JP2007101185A - Gel wherein probe is fixed to at least two kinds of substituted (meth)acrylamide derivative and microarray using it - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、２種類以上の置換（メタ）アクリルアミド誘導体にプローブが固定されたゲル及びそれを用いたマイクロアレイに関する。該マイクロアレイは、遺伝子発現解析等に使用される。 The present invention relates to a gel in which a probe is immobilized on two or more kinds of substituted (meth) acrylamide derivatives and a microarray using the gel. The microarray is used for gene expression analysis and the like.
遺伝子の分析手段として、特定のプローブを使用して所望の遺伝子の変異解析及び発現解析を一括して実施できるDNAマイクロアレイが開発されている。DNAマイクロアレイとしては、例えば、２次元表面上にフォトリソグラフィーを用いてキャプチャープローブを逐次的に合成されたマイクロアレイ（特許文献１）、予め合成されたキャプチャープローブが２次元表面上にスポッティングされたマイクロアレイ（特許文献２）、樹脂板等の基板に複数の溝又は貫通孔が形成され、それらの溝又は穴の内部にDNAを含むゲルが保持されたマイクロアレイ（特許文献３）、平面基盤上にDNA等を含むゲルのスポットが配置されたマイクロアレイ（特許文献４）等が知られている。本発明者らの一部も中空繊維の中空部にゲルを保持した中空繊維配列体を作製し、該配列体の繊維軸と交叉する方向で切断することにより得られるマイクロアレイを開発している（特許文献５）。 As a gene analysis means, a DNA microarray has been developed that can perform mutation analysis and expression analysis of a desired gene in a batch using a specific probe. As the DNA microarray, for example, a microarray in which capture probes are sequentially synthesized on a two-dimensional surface using photolithography (Patent Document 1), or a microarray in which a pre-synthesized capture probe is spotted on a two-dimensional surface ( Patent Document 2), a microarray in which a plurality of grooves or through holes are formed in a substrate such as a resin plate, and a gel containing DNA is held in the grooves or holes (Patent Document 3), DNA or the like on a flat substrate There is known a microarray (Patent Document 4) in which gel spots including A part of the present inventors has also developed a microarray obtained by producing a hollow fiber array in which a gel is held in the hollow part of a hollow fiber and cutting in a direction crossing the fiber axis of the array ( Patent Document 5).
ゲルを使用したマイクロアレイ（特許文献３〜５参照）は、２次元表面にキャプチャープローブが固定されたマイクロアレイに比べて、一区画に固定化できるプローブ量が増加する。よって、ハイブリダイゼーション効率に優れたマイクロアレイといえる。 A microarray using a gel (see Patent Documents 3 to 5) increases the amount of probes that can be immobilized in one section as compared with a microarray in which a capture probe is immobilized on a two-dimensional surface. Therefore, it can be said that the microarray has excellent hybridization efficiency.
上記ゲルマイクロアレイは、検査の対象となる試料（以下、検体）がゲルの多孔質構造中で十分に拡散し、ゲル中のキャプチャープローブと反応することにより、高いハイブリダイゼーション効率が達成できる。しかし、これまでに知られているゲルマイクロアレイでは、ゲルの多孔質構造中を検体が十分に拡散できず、ゲル表面しか検査に使用されていない場合もあった。 The gel microarray can achieve high hybridization efficiency by allowing a sample to be examined (hereinafter referred to as a specimen) to sufficiently diffuse in the porous structure of the gel and react with the capture probe in the gel. However, in the gel microarrays known so far, the specimen cannot be sufficiently diffused in the porous structure of the gel, and there are cases where only the gel surface is used for the inspection.
ゲルの多孔質構造の有効細孔径を大きくし、検体の拡散を向上させる目的で、ゲルを構成するモノマーの種類の検討、モノマー濃度の検討が行われている。例えば、特許文献６には、マイクロアレイに使用する好適なゲルとして、N,N-ジメチルアクリルアミドを２〜７質量％含むゲルを使用することにより、高いハイブリダイゼーション効率を得ることができると記載されている。また、N-イソプロピルアクリルアミドのような感温性ゲルを利用する方法も知られている（非特許文献１）。
しかし、ゲルの濃度を下げて、ゲルの多孔質構造の有効細孔径を大きくする試みは、ゲルの強度が弱くなるため、基板表面や貫通孔にゲルを配置、保持した際、基板表面や貫通孔から脱落するという問題がある。よって、このような解決手段では、検体の拡散の向上及びゲル強度を両立できるゲルを作製することは困難である。また、N-イソプロピルアクリルアミドのようなLCSTを持つホモポリマーを使用する場合、LCST以上の温度で重合した際、重合中に多孔質構造を形成し、不透明なゲルが形成される。このようなゲルは、有効細孔径は大きくなり、検体の拡散速度が速くなるが、例えば蛍光により検体を検出する際に、ゲル内部まで励起光が到達せず、ゲル全体の検体量をすべて検出することが不可能であった。よって、本発明は上記課題を解決したゲル及びそれを用いたマイクロアレイを提供することを目的とする。 However, attempts to lower the gel concentration and increase the effective pore size of the gel porous structure reduce the strength of the gel, so when placing and holding the gel on the substrate surface or through-holes, There is a problem of falling out of the hole. Therefore, with such a solution, it is difficult to produce a gel that can achieve both improved diffusion of the specimen and gel strength. In addition, when a homopolymer having LCST such as N-isopropylacrylamide is used, when polymerized at a temperature higher than LCST, a porous structure is formed during the polymerization, and an opaque gel is formed. Such a gel has a larger effective pore size and a faster specimen diffusion rate, but when detecting the specimen by fluorescence, for example, the excitation light does not reach the inside of the gel, and the entire specimen volume is detected. It was impossible to do. Therefore, an object of this invention is to provide the gel which solved the said subject, and the microarray using the same.
本発明者らは上記問題点を解決するために鋭意検討した結果、少なくとも２種類以上の置換（メタ）アクリルアミド誘導体、架橋剤及びプローブを含むゲル前駆体を共重合して得られるゲルが、ハイブリダイゼーション時にはゲルのネットワーク構造が不均一となり、ゲルのポアサイズが拡大し、且つ検出時にはゲルのネットワークが均一に変化し、透明となることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a gel obtained by copolymerizing a gel precursor containing at least two kinds of substituted (meth) acrylamide derivatives, a crosslinking agent, and a probe is high. The present inventors have found that the gel network structure becomes nonuniform during hybridization, the gel pore size increases, and the gel network changes uniformly and becomes transparent during detection, thereby completing the present invention.
即ち、本発明は、２種類以上の置換（メタ）アクリルアミド誘導体、架橋剤及びプローブを含むゲル前駆体を共重合して得られるゲルである。 That is, the present invention is a gel obtained by copolymerizing a gel precursor containing two or more kinds of substituted (meth) acrylamide derivatives, a crosslinking agent, and a probe.
本発明によれば、ハイブリダイゼーション時には、高いハイブリダイゼーション効率が得られるように、ゲルのネットワーク構造が不均一となりポアサイズが大きくなり、検出時にはネットワークが均一に変化し、透明となるゲル及びマイクロアレイを得ることができる。 According to the present invention, a gel and a microarray are obtained in which the gel network structure is non-uniform and the pore size is large and the network is uniformly changed and transparent during detection so that high hybridization efficiency can be obtained during hybridization. be able to.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明は、２種類以上の置換（メタ）アクリルアミド誘導体、架橋剤及びプローブを含むゲル前駆体を共重合して得られるゲルである。 The present invention is a gel obtained by copolymerizing a gel precursor containing two or more kinds of substituted (meth) acrylamide derivatives, a crosslinking agent and a probe.
本発明において、「プローブ」とは、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、蛋白質、脂質等をいう。これらのプローブは、市販品又は生細胞等から得ることができる。例えば、生細胞からのDNAの抽出は、Blinらの方法（Nucleic Acids Res.3.2303(1976)）等により、また、RNAの抽出は、Favaloroらの方法（Methods.Enzymol.65.718(1980)）等により実施することができる。 In the present invention, “probe” refers to deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), protein, lipid and the like. These probes can be obtained from commercial products or living cells. For example, DNA extraction from living cells is performed by the method of Blin et al. (Nucleic Acids Res.3.2303 (1976)), and RNA extraction is performed by the method of Favaloro et al. (Methods. Enzymol. 65.718 (1980)). Can be implemented.
また、DNAとしては、鎖状若しくは環状のプラスミドDNA又は染色体DNAが用いられる。さらには、制限酵素若しくは化学的に切断したDNA断片、試験管内で酵素等により合成されたDNA又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。 As the DNA, a chain or circular plasmid DNA or chromosomal DNA is used. Furthermore, a restriction enzyme or a chemically cleaved DNA fragment, DNA synthesized by an enzyme or the like in a test tube, or a chemically synthesized oligonucleotide can also be used.
後述するように、プローブは、置換（メタ）アクリルアミド誘導体及び架橋剤との共重合反応により、ゲルの網目構造に固定される。よって、プローブには共重合反応可能な不飽和官能基が導入されている（以下、修飾プローブという）。不飽和官能基としては、（メタ）アクリルアミド基、グリシジル基等が挙げられる。不飽和官能基は、プローブの機能を損なわない限り、いずれの部位に導入されていても良い。たとえば、プローブが核酸の場合、不飽和官能基は核酸の末端、鎖中のいずれに導入されていても良い。核酸の鎖の末端に導入されていることが好ましい。修飾プローブの製造方法に関しては、WO 02/062817に記載のごとく製造することができる。 As will be described later, the probe is fixed to the gel network structure by a copolymerization reaction with a substituted (meth) acrylamide derivative and a crosslinking agent. Therefore, an unsaturated functional group capable of copolymerization reaction is introduced into the probe (hereinafter referred to as a modified probe). Examples of unsaturated functional groups include (meth) acrylamide groups and glycidyl groups. The unsaturated functional group may be introduced at any site as long as the function of the probe is not impaired. For example, when the probe is a nucleic acid, the unsaturated functional group may be introduced either at the end of the nucleic acid or in the chain. It is preferably introduced at the end of the nucleic acid chain. The modified probe can be produced as described in WO 02/062817.
「置換（メタ）アクリルアミド誘導体」とは、一般式Ｉで示される化合物をいう。
［R1及びR2は、水素原子、飽和アルキル基を示す。］
一般式Ｉで示される置換（メタ）アクリルアミド誘導体には、重合することにより、相転移温度（LCST）を持つポリマーと、相転移温度（LCST）を持たないポリマーとに分類できる。
[R 1 and R 2 represent a hydrogen atom or a saturated alkyl group. ]
The substituted (meth) acrylamide derivative represented by the general formula I can be classified into a polymer having a phase transition temperature (LCST) and a polymer having no phase transition temperature (LCST) by polymerization.
置換（メタ）アクリルアミド誘導体の内、ポリマーがLCSTを持つ誘導体としては、例えば、N-エチルアクリルアミド（N-Ethylacrylamide）、N-シクロプロピルアクリルアミド（N-Cyclopropylacrylamide）、N-イソプロピルアクリルアミド（N-isopropylacrylamide、N,N-ジエチルアクリルアミド（N,N-Diethylacrylamide）、N-メチル−N-エチルアクリルアミド（N-Methyl-N-Ethylacrylamide）、N-メチル-N-イソプロピルアクリルアミド（N-Methyl-N-Isopropylacrylamide）、N-メチル-N-n-プロピルアクリルアミド（N-Methyl-N-n-propylacrylamide）等が挙げられる。これらのうち、好ましくは、N-イソプロピルアクリルアミド（N-isopropylacrylamide、N,N-ジエチルアクリルアミド（N,N-Diethylacrylamide）が用いられる。 Among the substituted (meth) acrylamide derivatives, examples of the polymer having LCST include N-Ethylacrylamide, N-Cyclopropylacrylamide, N-isopropylacrylamide, N, N-Diethylacrylamide, N-Methyl-N-Ethylacrylamide, N-Methyl-N-Isopropylacrylamide, N-Methyl-Nn-propylacrylamide, etc. Among these, N-isopropylacrylamide, N, N-diethylacrylamide (N, N-Diethylacrylamide) are preferable. ) Is used.
ポリマーがLCSTを持たない誘導体としては、メタクリルアミド（metacrylamide）、Ｎ−メチルアクリルアミド（Ｎ−methlylacrylamide）、N,N-ジメチルアクリルアミド（N,N-dimethylacrylamide）等が挙げられる。好ましくは、N,N-ジメチルアクリルアミド（N,N-dimethylacrylamide）が用いられる。 Derivatives in which the polymer does not have LCST include methacrylamide, N-methlylacrylamide, N, N-dimethylacrylamide, and the like. Preferably, N, N-dimethylacrylamide is used.
「架橋剤」とは、エチレン性不飽和結合を２個以上持つ多官能性単量体である。例えばN,N’-メチレンビスアクリルアミド、N,N’-ジアリル（1,2-ヒドロキシエチレン）−ビスアクリルアミド、N,N’-シスタミン−ビスアクリルアミド、N-アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ポリエチレングリコールジメタクリレート等である。好ましくはN,N’-メチレンビスアクリルアミドが用いられる。 The “crosslinking agent” is a polyfunctional monomer having two or more ethylenically unsaturated bonds. For example, N, N'-methylenebisacrylamide, N, N'-diallyl (1,2-hydroxyethylene) -bisacrylamide, N, N'-cystamine-bisacrylamide, N-acryloyltris (hydroxymethyl) aminomethane, polyethylene Glycol dimethacrylate and the like. N, N'-methylenebisacrylamide is preferably used.
次に共重合反応について説明する。 Next, the copolymerization reaction will be described.
ポリマーがLCSTを持つ置換（メタ）アクリルアミド誘導体と、LCSTを持たない置換（メタ）アクリルアミド誘導体は、モノマーのモル比で2:8〜5:5の範囲とし、上述の修飾プローブ及び架橋剤と共に共重合することが好ましい。LCSTを持つ誘導体のモル比が２以下になると、感温性を示さず、ハイブリダイゼーション時にゲルのネットワークが不均一にならないため、ネットワークのポアサイズが拡大できない。 The substituted (meth) acrylamide derivative in which the polymer has LCST and the substituted (meth) acrylamide derivative that does not have LCST should be in the range of 2: 8 to 5: 5 in terms of the molar ratio of monomers, and can be used together with the above-described modified probe and crosslinking agent. Polymerization is preferred. When the molar ratio of the derivative having LCST is 2 or less, temperature sensitivity is not exhibited, and the gel network does not become nonuniform during hybridization, so the pore size of the network cannot be increased.
また、LCSTを持つ誘導体のモル比が５以上になると、LCST以上の温度での重合では、重合時に相分離をしながらゲルが形成、ネットワークが保持された不透明なゲルとなり、検出時に透明なゲルに変化することができない。 In addition, when the molar ratio of the derivative with LCST is 5 or more, polymerization at a temperature above LCST forms a gel while phase-separating at the time of polymerization and becomes an opaque gel with a retained network. Can't change.
共重合反応の際に使用する修飾プローブは、ポリマーがLCSTを持つ置換（メタ）アクリルアミド誘導体と、LCSTを持たない置換（メタ）アクリルアミド誘導体両者のトータルモル数に対して1/10以下が好ましい。 The modified probe used in the copolymerization reaction is preferably 1/10 or less relative to the total number of moles of both the substituted (meth) acrylamide derivative having LCST and the substituted (meth) acrylamide derivative not having LCST.
共重合反応に使用する架橋剤の量は、置換（メタ）アクリルアミド誘導体のモノマーの和に対し、モル比で８:２〜５００：１の範囲で添加するのが好ましい。 The amount of the crosslinking agent used for the copolymerization reaction is preferably added in a molar ratio of 8: 2 to 500: 1 with respect to the sum of the monomers of the substituted (meth) acrylamide derivative.
架橋剤のモル比が８：２より大きくなるとゲルネットワークが不均一化し、白濁が生じやすい。一方モル比が５００：１以下になるとゲルとしての構造が保てなくなってしまう。 When the molar ratio of the crosslinking agent is larger than 8: 2, the gel network becomes non-uniform and white turbidity is likely to occur. On the other hand, when the molar ratio is 500: 1 or less, the gel structure cannot be maintained.
重合開始剤は、重合反応の際にキャプチャープローブの分解が生じないものであればいずれも選択できる。好ましい開始剤は、2,2’-アゾビス〔2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン〕ジハイドロクロライド、ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）、ＫＰＳ（過硫酸カリウム）等である。また開始剤としてＡＰＳまたはＫＰＳを用いた場合、重合促進剤としてＴＥＭＥＤ（テトラメチレンジアミン）を使用することも可能である。 Any polymerization initiator can be selected as long as it does not cause degradation of the capture probe during the polymerization reaction. Preferred initiators are 2,2'-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride, APS (ammonium persulfate), KPS (potassium persulfate), and the like. When APS or KPS is used as an initiator, TEMED (tetramethylenediamine) can be used as a polymerization accelerator.
重合温度はアゾ系の開始剤を用いた場合には４０℃以上が好ましい。またＡＰＳ、ＫＰＳを単独で用いた場合には５０℃以上が好ましい。ＡＰＳ、ＫＰＳにＴＥＭＥＤを使用した場合には室温から３０℃の範囲での重合が好ましい。 The polymerization temperature is preferably 40 ° C. or higher when an azo initiator is used. Moreover, when APS and KPS are used independently, 50 degreeC or more is preferable. When TEMED is used for APS and KPS, polymerization in the range of room temperature to 30 ° C. is preferred.
上記共重合反応により形成されるゲル中のポリマー濃度は、2〜７質量％の範囲が好ましい。また、なお、上記反応で作成したゲルは、５５℃における重合でも重合中に相分離せず透明である。ここで透明とは可視光における透過度が７０％以上のものをいう。 The polymer concentration in the gel formed by the copolymerization reaction is preferably in the range of 2 to 7% by mass. In addition, the gel prepared by the above reaction is transparent without phase separation even during polymerization at 55 ° C. Here, the term “transparent” means that the transmittance in visible light is 70% or more.
このように作製されたゲルは、キャプチャープローブを保持するゲルとして、遺伝子解析のツールとして使用される。例えば、上述のゲルを管状体の中空部に充填することによりゲル保持管状体が作製できる。その管状体は特開平3-47097号公報に記載のごとく、遺伝子変異のツールとして使用できる。中空部へのゲルの保持は、キャピラリーゲル電気泳動に使用されるキャピラリーカラムを作製する要領で実施可能である。 The gel thus prepared is used as a gene analysis tool as a gel holding a capture probe. For example, a gel-holding tubular body can be produced by filling the hollow portion of the tubular body with the gel described above. The tubular body can be used as a gene mutation tool as described in JP-A-3-47097. The retention of the gel in the hollow part can be carried out in the manner of producing a capillary column used for capillary gel electrophoresis.
また、マイクロアレイの構成部材としても使用できる。例えば、平面基板上に重合前又は重合開始直後のプローブを含むモノマー溶液を、予め定めた区画にスポッティングすることによりマイクロアレイを製造することができる（特表平6-507486号、USP 5,770,721号公報参照）。区画が溝又は貫通穴により形成されている場合、それら溝又は貫通穴に、重合前又は重合開始直後のプローブを含むモノマー溶液を添加し、区画内で重合反応を実施することによりマイクロアレイを作製することができる（特開2000-60554号公報参照）。 It can also be used as a component of a microarray. For example, a microarray can be produced by spotting a monomer solution containing a probe before polymerization or immediately after the start of polymerization on a flat substrate in a predetermined section (see JP 6-507486, USP 5,770,721). ). When the compartment is formed by a groove or a through hole, a monomer solution containing a probe before polymerization or immediately after the start of polymerization is added to the groove or the through hole, and a polymerization reaction is performed in the compartment to produce a microarray. (See JP 2000-60554 A).
さらには、プローブ固定化ゲルを保持した管状体を複数本、集束し、該集束物を管状体の長手方向に対して交叉する方向で切断を繰り返すことにより、マイクロアレイを作製することができる（WO 00/53736号公報参照）。複数の管状体を集束した後、集束物の各中空部にゲルを保持しても良い。その場合、以下の（１）〜（３）の工程を順次行うことによりマイクロアレイが製造できる。 Furthermore, a plurality of tubular bodies holding the probe-immobilized gel are converged, and the microarray can be produced by repeating cutting in a direction intersecting the longitudinal direction of the tubular body (WO) 00/53736). After converging a plurality of tubular bodies, the gel may be held in each hollow part of the converging object. In that case, the microarray can be manufactured by sequentially performing the following steps (1) to (3).
（１） 複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程。 (1) A step of converging a plurality of tubular bodies so that their longitudinal directions coincide.
（２） 集束物の各管状体の中空部に、置換（メタ）アクリルアミド誘導体、架橋剤及びプローブを含む溶液を充填する工程。 (2) A step of filling a hollow portion of each tubular body of the converged product with a solution containing a substituted (meth) acrylamide derivative, a crosslinking agent, and a probe.
（３） 中空部内で４０℃以上の重合温度で共重合反応する工程。 (3) A step of carrying out a copolymerization reaction at a polymerization temperature of 40 ° C. or higher in the hollow part.
（４） 集束物の長手方向と交叉する方向で切断する工程。 (4) A step of cutting in a direction intersecting with the longitudinal direction of the convergent object.
管状体としては、ガラス管、ステンレス管、中空繊維等が例示できる。加工性、取り扱いの容易さを考慮すると中空繊維を使用することが好ましい。 Examples of the tubular body include a glass tube, a stainless tube, and a hollow fiber. In view of processability and ease of handling, it is preferable to use hollow fibers.
従来の固定化ゲルでは、ハイブリダイゼーションの効率を高くするためには、ゲルの濃度を下げて網目の有効細孔径を大きくしなければならなかった。このためゲル強度が不十分となり、高いハイブリダイゼーション効率を得ることは困難であった。しかし、本発明のゲルは、従来のゲルと異なり、ハイブリダイゼーション時にはゲルの感温性により、ネットワークが不均一となり、ポアサイズが拡大し（網目の有効細孔径が大きくなり）、ハイブリダイゼーション効率が高くなる。更に、検出時にはゲルのネットワークが均一に変化し、透明なゲルに変化し、蛍光検出の際の励起光をゲル全体に透過させることが可能である。 In the conventional immobilized gel, in order to increase the efficiency of hybridization, it was necessary to reduce the gel concentration to increase the effective pore size of the network. For this reason, the gel strength was insufficient, and it was difficult to obtain high hybridization efficiency. However, unlike the conventional gel, the gel of the present invention has a heterogeneous network due to the temperature sensitivity of the gel, the pore size is enlarged (the effective pore size of the mesh is increased), and the hybridization efficiency is high. Become. Furthermore, the gel network changes uniformly during detection, changes to a transparent gel, and excitation light during fluorescence detection can be transmitted through the entire gel.
以下、実施例で実施形態の詳細について説明する。 Hereinafter, details of the embodiment will be described in Examples.
＜実施例１＞
１．ＤＮＡマイクロアレイの製造
（１）プローブの調製
プローブとして、核酸の5‘末端をビニル化した核酸（６５mer）を用いた（核酸Ａ、Ｂ、Ｃ）。これら核酸は、以下の方法により合成した。
<Example 1>
1. Manufacture of DNA microarray (1) Preparation of probe A nucleic acid (65mer) in which the 5 'end of a nucleic acid was vinylated was used as a probe (nucleic acid A, B, C). These nucleic acids were synthesized by the following method.
まず、オリゴヌクレオチドをＤＮＡ自動合成装置により合成した。合成の際、最終段階で、アミノリンクＴＭ（ＰＥバイオシステムズ社製）を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された5’-O-アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、5’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製した。 First, oligonucleotides were synthesized by an automatic DNA synthesizer. In the final stage of synthesis, aminolink TM (manufactured by PE Biosystems) was reacted with the oligonucleotide and then subjected to deprotection, whereby an aminohexyl group was introduced at the end of each oligonucleotide. -O-aminohexyl oligonucleotide was prepared. Next, these oligonucleotides were reacted with methacrylic anhydride to prepare 5′-terminal vinylated oligonucleotides.
（２）中空繊維束の作製
図１に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致する。
(2) Production of Hollow Fiber Bundle A hollow fiber bundle was produced using the array fixture shown in FIG. In the figure, x, y, and z are orthogonal three-dimensional axes, and the x-axis coincides with the longitudinal direction of the fiber.
まず、直径０．３２ｍｍの孔（５２）が、孔の中心間距離を０．４２ｍｍとして、縦横各１０列で合計１００個設けられた厚さ０．１ｍｍの多孔板（５０）２枚を準備した。これらの多孔板（５０）を重ね合わせて、そのすべての孔（５２）に、ポリカーボネート中空繊維（５４）（三菱エンジニアリングプラスチック社製 カーボンブラック1質量％添加）を１本づつ、通過させた。 First, two perforated plates (50) having a thickness of 0.32 mm and a total of 100 perforated plates (50) each having 10 rows in the vertical and horizontal directions, each having a center distance of 0.42 mm, were prepared. did. These perforated plates (50) were overlapped, and polycarbonate hollow fibers (54) (added by 1% by mass of carbon black manufactured by Mitsubishi Engineering Plastics) were passed through all the holes (52) one by one.
Ｘ軸方向に各繊維に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板の位置を移動させて、中空繊維の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板の間隔を８０ｍｍとした。次いで、多孔板間の空間の周囲３面を板状物（５６）で囲った。このようにして上部のみが開口状態にある容器を得た。次に、この容器の上部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、2.5質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５℃で１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで多孔板と板状物を取り除き、中空繊維束を得た。 The position of the two perforated plates was moved in a state in which a tension of 0.1 N was applied to each fiber in the X-axis direction, and was fixed at two positions of 20 mm and 100 mm from one end of the hollow fiber. . That is, the interval between the two perforated plates was 80 mm. Next, the three surrounding surfaces of the space between the perforated plates were surrounded by a plate-like object (56). In this way, a container having an open top only was obtained. Next, the resin raw material was poured into the container from the upper part of the container. As resin, what added 2.5 mass% carbon black was used with respect to the total weight of polyurethane resin adhesives (Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd., Nippon-Poran 4276, Coronate 4403). The resin was cured by standing at 25 ° C. for 1 week. Next, the porous plate and the plate-like material were removed to obtain a hollow fiber bundle.
（３）ゲル充填中空繊維配列体の製造
表１に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液（１、２、３）を調製した。
次に、プローブ核酸（Ａ，Ｂ，Ｃ）を含むゲル前駆体重合性溶液（１〜３）をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液（１〜３）を導入した。次いで、容器内を70℃とし、３時間かけて重合反応を行った。このようにしてプローブ核酸がゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束を得た。 Next, gel precursor polymerizable solutions (1-3) containing probe nucleic acids (A, B, C) were placed in a desiccator. After reducing the pressure inside the desiccator, one end of the hollow fiber bundle where the fiber bundle was not fixed was immersed in this solution. Nitrogen gas was sealed in a desiccator, and gel precursor polymerizable solutions (1 to 3) containing a capture probe were introduced into the hollow portion of the hollow fiber. Subsequently, the inside of a container was 70 degreeC and the polymerization reaction was performed over 3 hours. In this way, a hollow fiber bundle in which the probe nucleic acid was held in the hollow portion of the hollow fiber via a gel-like material was obtained.
次に、得られた中空繊維束を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．２５ｍｍの薄片シート（ＤＮＡマイクロアレイ）を５０枚得た。 Next, the obtained hollow fiber bundle was sliced in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the fiber using a microtome to obtain 50 thin sheet sheets (DNA microarray) having a thickness of 0.25 mm.
２．標識ラベル化ｃＤＮＡ溶液（検体液）の調製
次にハイブリダイゼーションに用いる標的核酸分子を含む、検体液の調製を以下の手順に従って行った。なお、本手順はマイクロアレイ１枚に対する調製量である。
2. Preparation of labeled labeled cDNA solution (sample solution) Next, a sample solution containing a target nucleic acid molecule used for hybridization was prepared according to the following procedure. This procedure is the amount prepared for one microarray.
まず、２００μｌのマイクロチューブに表２に示す成分を加え、７０℃で５分間静置した。
更に以下の表３に示す成分を順次加え、４２℃で５０分間、次いで７０℃で更に５分間静置した。
上記の試薬は、Atlas TM Power Script TM Fluorescent Labelimg Kit (Clontech #K1860-1)［ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製］に包含されているものを使用した。 The reagent contained in the Atlas ™ Power Script ™ Fluorescent Labelimg Kit (Clontech # K1860-1) [manufactured by Becton Dickinson & Company] was used.
次に０．５μｌのＲｎａｓｅＨを更に加え３７℃で１５分間静置した。次に０．５μｌの０．５M ＥＤＴＡ、２μｌのQick Clean Resin を加え、Voltexで１分間処理した後、２２um Spin-Filterに入れて、遠心分離機で処理した（14000RPM、１分間）。 Next, 0.5 μl of RnaseH was further added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 15 minutes. Next, 0.5 μl of 0.5 M EDTA and 2 μl of Qick Clean Resin were added and treated with Voltex for 1 minute, then placed in a 22 um Spin-Filter and treated with a centrifuge (14000 RPM, 1 minute).
次に処理後の通過液分をエタノール沈殿処理して、沈殿物を２×Fluorecent labeling Buffer １０μｌに溶解した後、Cy３ Monofunctional reactive dye （アマシャムバイオサイエンス社製）１０μｌを加えて３０分間静置した。 Next, the treated solution was subjected to ethanol precipitation, and the precipitate was dissolved in 10 μl of 2 × Fluorecent labeling Buffer. Then, 10 μl of Cy3 Monofunctional reactive dye (Amersham Biosciences) was added and left for 30 minutes.
次にQlAquick PCR purification Kit (QIAGEN #28104) ［キアゲン社製］で精製し、エタノール沈殿濃縮した後、水で希釈して、２０μｌの蛍光標識ラベル化ｃＤＮＡ溶液（検体液）を得た。 Next, it was purified with QlAquick PCR purification Kit (QIAGEN # 28104) [Qiagen Co., Ltd.], concentrated by ethanol precipitation, and diluted with water to obtain 20 μl of a fluorescently labeled labeled cDNA solution (specimen solution).
なお、Quick Clean Resin、Spin-Filter、2×Fluorescent labeling bufferは、Atlas TM Power Script TM Fluorescent Labelimg Kit (Clontech #K1860-1)［ベクトン、ディッキンソンアンドカンパニー社製］に包含されているものを使用した。 The Quick Clean Resin, Spin-Filter, and 2 × Fluorescent labeling buffer included in Atlas ™ Power Script ™ Fluorescent Labelimg Kit (Clontech # K1860-1) [Becton, manufactured by Dickinson & Company] were used. .
３．ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション
次にDNAマイクロアレイを、以下の手順でハイブリダイゼーション操作を行った。まず、表４に示す組成のハイブリ液を調製した。
次いで調製した溶液を94℃で2分間加熱した後、37℃まで冷却し、ハイブリ液とした。次にハイブリパックを用意し、上記で調製したハイブリ液（１００μｌ）およびＤＮＡマイクロアレイ1枚をパックに入れ、熱融着でシールし、密封した。このハイブリパックをインキュベーター内に入れ、６５℃で１7時間ハイブリダイゼーション反応を行った。 Next, the prepared solution was heated at 94 ° C. for 2 minutes and then cooled to 37 ° C. to obtain a hybrid solution. Next, a hybrid pack was prepared, and the above-prepared hybrid solution (100 μl) and one DNA microarray were put into the pack, sealed by heat sealing, and sealed. This hybrid pack was placed in an incubator and subjected to a hybridization reaction at 65 ° C. for 17 hours.
４．ハイブリダイゼーション反応後の洗浄操作
まず、洗浄バッファー液として、2×SSC/0.2％ SDS溶液20mlを２セットおよび2×SSC溶液20mlを１セット円筒ケースにそれぞれ入れ、45℃に設定した恒温槽に入れ、45℃に保温しておいた。次にインキュベーターからハイブリパックを取り出し、マイクロアレイを取り出し、先の操作であらかじめ45℃にしておいた2×SSC・0.2％ SDS溶液20mlの入った円筒ケースに浸漬させ、45℃に保温して20分間静置した。次に、45℃にしておいた新たな2×SSC・0.2％ SDS溶液20mlの入った円筒ケースに入れ替えて、さらに45℃で20分間静置した。
4). Washing operation after hybridization reaction First, 2 sets of 2 x SSC / 0.2% SDS solution and 20 ml of 2 x SSC solution were placed in a cylindrical case as washing buffer solutions, and placed in a thermostat set at 45 ° C. And kept at 45 ° C. Next, the hybrid pack is taken out from the incubator, the microarray is taken out, and immersed in a cylindrical case containing 20 ml of 2 × SSC / 0.2% SDS solution previously brought to 45 ° C. by the previous operation, and kept at 45 ° C. for 20 minutes. Left to stand. Next, the tube was replaced with a new cylindrical case containing 20 ml of 2 × SSC / 0.2% SDS solution that had been kept at 45 ° C., and the mixture was further allowed to stand at 45 ° C. for 20 minutes.
最後に、45℃にしておいた2×SSC溶液20mlの入った円筒ケースに入れ替えて、45℃で10分間静置した。 Finally, it was replaced with a cylindrical case containing 20 ml of 2 × SSC solution that had been kept at 45 ° C., and allowed to stand at 45 ° C. for 10 minutes.
５．ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションシグナルの検出
洗浄を施したマイクロアレイを、水を入れたシャーレに完全に浸漬させて、固定し、冷却ＣＣＤカメラ蛍光顕微鏡でハイブリダイゼーションシグナルを検出した。
5. Detection of hybridization signal of DNA microarray The microarray subjected to washing was completely immersed in a petri dish containing water and fixed, and the hybridization signal was detected with a cooled CCD camera fluorescence microscope.
ハイブリダイゼーションの結果（Ｃｙ５シグナル強度）を表５に示す。
核酸Ａ，Ｂ，Ｃ全てにおいて重合液２（ＤＭＡＡｍ：ＮＩＰＡＭ＝７０：３０）が重合液１（ＤＭＡＡｍ：ＮＩＰＡＭ＝１００：０）に比較してシグナル強度が高くなった。 In all of the nucleic acids A, B, and C, the signal strength of the polymerization solution 2 (DMAAm: NIPAM = 70: 30) was higher than that of the polymerization solution 1 (DMAAm: NIPAM = 100: 0).
なお、重合液３で作成したゲルは室温状態でも白濁し、さらに温度を上げても感温性を示さなかった。よって、ハイブリダイゼーションの結果、有効なシグナルが観測できなかった。 The gel prepared with the polymerization solution 3 became cloudy even at room temperature and did not show temperature sensitivity even when the temperature was raised. Therefore, an effective signal could not be observed as a result of hybridization.
５０ 多孔板
５２ 孔
５４ 中空繊維
５６ 板状物
50 perforated plate 52
Claims (8)
（１） 複数本の管状体をそれらの長手方向が一致するように集束する工程。
（２） 集束物の各管状体の中空部に、２種類以上の置換（メタ）アクリルアミド誘導体、架橋剤及びプローブを含むゲル前駆体溶液を充填し、中空部内で４０℃以上の重合温度で共重合反応する工程。
（３） 集束物の長手方向と交叉する方向で切断する工程。 A manufacturing method of a microarray including the following steps in sequence.
(1) A step of converging a plurality of tubular bodies so that their longitudinal directions coincide.
(2) Fill the hollow part of each tubular body of the converging product with a gel precursor solution containing two or more kinds of substituted (meth) acrylamide derivatives, a crosslinking agent and a probe, and co-polymerize at a polymerization temperature of 40 ° C. or higher in the hollow part. A process of polymerization reaction.
(3) A step of cutting in a direction crossing the longitudinal direction of the convergent object.
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