溶媒が、蛍光偏光の高いバックグラウンドを顕著に減少させ得ることを示す。これらの実験を、合成テンプレートCF508セットおよびBODIPY−Texas Red(BTR)標識ddNTPを使用して、実施した。
【0055】
実験手順を、本質的に実施例2に与えるように実施した。プライマー伸長の反応の完了に続いて、この反応混合物を、最初に125μLのTDI反応緩衝液に希釈して、その蛍光強度を測定し、そしてFP値を算出した。次いで、50μLのメタノールを、マイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、そして蛍光強度を再度測定した。これらの結果を、表8および表9に与える。
【0056】
各ウェルにメタノールを添加する前には、BTR−ddAおよびBTR−ddGを使用すると、陽性反応と陰性反応との差異は、実質的に注目されなかったが、ddCおよびddUを使用すると、いくらかの差異が観察された。各ウェルにメタノールを添加した後には、ddCおよびddUについての陽性反応と陰性反応との差異は劇的に増加し、それぞれ59〜143mPおよび38〜145mPであった。しかし、驚くべきことに、ddAおよびddGを使用した場合には、これらの陽性反応および陰性反応は、依然として顕著には異ならなかった。これらのデータは、特定の色素が、差別的な結果を生じ得ることを示唆する。しかし、熟練者は、これらの教示に容易に従って、あらゆる特定の色素についてのあらゆる差別的な結果を観察し得る。
【0057】
【表8】
【0058】
【表9】
(実施例の要約)
色素標識ジデオキシターミネーターが配列決定反応において広範に使用されており(Kaiser,R.J.ら、Nucleic Acids Res(1989)17:6087−6102;Prober,J.M.ら、Science(1987)238:336−341)、そしてテンプレート指向性プライマー伸長遺伝子型分類法の感度および特異性が十分に確立されている(Saiki,R.K.ら、Science(1988)239:487−491;Syvanen,A.C.ら;Genomics(1990)8:684−692)が、プライマー伸長反応における検出方法としてのFPの使用は、本研究の前に報告されていない。提供する7つの実施例は、FPが、単一塩基対変化についての均質プライマー伸長反応において、単純、高感度、かつ特異的な検出方法であることを示す。実施例1において、他の点では同一のオリゴヌクレオチドの中間における1つの特定の部位に4つの可能性のあるヌクレオチドを含む4つの合成テンプレートを使用して、色素−ターミネーター取り込みのFP検出の感度および特異性を確立した。第2の実施例において、いくつかの色素を、このアッセイにおけるそれらの有用性について試験した。第3のセットの実施例において、ゲノムDNAから増幅されたPCR産物を、単色FP−TDIアッセイにおけるテンプレートとして使用して、正確な遺伝子型分類データが、このアッセイによって効率的に得られることを示した。第4の実施例において、合成テンプレートを使用して、色素−ターミネーターの正しい組合せを選択することによって、二重色FP−TDIアッセイが実施され得ることを示した。第5の実施例において、PCR産物を、二重色FP−TDIアッセイにおけるテンプレートとして使用して、均質アッセイにおけるマーカーまたは変異の両方の対立遺伝子について正確な遺伝子型分類データが得られることを示した。第6の実施例は、一本鎖DNA結合タンパク質が、FP−TDI遺伝子型分類における陽性結果を特異的に増強し得ることを示す。第7の実施例は、いくつかの驚くべき結果を有し、メタノールは、BTR−ddCおよびBTR−ddUについての陽性反応と陰性反応との間の差異を増加し得たが、BTR−ddAおよびBTR−ddGに対する効果を有さない。このことは、蛍光色素の選択だけではなくこの色素および塩基の組合せもまた、非常に重要であることを示唆する。
【0059】
これらの研究は、FP−TDIアッセイが、プライマー伸長反応の感度および特異性を保持する一方で、その実行のために改変されたプライマーを必要としない、強固な、均質な遺伝子試験であることを実証する。非改変FP−TDIプライマーの費用は、色素標識プライマーの費用のわずか20%であるので、この新しい検出方法は、色素標識プローブに基づく他の遺伝子型分類アッセイよりも費用効果が高い。DNA試験(すなわち、既知のDNA多型または変異の存在または非存在についてアッセイすること)の需要は、診断、法医学および集団研究の分野において劇的に増加すると予測される。均質な遺伝子型分類アッセイ(例えば、FP−TDIアッセイ)は、大規模な遺伝子研究のために高度に適切である。なぜなら、このアッセイは、特定の反応形式に限定されず、そして高密度DNAチップを再設計または再組立する必要なく特定の適用に利用可能になるように最も良好なマーカーを使用するという柔軟性を提供するからである。さらに、FP−TDIアッセイは、セットアップ(標準的な試薬混合物をDNAテンプレートに添加することによる)が単純であり、結果は、対立遺伝子識別反応を行った数分後に電子形式で得られ、そして遺伝子型は、単純なコンピュータープログラムの使用によって自動的に指定され得る。FPの原理は任意の蛍光色素(赤外線領域において吸収する色素を含む)に当てはまるので、多重TDIに適切な反応条件の標準セットを生じる4つの至適な蛍光色素のセットを同定するための研究が現在進行中である。DNA診断試験は確かに、研究用実験室ではなく臨床用実験室によってますます多く実施されるので、最小の実験室技術または手動操作を必要とする標準的なプロトコルを利用する方法(例えば、FP−TDIアッセイ)は、将来の医学の臨床的実践にとって極めて重要である。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、蛍光偏光検出のプロセスを例示する。
【図2】 図2は、蛍光偏光テンプレート指向性色素ターミネーター取り込み(FD−TDI)アッセイのプロセスを例示する。
【配列表】
Claims (14)
- テンプレート核酸において少なくとも1つのヌクレオチドの標的部位の存在を検出する方法であって、以下:
(a)標的部位に結合したオリゴヌクレオチドを形成させる工程、ここでオリゴヌクレオチドが該オリゴヌクレオチド中のジデオキシヌクレオチドに結合した発蛍光団を含み;および
(b)蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの発蛍光団の蛍光偏光を検出する工程、
を包含し、
ここで、前記オリゴヌクレオチドは、標的部位に対して直ぐ3’側でテンプレートと結合したプライマー、および発蛍光団に共有結合したジデオキシヌクレオシド三リン酸(ddNTP)から形成され、そしてddNTP結合した発蛍光団は標的部位に結合し、プライマーと反応して、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドである、伸張されたプライマーを生成し、
ここで、蛍光偏光の増加は標的部位の存在を示し、該蛍光偏光の増加により標的部位の存在を検出する、
前記方法。 - テンプレート核酸がゲノムDNAまたはcDNAである、請求項1に記載の方法。
- 異なる蛍光分子で標識されたddNTPを用いて、二つのテンプレート核酸上で同時に行われる、請求項1または2に記載の方法。
- 発蛍光団が、5−カルボキシフルオレセイン(FAM−ddNTP);6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX−ddNTP);N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TMR−ddNTP);およびBODIPY(登録商標)−Texas Red(BTR−ddNTP)からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)は、一本鎖DNA結合(SSB)タンパク質の存在下で行われる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)は、有機溶媒の存在下で行われる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 有機溶媒がメタノールである、請求項6に記載の方法。
- 標的部位に結合した蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光偏光を検出することを含む、テンプレート核酸における少なくとも1つのヌクレオチド標的部位の存在を検出する方法であって、
ここで、蛍光偏光の増加は、標的部位の存在を示し、これによって蛍光偏光の増加による標的部位の存在を検出し、
ここで、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、蛍光標識されたオリゴヌクレオチド中のジデオキシヌクレオチド(ddNTP)に結合した発蛍光団を含み;そして、
ここで、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドは、標的部位に対して直ぐ3’側でテンプレートと結合したプライマー、および発蛍光団と共有結合したddNTPから形成され、そしてddNTP結合した発蛍光団は、標的部位に結合し、プライマーと反応して、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドである、伸張されたプライマーを生成する、
前記方法。 - テンプレート核酸は、ゲノムDNAまたはcDNAである、請求項8に記載の方法。
- 異なる蛍光分子で標識されたddNTPを用いて、二つのテンプレート核酸上で同時に行われる、請求項8または9に記載の方法。
- 発蛍光団が、5−カルボキシフルオレセイン(FAM−ddNTP);6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX−ddNTP);N,N,N’,N’−テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TMR−ddNTP);およびBODIPY(登録商標)−Texas Red(BTR−ddNTP)からなる群より選択される、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの形成は、一本鎖DNA結合(SSB)タンパク質の存在下で行われる、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 蛍光標識されたオリゴヌクレオチドの形成は、有機溶媒の存在下で行われる、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 有機溶媒がメタノールである、請求項13に記載の方法。
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