JP4372469B2

JP4372469B2 - Microarray for detecting biomaterials and method for producing the same

Info

Publication number: JP4372469B2
Application number: JP2003188041A
Authority: JP
Inventors: 厚高橋; 陽子宮内; 宙平大槻; 隆秋田
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2009-11-25
Anticipated expiration: 2023-06-30
Also published as: JP2005024322A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸等の生体関連物質を検出するために用いられる生体関連物質検出用マイクロアレイ及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、多数遺伝子の一括発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる分析法が開発されている。
【０００３】
このようなDNAマイクロアレイの例として、複数の区画を有し、各区画が中空繊維により形成されており、各区画にはキャプチャープローブがゲル状物を介して保持されている生体関連物質検出用マイクロアレイが提案されている（特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００４】
このマイクロアレイは、例えば以下の（１）〜（３）を順次行う方法により製造される。
【０００５】
（１）複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列をポリウレタン樹脂等の接着剤を用いて固定し、中空繊維束を製造する工程。
【０００６】
（２）キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する工程。
【０００７】
（３）繊維の長手方向に交叉する方向で、切断して中空繊維束を薄片化する工程。
【０００８】
この製造方法は、フォトリソグラフィー法やスポッティング法と比較して高価な製造設備を必要とせず、製造工程が簡略化できるという利点を有する。
【０００９】
また、これにより製造されたマイクロアレイは、所定長の中空繊維の中空部にキャプチャープローブがゲル状物を介して保持されているため、単にシートの表面に保持させる場合と比較すると、一区画により多くの量のキャプチャープローブを保持することができる。さらには電気泳動によるハイブリダイゼーション反応を行うことができる。
【００１０】
【特許文献１】
国際公開第００／４０９４２号
【００１１】
【特許文献２】
国際公開第０１／９８７８１号
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記のマイクロアレイは、中空繊維内壁とその中空部に形成されているゲル状物との界面に隙間を生じている場合がある。そのようなマイクロアレイを検査に使用した場合、隙間に検体が優先的に流れ、ゲル状物に保持されているキャプチャープローブの一部しか検体との反応に利用されない。
【００１３】
隙間が生じる原因として、酸素による重合阻害が考えられる。例えば、電気泳動用のポリアクリルアミドのスラブゲルを製造する際、予めゲル前駆体重合性溶液を脱気することは通常行われる操作である。
【００１４】
しかし、上述のマイクロアレイを製造する際、ゲル前駆体重合性溶液中に溶解している酸素を除去するだけでは不十分であることが分かった。
【００１５】
具体的には中空繊維に溶解している酸素や中空繊維束を製造する際に使用したポリウレタン樹脂等の包埋剤に溶解している酸素が中空繊維の中空部へ移動し、重合反応を阻害することがわかった。
【００１６】
また、通常行われている窒素置換等の脱気操作は、長時間実施する必要がある。さらに脱気のための装置も必要であるため、操作が煩雑となる。
【００１７】
また、脱気操作のみで中空繊維に溶解している酸素やポリウレタン樹脂等に溶解している酸素を完全に除去することは非常に困難であることが分かった。
【００１８】
本発明は上記の問題点を解決したマイクロアレイ及びその製造方法を提供する。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討検討した結果、中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去することにより、上記問題が解決できることを見いだし、本発明を完成させた。
【００２０】
すなわち本発明は、以下の (1) 〜 (4) の工程を順次行う工程を含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法である。
【００２１】
(1) 複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。
【００２２】
(2) 中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去する工程。
【００２３】
(3) キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する工程。
【００２４】
(4) 繊維の長手方向に交叉する方向で、切断して中空繊維束を薄片化する工程。
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明は、以下の (1) 〜 (4) の工程を順次行う工程を含む生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法である。
【００２６】
(1) 複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する工程。
【００２７】
(2) 中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去する工程。
【００２８】
(3) キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する工程。
【００２９】
(4) 繊維の長手方向に交叉する方向で、切断して中空繊維束を薄片化する工程。
【００３０】
まず、第１の工程では、複数本の中空繊維を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する。
【００３１】
中空繊維の材料としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系中空繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系中空繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系中空繊維、ポリビニルアルコール系中空繊維、ポリ塩化ビニリデン系中空繊維、ポリ塩化ビニル系中空繊維、ポリウレタン系中空繊維、フェノール系中空繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系中空繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系中空繊維等が挙げられる。
【００３２】
中空繊維の内径は任意に設定できる。好ましくは、10〜2000μmである。また中空繊維にはカーボンブラック等の黒色顔料を適量含有させたものを用いることもできる。
【００３３】
上記中空繊維の複数本を、中空繊維の各繊維軸が同一方向となるように３次元に配列し、その配列を固定して、中空繊維束を製造する。「集束」とは、複数本の中空繊維を互いに平行となるよう配置することをいう。集束体はその配置が乱れないように接着剤等で固定される。
【００３４】
中空繊維束を製造する方法としては、例えば、粘着シート等のシート状物に複数本の中空繊維を所定の間隔をもって平行に配置し、シート状とした後、このシートを螺旋状に巻き取る方法（特開平11-108928号公報参照）が挙げられる。
【００３５】
また、複数の孔が所定の間隔をもって設けられた多孔板２枚を孔部が一致するように重ねあわせ、それらの孔部に、中空繊維を通過させ、２枚の多孔板の間隔を開き、２枚の多孔板間の、中空繊維の周辺に硬化性樹脂原料を充満させ硬化させる方法（特開2001-133453号公報参照）が挙げられる。
【００３６】
接着剤としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂等を用いることができる。また、隣接する中空繊維の外表面を相互に融着することによって中空繊維の集束物を固定することもできる。
【００３７】
中空繊維束の固定は、集束した中空繊維の全長又は所定部分に対して行う。集束した中空繊維の少なくとも一方の端部から適当な長さの部分は固定しない状態とすることもできる。
【００３８】
第２の工程では、中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去する。脱酸素剤としては、食品や医薬品等の酸化を防止するために使用されている鉄系脱酸素剤、有機系脱酸素剤等が挙げられる。
【００３９】
除去は、例えば中空繊維束と脱酸素剤をガスバリア性の高いパックに封入し密閉系とすることにより行う。その際、市販の酸素インジケーターを同封することにより、パック内の酸素の有無が確認できる。酸素インジケーターとしては、タブレット状で酸素濃度によりタブレットの色が変化するものが使用される。
【００４０】
酸素除去は、酸素インジケーターが示す酸素濃度が0.5質量%以下、好ましくは0.3%以下、さらに好ましくは0.1質量%以下となるまで行う。
【００４１】
中空繊維束は、次の工程を実施する直前でパックから取り出せばよい。本方法によれば、特別な装置を必要とせず酸素除去を確実に実施することができる。さらに製造した中空繊維束をパックのまま保存することができる。
【００４２】
第３の工程では、キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を各中空繊維の中空部に導入し、重合反応を行い、キャプチャープローブが保持されたゲル状物を生成する。
【００４３】
「キャプチャープローブ」とは、核酸、アミノ酸、ペプチド、糖、脂質、抗体、さらには化学結合、物理結合などの相互作用により生体関連物質を検出しうる有機化合物、無機化合物等をいう。
【００４４】
例えば、核酸を用いる場合、生細胞からのDNAの調製は、Blinらの方法(Nucleic Acids Res.3.2303(1976))等により行うことができ、また、RNAの抽出については、Favaloroらの方法(Methods.Enzymol.65.718(1980))等により行うことができる。
【００４５】
「ゲル前駆体重合性溶液」とは、キャプチャープローブの他に前述の単量体、多官能性単量体、重合開始剤、及び水等を含むものである。
【００４６】
単量体とは、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸及びアリルデキストリン等である。
【００４７】
多官能性単量体とは、例えばメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等である。
【００４８】
ゲル前駆体重合性溶液は、真空吸引法等によって中空繊維の中空部へ導入される。例えば、まず中空繊維束とゲル前駆体重合性溶液をデシゲーター内に設置する。次いで、中空繊維束の中空繊維が固定されていない端部を、この溶液中に浸し、デシゲーター内を減圧状態し、中空繊維の中空部内にこの溶液を導入する。
【００４９】
ゲル前駆体重合性溶液は予め脱気しておくことが好ましい。
【００５０】
導入後、ゲル前駆体重合性溶液を含む中空繊維束を加熱することにより重合反応を開始する。重合温度は使用する単量体等により適宜選択される。
【００５１】
重合反応後、中空繊維の中空部にはキャプチャープローブが保持されたゲル状物が充填されている。
【００５２】
「保持」とは、上述のゲル状物にキャプチャープローブが化学的に又は物理的に固定されている状態をいう。
【００５３】
「化学的に固定する」とは、上述の単量体成分に生体関連物質を直接結合することをいう。例えば、核酸の末端にビニル基を導入し、アクリルアミド等の単量体と共重合させる方法が挙げられる（WO 98/39351号公報参照）。
【００５４】
また、「物理的に固定する」とは、ゲル状物中に生体関連物質が包括固定することをいう。例えば、ビオチン化した核酸とアビジン化したアガロースビーズ（シグマ社製アビジン化アガロース等）を反応させ、核酸が固定化されたアガロースビーズを得、この核酸固定化アガロースビーズをアクリルアミドゲル等に包括固定化する方法が挙げられる。
【００５５】
キャプチャープローブは目的に応じて必要な種類（数）が準備される。例えば、中空繊維の本数と同一の数のキャプチャープローブを準備し、各中空繊維に互いに異なる１種類のキャプチャープローブを導入することができる。また、複数本の中空繊維に同じキャプチャープローブを導入することもできる。
【００５６】
第４の工程において、重合反応終了後の中空繊維束を繊維の長手方向に交叉する方向で、通常は直交する方向で、切断して薄片化を行う。
【００５７】
中空繊維束の切断は、ミクロトーム、レーザー、等を使用することができる。得られる薄片の厚みは、5mm以下であり、好ましくは0.1mm〜1mmである。
【００５８】
得られた薄片は、核酸等の生体関連物質を検出するために用いられる生体関連物質検出用マイクロアレイとして使用される。
【００５９】
【実施例】
以下、実施例により詳細に説明する。
【００６０】
＜実施例１＞
（１）キャプチャープローブの製造
合成機DNA/RNA synthesizer (model394)（PEバイオシステムズ社製）を用いて、GCATのオリゴヌクレオチドを合成した。これらは、一般的手法によって脱保護及び精製して使用した。
【００６１】
得られたGCAT（500nmol/ml）50μl、グリシジルメタクリレート 5μl及びジメチルホルムアミド（DMF）5μlを混合し、７０℃で２時間反応させ、水190μlを加えて、100nmol/mlのメタクリレート基を有するGCAT（MA-GCAT）を得た。
（２）中空繊維束の製造
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
【００６２】
まず、直径０．３２ｍｍの孔が、孔の中心間距離を０．１２ｍｍとして、縦横各１６列で合計２５６個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板２枚を準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、ポリカーボネート中空繊維（三菱エンジニアリングプラスチック社製カーボンブラック1質量%添加）を１本づつ、通過させた。
【００６３】
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。
【００６４】
次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。
【００６５】
次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
【００６６】
（３）脱酸素処理
ガスバリア性パック（ガスバリアナイロン/PE 20X25cm）に（２）で製造した中空繊維束、脱酸素剤（三菱ガス化学社製エージレス^TM）および酸素インジケーター（三菱ガス化学社製エージレスアイ^TM）を入れた後、密閉した。約2日間でパック内の酸素濃度は0.1%以下となった。
【００６７】
（４）重合反応
次に、表１示すの質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。
【００６８】
【表１】

次に、キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を70℃とし、３時間かけて重合反応を行った。
【００６９】
このようにしてキャプチャープローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
【００７０】
（５）薄片化
（４）で得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．５ｍｍの薄片シート５０枚を得た。スライス時に中空繊維からゲル状物は脱落しなかった。
【００７１】
得られた薄片シート５０枚について、ゲル状物の形態、中空繊維内壁とゲル状物との界面を実体顕微鏡で観察した。
【００７２】
その結果、すべてのシートで、中空繊維の中空部にゲル状物が保持されており、中空繊維内壁とゲル状物との界面には隙間がないことを確認した。
【００７３】
＜比較例１＞
実施例１の（３）の操作を行わない以外は実施例１と同様に操作を行った。
【００７４】
その結果、マイクロアレイ１枚あたり、２５６スポット中６０スポットで中空繊維内壁とゲル状物との界面に隙間が観察された。
【００７５】
＜比較例２＞
実施例１の（３）の代わりに中空繊維束を窒素雰囲気下に約16時間、放置した以外は実施例１と同様に操作を行った。
【００７６】
その結果、マイクロアレイ１枚あたり、２５６スポット中９０スポットで中空繊維内壁とゲル状物との界面に隙間が観察された。
【００７７】
【発明の効果】
中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去することにより、中空繊維の中空部に保持されたゲル状物と中空繊維内壁との界面に隙間がないマイクロアレイを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】配列固定器具の概念図である。
【符号の説明】
１配列固定器具
１１孔部
２１多孔板
３１中空繊維
４１板状物[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a bioarray-detecting microarray used for detecting biorelated substances such as nucleic acids and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
In recent years, an analysis method called a DNA microarray method (DNA chip method) has been developed that enables collective expression analysis of a large number of genes.
[0003]
As an example of such a DNA microarray, a microarray for detecting a biological substance has a plurality of compartments, each compartment is formed of hollow fibers, and a capture probe is held in each compartment via a gel-like material Has been proposed (see Patent Document 1 and Patent Document 2).
[0004]
This microarray is manufactured, for example, by a method of sequentially performing the following (1) to (3).
[0005]
(1) A plurality of hollow fibers are three-dimensionally arranged so that the fiber axes of the hollow fibers are in the same direction, and the arrangement is fixed using an adhesive such as polyurethane resin to produce a hollow fiber bundle. Process.
[0006]
(2) A step of introducing a gel precursor polymerizable solution containing a capture probe into the hollow portion of each hollow fiber, performing a polymerization reaction, and generating a gel-like material holding the capture probe.
[0007]
(3) A step of cutting and thinning the hollow fiber bundle in a direction crossing the longitudinal direction of the fiber.
[0008]
This manufacturing method has the advantage that the manufacturing process can be simplified without requiring expensive manufacturing equipment as compared with the photolithography method and the spotting method.
[0009]
In addition, since the capture probe is held in the hollow portion of the hollow fiber of a predetermined length via the gel-like material, the microarray manufactured thereby has more in one section than when it is simply held on the surface of the sheet. An amount of capture probe can be retained. Furthermore, hybridization reaction by electrophoresis can be performed.
[0010]
[Patent Document 1]
International Publication No. 00/40942 [0011]
[Patent Document 2]
International Publication No. 01/98781
[Problems to be solved by the invention]
However, the microarray described above may have a gap at the interface between the hollow fiber inner wall and the gel-like material formed in the hollow portion. When such a microarray is used for inspection, the specimen flows preferentially in the gap, and only a part of the capture probe held in the gel is used for reaction with the specimen.
[0013]
As a cause of the formation of gaps, polymerization inhibition by oxygen can be considered. For example, when a polyacrylamide slab gel for electrophoresis is produced, it is a common practice to degas the gel precursor polymerizable solution in advance.
[0014]
However, it has been found that it is not sufficient to remove oxygen dissolved in the gel precursor polymerizable solution when manufacturing the microarray described above.
[0015]
Specifically, oxygen dissolved in the hollow fiber and oxygen dissolved in the embedding agent such as polyurethane resin used to manufacture the hollow fiber bundle move to the hollow part of the hollow fiber and inhibit the polymerization reaction. I found out that
[0016]
Moreover, it is necessary to perform degassing operations, such as nitrogen substitution currently performed normally, for a long time. Furthermore, since a device for deaeration is also necessary, the operation becomes complicated.
[0017]
Further, it has been found that it is very difficult to completely remove oxygen dissolved in the hollow fiber and oxygen dissolved in the polyurethane resin only by the deaeration operation.
[0018]
The present invention provides a microarray and a method for manufacturing the same, which solve the above problems.
[0019]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies and examinations in view of the above problems, the present inventors have found that the above problem can be solved by removing oxygen contained in the hollow fiber bundle with an oxygen scavenger, and have completed the present invention.
[0020]
That is, the present invention is a method for producing a microarray for detecting a substance related to a living body, which comprises the steps of sequentially performing the following steps (1) to (4).
[0021]
(1) A step of producing a hollow fiber bundle by arranging a plurality of hollow fibers in a three-dimensional manner so that the fiber axes of the hollow fibers are in the same direction, and fixing the arrangement.
[0022]
(2) A step of removing oxygen contained in the hollow fiber bundle with an oxygen scavenger.
[0023]
(3) A step of introducing a gel precursor polymerizable solution containing a capture probe into the hollow portion of each hollow fiber and performing a polymerization reaction to generate a gel-like material holding the capture probe.
[0024]
(4) A step of cutting the hollow fiber bundle into thin pieces by cutting in a direction crossing the longitudinal direction of the fibers.
[0025]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention is a method for producing a microarray for detecting a biomaterial-related substance, comprising the steps of sequentially performing the following steps (1) to (4).
[0026]
(1) A step of producing a hollow fiber bundle by arranging a plurality of hollow fibers in a three-dimensional manner so that the fiber axes of the hollow fibers are in the same direction, and fixing the arrangement.
[0027]
(2) A step of removing oxygen contained in the hollow fiber bundle with an oxygen scavenger.
[0028]
(3) A step of introducing a gel precursor polymerizable solution containing a capture probe into the hollow portion of each hollow fiber and performing a polymerization reaction to generate a gel-like material holding the capture probe.
[0029]
(4) A step of cutting the hollow fiber bundle into thin pieces by cutting in a direction crossing the longitudinal direction of the fibers.
[0030]
First, in the first step, a plurality of hollow fibers are three-dimensionally arranged so that the fiber axes of the hollow fibers are in the same direction, and the arrangement is fixed to produce a hollow fiber bundle.
[0031]
Examples of the hollow fiber material include polyamide-based hollow fibers such as nylon 6, nylon 66, and aromatic polyamide, polyester-based hollow fibers such as polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate, polylactic acid, polyglycolic acid, and polycarbonate, polyacrylonitrile, and the like. Acrylic hollow fiber, polyolefin hollow fiber such as polyethylene and polypropylene, polymethacrylate hollow fiber such as polymethyl methacrylate, polyvinyl alcohol hollow fiber, polyvinylidene chloride hollow fiber, polyvinyl chloride hollow fiber, polyurethane Examples include hollow fibers, phenolic hollow fibers, fluorine hollow fibers made of polyvinylidene fluoride and polytetrafluoroethylene, polyalkylene paraoxybenzoate hollow fibers, and the like.
[0032]
The inner diameter of the hollow fiber can be arbitrarily set. Preferably, it is 10-2000 micrometers. Moreover, what contained black pigments, such as carbon black, appropriate amount can also be used for a hollow fiber.
[0033]
A plurality of the hollow fibers are three-dimensionally arranged so that the fiber axes of the hollow fibers are in the same direction, and the arrangement is fixed to produce a hollow fiber bundle. “Focusing” means arranging a plurality of hollow fibers so as to be parallel to each other. The focusing body is fixed with an adhesive or the like so that its arrangement is not disturbed.
[0034]
As a method for producing a hollow fiber bundle, for example, a method in which a plurality of hollow fibers are arranged in parallel at a predetermined interval on a sheet-like material such as an adhesive sheet and the sheet is spirally wound. (See JP-A-11-108928).
[0035]
Further, two porous plates each having a plurality of holes provided at a predetermined interval are overlapped so that the hole portions coincide with each other, the hollow fibers are passed through the hole portions, and the interval between the two porous plates is opened. A method of filling a curable resin raw material around the hollow fiber between two perforated plates and curing it (see JP-A-2001-133453) can be mentioned.
[0036]
As the adhesive, polyurethane resin, epoxy resin, or the like can be used. Further, the bundle of hollow fibers can be fixed by fusing the outer surfaces of adjacent hollow fibers to each other.
[0037]
The hollow fiber bundle is fixed to the entire length or a predetermined portion of the collected hollow fibers. A portion having an appropriate length from at least one end of the bundled hollow fibers may be not fixed.
[0038]
In the second step, oxygen contained in the hollow fiber bundle is removed with an oxygen scavenger. Examples of the oxygen scavenger include iron-based oxygen scavengers and organic oxygen scavengers that are used to prevent oxidation of foods and pharmaceuticals.
[0039]
The removal is performed, for example, by enclosing the hollow fiber bundle and the oxygen scavenger in a pack having a high gas barrier property to form a sealed system. At that time, the presence or absence of oxygen in the pack can be confirmed by enclosing a commercially available oxygen indicator. As the oxygen indicator, a tablet in which the color of the tablet changes depending on the oxygen concentration is used.
[0040]
Oxygen removal is performed until the oxygen concentration indicated by the oxygen indicator is 0.5% by mass or less, preferably 0.3% or less, more preferably 0.1% by mass or less.
[0041]
What is necessary is just to take out a hollow fiber bundle from a pack just before implementing the next process. According to this method, oxygen removal can be reliably performed without requiring a special apparatus. Further, the produced hollow fiber bundle can be stored as a pack.
[0042]
In the third step, a gel precursor polymerizable solution containing a capture probe is introduced into the hollow portion of each hollow fiber, a polymerization reaction is performed, and a gel-like material holding the capture probe is generated.
[0043]
The “capture probe” refers to an organic compound, an inorganic compound, or the like that can detect a biological substance by an interaction such as a nucleic acid, an amino acid, a peptide, a sugar, a lipid, an antibody, or a chemical bond or a physical bond.
[0044]
For example, when nucleic acids are used, preparation of DNA from living cells can be performed by the method of Blin et al. (Nucleic Acids Res.3.2303 (1976)) and the like, and for RNA extraction, the method of Favaloro et al. Methods. Enzymol. 65.718 (1980)) and the like.
[0045]
The “gel precursor polymerizable solution” includes the above-described monomer, polyfunctional monomer, polymerization initiator, water and the like in addition to the capture probe.
[0046]
Monomers include, for example, acrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-acryloylaminoethoxyethanol, N-acryloylaminopropanol, N-methylolacrylamide, N-vinylpyrrolidone, hydroxyethyl methacrylate, (meta ) Acrylic acid and allyl dextrin.
[0047]
Examples of the polyfunctional monomer include methylene bis (meth) acrylamide, polyethylene glycol di (meth) acrylate, and the like.
[0048]
The gel precursor polymerizable solution is introduced into the hollow portion of the hollow fiber by a vacuum suction method or the like. For example, first, a hollow fiber bundle and a gel precursor polymerizable solution are placed in a desiccator. Next, the end of the hollow fiber bundle where the hollow fibers are not fixed is immersed in this solution, the inside of the desiccator is decompressed, and this solution is introduced into the hollow portion of the hollow fiber.
[0049]
It is preferable to degas the gel precursor polymerizable solution in advance.
[0050]
After the introduction, the polymerization reaction is started by heating the hollow fiber bundle containing the gel precursor polymerizable solution. The polymerization temperature is appropriately selected depending on the monomer used.
[0051]
After the polymerization reaction, the hollow portion of the hollow fiber is filled with a gel-like material holding a capture probe.
[0052]
“Holding” refers to a state in which the capture probe is chemically or physically fixed to the gel-like material described above.
[0053]
“Chemically immobilize” means that a biological substance is directly bonded to the monomer component. For example, there is a method in which a vinyl group is introduced at the end of a nucleic acid and copolymerized with a monomer such as acrylamide (see WO 98/39351).
[0054]
Further, “physically fix” means that a biological substance is comprehensively fixed in a gel. For example, a biotinylated nucleic acid and avidinized agarose beads (Sigma avidinized agarose, etc.) are reacted to obtain agarose beads on which the nucleic acid is immobilized, and the nucleic acid-immobilized agarose beads are comprehensively immobilized on an acrylamide gel or the like. The method of doing is mentioned.
[0055]
Necessary types (numbers) of capture probes are prepared according to the purpose. For example, the same number of capture probes as the number of hollow fibers can be prepared, and different types of capture probes can be introduced into each hollow fiber. Further, the same capture probe can be introduced into a plurality of hollow fibers.
[0056]
In the fourth step, the hollow fiber bundle after the completion of the polymerization reaction is cut in a direction intersecting with the longitudinal direction of the fiber, usually in a direction orthogonal thereto, and thinned.
[0057]
For cutting the hollow fiber bundle, a microtome, a laser, or the like can be used. The thickness of the obtained flake is 5 mm or less, preferably 0.1 mm to 1 mm.
[0058]
The obtained flakes are used as a bioarray-detecting microarray that is used to detect biomaterials such as nucleic acids.
[0059]
【Example】
Hereinafter, the embodiment will be described in detail.
[0060]
<Example 1>
(1) Production of capture probe GCAT oligonucleotides were synthesized using a synthesizer DNA / RNA synthesizer (model 394) (PE Biosystems). These were used after deprotection and purification by general techniques.
[0061]
The obtained GCAT (500 nmol / ml) 50 μl, glycidyl methacrylate 5 μl and dimethylformamide (DMF) 5 μl were mixed, reacted at 70 ° C. for 2 hours, 190 μl of water was added, and GCAT (MA having 100 nmol / ml methacrylate group) -GCAT).
(2) Production of Hollow Fiber Bundle A hollow fiber bundle was produced using the array fixture shown in FIG. In the figure, x, y, and z are orthogonal three-dimensional axes, and the x-axis coincides with the longitudinal direction of the fiber.
[0062]
First, two perforated plates with a thickness of 0.1 mm were prepared in which a total of 256 holes each having a diameter of 0.32 mm were provided in a total of 256 rows in 16 rows each with a distance between the centers of the holes being 0.12 mm. These perforated plates were overlapped, and polycarbonate hollow fibers (added by 1% by mass of carbon black manufactured by Mitsubishi Engineering Plastics) were passed through each of the holes one by one.
[0063]
The position of the two perforated plates was moved in a state in which a tension of 0.1 N was applied to each fiber in the X-axis direction, and the hollow fiber was fixed at two positions of 20 mm and 100 mm from one end of the hollow fiber. . That is, the interval between the two perforated plates was 80 mm.
[0064]
Next, the three surrounding surfaces of the space between the perforated plates were surrounded by a plate-like object. In this way, a container having an open top only was obtained.
[0065]
Next, the resin raw material was poured into the container from the upper part of the container. As resin, what added 2.5 mass% carbon black was used with respect to the total weight of polyurethane resin adhesives (Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd., Nippon-Poran 4276, Coronate 4403). The resin was cured by standing at 25 ° C. for 1 week. Next, the porous plate and the plate-like material were removed to obtain a hollow fiber bundle.
[0066]
(3) The hollow fiber bundle was prepared in de-oxygenated gas barrier pack (gas barrier nylon / PE 20X25cm) (2), oxygen scavenger (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Ageless ^TM) and oxygen indicator (manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd. Ageless Eye ^TM ) was added and sealed. In about 2 days, the oxygen concentration in the pack fell below 0.1%.
[0067]
(4) Polymerization reaction Next, a gel precursor polymerizable solution containing a monomer and an initiator mixed at a mass ratio shown in Table 1 was prepared.
[0068]
[Table 1]

Next, a gel precursor polymerizable solution containing a capture probe was placed in a desiccator. After reducing the pressure inside the desiccator, one end of the hollow fiber bundle where the fiber bundle was not fixed was immersed in this solution. Nitrogen gas was sealed in a desiccator, and a gel precursor polymerizable solution containing a capture probe was introduced into the hollow portion of the hollow fiber. Subsequently, the inside of a container was 70 degreeC and the polymerization reaction was performed over 3 hours.
[0069]
In this way, a hollow fiber bundle in which the capture probe was held in the hollow portion of the hollow fiber via the gel-like material was obtained.
[0070]
(5) The hollow fiber bundle obtained in the slicing (4) was sliced in a direction orthogonal to the longitudinal direction of the fiber using a microtome to obtain 50 lamella sheets having a thickness of 0.5 mm. During the slicing, the gel was not dropped from the hollow fiber.
[0071]
About 50 obtained flake sheets, the form of the gel-like material and the interface between the hollow fiber inner wall and the gel-like material were observed with a stereomicroscope.
[0072]
As a result, it was confirmed that the gel-like material was held in the hollow portion of the hollow fiber in all the sheets, and there was no gap at the interface between the inner wall of the hollow fiber and the gel-like material.
[0073]
<Comparative Example 1>
The operation was performed in the same manner as in Example 1 except that the operation (3) in Example 1 was not performed.
[0074]
As a result, a gap was observed at the interface between the inner wall of the hollow fiber and the gel material at 60 spots out of 256 spots per microarray.
[0075]
<Comparative example 2>
An operation was performed in the same manner as in Example 1 except that the hollow fiber bundle was left in a nitrogen atmosphere for about 16 hours instead of (3) in Example 1.
[0076]
As a result, a gap was observed at the interface between the hollow fiber inner wall and the gel-like material at 90 spots out of 256 spots per microarray.
[0077]
【The invention's effect】
By removing oxygen contained in the hollow fiber bundle with an oxygen scavenger, a microarray having no gap at the interface between the gel-like material held in the hollow part of the hollow fiber and the inner wall of the hollow fiber can be produced.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a conceptual diagram of an arrangement fixing device.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Array fixing tool 11 Hole 21 Perforated plate 31 Hollow fiber 41 Plate-shaped object

Claims

以下の（１）〜（４）の工程を順次行うことを含む、生体関連物質検出用マイクロアレイの製造方法。
（１）複数本の中空繊維を、それらの中空繊維の繊維軸方向が同一となるように３次元に配列し、その配列を固定し、中空繊維束を製造する工程。
（２）中空繊維束に含まれる酸素を脱酸素剤により除去する工程。
（３）中空繊維束の中空繊維の中空部に、キャプチャープローブを含むゲル状物を保持する工程。
（４）中空繊維束を、繊維の長手方向を交叉する方向で切断を繰り返す工程。A method for producing a microarray for detecting a biological substance, comprising sequentially performing the following steps (1) to (4).
(1) A step of producing a hollow fiber bundle by arranging a plurality of hollow fibers in three dimensions so that the fiber axis directions of the hollow fibers are the same, fixing the arrangement.
(2) A step of removing oxygen contained in the hollow fiber bundle with an oxygen scavenger.
(3) The process of hold | maintaining the gel-like thing containing a capture probe in the hollow part of the hollow fiber of a hollow fiber bundle.
(4) A step of repeatedly cutting the hollow fiber bundle in a direction crossing the longitudinal direction of the fibers.