JP2802125B2 - 核酸の検出方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、相補性を有する2種の核酸によるハイブリ
ッド形成反応を利用した核酸の検出方法、該方法に用い
る固定化プローブ及び該方法を利用した遺伝子病に特有
な遺伝子の検出方法に関する。
ッド形成反応を利用した核酸の検出方法、該方法に用い
る固定化プローブ及び該方法を利用した遺伝子病に特有
な遺伝子の検出方法に関する。
[従来の技術] 一本鎖のDNAやRNAが互いに相補性を有している場合、
相補性を有する部分が結合して二本鎖となりハイブッリ
ドを形成する。このハイブリダイゼーション反応を利用
した核酸の検出や定量のための方法としてサザン法等の
種々の方法があり、遺伝子のクローニング、遺伝子組換
え、所望の遺伝子のスクリーニング、あるいは検体遺伝
子を用いた疾病の診断等の各種遺伝子工学的手法におけ
る基本的技術の一つとなっている。
相補性を有する部分が結合して二本鎖となりハイブッリ
ドを形成する。このハイブリダイゼーション反応を利用
した核酸の検出や定量のための方法としてサザン法等の
種々の方法があり、遺伝子のクローニング、遺伝子組換
え、所望の遺伝子のスクリーニング、あるいは検体遺伝
子を用いた疾病の診断等の各種遺伝子工学的手法におけ
る基本的技術の一つとなっている。
核酸のハイブリダイゼーションを利用した分析方法と
しては、DNAやRNAからなるプローブにハイブリッドの検
出のための標識を施し、これを試料核酸とハイブリダイ
ズさせ、形成されるハイブリッドをプローブに付与した
標識を利用して検出する方法が一般的である。
しては、DNAやRNAからなるプローブにハイブリッドの検
出のための標識を施し、これを試料核酸とハイブリダイ
ズさせ、形成されるハイブリッドをプローブに付与した
標識を利用して検出する方法が一般的である。
このプローブの標識化の方法としては、放射性同位元
素をプローブに導入する方法、あるいは発光反応、発色
反応、蛍光反応等に必要な化合物等をプローブに導入あ
るいは結合させる方法等が用いられている。
素をプローブに導入する方法、あるいは発光反応、発色
反応、蛍光反応等に必要な化合物等をプローブに導入あ
るいは結合させる方法等が用いられている。
プローブとしては、例えば動物、植物、微生物等から
直接分離した核酸断片、所定の基準に従ってクローニン
グしたクローン化核酸断片、合成機器によって合成した
オリゴヌクレオチド等が、分析の目的等に応じて利用さ
れている。
直接分離した核酸断片、所定の基準に従ってクローニン
グしたクローン化核酸断片、合成機器によって合成した
オリゴヌクレオチド等が、分析の目的等に応じて利用さ
れている。
[発明が解決しようとする課題] 遺伝子工学の発展にともない、ハイブリダイゼーショ
ンを利用した核酸の分析法の利用頻度や応用範囲も拡大
しつつあり、より簡便な操作で感度良い分析が行なえる
方法に対する要請が高まっている。
ンを利用した核酸の分析法の利用頻度や応用範囲も拡大
しつつあり、より簡便な操作で感度良い分析が行なえる
方法に対する要請が高まっている。
例えば、放射性同位元素を用いた標識化は、ハイブリ
ッドの検出感度が良い等の利点を有する反面、放射性物
質を扱うので、そのための高価な試薬、特別な機器、装
置等が必要であり、また操作に危険性を伴なう。
ッドの検出感度が良い等の利点を有する反面、放射性物
質を扱うので、そのための高価な試薬、特別な機器、装
置等が必要であり、また操作に危険性を伴なう。
これに対して、ビオチン−アジピン−抗アジピン抗体
−蛍光色素複合体の蛍光反応を利用する酵素による標識
化に代表される非放射性標識は、安全かつ簡便な操作に
より標識化及び検出が行なえ、用いる試薬も安価である
という利点を有するが、プローブの標識に用いた場合に
検出感度が低くなり易いという欠点がある。
−蛍光色素複合体の蛍光反応を利用する酵素による標識
化に代表される非放射性標識は、安全かつ簡便な操作に
より標識化及び検出が行なえ、用いる試薬も安価である
という利点を有するが、プローブの標識に用いた場合に
検出感度が低くなり易いという欠点がある。
また、各種分析においては、標識化されるプローブと
して100塩基以上のヌクレオチド鎖長を有する核酸断片
が用いられる場合が多い。このような比較的長い核酸断
片は、その標識化が比較的容易であるという利点を有す
るが、合成機による合成が困難であり、その調達に生体
からの分離操作やクローニング等の煩雑な作業が必要と
なるという欠点がある。
して100塩基以上のヌクレオチド鎖長を有する核酸断片
が用いられる場合が多い。このような比較的長い核酸断
片は、その標識化が比較的容易であるという利点を有す
るが、合成機による合成が困難であり、その調達に生体
からの分離操作やクローニング等の煩雑な作業が必要と
なるという欠点がある。
これに対し、100塩基未満の長さの核酸断片は、合成
機器によって容易に合成できるという利点がある。しか
しながら、標識化、特にニックトランスレーションや酵
素による標識化が容易でないという短所がある。
機器によって容易に合成できるという利点がある。しか
しながら、標識化、特にニックトランスレーションや酵
素による標識化が容易でないという短所がある。
更に、複数種のプローブを用いて複数種の核酸を同時
に分析したい場合に、形成されたハイブリッドにどのプ
ローブが含まれているのかを判別するためには、各核酸
に対応するプローブのそれぞれに異なる標識を施す必要
がある。しかしながら、このような操作は極めて煩雑で
ある。
に分析したい場合に、形成されたハイブリッドにどのプ
ローブが含まれているのかを判別するためには、各核酸
に対応するプローブのそれぞれに異なる標識を施す必要
がある。しかしながら、このような操作は極めて煩雑で
ある。
一方、疾病と関連する遺伝子の検出方法へのハイブリ
ダイゼーションを利用した核酸の分析法の応用が注目さ
れている。
ダイゼーションを利用した核酸の分析法の応用が注目さ
れている。
遺伝子レベルでの変異等によって誘発される疾病とし
て、例えばフェニルケトン尿症、サラセミアなどの遺伝
性ヘモグロビン異常症、OTC(ornitine transcarbamyla
se)欠損症、Duchenne型筋ジストロフィー等種々の遺伝
子病が知られている。
て、例えばフェニルケトン尿症、サラセミアなどの遺伝
性ヘモグロビン異常症、OTC(ornitine transcarbamyla
se)欠損症、Duchenne型筋ジストロフィー等種々の遺伝
子病が知られている。
また、ある種の癌の発生に遺伝子変異による蛋白質の
変異が関与しているとの報告がある。
変異が関与しているとの報告がある。
あるいは、AIDS、ATL等の重篤な疾患がレトロウイル
スによって引き起されている可能性が高まっている。
スによって引き起されている可能性が高まっている。
遺伝子病の診断は、一般的には、遺伝子病に特徴的な
酵素の活性やタンパク質の量を測定し、その結果からこ
れらの欠損や異常があるかどうかを判断することによっ
て行なわれているが、場合によっては疾患の指標となる
酵素の存在がサンプリングの困難な臓器等の部分に極在
し、検体の入手が困難であったり、また測定すべき指標
酵素を特定できないこともあり、これらの診断方法は必
ずしも満足できるものではない。
酵素の活性やタンパク質の量を測定し、その結果からこ
れらの欠損や異常があるかどうかを判断することによっ
て行なわれているが、場合によっては疾患の指標となる
酵素の存在がサンプリングの困難な臓器等の部分に極在
し、検体の入手が困難であったり、また測定すべき指標
酵素を特定できないこともあり、これらの診断方法は必
ずしも満足できるものではない。
また、ウイルス感染症の診断は、もっぱらELISA法やP
A法により行なわれてきたが、これらの方法は必ずしも
正確なものではない。
A法により行なわれてきたが、これらの方法は必ずしも
正確なものではない。
遺伝子病、癌、ウイルス感染を、検体の採取が比較的
容易であり、正確な検査が期待できる遺伝子レベルでの
診断によって正確に早期発見できれば、適切な治療を早
期に行なうことができる。そこで、遺伝子レベルでの診
断方法に対する要望が高まっている。
容易であり、正確な検査が期待できる遺伝子レベルでの
診断によって正確に早期発見できれば、適切な治療を早
期に行なうことができる。そこで、遺伝子レベルでの診
断方法に対する要望が高まっている。
その有力な方法の一つとして、例えばRFLP(restrict
ion fragment length polymorphism)がある。
ion fragment length polymorphism)がある。
この方法は、ヒトの全遺伝子を制限酵素によって切断
して得たDNA断片をアガロースゲル電気泳動で展開し、
これを放射性同位元素等により標識化したプローブDNA
とハイブリダイズさせ、標識を利用して検出されるハイ
ブリッドの電気泳動パターンを、正常遺伝子で同様にし
て得た電気泳動パターンと比較することによって疾病と
関連する遺伝子の存在を検出する方法である。
して得たDNA断片をアガロースゲル電気泳動で展開し、
これを放射性同位元素等により標識化したプローブDNA
とハイブリダイズさせ、標識を利用して検出されるハイ
ブリッドの電気泳動パターンを、正常遺伝子で同様にし
て得た電気泳動パターンと比較することによって疾病と
関連する遺伝子の存在を検出する方法である。
RFLP等を利用した遺伝子の解析による遺伝子病の診断
法は、より確実な診断を行なう上で極めて有用な方法と
して注目されている。
法は、より確実な診断を行なう上で極めて有用な方法と
して注目されている。
しかしながら、これらの方法の実施に際しては、試験
者に対して分子生物学的知識や熟練した技術が要求さ
れ、しかも操作が極めて煩雑であるため、医師、検査技
術者等の医療に携わっている者が容易に実施できる方法
ではない。
者に対して分子生物学的知識や熟練した技術が要求さ
れ、しかも操作が極めて煩雑であるため、医師、検査技
術者等の医療に携わっている者が容易に実施できる方法
ではない。
また、これらの方法は、DNAの切断、サザンブロッテ
ィング、ハイブリダイゼーションの各工程にそれぞれ1
日程度の時間を要し、最終的な結果を得るまでに長時間
を要し、一回の検査に取り扱える検体数に限りがあるの
で、多くの患者のDNAを多項目にわたって検査するのは
極めて困難な作業となる。
ィング、ハイブリダイゼーションの各工程にそれぞれ1
日程度の時間を要し、最終的な結果を得るまでに長時間
を要し、一回の検査に取り扱える検体数に限りがあるの
で、多くの患者のDNAを多項目にわたって検査するのは
極めて困難な作業となる。
また、核酸のハイブリダイゼーションを利用した検出
方法の細菌等の微生物の分類法、特に病原菌の検定への
応用が注目されている。
方法の細菌等の微生物の分類法、特に病原菌の検定への
応用が注目されている。
微生物の分類学的な同定は、その微生物の生態学的性
状や生化学的性状を、標準微生物と比較検討することに
よって行なわれてきた。
状や生化学的性状を、標準微生物と比較検討することに
よって行なわれてきた。
ところが、このような方法では、検査法の違いによっ
て性状の判定が異なったり、どの性状に重点をおくかに
よって同定結果が異ったりする場合がある。
て性状の判定が異なったり、どの性状に重点をおくかに
よって同定結果が異ったりする場合がある。
検体が感染症を引き起した患者から得た細菌等の場
合、その同定結果に誤りがあると、適切な対応処置がで
きないことになるので、より確実な同定法が特に必要と
される。
合、その同定結果に誤りがあると、適切な対応処置がで
きないことになるので、より確実な同定法が特に必要と
される。
そこで、近年、より確実な同定法を提供する目的で、
細菌感染症における原因細菌の検出、同定にDNA−DNAハ
イブリダイゼーション法を用いる試みがなされてきてい
る。
細菌感染症における原因細菌の検出、同定にDNA−DNAハ
イブリダイゼーション法を用いる試みがなされてきてい
る。
この方法は、細菌のDNAのなかで該細菌に特徴的な塩
基配列に着目してそれを基準配列とし、該基準配列と相
同性の高い塩基配列が検体細菌から抽出したDNA中に存
在するかどうかを、該塩基配列を検出できるプローブを
用いたハイブリダイゼーション法によって調べることに
よって、検体細菌の分類学的な同定を行なう方法であ
る。
基配列に着目してそれを基準配列とし、該基準配列と相
同性の高い塩基配列が検体細菌から抽出したDNA中に存
在するかどうかを、該塩基配列を検出できるプローブを
用いたハイブリダイゼーション法によって調べることに
よって、検体細菌の分類学的な同定を行なう方法であ
る。
この方法におけるプローブとしては、細菌の染色体か
らクローン化したDNA断片、細菌の保持しているプラス
ミドそのもの、合成オリゴヌクレオチド等が用いられ
る。
らクローン化したDNA断片、細菌の保持しているプラス
ミドそのもの、合成オリゴヌクレオチド等が用いられ
る。
具体的には、プローブとして 1)クローン化したランダムフラグメントを用いる方
法、 2)リボゾームRNAを用いる方法及び 3)リボゾームRNAの塩基配列から選択した種や属に特
徴的な塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い
る方法がある。
法、 2)リボゾームRNAを用いる方法及び 3)リボゾームRNAの塩基配列から選択した種や属に特
徴的な塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用い
る方法がある。
上記1)の方法として、細菌から抽出したDNAを適当
な制限酵素で切断して得たランダムフラグメントをクロ
ーン化し、そのなかから目的の分類群とのみ特異的に反
応するクローンを選択してプローブとして用いる方法
が、例えば、Criale,M.S.,Flowers,R.S.et al.;DNA pro
bes,143−148,1986等により知られている。
な制限酵素で切断して得たランダムフラグメントをクロ
ーン化し、そのなかから目的の分類群とのみ特異的に反
応するクローンを選択してプローブとして用いる方法
が、例えば、Criale,M.S.,Flowers,R.S.et al.;DNA pro
bes,143−148,1986等により知られている。
上記2)の方法としては、Edelstein,P.H.;J.Clin.Mi
crobiol.,23:481−484,1986に開示された方法が知られ
ている。この方法は、細菌のリボゾームRNAが同一分類
群内で比較的類似していることに着目した方法であり、
細菌の染色体中に多数の遺伝子コピーが存在するので、
リボゾームRNAを用いれば検出感度が高くなるという利
点がある。
crobiol.,23:481−484,1986に開示された方法が知られ
ている。この方法は、細菌のリボゾームRNAが同一分類
群内で比較的類似していることに着目した方法であり、
細菌の染色体中に多数の遺伝子コピーが存在するので、
リボゾームRNAを用いれば検出感度が高くなるという利
点がある。
上記3)の方法としては、Proteus属のリボゾームRNA
の塩基配列から選択した、Proteus属に属する細菌の
属、種または亜種等に特異的な塩基配列をプローブに利
用した例が(Haun,G.& Gobel,U.;FEMS Microbiol.Let
t.,43:187−194,1987に報告されている。
の塩基配列から選択した、Proteus属に属する細菌の
属、種または亜種等に特異的な塩基配列をプローブに利
用した例が(Haun,G.& Gobel,U.;FEMS Microbiol.Let
t.,43:187−194,1987に報告されている。
しかしながらこれらの方法においても、先に述べたハ
イブリダイゼーションを利用した核酸の各種分析方法に
おける問題点を共通して有している。
イブリダイゼーションを利用した核酸の各種分析方法に
おける問題点を共通して有している。
本発明は、以上述べたようなハイブリダイゼーション
法を利用する従来の各種検出方法における問題点に鑑み
なされたものであり、その目的は、簡便かつ正確に実施
できるハイブリダイゼーション法を利用した核酸の検出
方法を提供することにある。
法を利用する従来の各種検出方法における問題点に鑑み
なされたものであり、その目的は、簡便かつ正確に実施
できるハイブリダイゼーション法を利用した核酸の検出
方法を提供することにある。
[課題を解決するための手段] 本発明の核酸の検出方法は、検体試料中の特定の塩基
配列を有する核酸の検出方法であって、 a)該特定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有す
るプローブ核酸を用意する工程; b)該検体試料中の核酸を一本鎖化した試料核酸と該プ
ローブ核酸とを反応させてハイブリッドを形成させる工
程; c)標識化されたヌクレオチドの存在下で該ハイブリッ
ドに伸展反応を施して該ハイブリッド末端の伸展部分に
標識物質を取り込ませることによって該ハイブリッドの
みを標識化する工程;及び d)該標識化されたハイブリッドをそこに取り込ませた
標識を利用して検出する工程; を含むことを特徴とする。
配列を有する核酸の検出方法であって、 a)該特定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有す
るプローブ核酸を用意する工程; b)該検体試料中の核酸を一本鎖化した試料核酸と該プ
ローブ核酸とを反応させてハイブリッドを形成させる工
程; c)標識化されたヌクレオチドの存在下で該ハイブリッ
ドに伸展反応を施して該ハイブリッド末端の伸展部分に
標識物質を取り込ませることによって該ハイブリッドの
みを標識化する工程;及び d)該標識化されたハイブリッドをそこに取り込ませた
標識を利用して検出する工程; を含むことを特徴とする。
本発明は、ヒト、動物、植物、細菌等の微生物、真
菌、原生動物等の生体に由来するDNAやRNA、クローン化
DNA、組換えDNA、合成DNA等の各種核酸の検出、定量に
利用でき、検出対象となる核酸(被検出核酸)の種類は
限定されない。
菌、原生動物等の生体に由来するDNAやRNA、クローン化
DNA、組換えDNA、合成DNA等の各種核酸の検出、定量に
利用でき、検出対象となる核酸(被検出核酸)の種類は
限定されない。
プローブ核酸としては、被検出核酸と効果的にハイブ
リダイズできる塩基配列を有する核酸であればどのよう
なものでも利用できるが、合成機で手軽に合成できる比
較的短いヌクレオチド鎖長のオリゴヌクレオチドが利用
し易い。
リダイズできる塩基配列を有する核酸であればどのよう
なものでも利用できるが、合成機で手軽に合成できる比
較的短いヌクレオチド鎖長のオリゴヌクレオチドが利用
し易い。
プローブ核酸のヌクレオチド鎖長は、被検出核酸のヌ
クレオチド鎖長の1/10以下とするのが好ましい。
クレオチド鎖長の1/10以下とするのが好ましい。
なお、本発明においては、プローブ核酸と被検出核酸
からなるハイブリッドに標識が施されるので、プローブ
核酸自体には標識化に必要な要件は要求されない。
からなるハイブリッドに標識が施されるので、プローブ
核酸自体には標識化に必要な要件は要求されない。
例えば、ニックトランスレーション法や標識酵素の結
合法を用いる標識では、標識される核酸がある程度以上
のヌクレオチド鎖長を有する必要があるが、本発明で利
用するプローブ核酸にはこのような要件は要求されな
い。
合法を用いる標識では、標識される核酸がある程度以上
のヌクレオチド鎖長を有する必要があるが、本発明で利
用するプローブ核酸にはこのような要件は要求されな
い。
従って、入手(調製)し易く、かつ上述のように高感
度な検出を実現し得る短いヌクレオチド鎖長のものがプ
ローブ核酸として利用できるようになる。
度な検出を実現し得る短いヌクレオチド鎖長のものがプ
ローブ核酸として利用できるようになる。
しかしながら、本発明においては形成されたハイブリ
ッドに標識が施されるので、プローブ核酸の構成やヌク
レオチド長を、形成されたハイブリッドの標識化が容易
であるように選択することが望ましい。
ッドに標識が施されるので、プローブ核酸の構成やヌク
レオチド長を、形成されたハイブリッドの標識化が容易
であるように選択することが望ましい。
例えば、後述するような、ハイブリットの二本鎖部分
の一方のヌクレオチド鎖をプライマーとして利用し、そ
の末端からヌクレオチド鎖を伸展させ、その伸展部分に
標識物質を取り込ませる方法による標識化方法で、プロ
ーブ核酸をプライマーとして利用する場合、形成される
ハイブリッドが、プローブ核酸とハイブリダイズした被
検出核酸のヌクレオチド鎖がプライマー端部の伸展の際
の鋳型として機能できるような構成、すなわちプローブ
核酸の末端伸展方向に被検出核酸のヌクレオチド鎖が一
本鎖の状態で存在する構成を有している必要がある。
の一方のヌクレオチド鎖をプライマーとして利用し、そ
の末端からヌクレオチド鎖を伸展させ、その伸展部分に
標識物質を取り込ませる方法による標識化方法で、プロ
ーブ核酸をプライマーとして利用する場合、形成される
ハイブリッドが、プローブ核酸とハイブリダイズした被
検出核酸のヌクレオチド鎖がプライマー端部の伸展の際
の鋳型として機能できるような構成、すなわちプローブ
核酸の末端伸展方向に被検出核酸のヌクレオチド鎖が一
本鎖の状態で存在する構成を有している必要がある。
従って、このようなプローブ核酸をプライマーとして
利用するこの標識化方法の場合には、プローブ核酸の構
成やヌクレオチド長を、形成されるハイブリッドの構造
を考慮して決定するのが望ましい。
利用するこの標識化方法の場合には、プローブ核酸の構
成やヌクレオチド長を、形成されるハイブリッドの構造
を考慮して決定するのが望ましい。
なお、場合によっては試料核酸をプライマーとして利
用するものであっても良い。
用するものであっても良い。
試料核酸とプローブ核酸とのハイブリダイゼーション
は、常法に従って行なうことができる。
は、常法に従って行なうことができる。
なお、ハイブリッド形成反応の条件は、用いられるプ
ローブ核酸の有するヌクレオチド鎖長や塩基配列などに
よって異なるので、ハイブリダイゼーションにおける操
作条件は所望とする目的に応じて最適条件を適宜選択す
ると良い。
ローブ核酸の有するヌクレオチド鎖長や塩基配列などに
よって異なるので、ハイブリダイゼーションにおける操
作条件は所望とする目的に応じて最適条件を適宜選択す
ると良い。
このハイブリッド形成反応は、一般的には、ホルムア
ミド、適当な塩及びDenhardt溶液を含むハイブリダイゼ
ーション溶液中で、温度をコントロールして行うことが
できる。
ミド、適当な塩及びDenhardt溶液を含むハイブリダイゼ
ーション溶液中で、温度をコントロールして行うことが
できる。
このハイブリッド形成反応には、試料核酸とプローブ
核酸とをハイブリダイゼーション溶液中で反応させる方
法、担体に固定化されたプローブ核酸にハイブリダイゼ
ーション溶液中で試料核酸を反応させる方法、担体に固
定化された試料核酸にハイブリダイゼーション溶液中で
プローブ核酸を反応させる方法等が利用できる。
核酸とをハイブリダイゼーション溶液中で反応させる方
法、担体に固定化されたプローブ核酸にハイブリダイゼ
ーション溶液中で試料核酸を反応させる方法、担体に固
定化された試料核酸にハイブリダイゼーション溶液中で
プローブ核酸を反応させる方法等が利用できる。
試料核酸やプローブ核酸の固定化には、核酸をニトロ
セルロース、ナイロン膜、各種ゲル等の担体に、物理的
あるいは化学的に結合させる方法が利用できる。
セルロース、ナイロン膜、各種ゲル等の担体に、物理的
あるいは化学的に結合させる方法が利用できる。
本発明の方法においては、試料核酸とプローブ核酸を
反応させ、その結果形成させれたハイブリッドに選択的
に標識が施される。
反応させ、その結果形成させれたハイブリッドに選択的
に標識が施される。
この標識化の方法としては、例えばハイブリットの二
本鎖部分を構成する鎖の一方をプライマーとして利用
し、その末端を伸展させて1本鎖部分を2本鎖化する際
に、その新たに合成される伸展部分に標識物質を取り込
ませる方法等が利用できる。
本鎖部分を構成する鎖の一方をプライマーとして利用
し、その末端を伸展させて1本鎖部分を2本鎖化する際
に、その新たに合成される伸展部分に標識物質を取り込
ませる方法等が利用できる。
この方法によれば、ハイブリットを形成していない核
酸には、新たな二本鎖部分形成のためのプライマーとし
て機能する部分及び伸展部分形成用の鋳型となる部分が
存在しないので、上記の標識物質を取り込む二本鎖化反
応が生じない。
酸には、新たな二本鎖部分形成のためのプライマーとし
て機能する部分及び伸展部分形成用の鋳型となる部分が
存在しないので、上記の標識物質を取り込む二本鎖化反
応が生じない。
従って、ハイブリットを形成していない核酸とハイブ
リッドとの混合物状態で、この標識化反応を行なって
も、ハイブリットのみに選択的に標識を施すことができ
る。
リッドとの混合物状態で、この標識化反応を行なって
も、ハイブリットのみに選択的に標識を施すことができ
る。
この標識化には、プライマーを利用して新たな2本鎖
部分を合成するための種々の方法が利用できる。
部分を合成するための種々の方法が利用できる。
例えば、プライマー端部の伸展に必要な、dATP、dCT
P、dGTP、dTTPなどのヌクレオチドと標識化すべきハイ
ブリッドとをヌクレオチド鎖形成用の酵素の存在下で反
応させ、その際に用いるヌクレオチドの1または2以上
に標識化ヌクレオチドを用いて、新たに形成されるヌク
レオチド鎖に標識を取り込ませる方法等を利用できる。
P、dGTP、dTTPなどのヌクレオチドと標識化すべきハイ
ブリッドとをヌクレオチド鎖形成用の酵素の存在下で反
応させ、その際に用いるヌクレオチドの1または2以上
に標識化ヌクレオチドを用いて、新たに形成されるヌク
レオチド鎖に標識を取り込ませる方法等を利用できる。
この標識化ヌクレオチドとしては、一般にプローブの
標識に利用されている。例えば放射性同位元素(RI)に
より標識化されたもの、例えばビオチン、ジニトロフェ
ニルヌクレオチド誘導体等の蛍光、発光または発色を誘
発するのに必要な酵素や化合物などの非放射性標識物質
(nonRI)で標識化されたものなどが利用できる。
標識に利用されている。例えば放射性同位元素(RI)に
より標識化されたもの、例えばビオチン、ジニトロフェ
ニルヌクレオチド誘導体等の蛍光、発光または発色を誘
発するのに必要な酵素や化合物などの非放射性標識物質
(nonRI)で標識化されたものなどが利用できる。
ヌクレオチド鎖形成用の酵素としては、大腸菌DNAポ
リメラーゼI、DNAポリメラーゼIのクレーノ断片、T4D
NAポリメラーゼ等の各種DNAのポリメラーゼや逆転写酵
素などが利用できる。
リメラーゼI、DNAポリメラーゼIのクレーノ断片、T4D
NAポリメラーゼ等の各種DNAのポリメラーゼや逆転写酵
素などが利用できる。
本発明における標識化は、ハイブリッドが適当な担体
に固定化した状態で、あるいはハイブリッドを適当な溶
媒中に溶解あるいは分散した状態で行なうことができ
る。
に固定化した状態で、あるいはハイブリッドを適当な溶
媒中に溶解あるいは分散した状態で行なうことができ
る。
なお、標識化の反応終了後に、標識化されたハイブリ
ッドと、ハイブリッドに取り込まれなかった標識物との
分離は、例えば以下のような方法により行なうことがで
きる。
ッドと、ハイブリッドに取り込まれなかった標識物との
分離は、例えば以下のような方法により行なうことがで
きる。
(1)固定化プローブ核酸を用いた場合; 適当な担体に固定化した固定化プローブ核酸に試料核
酸を反応させる。この反応でハイブリッドが形成された
場合には、ハイブリッドも担体に固定化されている状態
となる。その状態で、更に標識化処理を行なった後、適
当な条件下、例えば塩濃度や温度を変えて担体を洗浄
し、ハイブリッドに取り込まれなかった標識物を洗い出
して除去する。
酸を反応させる。この反応でハイブリッドが形成された
場合には、ハイブリッドも担体に固定化されている状態
となる。その状態で、更に標識化処理を行なった後、適
当な条件下、例えば塩濃度や温度を変えて担体を洗浄
し、ハイブリッドに取り込まれなかった標識物を洗い出
して除去する。
(2)固定化試料核酸を用いた場合; 適当な担体に固定化した試料核酸にプローブ核酸を反
応させる。この反応でハイブリッドが形成された場合に
は、ハイブリッドも担体に固定化されている状態とな
る。以下、上記(1)の方法と同様にして担体を洗浄
し、ハイブリッドに取り込まれなかった標識物を洗い出
して除去する。
応させる。この反応でハイブリッドが形成された場合に
は、ハイブリッドも担体に固定化されている状態とな
る。以下、上記(1)の方法と同様にして担体を洗浄
し、ハイブリッドに取り込まれなかった標識物を洗い出
して除去する。
(3)試料核酸とプローブ核酸を固定化しないで反応さ
せた場合; 適当な媒体中でプローブ核酸と試料核酸を反応させ
る。得られた反応液に、更に標識化処理を行なった後、
ハイブリッドとハイブリッドに取り込まれなかった標識
物とを適当な分離方法によって分離する。
せた場合; 適当な媒体中でプローブ核酸と試料核酸を反応させ
る。得られた反応液に、更に標識化処理を行なった後、
ハイブリッドとハイブリッドに取り込まれなかった標識
物とを適当な分離方法によって分離する。
この分離方法としては、エタノール沈殿法、ゲルろ過
カラムによる分離等が利用できる。
カラムによる分離等が利用できる。
なお、プローブ核酸を上述の反応のプライマーとして
利用する場合には、プローブ核酸としてハイブリッド形
成後にプライマーとして利用し得る構成やヌクレオチド
鎖長を有するものを用いるのが望ましい。また、場合に
よっては、試料核酸をプライマーとして利用しても良
い。
利用する場合には、プローブ核酸としてハイブリッド形
成後にプライマーとして利用し得る構成やヌクレオチド
鎖長を有するものを用いるのが望ましい。また、場合に
よっては、試料核酸をプライマーとして利用しても良
い。
なお、通常、同程度の標識量を用いた場合に、一般に
RI標識に比べてnonRI標識は低感度であるが、本発明の
方法ではnonRI標識を用いた場合でも高感度な検出が可
能となる。
RI標識に比べてnonRI標識は低感度であるが、本発明の
方法ではnonRI標識を用いた場合でも高感度な検出が可
能となる。
従来の方法では、短いヌクレオチド鎖長のプローブ核
酸を標識化して用いる場合が多いが、このような場合に
は標識取り込み部の量が制限され、標識の取り込み量に
限界がある。
酸を標識化して用いる場合が多いが、このような場合に
は標識取り込み部の量が制限され、標識の取り込み量に
限界がある。
これに対して、本発明の方法では、上述の標識化の操
作においてプライマーとなる核酸の末端の伸展により新
に合成される2本鎖部分の長さが十分に長いものとなる
ように、プローブ核酸と試料核酸の組合せを考慮して用
いることにより、標識化における標識の取り込み量を多
くさせることができ、nonRI標識を用いた場合でもその
低感度性を多量の取り込み量で補填することができ、高
感度な検出が可能となる。
作においてプライマーとなる核酸の末端の伸展により新
に合成される2本鎖部分の長さが十分に長いものとなる
ように、プローブ核酸と試料核酸の組合せを考慮して用
いることにより、標識化における標識の取り込み量を多
くさせることができ、nonRI標識を用いた場合でもその
低感度性を多量の取り込み量で補填することができ、高
感度な検出が可能となる。
ハイブリッドの標識化が終了したところで、該標識を
利用してハイブリッドの検出を行なう。
利用してハイブリッドの検出を行なう。
なお、形成されたハイブリッドの有する標識量を定量
的に分析することによって、被検出核酸の定量を行なう
ことができる。
的に分析することによって、被検出核酸の定量を行なう
ことができる。
以上の操作において、プローブ核酸として、複数種の
核酸を用いることにより、試料核酸中に複数の被検出核
酸が含まれている場合にそれらを同時に検出することが
できる。
核酸を用いることにより、試料核酸中に複数の被検出核
酸が含まれている場合にそれらを同時に検出することが
できる。
複数種のプローブを用いる方法の代表例を以下に示
す。
す。
a)固定化プローブを用いる方法; まず、複数種の被検出核酸のそれぞれに対応した複数
種のプローブ核酸を、どの位置にどのプローブ核酸が配
置されているかがわかるように所定の配列で固定化し、
それを試料核酸と反応させる。
種のプローブ核酸を、どの位置にどのプローブ核酸が配
置されているかがわかるように所定の配列で固定化し、
それを試料核酸と反応させる。
反応終了後、形成されたハイブリットに標識を施すた
めの処理を行ない、該標識を利用してハイブリット形成
位置を検出する。陽性を示す位置から対応するプローブ
核酸の種類を特定し、その結果から試料核酸中に含まれ
ていた被検出核酸の種類を判定する。
めの処理を行ない、該標識を利用してハイブリット形成
位置を検出する。陽性を示す位置から対応するプローブ
核酸の種類を特定し、その結果から試料核酸中に含まれ
ていた被検出核酸の種類を判定する。
この方法では、プローブ核酸が予め設定された位置で
固定されているので、どのプローブ核酸に試料核酸がハ
イブリダイズしたかが、このプローブ核酸の予め設定さ
れた固定位置から容易に判定できる。
固定されているので、どのプローブ核酸に試料核酸がハ
イブリダイズしたかが、このプローブ核酸の予め設定さ
れた固定位置から容易に判定できる。
従って、標識化したプローブを、固定化した試料核酸
と反応させる従来の方法におけるように、複数種のプロ
ーブ核酸のそれぞれを選別できるように、各プローブ核
酸で異なる標識を用いる必要がない。
と反応させる従来の方法におけるように、複数種のプロ
ーブ核酸のそれぞれを選別できるように、各プローブ核
酸で異なる標識を用いる必要がない。
なお、同一操作で複数種のプローブ核酸でのハイブリ
ッド形成反応を同時に効率良く行なわせるには、各プロ
ーブ核酸のヌクレオチド鎖長を、複数種のプローブ核酸
における個々のハイブリッド形成反応が同一条件化で進
行するために必要な長さに調節しておくことが好まし
い。
ッド形成反応を同時に効率良く行なわせるには、各プロ
ーブ核酸のヌクレオチド鎖長を、複数種のプローブ核酸
における個々のハイブリッド形成反応が同一条件化で進
行するために必要な長さに調節しておくことが好まし
い。
具体的には、例えば個々のハイブリッド形成反応にお
いて形成されるハイブリッドの解離温度(Tm:一本鎖化
する温度)をそろえておくと良い。
いて形成されるハイブリッドの解離温度(Tm:一本鎖化
する温度)をそろえておくと良い。
すなわち、Tm値の算出には、用いるハイブリダイゼー
ション溶液の種類によって種々の数式が用いられてい
る。例えば、0.9M NaCl中では20mer以下のオリゴヌクレ
オチドのTmは、 Tm=2×(A+T)+4×(G+C) (A、T、G、Cはそれぞれアデニン、チミン、グアニ
ン、シトシンの数を表す。) で示される(続生化学実験講座1、遺伝子研究法II、P2
36参照)。
ション溶液の種類によって種々の数式が用いられてい
る。例えば、0.9M NaCl中では20mer以下のオリゴヌクレ
オチドのTmは、 Tm=2×(A+T)+4×(G+C) (A、T、G、Cはそれぞれアデニン、チミン、グアニ
ン、シトシンの数を表す。) で示される(続生化学実験講座1、遺伝子研究法II、P2
36参照)。
そこで、これに従い、それぞれのプローブ核酸の塩基
配列をその式に代入して各プローブ核酸でのTm値がそろ
うようにそれらの長さを選択すると良い。
配列をその式に代入して各プローブ核酸でのTm値がそろ
うようにそれらの長さを選択すると良い。
複数種のプローブ核酸のヌクレオチド鎖長は、被検出
核酸のヌクレオチド鎖長の平均の1/10以下とするのが好
ましい。
核酸のヌクレオチド鎖長の平均の1/10以下とするのが好
ましい。
b)マイクロプレート等の独立した反応領域を有する担
体を用いる方法; まず、マイクロプレート等の独立した反応領域を有す
る担体の各反応領域に試料核酸を含むハイブリダイゼー
ション用の溶液を調製する。
体を用いる方法; まず、マイクロプレート等の独立した反応領域を有す
る担体の各反応領域に試料核酸を含むハイブリダイゼー
ション用の溶液を調製する。
次に、複数種のプローブ核酸のそれぞれを単独で反応
領域に加え、ハイブリダイゼーションを行なう。その
際、どの反応領域にどのプローブ核酸が加えられたかが
わかるようにしておく。
領域に加え、ハイブリダイゼーションを行なう。その
際、どの反応領域にどのプローブ核酸が加えられたかが
わかるようにしておく。
反応終了後、各反応領域内で形成されたハイブリッド
の標識化に必要な反応を行なわせてから、該標識を利用
してハイブリット形成を検出し、陽性を示す反応領域か
ら対応するプローブ核酸の種類を特定し、その結果から
試料核酸中に含まれていた被検出核酸の種類を判定す
る。
の標識化に必要な反応を行なわせてから、該標識を利用
してハイブリット形成を検出し、陽性を示す反応領域か
ら対応するプローブ核酸の種類を特定し、その結果から
試料核酸中に含まれていた被検出核酸の種類を判定す
る。
なお、同一操作で複数種のプローブ核酸でのハイブリ
ッド形成反応を同時に効率良く行なわせるには、各プロ
ーブ核酸のヌクレオチド鎖長を、複数種のプローブ核酸
における個々のハイブリッド形成反応が同一条件化で進
行するために必要な長さに調節しておくことが好まし
い。
ッド形成反応を同時に効率良く行なわせるには、各プロ
ーブ核酸のヌクレオチド鎖長を、複数種のプローブ核酸
における個々のハイブリッド形成反応が同一条件化で進
行するために必要な長さに調節しておくことが好まし
い。
例えば、上述したようにTmがそろうように各ヌクレオ
チド鎖長を選択すると良い。
チド鎖長を選択すると良い。
複数種のプローブ核酸のヌクレオチド鎖長は、被検出
核酸のヌクレオチド鎖長の平均の1/10以下とするのが好
ましい。
核酸のヌクレオチド鎖長の平均の1/10以下とするのが好
ましい。
以上の方法a、bを含む複数種のプローブ核酸を利用
する場合の本発明の方法においては、標識化したプロー
ブを固定化した試料核酸と反応させる従来の方法におけ
るように、複数種のプローブ核酸の選別のための各プロ
ーブ核酸への異なる標識による標識化を行なう必要がな
い。
する場合の本発明の方法においては、標識化したプロー
ブを固定化した試料核酸と反応させる従来の方法におけ
るように、複数種のプローブ核酸の選別のための各プロ
ーブ核酸への異なる標識による標識化を行なう必要がな
い。
一方、複数種の試料核酸に対して1種のプローブ核酸
を用いた複数種の試料核酸の同時検査を行なうこともで
きる。
を用いた複数種の試料核酸の同時検査を行なうこともで
きる。
例えば、複数種の試料核酸を、どの試料核酸がどの位
置にあるかわかるように適当な担体に固定し、1種のプ
ローブ核酸と反応させ、形成されたハイブリッドの標識
化及び標識の検出のための処理を行なうことにより、陽
性を示す位置に対応する試料に被検出核酸の存在を確認
できる。
置にあるかわかるように適当な担体に固定し、1種のプ
ローブ核酸と反応させ、形成されたハイブリッドの標識
化及び標識の検出のための処理を行なうことにより、陽
性を示す位置に対応する試料に被検出核酸の存在を確認
できる。
更に、この方法は、マイクロプレート等の独立した反
応領域を形成できる担体で、核酸を固定せずに行なうこ
ともできる。
応領域を形成できる担体で、核酸を固定せずに行なうこ
ともできる。
以上説明した本発明の核酸の検出方法は、遺伝子病、
癌、ウイルス感染症に特有な遺伝子の検出に有用であ
る。
癌、ウイルス感染症に特有な遺伝子の検出に有用であ
る。
遺伝子病等に特有な遺伝子を検出する方法としては、
例えば以下の過程を含む方法等を挙げることができる。
例えば以下の過程を含む方法等を挙げることができる。
、検査項目である疾病の指標となる遺伝子と関連する
プローブ核酸を適当な担体に固定化する過程。
プローブ核酸を適当な担体に固定化する過程。
、過程で得た固定化プローブと検体染色体DNA(試
料核酸)を反応させる過程。
料核酸)を反応させる過程。
、過程を経た担体に、形成されたハイブリッドの標
識化に必要な処理を行なう過程。
識化に必要な処理を行なう過程。
、過程で形成されたハイブリッドを過程で行なっ
た標識を利用して検出する過程。
た標識を利用して検出する過程。
上記過程で使用される核酸プローブとしては、遺伝
子病等の遺伝子に特有な塩基配列の認識に必要な塩基配
列を有するものが適宜選択されてい用いられ、そのヌク
レオチド鎖長は特に限定されない。
子病等の遺伝子に特有な塩基配列の認識に必要な塩基配
列を有するものが適宜選択されてい用いられ、そのヌク
レオチド鎖長は特に限定されない。
例えば、一塩基対の置換による点突然変異に基づく疾
患を検出する場合には、一塩基の違いを効果的に、かつ
感度良く判定する上で、核酸プローブとしては、100塩
基以下、好ましくは29塩基以下、より好ましくは17〜20
塩基からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。
患を検出する場合には、一塩基の違いを効果的に、かつ
感度良く判定する上で、核酸プローブとしては、100塩
基以下、好ましくは29塩基以下、より好ましくは17〜20
塩基からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。
また、点突然変異に対応する置換部位は、プローブ核
酸としてのオリゴヌクレオチドの中央に位置するように
配置するのが、より正確な判定を行なう上で好ましい。
酸としてのオリゴヌクレオチドの中央に位置するように
配置するのが、より正確な判定を行なう上で好ましい。
過程において、同一担体上に予め決められた配列で
複数検査項目に対応した複数種のプローブ核酸を固定し
ておけば、複数項目にわたった検査を同時に行なうこと
ができる。なお、この方法には、先に述べた複数のプロ
ーブ核酸を用いる方法のaの方法における操作が適用で
きる。
複数検査項目に対応した複数種のプローブ核酸を固定し
ておけば、複数項目にわたった検査を同時に行なうこと
ができる。なお、この方法には、先に述べた複数のプロ
ーブ核酸を用いる方法のaの方法における操作が適用で
きる。
過程で用いる検体DNAとしては、染色体DNAそのも
の、染色体DNAを適当な制限酵素によって適当な長さに
切断したもの等が利用できる。
の、染色体DNAを適当な制限酵素によって適当な長さに
切断したもの等が利用できる。
なお、多項目の検査を同時に行なう場合には、制限酵
素で適当な長さに切断した断片を利用するのが効率が良
い。
素で適当な長さに切断した断片を利用するのが効率が良
い。
また、ハイブリッド形成反応は、先に述べたような方
法によって行なうことができる。
法によって行なうことができる。
この方法で、点突然変異を検出する場合、一つのヌク
レオチドの違いだけでは、プローブと核酸とのミスマッ
チが発生して、点突然変異に有無の差別化ができない場
合がある。
レオチドの違いだけでは、プローブと核酸とのミスマッ
チが発生して、点突然変異に有無の差別化ができない場
合がある。
しかしながら、ハイブリッドのTmは、ミスマッチハイ
ブリッドにおける相補的でない塩基対数、プローブ核酸
のG(グアニン)及びC(シトシン)の含量、プローブ
核酸のヌクレオチド鎖長、点突然変異の位置、ミスマッ
チの種類等によって影響されるので、所望の点突然変異
の検出を阻害するミスマッチハイブリッドの発生のない
温度条件等を、用いるプローブ核酸の構成等に応じて選
択することが重要である。
ブリッドにおける相補的でない塩基対数、プローブ核酸
のG(グアニン)及びC(シトシン)の含量、プローブ
核酸のヌクレオチド鎖長、点突然変異の位置、ミスマッ
チの種類等によって影響されるので、所望の点突然変異
の検出を阻害するミスマッチハイブリッドの発生のない
温度条件等を、用いるプローブ核酸の構成等に応じて選
択することが重要である。
例えば、ミスマッチハイブリッドに含まれる相補的で
ない塩基対1つあたりTmは5〜10℃降下する。
ない塩基対1つあたりTmは5〜10℃降下する。
従って、ハイブリダイゼーションの温度は、所望とす
るハイブリッドのTmと形成し得るミスマッチハイブリッ
ドのTmを考慮して選択する必要がある。
るハイブリッドのTmと形成し得るミスマッチハイブリッ
ドのTmを考慮して選択する必要がある。
また、同一担体上に複数種のプローブ核酸を固定化し
て用いる場合には、上述のミスマッチに係る要件に加え
て、各プローブ核酸により形成されるハイブリットのTm
が揃うように、これらのヌクレオチド鎖長等を調節して
おくと良い。
て用いる場合には、上述のミスマッチに係る要件に加え
て、各プローブ核酸により形成されるハイブリットのTm
が揃うように、これらのヌクレオチド鎖長等を調節して
おくと良い。
過程における標識化には先に挙げた方法等が利用で
きる。
きる。
過程は、用いた標識に応じた方法によって行なわれ
る。
る。
なお、上述の方法ではプローブ核酸を固定化して用い
たが、プローブ核酸の代りに検体核酸を固定化しても良
い。
たが、プローブ核酸の代りに検体核酸を固定化しても良
い。
すなわち、複数検体のそれぞれを固定位置がわかるよ
うに固定し、これに1種のプローブ核酸を反応させるよ
うにすれば、1つの検査項目について、複数個の検体を
同時に検査することができる。
うに固定し、これに1種のプローブ核酸を反応させるよ
うにすれば、1つの検査項目について、複数個の検体を
同時に検査することができる。
更に、検体核酸とプローブ核酸のいずれも固定化せず
に反応させても良い。
に反応させても良い。
そのような方法の一例として以下の過程を含む方法等
が挙げられる。
が挙げられる。
、検体核酸とプローブ核酸を適当な媒体中でハイブリ
ダイズさせる過程。
ダイズさせる過程。
、過程で得た反応液に形成されたハイブリッドの標
識化に必要な処理を行なう過程。
識化に必要な処理を行なう過程。
、過程で形成されたハイブリッドを過程で行なっ
た標識を利用して検出する過程。
た標識を利用して検出する過程。
なお、これらの方法におけるハイブリダイゼーショ
ン、ハイブリッドの標識化、標識によるハイブリッドの
検出等の操作は先に説明した操作によって行なうことが
できる。
ン、ハイブリッドの標識化、標識によるハイブリッドの
検出等の操作は先に説明した操作によって行なうことが
できる。
また、先に複数種のプローブ核酸を用いる方法のbの
項で説明した操作に従って複数種のプローブ核酸を個々
に用い〜の過程を、複数種のプローブ核酸について
同時に行なうことで、複数の検査項目の同時検査が可能
である。
項で説明した操作に従って複数種のプローブ核酸を個々
に用い〜の過程を、複数種のプローブ核酸について
同時に行なうことで、複数の検査項目の同時検査が可能
である。
一方、マイクロプレート等の独立した反応領域を形成
できる担体の反応領域に、複数の検体核酸を、どの反応
領域に、検体が入っているかがわかるように別々に投入
した後、各ウエルに同種のプローブ核酸を加えて、ハイ
ブリダイゼーション、ハイブリッドの標識化、標識の検
出のための処理を行なうことにより、陽性を示すウエル
に対応する試料核酸が検査項目に対して陽性かどうかを
判定できる。
できる担体の反応領域に、複数の検体核酸を、どの反応
領域に、検体が入っているかがわかるように別々に投入
した後、各ウエルに同種のプローブ核酸を加えて、ハイ
ブリダイゼーション、ハイブリッドの標識化、標識の検
出のための処理を行なうことにより、陽性を示すウエル
に対応する試料核酸が検査項目に対して陽性かどうかを
判定できる。
以上の遺伝子病等に特有な遺伝子の検出方法におい
て、細菌やウイルス等の微生物に特有の塩基配列を有す
る核酸をプローブとして用い、試料として微生物から分
離した核酸を用いることによって、微生物の分類学的な
同定を行なうことができる。
て、細菌やウイルス等の微生物に特有の塩基配列を有す
る核酸をプローブとして用い、試料として微生物から分
離した核酸を用いることによって、微生物の分類学的な
同定を行なうことができる。
その際のプローブ核酸としては、細菌の分類の場合に
は、20mer程度のヌクレオチド鎖長を有するもの、ウイ
ルスの分類の場合には20mer程度のヌクレオチド鎖長を
有するものが好適である。
は、20mer程度のヌクレオチド鎖長を有するもの、ウイ
ルスの分類の場合には20mer程度のヌクレオチド鎖長を
有するものが好適である。
[実施例] 実施例1 DNA合成機(ABI社、381A型)によりプラスミドpUC19
の一部を構成する以下のDNA塩基配列を有する41merオリ
ゴヌクレオチドを合成した。
の一部を構成する以下のDNA塩基配列を有する41merオリ
ゴヌクレオチドを合成した。
合成物の一部を用い、7M尿素を含む15%ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によりその純度を調べたところ、90
%以上の純度を有していると判定さられたので、この合
成物は精製せずに以下の操作に直接用いた。
アミドゲル電気泳動によりその純度を調べたところ、90
%以上の純度を有していると判定さられたので、この合
成物は精製せずに以下の操作に直接用いた。
この合成物の50μgを含む溶液50μlを、混合試薬液
[0.64Mカコジル酸カリウム、3.3mM CaCl2、0.33mMジチ
オスレイトールを含む0.12Mトリス−OH(pH6.9)]の10
0μl、4.0mMビオチン化UTP(BRL社製)40μl、1.0mM
dTTP 1μl、水100μl及びTdT(Terminal Deoxynucleo
tidyl Transferase)15μl(約90単位)と混合し、10
分間、30℃で反応させた。なお、反応は、0.2M EDTA 4
μlの添加によって停止させた。
[0.64Mカコジル酸カリウム、3.3mM CaCl2、0.33mMジチ
オスレイトールを含む0.12Mトリス−OH(pH6.9)]の10
0μl、4.0mMビオチン化UTP(BRL社製)40μl、1.0mM
dTTP 1μl、水100μl及びTdT(Terminal Deoxynucleo
tidyl Transferase)15μl(約90単位)と混合し、10
分間、30℃で反応させた。なお、反応は、0.2M EDTA 4
μlの添加によって停止させた。
反応を停止させた後、フェノール処理、エタノール沈
殿を行ない、得られた沈殿物を乾燥後、水100μlに溶
解させた。
殿を行ない、得られた沈殿物を乾燥後、水100μlに溶
解させた。
アガロース(ゲル)を臭化シアンで活性化し、それに
アビジンを結合させて固定相(担体)を形成した。
アビジンを結合させて固定相(担体)を形成した。
得られた固定相を、先に得た41merオリゴヌクレオチ
ドを処理して得た沈殿物の水溶液に加え、20分間ゆっく
り撹拌しながらこれらを混合した後、かるい条件で遠心
処理し、上清を除去し、固定化プローブ核酸を得た。
ドを処理して得た沈殿物の水溶液に加え、20分間ゆっく
り撹拌しながらこれらを混合した後、かるい条件で遠心
処理し、上清を除去し、固定化プローブ核酸を得た。
一方、試料核酸として、プラスミドpBR322(試料
A)、プラスミドpUC19(試料B)及びプラスミドpBR32
2とプラスミドpUC19の混合物(試料C、混合重量比1:
1)を用意し、これらの試料を常法によってEcoR I(TOY
OBO製)で消化してから、得られた消化物を加熱処理し
て、二本鎖DNAを1本鎖化し、各試料から得られた3種
の一本鎖DNAを含む反応生成物を個々に用いて以下の操
作を行なった。
A)、プラスミドpUC19(試料B)及びプラスミドpBR32
2とプラスミドpUC19の混合物(試料C、混合重量比1:
1)を用意し、これらの試料を常法によってEcoR I(TOY
OBO製)で消化してから、得られた消化物を加熱処理し
て、二本鎖DNAを1本鎖化し、各試料から得られた3種
の一本鎖DNAを含む反応生成物を個々に用いて以下の操
作を行なった。
一本鎖DNAを含む反応生成物20μgと、先に調製した
固定化プローブ核酸を試験管に入れ、これに10×アニリ
ーング溶液[1×アニリーング溶液:60mM MgCl2、60mM
β−メルカプトエタノール及び500mM NaClを含む100mM
Tris−HCl(pH8.0)]の10μlを加え、更に全体が100
μlとなるように蒸留水を加えた。
固定化プローブ核酸を試験管に入れ、これに10×アニリ
ーング溶液[1×アニリーング溶液:60mM MgCl2、60mM
β−メルカプトエタノール及び500mM NaClを含む100mM
Tris−HCl(pH8.0)]の10μlを加え、更に全体が100
μlとなるように蒸留水を加えた。
得られた混合溶液を65℃に10分間にわたって加温して
から、その温度を室温まで約1時間かけて徐々に下げ
た。
から、その温度を室温まで約1時間かけて徐々に下げ
た。
次に、得られた反応液に、10×アニリーング溶液10μ
l、1mM dATP 10μl、1mM dCTP 10μl及び1mM dGTP 1
0μlを加えた後、p32−TTP100 Ciを添加し、全量を蒸
留水によって200μlとして標識化用の溶液を調製し
た。
l、1mM dATP 10μl、1mM dCTP 10μl及び1mM dGTP 1
0μlを加えた後、p32−TTP100 Ciを添加し、全量を蒸
留水によって200μlとして標識化用の溶液を調製し
た。
この標識化用溶液に、クレノー断片(TOYOBO社製)の
5単位を加え、氷冷下で1時間反応させた。
5単位を加え、氷冷下で1時間反応させた。
反応終了後、反応液中から固体相を分離し、これをTE
緩衝液で2度洗浄し、シンチレーションカウンターによ
ってその放射線の計量を行なった。
緩衝液で2度洗浄し、シンチレーションカウンターによ
ってその放射線の計量を行なった。
その結果、試料Bを用いた操作及び試料Cを用いた操
作で最終的に得られた固体相において108cpm程度(試料
Aを用いた場合の約104倍)の放射線が計数され、これ
ら試料B及びC中にpUC19が存在することが確認され
た。
作で最終的に得られた固体相において108cpm程度(試料
Aを用いた場合の約104倍)の放射線が計数され、これ
ら試料B及びC中にpUC19が存在することが確認され
た。
実施例2 DNA合成機(ABI社、381A型)によりプラスミドpUC19
の一部を構成する以下のDNA塩基配列を有する41merオリ
ゴヌクレオチド(プローブA)と、プラスミドpBR322の
一部を構成する以下のDNA塩基配列を有する41merオリゴ
ヌクレオチド(プローブB)を合成した。
の一部を構成する以下のDNA塩基配列を有する41merオリ
ゴヌクレオチド(プローブA)と、プラスミドpBR322の
一部を構成する以下のDNA塩基配列を有する41merオリゴ
ヌクレオチド(プローブB)を合成した。
これらの合成物の純度を、実施例1と同様の操作で調
べたところ、いずれも95%以上の純度を有していた。こ
れらの合成物は精製せずに以下の操作に直接用いた。
べたところ、いずれも95%以上の純度を有していた。こ
れらの合成物は精製せずに以下の操作に直接用いた。
これらの合成物のそれぞれの200ng/μl濃度のスポッ
ト用溶液を調製し、その2μlずつをニトロセルロース
フィルター(シュライヒャー&シャネル)にプローブA
とBのスポットが第1図に示すように配列されるように
スポットし、乾燥させた後、80℃、2時間の焼付けを行
なった。
ト用溶液を調製し、その2μlずつをニトロセルロース
フィルター(シュライヒャー&シャネル)にプローブA
とBのスポットが第1図に示すように配列されるように
スポットし、乾燥させた後、80℃、2時間の焼付けを行
なった。
一方、試料核酸として以下のものを用意した。
試料D; プラスミドpUC19と大腸菌JM109株から常法により調製
した染色体プラスミドの混合物(混合重量比、1:1) 試料E; プラスミドpBR322と大腸菌HB101株から常法により調
製した染色体プラスミドの混合物(混合重量比、1:1) 試料F: 大腸菌HB101株から常法により調製した染色体プラス
ミド 試料D〜Fを個々に用いて以下の操作を行なった。
した染色体プラスミドの混合物(混合重量比、1:1) 試料E; プラスミドpBR322と大腸菌HB101株から常法により調
製した染色体プラスミドの混合物(混合重量比、1:1) 試料F: 大腸菌HB101株から常法により調製した染色体プラス
ミド 試料D〜Fを個々に用いて以下の操作を行なった。
試料1μgを含む溶液2μlに、10×TA緩衝液2.0μ
l及び水16.0μlを混合し、得られた混合液に10単位の
Hind III(TOYOBO製)を加え、37℃で2時間放置して、
反応させた。
l及び水16.0μlを混合し、得られた混合液に10単位の
Hind III(TOYOBO製)を加え、37℃で2時間放置して、
反応させた。
反応終了後、反応液を、95℃、5分間加熱して、二本
鎖DNAを一本鎖化した後、100%ホルムアミド9ml、20×S
SC 5ml、50×Denhardt溶液0.4ml、1Mリン酸ナトリウム
(pH6.5)0.4ml及び50.5mg/ml濃度の変性サケ***DNA
(Sigmer社製)0.1mlと混合し、ハイブリダイゼーショ
ン用の溶液とした。
鎖DNAを一本鎖化した後、100%ホルムアミド9ml、20×S
SC 5ml、50×Denhardt溶液0.4ml、1Mリン酸ナトリウム
(pH6.5)0.4ml及び50.5mg/ml濃度の変性サケ***DNA
(Sigmer社製)0.1mlと混合し、ハイブリダイゼーショ
ン用の溶液とした。
以上の操作によって、各試料からの3種のハイブリダ
イゼーション用溶液が得られた。
イゼーション用溶液が得られた。
次に、各ハイブリダイゼーション用溶液に先に用意し
たプローブ核酸を固定したフィルターをそれぞれ浸漬
し、ハイブリダイゼーションを行なった。
たプローブ核酸を固定したフィルターをそれぞれ浸漬
し、ハイブリダイゼーションを行なった。
具体的には、フィルターを、最終濃度が3×SSC/及び
1×Denhardtとなる溶液の200mlに42℃で30分間浸漬し
てプレハイブリダイゼーションを行なった後、ポリエチ
レン製の袋内にフィルターがハイブリダイゼーション用
溶液に浸漬されるようにこれらを入れて密封し、これら
を42℃で12時間反応させた。
1×Denhardtとなる溶液の200mlに42℃で30分間浸漬し
てプレハイブリダイゼーションを行なった後、ポリエチ
レン製の袋内にフィルターがハイブリダイゼーション用
溶液に浸漬されるようにこれらを入れて密封し、これら
を42℃で12時間反応させた。
反応終了後、ポリエチレン製袋から取り出したフィル
ターを2×SSC/0.1% SDS 500mlに浸たし、室温で25分
間洗浄し、続いて0.2×SSC/0.1% SDS 500mlで同様に室
温で35分間洗浄した。
ターを2×SSC/0.1% SDS 500mlに浸たし、室温で25分
間洗浄し、続いて0.2×SSC/0.1% SDS 500mlで同様に室
温で35分間洗浄した。
次に、洗浄後の各フィルターを以下の組成の標識化用
の溶液に浸漬した状態で、ポリエチレン製袋内に密封
し、37℃、2時間放置して反応させた。
の溶液に浸漬した状態で、ポリエチレン製袋内に密封
し、37℃、2時間放置して反応させた。
標識化用溶液組成; 1mM dATP 20μl 1mM dGTP 20μl 1mM dCTP 20μl 0.4mMビオチン化UTP 50μl 10×アニーリング溶液 100μl クレノー断片 10μl 蒸留水 残部 計 2ml 反応終了後、取り出した各フィルターをTE緩衝液で洗
浄してから、常法(Bioindustry,Vol.3,No.6,1989,p479
−504等参照)に従って、呈色反応を行なった。
浄してから、常法(Bioindustry,Vol.3,No.6,1989,p479
−504等参照)に従って、呈色反応を行なった。
その結果、試料Dからのハイブリダイゼーション溶液
と反応させたフィルターではプローブAのスポット部分
が発色し、また試料Eからのハイブリダイゼーショ溶液
と反応させたフィルターではプローブBのスポット部分
が発色した。これに対し、試料Fからのハイブリダイゼ
ーション溶液と反応させたフィルターではスポット部分
における発色は認められなかった。
と反応させたフィルターではプローブAのスポット部分
が発色し、また試料Eからのハイブリダイゼーショ溶液
と反応させたフィルターではプローブBのスポット部分
が発色した。これに対し、試料Fからのハイブリダイゼ
ーション溶液と反応させたフィルターではスポット部分
における発色は認められなかった。
実施例3 フェニルアラニン尿症患者の白血球DNAに見られるPAH
遺伝子の変異のなかで頻度の高い変異(*部)として以
下のものが知られている。
遺伝子の変異のなかで頻度の高い変異(*部)として以
下のものが知られている。
そこで、これら4種のオリゴヌクレオチドをプローブ
核酸として利用するためにDNA合成機(ABI社、381A型)
で合成した。
核酸として利用するためにDNA合成機(ABI社、381A型)
で合成した。
なお、得られた合成物の純度を実施例1と同様の操作
で調べたところ、いずれも95%以上の純度を有してい
た。
で調べたところ、いずれも95%以上の純度を有してい
た。
これらの合成物を直接用い、実施例2と同様の操作に
より、ニトロセルロースフィルターに各プローブのスポ
ットを第2図に示す配置で形成した。
より、ニトロセルロースフィルターに各プローブのスポ
ットを第2図に示す配置で形成した。
次に、任意に選択した検体提供者からの培養羊水細胞
から、常法に従って、2本鎖DNAを抽出し、Pvu IIで消
化した後、100℃、10分間の加熱処理により2本鎖DNAを
1本鎖化した。
から、常法に従って、2本鎖DNAを抽出し、Pvu IIで消
化した後、100℃、10分間の加熱処理により2本鎖DNAを
1本鎖化した。
容器内に、各プローブのスポットを形成したフィルタ
ーと、10×アニーリング溶液0.5mlを入れ、更に蒸留水
を加えて全体の容量を5mlとし、溶液にフィルターが浸
漬されるようにした。
ーと、10×アニーリング溶液0.5mlを入れ、更に蒸留水
を加えて全体の容量を5mlとし、溶液にフィルターが浸
漬されるようにした。
これに、先に得た検体としての1本鎖DNA断片混合物
を加え、65℃、10分間放置した。
を加え、65℃、10分間放置した。
所定時間経過後、約1時間かけて反応液を徐々に室温
まで放冷した。
まで放冷した。
なお、この反応によってハイブリッドが形成された場
合、第3図に示すようなプローブと検体DNAとの部分的
二本鎖が形成されていると考えられる。
合、第3図に示すようなプローブと検体DNAとの部分的
二本鎖が形成されていると考えられる。
次に、室温まで放冷された反応液に、1mM dATP 0.2m
l、1mM dGTP 0.2ml、1mM dCTP 0.2ml、0.4mMビオチン化
UTP 0.5ml、10×アニーリング溶液0.5ml及び蒸留水3.4m
lを加えた後、更にクレーノ断片16単位を加え、37℃で
1時間反応させた。
l、1mM dGTP 0.2ml、1mM dCTP 0.2ml、0.4mMビオチン化
UTP 0.5ml、10×アニーリング溶液0.5ml及び蒸留水3.4m
lを加えた後、更にクレーノ断片16単位を加え、37℃で
1時間反応させた。
この反応で、第3図に示すような二本鎖部分を有する
ハイブリッドが形成されている場合には、その二本鎖部
分のプライマーとして機能する片方の鎖の3′末端から
DNAが合成され、末端が3′末端下流へ向けて(矢印方
向に)進展する。その際に、新しく形成される片側のヌ
クレオチド鎖内に標識が取り込まれることになる。
ハイブリッドが形成されている場合には、その二本鎖部
分のプライマーとして機能する片方の鎖の3′末端から
DNAが合成され、末端が3′末端下流へ向けて(矢印方
向に)進展する。その際に、新しく形成される片側のヌ
クレオチド鎖内に標識が取り込まれることになる。
次に、未反応のビオチン化UTPを除去するために、フ
ィルターを2×SSCで洗浄した。
ィルターを2×SSCで洗浄した。
洗浄後のフィルターを常法に従った発色反応にかけた
ところ、プローブ2のスポットが発色したので、この検
体提供者はフェニルアラニン尿症の疑いがあると判定さ
れた。
ところ、プローブ2のスポットが発色したので、この検
体提供者はフェニルアラニン尿症の疑いがあると判定さ
れた。
実施例4 任意に選択した数人の検体提供者からの培養羊水細胞
を個々に用い、常法に従って、2本鎖DNAを抽出し、Pvu
IIで消化した後、100℃、10分間の加熱処理により2本
鎖DNAを1本鎖化し、各検体提供者からの一本鎖DNA混合
物を得た。
を個々に用い、常法に従って、2本鎖DNAを抽出し、Pvu
IIで消化した後、100℃、10分間の加熱処理により2本
鎖DNAを1本鎖化し、各検体提供者からの一本鎖DNA混合
物を得た。
次に、実施例2と同様にして、各DNA混合物(各2μ
g)をニトロセルロースフィルターに、どのスポットが
どの検体提供者からのものであるかがわかるようにスポ
ットした。
g)をニトロセルロースフィルターに、どのスポットが
どの検体提供者からのものであるかがわかるようにスポ
ットした。
更に、容器内に、各検体DNA混合物のスポットを形成
したフィルターと、10×アニーリング溶液0.5mlを入
れ、更に蒸留水を加えて全体の容量を5mlとし、溶液に
フィルターが浸漬されるようにした。
したフィルターと、10×アニーリング溶液0.5mlを入
れ、更に蒸留水を加えて全体の容量を5mlとし、溶液に
フィルターが浸漬されるようにした。
これに、実施例3で得たプローブ1の1μgを添加
し、65℃で、10分間放置した。
し、65℃で、10分間放置した。
所定時間経過後、約1時間かけて反応液を徐々に室温
まで放冷してから、実施例3と同様の標識化、洗浄、呈
色のための処理を行なった。
まで放冷してから、実施例3と同様の標識化、洗浄、呈
色のための処理を行なった。
更に以上の操作をプローブ2〜4のそれぞれについて
行なった。
行なった。
その結果、プローブ2を用いた場合にフィルター上の
5番目のスポットが呈色し、このスポットの検体の提供
者はフェニルアラニン尿症の疑いがあると判定された。
5番目のスポットが呈色し、このスポットの検体の提供
者はフェニルアラニン尿症の疑いがあると判定された。
実施例5 実施例3で合成したプローブ1〜4(各約1μgず
つ)をどのウエルにどのプローブが含まれるかがわかる
ようにマイクロプレートに適用した。
つ)をどのウエルにどのプローブが含まれるかがわかる
ようにマイクロプレートに適用した。
次に、任意に選択した検体提供者からの培養羊水細胞
から、常法に従って、2本鎖DNAを抽出し、Pvu II(TOY
OBO社製)で消化した後、100℃、10分間の加熱処理によ
り2本鎖DNAを1本鎖化して、検体1本鎖DNAを含む混合
物を得た。
から、常法に従って、2本鎖DNAを抽出し、Pvu II(TOY
OBO社製)で消化した後、100℃、10分間の加熱処理によ
り2本鎖DNAを1本鎖化して、検体1本鎖DNAを含む混合
物を得た。
このDNA混合物を、各ウエルに50ngずつ投入した。
更に、各ウエルに、10×アニーリング溶液7μlを加
えてから、各ウエル内の溶液量が70μlとなるように蒸
留水を加えた。
えてから、各ウエル内の溶液量が70μlとなるように蒸
留水を加えた。
この状態のマイクロプレートを65℃で10分間放置して
から、約1時間かけて徐々に室温まで放冷した。
から、約1時間かけて徐々に室温まで放冷した。
次に、各ウエルに、1mM dATP 5μl、1mM dGTP 5μ
l、1mM dCTP 5μl、0.4mMビオチン化UTP 8μl、10×
アニーリング溶液7μl及び蒸留水40μlを加えて混合
した後、更にクレーノ断片10単位を加え、37℃で1時間
反応させ、標識化を行なった。
l、1mM dCTP 5μl、0.4mMビオチン化UTP 8μl、10×
アニーリング溶液7μl及び蒸留水40μlを加えて混合
した後、更にクレーノ断片10単位を加え、37℃で1時間
反応させ、標識化を行なった。
反応終了後、エタノール350μlを各ウエルに加え、
−70℃で1時間冷却した後、各ウエル内から上清を吸引
廃棄し、上清とともに未反応のビオチン化UTPを除去し
た。
−70℃で1時間冷却した後、各ウエル内から上清を吸引
廃棄し、上清とともに未反応のビオチン化UTPを除去し
た。
次に、マイクロプレートを乾燥させた後、ウシ血清ア
ルブミン(Sigmer社製)によって常法によりブロッキン
グを行なってから、ストレプトアビジン−アルカリホス
ファターゼ溶液(BRL社製)を各ウエルに加え、37℃で
反応させた。
ルブミン(Sigmer社製)によって常法によりブロッキン
グを行なってから、ストレプトアビジン−アルカリホス
ファターゼ溶液(BRL社製)を各ウエルに加え、37℃で
反応させた。
30分間経過したところで、液体を各ウエルから吸引廃
棄し、更に0.1M Tris−HCl(PH9.5)−0.1M NaCl−50mM
MgCl2溶液(緩衝液A)で洗浄した後、BCIP溶液(BRL
社製)30μl、NBT溶液(BRL社製)44μl及び緩衝液A1
0mlの混合溶液を各ウエルに200μl加え、室温で30分間
の反応を行なわせてから、プレートリーダーによって発
色を判定した。
棄し、更に0.1M Tris−HCl(PH9.5)−0.1M NaCl−50mM
MgCl2溶液(緩衝液A)で洗浄した後、BCIP溶液(BRL
社製)30μl、NBT溶液(BRL社製)44μl及び緩衝液A1
0mlの混合溶液を各ウエルに200μl加え、室温で30分間
の反応を行なわせてから、プレートリーダーによって発
色を判定した。
その結果、プローブ2のウエルに強い発色が認めら
れ、この検体提供者はフェニルアラニン尿症の疑いがあ
ると判定された。
れ、この検体提供者はフェニルアラニン尿症の疑いがあ
ると判定された。
実施例6 DNA合成機(ABI社、381A型)によりプラスミドpUC19
の一部を構成する以下のDNA塩基配列を有する41merオリ
ゴヌクレオチドを合成した。
の一部を構成する以下のDNA塩基配列を有する41merオリ
ゴヌクレオチドを合成した。
合成物の一部を用い、7M尿素を含む15%ポリアクリル
アミドゲル電気泳動によりその純度を調べたところ、90
%以上の純度を有していると判定されたので、この合成
物は精製せずに以下の操作のプローブ核酸として用い
た。
アミドゲル電気泳動によりその純度を調べたところ、90
%以上の純度を有していると判定されたので、この合成
物は精製せずに以下の操作のプローブ核酸として用い
た。
一方、試料核酸として、プラスミドpBR322(試料
A)、プラスミドpUC19(試料B)及びプラスミドpBR32
2とプラスミドpUC19の混合物(試料C、混合重量比1:
1)を用意し、これらの試料を常法によってEcoR I(TOY
OBO製)で消化してから、得られた消化物を加熱処理し
て、二本鎖DNAを1本鎖化し、各試料から得られた3種
の一本鎖DNAを含む反応生成物を個々に用いて以下の操
作を行なった。
A)、プラスミドpUC19(試料B)及びプラスミドpBR32
2とプラスミドpUC19の混合物(試料C、混合重量比1:
1)を用意し、これらの試料を常法によってEcoR I(TOY
OBO製)で消化してから、得られた消化物を加熱処理し
て、二本鎖DNAを1本鎖化し、各試料から得られた3種
の一本鎖DNAを含む反応生成物を個々に用いて以下の操
作を行なった。
一本鎖DNAを含む反応生成物20μgと、先に調製した
プローブ核酸20μlを反応チューブに入れ、これに10×
アニリーング溶液[1×アニリーング溶液:60mM MgC
l2、60mM β−メルカプトエタノール及び500mM NaClを
含む100mM Tris−HCl(pH8.0)]の10μlを加え、更に
全体が100μlとなるように蒸留水を加えた。
プローブ核酸20μlを反応チューブに入れ、これに10×
アニリーング溶液[1×アニリーング溶液:60mM MgC
l2、60mM β−メルカプトエタノール及び500mM NaClを
含む100mM Tris−HCl(pH8.0)]の10μlを加え、更に
全体が100μlとなるように蒸留水を加えた。
得られた混合溶液を65℃に10分間にわたって加温して
から、その温度を室温まで約1時間かけて徐々に下げ
た。
から、その温度を室温まで約1時間かけて徐々に下げ
た。
次に、得られた反応液に、10×アニリーング溶液10μ
l、1mM dATP 10μl、1mM dCTP 10μl及び1mM dGTP 1
0μlを加えた後、p32−TTP100Ciを添加し、全量を蒸留
水によって200μlとして標識化用の溶液を調製した。
l、1mM dATP 10μl、1mM dCTP 10μl及び1mM dGTP 1
0μlを加えた後、p32−TTP100Ciを添加し、全量を蒸留
水によって200μlとして標識化用の溶液を調製した。
この標識化用溶液に、クレノー断片(TOYOBO社製)の
5単位を加え、氷冷下で1時間反応させた。
5単位を加え、氷冷下で1時間反応させた。
反応終了後、GENECLEANTM(BIO101社)を用い、反応
液中の未反応のp32−TTPと形成されたハイブリッドを以
下のようにして分離した。
液中の未反応のp32−TTPと形成されたハイブリッドを以
下のようにして分離した。
GENECLEANのシリカマトリックス(5μl)を反応液2
00μlに加え、よく撹拌し、氷中に10分間保持した後、
5秒間遠心し、上清を除去して、シリカマトリックス/
ハイブリッド結合物のペレットを得た。
00μlに加え、よく撹拌し、氷中に10分間保持した後、
5秒間遠心し、上清を除去して、シリカマトリックス/
ハイブリッド結合物のペレットを得た。
その際、未反応のp32−TTPは、上清と共にシリカマト
リックスに結合しているハイブリッドから分離された。
リックスに結合しているハイブリッドから分離された。
GENECLEANの分離液で得られたペレットを3回洗浄
し、これに3μlの純水を加え、50℃、2分間のインキ
ュベートを行ない、ペレットからハイブリッドを溶離さ
せ、ハイブリッドを含む上清を遠心により回収した。
し、これに3μlの純水を加え、50℃、2分間のインキ
ュベートを行ない、ペレットからハイブリッドを溶離さ
せ、ハイブリッドを含む上清を遠心により回収した。
回収した上清をシンチレーションカウンターにかけ、
その放射線の計量を行なった。
その放射線の計量を行なった。
その結果、試料Bを用いた操作及び試料Cを用いた操
作で最終的に得られた溶液では107cpm程度(試料Aを用
いた場合の約103倍)の放射線が計数され、これら試料
B及びC中にpUC19が存在することが確認された。
作で最終的に得られた溶液では107cpm程度(試料Aを用
いた場合の約103倍)の放射線が計数され、これら試料
B及びC中にpUC19が存在することが確認された。
実施例7 以下のPUC19の一部を構成するオリゴヌクレオチドを
合成し、そのままプローブとして用いた。
合成し、そのままプローブとして用いた。
このプローブ(以下プローブAという)をI群;NO.1
〜NO.10の計10個、並びにII群;NO.1〜NO.10の計10個の
マイクロプレートウエルにそれぞれ1μgづつ導入し
た。
〜NO.10の計10個、並びにII群;NO.1〜NO.10の計10個の
マイクロプレートウエルにそれぞれ1μgづつ導入し
た。
次に試料pUC19を一本鎖に解離したものを下記表1の
割合でI群;NO.1〜NO.10のマイクロプレートウエルにそ
れぞれ投入し、またコントロールとしてpBR322を一本鎖
に解離したものを下記表1の割合でII群;NO.1〜NO.10の
マイクロプレートウエルにそれぞれ投入した(第4図
(A)参照)。
割合でI群;NO.1〜NO.10のマイクロプレートウエルにそ
れぞれ投入し、またコントロールとしてpBR322を一本鎖
に解離したものを下記表1の割合でII群;NO.1〜NO.10の
マイクロプレートウエルにそれぞれ投入した(第4図
(A)参照)。
更に、各ウエルに、10×アニーリング溶液7μlを加
えてから、各ウエル内の溶液量が70μlとなるように蒸
溜水を加えた。
えてから、各ウエル内の溶液量が70μlとなるように蒸
溜水を加えた。
この状態のマイクロプレートを65℃で10分間放置して
から、約1時間かけて徐々に室温まで放冷した。
から、約1時間かけて徐々に室温まで放冷した。
次に、各ウェルに、1mM dATP 5μl、1mM dGTP 5μ
l、1mM dCTP 5μl、0.5mMビオチン化UTP 8μl、10×
アニリーング溶液7μl及び蒸留水40μlを加えて混合
した後、更にクレノー断片10単位を加え、37℃で1時間
反応させ、標識化を行なった。
l、1mM dCTP 5μl、0.5mMビオチン化UTP 8μl、10×
アニリーング溶液7μl及び蒸留水40μlを加えて混合
した後、更にクレノー断片10単位を加え、37℃で1時間
反応させ、標識化を行なった。
反応終了後、エタノール350μlを各ウエルに加え、
−70℃で一時間冷却した後、各ウエル内から上清を吸引
廃棄し、上清とともに未反応のビオチン化UTPを除去し
た。
−70℃で一時間冷却した後、各ウエル内から上清を吸引
廃棄し、上清とともに未反応のビオチン化UTPを除去し
た。
次に、マイクロプレートを乾燥させた後、ウシ血清ア
ルブミン(Sigmer社製)によって常法によりブロッキン
グを行なってから、ストレプトアビジン−アルカリホス
ファターゼ溶液(BRL社製)を各ウエルに加え、37℃で
反応させた。
ルブミン(Sigmer社製)によって常法によりブロッキン
グを行なってから、ストレプトアビジン−アルカリホス
ファターゼ溶液(BRL社製)を各ウエルに加え、37℃で
反応させた。
30分間経過したところで、液体を各ウエルから吸引廃
棄し、更に0.1M Tris−HCl(pH9.5)−0.1M NaCl−50mM
MgCl2溶液(緩衛液A)で洗浄した後、BCIP溶液(BRL
社製)30μl、NBT溶液(BRL社製)44μl及び緩衛液A1
0mlの混合溶液を各ウエルに200μl加え、室温で30分間
の反応を行なわせてから、プレートリーダーによって発
色を判定した。
棄し、更に0.1M Tris−HCl(pH9.5)−0.1M NaCl−50mM
MgCl2溶液(緩衛液A)で洗浄した後、BCIP溶液(BRL
社製)30μl、NBT溶液(BRL社製)44μl及び緩衛液A1
0mlの混合溶液を各ウエルに200μl加え、室温で30分間
の反応を行なわせてから、プレートリーダーによって発
色を判定した。
その結果、Iの群ではNO.7の0.1ngまで発色した。II
の群のコントロールは発色をみなかった。
の群のコントロールは発色をみなかった。
比較例1 以下に示すpUC19の一部を構成する2本鎖DNAを合成
し、その3′末端にビチオン化dUTPをT4ファージ由来ポ
リメラーゼで導入し、標識化したものを一本鎖に解離し
プローブとして用いて従来法による検出を行なった。
し、その3′末端にビチオン化dUTPをT4ファージ由来ポ
リメラーゼで導入し、標識化したものを一本鎖に解離し
プローブとして用いて従来法による検出を行なった。
このプローブ(以下プローブBという)をIII群;NO.1
〜NO.10の計10個、並びにIV群;NO.1〜NO.10の計10個の
マイクロプレートウエルにそれぞれ1μgづつ導入し
た。
〜NO.10の計10個、並びにIV群;NO.1〜NO.10の計10個の
マイクロプレートウエルにそれぞれ1μgづつ導入し
た。
次に試料pUC19を一本鎖に解離したものを上記実施例
7の表1と同様の割合でIII群;NO.1〜NO.10のマイクロ
プレートウエルにそれぞれ投入し、またコントロールと
して試料pBR322を一本鎖に解離したものを上記実施例7
の表1と同様の割合でIV群;NO.1〜NO.10のマイクロプレ
ートウエルにそれぞれ投入した(第4図(B)参照)。
7の表1と同様の割合でIII群;NO.1〜NO.10のマイクロ
プレートウエルにそれぞれ投入し、またコントロールと
して試料pBR322を一本鎖に解離したものを上記実施例7
の表1と同様の割合でIV群;NO.1〜NO.10のマイクロプレ
ートウエルにそれぞれ投入した(第4図(B)参照)。
更に、各ウエルに、10×アニーリング溶液7μlを加
えてから、各ウエル内の溶液量が70μlとなるように蒸
溜水を加えた。
えてから、各ウエル内の溶液量が70μlとなるように蒸
溜水を加えた。
この状態のマイクロプレートを65℃で10分間放置して
から、約1時間かけて徐々に室温まで放冷した。
から、約1時間かけて徐々に室温まで放冷した。
反応終了後、エタノール350μlを各ウエルに加え、
−70℃で一時間冷却した後、各ウエル内から上清を吸引
廃棄し、上清とともに未反応のプローブを除去した。
−70℃で一時間冷却した後、各ウエル内から上清を吸引
廃棄し、上清とともに未反応のプローブを除去した。
次に、マイクロプレートを乾燥させた後、ウシ血清ア
ルブミン(Sigmer社製)によって常法によりブロッキン
グを行なってから、ストレプトアビジン−アルカリホス
スファターゼ溶液(BRL社製)を各ウエルに加え、37℃
で反応させた。
ルブミン(Sigmer社製)によって常法によりブロッキン
グを行なってから、ストレプトアビジン−アルカリホス
スファターゼ溶液(BRL社製)を各ウエルに加え、37℃
で反応させた。
30分間経過したところで、液体を各ウエルから吸引廃
棄し、更に0.1M Tris−HCl(pH9.5)−0.1M NaCl−50mM
MgCl2溶液(緩衝液A)で洗浄した後、BCIP溶液(BRL
社製)30μl、NBT溶液(BRL社製)44μl及び緩衛液A1
0mlの混合溶液を各ウエルに200μl加え、室温で30分間
の反応を行なわせてから、プレートリーダーによって発
色を判定した。
棄し、更に0.1M Tris−HCl(pH9.5)−0.1M NaCl−50mM
MgCl2溶液(緩衝液A)で洗浄した後、BCIP溶液(BRL
社製)30μl、NBT溶液(BRL社製)44μl及び緩衛液A1
0mlの混合溶液を各ウエルに200μl加え、室温で30分間
の反応を行なわせてから、プレートリーダーによって発
色を判定した。
その結果、IIIの群では5ngまで発色した。IVの群のコ
ントロールは発色をみなかった。
ントロールは発色をみなかった。
実施例7及び比較例1より本発明の方法によれば従来
例より50倍程度検出感度がよくなることが確認できた。
これはアニール後の伸展反応でビオチン化dUTPを50倍程
度多くとりこむためと考えられる。
例より50倍程度検出感度がよくなることが確認できた。
これはアニール後の伸展反応でビオチン化dUTPを50倍程
度多くとりこむためと考えられる。
[発明の効果] 本発明においては、標識化したプローブ核酸を用いな
いので、プローブ核酸に標識化のための要件が要求され
ない。その結果、入手が容易であり、かつ高感度な検出
が期待できるヌクレオチド鎖長の短いものをプローブ核
酸として利用でき、簡便な操作で感度の良い検出が行な
える。
いので、プローブ核酸に標識化のための要件が要求され
ない。その結果、入手が容易であり、かつ高感度な検出
が期待できるヌクレオチド鎖長の短いものをプローブ核
酸として利用でき、簡便な操作で感度の良い検出が行な
える。
また、本発明においては、形成されたハイブリットに
標識が施されるので、非放射性標識を用いた場合でも効
率良い標識化が可能となり、標識化及び検出操作がより
安全で簡便なものとなる。
標識が施されるので、非放射性標識を用いた場合でも効
率良い標識化が可能となり、標識化及び検出操作がより
安全で簡便なものとなる。
しかも、プローブ核酸に標識化を施する従来の方法で
は、全ての、すなわちハイブリッドの形成に関与しない
プローブ核酸にも標識が施されているのに対して、本発
明の方法では、形成されたハイブリッドだけが標識化さ
れるので、標識物質の節約ができる。
は、全ての、すなわちハイブリッドの形成に関与しない
プローブ核酸にも標識が施されているのに対して、本発
明の方法では、形成されたハイブリッドだけが標識化さ
れるので、標識物質の節約ができる。
更に、複数種のプローブ核酸を用いて同時に複数の核
酸の検出を行なう場合、プローブ核酸を核酸を標識化す
る従来の方法では、複数のプローブ核酸の差別化を複数
の異なる標識を用いることで行なうという煩雑な操作が
必要とされたが、本発明によれば形成されたハイブリッ
ドの標識化を1種の標識で行なえば良く、標識化操作が
簡易化され、複数の核酸の検出を極めて簡便に効率良く
行なうことができる。
酸の検出を行なう場合、プローブ核酸を核酸を標識化す
る従来の方法では、複数のプローブ核酸の差別化を複数
の異なる標識を用いることで行なうという煩雑な操作が
必要とされたが、本発明によれば形成されたハイブリッ
ドの標識化を1種の標識で行なえば良く、標識化操作が
簡易化され、複数の核酸の検出を極めて簡便に効率良く
行なうことができる。
第1図は実施例2におけるプローブ核酸のスポットの配
列を示す図、第2図は実施例3におけるプローブ核酸の
スポットの配列を示す図、第3図は被検出核酸・プロー
ブ核酸ハイブリットの構成を模式的に示した図、第4図
は(A)、(B)は実施例7及び比較例1を説明するた
めの図である。
列を示す図、第2図は実施例3におけるプローブ核酸の
スポットの配列を示す図、第3図は被検出核酸・プロー
ブ核酸ハイブリットの構成を模式的に示した図、第4図
は(A)、(B)は実施例7及び比較例1を説明するた
めの図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 桜永 昌徳 東京都大田区下丸子3丁目30番2号 キ ヤノン株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12Q 1/68
Claims (12)
- 【請求項1】検体試料中の特定の塩基配列を有する核酸
の検出方法であって、 a)該特定の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有す
るプローブ核酸を用意する工程; b)該検体試料中の核酸を一本鎖化した試料核酸と該プ
ローブ核酸とを反応させてハイブリッドを形成させる工
程; c)標識化されたヌクレオチドの存在下で該ハイブリッ
ドに伸展反応を施して該ハイブリッド末端の伸展部分に
標識物質を取り込ませることによって該ハイブリッドの
みを標識化する工程;及び d)該標識化されたハイブリッドをそこに取り込まれた
標識を利用して検出する工程 を含むことを特徴とする核酸の検出方法。 - 【請求項2】該プローブ核酸又は試料核酸が担体に固定
化されている請求項1に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項3】該プローブ核酸のヌクレオチド鎖長が、該
試料核酸のヌクレオチド鎖長の1/10以下である請求項1
に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項4】互いに異なる塩基配列を有する複数のプロ
ーブ核酸を所定の配置で担体上に固定化せしめ、各々の
プローブ核酸に対して試料核酸を接触させる請求項1に
記載の核酸の検出方法。 - 【請求項5】互いに異なる塩基配列を有する複数のプロ
ーブ核酸を所定の配置で担体上に固定化せしめ、各々の
プローブ核酸に対して1種の試料核酸を接触させる請求
項1に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項6】複数の試料核酸を所定の配置で担体上に固
定化せしめ、各々の試料核酸に対してプローブ核酸を接
触させる請求項1に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項7】複数の試料核酸を所定の配置で担体上に固
定化せしめ、各々の試料核酸に対して1種のプローブ核
酸を接触させる請求項1に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項8】該特定の塩基配列が遺伝子病に特有な塩基
配列である請求項1に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項9】該プローブ核酸のヌクレオチド鎖長が100
塩基以下である請求項8に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項10】該プローブ核酸のヌクレオチド鎖長が25
塩基以下である請求項9に記載の核酸の検出方法。 - 【請求項11】各々のプローブ核酸が、該試料核酸との
ハイブリッド形成反応が同一条件下で進行するのに必要
な構成を有する請求項4または5に記載の核酸の検出方
法。 - 【請求項12】各々のプローブ核酸が、該試料核酸とハ
イブリッドを形成したときのハイブリッドの解離温度が
互いに揃うような構成を有する請求項11に記載の核酸の
検出方法。
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ES90111773T ES2059894T3 (es) | 1989-06-23 | 1990-06-21 | Metodo para la deteccion de acido nucleico. |
DK90111773.9T DK0408918T3 (da) | 1989-06-23 | 1990-06-21 | Fremgangsmåde til detektion af nucleinsyrer |
DE90111773T DE69004632T2 (de) | 1989-06-23 | 1990-06-21 | Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren. |
EP90111773A EP0408918B1 (en) | 1989-06-23 | 1990-06-21 | Method for detecting nucleic acid |
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JP15971889 | 1989-06-23 | ||
JP1303182A JP2802125B2 (ja) | 1989-06-23 | 1989-11-24 | 核酸の検出方法 |
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---|---|
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---|---|
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SG63589A1 (en) * | 1993-05-14 | 1999-03-30 | Johnson & Johnson Clin Diag | Diagnostic compositions elements methods and test kits for amplification and detection of two or more dna's using primers having matched melting temperatures |
US7803529B1 (en) | 1995-04-11 | 2010-09-28 | Sequenom, Inc. | Solid phase sequencing of biopolymers |
JP2000513202A (ja) * | 1995-09-15 | 2000-10-10 | ジェンザイム・コーポレーション | 核酸の塩基配列決定または遺伝的置換の大量スクリーニング法 |
NO972006D0 (no) | 1997-04-30 | 1997-04-30 | Forskningsparken I Aas As | Ny metode for diagnose av sykdommer |
US6566101B1 (en) | 1997-06-16 | 2003-05-20 | Anthony P. Shuber | Primer extension methods for detecting nucleic acids |
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ATE537270T1 (de) | 1997-10-30 | 2011-12-15 | Cold Spring Harbor Lab | Sondenanordnungen und deren verwendungen für verfahren zur dns-unterscheidung |
EP1121469A2 (de) * | 1998-10-12 | 2001-08-08 | Attomol GmbH Molekulare Diagnostika | Verfahren und kit zum direkten nachweis von nukleotidsequenzen, aminosäuresequenzen oder antigenen |
US6280947B1 (en) | 1999-08-11 | 2001-08-28 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting nucleotide insertion or deletion using primer extension |
US6503718B2 (en) | 1999-01-10 | 2003-01-07 | Exact Sciences Corporation | Methods for detecting mutations using primer extension for detecting disease |
JP2002537856A (ja) * | 1999-03-05 | 2002-11-12 | トランジェーヌ | ヌクレオチド断片、プローブ、プライマー、試薬、及びpBR322の複製起点由来のヌクレオチド配列を検出する方法 |
WO2001083822A2 (en) * | 2000-05-01 | 2001-11-08 | Cold Spring Harbor Laboratory | Use of representations of dna for genetic analysis |
US6428964B1 (en) | 2001-03-15 | 2002-08-06 | Exact Sciences Corporation | Method for alteration detection |
US7196183B2 (en) | 2001-08-31 | 2007-03-27 | Innogenetics N.V. | Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent |
AU2003213107A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-09-09 | Exact Sciences Corporation | Methods for analysis of molecular events |
AU2004280531B2 (en) | 2003-05-23 | 2010-03-25 | Cold Spring Harbor Laboratory | Counting exact word matches in genomes |
ES2596753T3 (es) | 2003-08-29 | 2017-01-11 | Fujirebio Europe N.V. | Nuevo clado del virus de la hepatitis C y secuencias prototipo del mismo |
GB0412301D0 (en) | 2004-06-02 | 2004-07-07 | Diagenic As | Product and method |
US7981607B2 (en) | 2004-08-27 | 2011-07-19 | Esoterix Genetic Laboratories LLC | Method for detecting recombinant event |
US9109256B2 (en) | 2004-10-27 | 2015-08-18 | Esoterix Genetic Laboratories, Llc | Method for monitoring disease progression or recurrence |
WO2007044071A2 (en) | 2005-04-21 | 2007-04-19 | Exact Sciences Corporation | Analysis of heterogeneous nucleic acid samples |
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IL73577A (en) * | 1983-12-12 | 1989-10-31 | Miles Lab | Method and reagent system for detecting dna or rna sequences in a test medium containing single stranded dna or rna using antibodies to intercalation complexes with double stranded nucleic acid |
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