JP4359670B2 - Freezing tool - Google Patents
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Description
本発明は、卵子、胚や組織細胞などの生物学的標本を凍結保存する際に使用する凍結用具に関する。 The present invention relates to a freezing tool used when cryopreserving a biological specimen such as an egg, embryo or tissue cell.
産業として確立している牛の胚移植技術に用いられる胚は、受胚牛の発情周期に合わせて移植を行うのが一般的である。そのため、生産した胚を液体窒素である凍結物質の中で一定期間保存することが必要である。このような生物標本の生存性を維持したまま長期間保存する方法として、低温での凍結保存法が多く利用されている。 Embryos used for bovine embryo transfer technology, which has been established as an industry, are generally transferred in accordance with the estrous cycle of the recipient cow. Therefore, it is necessary to store the produced embryo in a frozen substance that is liquid nitrogen for a certain period of time. As a method for storing such a biological specimen for a long period of time while maintaining the viability, a cryopreservation method at a low temperature is often used.
凍結保存の従来法としては、保存液を氷結させて細胞内の自由水を脱水しながらゆっくりと冷却する緩慢冷却法と、高濃度耐凍剤を含んだ保存液を超急速に冷却してガラス化状に固化させることにより、種々の生物標本を高い生存性を維持したまま長期間保存することが可能なガラス化法とが知られている。 Conventional methods for cryopreservation include slow cooling, which freezes the preservation solution and slowly cools the free water in the cell while dehydrating it, and ultra-rapidly cools the preservation solution containing high-concentration antifreeze to vitrify it. There is known a vitrification method in which various biological specimens can be stored for a long period of time while maintaining high viability by solidifying into a shape.
例えば、特許文献１には、生物学的標本を移動用器具に置いて、この移動用器具を直接凍結物質の中に置くことにより、生物学的標本を直接凍結物質に暴露し、ガラス化することが記載されている。また、移動用器具として、ループ、ネットおよびヘラからなる群から選択すること、好ましくはループであることが記載されている。なお、ヘラについての詳細な記載はない。
For example, in
また、特許文献２には、ガラス化に用いる用具として、耐寒性材料により形成された本体部と、本体部の一端に取り付けられ、可撓性かつ透明性かつ液体窒素耐性材料により形成された卵付着保持用ストリップと、卵付着保持用ストリップを被包可能に本体部に着脱自在に取り付けられる一端が封鎖され、かつ耐寒性材料により形成された筒状部材からなる卵凍結保存用具が記載されている。卵付着保持用ストリップは、本体部の一端の円柱状部の先端に形成された軸方向に延びる凹部に、真っ直ぐに取り付けられている。
緩慢冷却法により牛胚を凍結すると、胚が凍結により障害を受けてしまうため、胚移植の融解時に生存率の減少が見られる。特に、体外受精胚は、従来の凍結による悪影響の感受性が高く、融解後７２時間後の生存率が７０％に達しない。そのため、移植後の受胎率も自ずと低い傾向にある。 When freezing bovine embryos by slow cooling, the embryos are damaged by freezing, so there is a decrease in survival rate when the embryo transfer is thawed. In particular, in vitro fertilized embryos are highly susceptible to the adverse effects of conventional freezing, and the survival rate after 72 hours after thawing does not reach 70%. Therefore, the conception rate after transplantation tends to be low.
そこで、別の保存法として高濃度耐凍剤を用いたガラス化法が考案され、牛胚移植技術においても、卵子および胚のガラス化技術が実験レベルで利用されているのであるが、商業レベルで利用するためには、ガラス化の費用が高いという問題がある。 Therefore, a vitrification method using a high-concentration antifreeze was devised as another preservation method, and in the embryo transfer technology, the vitrification technology of eggs and embryos is used at the experimental level, but at the commercial level. In order to use it, there is a problem that the cost of vitrification is high.
また、特許文献２に記載の用具にあっては、卵付着保持用ストリップが、本体部の一端の円柱状部の先端に真っ直ぐに取り付けられているため、本体部を手で保持して卵付着保持用ストリップの先端部を液体窒素に浸漬する際、この卵付着保持用ストリップの先端に付着させた卵子およびガラス化液が安定しにくい。
In addition, in the tool described in
そこで、本発明においては、標本の長期保存において融解後の標本の生存性を維持しつつ、保存作業を確実かつ簡便に行うことが可能な凍結用具を提供することを目的とする。 Therefore, an object of the present invention is to provide a freezing tool that can perform the preservation work reliably and easily while maintaining the viability of the specimen after thawing in the long-term preservation of the specimen.
本発明の凍結用具は、卵子、胚や細胞組織などの生物学的標本を凍結液で包被して一端に保持し、凍結物質の中に浸漬することによりガラス化するための凍結用具であって、直線糸状の本体部と、この本体部の一端に勾配を設けて形成された平面状の保持部とを備えたものである。 The freezing tool of the present invention is a freezing tool for vitrifying a biological specimen such as an egg, embryo or cell tissue with a freezing solution, holding it at one end, and immersing it in a frozen substance. In addition, a linear thread-like main body portion and a planar holding portion formed with a gradient at one end of the main body portion are provided.
本発明の凍結用具では、本体部の一端に平面状の保持部が勾配を設けて形成されているため、この平面状の保持部の平面が略水平となるように本体部を斜め下向きに保持した状態を維持したまま、平面状の保持部の上面に凍結液で包被した生物学的標本を滴下して保持し、凍結物質の中へ浸漬することにより、生物学的標本のガラス化を行うことができる。 In the freezing tool of the present invention, since the flat holding portion is formed at one end of the main body portion with a gradient, the main body portion is held obliquely downward so that the plane of the flat holding portion is substantially horizontal. The biological specimen encapsulated with the freezing solution is dropped on the upper surface of the flat holding part, and is immersed in the frozen substance to keep the biological specimen vitrified. It can be carried out.
ここで、平面状の保持部の本体部に対する勾配は、２０〜４０°とするのが望ましい。この範囲とすることで、凍結液で包被した生物学的標本の滴下および保持並びに凍結物質の中への浸漬時の作業性を維持しつつ、凍結用具全体の幅を小さくすることができる。勾配が２０°より小さい場合、保持部の平面を略水平とするためには本体部を水平に近く保持することになり、生物学的標本および凍結液の重量によってこれらの滴下時および保持時に本体部が斜めになってしまい、保持部の平面を略水平に維持するのが困難となることがある。一方、勾配が４０°より大きい場合、保持部の平面を略水平とするためには本体部を垂直に近く保持することになり、顕微鏡下で生物学的標本および凍結液の滴下および保持を行う場合に、顕微鏡に干渉してしまい、これらの作業が困難となることがある。 Here, the gradient of the planar holding portion with respect to the main body is preferably 20 to 40 °. By setting this range, it is possible to reduce the width of the entire freezing tool while maintaining the workability at the time of dripping and holding the biological specimen encapsulated with the frozen liquid and immersing in the frozen substance. When the gradient is smaller than 20 °, the main body portion is held almost horizontal in order to make the plane of the holding portion substantially horizontal, and the main body at the time of dripping and holding due to the weight of the biological specimen and the frozen liquid. The part may be inclined, and it may be difficult to maintain the plane of the holding part substantially horizontal. On the other hand, when the gradient is larger than 40 °, the main body portion is held close to the vertical in order to make the plane of the holding portion substantially horizontal, and the biological specimen and the frozen liquid are dropped and held under the microscope. In some cases, it may interfere with the microscope, making these operations difficult.
また、本発明の凍結用具は、本体部の他端に磁力により引き寄せ可能な磁性体材料を備えたものとするのが望ましい。これにより、ガラス化後、凍結用具ごとそのまま細い標本保存筒内に入れて冷凍保存した生物学的標本を、この細い標本保存筒から取り出す際、磁力によって本体部の他端を引き寄せて容易に取り出すことができる。 In addition, the freezing tool of the present invention is preferably provided with a magnetic material that can be attracted by a magnetic force at the other end of the main body. Thereby, after vitrification, when the biological specimen frozen and stored in the thin specimen storage cylinder as it is with the freezing tool is taken out from the thin specimen storage cylinder, the other end of the main body portion is pulled by the magnetic force and easily removed. be able to.
また、この本体部の他端は、着色したものとするのが望ましい。これにより、ガラス化後、凍結用具ごとそのまま細い標本保存筒内に入れて冷凍保存した生物学的標本を、この着色によって識別することができる。 The other end of the main body is preferably colored. Thereby, after vitrification, a biological specimen that has been frozen and stored in a thin specimen storage cylinder together with the freezing tool can be identified by this coloring.
また、本体部および保持部は、有色透明とするのが望ましい。これにより、本体部および保持部が光を透過するため、凍結液で包被した生物学的標本をそのまま顕微鏡で確認することができるとともに、有色であることから、凍結物質の中に浸漬した際、凍結物質内で凍結用具を容易に視認することができる。 Further, it is desirable that the main body part and the holding part be colored and transparent. As a result, since the main body and the holding part transmit light, the biological specimen encapsulated with the frozen liquid can be confirmed as it is with a microscope, and since it is colored, when immersed in a frozen substance, The freezing tool can be easily visually recognized in the frozen substance.
また、本体部は、ポリアミド繊維製の糸とするのが望ましい。本体部がポリアミド繊維製の糸であれば、−１９０〜−２００℃の凍結物質内に浸漬されても、可撓性を保持することができる。 Further, it is desirable that the main body is a polyamide fiber yarn. If the main body portion is a polyamide fiber yarn, flexibility can be maintained even when immersed in a frozen material at -190 to -200 ° C.
（１）直線糸状の本体部と、この本体部の一端に勾配を設けて形成された平面状の保持部とを備えたことにより、平面状の保持部の平面が略水平となるように本体部を斜め下向きに保持した状態を維持したまま、平面状の保持部の上面に凍結液で包被した生物学的標本を滴下して保持し、凍結物質の中へ浸漬することができる。これにより、ガラス化法による保存作業を確実かつ簡便に行うことができ、標本を高い生存性を維持したまま凍結保存することができる。また、保持部の上面に滴下した生物学的標本を含む凍結液が本体部と保持部との境界で堰き止められるため、少ない凍結液で確実に生物学的標本を包被することができる。さらに、この凍結用具は、主に直線糸状の本体部と、この本体部の一端に勾配を設けて形成された平面状の保持部とから構成され、簡単な構造であることから、安価に提供でき、ガラス化の費用を低廉とすることができる。 (1) By providing a linear thread-shaped main body portion and a planar holding portion formed with a gradient at one end of the main body portion, the main body so that the plane of the planar holding portion is substantially horizontal. While maintaining the state in which the part is held obliquely downward, the biological specimen encapsulated with the frozen liquid can be dropped and held on the upper surface of the planar holding part, and immersed in the frozen substance. Thereby, the preservation | save operation | work by vitrification method can be performed reliably and simply, and a specimen can be cryopreserved, maintaining high viability. Moreover, since the frozen liquid containing the biological specimen dripped onto the upper surface of the holding section is blocked at the boundary between the main body section and the holding section, the biological specimen can be reliably encapsulated with a small amount of frozen liquid. Furthermore, this freezing tool is mainly composed of a linear thread-shaped main body part and a planar holding part formed with a gradient at one end of the main body part, and is provided at low cost because of its simple structure. The cost of vitrification can be reduced.
（２）勾配を２０〜４０°とすることで、凍結液で包被した生物学的標本の滴下および保持並びに凍結物質の中への浸漬時の作業性を維持しつつ、凍結用具全体の幅を小さくすることができるため、細い標本保存筒からの出し入れ作業も容易となる。 (2) By setting the gradient to 20 to 40 °, the width of the entire freezing tool while maintaining the workability when dipping and holding the biological specimen encapsulated with the frozen liquid and immersing in the frozen substance Therefore, it is possible to easily take in and out the thin specimen storage cylinder.
（３）本体部の他端に磁力により引き寄せ可能な磁性体材料を備えたことにより、ガラス化後、凍結用具ごとそのまま細い標本保存筒内に入れて冷凍保存した生物学的標本を、この細い標本保存筒から取り出す際、磁力によって本体部の他端を引き寄せて容易に取り出すことができる。 (3) By providing a magnetic material that can be attracted by a magnetic force at the other end of the main body, a biological specimen that has been frozen and stored in a thin specimen storage cylinder together with the freezing tool after vitrification When taking out from the specimen storage cylinder, the other end of the main body can be pulled out easily by magnetic force.
（４）本体部の他端を着色したことにより、ガラス化後、凍結用具ごとそのまま細い標本保存筒内に入れて冷凍保存した生物学的標本を、着色によって識別することができ、生物学的標本を容易に管理することが可能となる。 (4) By coloring the other end of the main body, it is possible to identify biological specimens that have been frozen and stored in a thin specimen storage cylinder together with the freezing tool after vitrification, The specimen can be easily managed.
（５）本体部および保持部が、有色透明であることにより、凍結液で包被した生物学的標本をそのまま顕微鏡で確認することができるとともに、有色であることから、凍結物質の中に浸漬した際、凍結物質内で凍結用具を容易に視認することができ、作業性が向上する。 (5) Since the main body part and the holding part are colored and transparent, the biological specimen encapsulated with the frozen liquid can be confirmed as it is with a microscope, and since it is colored, it is immersed in a frozen substance. In this case, the freezing tool can be easily visually recognized in the frozen substance, and workability is improved.
（６）本体部が、ポリアミド繊維製の糸であることにより、−１９０〜−２００℃の凍結物質内に浸漬されても、可撓性を保持することができるため、本体部に加わる力が保持部に保持された生物学的標本および凍結液に伝わることがなく、生物学的標本を損傷することがない。 (6) Since the main body portion is a polyamide fiber yarn, flexibility can be maintained even when immersed in a frozen material at −190 to −200 ° C., so that the force applied to the main body portion is increased. The biological specimen and the frozen liquid held in the holding portion are not transmitted to the biological specimen, and the biological specimen is not damaged.
図１は本発明の実施の形態における凍結用具１を示す図であって、（ａ）は側面図、（ｂ）は平面図、（ｃ）は凍結液で包被した生物学的標本を保持した状態を示す側面図、（ｄ）は凍結液で包被した生物学的標本を保持した状態を示す平面図である。図１に示すように、本実施形態における凍結用具１は、卵子、胚や細胞組織などの生物学的標本（以下、「標本」と称す。）Ｅを凍結液Ｌで包被して一端に保持し、凍結物質の中に浸漬することによりガラス化するための用具であって、本体部２、保持部３および識別部４により構成される。
FIG. 1 is a view showing a
本体部２は、耐寒性、液体窒素耐性、耐伸縮性かつ耐変質性を有するポリアミド繊維（例えば、表面円滑ナイロン等）からなる直線糸状の線維素材である。この本体部２の全長は５〜４０ｍｍ、直径は０．２〜０．４ｍｍである。また、本体部２は有色透明とすることにより、凍結物質の中に浸漬した際、凍結物質内でその目視確認が容易となり、かつピンセットなどの把持具による把持および誘導が容易となるようにしている。
The
保持部３は、本体部２の延長であり、本体部２の一端に２０〜４０°の勾配を設けて平面状に形成されたものである。保持部３の幅は、０．３〜０．６ｍｍ、長さは０．５〜２．０ｍｍである。なお、少なくとも保持部３の内側（本体部２とのなす角が鈍角である面（以下、「上面」と称す。）の側）は、平面状とする。また、保持部３は、本体部２と同じ材質であり、保持部３の厚さは約０．１ｍｍである。
The
保持部３は、本体部２と同様、有色透明であるため、凍結液Ｌにより包被した標本Ｅを平面部の内側に滴下すると、標本がピペット内から保持部３に移行したことを容易に確認できる。また、この保持部３から凍結物質内へと浸漬していく際も、保持部３が凍結物質内へ挿入されていくのを容易に確認できる。
Since the holding
なお、本体部２および保持部３は、ポリアミド繊維製であるため、−１９０〜−２００℃の凍結物質内に浸漬されても、可撓性を保持することができる。したがって、本体部２に外部から加わる力が保持部３に保持された標本Ｅおよび凍結液Ｌに伝わることがなく、標本Ｅを損傷することがない。
In addition, since the main-
また、このポリアミド繊維製の本体部２の全長が５〜４０ｍｍであるため、可撓性を有する本体部２自らの重量に耐えて直線状を保つことができ、過剰な振動も本体部２から保持部３へ伝わらないため、凍結液Ｌで包被した生物学的標本Ｅの保持部３への滴下が容易に行える。また、凍結物質内での凍結用具１の視認が容易である。
In addition, since the overall length of the polyamide fiber
なお、本体部２の全長が５ｍｍより短い場合、凍結用具１の小型化による取り扱いが不便になり、凍結物質内での凍結用具１の存在確認が困難となる。また、全長が４０ｍｍより長い場合、可撓性を有する本体部２自らの重量で傾斜が起こり、また、過剰な振動が本体部２から保持部３へ伝わるようになるため、保持部３への凍結液Ｌで包被した生物学的標本Ｅの滴下が困難となる。
In addition, when the full length of the main-
また、本体部２の直径が０．２ｍｍよりも小さく過細な場合、凍結用具１の強度が減少してしまうため、凍結液Ｌで包被した生物学的標本Ｅの滴下が困難となるとともに、凍結物質内での凍結用具１の確認が困難となる。また、本体部２の直径が０．４ｍｍよりも大きく過大な場合、凍結完了後に標本保存筒内へ多数保存するのが困難となる。
In addition, when the diameter of the
また、保持部３の幅が０．３〜０．６ｍｍ、長さが０．５〜２．０ｍｍであることによって、滴下量を少なくすることができ、滴下量が少ないことによって、生存性の高い凍結を行うことが可能となる。なお、保持部３の長さが０．５ｍｍより短い場合、保持部３の長さが小さすぎることによって滴下作業が困難になるとともに、滴下量が少なすぎて生物学的標本Ｅの凍結が困難となる。また、２．０ｍｍより長い場合、滴下量が過剰となり、高い生存性の凍結が困難となる。
Moreover, when the holding
識別部４は、本体部２に対して保持部３の反対側の他端に形成されている。識別部４は、外径０．５〜０．８ｍｍ、内径０．３〜０．５ｍｍの１〜２ｍｍ長の着色鉄製管を、本体部２の末端部に包被装着したものである。また、装着した鉄製管は、振動や伸縮による本体部２からの脱落を防止する目的で、本体部２の反対側の保持部３の平面部と同じ側の面を軽度に押し潰して平面化している。
The
なお、この識別部４は、磁性体材料としての強磁性体である鉄により形成されているため、磁力により引き寄せ可能である。そのため、磁石等の利用により、この識別部４を引き寄せることで、本実施形態における凍結用具１を容易に誘導することが可能である。
In addition, since this
次に、上記構成の凍結用具１の使用法について、図２を参照して説明する。図２は本実施形態における凍結、保存および融解の工程を示す説明図である。なお、生物体を取り扱うにあたり、本凍結用具１は、清浄かつ滅菌用ガスや生物死活線等で滅菌処理したものを使用する。
Next, a method of using the freezing
（凍結法）
標本の凍結方法は、図２に示すように、（ア）一またはそれ以上の標本Ｅを平衡液Ｂ1，Ｂ2で数段階平衡した後、凍結液Ｌに短時間浸漬する。その後、標本Ｅを凍結液Ｌとともにパスツールピペット５に吸引し、（イ）実体顕微鏡下で確認しながら、ピンセット６により把持する凍結用具１の保持部３に滴下し、（ウ）決められた時間に凍結用具１全体を液体窒素等の凍結物質Ｆに投入し凍結する。次に、（ウ）凍結した凍結用具１の識別部４側を保持し、既存の耐寒性の標本保存筒７に凍結物質Ｆとともに挿入し、（エ）閉蓋して保管器８で保存する。
(Freezing method)
As shown in FIG. 2, (a) one or more specimens E are equilibrated in several stages with the equilibration liquids B 1 and B 2 and then immersed in the freezing liquid L for a short time. Thereafter, the specimen E was sucked into the
（融解法）
標本の融解方法は、図２に示すように、（オ）予め用意した凍結物質Ｆ内へ保管器８から取り出した標本保存筒７を入れ、標本保存筒７から凍結用具１を引き出し、（カ）識別部４を保持して、速やかに融解希釈液Ｗに保持部３を投入し、融解する。（キ）融解した標本Ｅは顕微鏡下で必要な段階希釈（希釈液Ｗ1，Ｗ2）を行い、保存液Ｍに投入後、種々の作業に利用する。
(Melting method)
As shown in FIG. 2, the specimen is thawed by placing the
以上のように、本実施形態における凍結用具１は、直線糸状の本体部２と、この本体部２の一端に勾配を設けて形成された平面状の保持部３とを備えたことにより、平面状の保持部３の平面が略水平となるように本体部２を斜め下向きに保持した状態を維持したまま、平面状の保持部３の上面に凍結液Ｌで包被した標本Ｅを滴下して保持し、凍結物質Ｆの中へ浸漬することができる（図２（イ）、（ロ）参照。）。
As described above, the freezing
したがって、本実施形態における凍結用具１を利用することで、ガラス化法による保存作業を確実かつ簡便に行うことができ、標本Ｅを高い生存性を維持したまま凍結保存することができる。また、本実施形態における凍結用具１では、保持部３の上面に滴下した標本Ｅを含む凍結液Ｌが本体部２と保持部３との境界で堰き止められるため、少ない凍結液で確実に標本Ｅを包被することができる。
Therefore, by using the freezing
本実施形態における凍結用具１では、滴下に必要な液量は約０．３μｌと極少量である。このように本実施形態における凍結用具１では、標本Ｅの凍結に必要な凍結液Ｌは微少量であるため、凍結物質Ｆに直接暴露することで、融解後の生存率の高い超急速冷却が可能である。
In the freezing
また、保持部３の本体部２に対する勾配を２０〜４０°とすることで、凍結液Ｌで包被した標本Ｅの滴下および保持並びに凍結物質Ｆの中への浸漬時の作業性を維持しつつ、凍結用具１全体の幅を小さくすることができるため、細い標本保存筒７であっても出し入れ作業が容易である。
Moreover, the workability at the time of dripping and holding of the specimen E encapsulated with the frozen liquid L and immersing in the frozen substance F is maintained by setting the gradient of the holding
また、本体部２の保持部３と反対側の他端に磁力により引き寄せ可能な磁性体材料である鉄により形成された識別部５を備えたことにより、ガラス化後、凍結用具１ごとそのまま細い標本保存筒７内に入れて冷凍保存した標本Ｅを、この細い標本保存筒７から取り出す際、磁力によってこの識別部５を引き寄せて容易に取り出すことができる。
In addition, since the other end of the
また、この識別部５を着色していることから、ガラス化後、凍結用具１ごとそのまま細い標本保存筒７内に入れて冷凍保存する場合に、この冷凍保存した標本Ｅを、この識別部５の着色によって識別することができ、標本Ｅを容易に管理することが可能となる。
In addition, since the
また、本体部２および保持部３が、有色透明であることにより、凍結液Ｌで包被した標本Ｅをそのまま顕微鏡で確認することができるとともに、有色であることから、凍結物質Ｆの中に浸漬した際、凍結物質Ｆ内で凍結用具１を容易に視認することができ、作業性が向上している。
In addition, since the
また、本実施形態における凍結用具１は、その材質により常温において、過剰な圧力等を加えない限り、変性、伸縮、脆弱化することがないため、衛生的処理を行うことで再利用することも可能である。
In addition, the freezing
本実施形態における凍結用具１を用いてウシ体外受精胚の超急速ガラス化を行い、その生存性を調査した。
Ultra-rapid vitrification of bovine in vitro fertilized embryos was performed using the freezing
（１）卵子採取
と畜場でと畜された雌ウシから卵巣を切り取り、２０℃の抗生物質を添加したビタミンＢ１加リンゲル液で洗浄後、と畜から６時間内に卵胞卵子を吸引した。吸引は、直径１０ｍｍ以内の形態的に正常な卵胞から、１８ゲージまたは２０ゲージの鈍尖注射針を装着した注射筒に予め吸引しておいた０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したダルベッコリン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）とともに、卵丘細胞卵子複合体（ＣＯＣｓ）を吸引した。
(1) Egg collection The ovaries were cut out from cows slaughtered in a slaughterhouse, washed with vitamin B1 added Ringer's solution supplemented with 20 ° C. antibiotics, and then follicular ova were aspirated within 6 hours from the slaughterhouse. For aspiration, 0.3% bovine serum albumin (BSA) that had been aspirated in advance was added from a morphologically normal follicle having a diameter of 10 mm to a syringe equipped with an 18 gauge or 20 gauge blunt needle. Cumulus cell oocyte complexes (COCs) were aspirated together with Dulbecco's phosphate buffer (D-PBS).
（２）卵子成熟
形態的に良好なＣＯＣｓを、５％仔ウシ血清（ＣＳ）を添加したＴＣＭ１９９（卵子成熟液）で２回洗浄後、１ウェルあたり５０個のＣＯＣｓを流動パラフィンで覆った卵子成熟液５００μｌで、５％ＣＯ2、９５％空気および３８．５℃の気相条件下で２０時間から２２時間成熟した。
(2) Oocyte maturation After morphologically good COCs were washed twice with TCM199 (egg maturation solution) supplemented with 5% calf serum (CS), 50 COCs per well were covered with liquid paraffin. Matured with 500 μl of mature solution for 20 to 22 hours under gas phase conditions of 5% CO 2 , 95% air and 38.5 ° C.
（３）体外受精
黒毛和種牛凍結***を３８℃で融解後、融解***をテオフィリンおよびカフェインを添加したブラケットとオリファント液（ＢＯ液）で希釈して遠心分離を２回施して洗浄し、濃縮***を***濃度で１０7／ｍｌにＢＳＡおよびヘパリンを添加したＢＯ液で***液を調製した。***液で２００μｌドロップを作成し、成熟卵子５０個を導入し、流動パラフィンで覆い、５％ＣＯ2、９５％空気および３８．５℃の気相条件下で４時間媒精した。
(3) In vitro fertilization Frozen semen of Japanese Black cattle is thawed at 38 ° C, diluted with theophylline and caffeine-added bracket and orifant solution (BO solution), washed twice by centrifugation and concentrated A sperm solution was prepared with a BO solution to which BSA and heparin were added at a sperm concentration of 10 7 / ml. A 200 μl drop was made with the sperm solution, 50 mature eggs were introduced, covered with liquid paraffin, and vasculatured for 4 hours under 5% CO 2 , 95% air and 38.5 ° C. gas phase conditions.
（４）体外発生
媒精完了した卵子を、１０％ＣＳを添加したグルコース不含ＴＣＭ１９９（初期発生培地）で洗浄後、１ウェルあたり５０個の卵子を卵子成熟に用いた同じウェルに、初期発生培地５００μｌ内で３日または４日培養し、その後１０％ＣＳを添加したＴＣＭ１９９（後期発生培地）に交換し、その後２日おきに新鮮な後期発生培地２００μｌを交換し、受精８日まで培養した。培養気相条件は５％ＣＯ2、９５％空気および３８．５℃で行った。
(4) In vitro development After sperm completion of ovum washing with glucose-free TCM199 (early development medium) supplemented with 10% CS, 50 eggs per well were used in the same well used for egg maturation. Cultivate in 500 μl of medium for 3 or 4 days, then replace with TCM199 (late development medium) supplemented with 10% CS, then replace with 200 μl of fresh late development medium every 2 days, and culture until 8 days of fertilization . The culture gas phase conditions were 5% CO 2 , 95% air and 38.5 ° C.
（５）供試胚
体外受精後７日または８日において、形態的に栄養膜細胞が単層で均一に発育した上、充実した内部細胞塊を有している拡張胚盤胞期胚を、２０％ＣＳ添加Ｄ−ＰＢＳ（保存液）で洗浄後、３７℃の保存液中で保存して、緩慢冷却による凍結またはガラス化に供試した。
(5) Test embryo On the 7th or 8th day after in vitro fertilization, an expanded blastocyst stage embryo having a solid inner cell mass in addition to a morphologically uniform growth of trophoblast cells, After washing with 20% CS-added D-PBS (preservation solution), the solution was stored in a preservation solution at 37 ° C., and subjected to freezing by slow cooling or vitrification.
（６）胚の緩慢冷却凍結
発生胚を１０％エチレングリコール、０．１Ｍシュクロースおよび２０％ＣＳを添加したＤ−ＰＢＳ（１０ＥＳ）に導入し、１５分平衡し、０．２５ｍｌプラスチックストローに吸引封入した。プログラムフリーザを用い、−７℃の冷媒中にストローをセットし、２分経過後液体窒素で冷却した金属製ピンセットを用い強制植氷した。強制植氷して１０分経過後、０．３℃／分で緩慢冷却して、−３０℃に到達した後、液体窒素へ導入し保存した。
(6) Slow cooling and freezing of embryos The embryos were introduced into D-PBS (10ES) supplemented with 10% ethylene glycol, 0.1M sucrose and 20% CS, equilibrated for 15 minutes, and sucked into a 0.25 ml plastic straw. Enclosed. Using a program freezer, a straw was set in a refrigerant at −7 ° C., and forced ice planting was performed using metal tweezers cooled with liquid nitrogen after 2 minutes. After 10 minutes from forced ice planting, the mixture was slowly cooled at 0.3 ° C./min. After reaching −30 ° C., it was introduced into liquid nitrogen and stored.
（７）胚の超急速ガラス化
発生胚を２種類のガラス化液でガラス化した。１つは、１０％グリセロール、０．１Ｍシュクロース、０．１Ｍキシロースおよび１％ポリエチレングリコールを添加したＤ−ＰＢＳ（ＶＳ１）、および、１０％グリセロール、１０％エチレングリコール、０．２Ｍシュクロース、０．２Ｍキシロースおよび２％ポリエチレングリコールを添加したＤ−ＰＢＳ（ＶＳ２）に順次５分前平衡し、２０％グリセロール、２０％エチレングリコール、０．３Ｍシュクロース、０．３Ｍキシロースおよび３％ポリエチレングリコールを添加したＤ−ＰＢＳ（ＧＥＳＸ）に浸漬した。
(7) Ultra-rapid vitrification of embryo The developing embryo was vitrified with two types of vitrification solutions. One is D-PBS (VS1) supplemented with 10% glycerol, 0.1M sucrose, 0.1M xylose and 1% polyethylene glycol, and 10% glycerol, 10% ethylene glycol, 0.2M sucrose, Sequentially equilibrate for 5 minutes in D-PBS (VS2) supplemented with 0.2M xylose and 2% polyethylene glycol, then 20% glycerol, 20% ethylene glycol, 0.3M sucrose, 0.3M xylose and 3% polyethylene glycol. It was immersed in D-PBS (GESX) to which was added.
もう一つのガラス化は、１０％エチレングリコール、１０％ジメチルスルホキシドおよび２０％ＣＳを添加したＴＣＭ１９９で５分前平衡を行い、２０％ジメチルスルホキシド、２０％エチレングリコールおよび２０％ＣＳを添加したＴＣＭ１９９（ＶＳ）に浸漬して、ＧＥＳＸも同様に胚をパスツールピペットで吸い上げ、実体顕微鏡下で凍結用具１の保持部３に滴下した。
Another vitrification was pre-equilibrated with TCM199 supplemented with 10% ethylene glycol, 10% dimethylsulfoxide and 20% CS for 5 minutes, and TCM199 (with 20% dimethylsulfoxide, 20% ethylene glycol and 20% CS added) VS), the embryo was similarly sucked up with a Pasteur pipette and dropped onto the
胚をＧＥＳＸまたはＶＳへ浸漬してから３０秒後に凍結用具１を、素早く液体窒素に投入し、超急速ガラス化を行った。ガラス化した凍結用具１は、液体窒素中で市販の耐寒性サンプルチューブに導入後、封閉して液体窒素内で保存した。
30 seconds after the embryo was immersed in GESX or VS, the freezing
（８）緩慢冷却凍結胚の融解
凍結ストローを液体窒素から取り出し、室温で６秒保持し、その後３０℃温湯中で２０秒維持することで胚を融解した。次に融解したストローを室温で５分保持し、封印側をストローカッターで切断し、ストローの綿栓側から圧力をかけ、凍結液とともに胚を押し出した。次に胚を保存液に導入して凍結液を希釈した。
(8) Thawing of slow-cooled frozen embryos A frozen straw was taken out of liquid nitrogen, kept at room temperature for 6 seconds, and then kept in 30 ° C hot water for 20 seconds to thaw the embryo. Next, the thawed straw was kept at room temperature for 5 minutes, the sealed side was cut with a straw cutter, pressure was applied from the cotton plug side of the straw, and the embryo was extruded together with the frozen solution. Next, the embryo was introduced into a preservation solution to dilute the frozen solution.
（９）超急速ガラス化胚の加温
液体窒素からピンセットでガラス化した凍結用具１をつまみ、保持部３を素早く０．５Ｍシュクロースおよび２０％ＣＳを添加したＤ−ＰＢＳへ導入して、胚を凍結用具１から加温離脱した。この状態で５分浸漬し、次に胚を０．２５Ｍシュクロースおよび２０％ＣＳを添加したＤ−ＰＢＳへ導入し、再び５分浸漬してガラス化液の希釈を行った。加温希釈は室温下で行い、ガラス化液希釈後は３７℃の保存液に導入して保存した。
(9) Heating of ultra-rapid vitrified embryo The freezing
（１０）融解または加温胚の培養
融解または加温した緩慢冷却凍結胚および超急速ガラス化胚は、１００μＭベータメルカプトエタノールおよび２０％ウシ胎仔血清を添加したＴＣＭ１９９（培養液）で数回洗浄後、流動パラフィンで覆った１胚あたり２０μｌの培養液ドロップで７２時間培養した。培養の気相条件は５％ＣＯ2、９５％空気および３８．５℃で行った。
(10) Culture of thawed or warmed embryos Thawed or warmed slowly cooled frozen embryos and ultra-rapid vitrified embryos were washed several times with TCM199 (culture medium) supplemented with 100 μM beta mercaptoethanol and 20% fetal calf serum. Then, the culture medium was cultured for 72 hours with a 20 μl culture medium drop per embryo covered with liquid paraffin. The culture gas phase conditions were 5% CO 2 , 95% air and 38.5 ° C.
（１１）保存胚の生存性調査
融解または加温した胚は培養開始から２４時間、４８時間および７２時間で生存、発育および状態を観察した。
(11) Survival investigation of preserved embryos Thawed or warmed embryos were observed for survival, development and state at 24, 48 and 72 hours from the start of culture.
（１２）統計処理
保存胚の融解または加温後の生存胚数および透明帯脱出胚数を同系列内でカイ自乗検定を行った。
(12) Statistical processing Chi-square test was performed within the same series for the number of surviving embryos and the number of zona pelvic escaped embryos after thawing or heating the preserved embryos.
（１３）保存胚の生存率
融解または加温後培養した体外受精胚の生存率は、２４時間後で１０ＥＳ：７２％、ＶＳ：８７％およびＧＥＳＸ：１００％、４８時間後で６７％、８６％および９９％、７２時間後で６５％、８３％および９９％とガラス化液ＶＳおよびＧＥＳＸは８０％以上の生存率を維持した。
(13) Survival rate of preserved embryos Viability of in vitro fertilized embryos cultured after thawing or warming was 10ES: 72% after 24 hours, VS: 87% and GESX: 100%, after 48 hours 67%, 86 % And 99%, after 72 hours 65%, 83% and 99% and vitrification solutions VS and GESX maintained over 80% viability.
しかし、緩慢冷却区は２４時間後で生存率７２％であり、その後も経時的に下降が見られ、両ガラス化液は緩慢冷却液より有意（ｐ＜０．０５）に高い生存率を示した。また、両ガラス化液では加温後７２時間後で９９％の生存性を示したＧＥＳＸがＶＳより有意（ｐ＜０．００１）に高い生存率を示した。表１に保存胚の融解または加温後生存率を示す。表１から分かるように、ａとｂの有意差はｐ＜０．０５、ｃとｄの有意差はｐ＜０．０１、ｅとｆの有意差はｐ＜０．００５、ｇとｈの有意差はｐ＜０．００１、ｉとｊの有意差はｐ＜０．０００５であった。 However, the slow cooling zone had a survival rate of 72% after 24 hours, and continued to decline over time, and both vitrification solutions showed significantly higher survival rates (p <0.05) than the slow cooling solutions. It was. In both vitrification solutions, GESX, which showed 99% survival after 72 hours after heating, showed a significantly higher survival rate (p <0.001) than VS. Table 1 shows the survival rate after thawing or warming of preserved embryos. As can be seen from Table 1, the significant difference between a and b is p <0.05, the significant difference between c and d is p <0.01, the significant difference between e and f is p <0.005, and g and h. The significant difference was p <0.001, and the significant difference between i and j was p <0.0005.
（１４）保存胚の透明帯脱出率
融解または加温後培養した体外受精胚の透明帯脱出率は、２４時間後で１０ＥＳ：１５％、ＶＳ：１０％およびＧＥＳＸ：６２％、４８時間後で３３％、５１％および９６％、７２時間後で４８％、６１％および９７％と全ての試験区で経時的に上昇が見られた。４８時間および７２時間後ではガラス化が緩慢冷却より透明帯脱出率が高い傾向にあった。特に、ガラス化液ＧＥＳＸは加温後２４時間後で６２％、４８時間後には９６％が透明帯を脱出し、脱出した胚は細胞発育並びに内部細胞塊の形態等良好な発生経過を示した。表２に保存胚の融解または加温後透明帯脱出率を示す。表２から分かるように、ａとｂの有意差はｐ＜０．０５、ｃとｄの有意差はｐ＜０．０００５であった。
(14) Zona pellucida escape rate of preserved embryos The zona pellucida escape rates of in vitro fertilized embryos cultured after thawing or warming were 10 ES: 15% after 24 hours, VS: 10% and GESX: 62%, 48 hours later There was an increase over time in all test sections, 33%, 51% and 96%, and 48%, 61% and 97% after 72 hours. After 48 hours and 72 hours, vitrification was slow and the zona pellucida escape rate tended to be higher than cooling. In particular, the vitrification solution GESX was 62% after heating and 96% after 48 hours and 96% escaped the zona pellucida, and the escaped embryo showed a good developmental process such as cell growth and internal cell mass morphology. . Table 2 shows the zona pellucida escape rate after thawing or heating of the preserved embryo. As can be seen from Table 2, the significant difference between a and b was p <0.05, and the significant difference between c and d was p <0.0005.
本発明の凍結用具は、卵子、胚や組織細胞などの生物学的標本を凍結保存する用具として有用である。特に、種々の生物標本を高い生存性を維持したまま長期間保存することが可能なガラス化法の凍結用具として好適である。 The freezing tool of the present invention is useful as a tool for cryopreserving biological specimens such as eggs, embryos and tissue cells. In particular, it is suitable as a freezing tool for vitrification, in which various biological specimens can be stored for a long period of time while maintaining high viability.
１ 凍結用具
２ 本体部
３ 保持部
４ 識別部
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