JP2011133470A - Biomolecule immobilization array having biomolecule immobilization carrier consisting of hydrophilic gel - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、検出対象となる生体分子（ターゲット分子）とそれを特異的に検出するための生体分子（プローブ）を効率的に接触及び反応させることができる生体分子固定化アレイ、並びにその製造方法に関する。 The present invention relates to a biomolecule-immobilized array capable of efficiently contacting and reacting a biomolecule (target molecule) to be detected with a biomolecule (probe) for specifically detecting it, and a method for producing the same. About.
近年、ヒトを初めとする多くの生物種についてゲノムプロジェクトが進められ、各種生物において既にその塩基配列が明らかにされている。配列が明らかにされた遺伝子の機能や発現の動態については、各種の方法で調べることができ、その有力な方法の一つとしてＤＮＡマイクロアレイ法が開発されている。ＤＮＡマイクロアレイ法は、多数の遺伝子の発現解析を一括して行うことができる点で有用である。この方法は、核酸−核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出法又は定量法である点でそれまで知られていた方法と原理的には同じであるが、マイクロアレイ又はチップと呼ばれる平面基盤片上に、多数のＤＮＡ断片がプローブとして高密度に整列固定化されている点に大きな特徴がある。ＤＮＡマイクロアレイ法の具体的使用法としては、例えば、研究対象となる細胞が発現する遺伝子のＤＮＡ又はＲＮＡ（ターゲット分子）等を蛍光色素等で標識し、標識した核酸と平面基盤片上の核酸とをハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸同士が結合した箇所の蛍光を、高解像度解析装置により高速で読みとる方法が挙げられる。この方法により、検体中に存在するそれぞれのターゲット分子の量を迅速に測定できる。 In recent years, genome projects have been promoted for many biological species including humans, and the base sequences have already been clarified in various organisms. The function of genes whose expression has been clarified and the dynamics of expression can be examined by various methods, and the DNA microarray method has been developed as one of the promising methods. The DNA microarray method is useful in that expression analysis of a large number of genes can be performed at once. This method is in principle the same as a method known so far in that it is a nucleic acid detection method or a quantification method based on a nucleic acid-nucleic acid hybridization reaction, but on a planar substrate piece called a microarray or chip, A great feature is that a large number of DNA fragments are aligned and immobilized at high density as probes. As a specific method of using the DNA microarray method, for example, DNA or RNA (target molecule) of a gene expressed by a cell to be studied is labeled with a fluorescent dye or the like, and the labeled nucleic acid and the nucleic acid on the planar base piece are combined. There is a method in which the fluorescence at a location where nucleic acids complementary to each other are hybridized and read with a high resolution analyzer is read at high speed. By this method, the amount of each target molecule present in the specimen can be quickly measured.
マイクロアレイ法は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を解析するためのＤＮＡマイクロアレイ法に限らず、プローブとターゲット分子が接触又は反応する限りにおいて、タンパク質、ペプチド、抗体、糖鎖など様々な生体分子を解析するために用いることができる。マイクロアレイ法は、基本的には反応試料を微量化する技術と、その反応試料を再現性よく多量・迅速・系統的に分析及び定量しうる形に配列又は整列する技術とが統合されたものであると理解される。プローブを基盤上に固定化するための技術としては、ナイロンシート等の上に高密度に固定化する方法（シート法）、更に密度を高めるためにガラス等の固体表面を化学的又は物理的に修飾した基盤上にプローブをスポッティング固定化する方法（スポッティング法）（非特許文献１）、フォトリソグラフィー技術を用い、シリコン等の基盤の上に多種類のプローブを直接固相合成していく方法（直接合成法）（特許文献１、２）などが開発されている。しかし、例えば、スポッティング法は、基盤上の単位面積当たりに合成しうるプローブ種数（スポット密度）においてシート法より優れるものの、スポット密度及びスポット当たり固定できるプローブの量（合成量）がシリコン基盤上における直接合成法と比較して少量であり、再現が困難である点が指摘されている。他方、直接合成法は、スポット密度及びスポット当たりの合成量、並びに再現性等において、スポッティング法より優れるとされるものの、固定化しうるプローブ種は、フォトリソグラフィーにより制御可能な比較的低分子量のプローブに限られる。また、直接合成法は、高価な製造装置と多段の製造プロセスを必要とするため、アレイ当たりのコストを大幅に削減することが困難とされる。
その他、微小な担体上にプローブを固相合成しライブラリー化する手法として、微小なビーズを利用する方法が知られている。この方法は、マイクロアレイ法より大きな分子量のプローブを多種類合成することが可能であり、また安価に合成することが可能であるが、マイクロアレイ法のように指定の化合物を指定の配列基準で再現性よく整列させたものを作製することは困難である。
The microarray method is not limited to the DNA microarray method for analyzing nucleic acids such as DNA and RNA, but analyzes various biomolecules such as proteins, peptides, antibodies, sugar chains, etc. as long as the probe and the target molecule contact or react with each other. Can be used for The microarray method is basically an integration of technology for reducing the amount of reaction samples and technology for arranging or aligning the reaction samples in a reproducible, rapid, and systematic form for analysis and quantification. It is understood that there is. As a technique for immobilizing the probe on the substrate, a method of immobilizing the probe on a nylon sheet or the like at high density (sheet method), and a solid surface such as glass to increase the density chemically or physically A method of spotting and immobilizing a probe on a modified substrate (spotting method) (Non-Patent Document 1), a method of directly solid-phase synthesizing various types of probes on a substrate such as silicon using a photolithography technique ( Direct synthesis methods) (
In addition, a method using microbeads is known as a technique for solid-phase synthesis of probes on a microcarrier to form a library. This method can synthesize many types of probes with a larger molecular weight than the microarray method, and can be synthesized at a low cost. However, as with the microarray method, the specified compound is reproducible with the specified sequence standard. It is difficult to produce well-aligned ones.
このような状況下、分子量によらずプローブを所定の濃度に固定化でき、測定可能な形に高密度に再現よく配列化することが可能で、安価な大量製造に適応しうる新たな方法が確立されている。 Under these circumstances, there is a new method that can be used to fix probes at a predetermined concentration regardless of molecular weight, and can be reproducibly arranged in a measurable form at high density, and can be applied to inexpensive mass production. Has been established.
その方法の一つとしては、例えば、プローブの固定化プロセスを一次元構造体としての繊維上（1本の繊維上）に独立して行い、それらの整列化プロセスに各種の繊維賦形化技術を導入することにより三次元構造体としての繊維束を作製し、得られる繊維束の切片化プロセスを経ることで、生体分子固定化アレイを作製する方法が挙げられる。
より具体的には、プローブを固定したゲルを中空繊維の中空部に充填し、前記ゲルが保持された複数の中空繊維を整列し、繊維束を固定化した後に、固定化した繊維束を切片化することでこのような生体分子固定化アレイを作製することができる（特許文献３）。
As one of the methods, for example, the probe immobilization process is independently performed on the fiber (one fiber) as a one-dimensional structure, and various fiber shaping technologies are used for the alignment process. There is a method of producing a biomolecule-immobilized array by producing a fiber bundle as a three-dimensional structure by introducing, and through a sectioning process of the obtained fiber bundle.
More specifically, the hollow fiber is filled with the gel to which the probe is fixed, the hollow fibers holding the gel are aligned, the fiber bundle is fixed, and then the fixed fiber bundle is cut into pieces. It is possible to produce such a biomolecule-immobilized array (see Patent Document 3).
ゲルにプローブを固定した生体分子固定化アレイは、平面基板上にプローブを直接固定化するものに比べ、固定の場が３次元となるため基板上に小面積で多くのプローブが保持できるという利点がある。その一方で、検体はゲル内部で拡散した上でプローブとハイブリッドを形成する必要があるため、ターゲット分子とプローブとの接触及び反応速度は、拡散速度が律速段階となり、高分子量の検体ほど拡散速度が遅くなるために、検出に時間がかかるという問題があった。 The biomolecule-immobilized array in which probes are immobilized on a gel has the advantage that many probes can be held in a small area on the substrate because the immobilization field is three-dimensional compared to those in which probes are directly immobilized on a flat substrate. There is. On the other hand, since it is necessary to form a hybrid with the probe after the specimen diffuses inside the gel, the diffusion rate of the contact and reaction rate between the target molecule and the probe becomes the rate-determining step. Has a problem that it takes a long time to detect.
このため、ゲルを利用した生体分子固定化アレイでは、より高分子量の検体のゲル中への拡散速度を上げ、ターゲット分子とプローブとの接触及び反応に要する時間を短縮し、検出速度を上げるために、ゲル中に高分子多価アルコールを含ませ、ゲル中への生体分子の浸透度を向上させるなどの工夫がなされてきた（特許文献４）。しかしながら、それでもまだゲルを利用した生体分子固定化アレイがもつ本来の検出感度を十分に引き出すには至っていなかった。 For this reason, in biomolecule-immobilized arrays using gels, the diffusion rate of higher molecular weight analytes into the gel is increased, the time required for contact and reaction between the target molecule and the probe is shortened, and the detection rate is increased. In addition, a device has been devised in which a polymer polyhydric alcohol is included in the gel to improve the penetrability of biomolecules into the gel (Patent Document 4). However, the original detection sensitivity of a biomolecule-immobilized array using a gel has not yet been fully exploited.
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、検出感度が、従来技術と比較して有意に高い生体分子固定化アレイを提供することにある。 The present invention has been made in view of such circumstances, and a problem to be solved is to provide a biomolecule-immobilized array whose detection sensitivity is significantly higher than that of the prior art.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体、好ましくは柱状の前記担体を基板上にアドレス可能に配置することで、プローブと検体溶液との接触の効率が極めて向上し、検出感度が有意に向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have determined that a carrier made of a hydrophilic gel to which a biomolecule is fixed, preferably a columnar carrier, is arranged on a substrate in an addressable manner, It has been found that the efficiency of contact with the sample solution is greatly improved and the detection sensitivity is significantly improved, and the present invention has been completed.
That is, the present invention is as follows.
（１）生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体が、アドレス可能な状態で基板上に配置された、生体分子固定化アレイ。
（２）担体が柱状のものである、上記（１）に記載のアレイ。
（３）基板が親水性ゲルからなるものである、上記（１）又は（２）に記載のアレイ。
（４）基板が検体を含有するものである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のアレイ。
（５）生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体の数が２以上である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のアレイ。
（６）生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体を、アドレス可能な状態で基板上に配置させる工程を含む、生体分子固定化アレイの製造方法。
（７）生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体をアドレス可能な状態で基板上に配置させる工程が、以下の工程：
(a)担体成形用鋳型の空隙部に、生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填し、該溶液をゲル化する工程、
(b) 前記ゲルを保持した鋳型を基板に配置させる工程、並びに、
(c) 前記基板から鋳型を除去する工程
を含むものである、上記（６）に記載の方法。
（８）生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体をアドレス可能な状態で基板上に配置させる工程が、以下の工程：
(a) 複数の中空繊維を、各繊維軸が同一方向となるように三次元に配列及び固定して中空繊維束を製造する工程、
(b) 前記中空繊維の中空部に、生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填し、該溶液をゲル化する工程、
(c) 前記ゲルを保持した中空繊維束を中空繊維の長手方向に直交する方向で切断して薄片を製造し、該薄片を基板に配置させる工程、並びに
(d) 前記基板から、中空繊維束を除去する工程
を含むものである、上記（６）に記載の方法。
(1) A biomolecule-immobilized array in which a carrier made of a hydrophilic gel on which biomolecules are immobilized is arranged on a substrate in an addressable state.
(2) The array according to (1) above, wherein the carrier is columnar.
(3) The array according to (1) or (2) above, wherein the substrate is made of a hydrophilic gel.
(4) The array according to any one of (1) to (3), wherein the substrate contains a specimen.
(5) The array according to any one of (1) to (4), wherein the number of carriers made of a hydrophilic gel to which a biomolecule is fixed is 2 or more.
(6) A method for producing a biomolecule-immobilized array, comprising a step of arranging a carrier comprising a hydrophilic gel on which a biomolecule is immobilized on a substrate in an addressable state.
(7) The step of arranging a carrier made of a hydrophilic gel on which a biomolecule is fixed on a substrate in an addressable state includes the following steps:
(a) a step of filling a gel precursor polymerizable solution containing a biomolecule in the void of the carrier molding template and gelling the solution;
(b) placing the mold holding the gel on a substrate, and
(c) The method according to (6) above, comprising a step of removing the template from the substrate.
(8) The step of arranging a carrier made of a hydrophilic gel on which a biomolecule is fixed on a substrate in an addressable state includes the following steps:
(a) A step of producing a hollow fiber bundle by arranging and fixing a plurality of hollow fibers in three dimensions so that each fiber axis is in the same direction,
(b) filling the hollow portion of the hollow fiber with a gel precursor polymerizable solution containing a biomolecule, and gelling the solution;
(c) cutting the hollow fiber bundle holding the gel in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the hollow fiber to produce a flake, and placing the flake on a substrate; and
(d) The method according to (6) above, comprising a step of removing the hollow fiber bundle from the substrate.
本発明により、従来の貫通孔型の生体分子固定化アレイと比較して、検出感度が有意に高い生体分子固定化アレイが提供される。 The present invention provides a biomolecule-immobilized array having significantly higher detection sensitivity than a conventional through-hole type biomolecule-immobilized array.
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail. The following embodiment is an example for explaining the present invention, and is not intended to limit the present invention to this embodiment alone. The present invention can be implemented in various forms without departing from the gist thereof.
１．概要
本発明は、生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体（以下、「生体分子固定化担体」ともいう）が、アドレス可能な状態で基板上に配置された生体分子固定化アレイである。本発明者らは、当該担体の上面及び側面部分が検体と接触するように当該担体を成形することにより、従来技術と比較して、当該アレイの検出感度が有意に向上することを見出した。また、当該担体の上面及び側面部分が検体と接触することにより、従来技術と比較して、検体中のターゲット分子と担体中のプローブとが相互作用するまでに要する時間が短縮され、生体分子固定化アレイを用いた実験又は検査の結果がより迅速に得られることを見出した。本発明は、これらの知見に基づき完成されたものである。
1. Outline The present invention is a biomolecule-immobilized array in which a carrier made of a hydrophilic gel to which a biomolecule is immobilized (hereinafter also referred to as “biomolecule-immobilized carrier”) is arranged on a substrate in an addressable state. . The present inventors have found that the detection sensitivity of the array is significantly improved by molding the carrier so that the upper and side portions of the carrier are in contact with the specimen as compared with the prior art. In addition, since the upper surface and side surfaces of the carrier are in contact with the specimen, the time required for the target molecule in the specimen to interact with the probe in the carrier is shortened compared to the conventional technique, and the biomolecule is immobilized. It has been found that the results of experiments or tests using structured arrays can be obtained more quickly. The present invention has been completed based on these findings.
２．生体分子
本発明において、生体分子は、プローブ又はターゲット分子として本発明に用いることができるものであれば限定されるものではなく、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、タンパク質、ペプチド、抗体、糖鎖及びレクチン等が挙げられる。
本発明において、プローブとは、検体中に含まれるターゲット分子を特異的に捕捉するための生体分子であり、個々のターゲット分子に応じた構造を持った分子を指す。プローブは、所定のターゲット分子を特異的に認識できる生体分子であれば、どのような種類の分子種であっても良く、天然物であっても人工的に合成されたものであってもよい。このような生体分子プローブとしては、例えば、核酸プローブ、タンパク質プローブ、ペプチドプローブ、抗体プローブ、レクチンプローブ等が挙げられる。また、ターゲット分子とは、解析の対象となる任意の生体分子を指す。
2. Biomolecule In the present invention, the biomolecule is not limited as long as it can be used in the present invention as a probe or target molecule. For example, nucleic acid (DNA, RNA, etc.), protein, peptide, antibody, sugar Examples include chains and lectins.
In the present invention, a probe is a biomolecule for specifically capturing a target molecule contained in a specimen, and refers to a molecule having a structure corresponding to each target molecule. The probe may be any kind of molecular species as long as it can specifically recognize a predetermined target molecule, and may be a natural product or an artificially synthesized one. . Examples of such biomolecular probes include nucleic acid probes, protein probes, peptide probes, antibody probes, lectin probes, and the like. The target molecule refers to an arbitrary biomolecule to be analyzed.
本発明において、ある種のＤＮＡやＲＮＡなどの核酸がターゲット分子である場合、ターゲット分子の塩基配列に相補的な配列を有し、これらの塩基配列を特異的に認識して捕捉することができる核酸をプローブとして使用することができる。また、タンパク質やペプチドなどがターゲット分子である場合、それらを抗原として特異的に認識するような抗体をプローブとして使用することができる。また逆に、抗体をターゲット分子とし、それらの抗原となるようなタンパク質やペプチドなどをプローブとして使用することもできる。さらに、糖鎖をターゲット分子とする場合は、レクチンなどをプローブとして使用することができる。すなわち、ある特定の分子（Ａ）がある特定の分子（Ｂ）に特異的に結合する性質がある場合、Ａがターゲット分子として検出対象となるのであれば、Ｂがプローブとなり、逆にＢがターゲット分子となるのであれば、Ａがプローブとなる。 In the present invention, when a nucleic acid such as a certain kind of DNA or RNA is a target molecule, it has a sequence complementary to the base sequence of the target molecule, and can specifically recognize and capture these base sequences. Nucleic acids can be used as probes. Moreover, when protein or peptide is a target molecule, an antibody that specifically recognizes them as an antigen can be used as a probe. Conversely, proteins and peptides that serve as antigens and target antigens can be used as probes. Furthermore, when a sugar chain is used as a target molecule, a lectin or the like can be used as a probe. That is, when a specific molecule (A) has a property of specifically binding to a specific molecule (B), if A is a detection target as a target molecule, B is a probe, and conversely, B is If it becomes a target molecule, A becomes a probe.
３．生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体
本発明において、担体とは、生体分子を担持させるための支持体を指す。生体分子は、担体に固定化することで、個々の生体分子を他の生体分子と混じりあわない状態で独立に存在させることが可能である。
本発明において、生体分子の担体として用いられるゲルは、親水性ゲルであり、所望の生体分子を固定化できるものであればどのような親水性ゲルであっても良い。
本発明に用いることができる親水性ゲルとしては、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類又は二種類以上と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体とを共重合したゲルが挙げられる。その他本発明に用いることのできるゲルとしては、例えばアガロース、アルギン酸、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等のゲル、又はこれらを架橋したゲルが挙げられる。
3. In the present invention, the carrier refers to a support for supporting a biomolecule. By immobilizing biomolecules on a carrier, individual biomolecules can exist independently without being mixed with other biomolecules.
In the present invention, the gel used as a biomolecule carrier is a hydrophilic gel and may be any hydrophilic gel as long as it can immobilize a desired biomolecule.
Examples of the hydrophilic gel that can be used in the present invention include acrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-acryloylaminoethoxyethanol, N-acryloylaminopropanol, N-methylolacrylamide, and N-vinylpyrrolidone. , One or more monomers such as hydroxyethyl methacrylate, (meth) acrylic acid, and allyl dextrin, and polyfunctional monomers such as methylene bis (meth) acrylamide and polyethylene glycol di (meth) acrylate A copolymerized gel may be mentioned. Other examples of the gel that can be used in the present invention include gels such as agarose, alginic acid, dextran, polyvinyl alcohol, and polyethylene glycol, and gels obtained by crosslinking these.
本発明において、生体分子の固定とは、生体分子を担体から遊離させないための処理である。本発明では、プローブ等の生体分子をそのままゲルに固定化してもよく、また、生体分子に化学的修飾を施した誘導体や、必要に応じて変成させた生体分子を固定化してもよい。生体分子のゲルへの固定化には、生体分子をゲルに物理的に包括する方法を利用してもよく、ゲル構成成分への直接的な結合を利用してもよい。また、生体分子を一旦高分子体や無機粒子などに共有結合又は非共有結合により結合させ、それらをゲルに包括固定化してもよい。例えば、生体分子として核酸を利用する場合には、核酸の末端基にビニル基を導入し（ＷＯ98/39351）、アクリルアミド等のゲルの構成成分と共重合させることができる。共重合においては、単量体、多官能性単量体及び重合開始剤と共に共重合する方法、単量体及び重合開始剤と共に共重合したのち、架橋剤でゲル化する方法などがある。また、アガロースを臭化シアン法でイミドカルボネート化しておき、末端アミノ化した核酸のアミノ基と結合させてからゲル化することもできる。この際、ゲルは、核酸を固定化したアガロースと他のゲル（例えばアクリルアミドゲル等）との混合ゲルにしてもよい。 In the present invention, the immobilization of a biomolecule is a treatment for preventing the biomolecule from being released from the carrier. In the present invention, a biomolecule such as a probe may be immobilized on a gel as it is, or a derivative obtained by chemically modifying a biomolecule, or a biomolecule modified as necessary may be immobilized. For immobilization of the biomolecule on the gel, a method of physically encapsulating the biomolecule in the gel may be used, or direct binding to the gel component may be used. Alternatively, biomolecules may be once bonded to a polymer or inorganic particle by covalent bonding or non-covalent bonding, and then comprehensively immobilized on the gel. For example, when a nucleic acid is used as a biomolecule, a vinyl group can be introduced into the terminal group of the nucleic acid (WO98 / 39351) and copolymerized with a gel component such as acrylamide. In the copolymerization, there are a method of copolymerizing with a monomer, a polyfunctional monomer and a polymerization initiator, a method of copolymerizing with a monomer and a polymerization initiator, and then gelling with a crosslinking agent. Alternatively, agarose may be converted to imide carbonate by the cyanogen bromide method and bonded to the amino group of the terminally aminated nucleic acid before gelation. In this case, the gel may be a mixed gel of agarose with immobilized nucleic acid and another gel (for example, acrylamide gel).
４．生体分子固定化担体の形状
生体分子固定化担体は、検出可能な量の生体分子を固定化できる体積を保持している限り、どのような形状であってもよい。
ここで、生体分子固定化担体の形状としては、球状や半球状が、構造上安定であり、比較的容易に製造できるという観点から好ましい形状である（図６）。その一方で、球状の場合は、基板との接触面積が小さくなり、生体分子固定化担体が基板から剥がれやすいと考えられる。また、半球状の場合、体積あたりの表面積が小さくなるため、検体の生体分子固定化担体への浸透及びプローブとの反応にかかる時間は、同一体積の他の形状と比較すると長くなる場合が考えられる。また、検出に際しては通常、基板に対して垂直方向から検出することになるが、生体分子固定化担体が球状であったり、半球状であったりすると、生体分子固定化担体の厚みが一定でないため、検出時にシグナル強度の評価がしにくくなる可能性が考えられる。
これらの点を考慮すると、本発明の生体分子固定化担体の形状は、基板からより剥がれにくく、検体の当該担体への浸透時間がより短く、かつ検出時のシグナル強度の測定誤差がより小さい立体的形状がより好ましい。
このような立体的形状の生体分子固定化担体としては、例えば柱状のものが挙げられる。本発明において、「柱状」とは、生体分子固定化担体の基板表面との接触面（以下単に「接触面」という）と、基板表面から法線方向に最も遠い位置の面（以下単に「上面」という）の形状が実質的に同一であり、上面から接触面を法線方向に見た場合に、上面と接触面とが実質的に重なりあう形状であって、上面と接触面と間にある担体の厚みが一定である形状をいい、このような形状であれば限定されるものではない（図７）。柱状の生体分子固定化担体としては、例えば、円柱状、楕円柱状、多角柱状（三角柱、四角柱、六角柱、八角柱等）のものが挙げられる。柱状の生体分子固定化担体は、後述する中空繊維束を用いることにより短時間で簡便かつ安価に製造できる点においても、他の複雑な立体的形状よりも優れている。図７においては、説明の都合上、アスペクト比の高い四角柱及び三角柱（四角柱及び三角柱を2次元平面に投影したときの縦と横の比率が高い形態）を記載したが、柱状の形態を有する限り、アスペクト比に制限はない。
4). Shape of Biomolecule-Immobilized Carrier The biomolecule-immobilized carrier may have any shape as long as it retains a volume capable of immobilizing a detectable amount of biomolecule.
Here, the shape of the biomolecule-immobilized carrier is preferably a spherical shape or a hemispherical shape from the viewpoint of being structurally stable and relatively easy to produce (FIG. 6). On the other hand, in the case of a spherical shape, the contact area with the substrate becomes small, and the biomolecule-immobilized carrier is considered to be easily peeled off from the substrate. In the case of a hemisphere, since the surface area per volume is small, the time required for the penetration of the specimen into the biomolecule-immobilized carrier and the reaction with the probe may be longer than in other shapes of the same volume. It is done. In addition, the detection is usually performed from the direction perpendicular to the substrate. However, if the biomolecule-immobilized carrier is spherical or hemispherical, the thickness of the biomolecule-immobilized carrier is not constant. The signal intensity may be difficult to evaluate at the time of detection.
In view of these points, the shape of the biomolecule-immobilized carrier of the present invention is a three-dimensional solid that is less likely to be peeled off from the substrate, has a shorter penetration time of the specimen into the carrier, and has a smaller signal intensity measurement error during detection. The target shape is more preferable.
Examples of such a three-dimensionally shaped biomolecule-immobilized carrier include columnar ones. In the present invention, “columnar” means a contact surface of the biomolecule-immobilized carrier with the substrate surface (hereinafter simply referred to as “contact surface”) and a surface farthest from the substrate surface in the normal direction (hereinafter simply referred to as “upper surface”). Are substantially the same, and when the contact surface is viewed from the upper surface in the normal direction, the upper surface and the contact surface substantially overlap each other, and the upper surface and the contact surface are A shape in which the thickness of a certain carrier is constant is not limited as long as it is such a shape (FIG. 7). Examples of the columnar biomolecule-immobilized carrier include cylindrical, elliptical, and polygonal columns (triangular, quadrangular, hexagonal, octagonal, etc.). The columnar biomolecule-immobilized carrier is superior to other complicated three-dimensional shapes in that it can be manufactured easily and inexpensively in a short time by using a hollow fiber bundle described later. In FIG. 7, for the convenience of explanation, a rectangular column and a triangular column having a high aspect ratio (a mode in which a ratio of length and width when a square column and a triangular column are projected onto a two-dimensional plane are high) are described. As long as it has, the aspect ratio is not limited.
５．基板
本発明において、基板とは、生体分子固定化担体が配置される板である。生体分子固定化担体との接触面が平らな基板であればどのようなものであってもよく、立体的なものであってもよいが、プローブとターゲット分子の接触及び反応の検出を阻害しないものが望ましい。そのような基板としては、平面基板が挙げられる。平面基板は、その表面が実質的に平面からなる板である。基板としては、例えば、スライドガラス、シリコン基板、ゲルからなる基板などが挙げられる。中でも、生体分子固定化担体の形状に応じて取り扱いが容易なゲルからなる基板であることが好ましい。また、基板に用いるゲルとしては、親水性のゲルが望ましく、さらに温度を変化させることでゾル化、ゲル化を繰り返すゲルが望ましい。基板に用いる親水性ゲルの種類は、上記に例示したものと同様であるが、好ましくはアガロースゲルである。
5. Substrate In the present invention, the substrate is a plate on which a biomolecule-immobilized carrier is disposed. Any substrate may be used as long as the contact surface with the biomolecule-immobilized carrier is flat, and the substrate may be three-dimensional, but does not hinder the contact between the probe and the target molecule and detection of the reaction. Things are desirable. An example of such a substrate is a flat substrate. A planar substrate is a plate whose surface is substantially planar. Examples of the substrate include a glass slide, a silicon substrate, and a substrate made of gel. Especially, it is preferable that it is a board | substrate which consists of a gel with easy handling according to the shape of a biomolecule fixed support | carrier. The gel used for the substrate is preferably a hydrophilic gel, and is preferably a gel that repeats solification and gelation by changing the temperature. Although the kind of hydrophilic gel used for a board | substrate is the same as that of what was illustrated above, Preferably it is an agarose gel.
基板がゲルで構成される場合には、あらかじめ基板中に検体を混合しておき、基板中から生体分子固定化担体へ拡散、蒸散、電気泳動などの手法により検体を移動させることができる。これにより、生体分子固定化アレイにおいて、プローブと検体との反応を極めて効率的にすることができる。このような用途においては、事前に検体を十分に混和するという観点から、生体分子（核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、糖鎖等）が分解又は変性しない温度で溶解するような親水性ゲルからなる基板であることが望ましい。そのような基板としては、例えばアガロースゲルからなる基板が挙げられる。アガロースゲルとしては、1%（ｗ／ｖ）から4%（ｗ／ｖ）の濃度であることが望ましく、さらに2%（ｗ／ｖ）から3%（ｗ／ｖ）の濃度であることがより望ましい。ゲル濃度が1%（ｗ／ｖ）より薄いと基板としての強度が不足しアレイが壊れやすくなり、ゲル濃度が4%（ｗ／ｖ）より濃いと基板中に混合した検体の生体分子固定化担体への移動効率が著しく低下するためである。
基板は、最終的に生体分子固定化担体が接触する面が平面である限り、異なる物質が積層構造となっていても、また、いかなる形態で表面がコーティングされているものであってもよい。
When the substrate is composed of a gel, the sample can be mixed in advance in the substrate, and the sample can be moved from the substrate to the biomolecule-immobilized carrier by diffusion, evaporation, electrophoresis, or the like. Thereby, in the biomolecule-immobilized array, the reaction between the probe and the specimen can be made extremely efficient. In such applications, from the viewpoint of sufficiently mixing the specimen in advance, it consists of a hydrophilic gel that dissolves at a temperature at which biomolecules (nucleic acid, protein, peptide, antibody, sugar chain, etc.) do not decompose or denature. A substrate is desirable. An example of such a substrate is a substrate made of agarose gel. The agarose gel preferably has a concentration of 1% (w / v) to 4% (w / v), and more preferably 2% (w / v) to 3% (w / v). More desirable. If the gel concentration is less than 1% (w / v), the strength of the substrate will be insufficient and the array will be fragile. If the gel concentration is greater than 4% (w / v), the biomolecules immobilized on the sample mixed in the substrate will be immobilized. This is because the transfer efficiency to the carrier is significantly reduced.
The substrate may have a laminated structure of different substances or may be coated on the surface in any form as long as the surface with which the biomolecule-immobilized carrier is finally contacted is a flat surface.
本発明において、「アドレス可能な状態」とは、どの生体分子固定化担体に、どの種類の生体分子プローブが固定化されているのかを、事前の情報に基づいて識別することが可能な状態を意味する。アドレス可能な状態は、例えば、各生体分子固定化担体を縦横の升目に従って配列し、当該担体に位置情報（例えば縦ｘ・横ｙなど）を与えることで達成できる。また、事前の位置情報が取得不可能であっても、個々の担体をその形態によって区別することが可能であれば、アドレス可能であると言える。即ち、生体分子固定化担体の形状が個々に異なっていれば、アレイ上の配置を制御しなかったとしても、どの生体分子固定化担体に、どの種類の生体分子プローブが固定化されているのかを判別することが可能であるため、アドレス可能であると言える。 In the present invention, the “addressable state” means a state in which which type of biomolecule probe is immobilized on which biomolecule-immobilized carrier can be identified based on prior information. means. An addressable state can be achieved, for example, by arranging each biomolecule-immobilized carrier according to vertical and horizontal grids and giving positional information (for example, vertical x and horizontal y) to the carrier. In addition, even if it is impossible to obtain prior position information, it can be said that addressing is possible if individual carriers can be distinguished by their forms. That is, if the shape of the biomolecule-immobilized carrier is different from each other, which type of biomolecule probe is immobilized on which biomolecule-immobilized carrier even if the arrangement on the array is not controlled. Therefore, it can be said that addressing is possible.
本発明における生体分子固定化アレイとは、生体分子（核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、レクチン等）が固定された親水性ゲルからなる担体がアドレス可能な状態で上述の基板上に配置されたものである。このようなアレイの例としては、ＤＮＡアレイやプロテインアレイ、抗体アレイ、レクチンアレイなどが挙げられる。このような生体分子固定化アレイは、いずれの場合も反応に用いる検体の量を極小化し、検出を高速に行うために、２つ以上の生体分子固定化担体を高密度に並べたマイクロアレイであることが望ましい。このようなマイクロアレイとしては、１ｃｍ２あたり１００個以上の生体分子固定化担体が並べられているものが望ましく、１ｃｍ２ あたり５００個から１０,０００,０００個の生体分子固定化担体が並べられているものがさらに望ましい。 The biomolecule-immobilized array in the present invention is an array in which a carrier made of a hydrophilic gel on which biomolecules (nucleic acid, protein, peptide, antibody, lectin, etc.) are immobilized is arranged on the above-mentioned substrate in an addressable state. It is. Examples of such arrays include DNA arrays, protein arrays, antibody arrays, lectin arrays, and the like. Such a biomolecule-immobilized array is a microarray in which two or more biomolecule-immobilized carriers are arranged at high density in order to minimize the amount of specimen used for the reaction and perform detection at high speed in any case. It is desirable. Such a microarray, preferably those 1 cm 2 per 100 or more biomolecule-immobilized carrier are arranged, are arranged is 10,000,000 biomolecule immobilization carrier from 500 per 1 cm 2 What is more desirable.
高密度な生体分子固定化アレイを作製する場合、最終的な形態としては、生体分子固定化担体の、基板表面との接触面積が１０μｍ２以上１,０００,０００μｍ２以下であることが望ましく、１０μｍ２以上１００,０００μｍ２以下であることがより望ましい。これは生体分子固定化担体の、基板表面との接触面積が小さすぎる場合、検体の定量的な検出が困難となり、逆に大きすぎる場合は基板上に搭載できる生体分子固定化担体の数が制限されるためである。 When fabricating a dense biomolecules immobilized arrays, as the final form of the biomolecule-immobilized carrier, it is desirable contact area with the substrate surface is 10 [mu] m 2 or more 1,000,000Myuemu 2 or less, and more desirably at 10 [mu] m 2 or more 100,000Myuemu 2 or less. This is because if the contact area of the biomolecule-immobilized carrier with the substrate surface is too small, it is difficult to quantitatively detect the specimen. If it is too large, the number of biomolecule-immobilized carriers that can be mounted on the substrate is limited. It is to be done.
また、生体分子固定化担体の、基板表面からの高さの最大は、１μｍ以上５,０００μｍ以下であることが望ましく、１０μｍ以上５００μｍ以下であることがより望ましい。これは、基板表面からの高さが低すぎると、生体分子固定化担体の体積に対する検体との接触面積が相対的に小さくなり、逆に高すぎるとその形状を維持することが困難となるためである。 The maximum height of the biomolecule-immobilized carrier from the substrate surface is preferably 1 μm or more and 5,000 μm or less, and more preferably 10 μm or more and 500 μm or less. This is because if the height from the substrate surface is too low, the contact area with the specimen relative to the volume of the biomolecule-immobilized carrier is relatively small, and conversely if it is too high, it is difficult to maintain the shape. It is.
６．生体分子固定化アレイの製造方法
本発明の生体分子固定化アレイの製造方法は、生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体を、アドレス可能な状態で基板上に配置させる工程を含むものである。
本発明における生体分子固定化アレイは、微量な親水性ゲルを乾燥させることなく前記担体をアレイ上に配置し、製造する必要があるため、公知の方法に基づいて製造することは極めて困難である。これを可能にする製造方法としては、一旦、前記担体を成形するための鋳型に生体分子固定化担体の前駆体を充填して、その後、当該担体の成形体を基板に配置する方法が挙げられる。あるいは、前記担体を成形するための鋳型を基板に先に配置しておいて、その後、鋳型の空隙部に生体分子固定化担体の前駆体を充填することにより、担体の成形体を基板に配置する方法が挙げられる。前記鋳型を用いて生体分子固定化担体を作製するためには、例えば、生体分子固定化担体を、当該担体の上面及び下面とは接触しないような管などの空間の内部にて製造し、その後に任意の樹脂からなるマトリックスにて固定化する方法が挙げられる（図８（ａ））。この際、必ずしも管を用いる必要は無く、マトリックス部分に規則的に空けられた空隙にて生体分子固定化担体を製造することも可能である（図９（ａ））。また、管の長さ方向に十分に長いマトリックスと管と生体分子固定化担体との複合体を作製した後に、複合体をマトリックスごと管の長さ方向に直交する方向にスライスすることで、多数のマトリックスと管と生体分子固定化担体との複合体（貫通孔型生体分子固定化アレイ）を作製することも可能である。
6). Method for Producing Biomolecule-Immobilized Array The method for producing a biomolecule-immobilized array of the present invention includes a step of arranging a carrier made of a hydrophilic gel on which a biomolecule is immobilized on a substrate in an addressable state.
The biomolecule-immobilized array in the present invention must be manufactured by arranging the carrier on the array without drying a trace amount of hydrophilic gel, and thus is extremely difficult to manufacture based on a known method. . As a manufacturing method that enables this, there is a method in which a template for molding the carrier is once filled with a precursor of a biomolecule-immobilized carrier, and then the molded body of the carrier is placed on a substrate. . Alternatively, the carrier mold is placed on the substrate by first placing the mold for molding the carrier on the substrate, and then filling the void portion of the template with the precursor of the biomolecule-immobilized carrier. The method of doing is mentioned. In order to produce a biomolecule-immobilized carrier using the template, for example, a biomolecule-immobilized carrier is produced in a space such as a tube that does not contact the upper and lower surfaces of the carrier, and then And a method of fixing with a matrix made of an arbitrary resin (FIG. 8A). At this time, it is not always necessary to use a tube, and the biomolecule-immobilized carrier can be produced with voids regularly spaced in the matrix portion (FIG. 9A). In addition, by preparing a complex of a matrix, a tube, and a biomolecule-immobilized carrier that is sufficiently long in the length direction of the tube, and then slicing the complex together with the matrix in a direction perpendicular to the length direction of the tube, It is also possible to produce a complex (through-hole type biomolecule-immobilized array) of the matrix, tube and biomolecule-immobilized carrier.
すなわち、本発明の生体分子固定化アレイの製造方法としては、生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体をアドレス可能な状態で基板上に配置させる工程が、以下の工程：(a)担体成形用鋳型の空隙部に、生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填し、該溶液をゲル化する工程、(b) 前記ゲルを保持した鋳型を基板に配置させる工程、並びに(c) 前記基板から鋳型を除去する工程を含む方法が挙げられる。 That is, as a method for producing the biomolecule-immobilized array of the present invention, the step of arranging a carrier made of a hydrophilic gel on which a biomolecule is immobilized on a substrate in an addressable state includes the following steps: Filling the void of the molding mold with a gel precursor polymerizable solution containing a biomolecule and gelling the solution; (b) placing the mold holding the gel on a substrate; and (c ) A method including a step of removing the template from the substrate.
上記工程(a)は、担体成形用鋳型の空隙部に、生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填し、該溶液をゲル化する工程である。本発明において、「担体成形用鋳型」とは、生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体を成形するための鋳型をいう。本発明における鋳型は、生体分子固定化担体の親水性ゲルを乾燥させることなく、前記担体をアドレス可能な状態でアレイ上に配置できるものであれば限定されるものではない。担体成形用鋳型は、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂等の樹脂を用いて作製することができる。鋳型における空隙の形状は、限定されるものではなく、作製する生体分子固定化担体の形状、例えば、球状、半球状、柱状等の形状に合わせて適宜選択することができる。鋳型の空隙は貫通孔であっても貫通孔でなくてもよい。また、鋳型は任意の管状体（例えば中空繊維等）を樹脂で固定することにより作製することもできる。 The step (a) is a step of filling a gel precursor polymerizable solution containing a biomolecule into the void portion of the carrier molding template and gelling the solution. In the present invention, the “carrier molding mold” refers to a mold for molding a carrier made of a hydrophilic gel to which a biomolecule is fixed. The template in the present invention is not limited as long as the carrier can be arranged on the array in an addressable state without drying the hydrophilic gel of the biomolecule-immobilized carrier. The carrier molding mold can be prepared using a resin such as a urethane resin or an epoxy resin. The shape of the void in the template is not limited, and can be appropriately selected according to the shape of the biomolecule-immobilized carrier to be produced, for example, a spherical shape, a hemispherical shape, a columnar shape or the like. The void of the mold may or may not be a through hole. The mold can also be produced by fixing an arbitrary tubular body (for example, a hollow fiber) with a resin.
本発明において、「ゲル前駆体重合性溶液」とは、プローブ、単量体、多官能性単量体、重合開始剤、及び水等を含むものである。単量体としては、例えばアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシエチルメチルメタクリレート、メチルピロリドン、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等の単量体の一種類または二種類以上、並びにメチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体を挙げることができる。重合開始剤としては、例えば、過硫酸塩等のレドックス系や、2,2'-アゾビス[2-（2-イミダゾリン-2-イル）プロパン]ジハイドロクロライド、2,2'-アゾビス（4-シアノペンチルカルボン酸）、2,2'-アゾビス（2-メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライド等のアゾ系の開始剤が挙げられる。 In the present invention, the “gel precursor polymerizable solution” includes a probe, a monomer, a polyfunctional monomer, a polymerization initiator, water, and the like. Examples of the monomer include acrylamide, N, N-dimethylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N-acryloylaminoethoxyethanol, N-acryloylaminopropanol, N-methylolacrylamide, N-vinylpyrrolidone, hydroxyethyl methacrylate, hydroxyethyl. One or more monomers such as methyl methacrylate, methyl pyrrolidone, (meth) acrylic acid, and allyl dextrin, and polyfunctional monomers such as methylene bis (meth) acrylamide and polyethylene glycol di (meth) acrylate Can be mentioned. Examples of the polymerization initiator include redox compounds such as persulfate, 2,2′-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride, 2,2′-azobis (4- And azo initiators such as cyanopentylcarboxylic acid) and 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride.
上記工程(a)において、担体成形用鋳型の空隙部に生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填する工程は、例えば、予め十分脱気し、かつ低温で保存しておいたゲル前駆体重合性溶液を、担体成形用鋳型の充填口から鋳型の空隙部に注入することにより行うことができる。さらに、酸素による重合阻害を回避するため、例えば、以下の方法により行うこともできる。まず、低温で保存しておいたゲル前駆体重合性溶液と担体成形用鋳型をデシゲーター内に設置する。ゲル前駆体重合性溶液は予め十分脱気しておく。ここで、窒素、ヘリウム等の不活性ガスを導入し、デシゲーター内を前記ガスで置換しておく。不活性ガスへの置換は、１０〜２０時間で実施される。次にデシゲーター内を減圧状態とし、担体成形用鋳型の充填口を、重合性溶液中に浸す。次にデシゲーター内に不活性ガスを吹き込むことにより加圧状態にし、担体成形用鋳型の空隙部にゲル前駆体重合性溶液を充填する。 In the step (a), the step of filling the void portion of the carrier molding mold with the gel precursor polymerizable solution containing a biomolecule is, for example, a gel precursor that has been sufficiently degassed and stored at a low temperature in advance. It can be carried out by injecting the body polymerizable solution into the cavity of the mold from the filling port of the carrier molding mold. Furthermore, in order to avoid polymerization inhibition due to oxygen, for example, the following method can be used. First, a gel precursor polymerizable solution stored at a low temperature and a carrier molding mold are placed in a desiccator. The gel precursor polymerizable solution is sufficiently deaerated beforehand. Here, an inert gas such as nitrogen or helium is introduced, and the inside of the desiccator is replaced with the gas. Replacement with the inert gas is carried out in 10 to 20 hours. Next, the inside of the desiccator is evacuated, and the filling port of the carrier molding mold is immersed in the polymerizable solution. Next, an inert gas is blown into the desiccator to bring it into a pressurized state, and the gel precursor polymerizable solution is filled into the voids of the carrier molding mold.
本発明において、「ゲル化」は、ゲル前駆体重合性溶液を充填した後、担体成形用鋳型を加温し、重合反応を行うことにより実施される。重合温度は使用する単量体等により適宜選択される。この操作により、ゲルは担体成形用鋳型に保持される。 In the present invention, “gelation” is carried out by filling a gel precursor polymerizable solution and then heating the carrier molding mold to perform a polymerization reaction. The polymerization temperature is appropriately selected depending on the monomer used. By this operation, the gel is held on the carrier molding mold.
上記工程(b)は、ゲルを保持した鋳型を基板に配置する工程である。配置する際には、鋳型に保持されたゲルが基板に接触するようにする。配置する時点において、基板は溶液の状態であってもよい。 The step (b) is a step of placing the mold holding the gel on the substrate. When placing, the gel held in the mold is brought into contact with the substrate. At the time of placement, the substrate may be in solution.
上記工程(c)は、基板から鋳型を除去する工程である。基板から鋳型を除去する際には、基板は固形化し、鋳型に保持されたゲルは基板に結合していることが好ましい。「除去」の方法は限定されるものではなく、物理的又は化学的に除去する方法が含まれ、例えば、溶解、融解、剥離などの方法が挙げられる。 The step (c) is a step of removing the template from the substrate. When removing the template from the substrate, the substrate is preferably solidified and the gel held in the template is preferably bonded to the substrate. The method of “removal” is not limited, and includes a method of physical or chemical removal, and examples thereof include methods such as dissolution, melting, and peeling.
また別の態様において、本発明の生体分子固定化アレイの製造方法としては、生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体をアドレス可能な状態で基板上に配置させる工程が、以下の工程：(a) 担体成形用鋳型を基板に配置させる工程、(b) 前記担体成形用鋳型の空隙部に、生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填し、該溶液をゲル化する工程、並びに(c) 前記基板から鋳型を除去する工程を含む方法が挙げられる。 In another aspect, as a method for producing a biomolecule-immobilized array of the present invention, a step of arranging a carrier made of a hydrophilic gel on which a biomolecule is immobilized on a substrate in an addressable state includes the following steps: (a) a step of placing a carrier molding template on a substrate, (b) a step of filling a gel precursor polymerizable solution containing a biomolecule in the void of the carrier molding template and gelling the solution, And (c) a method including a step of removing the template from the substrate.
上記工程(a)は、担体成形用鋳型を基板に配置させる工程である。配置する時点において、基板は溶液の状態であってもよい。 The step (a) is a step of arranging the carrier molding mold on the substrate. At the time of placement, the substrate may be in solution.
上記工程(b)は、前記担体成形用鋳型の空隙部に、生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填し、該溶液をゲル化する工程である。ゲル前駆体重合性溶液の充填は、例えば、予め十分脱気し、かつ低温で保存しておいたゲル前駆体重合性溶液を、担体成形用鋳型の充填口から鋳型の空隙部に注入することにより行うことができる。 The step (b) is a step of filling a gel precursor polymerizable solution containing a biomolecule into the void portion of the carrier molding template to gel the solution. The gel precursor polymerizable solution can be filled, for example, by injecting the gel precursor polymerizable solution that has been sufficiently degassed in advance and stored at a low temperature into the cavity of the mold from the filling port of the carrier molding mold. Can be performed.
上記工程(c)は、基板から鋳型を除去する工程である。当該工程の内容は、上記と同様である。 The step (c) is a step of removing the template from the substrate. The contents of this process are the same as described above.
さらに別の態様において、本発明の生体分子固定化アレイの製造方法としては、生体分子が固定された親水性ゲルからなる担体をアドレス可能な状態で基板上に配置させる工程が、以下の工程：(a) 複数の中空繊維を、各繊維軸が同一方向となるように三次元に配列及び固定して中空繊維束を製造する工程、(b) 前記中空繊維の中空部に、生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填し、該溶液をゲル化する工程、(c) 前記ゲルを保持した中空繊維束を中空繊維の長手方向に直交する方向で切断して薄片を製造し、該薄片を基板に配置させる工程、並びに(d) 前記基板から、中空繊維束を除去する工程を含む方法が挙げられる。 In still another embodiment, the method for producing the biomolecule-immobilized array of the present invention includes a step of arranging a carrier made of a hydrophilic gel on which a biomolecule is fixed on a substrate in an addressable state as follows: (a) a step of producing a hollow fiber bundle by three-dimensionally arranging and fixing a plurality of hollow fibers so that each fiber axis is in the same direction, (b) containing a biomolecule in the hollow portion of the hollow fiber Filling the gel precursor polymerizable solution to be gelled, and (c) producing a flake by cutting the hollow fiber bundle holding the gel in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the hollow fiber, Examples of the method include a step of placing a flake on a substrate, and (d) a step of removing a hollow fiber bundle from the substrate.
上記工程(a)は、複数の中空繊維を、各繊維軸が同一方向となるように三次元に配列及び固定して中空繊維束を製造する工程である。「中空繊維束」は、複数の中空繊維を各繊維軸が同一方向となるように配列及び固定したものであれば限定されるものではない。本発明においては、中空繊維及び固定剤部分（例えば、ウレタン樹脂等のマトリックス部分）の両者を含めて「中空繊維束」と称する。 The step (a) is a step of manufacturing a hollow fiber bundle by arranging and fixing a plurality of hollow fibers in three dimensions so that the fiber axes are in the same direction. The “hollow fiber bundle” is not limited as long as a plurality of hollow fibers are arranged and fixed so that the fiber axes are in the same direction. In the present invention, both the hollow fiber and the fixing agent part (for example, a matrix part such as urethane resin) are referred to as a “hollow fiber bundle”.
本発明の方法に中空繊維束を用いた場合、中空繊維ごとにそれぞれ別の種類のプローブを含有するゲル前駆体重合性溶液を充填することが可能であるため、特定の種類のプローブを特定の担体に固定することが容易である。従って、中空繊維束を用いた場合、生体分子固定化担体をアドレス可能な状態で基板上に配置することが容易である。また、中空繊維束は、生体分子固定化担体を柱状に成形する上で有効である。さらに、中空繊維束は、多量に生産することが容易であるため、これらを用いることにより、生体分子固定化アレイを短時間で簡便かつ安価に製造できる点で有効である。 When a hollow fiber bundle is used in the method of the present invention, it is possible to fill a gel precursor polymerizable solution containing a different type of probe for each hollow fiber. It is easy to fix to the carrier. Therefore, when a hollow fiber bundle is used, it is easy to arrange the biomolecule-immobilized carrier on the substrate in an addressable state. Moreover, the hollow fiber bundle is effective in forming the biomolecule-immobilized carrier into a columnar shape. Furthermore, since hollow fiber bundles can be easily produced in large quantities, using them is effective in that a biomolecule-immobilized array can be produced easily and inexpensively in a short time.
工程(a)における中空繊維束の製造は、例えば、図１に示す配列固定器具を利用して行うことができる。具体的には、まず、二枚の多孔板を孔が一致するように重ね合わせ、その孔に中空繊維を挿入し、挿入後多孔板の間隔を広げ、多孔板間の空間の周囲３面を板状物で囲うことにより容器を作製する。次に、前記容器に樹脂原料を流し、樹脂を硬化させ、多孔板と板状物を取り除く。これにより、複数の中空繊維が三次元に配列及び固定された中空繊維束を製造することができる。なお、中空繊維を固定する際、工程(b)においてゲル前駆体重合性溶液の充填を容易にするため、中空繊維の全長を固定するのではなく、片端を固定しないで自由端とすることが好ましい。 The production of the hollow fiber bundle in the step (a) can be performed using, for example, an array fixing device shown in FIG. Specifically, first, two porous plates are overlapped so that the holes coincide with each other, hollow fibers are inserted into the holes, the interval between the porous plates is increased after insertion, and the three surfaces around the space between the porous plates are covered. A container is produced by surrounding with a plate-like object. Next, a resin raw material is poured into the container, the resin is cured, and the porous plate and the plate-like material are removed. Thereby, a hollow fiber bundle in which a plurality of hollow fibers are arranged and fixed in three dimensions can be manufactured. When fixing the hollow fiber, in order to facilitate the filling of the gel precursor polymerizable solution in step (b), instead of fixing the entire length of the hollow fiber, it may be a free end without fixing one end. preferable.
中空繊維の材質としては、例えば、ナイロン６、ナイロン６６、芳香族ポリアミド等のポリアミド系中空繊維、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカーボネート等のポリエステル系中空繊維、ポリアクリロニトリル等のアクリル系中空繊維、ポリエチレンやポリプロピレン等のポリオレフィン系中空繊維、ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリレート系中空繊維、ポリビニルアルコール系中空繊維、ポリ塩化ビニリデン系中空繊維、ポリ塩化ビニル系中空繊維、ポリウレタン系中空繊維、フェノール系中空繊維、ポリフッ化ビニリデンやポリテトラフルオロエチレン等からなるフッ素系中空繊維、ポリアルキレンパラオキシベンゾエート系中空繊維等が挙げられる。
Examples of the hollow fiber material include polyamide-based hollow fibers such as
上記工程(b)は、中空繊維の中空部に、生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填し、該溶液をゲル化する工程である。ゲル前駆体重合性溶液の充填は、例えば以下の方法により行うことができる。まず、低温で保存しておいたゲル前駆体重合性溶液と中空繊維束をデシゲーター内に設置する。ゲル前駆体重合性溶液は予め十分脱気しておく。ここで、窒素、ヘリウム等の不活性ガスを導入し、デシゲーター内を前記ガスで置換しておく。不活性ガスへの置換は、１０〜２０時間で実施される。次にデシゲーター内を減圧状態とし、中空繊維束の中空繊維が固定されていない自由端を、重合性溶液中に浸す。次にデシゲーター内に不活性ガスを吹き込むことにより加圧状態にし、各中空繊維の中空部に溶液を充填する。 The step (b) is a step of filling the hollow part of the hollow fiber with a gel precursor polymerizable solution containing a biomolecule and gelling the solution. The gel precursor polymerizable solution can be filled, for example, by the following method. First, a gel precursor polymerizable solution and a hollow fiber bundle that have been stored at a low temperature are placed in a desiccator. The gel precursor polymerizable solution is sufficiently deaerated beforehand. Here, an inert gas such as nitrogen or helium is introduced, and the inside of the desiccator is replaced with the gas. Replacement with the inert gas is carried out in 10 to 20 hours. Next, the inside of the desiccator is brought into a reduced pressure state, and the free end where the hollow fibers of the hollow fiber bundle are not fixed is immersed in the polymerizable solution. Next, an inert gas is blown into the desiccator to bring it into a pressurized state, and the hollow portion of each hollow fiber is filled with the solution.
本発明において、「ゲル化」は、各中空繊維の中空部にゲル前駆体重合性溶液を充填した後、中空繊維束を加温し、重合反応を行うことにより実施される。重合温度は使用する単量体等により適宜選択される。この操作により、ゲルが中空繊維束に保持される。 In the present invention, “gelation” is carried out by filling a hollow portion of each hollow fiber with a gel precursor polymerizable solution, then heating the hollow fiber bundle, and performing a polymerization reaction. The polymerization temperature is appropriately selected depending on the monomer used. By this operation, the gel is held in the hollow fiber bundle.
上記工程(c)は、前記ゲルを保持した中空繊維束を中空繊維の長手方向に直交する方向で切断して薄片を製造し、該薄片を基板に配置する工程である。薄片の製造においては、ミクロトーム、レーザー等を使用することができる。薄片の厚さは、１μｍ以上５,０００μｍ以下であることが望ましく、１０μｍ以上５００μｍ以下であることがより望ましい。
このようにして作製した薄片を、本明細書では「貫通孔型生体分子固定化アレイ」と称する。
薄片を基板に配置する際には、薄片に保持されたゲルが基板に接触するようにする。また、薄片を基板に配置する時点で、基板は溶液の状態であってもよい。基板としてゲルを用いる場合、薄片を基板に配置する時点で、基板はゲル化前の状態であってもよい。例えば、基板としてアガロースゲルを用いる場合、薄片をゲル化前のアガロース溶液表面に浮かべることにより、薄片を基板に配置することができる。
The step (c) is a step of producing a flake by cutting the hollow fiber bundle holding the gel in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the hollow fiber, and placing the flake on a substrate. In the production of flakes, a microtome, a laser or the like can be used. The thickness of the flakes is preferably 1 μm or more and 5,000 μm or less, and more preferably 10 μm or more and 500 μm or less.
The flakes thus produced are referred to as “through-hole biomolecule-immobilized array” in this specification.
When placing the flakes on the substrate, the gel held on the flakes is brought into contact with the substrate. Further, the substrate may be in a solution state when the thin piece is placed on the substrate. When gel is used as the substrate, the substrate may be in a state before gelation at the time when the flakes are arranged on the substrate. For example, when an agarose gel is used as the substrate, the flakes can be placed on the substrate by floating the flakes on the surface of the agarose solution before gelation.
上記工程(d)は、基板から中空繊維束を除去する工程である。基板から中空繊維束を除去する際には、基板は固形化（基板としてゲルを用いる場合にはゲル化）し、中空繊維束に保持されたゲルは基板に結合していることが好ましい。「除去」の方法は上記の通りである。基板としてアガロースゲルを用いる場合、アガロースがゲル化した後、薄片中の中空繊維束部分をアガロースゲルから剥離することで生体分子固定化担体のみを容易にアガロースゲル上に配置することが可能である（図８、図１０及び図１１）。なお、図１０中のＡで示す部分を図１１（ａ）に示す。 The step (d) is a step of removing the hollow fiber bundle from the substrate. When removing the hollow fiber bundle from the substrate, it is preferable that the substrate is solidified (gelation when a gel is used as the substrate), and the gel held on the hollow fiber bundle is bonded to the substrate. The “removal” method is as described above. When agarose gel is used as the substrate, it is possible to easily dispose only the biomolecule-immobilized carrier on the agarose gel by peeling the hollow fiber bundle part in the flakes from the agarose gel after the agarose has gelled. (FIGS. 8, 10 and 11). A portion indicated by A in FIG. 10 is shown in FIG.
生体分子、プローブ、担体及び担体の形状、親水性ゲル、生体分子の固定、基板、アドレス可能な状態並びに生体分子固定化アレイについての定義、例示及び好ましい態様等の説明は、上記と同様である。 The definition of biomolecules, probes, carriers and carrier shapes, hydrophilic gels, biomolecule immobilization, substrates, addressable states, biomolecule-immobilized arrays, explanations and preferred embodiments are the same as described above. .
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples.
１．貫通孔型生体分子固定化アレイの作製
（１）プローブの合成
表１に示す配列番号１から配列番号２０で示されるオリゴヌクレオチドを合成した。合成の際、最終段階で、アミノリンクTM（ＰＥバイオシステムズ社製）を前記オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された５’−Ｏ−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、５’−Ｏ−オリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、５’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製し、これらをプローブとした。
（２）中空繊維束の製造
次に、図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図１中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。まず、直径０．３２ｍｍの孔（１１）が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦５列、横４列で合計２０個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（２１）を２枚準備した。これらの多孔板を重ね合わせて、そのすべての孔に、内径がおよそ０．１８ｍｍのポリカーボネート中空繊維（３１）（三菱エンジニアリングプラスチック社製 カーボンブラック１質量％添加）を１本ずつ、通過させた。Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（４１）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン４２７６、コロネート４４０３）の総重量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。
次に、表２に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液をプローブ毎にそれぞれ調製した。
ゲル前駆体重合性溶液組成
Next, a gel precursor polymerizable solution containing a monomer and an initiator mixed at a mass ratio shown in Table 2 was prepared for each probe.
Gel precursor polymerizable solution composition
上記で作製した配列番号１から配列番号２０で示されるオリゴヌクレオチドを含むゲル前駆体重合性溶液を、それぞれ図２に示した配置（図２中の数字は各プローブの塩基配列の配列番号を示す）になるように、中空繊維束における中空繊維の中空部に充填した。具体的には、まず、前記重合性溶液の入った容器及び上記で作製した中空繊維束を、図２に示した配置になるようにデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の各糸の封止されていない端部を所定の前記重合性溶液の入った容器に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にプローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を７０℃とし、３時間かけて重合反応を行った。このようにして、プローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。
次に、得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．２５ｍｍの薄片シート（貫通孔型生体分子固定化アレイ）を複数枚得た。プローブの固定化は、図２に示す配置で作製した。作製した貫通孔型生体分子固定化アレイには、それぞれの配列番号で示される塩基配列を有するプローブが、図２に示される配列番号に対応するように配置されている。
The gel precursor polymerizable solutions containing the oligonucleotides represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20 prepared above are shown in FIG. 2 (the numbers in FIG. 2 indicate the SEQ ID NOs of the base sequences of the probes). ) So that the hollow portion of the hollow fiber in the hollow fiber bundle was filled. Specifically, first, the container containing the polymerizable solution and the hollow fiber bundle produced above were placed in a desiccator so as to have the arrangement shown in FIG. After the inside of the desiccator was decompressed, the unsealed end of each yarn of the hollow fiber bundle was immersed in a container containing the predetermined polymerizable solution. Nitrogen gas was sealed in a desiccator, and a gel precursor polymerizable solution containing a probe was introduced into the hollow portion of the hollow fiber. Subsequently, the inside of a container was 70 degreeC and the polymerization reaction was performed over 3 hours. In this way, a hollow fiber bundle was obtained in which the probe was held in the hollow portion of the hollow fiber via the gel-like material.
Next, the obtained hollow fiber bundle was sliced in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the fiber using a microtome to obtain a plurality of thin sheet (through-hole type biomolecule-immobilized array) having a thickness of 0.25 mm. . The probe was immobilized in the arrangement shown in FIG. In the prepared through-hole type biomolecule-immobilized array, probes having the base sequences indicated by the respective sequence numbers are arranged so as to correspond to the sequence numbers shown in FIG.
２．ゲル担体生体分子固定化アレイの作製
１００ｍｌの純水に対し、アガロース（タカラバイオ株式会社製 型番：５００３）２．４ｇを加え、電子レンジで加熱してアガロース溶解液を作製した（2.4%（ｗ／ｖ））。１００℃に設定したヒートブロック上にスライドグラスを置き、スライドグラス上に前述のアガロース溶解液を２００μｌ滴下した。アガロース溶解液上に上記で作製した貫通孔型生体分子固定化アレイを浮かべた後、スライドグラスをヒートブロックから下ろし、室温で１０分間冷却させた後、更に４℃で３０分間冷却し、アガロース溶解液をゲル化した。その後貫通孔型生体分子固定化アレイのウレタン及びポリカーボネートからなるマトリックス部分と中空繊維部分とをアガロースゲルからゆっくりと剥がした。
以上の操作により、貫通孔型生体分子固定化アレイのウレタン及びポリカーボネートからなるマトリックス部分と中空繊維部分が剥離され、アクリルアミドゲルからなる生体分子固定化担体だけがアガロースゲル上に残った（図１１）。過剰なアガロースゲルを剃刀で除去した後、スライドグラスからアガロースゲルを剥離して、基板がアガロースゲル、生体分子固定化担体がアクリルアミドゲルからなるゲル担体生体分子固定化アレイが完成した。当該ゲル担体生体分子固定化アレイにおいて、生体分子固定化担体の形状は円柱状であり、１ｃｍ２あたり約７５０個の密度になるよう並べられていて、生体分子固定化担体の基板との接触面積は、貫通孔型生体分子固定化アレイの中空繊維断面積と同じく、約２５０００μｍ２であり、生体分子固定化担体の基板表面からの高さは、貫通孔型生体分子固定化アレイの厚みと同じく２５０μｍであった。また、図２より、前記ゲル担体生体分子固定化アレイにおける各生体分子固定化担体は、それぞれどの配列番号で示される塩基配列を有するプローブが固定されているかを特定できるため、アドレス可能な状態で基板上に配置されているといえる。
2. Preparation of Gel Carrier Biomolecule-Immobilized Array 2.4 g of agarose (manufactured by Takara Bio Inc., model number: 5003) was added to 100 ml of pure water, and heated in a microwave to prepare an agarose solution (2.4% (w / V)). A slide glass was placed on a heat block set at 100 ° C., and 200 μl of the agarose solution was dropped onto the slide glass. After floating the through-hole type biomolecule-immobilized array prepared above on the agarose solution, the slide glass was lowered from the heat block, allowed to cool at room temperature for 10 minutes, and further cooled at 4 ° C for 30 minutes to dissolve the agarose. The liquid was gelled. Thereafter, the matrix portion made of urethane and polycarbonate and the hollow fiber portion of the through-hole type biomolecule-immobilized array were slowly peeled off from the agarose gel.
Through the above operation, the matrix portion made of urethane and polycarbonate and the hollow fiber portion of the through-hole type biomolecule-immobilized array were peeled off, and only the biomolecule-immobilized carrier made of acrylamide gel remained on the agarose gel (FIG. 11). . After the excess agarose gel was removed with a razor, the agarose gel was peeled off from the slide glass to complete a gel carrier biomolecule-immobilized array in which the substrate was agarose gel and the biomolecule-immobilized carrier was acrylamide gel. In the gel carrier biomolecule-immobilized array, the shape of the biomolecule-immobilized carriers is a columnar shape, arranged so as to have a density of about 750 per cm 2 , and the contact area of the biomolecule-immobilized carriers with the substrate. Is about 25000 μm 2 as with the hollow fiber cross-sectional area of the through-hole biomolecule-immobilized array, and the height of the biomolecule-immobilized carrier from the substrate surface is the same as the thickness of the through-hole biomolecule-immobilized array. It was 250 μm. In addition, from FIG. 2, each biomolecule-immobilized carrier in the gel carrier biomolecule-immobilized array can specify which sequence number indicates the probe having the base sequence, so that it can be addressed. It can be said that it is arranged on the substrate.
３．モデル検体の作製
ゲル担体生体分子固定化アレイを評価するためのモデル検体を以下の通りに作製した。まず、表３に記載の配列番号２１から配列番号４０で示されるオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドの中には、プローブであるオリゴヌクレオチドと相補的な配列のものが含まれる。
表３に記載のオリゴヌクレオチドは、モデル検体００１、００２、００３、００５、００６、０１１、０１７、０１８、０２０については全て１００ｐｍｏｌ／μｌに調製し、その他のオリゴヌクレオチドについては２ｐｍｏｌ／μｌに調製した。これらのオリゴヌクレオチドは、各２μｌづつ用い、これに水を加えてそれぞれ５００μｌのオリゴヌクレオチド混合溶液を作製した。このオリゴヌクレオチド混合溶液を５μｌ使用し、標識試薬ＰｌａｔｉｎｕｍＢｒｉｇｈｔTM Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（型番：ＧＬＫ−００３）（Ｋｒｅａｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて蛍光標識を行った。具体的には、まず、表４の組成となるようにキットに付属の標識剤及びバッファーと混合し、反応液とした。
４．ハイブリダイゼーション
モデル検体とゲル担体生体分子固定化アレイとの接触及び反応に際し、まず表５の組成のハイブリダイゼーション溶液を調製した。このハイブリダイゼーション溶液を、上記で作製したゲル担体生体分子固定化アレイに対して接触させ、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、生体分子固定化アレイ（核酸アレイ）とハイブリダイゼーション溶液１５０μｌとを密封した状態で５０℃、１６時間接触させることで実施した。
ハイブリダイゼーション溶液の組成
Composition of hybridization solution
なお、２０ｘＳＳＣ溶液は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製（型番：ＡＭ９７６３）のものを使用し、２％ＳＤＳは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製（型番：ＡＭ９８２０）のものを水で１０倍希釈して使用した。 The 20 × SSC solution was from Applied Biosystems (model number: AM9763), and 2% SDS was from Applied Biosystems (model number: AM9820) diluted 10-fold with water.
５．洗浄
洗浄溶液として２ｘＳＳＣ・０．２％ＳＤＳ溶液、保存液として２ｘＳＳＣを各１００ｍｌづつ用意した。ハイブリダイゼーション終了後のゲル担体生体分子固定化アレイを、５０℃に保温した１０ｍｌの洗浄溶液に２０分間浸漬し、過剰のハイブリダイゼーション溶液を洗い流した。同じ操作を更にもう一回繰り返した後、ゲル担体生体分子固定化アレイを５０℃に保温した１０ｍｌの保存液に１０分間浸漬し、その後室温で冷却した。
5. 2xSSC · 0.2% SDS solution as wash washing solution, a 2xSSC as preservative solution was prepared each 100ml increments. After completion of hybridization, the gel carrier biomolecule-immobilized array was immersed in 10 ml of a washing solution kept at 50 ° C. for 20 minutes to wash away excess hybridization solution. After the same operation was repeated once more, the gel carrier biomolecule-immobilized array was immersed in 10 ml of a storage solution kept at 50 ° C. for 10 minutes, and then cooled at room temperature.
６．蛍光の検出
検出操作は、ＧｅｎｅＴＡＣTM ＬＳ ＩＶ（ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）を用いて、ゲル担体生体分子固定化アレイを保存液に浸漬し、カバーガラスをかぶせた後に、蛍光標識されたモデル検体の蛍光シグナル強度を測定した。測定条件は、Ｃｙ５検出用チャンネルを用い、Ｇａｉｎを５５に設定して測定した。得られた蛍光画像における、各スポットのシグナル強度は、プローブ搭載部位を取り囲むおよそ２８００画素分の値を平均して算出した。さらに、当該シグナル強度から、プローブを搭載していない箇所のシグナル強度をバックグラウンドとして減算し、正味のシグナル強度を算出した。その結果を図３に示す。
6). Fluorescence detection and detection operation is performed by using GeneTAC ™ LS IV (Genomic Solutions) to immerse the gel carrier biomolecule-immobilized array in a storage solution and cover it with a cover glass. The strength was measured. Measurement conditions were measured using a Cy5 detection channel and setting Gain to 55. The signal intensity of each spot in the obtained fluorescence image was calculated by averaging the values for approximately 2800 pixels surrounding the probe mounting site. Further, from the signal intensity, the signal intensity at the part where the probe was not mounted was subtracted as a background to calculate the net signal intensity. The result is shown in FIG.
７．比較例
本発明のゲル担体生体分子固定化アレイの効果と貫通孔型生体分子固定化アレイの効果とを比較するため、ゲル担体生体分子固定化アレイを作製する工程にて得た貫通孔型生体分子固定化アレイに対して、実施例で作製したモデル検体を接触及び反応（ハイブリダイゼーション）させた。アレイの種類以外の実験条件は全て実施例と同様の条件で、ハイブリダイゼーション、洗浄及び蛍光の検出を行った。結果を図４に示す。
貫通孔型生体分子固定化アレイにおける蛍光シグナル強度と、ゲル担体生体分子固定化アレイにおける蛍光シグナル強度とを比較した。その結果を図５に示す。縦軸は、両アレイにおける同一プローブについて、ゲル担体生体分子固定化アレイのシグナル強度を貫通孔型生体分子固定化アレイのシグナル強度で割った値を示す。全てのプローブにおいて両アレイのシグナル強度の倍率は１．５以上の値であり、プローブによっては３倍から４倍を示すものも認められ、全体として大幅なシグナル強度の増加が確認された。
7). Comparative Example In order to compare the effect of the gel carrier biomolecule-immobilized array of the present invention with the effect of the through-hole biomolecule-immobilized array, the through-hole biomolecule obtained in the step of producing the gel carrier biomolecule-immobilized array The model specimen prepared in the example was contacted and reacted (hybridized) with the molecule-immobilized array. The experimental conditions other than the type of array were all the same as in the examples, and hybridization, washing, and fluorescence were detected. The results are shown in FIG.
The fluorescence signal intensity in the through-hole type biomolecule-immobilized array was compared with the fluorescence signal intensity in the gel carrier biomolecule-immobilized array. The result is shown in FIG. The vertical axis represents the value obtained by dividing the signal intensity of the gel carrier biomolecule-immobilized array by the signal intensity of the through-hole biomolecule-immobilized array for the same probe in both arrays. In all the probes, the signal intensity magnification of both arrays was 1.5 or more, and some probes showed 3 to 4 times, confirming a significant increase in signal intensity as a whole.
搭載プローブとして下表６に示したものを用い、スライス厚みを100μmとした以外は、実施例１と同様にしてアレイを作製した。したがって、生体分子固定化担体の基板との接触面積は、貫通孔型生体分子固定化アレイの中空繊維断面積と同じく、約２５０００μｍ２であり、生体分子固定化担体の基板表面からの高さは、貫通孔型生体分子固定化アレイの厚みと同じく１００μｍであった。また、図１２より、ゲル担体生体分子固定化アレイにおける各生体分子固定化担体は、それぞれどの配列番号で示される塩基配列を有するプローブが固定されているかを特定できるため、アドレス可能な状態で基板上に配置されているといえる。
モデル検体の作製
表７に記載のオリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして作製した。ただし、全てのオリゴヌクレオチドは全て２ｐｍｏｌ／μｌに調製した。以降の標識操作から検出操作までは、ハイブリダイゼーションの時間を８時間とした以外は、全て実施例１に従った。
結果を図１３に示す。
The results are shown in FIG.
比較例２
実施例２におけるゲル担体生体分子固定化アレイの効果と貫通孔型生体分子固定化アレイの効果とを比較するため、ゲル担体生体分子固定化アレイを作製する工程にて得た貫通孔型生体分子固定化アレイに対して、実施例２で作製したモデル検体を接触及び反応（ハイブリダイゼーション）させた。アレイの種類以外の実験条件は全て実施例２と同様の条件で、ハイブリダイゼーション、洗浄及び蛍光の検出を行った。結果を図１４に示す。
貫通孔型生体分子固定化アレイにおける蛍光シグナル強度と、ゲル担体生体分子固定化アレイにおける蛍光シグナル強度とを比較した。その結果を図１５に示す。縦軸は、両アレイにおける同一プローブについて、ゲル担体生体分子固定化アレイのシグナル強度を貫通孔型生体分子固定化アレイのシグナル強度で割った値を示す。全てのプローブにおいて両アレイのシグナル強度の倍率は１以上の値であり、プローブによっては１．５倍以上を示すものも認められ、全体として大幅なシグナル強度の増加が確認された。
Comparative Example 2
In order to compare the effect of the gel carrier biomolecule-immobilized array in Example 2 with the effect of the through-hole biomolecule-immobilized array, the through-hole biomolecule obtained in the step of producing the gel carrier biomolecule-immobilized array The model specimen prepared in Example 2 was contacted and reacted (hybridized) with the immobilized array. All experimental conditions other than the type of array were the same as in Example 2, and hybridization, washing, and fluorescence were detected. The results are shown in FIG.
The fluorescence signal intensity in the through-hole type biomolecule-immobilized array was compared with the fluorescence signal intensity in the gel carrier biomolecule-immobilized array. The result is shown in FIG. The vertical axis represents the value obtained by dividing the signal intensity of the gel carrier biomolecule-immobilized array by the signal intensity of the through-hole biomolecule-immobilized array for the same probe in both arrays. In all probes, the magnification of the signal intensity of both arrays was 1 or more, and some probes showed 1.5 times or more, confirming a significant increase in signal intensity as a whole.
搭載プローブとして下表８に示したものを用い、スライス厚みを５００μｍとした以外は、実施例１と同様にしてアレイを作製した。したがって、生体分子固定化担体の基板との接触面積は、貫通孔型生体分子固定化アレイの中空繊維断面積と同じく、約２５０００μｍ２であり、生体分子固定化担体の基板表面からの高さは、貫通孔型生体分子固定化アレイの厚みと同じく５００μｍであった。また、図１６より、ゲル担体生体分子固定化アレイにおける各生体分子固定化担体は、それぞれどの配列番号で示される塩基配列を有するプローブが固定されているかを特定できるため、アドレス可能な状態で基板上に配置されているといえる。
モデル検体の作製
表９に記載のオリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして作製した。ただし、全てのオリゴヌクレオチドは全て２ｐｍｏｌ／μｌに調製した。以降の標識操作から検出操作までは、ハイブリダイゼーションの時間を８時間とした以外は、全て実施例１に従った。結果を図１７に示す。
比較例３
実施例３におけるゲル担体生体分子固定化アレイの効果と貫通孔型生体分子固定化アレイの効果とを比較するため、ゲル担体生体分子固定化アレイを作製する工程にて得た貫通孔型生体分子固定化アレイに対して、実施例で作製したモデル検体を接触及び反応（ハイブリダイゼーション）させた。アレイの種類以外の実験条件は全て実施例３と同様の条件で、ハイブリダイゼーション、洗浄及び蛍光の検出を行った。結果を図１８に示す。
貫通孔型生体分子固定化アレイにおける蛍光シグナル強度と、ゲル担体生体分子固定化アレイにおける蛍光シグナル強度とを比較した。その結果を図１９に示す。縦軸は、両アレイにおける同一プローブについて、ゲル担体生体分子固定化アレイのシグナル強度を貫通孔型生体分子固定化アレイのシグナル強度で割った値を示す。全てのプローブにおいて両アレイのシグナル強度の倍率は１以上の値であり、プローブによっては２．５倍以上を示すものも認められ、全体として大幅なシグナル強度の増加が確認された。
Comparative Example 3
In order to compare the effect of the gel carrier biomolecule-immobilized array in Example 3 with the effect of the through-hole biomolecule-immobilized array, the through-hole biomolecule obtained in the step of producing the gel carrier biomolecule-immobilized array The model specimen prepared in the example was contacted and reacted (hybridized) with the immobilized array. The experimental conditions other than the type of array were all the same as in Example 3, and hybridization, washing, and fluorescence were detected. The results are shown in FIG.
The fluorescence signal intensity in the through-hole type biomolecule-immobilized array was compared with the fluorescence signal intensity in the gel carrier biomolecule-immobilized array. The result is shown in FIG. The vertical axis represents the value obtained by dividing the signal intensity of the gel carrier biomolecule-immobilized array by the signal intensity of the through-hole biomolecule-immobilized array for the same probe in both arrays. In all probes, the magnification of the signal intensity of both arrays was 1 or more, and some probes showed 2.5 times or more, confirming a significant increase in signal intensity as a whole.
以上、実施例１〜３の結果から、ゲル担体生体分子固定化アレイを使用することで、ハイブリダイゼーションの単位時間当たりに得られるシグナル強度は、貫通孔型生体分子固定化アレイに比較して有意に向上することが明らかとなった。このことは、本発明のゲル担体生体分子固定化アレイが貫通孔型生体分子固定化アレイと比較して同一のハイブリダイゼーション時間における検出感度が向上したことを示しており、同一感度を得るのに要するハイブリダイゼーション時間が短縮したことを示している。 As described above, from the results of Examples 1 to 3, the signal intensity obtained per unit time of hybridization using the gel carrier biomolecule-immobilized array is significant compared to the through-hole biomolecule-immobilized array. It became clear to improve. This indicates that the gel carrier biomolecule-immobilized array of the present invention has improved detection sensitivity at the same hybridization time as compared with the through-hole type biomolecule-immobilized array. This shows that the required hybridization time has been shortened.
本発明の生体分子固定化アレイは、従来の貫通孔型のアレイに比較して有意に高い検出感度で検体を検出することができる。 The biomolecule-immobilized array of the present invention can detect a specimen with detection sensitivity significantly higher than that of a conventional through-hole type array.
１１・・・・孔
２１・・・・多孔板
３１・・・・中空繊維
４１・・・・板状物
11...
配列番号１〜１２０：合成DNA SEQ ID NOs: 1-120: Synthetic DNA
Claims (8)
(a)担体成形用鋳型の空隙部に、生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填し、該溶液をゲル化する工程、
(b) 前記ゲルを保持した鋳型を基板に配置させる工程、並びに、
(c) 前記基板から鋳型を除去する工程
を含むものである、請求項６に記載の方法。 The step of arranging a carrier made of a hydrophilic gel on which a biomolecule is fixed on a substrate in an addressable state includes the following steps:
(a) a step of filling a gel precursor polymerizable solution containing a biomolecule in the void of the carrier molding template and gelling the solution;
(b) placing the mold holding the gel on a substrate, and
The method of claim 6, comprising (c) removing a template from the substrate.
(a) 複数の中空繊維を、各繊維軸が同一方向となるように三次元に配列及び固定して中空繊維束を製造する工程、
(b) 前記中空繊維の中空部に、生体分子を含有するゲル前駆体重合性溶液を充填し、該溶液をゲル化する工程、
(c) 前記ゲルを保持した中空繊維束を中空繊維の長手方向に直交する方向で切断して薄片を製造し、該薄片を基板に配置させる工程、並びに
(d) 前記基板から、中空繊維束を除去する工程
を含むものである、請求項６に記載の方法。 The step of arranging a carrier made of a hydrophilic gel on which a biomolecule is fixed on a substrate in an addressable state includes the following steps:
(a) A step of producing a hollow fiber bundle by arranging and fixing a plurality of hollow fibers in three dimensions so that each fiber axis is in the same direction,
(b) filling the hollow portion of the hollow fiber with a gel precursor polymerizable solution containing a biomolecule, and gelling the solution;
(c) cutting the hollow fiber bundle holding the gel in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the hollow fiber to produce a flake, and placing the flake on a substrate; and
(d) The method of Claim 6 including the process of removing a hollow fiber bundle from the said board | substrate.
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