JP4403268B2 - リン酸カルシウム多孔質焼結体の製造方法及びそれを用いた人工骨の製造方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、リン酸カルシウム多孔質セラミックスに関し、本発明によって得られるリン酸カルシウム質多孔質セラミックスは生体適合性が要求される、生体組織代替材料、組織工学スキャホールド、ＤＤＳ用薬剤担持媒体として利用される。
背景技術
従来のリン酸ンカルシウム多孔質セラミックスは、樹脂又は有機物とリン酸カルシウム質原料粉体を混合、成形、焼成し樹脂又は有機物がぬけた部分を気孔とする多孔体（特公Ｈ２−５４３０３、Ｈ７−８８１７５、Ｈ８−４８５８３他多数）、発泡剤を加えたスラリー、又は発泡状態のスラリーを型に流し込んで乾燥、焼結し、発泡を気孔とした多孔体（特開平Ｈ５−２７０９４５）、発泡剤を加えたスラリーにさらに熱収縮性樹脂を添加して乾燥、焼結し、発泡を気孔とした多孔体（特開２００１−２０６７８７）、リン酸カルシウム緻密質粒を成形型に充填し、メタリン酸塩、有機質バインダー及び溶剤を混合した泥しょうを添加して焼結し、溶剤と有機質バインダーの除去により気孔を作成した多孔体（特許第３０９６９３０号）、針状リン酸カルシウム、リン酸カルシウム水和凝結体、球状リン酸カルシウム等を焼結し、粒子間隙を気孔とした多孔体（特開平Ｈ１０−２５９０１２、Ｈ９−３０９７７５、Ｈ６−６３１１９、Ｈ１１−３２２４５８）、穿孔されたグリーンシートを積層、焼結することで作製する多孔体（特開平Ｈ１１−１７８９１３）、高電圧パルスにより焼結することで作製する多孔体（特開平Ｈ１１−３５３７９）、ヌードル状押し出し成形体を集結して焼結することで製造したアパタイト多孔体（特開平Ｈ１０−２４５２７８）、動物の海綿骨組織を焼結することで製造したリン酸カルシウム多孔体（特開２０００−２１１９７８）、珊瑚をリン酸とともに水熱処理し、珊瑚骨格組織を残したまま多孔体化したリン酸カルシウム（Ｒｏｙ ＤＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２４７：２２０−２２２（１９７４））、ポリエステル繊維を含むスラリーを焼結して製造したリン酸カルシウム多孔体（Ｃｈａｎｇ ＢＳ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２１：１２９１−１２９８（２０００））、スラリーの段階的乾燥により一定方向に気孔を連通させ、焼結した多孔体（Ｈ７−２３９９４）さらに、焼結体ではないが、リン酸カルシウム粒子を高分子物質によって結合又は接着し、粒子間の空隙または新たに機械的に穿孔した穴を、気孔とした多孔体がある（特開平Ｈ８−２７６００３、Ｈ１１−２９０４４７）。
発明の開示
上記で述べたリン酸カルシウム多孔体製造方法のうち、動物の海綿骨組織または珊瑚の骨格を利用した生物由来多孔体以外の合成多孔体には共通の問題点がある。すなわち、今までの人工合成リン酸カルシウム多孔体においては、強度を維持したまま、多孔体を貫通する直径７０μｍ以上の気孔比率を高くすることができないという問題点があった。すなわち、多孔体を貫通する直径７０μｍ以上、特に直径１００μｍ以上の大気孔のみからなり、気孔率が５０％以上で、なおかつ実用上十分な強度を有する人工合成リン酸カルシウム多孔体はこれまで無かった。多孔体を貫通する気孔径が７０μｍ以下の場合、気孔が袋小路状で多孔体を貫通してない場合、及び気孔が閉気孔である場合は、多孔体を骨組織等の生体組織中に埋入しても、多孔体内への血管の侵入と貫通が制限され、多孔体内への養分補給と酸素補給が制限される結果、骨等の組織侵入が不充分となり、骨等の組織はわずかに多孔体周辺部でのみ結合する結果になる。さらに、多孔体内に逃げ場を失った空気が残存することも、細胞、組織、血管の侵入を妨げる原因となっている。
また、このような袋小路状の非貫通気孔や閉気孔がある多孔体を細胞培養担体に使用した場合、袋小路状の気孔と閉気孔内に逃げ場を失った空気が充満して、多孔体が培養液上に浮遊して沈降しない、あるいは袋小路状気孔や閉気孔内に細胞培養液と細胞が浸透しないという現象が生じる。その結果、細胞をリン酸カルシウム多孔体内で体外培養し、その後細胞を多孔体と共に生体内に戻して、組織修復や臓器再生をはかる組織工学又は再生医工学への応用が制限されてしまっている。
人工合成多孔体の強度が低い理由はおおむね以下の２点による。第一点は、多孔体の多くが圧縮プレス成型でなく、粉体スラリーを乾燥させる手法で成型されるため、粉末粒子同士の密着が不充分となり、焼結後の粒子密着が悪くて強度が高まらない。第二点目に、多孔体の気孔の大きさと配列が無秩序であるため、圧縮負荷を加えると気孔の壁もしくは多孔組織を形成する梁の必ず何処かに、せん断力が働き、せん断で梁や壁が破壊するためである。
これに対して、袋小路状の気孔や閉気孔が無く、貫通する直径７０μｍ以上の気孔のみからできていて、液体中での空気の排出が速やかで、生体内で十分な血管の侵入と貫通を生じ、組織工学又は再生医工学へも応用可能な多孔体は、実用上、生物由来リン酸カルシウム多孔体にほぼ限定される。さらに、生物由来リン酸カルシウム多孔体は、骨や珊瑚を原料にしているわけだが、これらの生体組織の多孔構造は、元々、圧縮荷重をせん断ではなく、全て座屈でのみ受けるように気孔の大きさや梁の配置が秩序をもっている。そのために、生物由来リン酸カルシウム多孔体は、事実上多孔体を貫通する直径７０μｍ以上の気孔のみからできているにもかかわらず、強度が高い。このように生物由来リン酸カルシウム多孔体は、優れた点が多いものの、欠点は化学組成と相組成を人工多孔体ほど自由に選択できず、生体内での吸収性や組織再生促進性を制御できないことである。
本発明では、生物由来リン酸カルシウム多孔体と同等かそれ以上の強度を有し、液体中での空気の排出、血管の侵入と貫通、あるいは細胞の浸透のために、気孔が多孔体を貫通する７０μｍ以上の気孔、好ましくは１００μｍ以上の大気孔から成り、なおかつ十分な気孔率を有し、化学組成をＣａ／Ｐモル比０．７５から２．１まで自由に変更でき、骨形成促進や吸収性発揮に重要な元素を添加でき、相組成も比較的変更容易な、高強度リン酸カルシウム多孔体が提供される。
本発明において、人工的につくられた立体的な貫通孔とは、長柱体をオス型に使用してひとつひとつ作製した貫通孔で、さらに貫通方向が２方向以上の方向性を有するものであり、さらに貫通の始点と終点位置が意図的に設計されたもので、さらに焼結体を完全に貫通するものであり、さらに各々の貫通孔の間隔と配置が人為的に設計された貫通孔のことである。
本発明においては、人工的に立体的な貫通孔を作製するために断面寸法９０μｍ以上５．０ｍｍ以下、好ましく１００μｍ以上３．０ｍｍ以下、長さが断面図寸法の３倍以上、好ましく１０倍以上の多数の長柱体を気孔のオス型として使用する。長柱体状オス型の材質は、金属、木材、竹その他植物材料、木材、炭素材料、ハロゲンを含まない弾性率１０ＧＰａ以上のポリマー具体的にはポリエチレン、ナイロン、ポリアセタール、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエステル、ＡＢＳ、ポリスチレン、フェノール、尿素樹脂、エポキシ樹脂、アクリライト、好ましくはハロゲンを含まない１０ＧＰａ以上の熱硬化性ポリマー具体的にはポリエステル、フェノール樹脂、尿素樹脂、エポキシ樹脂から選ばれる１種又は複数種の固体である。これらの固体を使用する理由は、その高弾性率にある。すなわち、本発明では成形時に長柱体オス型が圧力５ＭＰａ以上５００ＭＰａ以下、好ましくは１０ＭＰａ以上２００ＭＰａで加圧されるため、長柱体オス型の弾性率が１０ＧＰａ以下の場合には、長柱体自身が０．０５％以上の変形を生じ、加圧時の気孔閉鎖や、加圧後の長柱体の復形による成形体破壊が生じるからである。ハロゲンを含むポリマーの場合は、ハロゲンがリン酸カルシウムと反応して、生体適合性の低い塩素アパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６Ｃｌ_２）やフッ素アパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６Ｆ_２）が、焼結時に生成するからである。さらに、ポリマーが熱硬化性ポリマーであるほうが、ポリマーの溶融による粉体やバインダーとの反応が避けられて焼成中の気孔閉鎖が少ない。
貫通孔を作成するための長柱体が加圧成型後の成型体に占める体積分率は２０％以上９０％以下とし、好ましくは３０％以上８０％以下とする。加圧後の成型体に占める長柱体体積分率が２０％より低い場合は、十分な量の細胞や血管を気孔内に導入することができず、実用上の価値が非常に少ない。長柱体体積分率が９０％より高い場合は多孔体の強度が著しく低下して実用に適さない。
長柱体の断面形状には特に制限はないが、少なくとも１組の平行な辺をもつ多角形、楕円、円、または少なくとも１組の平行な辺と曲線からなる図形であれば、加圧成形や長柱体の引き抜きに有利である。長柱体の伸長方向の形状は屈曲のない直線状または一平面内でのみ屈曲した曲線状又は折れ線状である必要がある。二平面以上の面内で屈曲している場合は、加圧成形の際に長柱体状オス型の変形を生じ、長柱体オス型の破壊、加圧後の長柱体の復形による成形体破壊等が生じて、加圧成形に支障がある。
長柱体状オス型の断面寸法は、最終的に必要とされる気孔の大きさによって決まる。人工骨または組織工学用リン酸カルシウム多孔体にあっては、最小でも、焼結後に大きさ３０μｍの血管内皮細胞や骨芽細胞が同時に複数個侵入できるための気孔が必要である。焼結により１０〜２０％の気孔径収縮が生じるため、焼結後の気孔径を７０μｍ以上にするためには、長柱体状オス型の断面寸法は９０μｍ以上であることが必要になる。また、人工骨または組織工学用リン酸カルシウム多孔体にあっては直径４ｍｍ以上の血管を侵入させる必要性は特になく、焼結による１０〜２０％の気孔径収縮を考慮しても、長柱体状オス型の断面寸法は５．０ｍｍ以上ある必要はない。以上の理由により、長柱体状オス型の断面寸法の大きさは９０μｍ以上５．０ｍｍ以下となる。長柱体状オス型の長さは、断面図寸法の３倍以上、好ましくは１０倍以上が望ましい。長柱体状オス型の長さが断面寸法の３倍以下では、全ての長柱体が粉末を貫通するように添加した場合は、出来上がる多孔体の最大寸法が１０ｍｍ程度に制限されてしまうため、人工骨や組織工学に利用する際の実用上の価値が非常に少ない。
多孔体の強度を向上させるためこれらの長柱体オス型をまず配列して粉末を添加し、配列面を加圧圧縮する。配列の方向性は、長柱体状オス型が相互に重ならなければ、等間隔平行、異間隔平行の他、非平行でも良い。複数の長柱体状オス型を周囲から１点に向けて集中するように配列した放射状、複数点に向けて集中するように配列した複放射状、さらには樹脂状とすることもできる。但し、放射状、複放射状、樹脂状とするときは、長柱体の端面が他の長柱体と接触する部分の接着を、勘合、接着等で完全接触させる必要がある。接触が不完全であるとこの部分が焼結後袋小路気孔になってしまう。加圧成形時の圧力は５ＭＰａ以上５００ＭＰａ以下、好ましくは１０ＭＰａ以上２００ＭＰａである。加圧成形時の圧力をこの範囲とするのは、圧力５ＭＰａ以下では、粉体粒子の密着が不充分となり、十分強度のある多孔体が作製できず、加圧が５００ＭＰａ以上では、長柱体状オス型の変形や破壊が起こりやすいためである。さらに、加圧が５００ＭＰａ以上の場合には、積層工程終了後に長柱体状オス型を引き抜く場合に、長柱体状オス型が、加圧成形物から抜けなかったり、長柱体状オス型が粉体との間の摩擦で摩耗されることがあり、金属製長柱体状オス型を使用した場合に問題となる。
本発明において、リン酸カルシウム前駆体とは、焼結後にリン酸カルシウム焼結体となるリン酸カルシウム及び、これに炭酸、珪素、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガンの少なくとも１種類を含んだものをいう。
本発明において、元素や炭酸が固溶したリン酸カルシウムとは、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガンの金属元素の固溶であればリン酸カルシウムのカルシウムを当該金属元素が不純物として一部置換したリン酸カルシウム、珪素であればリン酸カルシウムのリンを不純物として一部置換したリン酸カルシウム、炭酸の場合はリン酸カルシウムのリン酸基を不純物として一部置換したリン酸カルシウムのことである。珪素や炭酸が固溶する場合は置換される原子またはイオン団との間で電荷の不一致があるため、これを補うための他元素の２次的固溶や、構造中に原子が存在しない空孔サイトが生成したりする。例えば、炭酸が水酸アパタイトＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２に固溶する場合、（Ｎａ^＋，ＣＯ_３ ^２−）と（Ｃａ^２＋、ＰＯ_４ ^３−）の同時置換、や（Ｈ^＋，ＣＯ_３ ^２−）と（Ｃａ^２＋、ＰＯ_４ ^３−）の同時置換で炭酸が固溶する。各元素やイオン団には固溶限界があり、固溶限界以上に珪素、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガンをリン酸カルシウムに含有させようとすると、これらの元素を固溶したリン酸カルシウムの他に、これらの元素の酸化物やリン酸塩が生成して、これら元素の酸化物やリン酸塩を含む組成物となる。固溶限界は、例えば低温型Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２であれば、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガンはいずれも全カルシウムの約１２ｍｏｌ％である。
リン酸カルシウム前駆体粉末としては全体としてＣａ／Ｐモル比が０．７５以上２．１以下、好ましくは１．１以上１．９以下のものを使用することができる。Ｃａ／Ｐモル比１．５以下の範囲にあっても、炭酸、珪素、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガンから選ばれた不純物を含むリン酸カルシウム前駆体、例えばマグネシウムを含有するリン酸カルシウム前駆体であれば、焼結後にマグネシウム固溶リン酸三カルシウムとリン酸三マグネシウムの混合物とすることができ、生体適合性の低いピロリン酸カルシウムの生成を防ぐことができる。しかし、Ｃａ／Ｐモル比０．７５以下では、炭酸、珪素、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガンから選ばれた不純物を添加した場合は、ピロリン酸カルシウムの生成を防ぐことができても、これら不純物成分の含有モル数のほうがカルシウムの含有モル数より多い結果となり、リン酸カルシウム質焼結体でなくなる。従って、リン酸カルシウム前駆体粉末のＣａ／Ｐモル比の下限は０．７５とした。Ｃａ／Ｐモル比が２．１以上では毒性限界以上の酸化カルシウム生成を伴い、焼結後の多孔体の生体適合性が損なわれるため、リン酸カルシウム前駆体粉末のＣａ／Ｐモル比の上限は２．１とした。リン酸カルシウム前駆体粉末の粒子径には特に制限はないが、約０．１μｍから１００μｍであることが望ましい。
炭酸、珪素、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガンを含まないリン酸カルシウム前駆体のＣａ／Ｐモル比は１．５以上２．０以下であることが望ましい。このようなリン酸カルシウム前駆体としては、具体的には単独でもＣａ／Ｐモル比が１．５以上２．０以下である水酸アパタイト、リン酸三カルシウム、リン酸４カルシウム、非晶質リン酸カルシウム、及びこれらの混合物のほか、これらの単独粉末又は混合物にＣａ／Ｐモル比が１．５以下または２．０以上の粉末、具体的には、リン酸水素カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、金属カルシウム、酸化カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、クエン酸カルシウム、硝酸カルシウム、カルシウムアルコキサイド等のカルシウム塩が混合されたものでもよいし、リン酸アンモニウム、リン酸等が混合されたものでもよい。これらの化合物は、化学量論組成のものであってもよいし、非化学量論組成のものでもよい。
炭酸を含むリン酸カルシウム前駆体としては、具体的には炭酸を固溶した水酸アパタイト、炭酸を固溶した非晶質リン酸カルシウム、及びこれらの混合物、さらに炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウムを添加したリン酸カルシウム前駆体を挙げることができる。
珪酸を含むリン酸カルシウム前駆体としては、具体的には珪酸を固溶した水酸アパタイト、珪酸を固溶した非晶質リン酸カルシウム、珪酸を固溶したリン酸三カルシウム、及びこれらの混合物のほか、ケイ酸カルシウム又は珪酸を添加したリン酸カルシウム前駆体を挙げることができる。
マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガンを含むリン酸カルシウム前駆体としては、これらの金属イオンを固溶した水酸アパタイト、非晶質リン酸カルシウム、リン酸４カルシウム、リン酸三カルシウムのほか、これら金属及び金属酸化物、水酸化物、リン酸塩、硝酸塩、炭酸塩を添加したリン酸カルシウム前駆体を挙げることができる。金属の塩化物、弗化物、硫酸塩は焼結時に生体適合性の低い塩素、フッ素、硫酸基が残存する結果となるため、使用できない。
また、本発明において、バインダーとは、リン酸カルシウム前駆体を成型して焼結するまでうまくゆくように添加する無機若しくは有機の接着作用をする物質を言う。具体的には、ポリビニルアルコールやカルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
また、本発明において、溶剤とはリン酸カルシウム前駆体を成型するさいに前駆体の流動性や粘着性を向上させるために添加する物質をいう。具体的には水やアルコールやその他の揮発性有機溶剤などが挙げられる。
添加するリン酸カルシウム前駆体粉末の量は、経験的に（長柱体間隙の体積）×（リン酸カルシウム理論密度）で計算されるリン酸カルシウム粉末量の１０３％以上１１４％未満、好ましくは１０４％以上１０６．５％以下となるように正確に秤量する必要がある。１０３％以下では粉体を加圧することが困難である。粉末量が１１４％以上だと長柱体柱面が粉末に完全に埋没し、以下に説明する積層過程で、隣接層の長柱体と接触しなくなる。この場合は、粉体を加圧後、粉体と長柱体の高さが同じになるまで余分な粉体を除去する。
好ましい範囲１０４％以上１０６．５％以下に粉末を添加した場合は、長柱体面が一部露出する結果となり、積層過程で配向面と垂直方向に気孔を連続させることができる。ただし、好ましい範囲１０４％以上１０６．５％以下の粉末添加量であっても、粉体と長柱体の高さが同じになるまで余分な粉体を除去する工程を行った方が、より多くの気孔を配向面と垂直方向に連続させることが出来る。
リン酸カルシウム前駆体粉末に添加するバインダーは、通常のリン酸カルシウム加圧成形に用いられるのと同様に、２重量％以上〜１０重量％以下、好ましくは２重量％以上５重量％以下のポリビニルアルコールでよい。１０重量％ポリビニルアルコール添加では、焼結後の多孔体の壁や梁が多孔質となり、強度の向上が不十分であり、２重量％ポリビニルアルコール添加では、粉体粒子同士の粘着が弱く、加圧成形できない。溶剤は５重量％以上５２重量％以下、好ましくは１０重量％以上４５重量％以下で添加することが望ましい。溶剤の添加により、粉体の流動性が向上して加圧時に長柱体上オス型の間隙に隙間なく粉体を充てんできる。溶剤を添加した場合には、焼結工程の前に溶剤を蒸発させるための乾燥工程を行う。溶剤の添加量を５％以上５２％以下とした理由は、５％以下では実際上乾燥粉末とおなじであり、溶剤添加の効果がなく、５２％以上の場合は焼結後の多孔体の壁や梁が多孔質となり、強度向上が不十分となるからである。
リン酸カルシウム前駆体またはこれにバインダーを含む組成物、場合によってはさらに溶剤を含む組成物を用いて作製された単層加圧成形物を複数積層させる。積層は複数の単層をあらかじめ作製しておき、１回で全てを積層させてもよいし、単層を加圧成形後に、その単層上で別の単層を成形して積層させてもよい。積層工程では、ある層の長柱体状オス型が上下に隣接する長柱体状オス型と複数の接点を持つようにし、なおかつ、隣りあう層中で、長柱体状オス型の方向が異なるようにする。こうすることで、長柱体状オス型の接点が積層方向への連続気孔となる。加圧成形時の圧力は、単層成形工程と同様、圧力５ＭＰａ以上５００ＭＰａ以下、好ましくは１０ＭＰａ以上２００ＭＰａである。
リン酸カルシウム前駆体には、骨形成やその他の生体機能を強化するために、亜鉛，マグネシウム、鉄、マンガン、珪素のなかから選ばれた１種または複数の生体必須元素を添加することができる。亜鉛、鉄、マンガン、珪素の焼結後の含有量は、骨の亜鉛，鉄、マンガン、珪素含有濃度の１倍以上１００倍までの範囲とする。骨の亜鉛，鉄、マンガン、ケイ素含有濃度は亜鉛：０．０１２重量％〜０．０２１７重量％、鉄：０．０１４重量％〜０．０２重量％、マンガン：１ｐｐｍ〜４ｐｐｍ、珪素：０．０１０５重量％である。生体必須元素含有量が骨の含有量の１倍以下では、これら元素特有の生体機能促進作用を骨中で発揮することは出来ない。また、１００倍以上の含有量では、骨組織中で使用する人工骨においても、細胞培養液中で使用する組織工学スキャフォールドにおいても、これらの元素が過剰となり毒性を発現する。２５倍以上１００倍以下の含有量の場合は、骨組織中では毒性を発現するものの、細胞培養液中では毒性を発現せず、組織工学スキャフォールドとして使用できる。マグネシウムの焼結後の含有量は、骨のマグネシウム含有濃度の１倍以上５０倍までの範囲とする。骨のマグネシウム含有濃度は０．２６重量％〜０．５５重量％である。マグネシウム含有量が骨の含有量の１倍以下では、マグネシウムの生体機能促進作用を骨中で発揮することは出来ない。マグネシウム含有量の上限だけ他の生体必須元素と違って骨の含有濃度の５０倍までとした理由は、マグネシウムの骨含有量が他の生体必須元素よりけた違いに多いため、５０倍以上の含有量では焼結後のカルシウムモル数よりマグネシウムモル数のほうが多くなり、リン酸カルシウムが主成分とならないからである。
これらの生体必須元素は、リン酸カルシウム前駆体粉末を構成するリン酸カルシウム結晶に固溶させておいてもよいし、無機塩、金属、酸化物、水酸化物、有機金属化合物として混合させておいてもよい。無機塩、金属、酸化物、水酸化物、有機金属化合物をあらかじめ混合させておく場合は、焼結時にこれら元素はリン酸カルシウムと反応して固溶する。混合元素量が固溶限界以上の場合は、焼結後当該元素固溶リン酸カルシウムの他に当該金属酸化物またはリン酸塩が生成する。無機塩として混合させる場合は、焼結時に陰イオン団が揮発する、炭酸塩や硝酸塩が好ましい。
焼結後の多孔質リン酸カルシウムが生体内で時間の経過と共に、溶解・吸収により消滅するのを促進するよう、リン酸カルシウム前駆体粉末には炭酸を含有させておくこともできる。焼結後の炭酸含有量は、ＣＯ_３ ^２−の形で０．３重量％〜１５重量％の範囲とする。炭酸含有量０．３重量％は空気中で析出する骨類似アパタイトの炭酸含有量に相当し、この程度あるいはこれ以下の炭酸量では、析出の傾向が強くてむしろ溶解・吸収がされにくい。炭酸含有量１５重量％以上では、リン酸カルシウム相を安定に保つことが困難である。炭酸塩の多くは高温で分解して炭酸が散逸するため、リン酸カルシウム前駆体に炭酸を含有させるためには、水酸アパタイトＣａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２のＣａサイとＰＯ_４サイトをＮａとＣＯ_３で同時置換した炭酸アパタイトを用いるか、または炭酸ナトリウムを添加物として加えることが好ましい。
単層形成工程、積層工程を経て作成された加圧成形体中の長柱体状オス型は、積層工程後、金属の場合は、必ず引き抜いて除去する。その他の竹、木材、炭素材料、ポリマーからなる長柱体状オス型の場合は積層工程後に引き抜いても良いが、そのまま粉体中に包埋させたままでも焼成時に消失する。
粉体に水分を添加して、加圧成形した場合は積層工程終了後に室温にて、重量変化がなくなるまで乾燥させる。乾燥温度に特に指定はないが、室温もしくはそれ以下の温度のほうが好ましい。５０℃以上ではバインダーにポリビニルアルコールを使用した場合は、ポリビニルアルコールに変質が生じ、その結果、焼結しても焼結密度が上がらず、積層界面で剥離する場合が多い。乾燥温度が４０℃以上の場合も、ときおり積層界面での剥離が生じることがある。
加圧成形体の焼結工程は、通常の電気炉を用い大気雰囲気下で、５００℃以上１５００℃以下、好ましくは７００℃以上１４００℃以下で行う。５００℃以下では焼結は起こらず、１５００℃以上では多くのリン酸カルシウムが分解する。最適焼結温度は、焼結させるリン酸カルシウム粉末の化学組成によって異なる。例をあげれば、炭酸を３〜１５重量％含有する水酸アパタイトの最適焼結温度は６００℃以上８００℃以下である。水酸アパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２：Ｃａ／Ｐモル比＝１．６７）の最適焼結温度は９００℃以上１２００℃以下である。ケイ素を含む水酸アパタイトの最適焼結温度は９００℃以上１２００℃以下である。低温型リン酸三カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２：Ｃａ／Ｐモル比＝１．５０）の最適焼結温度は、９００℃以上１１００℃以下である。高温型リン酸三カルシウムの最適焼結温度は１２００℃以上１５００℃以下である。亜鉛、マンガン、マグネシウムを含有する低温型リン酸三カルシウムの最適焼結温度は９００℃以上１２００℃以下である。亜鉛、マンガン、マグネシウムを含有する高温型リン酸三カルシウムの最適焼結温度は１３００℃以上１５００℃以下である。
焼結工程終了後、密度を測定して気孔率を求めることができる。気孔の連通状態は、顕微鏡、実体鏡、電子顕微鏡、染色液浸透によって評価することができる。多孔体の圧縮強度をインストロン型の万能試験機を用いて評価することができる。
発明を実施するための最良の形態
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
〔実施例１〕
３％ポリビニルアルコールを添加した、粒径７５μｍアンダーの水酸アパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２：Ｃａ／Ｐモル比１．６７）粉末、０．１７５ｇを秤量し、超純水６５マイクロリットル添加して錬和した。直径０．５ｍｍ長さ２８ｍｍのステンレス製長柱体状オス型１３本を０．３ｍｍ間隔に平行に配列し、この上に、これと直交する方向で同一寸法のステンレス製長柱体状オス型１４本を配列した。この長柱体状オス型配列物に上記粉末錬和物を詰め込み、３６ＭＰａで加圧した。加圧後、長柱体状オス型を被覆している粉末をプラチック製スクレーパーで取り除いた。上記操作を４回繰り返した。加圧成型後、長柱体状オス型を全部抜き取って、気孔を形成させた。これを室温で、２日間乾燥させ、１１７０℃で５時間焼結して多孔体とした。焼結後、多孔体は収縮し、直径３８０μｍの直線状貫通気孔を２００μｍ間隔に配置し、これらの気孔列を交互に直交させた多孔体を作製することができた（図１参照）。２方向の気孔の交点は直径５０〜２００μｍの気孔になっていて、長柱体状オス型をレプリカとした気孔だけでなく、長柱体状オス型の積層方向にも連続した気孔が形成されていた（図２参照）。ただし交点の一部は閉鎖していたため、積層方向の気孔は開気孔であっても全てが多孔体を貫通しているわけではない。この多孔体の気孔率は１１個の平均で６１±３％であった。この気孔率はサンゴを水熱処理して得られるアパタイト多孔体と同程度であった。ＳＥＭ観察の結果では梁部分は気孔の少ない組織であった。強度の最も低い方向である、積層と垂直な方向の圧縮強度試験を行ったところ、１０ＭＰａ以上の圧縮強度を示し、サンゴ由来アパタイト多孔体と同等以上の圧縮強度を示した。
〔実施例２〕
３％ポリビニルアルコールを添加した、粒径７５μｍアンダーの水酸アパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２：Ｃａ／Ｐモル比１．６７）粉末、０．１７５ｇを秤量し、超純水６５マイクロリットル添加して錬和した。直径０．５ｍｍ長さ３０ｍｍの竹製長柱体状オス型またはポリスチレン製長柱状オス型１３本を０．３ｍｍ間隔に平行に配列し、この上に、これと直交する方向で同一寸法の長柱体状オス型１４本を配列した。この長柱体状オス型配列物に上記粉末錬和物を詰め込み、３６ＭＰａで加圧した。加圧後、長柱体状オス型を被覆している粉末をプラチック製スクレーパーで取り除いた。上記操作を４回繰り返した。加圧成型後、２日間乾燥させ、１１７０℃で５時間焼結して多孔体とした。竹製長柱体状オス型及びポリスチレン製長柱状オス型は焼結過程で焼失した。焼結後、竹製長柱状オス型を使用した多孔体は収縮し、直径３８０μｍの直線状貫通気孔を２００μｍ間隔に配置し、これらの気孔列を交互に直交させた多孔体を作製することができた。熱可塑性であるポリスチレン製長柱状オス型から作製したものは、加圧成型時のポリスチレンの変形と、２００℃以下の加熱初期段階での複形が生じ、多孔体は部分的に崩壊した。
〔実施例３〕
Ｃａ／Ｐモル比の異なる、３％ポリビニルアルコールを添加した、粒径７５μｍアンダーの各種リン酸カルシウム前駆体粉末０．１７５ｇを秤量し、超純水４０〜６５マイクロリットル添加して錬和した。直径０．５ｍｍ長さ２８ｍｍのステンレス製長柱体状オス型１３本を０．３ｍｍ間隔に平行に配列し、この上に、これと直交する方向で同一寸法のステンレス製長柱体状オス型１４本を配列した。この長柱体状オス型配列物に上記粉末錬和物を詰め込み、３６ＭＰａで加圧した。加圧後、長柱体状オス型を被覆している粉末をプラチック製スクレーパーで取り除いた。上記操作を４回繰り返した。加圧成型後、長柱体状オス型を全部抜き取って、気孔を形成させた。これを室温で、２日間乾燥させ、１１００〜１１７０℃で５時間焼結して多孔体とした。焼結後、多孔体は収縮し、直線状貫通気孔を交互に直交させた多孔体を作製することができた。２方向の気孔の交点は直径５０〜２００μｍの気孔になっていて、長柱体状オス型をレプリカとした気孔だけでなく、長柱体状オス型の積層方向にも連続した気孔が形成されていた。ただし交点の一部は閉鎖していた。これらの結果を表１に示す。外形寸法８ｍｍ×８ｍｍ×３ｍｍの多孔体に５００マイクロリットルの染色液を浸透させると、いずれの方向でも１〜３秒以内に焼結体の反対側に染色液が浸透し、気孔が完全に貫通しているために、細胞、組織、血管の侵入を妨げる要因がほとんどないことが示された。

〔実施例４〕
生体必須元素を含有する、３％ポリビニルアルコールを添加した、粒径７５μｍアンダーの各種リン酸カルシウム前駆体粉末０．１７５ｇを秤量し、超純水６５〜８０マイクロリットル添加して錬和した。直径０．５ｍｍ長さ２８ｍｍのステンレス製長柱体状オス型１３本を０．３ｍｍ間隔に平行に配列し、この上に、これと直交する方向で同一寸法のステンレス製長柱体状オス型１４本を配列した。この長柱体状オス型配列物に上記粉末錬和物を詰め込み、３６ＭＰａで加圧した。加圧後、長柱体状オス型を被覆している粉末をプラチック製スクレーパーで取り除いた。上記操作を４回繰り返した。加圧成型後、長柱体状オス型を全部抜き取って、気孔を形成させた。これを室温で、２日間乾燥させ、１１００℃で５時間焼結して多孔体とした。焼結後、多孔体は収縮し、直線状貫通気孔を交互に直交させた多孔体を作製することができた。２方向の気孔の交点は直径５０〜２００μｍの気孔になっていて、長柱体状オス型をレプリカとした気孔だけでなく、長柱体状オス型の積層方向にも連続した気孔が形成されていた。ただし交点の一部は閉鎖していた。多孔体の色は白色であったが、鉄を含有させたものは淡褐色を呈していた。これらの結果を表２に示す。

〔実施例５〕
リン酸カルシウム前駆体として炭酸を１２．５重量％及び７．１重量％含有する、粒径７５μｍアンダーの炭酸水酸アパタイト粉末を利用した。炭酸水酸アパタイトは、リン酸イオンを含む水溶液とカルシウムイオンを含む水溶液と炭酸ナトリウムを混合して沈殿させたものである。炭酸基は水酸アパタイトのリン酸基を一部置換し、ナトリウムが水酸アパタイトのカルシウムを一部置換している。この炭酸水酸アパタイト粉末０．１７５ｇを秤量し、超純水４０マイクロリットル添加して錬和した。バインダーは添加していない。直径０．５ｍｍ長さ２８ｍｍのステンレス製長柱体状オス型１３本を０．３ｍｍ間隔に平行に配列し、この上に、これと直交する方向で同一寸法のステンレス製長柱体状オス型１４本を配列した。この長柱体状オス型配列物に上記粉末錬和物を詰め込み、３６ＭＰａで加圧した。加圧後、長柱体状オス型を被覆している粉末をプラチック製スクレーパーで取り除いた。上記操作を４回繰り返した。加圧成型後、長柱体状オス型を全部抜き取って、気孔を形成させた。これを室温で、２日間乾燥させ、６３０℃で５時間焼結して多孔体とした。焼結後の炭酸含有量は、焼結により炭酸基が一部揮発散逸するため、焼結前より約６％減少した。焼結後、多孔体は収縮し、直線状貫通気孔を交互に直交させた多孔体を作製することができた。２方向の気孔の交点は直径５０〜２００μｍの気孔になっていて、長柱体状オス型をレプリカとした気孔だけでなく、長柱体状オス型の積層方向にも連続した気孔が形成されていた。ただし交点の一部は閉鎖していた。これらの結果を表３に示す。

〔実施例６〕
実施例１で得られた直線状貫通気孔からなる水酸アパタイト多孔体、及び珊瑚由来の水酸アパタイト多孔体を１６０℃、１時間乾熱滅菌した。使用した直線状貫通気孔多孔体と珊瑚由来多孔体の気孔径、気孔率を表４に示す。両者の気孔率はほぼ同一である。７週令フィッシャー３４４系雄ラットの大腿骨の両端を切断し、細胞培養液１０ｍＬを用いて内部の骨髄細胞を洗い出した。取り出した骨髄細胞を、１５％牛胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００マイクロｇ／ｍＬ、アンホテリシンＢ０．２５マイクロｇ／ｍＬを含有したＥａｇｌｅ−ＭＥＭ培地中で９日間培養した。培用後、０．１％トリプシンで細胞を処理して、１×１０^７個／ｍＬの細胞懸濁液を作製した。この細胞懸濁液中に上述の滅菌した直線状貫通気孔多孔体と珊瑚由来多孔体を浸漬した。その後、両多孔体をフィッシャー３４４系ラットの背部皮下に移植した。４週後に多孔体を摘出し、骨芽細胞の分化マーカーで、骨芽細胞の骨形成能の指標であるアルカリ性フォスファターゼ活性を測定した。さらに、骨形成量の指標である骨グラ蛋白量を定量した。測定されたアルカリ性フォスファターゼ活性値と骨グラ蛋白量を多孔体の重量で割り算した。これらの値を本発明の直線状貫通気孔多孔体と珊瑚由来多孔体との間で比較した（ｎ＝４）。その結果を表５、６に示す。直線状貫通気孔多孔体の単位重量当りのアルカリ性フォスファターゼ活性値と珊瑚由来多孔体の単位重量当りのアルカリ性フォスファターゼ活性値との間には有意な差は認められなかった。直線状貫通気孔多孔体の単位重量当りの骨グラ蛋白量と珊瑚由来多孔体の単位重量当りの骨グラ蛋白量との間にも有意な差は認められなかった。これらのことは、本発明の直線状貫通気孔多孔体が、既に人工骨と組織工学スキャホールドに使用されている珊瑚由来多孔体と同等の生体適合性と生体活性を有し、本発明の直線状貫通気孔多孔体が、人工骨としても組織工学スキャホールドとしても使用できることを示している。摘出した直線状貫通気孔多孔体を固定、脱灰、薄切し、ヘマトキシリン−エオジン染色で多孔体内に形成された骨組織を染色し、顕微鏡観察用の脱灰組織標本とした。この標本を生物顕微鏡で観察し、多孔体内部に骨組織が形成されているかどうかどうかを検討した（図３）。その結果、炎症反応は認められず、高い生体適合性を示すことが解った。さらに、多孔体の内部を中心に旺盛な骨形成が確認され、本発明の直線状貫通気孔多孔体が、人工骨としても組織工学スキャホールドとしても使用できることが確認された。

産業上の利用可能性
以上のように本発明によるリン酸カルシウム多孔体によれば、生物由来リン酸カルシウム多孔体と同等かそれ以上の強度を有し、気孔が多孔体を貫通する７０μｍ以上の気孔から成り、なおかつこれらの気孔が三次元網目状に配置され、さらに血管の侵入と貫通、あるいは細胞の浸透のために十分なだけの気孔率を有し、化学組成をＣａ／Ｐモル比を０．７５から２．１まで自由に変更でき、骨形成促進や吸収性発揮に重要な元素を添加でき、相組成も比較的変更容易な、高強度リン酸カルシウム多孔体が提供され、人工骨として用いることが出来る。
本明細書に引用されたすべての刊行物は、その内容の全体を本明細書に取り込むものとする。また、添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。本発明はこのような変形および変更をも包含することを意図している。
【図面の簡単な説明】
図１は、焼成後の多孔質焼結体の外観を示す写真である。外形寸法は８ｍｍｘ８ｍｍｘ３ｍｍである。
図２は、焼成後の多孔質焼結体の気孔を示す電子顕微鏡写真である。
図３は、多孔体内部に形成された骨組織を示す顕微鏡写真である。

Claims (7)

1. 直線状長柱体または一平面内でのみ屈曲した曲線状又は折れ線状である長柱体を一平面内で重ならないように配列後、その上に、直線状長柱体または一平面内でのみ屈曲した曲線状又は折れ線状である長柱体を、下層の長柱体と配列方向を変えて、一平面内で重ならないように配列し、さらにこのような長柱体の配列体を積層して、長柱体の配列体の積層構造物を作製し、この長柱体の配列体の積層構造物に対して、リン酸カルシウム前駆体を含む組成物を、全ての長柱体がリン酸カルシウム前駆体を含む組成物を貫通するように配置し、一平面内の長柱体が下層及び上層の長柱体と方向を異にし、かつ接点で下層及び上層の長柱体と直接接触するよう圧力５ＭＰａ〜５００ＭＰａで加圧成型し、長柱体体積分率を加圧成型した成型体の２０％〜９０％とし、加圧成型した成型体を５００℃〜１５００℃の大気雰囲気中で焼結するリン酸カルシウム多孔質焼結体の製造方法。
2. リン酸カルシウム前駆体を含む組成物が、バインダーを含有する組成物である請求項１のリン酸カルシウム多孔質焼結体の製造方法。
3. リン酸カルシウム前駆体、バインダーを含む組成物において、リン酸カルシウムまたはバインダーのうち少なくとも一方に予め溶剤を含んでいる請求項２に記載したリン酸カルシウム多孔質焼結体の製造方法。
4. 長柱体体積分率を加圧成型した成型体の２０％〜９０％とし、成形後長柱体を１００℃以下の温度で物理的又は化学的に除去してから、５００℃〜１５００℃の大気雰囲気中で焼結する請求項１から請求項３のいずれかひとつに記載したリン酸カルシウム多孔体の製造方法。
5. 断面が円形、楕円形、多角形のいずれか一つである直線状長柱体または一平面内でのみ屈曲した曲線状又は折れ線状である長柱体が、金属、木材、竹その他植物材料、炭素材料、ハロゲンを含まない弾性率１０ＧＰａ以上のポリマーから選ばれる１種又は２種以上である請求項１から請求項４のいずれかひとつに記載したリン酸カルシウム多孔質焼結体の製造方法。
6. 直線状長柱体または一平面内でのみ屈曲した曲線状又は折れ線状である長柱体の最大径が、９０μｍ〜５．０ｍｍである請求項１から請求項５のいずれかひとつに記載したリン酸カルシウム多孔質焼結体の製造方法。
7. 請求項１から請求項６のいずれかひとつに記載されたリン酸カルシウム多孔質焼結体の製造方法を用いた人工骨の製造方法。

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